JP2001513653A - 新規な受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なＧタンパク質共役型受容体（TSR32と呼ばれる）をコードする単離したポリヌクレオチド分子を提供する。これらの単離したポリヌクレオチド分子を使用して細胞内に受容体を発現させ、つぎにこれを用いてアゴニストおよびアンタゴニスト活性について化合物をスクリーニングすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な受容体発明の分野 本発明は、TSR32と呼ばれる新規な７回膜貫通Ｇタンパク質共役型受容体をコ ードする単離されたポリヌクレオチド分子に関する。さらに、本発明は、組換え 技法を用いたTSR32受容体の産生におけるこれらの分子の使用、および該TSR32受 容体のアゴニストおよび／またはアンタゴニストについて化合物をスクリーニン グする方法に関する。発明の背景 ７回膜貫通（7TM）セグメントを有するタンパク質は、細胞外Ｎ末端、形質膜 の片側に３つの膜外ループ、および細胞質Ｃ末端を含む共通構造を有する受容体 のスーパーファミリーを定義する。このようなタンパク質の大部分は、小分子、 ペプチド、ホルモン、イオン、および外部からの感覚刺激（発臭剤など）を含む 種々のリガンドに対する細胞表面受容体として機能する(Watson，S.およびArkin stall,S.,The G-protein Linked Receptor Facts Book,Academic Press,London, 1994)。7TMスーパーファミリーの中の１つのファミリーはセクレチン受容体ファ ミリーとして知られており、セクレチン、カルシトニン、グルカゴン、グルカゴ ン様ペプチド１、副甲状腺ホルモン、副甲状腺関連ペプチド、副腎皮質刺激ホル モン放出因子(CRF)、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、ガストリックインヒビ トリーポリペプチド、下垂体細胞アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(PAC AP)、バソアクティブ・インテスティナル・ペプチド（VIP）および昆虫の利尿ホ ルモン（DHR）に特異的なメンバー受容体を含む。 本発明者は、セクレチン受容体ファミリーの更なるメンバー受容体を同定した 。TSR32と呼ばれるこの受容体は、心臓、腎臓、肺および脳を含む種々の組織型 において発現すると思われるが、甲状腺において最も高レベルで発現するようで ある。この受容体のアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、例えば成長、 発 生および代謝活性における重要な甲状腺機能のレギュレータとして商業的価値を もち得るため、組換えDNA技法によりTSR32受容体を生成する能力は有益となろう 。発明の説明 従って、第一の態様において、本発明は、以下のＮ末端アミノ酸配列： MTPQSLLQTT（配列番号：１） によって特徴付けられる、TSR32と呼ばれるＧタンパク質共役型受容体、または 該受容体の機能的に同等な断片をコードする、単離したポリヌクレオチド分子を 提供する。 好ましくは、該ポリヌクレオチド分子は約693アミノ酸からなるヒトTSR32受容 体をコードする。 より好ましくは、単離した該ポリヌクレオチド分子は、配列番号：２に示した ものに実質的に相当するアミノ酸配列を含むヒトTSR32受容体、またはその機能 的に同等な断片をコードする。 第一の態様のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、配列番号：３また は配列番号：４に示したものに実質的に相当する、またはこれと少なくとも75％ （好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％）の配列同一性 を示すヌクレオチド配列、あるいは機能的に同等なTSR32受容体断片をコードす るその任意の部分を含むことができる。 該ポリヌクレオチド分子は、プラスミドまたは発現ベクター（ウイルスベクタ ーを含む）に組み込み、これを適切な宿主細胞（例えば細菌、酵母、昆虫および 哺乳動物の宿主細胞）に導入することができる。このような宿主細胞は、上記単 離したポリヌクレオチド分子によってコードされたTSR32受容体を発現させるた めに使用することができる。 従って、第二の態様において、本発明は、第一の態様のポリヌクレオチド分子 を用いて形質転換した宿主細胞を提供する。 第三の態様において、本発明は、TSR32受容体または機能的に同等なその断片 を産生する方法を提供する。この方法は、上記ポリヌクレオチド分子を発現させ ることができる条件下において前記第二の態様の宿主細胞を培養すること、およ び任意で上記TSR32受容体またはその断片を回収するステップを含む。 