JP2001511641A - Interleukin-5 antagonist - Google Patents

Interleukin-5 antagonist

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ブレザーゲン リミティッド
メドヴェット サイエンス ピーティーワイ．エルティーディー．
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、インターロイキン−５の活性に拮抗しまたはそれを弱めることができるＩＬ−５分子の修飾型および変異型に関する。そして、ＩＬ−５の天然型または突然変異型により惹起される異常な効果を緩和し、軽くしあるいはその他の方法により減少させるためのそれらの使用に関する。   (57) [Summary] The present invention relates to modified and mutant forms of IL-5 molecules that can antagonize or attenuate the activity of interleukin-5. And the use thereof to mitigate, reduce or otherwise reduce the abnormal effects elicited by the native or mutant form of IL-5.

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン−５のアンタゴニスト 本発明は、ＩＬ−５の活性に拮抗したりそれを減少させたりすることができる インターロイキン−５分子の修飾型および変異型に関し、そしてＩＬ−５の天然 型または突然変異型により惹起される異常な効果を緩和し、苦痛を和らげあるい はその他の方法で減少させるためのそれらの使用に関する。 本出願（specification）で言及するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に 対する配列番号(SEQ ID NOs.)は明細書の後に記載する。 本出願を通じて、論旨から別の意味に解すべき場合を除き、「コンプライズ（ comprise）（含む、含んで成る）」という語、あるいは「コンプライジーズ(com prises)」または「コンプライジング(comprising)」などのその変形は、述べら れている要素または実体あるいは要素群または実体群の含有を意味するが、他の 如何なる要素または実体あるいは要素群または実体群の排除を意味するものでは ないと理解されるべきである。 組換えＤＮＡ技術の精巧さが急速に増大したため、医学分野および関連健康分 野における研究および発展が大いに促進されている。 このことは、幾つもの疾病状態が天然型または突然変異型成長因子の異常な効果 に起因しているヘモポエチン成長因子の研究の領域で 特に重要である。 一つの特に重要なヘモポエチン成長因子はＩＬ−５である。この分子はＴ−細 胞および肥満細胞により分泌されるリンホカインであり、糖タンパクのジスルフ ィド結合をしたホモダイマーである。この分子のヒト型はモノマー当たり１１４ 個のアミノ酸を含んでいる。ＩＬ−５は上上、下下配列の４個のα−ヘリックス の束から形成されている。一つの束が一つのモノマーに由来する３個のヘリック スと第２のモノマーに由来する第４のヘリックスとから形成されるＤ−ヘリック ス交換という現象は、ＩＬ−５に独特のものである。ＩＬ−５分子はヘリックス ＡとＢおよびヘリックスＣとＤの間に位置する二つの短い逆平行β−鎖をも含ん でいる。 ヒトおよびネズミのＩＬ−５受容体は二つの異なる鎖、すなわち、α−サブユ ニットおよびβ−サブユニットを含んでいる。ヒトＩＬ−５はこのα−サブユニ ットに結合するが、その結合親和性はβ−鎖と結合すると増大する。ＧＭ−ＣＳ ＦおよびＩＬ−３などの他のサイトカインもこのβ−鎖を共有する。 ＩＬ−５はヒト好酸球の産生および活性化に対し選択性を有するヘモポエチン チン成長因子である。従って、慢性喘息またはＩＬ−５との関係が証明された好 酸球増多症を伴う他の疾病状態またはＩＬ−５と関連する他の状態に対する治療 剤として作用するＩＬ−５のアンタゴニストを開発すべき必要がある。ＩＬ−５ アンタゴニストがＧＭ−ＣＳＦやＩＬ−３などの他のサイトカインの活性を妨害 しないことも重要である。 従って、本発明の一つの側面は、第１のα−ヘリックス内に一つのアミノ酸配 列を含む修飾されたＩＬ−５であって、その第１のα−ヘリックス中の酸性また は酸様の性質を有する露出しているアミノ酸の一つ以上が塩基性アミノ酸残基ま たは非−酸性アミノ酸残基で置換されているものを提供する。 修飾を受けるＩＬ−５は、一般に、ヒト、霊長類、家畜動物（例えば、羊、牛 、豚、馬）、実験室テスト動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ ）、愛玩動物（例えば、犬、猫）および捕獲された野生動物（例えば、カンガル ー、狐、鹿）などから得られる哺乳類起源のものである。ＩＬ−５はヒト起源で あることが最も好ましい。本発明の修飾されたＩＬ−５はグリコシル化されてい てもグリコシル化されていなくてもよく、そしてＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３の 活性を妨害することはない。 より一層具体的にいうと、本発明は第１のα−ヘリックス中のアミノ酸位置１ ３（またはそれと同等の位置）にあるＧｌｕがＡｒｇまたはＬｙｓまたはそれら の化学的同等物または誘導体により置換されているアミノ酸配列を含んでいる修 飾されたヒトＩＬ−５分子に関するものである。別の置換は、ＧｌｎおよびＡｓ ｎまたはそれらの化学的同等物または誘導体などの非−酸性アミノ酸残基を用い て行うこともできるが、これらの残基に限定されるわけではない。「誘導体」は 天然に生ずるアミノ酸残基でも合成アミノ酸残基でもよい。 本発明によれは、上に定義したような修飾されたＩＬ−５分子はＩＬ−５の天 然型のアンタゴニストとして作用すると提唱される。「修飾された」という用語 は、本明細書では、「変異型」、「誘導体」および「突然変異型」などの用語と 同義語と考える。本発明はインビトロで観察されるようなＩＬ−５の分裂促進効 果(mitogenic effects)に対し特異的拮抗作用を示す修飾されたＩＬ−５に特に 関係する。この修飾されたＩＬ−５分子はグリコシル化されていてもグリコシル 化されていなくてもよく、そしてＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３の活性を妨害する ことはない。 従って、本発明の別の側面はＩＬ−５アンタゴニストに関する。該アンタゴニ ストはその第１のα−ヘリックス内に一つのアミノ酸配列を有するＩＬ−５分子 を含んで成るものであって、該第１のα−ヘリックス内の酸性または酸様の性質 を有する露出したアミノ酸の一つ以上が塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ 酸残基で置換されているものである。 より具体的には、本発明は、その第１のα−ヘリックス内の第１３位（または それと同等の位置）にあるＧｌｕがＡｒｇまたはＬｙｓまたはそれらの化学的同 等物またはそれらの誘導体で置換されているＩＬ−５分子を含んで成るＩＬ−５ のアンタゴニストを提供する。別の置換も、ＧｌｎおよびＡｓｎまたはそれらの 化学的同等物または誘導体などの非−酸性アミノ酸残基を用いて行うことができ るが、これらの残基に限定されるわけではない。 本発明の修飾されたＩＬ−５分子は組換え型または合成型である ことが好ましい。その第１のα−ヘリックス内のアミノ酸の置換（単数または複 数）を例外として、ＩＬ−５のアミノ酸配列は天然に生ずる分子（すなわち、天 然の分子）と同一であることができあるいは天然のアミノ酸配列に対する１個ま たは多重の、アミノ酸の置換、欠失および／または付加を持つこともできる。そ れを「突然変異型」ＩＬ−５と呼ぶ。ＩＬ−５の第１α−ヘリックスの構造は２ ．４オングストローム分解能でＸ線結晶学により決定され、それがアミノ酸残基 ７〜２７またはそれらの同等物を含んでいることが明らかにされた（ミルバーン ら、Nature 363:172-176，1993を参照）。本発明の修飾されたＩＬ−５はリーダ ー配列を含んでいてもよくあるいは含んでいなくてもよい。 第１３位にＡｒｇを持つ修飾されたＩＬ−５に対するヌクレオチド配列および 対応するアミノ酸配列は、配列番号：１および配列番号：２および図１に示す。 リーダー配列はアミノ酸１〜６として（Met His Tyr His His His(配列番号：３ )）示してある。従って、アミノ酸７〜２７は配列番号：１および配列番号：２ および図１ではアミノ酸１３〜３３として示される。アミノ酸７〜２７への言及 はリーダー配列なしの分子中のアミノ酸残基番号と解される。アミノ酸７〜２７ に対するアミノ酸配列は、アミノ酸１３がＸａａと表されている点を除き配列番 号：４として示される。本発明によれば、Ｘａａは塩基性アミノ酸残基または非 酸性アミノ酸残基であることが好ましい。 本明細書で「非グリコシル化型」というときは、原核生物（例えば、大腸菌） 中で組換え型として発現された場合のように分子が完 全に非グリコシル化されていることを意味する。また、グリコシレーション欠如 哺乳類細胞を使用することあるいは適当な酵素を用いてインビトロで完全な脱グ リコシレーションを起こすこともできる。異なる哺乳類細胞中で組換え分子が製 造される場合のような異なるグリコシレーションパターンも本発明の中に包含さ れる。 「露出した」アミノ酸とは、本明細書では、分子の内部に向いているアミノ酸 と比べてα−ヘリックスの溶媒に露出した部分または外側にある部分のアミノ酸 を指すために用いられる。 酸性アミノ酸とは、例えば、ＧｌｕおよびＡｓｐを含む。塩基性アミノ酸はＡ ｒｇおよびＬｙｓであることが好ましい。非酸性アミノ酸はＧｌｎおよびＡｓｎ であることが好ましい。 本発明の別の側面によれば、下記の点により特徴付けられる修飾されたＩＬ− ５が提供される。 （ｉ）第１α−ヘリックス内に一つのアミノ酸配列を含む、 （ii）該α−ヘリックス内に、塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残 基で置換されている酸性または酸様性質を有する露出したアミノ酸を一つ以上持 っている、 (iii)組換え型または合成型である、そして (iv)インビトロでＩＬ−５の分裂促進活性と拮抗することができる。 関連する態様では、本発明は下記の点により特徴付けられるＩＬ−５アンタゴ ニストを提供する、 （ｉ）第１α−ヘリックス内に一つのアミノ酸配列を含む、 （ii）該α−ヘリックス内に、塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸 残基で置換されている酸性または酸様性質を有する露出したアミノ酸を一つ以上 持っている、 (iii)組換え型または合成型である、そして （iv）インビトロでＩＬ−５の分裂促進活性と拮抗することができる。 ＩＬ−５突然変異体はグリコシル化型でも非グリコシル化型でもよい。 本発明のこの側面は、一部には、ヒト（ｈ）ＩＬ−５のアミノ酸１３（Ｇｌｕ ）のＡｒｇへの突然変異がインビトロでＩＬ−５の分裂促進効果に拮抗すること ができるｈＩＬ−５変異型を生ずるという発見に基づいている。この変異型は本 明細書では「ＩＬ−５Ａｒｇ13」または「Ｅ１３Ｒ」と呼ばれる。このような変 異型は高親和性受容体に結合することはできないであろうが、ＩＬ−５受容体の 低親和性α鎖にはなお十分に結合することができるであろう。ＩＬ−５Ａｒｇ13 突然変異体がアンタゴニストとして作用し、天然のＩＬ−５の刺激効果を阻止す ることが重要である。