JP2001514658A

JP2001514658A - 異種遺伝子の一時的及び選択的発現に対する酸化ストレスを発生させる光力学的治療

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Publication number: JP2001514658A
Application number: JP53966198A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ゴーマー，チャールス; ケンスームウォング，サム; フェラリオネイム，アンジェラ; クーンスゲンルーナ，マリアン
Original assignee: Research Development Foundation
Current assignee: Research Development Foundation
Priority date: 1997-03-10
Filing date: 1998-03-09
Publication date: 2001-09-11
Also published as: EP1005375A1; AU6453998A; KR20000076115A; ZA981948B; AU731502B2; NZ337693A; IL131776A0; WO1998040105A1; CN1252006A; CA2283108A1

Abstract

(57)【要約】本発明は異種遺伝子の選択的、一時的発現のための方法を開示している。本発明は標的組織内で異種遺伝子を選択的、一時的に発現するための方法で構成されている。加熱または光力学的治療（ＰＤＴ）によって誘発される酸化ストレスの条件下で対象の遺伝子を発現するために光力学的治療または熱によって誘発されるプロモーターが用いられる。（サイトカイン、毒素、腫瘍抑制遺伝子、アンチセンス分子、及び抗血管形成性因子などの）異種遺伝子の選択的、一時的発現は腫瘍、血管増殖、組織低酸素症の治療において有意の治療効果を有している。加熱、他の熱源（マクロ波、超音波、あるいはラジオ周波数波誘発電流など）、あるいはＰＤＴによる標的を絞った遺伝子治療は制御され、局所化された形態で治療遺伝子の発現を誘発してくれる。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称異種遺伝子の一時的及び選択的発現に対する酸化ストレスを発生ささせる光力学的治療発明の背景本発明は一部国立健康研究所からの交付金を用いて行われたものである。その結果として、連邦政府も本発明に対して一定の権利を有している。発明の分野本発明は一般的には充実性腫瘍の臨床治療に関するものである。より具体的には、本発明は制御され局所化された形態で治療的遺伝子の発現を誘発することに関連している。関連技術の説明光力学的治療（ＰＤＴ）は充実性悪性腫瘍の臨床治療である(Fisher，A．M．R ．ら、Laser Surgery Medicine 17：２−31（1995）；Marcus，S．L．及びDugan ，M．H.，Laser Surgery Medicine，12：318−24（1992）；及びHenderson,B．W ．及びDougherty，T．J.，Photochem ．Photobiol.，55：931−48（1992））。有効な局所的腫瘍抑制活性を提供するための手順をつくりだすためには、腫瘍組織内の光感作化剤の局所化及び反応酸素種の光化学的発生がレーザー発生光の正確な伝達と組み合わされる(Henderson，B．W，Photodermatology ６：200−11（19 89）；及びWilson，B．C.，及びJeeves,W．P.，ＰＨＯＴＯＭＥＤＩＣＩＮＥ（B en Hur，E.，及びI.Rosenthal編集）２：127−67（1987））。フォトフリン（Photofrin）と命名されているヘマトポルフィリンの誘導体が多数の臨床実験で用いられている。フォトフリン媒介ＰＤＴは最近食道癌の治療に関してＦＤＡの承認を受け、この化合物はカナダ、オランダ、及び日本でも承認を受けている。ＰＤＴは気管支、膀胱、皮膚、頭部／首及び子宮頸部の腫瘍の治療と乾癬及び年齢性の皮膚のあざ変性などの非悪性不全の治療にかなり有望である。より改善された薬学的、光化学的、及び光物理的特性を示す新しい光感作化剤の開発及び臨床的評価についても関心も高まりつつある（Gomer．C．J.，Yearly Review ：Photochem．Photobiol.，54：1093−1107（1991））。臨床実験中の第二世代の光感作化剤には錫エチオプルプリン（ＳｎＥＴ２）、モノ−１−アスパルチル・クロリンｅ６（ＮＰｅ６）、ベンゾポルフィリン誘導物（ＢＰＤ）、メソ−テトラ−（ヒドロキシフェニル）クロリン（ｍＴＨＰＣ）及び５−アミノ・レブリン酸（ＡＬＡ）がある。これらの化合物は化学的純度、より長い波長での吸光性の向上、より優れた腫瘍組織保留性、正常な組織からの迅速な除去が可能であること、反応性酸素種及び暗毒性が少ないことなどを含むフォトフリンと同等、あるいはそれを上回ると考えられるいろいろな特性を示す（Dougherty，T． J.，Photochem ．Phrotobiol．58：895−900（1993）；Moan，J及びBerg．K.，Ph otochem ．Photobiol． 55：931−48（1992）及びKessel，Photochem ．Photobiol ． 50：169−74（1989））。ＡＬＡは内発性プロトポルフィリンIXの代謝性前駆体である。ＰＤＴ中の反応性酸素種の光化学的発生は脂質、蛋白質、及び核酸に損傷を及ぼす場合がある（Moan，J.，Photochem ．Photobiol．43：681−90（1986））。実際、細胞膜、細胞小器官、酵素、ＤＮＡに対する損傷は多数の正常及び悪性細胞に関して資料で報告されている（Prinze、C.，ら、Biochim ．Biophys．Acta. ，1038：152−57（1990））；及びHilf，R.,ら、Cancer Res.，44：1483−88（1 984））。こうした箇所のいずれかに対する酸化損傷は細胞死につながる可能性がある。しかしながら、ＰＤＴが誘発する致死性の実際の機序及び標的についてはまだ十分に判明していない。