好ましくは、上記宿主細胞は哺乳動物もしくは昆虫由来のものである。哺乳動 物由来の細胞である場合、現在のところはチャイニーズハムスター卵巣（CHO） 細胞またはヒト胚腎（HEK）293細胞であるのが好ましい。昆虫由来の細胞である 場合、現在のところは昆虫Sf9細胞であるのが好ましい。 好適な実施形態において、TSR32受容体またはその断片は、宿主細胞の表面上 に発現させる。 本発明のポリヌクレオチド分子は、多くの組織型において発現され、それゆえ 種々の系に関与し得るため、臨床的にも商業的にも興昧深いものとなり得る、セ クレチン受容体ファミリーの新しいサブファミリーである。 本発明のポリヌクレオチド分子を用いることにより、TSR32受容体タンパク質 または機能的に同等なその断片を実質的に純粋な形で得ることが可能である。 従って第四の態様では、本発明は、以下のＮ末端アミノ酸配列： MTPQSLLQTT(配列番号：１) により特徴付けられるTSR32と呼ばれるＧタンパク質共役型受容体、または機能 的に同等なその断片を、実質的に純粋な形で提供する。 好ましくは、精製したTSR32受容体は、配列番号：２に示したものに実質的に 相当するアミノ酸配列を有する。 第五の態様において、本発明は、第四の態様のTSR32受容体に特異的に結合す ることができる抗体または抗体の断片を提供する。 該抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよいが、現在の ところはモノクローナル抗体であるのが好ましい。適切な抗体断片には、Fab、( F(ab')₂およびscFvが含まれる。 第六の態様において、本発明は、本発明の第一の態様のポリヌクレオチド分子 を用いて形質転換した、非ヒト動物を提供する。 第七の態様において、本発明は、TSR32受容体のアゴニストおよび／またはア ンタゴニスト化合物を検出するための方法を提供する。この方法は、TSR32受容 体、機能的に同等なその断片、または第一の態様のポリヌクレオチド分子で形質 転換しかつこれを発現する宿主細胞を、該TSR32受容体または機能的に同等なそ の断片を活性化することができる条件下において試験化合物と接触させること、 およびTSR32受容体または機能的に同等なその断片の活性の増減を検出すること 、を含む。 該受容体または機能的に同等なその断片の活性の増減は、特異的アゴニストま たはアンタゴニストを有する該受容体またはその断片を活性化させたあとのCAMP 生成量、CA²⁺レベル、またはIP3の代謝回転の変化を測定することにより検出す ることができる。 他の態様では、本発明は、10以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を 含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブを提供する。前記プロ ーブは、該プローブが高ストリンジェンシー条件のもとで第一の態様のポリヌク レオチド分子に特異的にハイブリダイズするようなヌクレオチド配列を含む(Sam brookら、Molecular Cloning:a laboratory manual,Second Edition,Cold Sprin g Harbor LaboratoryPress)。 好ましくは、上記プローブは標識される。 さらに他の態様において、本発明は、mRNA分子の翻訳を妨げるように、TSR32 受容体をコードするmRNA分子に特異的にハイブリダイズすることができるヌクレ オチド配列を含むアンチセンスポリヌクレオチド分子を提供する。 このようなアンチセンスポリヌクレオチド分子には、それがハイブリダイズさ れるmRNAを触媒として不活性化するためのリボザイム領域が含まれていても良い 。 本発明の第一の態様のポリヌクレオチド分子は、例えば内因性TSR32受容体の 活性を減少または消去することにより表現型の変更を引き起こす遺伝子産物をコ ードする、ドミナントネガティブ変異体であっても良い。 アミノ酸配列に関して本明細書中で使用する「実質的に相当する」という用語 は、アミノ酸配列におけるTSR32受容体の生物学的活性を減少させない微小な変 異を含むことを意図する。これらの変異には、保存的アミノ酸置換も含まれる。 想定される置換は、以下の通りである。 G,A,V,I,L,M;D,E;N,Q;S,T;K,R,H;F,Y,W,H; およびP,Nα-アルカルアミノ酸 ヌクレオチド酸配列に関して本明細書中で使用する「実質的に相当する」とい う用語は、DNAコードの縮重によるコードされたタンパク質の変化を生じないヌ クレオチド配列中の微小な変異を包含することを意図する。さらに、この用語は 、特定の系において発現を強化するのに必要となりうる配列中の他の微小な変異 であって、該変異がコードされたタンパク質の生物学的活性を減少させないもの を包含することを意図する。 