ＩＬ−５Ａｒｇ13アンタゴニストの特に重要な用途はイン ビボまたはインビトロでＩＬ−５により媒介される好酸球の刺激および活性化を 弱めあるいはその他の方法で拮抗させる場合のものである。このアンタゴニスト は突然変異をさせた内因性のＩＬ−５により惹起される効果に拮抗することもで きる。本発明は、ＩＬ−５Ｌｙｓ13、ＩＬ−５Ｇｌｎ13およびＩＬ−５Ａｓｎ13 などの他の一連のＩＬ−５突然変異体並 びに機能的に同等な突然変異体にも及ぶ。ＩＬ−５Ａｒｇ13（Ｅ１３Ｒ）のヌク レオチド配列およひ対応するアミノ酸配列は配列番号：１および配列番号：２に 示してある。本発明は、特に好ましい態様では、配列番号：２に実質的に記載さ れたアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドまたは配列番号：１に実質的 に記載されたヌクレオチド配列を有する配列をコードする遺伝配列に及ぶ。 簡略記載法により、本出願においてアミノ酸残基に対して１文字略記および３ 文字略記の両方が使用される。これらは表１に示してある。 特定のアミノ酸残基がＩＬ−５中におけるその位置により参照されるときは、 １文字または３文字アミノ酸略号が上部添字として記す残基番号（例えば、Ｘａ ａn、ここで、Ｘａａはアミノ酸残基である）と共に使用される。ここで「ｎ」 は分子中の残基番号である。 表１ アミノ酸 ３文字略号 対応する １文字略号 アラニン Ａｌａ Ａ アルギニン Ａｒｇ Ｒ アスパラギン Ａｓｎ Ｎ アスパラギン酸 Ａｓｐ Ｄ システイン Ｃｙｓ Ｃ グルタミン Ｇｌｎ Ｑ グルタミン酸 Ｇｌｕ Ｅ グリシン Ｇｌｙ Ｇ ヒスチジン Ｈｉｓ Ｈ イソロイシン Ｉｌｅ Ｉ ロイシン Ｌｅｕ Ｌ リジン Ｌｙｓ Ｋ メチオニン Ｍｅｔ Ｍ フェニルアラニン Ｐｈｅ Ｆ プロリン Ｐｒｏ Ｐ セリン Ｓｅｒ Ｓ スレオニン Ｔｈｒ Ｔ トリプトファン Ｔｒｐ Ｗ チロシン Ｔｙｒ Ｙ バリン Ｖａｌ Ｖ 本発明はＩＬ−５Ａｒｇ13を用いて実証される。しかしながら、これは、本発 明がイン・ビトロでのＩＬ−５に対しあるいはイン・ビトロまたはイン・ビボで の好酸球に対する拮抗性を有する他のすべてのＩＬ−５変異型に及ぶという条件 のもとでなされるものである。 本発明の別の側面によれば、該ＩＬ−５の第１α−ヘリックス中のアミノ酸配 列を含むＩＬ−５変異型が提供される、 ここで、Ｘａａは、好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎより成る群 から選択される塩基性または非酸性アミノ酸残基であり、該変異型ＩＬ−５は対 応する天然型ＩＬ−５の少なくとも一つの性質に対しアンタゴニストとして作用 するものである。配列番号：４により規定されるアミノ酸配列はヒトＩＬ−５の アミノ酸残基７〜２７に対応する。ＸａａはＸａａnであり、ｎはヒトＩＬ−５ のアミノ酸位置１３であることが好ましい。ＸａａnはＡｒｇ13またはその同等 物であることが好ましい。 関連する態様では、本発明はヒトＩＬ−５の第１α−ヘリックスのアミノ酸７ 〜２７を含むポリペプチドまたはその化学的同等物を含んで成るＩＬ−５アンタ ゴニストを提供する、ただし該第１α−ヘリックス中の酸性または酸様性質を有 する露出したアミノ酸の一つ以上が塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残 基で置換され ていることを条件とする。 酸性または酸性様アミノ酸残基がＧｌｕまたはＡｓｐであり、Ａｒｇ、Ｌｙｓ 、ＧｌｎまたはＡｓｎで置換されていることが好ましい。 酸性または酸性様アミノ酸残基がＡｒｇによって置換されていることがより好 ましい。 修飾されたＩＬ−５のアミノ酸配列が配列番号：２に記載されているものであ ることが最も好ましい。 特に好ましい態様では、本発明は、その第１α−ヘリックス中に下記のアミノ 酸配列を有する修飾されたＩＬ−５分子、 ここでＸａａはＡｒｇである、 あるいは、第１α−ヘリックス中における１個または多重の突然変異であって、 ＸａａがＡｒｇであるその突然変異に機能的に類似の拮抗性を与えるものを有す るＩＬ−５分子、 を含んで成るＩＬ−５アンタゴニストに関する。 後者の態様の側面では、ＩＬ−５分子中の突然変異は１個または多重のアミノ 酸の置換、欠失および／または付加であることができ 、あるいは突然変異の中でもとりわけグリコシレーションパターンの変更である こともできる。ＩＬ−５アンタゴニストは配列番号：２に記載されたようなアミ ノ酸配列を含んで成ることが好ましい。 本発明のＩＬ−５アンタゴニスト、そして特にＩＬ−５Ａｒｇ13は、ＩＬ−５ により媒介される好酸球の活性化を防止しまたは弱めることにより、アレルギー 、一部の骨髄性白血病（好酸球性骨髄性白血病などの）、特発性の好酸球症候群 、喘息、鼻炎および皮膚アレルギーなどのアレルギー性炎症を治療するのにとり わけ有用である。これらおよびその他の状態は本明細書では内因性の天然型ＩＬ −５または内因性の自然に生じた突然変異型ＩＬ−５の異常な効果により生じま たは促進されるものと考える。 従って、本発明はこれまで述べてきた修飾されたＩＬ−５、そして特にＩＬ− ５Ａｒｇ13の有効量を該治療を行うのに十分な時間および条件の下で哺乳類に投 与することを含んで成る治療方法を提供する。 この治療は、アレルギー、一部の骨髄性白血病（好酸球性骨髄性白血病などの ）、特発性好酸球症候群、喘息、鼻炎および皮膚アレルギーなどのアレルギー性 炎症の治療の局面で行われることが好ましい。 一般に、治療対象である哺乳類はヒト、霊長類、家畜動物、愛玩動物または実 験室テスト動物である。哺乳類はヒトであることが最 も好ましい。 １種の修飾されたＩＬ−５を投与してもよく、あるいは同一ＩＬ−５の変異型 の組み合わせを投与してもよい。例えば、一連のＩＬ−５変異型はＩＬ−５Ａｒ ｇ13、ＩＬ−５Ｌｙｓ13、ＩＬ−５Ｇｌｎ13およびＩＬ−５Ａｓｎ13の二つ以上 から選択された組み合わせとして使用することができよう。本発明のＩＬ−５変 異型は好酸球増多症そして喘息などのそれから生ずる状態を治療するのに特に有 用である。投与は静脈内投与によるのが好ましいが、一連の他の投与形態も本発 明により予定されており、その中にはＩＬ−５変異型の移植物または制御放出を 可能とする他の形態、噴霧器型または鼻スプレーを経由するものが含まれる。局 所適用の後に浸入を許すＩＬ−５の修飾型も本発明に包含される。 上記のＩＬ−５への修飾に加え、本発明はさらに一群の他のＩＬ−５誘導体を 提供する。 このような誘導体はＩＬ−５ポリペプチドおよび対応する遺伝子配列の断片、 一部、部分、突然変異体、同族体および類似体を含む。誘導体は、ＩＬ−５に対 する１個または多重のアミノ酸の置換、欠失および／または付加あるいはＩＬ− ５をコードする遺伝子配列に対する１個または多重のヌクレオチドの置換、欠失 および／または付加をも含む。誘導体は本来のヌクレオチド(resident nucleoti de)に対する修飾をも予定する。ヌクレオチドの変更は対応するアミノ酸配列の 変更または他の効果の中でもとりわけグリコシレーションパターンの変更を生じ る。アミノ酸配列またはヌクレオチド配 列に対する「付加」には、他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパクとの融合 あるいはヌクレオチド配列への融合が含まれる。本明細書で「ＩＬ−５」という ときは、機能的誘導体すなわちＩＬ−５と免疫学的に相互作用する誘導体を含む その全ての誘導体を指す。このような誘導体はすべて上記の第１α−ヘリックス に対する修飾に加えられるであろう。従って、このような誘導体はＩＬ−５Ａｒ ｇ13、ＩＬ−５Ｌｙｓ13、ＩＬ−５Ｇｌｎ13またはＩＬ−５Ａｓｎ13に加えられ るであろう。 本発明で予定するＩＬ−５の類似体は、側鎖に対する修飾、ペプチド、ポリペ プチドまたはタンパクの合成の間における非天然型アミノ酸および／またはそれ らの誘導体の取り込み、およびタンパク性の分子またはそれらの類似体に対しコ ンホーメーション上の制約を課す架橋剤の使用およびその他の方法の使用を含む が、これらに限定されるわけではない。 本発明はＩＬ−５のアンタゴニストまたはアゴニストとして作用することがで き、あるいはＩＬ−５の機能的類似体として作用することができるＩＬ−５の化 学的類似体をさらに提供する。化学的類自体は必ずしもＩＬ−５から誘導される とは限らず、ある種のコンホーメーション上の類似性を共有するものであること もある。また、化学的類自体はＩＬ−５のある種の物理化学的性質を模倣するよ うに特別に設計することができる。化学的類自体は化学的に合成することができ 、あるいは、例えば、天然産物のスクリーニングの後に検出することができる。 本発明が予定する他の誘導体には、完全にグリコシル化されていない分子から 完全にグリコシル化されている分子まで、そして天然にグリコシル化された分子 から改変されたグリコシレーションパターンを持つ分子までの一連のグリコシレ ーション変異型が含まれる。改変されたグリコシレーションパターンは異なる宿 主細胞中で組換え体分子を発現させることにより得ることができる。 これらのすべての型の修飾が、修飾されたＩＬ−５分子を個体に投与するとき または診断薬として使用するとき、これらを安定化するために重要である。これ らの修飾は修飾されたＩＬ−５分子の拮抗性を付加し、補完し、あるいは他の方 法で促進することができる。 従って、本明細書で「修飾された」ＩＬ−５というときは、第１α−ヘリック ス内に改変されたアミノ酸配列を持つＩＬ−５に対する参照、並びに適当な場合 には、一連のグリコシレーション変異型、分子の他の部分におけるアミノ酸の変 化、分子および融合分子への化学的修飾を持つＩＬ−５に対する参照をも含んで いる。 本発明はこれまで述べてきた修飾されたＩＬ−５分子またはそれらの組み合わ せを含んで成る薬学的組成物をも提供する。 従って、本発明は、修飾されたＩＬ−５を含んで成る薬学的組成物であって、 該修飾されたＩＬ−５が第１α−ヘリックスを有するアミノ酸配列を含むもので あり、該第１α−ヘリックス内の酸性または酸様性質を有する露出したアミノ酸 の一つ以上が塩基性アミノ 酸残基または非酸性アミノ酸残基で置換されているものであり、該組成物が一つ 以上の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤をさらに含むものである 、薬学的組成物を提供する。 関連する態様では、本発明は、修飾されたヒトＩＬ−５または哺乳類のそれら の同族体を含んで成る薬学的組成物であって、該修飾されたＩＬ−５が第１α− ヘリックス内に下記のアミノ酸配列を含んでいるものであり、 Ｘａａが好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎから選択される塩基性 または非酸性アミノ酸残基であり、該組成物が一つ以上の薬学的に許容され得る 担体および／または希釈剤をさらに含むものである薬学的組成物を提供する。Ｘ ａａはＸａａnであり、ｎはアミノ酸位置１３であることか好ましい。Ｘａａは Ａｒｇであることが好ましい。 別の関連する態様では、本発明はＩＬ−５に拮抗することができる薬学的組成 物であって、修飾されたＩＬ−５がその第１α−ヘリックス中に下記のアミノ酸 配列を有するものでありＸａａが好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎから選択されるもので ある組成物を提供する。 ＸａａはＡｒｇであることが好ましい。 この薬学的組成物は、他のＩＬ−５変異型を含む他の薬学的に活性な分子を含 むこともできる。薬学的組成物中の修飾されたＩＬ−５分子および他の成分は、 以下には「活性薬剤」または「活性化合物」と呼ばれる。 注射可能な用途に適する薬学的剤型としては、滅菌水溶液（水に可溶な場合） または滅菌分散剤および滅菌注射可能溶液または滅菌分散剤の即時調製用の滅菌 粉末が挙げられる。