ＰＤＴは初期応答遺伝子（c-fos，c-jun，c-myc，egr-1）と、ヒートショック蛋白質（ＨＳＰ）に属するストレス蛋白質遺伝子、グルコース調節蛋白質（ＧＲＰ）及びヘム・オキシゲナーゼ系の発現を誘発する（Luna．M．C.，ら、Cancer Res. ，54：1374−80(1994)；Gomer，C．J.，ら、Photochem ．Photobiol.，53：2 75−279（1991）；Gomer，C.J.，ら、Cancer Res.，51：6574−79（1991）；及びGomler,C．J.，ら、Cancer Res ．（印刷中）（1997））。ストレス遺伝子の誘発は転写レベルで行われるが、特定の標的及び／又はストレス反応遺伝子発現の誘発に関与している信号経路に関する情報は分かっていない。アポトーシスもＰＤＴによって誘発され、細胞膜から始まる信号形質導入経路が関与しているようである（Agarwal．M．L.，ら、Cancer Res.，51: 5993−96(1991)；He．X．Y.，ら、Photochem ．Photobiol．59：468−73(1994)及びZaidi，S.Ｉ．A.，ら、Photochem ．Photobiol．58：771−76（1993））。特徴的なＤＮＡ分断、クロマチン濃縮、及び構成エンドヌグレアーゼは光感作化された細胞で観察される。アポトーシスもイン・ビボでＰＤＴ処理腫瘍において初期の出来事として確認されている。細胞は種々のストレス応答を有している。そうしたストレス応答のそれぞれは１つまたは複数のタイプの環境的刺激あるいはストレスによって引き起こされ、その誘発の主な結果はストレス許容レベルの増大である。ヒートショック応答はこうしたストレス応答のうちでも最も良く特徴付けが行われているもののひとつである。1962年に、高いが、致死的ではない温度（ヒートショック）及び一定の化学物質に対する露出がDrosophila busckiiの唾液腺上に新しいパフを出現させることが報告された。顕微鏡ではっきり見えるこれらのパフはヒートショック誘発可能遺伝子に関する高い転写活性とヒートショック蛋白質に対するメッセンジャ−ＲＮＡを発生させるＲＮＡ合成を示している。より最近、バクテリアからより高等な脊椎動物にいたるまでの広範な生物がヒートショックで遺伝子発現における同様の劇的な変化を示すことが実証されている。ヒートショックに対する反応はヒートショック蛋白質（ＨＳＰ）の強力な誘発と誘発前に発現されていたほとんどの遺伝子の抑制の両方を伴う。その細胞の蛋白質合成機構による翻訳のためにｍＲＮＡが選択される遺伝子転写とその方法の両方のパターンに著しい変化が起きる。ヒートショックによる転写上の変化はヒートショック遺伝子プロモーターにおけるヒートショック要素の存在によるものである。この要素はヒートショックに対する反応における転写の特殊な誘発のために必要なＤＮＡ配列である。大腸菌の熱誘発可能プロモーターにおいては、ヒートショック要素のコンセンサス配列は転写開始サイトに対して対して−44〜ー36のヌクレオチド位置でのＣＴＧＣＣＡＣＣＣである。真核細胞の熱誘発性プロモーターにおいて、それはＴＡＴＡボックス要素上流に交互に反対向きになって配置されている５bpの配列ＮＧＡＡＮの連続的な反復として発現される。実験的な目的のために、ヒートショック反応は通常温度を上昇させることによって誘発される。誘発のために最適の温度は種によるが、通常は細胞成長を可能とする最高温度より１度か２度上である。また、この反応は通常は一過性である。熱反応以外にもヒートショック蛋白質合成の他の誘発因子も存在する。これらにはいくつか全体的に潜在的な細胞毒性を有する化学物質と、非常に反応性の高い遊離基を発生させる可能性のある生理学的状態を含んでいる。こうした誘発因子は高温になると異常な、あるいは部分的に変性した蛋白質の細胞内蓄積を起こさせる能力を共有しているようである。分子量が78,000〜94,000のグルコース調節蛋白質、すなわちＧＲＰはヒートショック蛋白質と類似した配列を有している。ＧＲＰ族の蛋白質はグルコースの枯渇、酸素欠乏、細胞内カルシウムの変質、抑制因子への露出や配糖体化、及びＰＤＴ媒介酸化ストレスなどの要素が共同して関与することで誘発される（Gomer．C．J.，ら、Cancer Res ．51：6574−79 （1991）；及びLi，L-J.，ら、J ．Cell Physiol．153：575−82（1992））。78, 000ＧＲＰは配列が免疫グロブリン重鎖結合蛋白質と同じであり、ＧＲＰ78とＧＲＰ94の両方が内部原形質網状組織（ＥＲ）内に局在している。ＧＲＰ78は発生期の、分泌性膜横断蛋白質と一時的に結合すると同時に、ＥＲ内に異常に組み込まれた、あるいは処理された蛋白質と永続的に結合する。ＧＲＰ78はＥＲ内の蛋白質処理が攪乱された場合、細胞ストレス中及びその後に保護的機能を示すと考えられる。Leeらは腫瘍低酸素症によるgrp78の転写性活性化が標的を定めた遺伝子治療に応用可能であることを示した。塩基要素の大部分が除去された先端が切られたgrp78は低酸素症のマウス腫瘍内のレポーター遺伝子の高レベルの表現を効果的に促進することが示されている（Gazit，G.，ら、Cancer Res ．55：1660 −63（1995））。本発明はＰＤＴによって媒介された酸化ストレスがストレス蛋白質、特にヒートショック蛋白質に属するものの強力な転写性変換因子であることを実証するものである。従って、本発明はＤＰＴ殺腫瘍作用を増強するために高レベルで局所的な細胞毒素又は免疫調整因子の発現を促進するめのＨＳＰ−又はＧＲＰ誘発性プロモーターを有する遺伝子組換え構成物を用いた標的を定めた遺伝子治療の方法にも関係している。従って、先行技術は細胞毒素あるいは免疫調整因子の高レベルの局所発現をつくりだす方法においては不十分である。本発明はこの技術分野における長い間望まれていたニーズに応えるものである。発明の要約本発明のひとつの目的はＰＤＴの直接的な影響を増大させるために、あるいはそれとの相乗作用を目的として、遺伝子の空間的及び一時的発現に対する分子スイッチとして機能するこうした治療的機能性を用いてＰＤＴ（又は熱）の殺腫瘍性（又は抗血管形成性）特性を局所的に増大させるための新しい方法を提供するものである。本発明は構成的に作用するプロモーター、例えば遺伝子転写を特定の細胞グループに限定する組織固有レセプター又は組織固有エンハンサーを用いるウイルスによる伝達システムを用いて局所化細胞毒性遺伝子治療を行おうとする現在行われている治療方式より優れている。