本明細書中で使用する「機能的に同等な断片」という用語は、TSR32受容体の 断片であって、該断片の起源である完全長受容体と実質的に同等な結合特異性お よび活性を示すもの、を指すことを意図する。 本明細書中において使用する「含む」という用語は、記載したステップ、構成 要素または特徴または複数のステップのグループ、さらにステップを含むもしく は含まない複数の構成要素または複数の特徴、構成要素または特徴または複数の ステップのグループ、構成要素または特徴の包含を意図する。図面の簡単な説明 図１は、ヒトTSR32受容体をコードするcDNAのヌクレオチド配列を提供し、予 想されるアミノ酸配列を含む。 図２は、ヒトTSR32受容体のアミノ酸配列とヒト精巣上体特異的HE6受容体のア ミノ酸配列の配列アラインメントを提供する(Osterhoff,C.,DNA and Cell Biolo gy,Vol.16No.4,1997)。実施例 ヒトグルカゴン様ペプチド受容体（GLP1)ファミリー内の保存領域に対応する 縮重オリゴヌクレオチドを使用して、様々なcDNAライブラリーのDNAから特定のD NA配列を増幅した。ヒト視床下部および心臓由来のライブラリーDNAは予想した サイズの断片を産生した。これらの断片をサブクローン化し、配列決定した。45 6bp長のある断片から、セクレチン受容体ファミリーの遠縁である新規な7TM受容 体配列が明らかとなった。高ストリンジェンシー条件下でこの断 片を用いてヒト心臓cDNAライブラリー（Stratagene）をスクリーニングし、２つ の陽性ハイブリダイズクローン（それぞれのサイズは1kbおよび2.9kb）を同定し た。このうち大きい方のクローンは、693アミノ酸長タンパク質（TSR32と呼ばれ る）をコードする2079個のヌクレオチドからなるオープンリーディングフレーム を含む。このヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を図１に表す。 EMBL/GenBankデータベースの検索により、TM7受容体のセクレチン受容体ファ ミリーに対する低いにも拘わらず有意である配列類似性が明らかとなった。上記 受容体配列に対する該配列の類似性は約25％の同一性しか有さず、また該膜貫通 領域に限られる。しかし、他の４つのＧタンパク質共役型受容体サブタイプ、ヒ ト精巣上体特異的HE6(31％の同一性)、ヒトリンパ球抗原CD97(33％の同一性)、 オーファンヒト受容体EMR1(27％の同一性)、昆虫DHR（26％の同一性）およびラ ットラトロフィリン（latrophilin）関連タンパク質１前駆体（35％の同一性） にもっとも高い全体的な配列類似性が発見された。これら全ては、多数の推定O- およびN-グリコシル化部位を有する大きな細胞外ドメインを共有する。DHRを除 く全ての受容体の中には、第一膜貫通ドメインに先行するシステインモチーフが ある。さらに、CD97およびEMR1受容体とは対照的に、TSR32は細胞外ドメインの 中にEGF-ドメインやカルシウム結合部位を全く含まない。 興味深いことに、遺伝子レベルでは、少なくとも膜貫通ドメインをコードする 領域内のTSR-32コードcDNAのエキソン/イントロン構成は、PACAP受容体ファミリ ーの遺伝子構造に最も良く似ている(この場合、エキソンとイントロンとの境界 は少ないが同一である)。 ノーザン分析は、腎臓、肺、小脳および心臓を含む、種々の組織における低レ ベルの受容体mRNA発現を示す。しかし、甲状腺において最高レベルのmRNAが見ら れた。受容体mRNAのこの発現パターンは、TSR32が甲状腺を介する体内の代謝調 節において重要な機能を有するこをと示す。 TSR32の遺伝子を、in situハイブリダイゼーションによりヒト第16q31染色体 にマッピングし、この局在化を放射線ハイブリッド分析により確認した。常染色 体劣性疾患(Bardet Biedl Syndrome;Kwitek-Black,A.E.ら、Nature Genetics 5: 392-396，1993)もまた、この領域に関連付けられた。この症候群の特徴は、 肥満、網膜変性、性機能低下症および精神遅滞を含む。In situハイブリダイゼ ーションおよびノーザン分析により調べたTSR32の発現は、TSR32をこの遺伝子座 の有力候補物質とするBardet Biedl症候群において侵された組織と強くオーバー ラップする。 広範囲に記載した発明の精神および範囲から逸脱することなく、具体的な実施 の形態に示したような本発明に多くの変更および/または改変を行い得ることが 当業者には理解できよう。従って、本発明の実施の形態は、全ての態様において 例示的なものであり、限定的なものではないとみなされるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下のＮ末端アミノ酸配列 MTPQSLLQTT（配列番号：１） により特徴付けられる、Ｇタンパク質共役型受容体または該受容体の機能的 に同等な断片をコードする単離したポリヌクレオチド分子。 ２．前記ポリヌクレオチド分子がヒト由来の約693アミノ酸長Ｇタンパク質共役 型受容体をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。 ３．前記ポリヌクレオチド分子が、配列番号：２に記載されたものに実質的に相 当するアミノ酸配列を含むＧタンパク質共役型受容体をコードする、請求項 ２に記載のポリヌクレオチド分子。 ４．前記ポリヌクレオチド分子が、配列番号：３または配列番号：４に示される ものと少なくとも75％の配列同一性を示すヌクレオチド配列または機能的に 同等な受容体断片をコードするその部分を含む、Ｇタンパク質共役型受容体 をコードする単離したポリヌクレオチド分子。 ５．前記ポリヌクレオチド分子が、配列番号：３または配列番号：４に示される ものと少なくとも90％の配列同一性を示すヌクレオチド配列または機能的に 同等な受容体断片をコードするその部分を含む、請求項４に記載のポリヌク レオチド分子。 ６．前記ポリヌクレオチド分子が、配列番号：３または配列番号：４に示される ものと少なくとも95％の配列同一性を示すヌクレオチド配列または機能的に 同等な受容体断片をコードするその部分を含む、請求項５に記載のポリヌク レオチド分子。 ７．請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子を含むプラスミ ドまたは発現ベクター。 ８．請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子を用いて形質転 換した宿主細胞。 ９．前記細胞が哺乳動物または昆虫の細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。 10．前記細胞がチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ヒト胚腎（HEK） 293細胞または昆虫Sf9細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。 11．前記細胞がＧタンパク質共役型受容体または機能的に同等なその断片を前記 細胞上に発現する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の宿主細胞。 12．以下のＮ末端アミノ酸配列： MTPQSLLQTT（配列番号：１） により特徴付けられる、実質的に純粋な形のＧタンパク質共役型受容体また は該受容体の機能的に同等な断片。 13．前記受容体が約693アミノ酸からなるヒト受容体である、請求項12に記載の 受容体。 14．前記受容体が、配列番号：２に記載のものに実質的に相当するアミノ酸配列 を有する、請求項13に記載の受容体。 15．請求項12〜14のいずれか１項に記載のＧタンパク質共役型受容体に特異的に 結合する抗体またはその断片。 16．請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド分子を用いて形質転 換された非ヒト動物。 17．請求項12〜14のいずれか１項に記載のＧタンパク質共役型受容体または請求 項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子で形質転換されてこれを発現す る宿主細胞を、該受容体を活性化させることができる条件下において試験薬 と接触させること、および該受容体活性の増減を検出することを含む、Ｇタ ンパク質共役型受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト作用物質を検出す るための方法。 18．10以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド またはポリヌクレオチドプローブであって、該プローブが高ストリンジェン シー条件下において請求項１から６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ ド分子に特異的にハイブリダイズするようなヌクレオチド配列を含む、プロ ーブ。 19．mRNA分子の翻訳を妨げるために、請求項１から６のいずれか１項に記載のポ リヌクレオチド分子によりコードされるＧタンパク質共役型受容体をコード するmRNA分子に特異的にハイブリダイズすることができるヌクレオ チド配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド分子。 20．ポリヌクレオチド分子の発現を可能にする条件下において、請求項８から11 のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養すること、および任意で受容体また は機能的に同等なその断片を回収すること、を含む、請求項12〜14のいずれ か１項に記載のＧタンパク質共役型受容体または機能的に同等なその断片を 産生する方法。