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、そ して細菌やカビなどの微生物の汚染作用に対して保護されねばならない。担体は 、例えば、水、マンニトールグリシンまたはそれらの適当な混合液を含む溶媒ま たは分散培地であることができる。微生物の作用の防止は種々の抗細菌剤および 抗カビ剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チ ルメロサル(thirmerosal)および同種のものにより行うことができる。多くの場 合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射 可能な組成物の長期間吸収は組成物中に吸収を遅延させる物質を使用することに より行うことができる。 滅菌した注射可能溶液は、適当な溶媒中の必要な量の活性化合物を上記の他の 成分の必要なもの各種と混合し、その後、濾過滅菌す ることにより調製される。一般に、分散剤は基本分散培地と上記のものの中の必 要な他の成分とを含む滅菌ビークル中に各種の滅菌活性成分を混合することによ り調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、好ましい 調製方法は活性成分プラス必要な付加的成分の粉末をそれらの予め濾過滅菌した 溶液から形成させる真空乾燥法および凍結乾燥法である。マンニトールグリシン は、特別有用な処方剤(formulation)である、そして修飾されたＩＬ−５分子が 静脈滴下により投与される場合に特にそうである。 本発明は鼻スプレーや噴霧器型の吸入に適する剤型にも及ぶ。また、制御放出 用組成物も一連の移植物と同様に調製することができる。適当に修飾すると、こ れらの分子はクリーム、ローションまたはゲルとすることもできる。クリーム、 ローションまたはゲルに適する担体としては、グリセロール、プロピレングリコ ール、液状ポリエチレングリコールおよび同種のものが挙げられるが、これらに 限定されない。 薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤としては、いずれかまたはす べての溶媒、分散培地、そして抗細菌剤および抗カビ剤が挙げられる。薬学的に 活性な物質のためのこのような培地や物質の使用は当技術分野でよく知られてい る。通常の培地や物質がこの活性成分と配合禁忌である場合を除き、治療用組成 物におけるそれらの使用は本発明によって予定されている。補足的な活性成分を この組成物中に組み込むこともできる。 投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与量単位剤型とし て非経口的組成物を製剤化することは特に有利である。投与量単位剤型とは、本 明細書で使用されるとき、治療対象である哺乳類のために単一の投与量として適 する物理的に区別された単位を指す。各単位は望まれる治療上の効果をもたらす ように計算された活性物質の予め計量された量を必要な薬学的担体と共に含んで いる。本発明の新規な投与量単位剤型のための仕様は、（ａ）活性物質のユニー クな特性および達成すべき特定の治療上の効果、および（ｂ）ＩＬ−５分子また はＩＬ−５レベルの異常に関係しそしてそれにより促進される疾病状態を有する 生命体の病気の治療のためのこのような活性物質を調合する技術に固有の制約、 により左右されそして直接依存する。 主要な活性成分は、便利で効果的な投与ができるように、これまでに開示され たような投与量単位剤型中に適当な薬学的に許容され得る担体と共に有効量が調 合される。単位投与量剤型は、例えば、主要な活性化合物を０．５μｇから約２ ０００ｍｇ／ｍｌの範囲の量で含むことができる。割合で表すと、活性化合物は 一般に担体１ｍｌ当たり約０．５μｇから約２０００ｍｇまで存在する。補足的 な活性成分を含む組成物の場合には、投与量は該成分の通常投与量および投与方 法を参照することにより決定される。 薬学的組成物は標的細胞をトランスフェクトすることができるベクターなどの 遺伝子分子を含むこともできる。ここで、ベクターは修飾されたＩＬ−５の発現 または修飾されたＩＬ−５の活性を調節することができる核酸分子を担っている ものである。かかるベクターは、例えば、ウイルスベクターであることができる 。 本発明のさらに別の側面は、修飾されたＩＬ−５分子およびそれらの誘導体に 対する抗体に関する。このような抗体はモノクローンまたはポリクローンである ことができ、そして修飾されたＩＬ−５またはそれらの誘導体にたいして特異的 に産生させることができる。後者の場合には、修飾されたＩＬ−５またはその誘 導体はまず担体分子と混合することが必要であるかも知れない。本発明の抗体お よび／または組換え修飾ＩＬ−５またはその誘導体は治療剤または診断薬として 特に有用である。 例えば、修飾されたＩＬ−５およびその誘導体はＩＬ−５に対して天然に生ず る抗体をスクリーニングするために使用することができる。これらは、例えば、 自己免疫疾患の一部に起こり得る。また、特異的抗体は修飾されたまたは突然変 異型のＩＬ−５をスクリーニングするために使用することができる。このような 検定のための技法は当技術分野でよく知られており、例えば、サンドイッチ検定 法およびＥＬＩＳＡが例示できる。ＩＬ−５レベルの知識はある種の癌または癌 の素因の診断のためまたは修飾されたＩＬ−５分子が用いられるときの治療プロ トコルを監視のために重要であり得る。 本発明の修飾されたＩＬ−５に対する抗体は、モノクローンまたはポリクロー ンであり得る。また、Ｆａｂ断片のような抗体の断片も使用することができる。 さらに、本発明は組換え抗体および合成抗体にも及び、そして抗体ハイブリッド にも及ぶ。「合成抗体」とは本明細書では抗体の断片およびハイブリッドをも含 むものと考え る。本発明のこの側面の抗体は免疫治療において特に有用であり、アポプトシス (apoptosis)を評価するためあるいは治療法のプログラムを監視するための診断 用具として使用することもできる。 例えば、特異的抗体は修飾されたＩＬ−５タンパクをスクリーニングするため に使用することができる。後者は、例えば、細胞抽出物または他の生物体液中の 修飾されたＩＬ−５のレベルをスクリーニングするためのまたは組換え手段によ り作られた修飾されたＩＬ−５を培養上清から精製するための手段として重要と なるであろう。本明細書で予定される検定のための技法は当技術分野で公知であ り、例えば、サンドイッチ検定法およびＥＬＩＳＡが含まれる。 最初に述べた上記の抗体に対する第２の抗体（モノクローン、ポリクローンま たは抗体の断片または合成抗体）のいずれかを含めることも本発明の範囲内であ る。第１および第２の抗体は両方とも検出検定に使用することができ、あるいは 第１の抗体は市販されている抗免疫グロブリン抗体と共に使用することができる 。本発明で予定される抗体は修飾されたＩＬ−５の何らかの部分に対して特異的 な如何なる抗体をも含む。 ポリクローンおよびモノクローン抗体は両方とも酵素またはタンパクで免疫化 することにより得ることができ、そしていずれのタイプも免疫検定に利用するこ とができる。両方のタイプの血清を得る方法は、当技術分野でよく知られている 。ポリクローン血清はあまり好ましくないが、適当な実験室動物に修飾されたＩ Ｌ−５またはそれらの抗原性部分の有効量を注射し、その動物から血清を集め、 そして公知の免疫吸着法のいずれかにより特異的血清を単離することにより比較 的容易に調製することができる。この方法により調製される抗体はどのタイプの 免疫検定にも実際に利用することができるが、これは調製物の潜在的不均一性の ため一般的にはあまり好ましくない。 免疫検定におけるモノクローン抗体の使用は、それを大量に製造する能力と生 産物の均一性のために特に好ましい。不死化細胞系と免疫原調製物に対し感作さ れたリンパ球の融合により誘導されるモノクローン抗体製造のためのハイブリド ーマ細胞系の調製は、当技術分野の熟練者によく知られている技法により行うこ とができる。 本発明の別の側面はある主体から得られた生物試料中の修飾されたＩＬ−５を 検出する方法であって、修飾されたＩＬ−５またはその誘導体または同族体に対 して特異的な抗体と該生物試料を、抗体ー修飾されたＩＬ−５複合体が形成する のに十分な時間および条件の下で接触させる工程、および次いで該複合体を検出 する工程を含んで成る方法を提供する。 本発明は、修飾されたＩＬ−５遺伝子またはその誘導体を検出するためのＰＣ Ｒ分析を含むような遺伝子検定法をも提供する。別の方法としては、一本鎖ＤＮ Ａ高次構造多型（ＳＳＣＰ）や特異的オリゴヌクレオチドハイブリッド形成など の直接ヌクレオチド配列決定または突然変異走査(mutation scanning)が含まれ る。 本発明は本発明の修飾されたＩＬ−５をコードする核酸分子に及ぶ。このよう な核酸分子はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。核酸分子がＤＮＡ形であ るときは、それはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであることができる。本発明の核 酸分子のＲＮＡ形は一般にｍＲＮＡである。 本発明の核酸分子は一般に単離された形態であるが、ベクター分子、特に発現 ベクター分子などの他の遺伝子分子に取り込まれ、あるいは連結されあるいはそ の他の方法で融合または結合されていることもできる。ベクターおよび発現ベク ターは一般に複製することができ、そして適用可能であれば、原核細胞または真 核細胞の一つまたは両方の中で発現することができる。原核細胞は大腸菌、バチ ルス種(Bacillus sp)およびシュードモナス種(Pseudomonas sp)を含むことが好 ましい。好ましい真核細胞としては、酵母細胞、カビ細胞、哺乳類細胞および昆 虫細胞が挙げられる。 従って、本発明の別の側面は遺伝子構築物であって、ベクター部分と哺乳類の 、より好ましくはヒトの修飾されたＩＬ−５遺伝子部分とを含んで成り、該修飾 されたＩＬ−５遺伝子部分が修飾されたＩＬ−５ポリペプチドまたは機能的にま たは免疫学的に相互作用し得るその誘導体をコードすることができるものである 遺伝子構築物を提供する。 上記遺伝子構築物の修飾されたＩＬ−５遺伝子部分は、ベクター上のプロモー ターに機能的に連結されており、該プロモーターが適当な細胞中で該修飾されＩ Ｌ−５遺伝子部分の発現を制御すること ができるようなものであることが好ましい。 さらに、この遺伝子構築物の修飾されたＩＬ−５遺伝子部分は、グルタチオン −Ｓ−トランスフェラーゼまたはその一部をコードするヌクレオチド配列などの 別の遺伝子配列に融合された遺伝子のすべてまたは部分を含むこともできる。 従って、本発明の別の側面は、修飾されたＩＬ−５をコードするまたはそれを コードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって 、該修飾されたＩＬ−５が第１α−ヘリックスを持つアミノ酸配列を含んでおり 、該第１α−ヘリックス中の酸性または酸様性質を有する露出したアミノ酸の一 つ以上が塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残基で置換されているもので ある単離された核酸分子を提供する。 上記ヌクレオチド配列は、下記のアミノ酸配列を第１α−ヘリックス中に含む ヒトの修飾されたＩＬ−５または哺乳類の同族体をコードするものであり、 Ｘａａが好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎから選択される塩基性 または非酸性のアミノ酸残基であり、該修飾されたＩＬ−５がＩＬ−５により誘 発される分裂促進効果に対し拮抗作用を示すものであることが好ましい。Ｘａａ はＸａａnであり、ｎはア ミノ酸位置１３であることが好ましい。