遺伝子発現の一時的な調節は通常の細胞や組織では細胞毒性遺伝子生産の高基底表現の故に構成的に作用するプロモーターを用いて行うことはできない（誘発性遺伝子治療とＰＤＴ又は熱を組み合わせる）。本発明は通常の組織に対する毒性を増大することなしに局所腫瘍制御を増大させる（治療効果を増大させる）。ＰＤＴ又は熱誘発性プロモーターの転写性活性化は任意の組織体積、そして特定の期間で制御される。従ってこの手順は、ＰＤＴ又は熱によって誘発される直接的な細胞毒性とＰＤＴ又は熱の向標的性の両方を活用して細胞毒性転写の空間的及び一時的規制を誘発する。ＰＤＴ又は熱向標的遺伝子治療はＰＤＴあるいは熱処理分野内で転写的に活性化されて局所的な細胞毒性を増強させる異種遺伝子をコードするｃＤＮＡの上流にＰＤＴあるいは熱誘発性プロモーターを含んだ構成物を用いる。Weichselbaum らはイオン化放射を用いて同様の手順に関して報告している（Weichselbaum，R ．R.，ら、Cancer Res ．54：4266−69（1994)）。本発明のひとつの目的は個人の標的細胞の一時的で局所化された治療方法を提供することであり、この方法は光力学的治療又は熱で誘発可能なプロモーターによる制御下で治療に役立つ異種遺伝子を発現するベクターを該個人に投与するステップと、その標的組織を光力学的治療あるいは熱に露出させるステップを含んでいる。本発明のこうした具体的な目的の種々の実施の形態として、熱レーザー、マイクロ波、超音波、あるいはラジオ周波数波などを用いて熱を発生させる方法が含まれている。本発明の別の目的において、個人の標的組織の一時的で局所化された治療の方法が提供され、その方法はその個人に光力学的治療のための光感作化剤を投与するステップと、その個人に光力学的治療によって誘発可能なプロモーターの制御下で治療に役立つ異種遺伝子を発現する発現ベクターを投与するステップと、その光感作化剤及び発現ベクターをその標的組織に摂取させるステップと、その標的組織を光にあててその光と上記光感作化剤との組み合わせが反応性酸素種を発生させて光力学的治療によって誘発可能なプロモーターを誘発させ、その治療に役立つ異種遺伝子を発現させるステップで構成されている。本発明のこの目的の具体的な実施例において、光感作化剤はフォトフリン、錫エチオプルプリン、モノ−１−アスパルチル・クロリンｅ６、ベンゾポルフィリン誘導物、メソ−テトラ（ヒドロキシフェニル（クロリン及び５−アミノ・レブリン酸によって構成されるグループから選択される。本発明による方法の両方の目的に種々の実施態様にはベクターを系統的、あるいは局所的に投与するステップが含まれる。本発明によるベクターの好ましい実施の態様としてはそのベクターがレトロウイルス・ベクター、アデノ会合ウイルス・ベクター、あるいはリポソーマルＤＮＡベクターである場合が含まれる。本発明の両方の目的の具体的な好ましい実施態様としては、そのプロモーターがヒートショック蛋白質（hsp）プロモーターあるいはグルコース調節蛋白質プロモーターである場合が含まれる。さらに、好ましい実施態様には、その異種遺伝子は免疫調節遺伝子、特にサイトカインである場合を含んでいる。さらに、実施態様にはその異種遺伝子が腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスＤＮＡ、あるいは抗血管形成性遺伝子である場合も含まれる。本発明のいずれかの目的で、好ましい実施態様には上記の標的組織が腫瘍であるか、あるいは異常な組織成長領域である場合が含まれる。本発明の他の側面、特徴、利点は本発明の現時点での好ましい実施態様についての以下の説明から明らかになるであろう。これらの実施態様は開示の目的のために提供されるものである。図面の簡単な説明本発明の上に述べたような特徴、利点、及び目的がより明確になり、詳しく理解されるように、以下に図面を添付してある。これらの図面は明細書の一部を形成するものである。なお、添付図面は本発明の好ましい実施態様を示すものであって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。図１〜５は熱又はＰＤＴのいずれかにさらされたＲＩＦＨＢ−３細胞内のベータ・ガラクトシダーゼ（β −gal）レポーター遺伝子の選択的、一時的発現を示しており、図１：1.5，10，20，30及び40分間熱（45℃）で処理した感染ＲＩＦＨＢ− ３細胞内でのベータ−ガラクトシダーゼ活性（基質としてＯＮＧＰ（ｏ−ニトロフェニル−ピラノガラクトシダーゼ）を用いて測定）。サンプルは高温処理して６時間後に回収された。各データ・ポイントは少なくとも３つの個別実験の平均値±Ｓ.Ｅ.を示している。図２：600ジュール/cm²から5400ジュール/cm²の範囲の照射量でＮＰｅ６−媒介ＰＤＴによって処理したＲＩＦＨＢ− ３細胞内でのベータ−ガラクトシダーゼ活性（ＯＮＰＧを基質として用いて測定）。サンプルは光処理の６時間後に回収された。各データ・ポイントは少なくとも３つの個別実験の平均値±Ｓ.Ｅ.を示している。図３：45℃で20分間処理したＲＩＦＨＢ−３細胞でのベータ−ガラグトシダーゼ発現（ＯＮＰＧを基質として用いて測定）の反応速度。各データ・ポイントは少なくとも３回の個別実験の平均値±Ｓ.Ｅ.である。酵素活性を熱処理から３時間後に検出した（19ミリユニット/mg蛋白質）。β−gal活性のピーク値（100 及び125ミリユニット/mg蛋白質）は熱処理後６時間及び12時間後に到達された。図４：3000ジュール/cm²の照射量でＮＰｅ６−ＰＤＴで処理したＲＩＦＨＢ −３細胞内でのベータ−ガラクトシダーゼ発現（ＯＮＰＧを基質として使用して測定）の反応速度。各データ・ポイントは少なくとも３回の個別実験の平均値± Ｓ.Ｅ.を示す。酵素活性の最低レベルは処理から３時間後に検出された。ピーク活性はＮＰｅ６媒介ＰＤＴから６時間後と12時間後との間に到達された。図５：Ｃ３Ｈ/ＨｅＪマウス内で成長しつつあり、熱かＮＰｅ６−ＰＤＴのいずれかで処理されたＲＩＦＨＢ−３腫瘍からのベータ−ガラクトシダーゼ活性（ＯＮＰＧを基質として用いて測定）。熱処理は45℃で20分間さらすことによって行われた。ＰＤＴに関しては３つの照射量でテストされた。各カラムは５つの個別の実験の平均値±Ｓ.Ｅ.を示している。最大の反応は熱処理（hyperthermia）（8.25ミリユニット/mg蛋白質）後に観察された。