ＸａａはＡｒｇであることが好ましい。 本発明はこのような遺伝子構築物に及び、そして該遺伝子構築物を含む原核細 胞または真核細胞に及ぶ。 本発明は、アレルギー、一部の骨髄性白血病（好酸球性骨髄白血病など）、特 発性好酸球症候群、喘息、鼻炎および皮膚アレルギーなどのアレルギー性炎症の 治療のための治療薬の製造における、これまで述べてきた修飾されたＩＬ−５の 使用をさらに提供する。 本発明は下記の非限定的な実施例および／または図面を参照することによりさ らに説明する。 図面の簡単な説明 図１は（ａ） ＩＬ−５Ｅ１３Ｒ細菌発現プラスミドであるｐＰＰ３１の図式 的表示であり、そして（ｂ）ＭＨＹＨ3−ＩＬ−５（Ｅ１３Ｒ）のＤＮＡ／アミ ノ酸配列である。Ｅ１３Ｒ突然変異は丸で囲んである。 図２はＩＬ−５により媒介されるＴＦ１．８細胞の増殖に拮抗する能力を測定 するためのＥ１３Ｒの滴定を示すグラフ表示である。 図３ＡはＩＬ−５により媒介されるＴＦ１．８細胞の増殖に拮抗する能力を測 定するためのＥ１３Ｒの滴定を示す。この数値はＥ１３Ｒが検出可能なアゴニス ト活性を示さないことをも示す。 図３ＢはＥ１３ＲがＩＬ−３により媒介されるＴＦ１．８細胞の増殖に拮抗し 得ないことを示す。 図３ＣはＥ１３ＲがＧＭ−ＣＳＦにはり媒介されるＴＦ１．８細胞の増殖に拮 抗し得ないことを示す。 図４はＴＦ１．８細胞に対する分裂促進効果を測定するためのＩＬ−３の滴定 を示すグラフ表示である。そして、高レベルのＥ１３Ｒがこの活性を妨害し得な いことを示す。 図５はＩＬ−５に対するＴＦ１．８の増殖試験を示すグラフ表示である。 ＷＴＩＬ−５（ＨＩ）は細菌中の封入体として調製し、２Ｍ尿素中でダイマー とし、逆相ＨＰＬＣで精製し、ＰＢＳ中でバッファー交換で濃縮した。決して乾 燥させなかった。 ＩＬ−５ＷＴはＷＴＩＬ−５（ＨＩ）と同様にして調製したが、濃縮後に調製 物を乾燥し、２５ｍＭグリシンおよび１．２５ｍｇ／ｍｌのマンニトール中に溶 解した点で異なる。 図６はＴＦ１．８細胞に対する分裂促進効果を測定するためのＧＭ−ＣＳＦの 滴定を示すグラフ表示であり、高レベルのＥ１３Ｒがこの活性を妨害し得ないこ とを示す。 図７はＥ１３ＲがＩＬ−５により誘発される好酸球抗体依存性細胞により媒介 される細胞毒性を阻害することを示すグラフ表示であ る。 ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５が存在しない場合は、51Ｃｒ-放出％は４％であ った。 図８はＥ１３ＲがＩＬ−５により誘発される好酸球コロニー形成を阻害するこ とを示すグラフ表示である。 ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５が存在しない場合は、好酸球コロニーは検出され なかった。実施例１ ＩＬ−５−アンタゴニスト活性を有する、 インターロイキン−５（ＩＬ−５）の荷電逆転突然変異体の製造 本発明者らは、１３位のグルタミン酸残基（Ｅ１３）がアルギニン残基（Ｒ） で置換されているＩＬ−５の荷電逆転突然変異体〔Ｅ１３Ｒ〕を発現させ、精製 した。この突然変異体、Ｅ１３Ｒ、はイン・ビトロでＩＬ−５の分裂促進効果に 対し特異的な拮抗作用を示す。発現を最大にするため、このタンパクは、現在、 リーダー配列であるＭＨＹＨ3（ＭＨＹＨＨＨ）（配列番号：３）との融合タン パクとして発現させている。このリーダー配列は、配列番号：１および２中のア ミノ酸１〜６を含んでいる。しかしながら、このリーダー配列の除去（または別 のリーダー配列によるその置換）がＥ１３Ｒの拮抗効果に悪影響を与えると信ず べき理由はない。ＭＨＹＨ3およびＥ１３Ｒの配列の図式的表示は図１に示して ある。Ｅ１３Ｒのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は配列番号：１ および２に示してある。 実施例２ ＭＨＹＨ3ＩＬ−５（Ｅ１３Ｒ）をコードする 細菌発現プラスミドの製造 ヒトＩＬ−５Ｅ１３Ｒ突然変異体の解読配列はＩＬ−５野生型配列から部位特 異的突然変異誘発により誘導された。 コドン１３はＡｒｇコドンに変換した。 ここにリストした付加的なコドン変化は、大腸菌における翻訳効 率を増加させるための細菌のコドン優先に基づくものであり、アミノ酸の変化を もたらすものではなかった。 突然変異体のＤＮＡ断片は、プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により 修飾して、５’末端にリーダーＭＨＹＨ3、３’末端に停止コドンをコードする 配列を作成した。増幅された断片をプラスミドｐＥＣ６１１中にサブクローニン グして、ｔｒｃプロモーターを含む発現プラスミドｐＰＰ３１を作成した。 実施例３ ＭＨＹＨ3ＩＬ−５（Ｅ１３Ｒ） の生産、単離および再生（refolding） 醗酵は流加培養法（Fed-Batch method）で行う。Ｅ１３Ｒ−発現プラスミドで あるｐＰＰ３１で形質転換された大腸菌ＭＭ２９４／ｐＡＣＹＣＬａｃＩqを３ ７℃で最小培地に生育させる。ｐＨは細菌が成長する間ＮＨ4ＯＨの添加により ｐＨ７．０に一定に保つ。 ＩＬ−５（Ｅ１３Ｒ）の発現は高細胞密度（ＯＤ600＞２０）でＩＰＴＧの添加 かまたは乳糖の添加かのいずれかにより誘導される。誘導は５時間（誘導期を含 まず）続けると、タンパクは不溶性の封入体（ＩＢｓ）として発現する。細胞を 高圧ホモジナイゼーションにより溶解する。細胞断片から不溶性封入体の一次分 離はディフレンシャル セントリフュゲーションにより行い、その後不溶性封入 体を洗浄し、もう一度ホモジナイズする。最終的遠心分離工程により、再生用に は十分にきれいな不溶性封入体が単離される。 醗酵、誘導、単離および再生の諸条件は下記のようなものである。 １．醗酵 Ａ．接種 １． ｐＰＰ３１を保持する大腸菌ＭＭ２９４／ｐＡＣＹＣｌａｃＩqをアンピ シリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含む最小 培地プレート上に−８０℃グリセリンストックから塗布し、３７℃で一晩成長さ せた。 ２． 誘導物質をふくむ２０ｍｌ振盪フラスコ培養物の顕微鏡検査により、また は誘導物質の存在下または非存在下に寒天プレート上でのコロニーサイズにより 、多数のコロニーについてＩＬ−５（Ｅ１３Ｒ）の発現レベルを評価した。誘導 物質としてはＩＰＴＧを用いた。 ３． 寒天プレートから選択された１個のコロニーを、アンピシリ ン（１００μｇ／ｍｌ）＋カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含む窒素の豊富な 最小培地（２）２０ｍｌ中に移植し、振盪しながら、３７℃で一晩培養した。 ４． ２２リットル醗酵槽中で１０リットルのＣ２を滅菌し、一晩培養を極めて 低い密度で接種した。成長は３７℃で行い、ｐＨはＮＨ4ＯＨまたはＨ2ＳＯ4の 添加により７．０に維持された。 ５． 振盪は手動で制御し、通気は酸素飽和レベルで自動的に制御し１０％ｖ／ ｖｐＯ2以上を維持するようにした。１６〜２０時間でグルコースが枯渇した後 、菌体に付加的な塩を含む濃グルコース溶液をフィードした。栄養素のフィード 流速はｐＨまたは酸素飽和レベルにより決定された。Ｂ．誘導 １． Ａ600＝＞２０という光学密度で、Ｅ１３Ｒアンタゴニストの組換え体発 現が誘導された。この場合、乳糖系の栄養素フィードに変えることにより誘導を 行った。誘導は３７℃、ｐＨ７．０で５時間継続させた。試料を誘導直前および 誘導後１時間ごとに採取して不溶性封入体の存在を顕微鏡で検査した。そのサイ ズはディスク遠心分離により測定した。 ２． 培養物は４℃で一晩貯蔵した。 ２． ＩＬ−５（Ｅ１３Ｒ）封入体の一次単離 １．ホモジナイゼーション−工程１ 培養物はガウリン３０ＣＤホモジナイザーを１３，５００ｐｓｉで５回通過さ せた。通過の間、ホモジネートは冷却した。次いで、ホモジネートを等容量のＲ ＯＨ2Ｏで希釈した。 不溶性封入体のサイズはディスク遠心分離で再測定した。 ２．遠心分離−工程１ ホモジネートはウエストファリアＳＢ−７セパレーター中で、不溶性封入体の サイズにより定められる流速で、９，２１０ｒｐｍの一定速度で遠心分離した。 この第１工程から集められた濃縮物は２．５％ｗ／ｖまたはそれ以下に希釈さ れた。 ３．ホモジナイゼーションー工程２ 不溶性封入体の懸濁液を１３，５００ｐｓｉでガウリン３０ＣＤホモジナイザ ーを１回通過させた。 不溶性封入体のサイズは再度ディスク遠心分離により測定された。 ４．遠心分離−工程２ ホモジネートをウエストファリアＳＡ−１セパレーター中で、不溶性封入体の サイズにより定められる流速で、９，７００ｒｐｍの一定速度で遠心分離した。 再生のために、不溶性封入体をまず５〜１０ｍＭジチオスレイトールを含みｐ Ｈ９．５に緩衝化された６Ｍグアニジン−塩酸中に溶解する。ＭＨＹＨ2ＩＬ− ５（Ｅ１３Ｒ）の還元型ＩＬ−５モノマーを次に５ｍＭジチオスレイトールを含 みｐＨ９．５に緩衝化された６Ｍグアニジン−塩酸中、ゲル濾過クロマトグラフ ィー（Size Exclusion Chromatography）(例えば、Superose 12(ファルマシア)) により、非還元タンパクから精製する。精製された還元型モノマーは、次にｐＨ ９．５に緩衝化された２Ｍ尿素中に、最終タンパク濃度が０．０１〜０．１ｍｇ ／ｍｌまで希釈することにより、ダイマーに再生される。正確に畳み込まれたダ イマーの精製は、適当なカラム（例えば、ブラウンリーのブチル−シリカ、緩衝 液Ａとして水中０．１％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および緩衝液Ｂとし てアセトニトリル中０．１％ｖ／ｖＴＦＡを用いるもの）を用いる高速液体クロ マトグラフィー（ＨＰＬＣ）上の逆相クロマトグラフィーにより行う。精製され た、正確に畳み込まれたタンパクは賦形剤として添加されたマンニトールおよび グリシンの存在下にＨＰＬＣ緩衝液から凍結乾燥後に生物学的バッファ中に回収 することができる。精製されたタンパクの同定は質量分析およびＮ−末端配列決 定を用いて確認することができる。 実施例４ ＩＬ−５に対する拮抗活性の検定 Ｅ１３ＲによるＩＬ−５拮抗作用についての生物学的検定はＩＬ−５により誘 導される細胞増殖を検出するため放射標識化チミジンの取り込みを利用する。使 用する細胞系、ＴＦ１．８は、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦに対する受容体を発 現するヒト赤白血病細胞系 であるＴＦ１のサブラインである。ＴＦ１．８はＩＬ−５受容体の発現に対して 選択されたという点でＴＦ１と異なっている。ＩＬ−５によるＴＦ１．８増殖の 刺激はＥ１３Ｒの３０倍過剰の存在下では５０％まで阻害され、そして３００倍 過剰の存在下では絶滅させられる（図２）。しかしながら、ＩＬ−３またはＧＭ −ＣＳＦによるＴＦ１．８増殖の刺激はＥ１３Ｒのの存在により影響を受けない 。これらの結果はＥ１３ＲがＩＬ−５の特異的なかつ強力なアンタゴニストであ ることを証明するものである。 検定（１５００ｒｐｍ／５ｍｉｎ／ＲＴ）前に、細胞を２４時間洗浄し、 ついでそれをサイトカインを含まない培地に再懸濁する。 上記の培養培地に標準液および試料を必要な濃度に（例えば、１０００ ｎｇ／ｍｌ〜１ｐｇ／ｍｌの範囲で）希釈する。 希釈は３連で行った。 滅菌した９６穴平底ミクロタイタープレート中に１００μｌの最終容量 で、適当な標準液（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−５、など）および試料の希 釈液を等分に分配する。 洗浄した細胞の生存性をチェックし、ついで５×１０4細胞／穴の濃度 で細胞を再懸濁する。 各穴は希釈された標準液／試料の１００μｌ＋再懸濁細胞の１００μｌ を含む。 プレートは、加湿ＣＯ2インキュベーター中で３７℃で７２時間インキュ ベートする（ＴＦ−１およびＴＦ１．８細胞に対しては４８時間）。 細胞を3Ｈ−チミジン（貯蔵液を１／２０希釈し、ついで穴当たり１０μ ｌ添加する）０．５μＣｉ／穴でパルスする。 加湿ＣＯ2インキュベーター中で、プレートを３７℃で５時間インキュベ ートする。 セルハーベスターを用いて各穴中の内容物をろ紙上に収穫し、液体シンチ レーション計測によりＤＮＡ中に取り込まれた放射活性を測定する。 その結果を図２から図６に示す。これらの結果はＥ１３ＲがＩＬ−５活性に対 し特異的な拮抗作用を示すが、ＧＭ−ＣＳＦ活性またはＩＬ−３活性は妨害しな いことを示す。特に、これらの図はＥ１３ＲがＩＬ−３により誘導されるＴＦ１ ．８細胞の増殖に拮抗せず、ＧＭ−ＣＳＦにより誘導されるＴＦ１．８細胞の増 殖にも拮抗しないことを示す。実施例５ 実施例６ 実施例７ 実施例８ 実施例９ 好酸球に対するＥ１３Ｒの拮抗活性 Ｅ１３Ｒの好酸球機能に対する効果を測定するため、抗体依存性細胞により媒 介される細胞毒性（ＡＤＣＣ）検定を使用した。この検定はクロムで放射標識さ れた標的細胞であって好酸球により認識されるある種の抗体を発現するものを殺 す好酸球の能力を測定する(ヴァダスら、J.Immunol．130:795，1983)。血液は健 康な供与者から集め、好酸球はデキストランで赤血球を除去した後、白血球をメ トリズアミド(metrizamide)の勾配分離で除去することにより調製した（ヴァダ スら、J.Immunol．122:1228，1979）。好酸球の純 度は９５％を越えた。次いで、好酸球を標的細胞当たり１００個の好酸球の比率 で標的細胞と共にインキュベートし、そしてＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）か またはＩＬ−５（１０ｎｇ／ｍｌ）かの固定用量およびＥ１３Ｒの滴定を行った 。図７はＥ１３Ｒが用量依存的にＩＬ−５により誘導されるＡＤＣＣに拮抗した が、ＧＭ−ＣＳＦにより誘導されるＡＤＣＣに対しては影響を与えなかったこと を示す。数値は３連の平均値およびその標準誤差である。 実施例１０ 好酸球の先祖の増殖および分化に対するＥ１３Ｒの影響 健康な供与者から骨髄を集め、密度遠心分離にかけた(Lymphopr ep.)。その単 核細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）かまたはＩＬ−５（１０ｎｇ／ｍｌ ）かの固定用量で補足しそしてＥ１３Ｒの滴定をした寒天上でプレート培養した 。細胞は３７℃で２週間成長させた。次いで、寒天プレートをグルタルアルデヒ ドで固定した後プレートをルクソールファストブルーで染色して好酸球のコロニ ーを検出した。図８はＥ１３Ｒが用量依存的にＩＬ−５のコロニー増殖効果に拮 抗したが、一方、Ｅ１３Ｒは好酸球コロニー形成のＧＭ−ＣＳＦによる刺激に対 しては影響を与えなかったことを示す。数値は３連の平均値およびその標準偏差 である。 当技術分野の熟練者は本明細書に記載された発明が具体的に記載されたもの以 外に変更および修飾を受け得るものであることを認めるであろう。本発明はこの ような変更および修飾のすべてを包含するものと理解すべきである。本発明は本 明細書で個別にまたは集合的に言及されあるいは指摘された工程、特徴、組成物 および化合物 のすべてをも包含し、そして上記の工程または特徴のどの二つ以上の組み合わせ のいずれかおよびすべてをも包含する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION             Interleukin-5 antagonists   The present invention can antagonize or reduce the activity of IL-5 With respect to modified and mutant forms of the interleukin-5 molecule, and To mitigate the unusual effects caused by a strain or mutation and reduce pain Relates to their use to reduce in other ways.   The nucleotide and amino acid sequences referred to in the present application (specification) The corresponding SEQ ID NOs. Are given after the description.   Throughout this application, "Compliance ( comprising) or "Compliances (com prises) or its variants such as `` comprising '' Contains the element or entity or group of elements or entities that are Does not mean the exclusion of any element or entity or group of elements or entity It should be understood that there is no.   Due to the rapid sophistication of recombinant DNA technology, the medical field and related health Research and development in the field are greatly promoted. This suggests that several disease states may have abnormal effects of native or mutant growth factors. In the area of research on hemopoietin growth factor caused by Of particular importance.   One particularly important hemopoietin growth factor is IL-5. This molecule is T-fine Lymphokine secreted by vesicles and mast cells, and the glycoprotein disulfate It is a homodimer with an amide bond. The human form of this molecule is 114 Contains amino acids. IL-5 has four α-helices in the upper, lower and lower sequences. Are formed from a bundle. 3 helics where one bundle is derived from one monomer D-helic formed from the second helix and the fourth helix derived from the second monomer This phenomenon is unique to IL-5. The IL-5 molecule is a helix Also includes two short antiparallel β-strands located between A and B and helices C and D In.   Human and murine IL-5 receptors have two distinct chains, α-subunits. Contains knit and β-subunit. Human IL-5 is composed of this α-subunit But its binding affinity increases when it binds to the β-chain. GM-CS Other cytokines such as F and IL-3 also share this β-chain.   IL-5 is a hemopoietin with selectivity for the production and activation of human eosinophils Tin growth factor. Therefore, a favorable relationship with chronic asthma or IL-5 has been demonstrated. Treatment for other disease states involving eosinophilia or other conditions associated with IL-5 There is a need to develop antagonists of IL-5 that act as agents. IL-5 Antagonists interfere with the activity of other cytokines such as GM-CSF and IL-3 It is also important not to do it.   Accordingly, one aspect of the present invention relates to a single amino acid sequence within the first α-helix. A modified IL-5 comprising a sequence, wherein the acid or acid in the first α-helix is Indicates that at least one of the exposed amino acids having acid-like properties is a basic amino acid residue. Or substituted with a non-acidic amino acid residue.   The IL-5 to be modified is generally used in humans, primates, livestock animals (eg, sheep, cattle). , Pigs, horses, laboratory test animals (eg mice, rats, guinea pigs, rabbits) ), Companion animals (eg, dogs, cats) and captured wild animals (eg, kangar Fox, deer) from mammals. IL-5 is of human origin Most preferably. The modified IL-5 of the present invention is glycosylated. Or non-glycosylated, and of GM-CSF or IL-3 Does not interfere with activity.   