ＮＰｅ６−ＰＤＴは1.08〜3.48ミリユニット／mg蛋白質の範囲のベーターガラクトシダーゼ酵素活性を誘発した。比較対象の腫瘍や光やＮＰｅ６だけで処理した腫瘍では測定可能なレベルでの検出は行われなかった（ＰＨ及びＳｎＥＴ２を用いてのＰＤＴ措置に対しては同様の結果が得られた）。図６〜1２は熱かＰＤＴで処理されたＲＩＦＨＣ−２細胞及びＲＩＦＲＨＣ−７細胞内でのクロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子の選択的で一時的な発現を示している。図６：熱（45℃）で1.5，10，20及び40分間処理されたトランスフェクトＲＩＦＨＣ−Ｃ細胞でのＣＡＴ活性。サンプルは熱処理から24時間後に回収された。クロラムフェニコールのアセチレート化クロラムフェニコールへの転化は結果として得られるＴＬＣプレートからの放射活性をカウントすることによって計算された。図７：熱（45℃）で1.5，10，20及び40分間処理した後のトランスフェクトＲＩＦＲＨＣ−７細胞におけるＣＡＴ活性。サンプルは熱処理24時間後に得られた。クロラムフェニコールのアセチレート化クロラムフェニコールへの転化は結果として得られるＴＬＣプレートからの放射活性をカウントすることによって計算された。図８：600ジュール/cm²と5400ジュール/cm²の範囲のＮＰｅ６媒介ＰＤＴで処理したトタンスフェクトＲＩＦＨＣ−２細胞でのＣＡＴ活性。クロラムフェニコールのアセチレート化クロラムフェニコールの転化は結果として得られるＴＬＣプレートからの放射活性をカウントすることによって計算された。図９：45℃で20分間処理されたトタンスフェクトＲＩＦＨＣ−２細胞内でのＣＡＴ活性の反応速度。サンプルは熱の処理から３〜48時間後に集められた。クロラムフェニコールのアセチレート化クロラムフェニコールへの転化は結果として得られるＴＬＣプレートからの放射活性をカウントすることによって計算された。図10：45℃で20分間処理したトタンスフェクトＲＩＦＲＨＣ−７細胞内でのＣＴＡ活性の反応速度。サンプルは熱の処理から３〜48時間後に得られたものである。クロラムフェニコールのアセチレート化クロラムフェニコールの転化は結果として得られるＴＬＣプレートからの放射活性をカウントすることによって計算された。図11：細胞用のウォーターバス熱あるいは細胞用のレーザー誘発熱のいずれかで処理されたＲＩＦＨＣ−２細胞及びＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス内で成長しているＲＩＦＨＣ−２腫瘍からのＣＡＴ活性。熱処理は45℃の温度に20分間さらすことによって行われた。細胞培養サンプルは熱処理から24時間後に回収され、腫瘍サンプルは熱処理後３，６及び24時間後に回収された。比較対象の腫瘍からは測定可能なレベルのＣＡＴは記録されなかった。図12：レーザー誘発加熱、ＮＰｅ６−ＰＤＴ、又はＰＨ−ＰＤＴのいずれかによって処理されたＣＨ３Ｈ／ＨｅＪマウス内で成長しているＲＩＦＨＣ−２及びＲＩＦＲＨＣ−７腫瘍からのＣＡＴ活性。熱処理は45℃の温度で20分間さらすことで行われた。比較対象の腫瘍、及び光、ＮＰｅ６あるいはＰＨだけで処理された腫瘍の場合、測定可能なレベルは記録されなかった。発明の詳細な説明本発明の範囲と精神を逸脱せずにここに開示されている発明に対して種々の置き換えや修正が可能であることは当業者には明らかであろう。ここに用いられている『光力学的治療』あるいは『ＰＤＴ』という用語は充実性腫瘍を可視光（通常は非熱レーザーによって発生される）によって処理し、その後、腫瘍局所化光感作化剤を系統投与する措置を意味している（Fisher，A．M .R.，ら、Laser Surgery Medicine 17：２−31（1995）；Marcus．S．L．及びD ugan，M．H.，Laser Surgery Medicine,12：318−24(1992)；及びHenderson，B ．W．及びDougherty，T．J.，Photochem ．Photobiol.，55：931−48(1992)参照）。光感作化剤及びレーザー光によって誘発される光化学反応は細胞レベル以下の標的（細胞膜、細胞小器官、酵素及びＤＮＡ）に対する酸化損傷をもたらす単原子酸素などの酸素種をつくりだす。ＰＤＴは種々のタイプの固形腫瘍（食道、気管支、膀胱、脳、眼球、頭部／首、皮膚、子宮頸部及び年齢性の皮膚のあざ変性及び乾癬などの非悪性疾患）を治療するために臨床的に用いられている。フォトフリン（ＰＨ）、錫エチオプルプリン（ＳｎＥＴ２）、モノ−１−アスパルチル・クロリンｅ６（ＮＰｅ６）、ベンゾポルフィリン誘導物（ＢＰＤ）、メソ−テトラ−（ヒドロキシフェニル）グロリン（ｍＴＨＰＣ）及び５−アミノ・レブリン酸（ＡＬＡ）などの種々の光感作化剤がＰＤＴにおいて用いられている。ここで用いられている『ヒートショック遺伝子』という用語は昇温に対する反応において高いレベルで転写される遺伝子を意味する。ここで用いられている『ＣＡＴ』あるいは『ＣＡＴアッセイ』という用語は真核プロモーター配列の有効性をイン・ビボで評価するためのアッセイを意味する。ＣＡＴ遺伝子はＣＡＴをコードし、ＣＡＴはその２つのヒドロキシル基の１つ又は両方で薬品をアセチル化することによって抗生物質クロラムフェニコールを不活性化する。真核細胞はＣＡＴを合成せず、その遺伝子は特に哺乳動物細胞におけるプロモーターの合成のためのレポーター遺伝子として開発されている。ＣＡＴは［¹⁴Ｃ］クロラムフェニコールがＣＴＡ酵素の存在下だけで合成されるアセチル化された不活性誘導体から分離される薄層クロマトグラフィーに基づく方法によって分析される。ここで用いられている『β−gal』又は『β−ガラクトシダーゼ・アッセイ』という用語は真核プロモーター配列の有効性をイン・ビボで評価するために用いられるアッセイを意味している。β−ガラグトシダーゼはラクトースなどのβ−ガラクトシドを末端非還元性β−ガラクトース残基の加水分解によって構成成分の糖類に加水分解する酵素である。大腸LacZ遺伝子は調査対象のプロモーターの制御下で問題の遺伝子とLacZ遺伝子との間のlacZ発現の翻訳的なイン−フレーム融合としてのプロモーターの作用の調査においてレポーター遺伝子として用いられる。プロモーターの活性はｏ−ニトロフェニル−ピラノガラクトースを基質として用いたβ−ガラクトシダーゼ活性の測定によって評価することができる。