Even more specifically, the invention relates to amino acid position 1 in the first α-helix. Glu at position 3 (or equivalent position) is Arg or Lys or Including amino acid sequences replaced by chemical equivalents or derivatives of It concerns a decorated human IL-5 molecule. Another substitution is Gln and As using non-acidic amino acid residues such as n or their chemical equivalents or derivatives However, the present invention is not limited to these residues. "Derivatives" It may be a naturally occurring amino acid residue or a synthetic amino acid residue.   According to the present invention, a modified IL-5 molecule as defined above is a IL-5 molecule. It is proposed to act as a natural antagonist. The term "modified" Are used herein with terms such as "mutant," "derivative," and "mutant." Think synonymous. The present invention relates to the mitogenic effect of IL-5 as observed in vitro. In particular, modified IL-5 showing specific antagonism against mitogenic effects Involved. The modified IL-5 molecule may be glycosylated or glycosylated. May not be activated and interfere with the activity of GM-CSF or IL-3 Never.   Thus, another aspect of the present invention relates to an IL-5 antagonist. The antagoni The strike is an IL-5 molecule having one amino acid sequence in its first α-helix. Comprising an acidic or acid-like property in the first α-helix. One or more of the exposed amino acids having a basic amino acid residue or a non-acidic amino acid It is substituted with an acid residue.   More specifically, the invention relates to position 13 in the first α-helix (or Glu at the equivalent position) is Arg or Lys or a chemical equivalent thereof. IL-5 comprising an IL-5 molecule substituted with an equivalent or a derivative thereof The present invention provides an antagonist of Another substitution is also Gln and Asn or their This can be done using non-acidic amino acid residues such as chemical equivalents or derivatives. But not limited to these residues.   The modified IL-5 molecules of the present invention are recombinant or synthetic Is preferred. Substitution of an amino acid within the first α-helix (single or multiple) With the exception of the (number), the amino acid sequence of IL-5 is the naturally occurring molecule (ie, natural). Of the natural amino acid sequence. Or it may have multiple, amino acid substitutions, deletions and / or additions. So It is called "mutant" IL-5. The structure of the first α-helix of IL-5 is 2 . Determined by X-ray crystallography at 4 Angstrom resolution, it contains amino acid residues 7-27 or their equivalent (Milburn Et al., Nature 363: 172-176, 1993). The modified IL-5 of the present invention is a leader -May or may not include a sequence.   A nucleotide sequence for the modified IL-5 having Arg at position 13; The corresponding amino acid sequences are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and in FIG. The leader sequence is represented by amino acids 1 to 6 (Met His Tyr His His His (SEQ ID NO: 3) )) Is shown. Thus, amino acids 7-27 have SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 And in Figure 1 as amino acids 13-33. References to amino acids 7-27 Is taken as the amino acid residue number in the molecule without the leader sequence. Amino acids 7-27 The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 except that amino acid 13 is represented as Xaa No .: 4 is indicated. According to the present invention, Xaa is a basic amino acid residue or It is preferably an acidic amino acid residue.   As used herein, "non-glycosylated" refers to prokaryotes (eg, E. coli) The molecule is complete as if it were expressed recombinantly in Means completely non-glycosylated. Also lack of glycosylation Complete deaggregation in vitro using mammalian cells or using appropriate enzymes Recognition can also occur. Recombinant molecules produced in different mammalian cells Different glycosylation patterns, such as when made, are included in the present invention. It is.   An "exposed" amino acid, as used herein, is an amino acid that points to the interior of the molecule. Amino acids in the portion of the α-helix exposed to the solvent or outside Used to refer to   Acidic amino acids include, for example, Glu and Asp. Basic amino acid is A rg and Lys are preferred. Non-acidic amino acids are Gln and Asn It is preferred that   According to another aspect of the present invention, there is provided a modified IL- 5 are provided.     (I) including one amino acid sequence in the first α-helix;     (Ii) a basic amino acid residue or a non-acidic amino acid residue in the α-helix Having one or more exposed amino acids having acidic or acid-like properties ing,     (iii) is recombinant or synthetic, and     (iv) Can antagonize the mitogenic activity of IL-5 in vitro.   In a related aspect, the invention relates to an IL-5 antago characterized by: Provide a nyst,       (I) including one amino acid sequence in the first α-helix;       (Ii) a basic amino acid residue or a non-acidic amino acid within the α-helix One or more exposed amino acids having acidic or acid-like properties replaced by residues have,       (iii) is recombinant or synthetic, and       (Iv) Can antagonize the mitogenic activity of IL-5 in vitro.   The IL-5 mutant can be glycosylated or non-glycosylated.   This aspect of the invention relates, in part, to amino acid 13 of human (h) IL-5 (Glu ) Mutation to Arg antagonizes the mitogenic effect of IL-5 in vitro Is based on the finding that this results in a mutant form of hIL-5. This variant is In the description, “IL-5Arg13"Or" E13R ". Such a strange The variant may not be able to bind to the high affinity receptor, but the IL-5 receptor It would still be able to bind well to low affinity α chains. IL-5Arg13 Mutants act as antagonists, blocking the stimulatory effects of native IL-5 It's important to. IL-5Arg13A particularly important use for antagonists is in IL-5-mediated stimulation and activation of eosinophils in vivo or in vitro This is for weakening or otherwise antagonizing. This antagonist Can also antagonize the effects elicited by the mutated endogenous IL-5. Wear. The present invention relates to IL-5Lys13, IL-5Gln13And IL-5Asn13 Other series of IL-5 mutants And also functionally equivalent mutants. IL-5Arg13Nuku of (E13R) The leotide sequence and the corresponding amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. Is shown. The invention, in a particularly preferred embodiment, is substantially as set out in SEQ ID NO: 2. An isolated polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or substantially And genetic sequences encoding sequences having the nucleotide sequences described in   Due to the shorthand notation, one-letter abbreviations and 3 Both letter abbreviations are used. These are shown in Table 1.   When a particular amino acid residue is referred to by its position in IL-5, The residue number (for example, Xa an, Where Xaa is an amino acid residue). Where "n" Is the residue number in the molecule.                                   Table 1 Amino acid 3 letter abbreviation corresponding                                                         One letter abbreviation Alanine Ala A Arginine Arg R Asparagine Asn N Aspartic acid Asp D Cysteine Cys C Glutamine Gln Q Glutamate Glu E Glycine Gly G Histidine His H Isoleucine Ile I Leucine Leu L Lysine Lys K Methionine Met M Phenylalanine Phe F Proline Pro P Serine Ser S Threonine Thr T Tryptophan Trp W Tyrosine Tyr Y Valin Val V   The present invention relates to IL-5Arg.13Is demonstrated using However, this Ming is in vitro against IL-5 or in vitro or in vivo Condition that all other IL-5 variants with antagonism of eosinophils It is done under.   According to another aspect of the present invention, an amino acid sequence in the first α-helix of IL-5. An IL-5 variant comprising the sequence is provided, Wherein Xaa is preferably a group consisting of Arg, Lys, Gln and Asn Wherein the mutant IL-5 is a basic or non-acidic amino acid residue selected from Acting as an antagonist to at least one property of the corresponding native IL-5 Is what you do. The amino acid sequence defined by SEQ ID NO: 4 is that of human IL-5. Corresponds to amino acid residues 7-27. Xaa is XaanAnd n is human IL-5 Is preferably amino acid position 13. XaanIs Arg13Or its equivalent It is preferably an object.   In a related aspect, the invention relates to amino acids 7 of the first α-helix of human IL-5. IL-5 ant comprising a polypeptide comprising -27 or a chemical equivalent thereof Providing a gonist, but having acidic or acid-like properties in the first α-helix. One or more of the exposed amino acids is a basic amino acid residue or a non-acidic amino acid residue Substituted with a group On condition that   The acidic or acidic-like amino acid residue is Glu or Asp, and Arg, Lys , Gln or Asn.   More preferably, the acidic or acid-like amino acid residues are replaced by Arg. Good.   The amino acid sequence of the modified IL-5 is set forth in SEQ ID NO: 2. Is most preferred.   In a particularly preferred embodiment, the present invention provides the following amino acid in the first α-helix: A modified IL-5 molecule having an acid sequence, Where Xaa is Arg, Alternatively, one or more mutations in the first α-helix, Xaa is one that confers functionally similar antagonism to that mutation that is Arg IL-5 molecule, Comprising an IL-5 antagonist.   In aspects of the latter embodiment, the mutation in the IL-5 molecule comprises one or more amino acids. Can be an acid substitution, deletion and / or addition Or, among other mutations, a change in glycosylation pattern You can also. An IL-5 antagonist is an amino acid as set forth in SEQ ID NO: 2. It preferably comprises a noic acid sequence.   IL-5 antagonists of the invention, and in particular, IL-5Arg13Is IL-5 Allergy by preventing or attenuating eosinophil activation mediated by , Some myeloid leukemias (such as eosinophilic myeloid leukemia), idiopathic eosinophil syndrome For treating allergic inflammation such as asthma, rhinitis and skin allergy That is why it is useful. These and other conditions are referred to herein as endogenous native IL Caused by the unusual effects of -5 or endogenous naturally occurring mutant IL-5. Or promoted.   Thus, the present invention relates to the modified IL-5 described above, and in particular IL- 5Arg13To a mammal for a time and under conditions sufficient to effect the treatment. Providing a method of treatment comprising administering.   This treatment includes allergies and some myeloid leukemias (such as eosinophilic myeloid leukemia). ), Allergic such as idiopathic eosinophil syndrome, asthma, rhinitis and skin allergy It is preferably performed in the aspect of treating inflammation.   