ここで用いられている『グルコース調節蛋白質』あるいは『ＧＲＰ』という用語はグルコース枯渇、低酸素症、細胞内カルシウムの変質、抑制因子への露出、あるいはグリコシル化、及びＰＤＴ媒介酸性化ストレス状態などが共に働いて誘発される蛋白質の群を意味している。そしてここで用いられている『腫瘍抑制遺伝子』という用語は細胞の成長及び分裂の通常の制御の種々の側面に関与していると考えられるタイプの遺伝子を意味している。これらの遺伝子の共通の特徴は、通常、遺伝子的な手段で不活性化され、腫瘍形成に寄与してしまうことである。ここで用いられている『免疫調節遺伝子』とは、その発現が特定の刺激、あるいは種々の刺激に対する免疫反応の過程を調節する遺伝子を意味している。その例としてはインターロイキン４、インターロイキン10、腫瘍壊死因子αなどがある。ここで用いられている『サイトカイン』という用語は特定の刺激に対する免疫応答の過程に影響を及ぼし、そして規制することができる免疫システムの細胞によってつくりだされる小さな蛋白質を意味している。ここで用いられている『抗血管形成性遺伝子』とは血管の形成を滅少させる、あるいはそれを終わらせる蛋白質をコードする遺伝子を意味している。ここで用いられている『アンチセンスＤＮＡ』とはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを意味している。こうしたアンチセンスＲＮＡは遺伝子の天然の『センス』ｍＲＮＡ転写によってＲＮＡ−ＤＮＡ二重体を形成して、それによってその翻訳を妨害してしまう可能性を有している。アンチセンスＲＮＡは特定の遺伝子の発現を不活性化する手段を提供してくれ、単純な細胞と複雑な細胞の両方に適用することができる。本発明によれば、当業者に知られているような通常の分子生物学的、微生物学的、及び遺伝子組換えＤＮＡ技術を用いることができる。こうした技術は以下のような文献に詳細に説明されている。例えば、Maniatis，Fritsch & Sambrook, “Molecular Cloning：A Laboratory Manual”（1982）：“ＤＮＡ Cloning：A Practical Approach”，巻Ｉ及びII （D．N．Glover編、1985）；“Oligonucleotide Synthesis”（M．J．Gait編、1 984）；“Nucleic Acid Hybridization”（B．D．Hames & S．J．Higgins編、(1 985)）；“Transcription and Translation”(B．D．Hames & S．J．Higgins編（1984）；“Animal Cell Culture”（R．I．Freshney編（1986）；“Immobiliz ed Cells And Enzymes”（IRL Press，（1986）；B．Perbel，“A Practical Gu ide To Molecular Cloning”（1984））。従って、以下の用語が使われている場合、それは以下のような定義を有している。『ベクター』とは別のＤＮＡ部分を取りつけて、その取りつけられた部分の複製をもたらすことができるプラスミド、ファージ、あるいはコスミドなどのレプリコンである。ベクターは、その投与が受容体哺乳動物によって許容できる場合に『薬学的に受け入れ可能な』と称する。こうした薬剤は、投与された量が生理学的に有意である場合に、『治療的に有効な量』と称せられる。薬剤は、その存在が受容体哺乳動物の生理に変化をもたらす場合に生理学的に有意であると称する。例えば、レトロウイルス感染症の治療において、感染の程度、あるいは感染による生理学的損傷を減少させる化合物を治療的に有効であると考えられる。『ＤＮＡ分子』とは一本鎖形状か、あるいは二本鎖らせん形のポリマー形態のデオキシボヌクレオチド（アデニン、グアニン、シミン、あるいはシトシン）を意味する。この用語はこの分子の一次構造及び二次構造のみを意味しており、いずれの形態の三次形態も限定されるものでもない。従って、この用語は特に直鎖状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、及びクロモソームに見られる二本鎖ＤＮＡを含んでいる。以下の構造の検討では、従来の方式に従って、ＤＮＡの非転写ストランドに沿った５'−３'の方向でのみ配列を示す（例えば、ｍＲＮＡに相同な配列を有するストランド）。『複製元』とはＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列を意味する。ＤＮＡ『コード配列』とは適切な規制配列の制御下に置かれた場合にイン・ビボで転写されポリペプチド内に翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列を意味する。コード配列の境界は５'（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシル）末端の翻訳停止コドンによって決められる。コード配列は原核配列、真核細胞ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核細胞性（例えば哺乳動物の）ＤＮＡからのゲノム性ＤＮＡ配列、そして合成ＤＮＡ配列も含む。ポリアデニル化信号及び翻訳終了配列は通常コード配列の３'末端に配置される。転写及び翻訳制御配列はプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化信号、ターミネーターなど宿主細胞内でのコード配列の発現をもたらすＤＮＡ調節遺伝子である。『プロモーター配列』とは細胞内のＲＮＡポリメラーゼを結合させ、下流（３ '方向）コード発現配列の転写を開始することができるＤＮＡ領域のことである。本発明を明確にするために、プロモーター配列は転写開始サイトによってその３'末端で結合され、上流（５'方向）に延びて背景との対比で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最低限の塩基又は要素を取り込むものと定義する。このプロモーター配列内には転写開始サイト（通常はヌグレアーゼＳ１によるマッピングによって定義される）とＲＮＡポリメラーゼの結合に関係している蛋白質結合サイト（コンセンサス配列）が見いだされるであろう。真核細胞プロモーターは、いつもではないがしばしば、“ ＴＡＴＡ”ボックス及び“ＣＡＴ”ボックスを含んでいる。原核細胞プロモーターは−10〜−35コンセンサス配列に加えてシャイン−ダルガノ配列を含んでいる。ベクターを働かせるために種々のプロモーターを用いることができる。『発現制御配列』とは別のＤＮＡ配列の転写や翻訳を制御したり調節したりするＤＮＡ配列である。コード配列はＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、それがコード配列によってコードされる蛋白質に翻訳される場合に、細胞内の転写及び翻訳制御配列の『制御下』に置かれている。『信号配列』はコード配列の前に含まれる場合がある。この配列は、宿主細胞に対してポリペプチドと細胞表面に向かわせたり、あるいはポリペプチドを培養液内に分泌するように信号を送る信号ペプチド、Ｎ末端からポリペプチドまでをコードし、この信号ペプチドがその蛋白質が細胞を出ていく前に宿主細胞によってクリップ・オフされる。信号配列は真核細胞や原核細胞内に天然の状態で存在する種々の蛋白質と組み合わさった状態で見いだされる場合もある。本発明はこれらの治療的機能性をＰＤＴの種々の効果を増大させたりあるいは相乗的に働かせたりするために遺伝子の場所的、一時的発現に対する分子スイッチとして働かせるために用いることによって、ＰＤＴ（又は熱）の殺腫瘍（又は抗血管形成性）特性を局所的に強化させるための新しい方法に向けられたものである。本発明は構成的に作用するプロモーター、つまり、遺伝子転写を特定の細胞グループに限定する組織固有レセプターあるいは組織固有エンハンサーを用いるウイルス伝達システムを用いて局所的な細胞毒性遺伝子治療を行おうとする現在の方式より優れている。正常な細胞や組織内では細胞毒性遺伝子生産が基本的に高いレベルで発現されるために構成的に作用するプロモーターを用いて遺伝子発現の一時的な調節を行うことはできない。本発明は（誘発性遺伝子治療とＰＤＴ又は熱を組み合わせることで）通常の組織の毒性を増大させずに局所的腫瘍制御を強化させ（治療効果を高め）ることができる。ＰＤＴ又は熱誘発性プロモーターの転写活性化は任意の組織体積内で、そして特定の時間的枠組みで制御される。従ってこの手順は、ＰＤＴ又は熱によって誘発される直接的な細胞毒性と細胞毒性遺伝子転写の空間的、一時的調節を引き出すためにＰＯＤＴをより集中的に標的に向かって行わせることとの両方を可能にしてくれる。ＰＤＴ−あるいは熱標的遺伝子治療はＰＤＴ又は熱処理領域内で転写的に活性化されて局所的な細胞毒性を強める異種遺伝子をコードするｃＤＮＡの上流のＰＤＴ−又は熱誘発性プロモーターを含む構成物を用いる。本発明はヒト個人の標的組織の一時的で局所的な措置の方法を提供するものであり、この方法はその個人に対して光力学的治療あるいは熱によって誘発可能なプロモーターの制御下で治療に役立つ発現ベクターを投与するステップと、その標的組織を光力学的治療あるいは熱にさらすステップとで構成されている。遺伝子治療の目的のために、分子生物学及び腫瘍学の分野での通常の知識と技術を有している人であれば、それほど過重な実験をしなくても、本発明によるこの新しい方法において用いられるべき適切な用量や投与経路については判断できるであろう。本発明は異種遺伝子の選択的及び一時的な発現のための方法を開示するものである。本発明は培養液内で成長された細胞内と、充実性腫瘍としてイン・ビボで成長された細胞のための両方に異種遺伝子を選択的且つ一時的発現を獲得するための二つの方法で構成されている。ヒトヒートショック蛋白質（hsp）プロモーターはレーザー誘発加熱あるいは光力学的治療（ＰＤＴ−）誘発酸化性ストレスの状態下で対象となる遺伝子を発現するために用いられる。異種遺伝子（サイトカイン、トキシン、腫瘍抑制遺伝子、アンチセンス分子、及び抗血管形成性因子など）の選択的及び一時的発現は腫瘍、血管増殖、及び組織肥大の措置において治療上有意義な利点をもっている。レーザー誘発加熱や他の熱源（マイクロ波、超音波、あるいはラジオ周波数誘発電流など）によって標的に向けられた遺伝子治療は制御され局所化された形態で治療的に役立つ遺伝子の発現を誘発することにより治療的な有効性を向上させる。以下の実施例は本発明の種々の実施の形態を示すために開示されるものであって、いかなる意味でも本発明を限定することは意図していない。実施例１細胞系：親の比較対象細胞及びhspプロモーターレポーター遺伝子構成物によってトランスフェクトあるいは形質導入された受容体細胞として放射線誘発繊維肉腫細胞（ＲＩＦ）を用いた。３つのhspプロモーター・レポーター遺伝子細胞系が確立され、テストされた。これらの細胞系のうちの２つは発現プラスミドによってトランスフェクトされ、１つの細胞系は誘発可能なレトロウィルス性ベクターによって形質導入された。StressGen Biotech Corpから入手したプラスミド、ｐ2500 -ＣＡＴ（hsp70プロモーターの制御下でクロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の誘発性発現をもたらす）及びｐ1730Ｒ（hsp70プロモーターの制御下でベータ・ガラクトシダーゼ（β−gal）の誘発性発現をもたらす）、さらにStratagene社からのプラスミド、ｐＭＣ１Ｎｅｏ（チミジン・キナーゼ・プロモーターの制御下でネオマイシン抵抗遺伝子の構成的発現をもたらす）をスーパーコンペテント大腸菌内で成長させて、単離し、その後アルカリ溶解を行い、精製された。各StressGen発現プラスミドはカルシウム・リン酸ＤＮＡ沈殿技術を用いてｐＭＣ１Ｎｅｏ（５：１の比率）と共にＲＩＦ−Ｉ細胞内に共トランスフェクトさせた。これらの細胞を600μg/ml Ｇ418内で成長させて、その結果得られるコトニーをクローニング・リングを用いて取り出した。Ｇ418 抵抗性クローンを延長させて、β−galあるいはＣＡＴ活性に関して熱をポジティブ誘発因子として用いることで調べた。次にポジティブ・クローンのＰＤＴ後の活性について調べた。ＰＤＴ後にβ−galかＣＡＴ活性を表現した個々のＲＩＦ−１クローンが得られた。異種レポーター遺伝子の作用を開始させるためのスイッチとして熱又はＰＤＴを用いることができることを証明するために用いられた３つの細胞系は： 1. 2.5kb hspプロモーターの制御下でＣＡＴを発現するＲＩＦＨＣ−２細胞。 2. 2.5kb hspプロモーターの制御下でベータ・ガラクトシダーゼを発現するＲＩＦＨＢ−３細胞、及び 3.（クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ遺伝子と結紮された 300bphspプロモーター＋５’ＬＴＲから構成的に表現されるホスホトランスフェラーゼ（メオ・レジスタンス）遺伝子を含む修正ＧＩＮＡレトロウィルス性ベクターによって得られたＲＩＦＲＦＣ−７細胞。Ｇ−418内で成長させることで安定したトランスフェクタントが確立され、その後、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ活性の熱誘発発現に関する選別を行った。これら３つの細胞系のすべては安定的に発現ベクターを一体化し、それらの細胞系がＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスのわき腹に注入されると、充実性繊維肉腫腫瘍をつくりだす。実施例２処理条件：培養中の細胞の高熱処理：細胞（２×10⁶）をＴ−75フラスコに熱処理開始より24時間前に播種した。熱処理は温度を調節したウォーターバス内で45℃の温度に細胞をさらすことによって行われた。培養中の細胞の光感作化処理（ＰＤＴ）：３つの違った光感作化剤、フォロフリン（ＰＨ）、モノ−１−アスパラチル・クロリンｅ６（Ｎｏｅ６），及び錫エチオプルプリン（ＳｎＥＴ２）について調べた。細胞（２×10⁶）を100mmペトリ皿に上記の光感作化剤の１つと共に16時間のインキュベーションを開始するより24時間前に入れた。光感作化剤培養濃度はＰＨ及びＮｐｅ６の場合25μg/ml、そしてＳｎＥＴ２の場合は0.75μg/mlであった。細胞は５％血清を含む培養液内で光感作化剤と共に暗下で16時間インキュベーションされた。その後、その細胞を15％血清を含む培地で30分間洗浄してから、段階別の照射量の赤色光に照射された。Ｎｐｅ６とＳｎＥＴ２に対して664nmダイオード・レーザー光が２mW．cm²の照射量で用いられた。ＰＨで培養された細胞に対しては、並列の30−Ｗ蛍光球からの広スペクトル（570〜650mm）赤色光を0.35mW/cm²の割合で用いた。マウス内で成長している腫瘍の熱処理：直径が６〜７mmの寸法の腫瘍の高熱処理は44.5〜45℃の温度に20分間さらすことによって行われた。これらの温度は腫瘍を270mW/cm²の密度で810nmレーザー光を放出するダイオード・レーザーによって腫瘍を照射することによって行われた。マウス内で成長している腫瘍のＰＤＴ処理：直径が６〜７mmの腫瘍の光力学的治療（ＰＤＴ）はＰＨあるいはＮＰｅ６を５ mg/kgの割合で、あるいはＳｎＥＴ２を1.5mg/kgの割合で静脈注射することによって行われた。腫瘍の非熱レーザー光による照射は薬品を投与してから４〜５時間（Ｎｐｅ６の場合）あるいは24時間（ＰＨ及びＳｎＥＴ２の場合）に開始された。630nmの赤色光をpH媒介ＰＤＴの場合に、また664nm光をＳｎＥＴ２−及びＮｐｅ６−媒介ＰＤＴの場合にそれぞれ用いた。照射量は75mW/cm²であった。実施例３細胞及び組織のベーターガラクトシダーゼ・アッセイ：細胞リゼイト（ＲＩＦＨＢ−３細胞をレポーター・リシス緩衝液（promega ）でインキュベートして得られた）あるいは腫瘍リゼイト（ＲＩＦＨＢ−３固形腫瘍をレポーター・リシス緩衝液に入れてポリトロンでホモゲナイズすることによって得たもの）を微細遠心分離管に入れて４℃で２分間遠心分離にかけた。150μlの上澄液を基質ＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むアッセイ２Ｘ緩衝液（promega）を加えて、反応物を37℃の温度で３時間インキュベートすることによってそのベーターガラクトシダーゼ活性に関して調べた。500μlの１Ｍ炭酸ナトリウムを加えてこの反応を停止させ、420nmでの吸収度を分光光度計で読み取った。ベーターガラクトシダーゼ活性は蛋白質のミリユニット/mg（ＢＩＯ−ＲＡＤ蛋白質アッセイで測定）で示した。実施例４細胞及び組織のＣＡＴアッセイ：細胞の場合、10μgの細胞蛋白質（細胞の凍結／解凍によって得たもの）を35 μlの１ＭトリスＣｌ pH7.8，10μlの6.0mg/mlアセチルＣｏＡ、2.5μlのＣ −14クロラムフェニコール（ＩＣＮ Pharmaceiticals社、Costa Mesa，CA，カタログ番号12060）、及び最終体積が75μlにする水と混合した。この反応混合物を37℃のウォーターベースで30分間インキュベートした。アセチル化クロラムフェニコールを１ml酢酸エチルを加えることで反応混合物から抽出して、１分間ボルテックスして最大速度で５分間遠心分離した。酢酸エチル層を取り出して、45 分間かけて乾燥させた。サンプルを30μlの酢酸エチルに溶解して、シリカ・ゲル薄層クロマトグラフィー・プレート上に滴下した。ＴＬＣプレートをクロロホルム：メタノール（比率、95：５）を200ml含むチェンバー内で45分間かけて展開し、空気乾燥し、Ｘ線フィルムに一昼夜露出させた。ＣＡＴ転化比率はＴＬＣプレート上のアセチル化されたスポットとアセチル化されないスポットを切り出してシンチレーション・カウンターでカウントして計算した。組織サンプルの場合、ＣＡＴアッセイを“Molecular Cloning”，Sambrook，F ritsch．Maniatis．Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）に紹介されている手順に多少の修正を加えて行った。65.5μgの蛋白質サンプルを65℃の温度で10分間インキュベートしてジアセチレートを非活性化させた。各サンプルに対して、50μlの１ＭトリスＣｌ pH7.8，10μlの6.0mg/mlアセチルＣｏＡ，4.3 μlのＣ−14クロラムフェニコール（ＩＣＮ Pharmaceuticals社，Costa Mesa,C A）と水を加えて、最終体積を130μlとした。サンプルと37℃の温度で６時間インキュベートして、５μlの新たに作成した6.0mg/m1アセチルＣｏＡ溶液をそれらのサンプルに２時間毎に加えた。６時間インキュベートを行った後、１mlの酢酸エチルを各サンプルに加えて、１分間ボルテックスさせてから５分間遠心分離を行い、有機層を取り出してから空気乾燥して、30μlの酢酸エチルを各サンプルに加えてから、それらサンプルをＴＬＣプレート上にスポッティングした。ＴＬＣプレートを200mlのクロロホルム：メタノール（95：5）を含むチェンバー内で45分間展開して、空気乾燥し、Ｘ線フィルムに一昼夜露出させた。ＣＡＴ転化比率はＰＬＣプレート上のアセチル化されたスポットとアセチル化されなかったスポットと切り出してシンチレーションカウンターでカウントすることで計算した。実施例５ＰＤＴ誘発性プロモーター／ＴＮＦ−α発現ベクター：ｈｓｐプロモーターを含むStressGen（ｐ2500ＣＡＴ）とＴＮＦ−αの完全なコード配列を含むＡＴＣＣ（ｐＵＣ−Ｒ10173）から開始プラスミドを得る。ｐ2 500ＣＡＴからのＣＴＡ遺伝子をHindIII及びBamH1による消化によって取り出す。その結果得られる末端をNew England Biolabs社から得られる市販のアダプターを用いて修飾する。事前にアリール化されたアダプター1105（EcoＲ１−Ｘmn Ｉ）及び1107（HindIII−ＸmnＩ）を用いてEcoＲ１に転化する。BamＨ１末端をアダプター1105（EcoＲ１−ＸmnＩ）及び1106（BamＨ１−ＸmnＩ）を用いてEco Ｒ１に転化する。アダプター挿入に続いて、ベクターをｐＵＣ−Ｒ10173の精製E coＲ１フラグメントに結紮させる。環状プラスミドを用いてコンペテント大腸菌を形質変換させる。選別されたコロニーの微細サンプルをAval及びBgIIIで切断して挿入物の方向を判定する。正しく挿入されたコロニーを拡張して、その結果得られるプラスミド（ｐＨｓｐＴＮＦ）をＲＩＦ癌細胞内でｐＭＣｌＮｅｏと共にトランスフェクトさせる。安定して一体化された hspプロモーター/ＴＮＦ−α発現ベクター、ｐＨｓｐＴＮＦを含む腫瘍細胞系を単離する。本明細書で取り上げられているすべての特許及び刊行物は本発明が関係する技術分野の当業者の水準に合致したものである。さらに、これらの特許及び刊行物は、引用によってそれぞれ個別的、具体的に組み込まれるのと同じ程度に全体として本明細書に組み込まれている。当業者であれば、ここに述べられている課題を実行し、目的と利点を達成すると同時に、それらに本質的に付随した課題、目的、利点を達成するのによく適合していることは容易に理解できるであろう。上に述べた実施の形態はここに述べられている方法、手順、処理、分子、及び具体的な化合物と共に現段階で好ましい実施の段階を示しており、具体例であって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。特許請求の範囲の範囲で定義される本発明の精神の範囲内での変更や他の使用法は当業者であれば容易に想起できるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 41/00 Ａ６１Ｋ 41/00 Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１１１１ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ネイム，アンジェラフェラリオアメリカ合衆国 91206 カリフォルニア, グレンダール，リュートンドライブ 666 (72)発明者ルーナ，マリアンクーンスゲンアメリカ合衆国 91105 カリフォルニア, パサデナ，カウイーアドライブ 1882

Claims

【特許請求の範囲】 1. ヒトの標的組織内の遺伝子の発現を増強する方法において、光力学的治療又は熱によって誘発可能なプロモーターの制御下で治療的に有効な異種遺伝子を発現するベクターで、上記遺伝子が上記プロモーターに対して異種である発現ベクターを上記ヒトの上記標的組織に対して配送するステップと、上記標的組織を光力学的治療又は熱処理し、上記光力学的治療又は熱が上記遺伝子の発現を増強するステップとで構成される方法。 2. 上記ベクターが組織的に投与される請求項１の方法。 3. 上記ベクターが局所的に投与される請求項１の方法。 4. 上記ベクターがレトロウイルス性ベクター、アデノ会合ウイルス性ベクター、あるいはリポソーマルＤＮＡベクターである請求項１の方法。 5. 上記プロモーターがヒートショック蛋白質（hsp）プロモーター、あるいはグルコース調節蛋白質プロモーターである請求項１の方法。 6. 上記異種遺伝子が免疫調節遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスＤＮＡ、又は抗血管形成性遺伝子である請求項１の方法。 7. 上記免疫調節遺伝子がサイトカイン遺伝子である請求項６の方法。 8. 上記プロモーターが反応性酸素種によって誘発可能な請求項１の方法。 9. 上記標的組織が腫瘍、異常組織成長領域、異常血管成長領域である請求項１の方法。 10. 上記熱が熱レーザー、マクロ波、超音波、あるいはラジオ周波数波である請求項１の方法。 11. 上記熱が44.5〜45℃の範囲である請求項１の方法。 12. ヒトの標的組織内での遺伝子の発現を増強する方法において、上記ヒトに光力学的治療のために光感作化剤を投与するステップと、上記ヒトの上記標的組織に光力学的治療によって誘発可能なプロモーターの制御下で治療的に役立つ異種遺伝子を発現し、上記遺伝子が上記プロモータに対して異種である発現ベクターを配送するステップと、上記光感作化剤及び上記発現ベクターを上記標的組織によって取り込まれるようにするステップと、そして上記標的組織を光にさらし、上記光が上記光感作化剤と組み合わさって反応性酸素種を発生させ、光力学的治療によって誘発可能な上記プロモータを誘発させて、上記治療的に有用な異種遺伝子の発現を増強させるステップとで構成される方法。 13. 上記光感作化剤がフォトフリン、錫エチオプルプリン、モノ−１−アスパルチルコリンｅ６、ベンゾポルフィリン誘導体、メソ−テトラ−（ヒドロキシフェニル）クロリン及び５−アミノ・レブリン酸の群から選択される請求項12の方法。 14. 上記プロモーターはヒートショック蛋白質（hsp）プロモーター又はグルコース調節蛋白質プロモーターである請求項12の方法。 15. 上記ベクターがレトロウイルス性ベクター、アデノ会合ウイルス性ベクター、又はリポソーマルＤＮＡベクターである請求項12の方法。 16. 上記異種遺伝子が免疫調節遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスＤＮＡ又は抗血管形成性遺伝子である請求項12の方法。 17. 上記免疫調節遺伝子がサイトカイン遺伝子である請求項16の方法。 18. 上記光がレーザーによって発生される請求項12の方法。