Generally, the mammal to be treated is a human, primate, livestock, pet, or real animal. Laboratory test animals. Most mammals are human. Is also preferred.   One modified IL-5 may be administered, or a variant of the same IL-5 May be administered. For example, a series of IL-5 variants are IL-5Ar g13, IL-5Lys13, IL-5Gln13And IL-5Asn13Two or more Could be used as a combination selected from: IL-5 variant of the invention Variants are particularly useful in treating conditions resulting therefrom, such as eosinophilia and asthma. It is for. Administration is preferably by intravenous administration, although a series of other administration forms are also contemplated. Which include implants or controlled release of IL-5 variants Other forms possible, including nebulizer-type or via nasal spray, are included. Station Modified forms of IL-5 that allow invasion after local application are also encompassed by the present invention.   In addition to the above modifications to IL-5, the present invention further provides a group of other IL-5 derivatives. provide.   Such derivatives include fragments of the IL-5 polypeptide and the corresponding gene sequence, Includes parts, parts, mutants, homologs and analogs. Derivatives bind to IL-5 Substitution, deletion and / or addition of one or more amino acids or IL- Substitution or deletion of one or more nucleotides in the gene sequence encoding 5 And / or also including additions. Derivatives are resident nucleoti We also plan to modify de). Nucleotide changes correspond to the corresponding amino acid sequence Changes or glycosylation patterns, among other effects. You. Amino acid sequence or nucleotide sequence An “addition” to a sequence involves a fusion with another peptide, polypeptide or protein Alternatively, a fusion to a nucleotide sequence is included. In the present specification, this is referred to as “IL-5”. Sometimes includes functional derivatives, ie derivatives that immunologically interact with IL-5 Refers to all its derivatives. All such derivatives are the first α-helix described above. Will be added to the modifications to Thus, such derivatives are IL-5Ar g13, IL-5Lys13, IL-5Gln13Or IL-5Asn13Added to Will be.   Analogues of IL-5 contemplated in the present invention include modifications to side chains, peptides, polypeptides and the like. Unnatural amino acids during peptide or protein synthesis and / or Incorporation of these derivatives and co-production of proteinaceous molecules or their analogs Includes the use of crosslinkers and other methods that impose conformational constraints However, it is not limited to these.   The invention can act as an antagonist or agonist of IL-5. Of IL-5, which can act as a functional analog of IL-5 Further provided are biological analogs. The chemistry itself is necessarily derived from IL-5 Not necessarily, but share some conformational similarities There is also. Also, the chemistry itself mimics certain physicochemical properties of IL-5. Can be specially designed. Chemicals themselves can be chemically synthesized Alternatively, for example, it can be detected after screening for a natural product.   Other derivatives contemplated by the present invention include molecules that are not fully glycosylated. Up to fully glycosylated molecules, and naturally glycosylated molecules Of glycosylation from a molecule to a molecule with an altered glycosylation pattern Solution variants. Modified glycosylation pattern is different inn It can be obtained by expressing a recombinant molecule in a main cell.   All these types of modifications occur when the modified IL-5 molecule is administered to an individual. Or when used as a diagnostic, they are important for stabilizing them. this These modifications add, complement, or otherwise modify the antagonistic properties of the modified IL-5 molecule. Can be promoted by law.   Thus, as used herein, “modified” IL-5 refers to the first α-helic. Reference to IL-5 with the amino acid sequence modified in the Include a series of glycosylation variants, amino acid changes in other parts of the molecule. Also includes references to IL-5 with chemical modifications to the molecules, fusions and molecules. I have.   The present invention relates to the modified IL-5 molecules described above or combinations thereof. Also provided is a pharmaceutical composition comprising   Accordingly, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a modified IL-5, The modified IL-5 comprises an amino acid sequence having a first α-helix. Exposed amino acids having acidic or acid-like properties within the first α-helix One or more of the basic amino Substituted by an acid residue or a non-acidic amino acid residue, wherein the composition comprises one It further contains the above pharmaceutically acceptable carrier and / or diluent. , A pharmaceutical composition.   In a related aspect, the invention relates to modified human IL-5 or mammalian A pharmaceutical composition comprising a homolog of the modified IL-5 wherein the modified IL-5 is a 1α- It contains the following amino acid sequence in the helix, Xaa is preferably a basic selected from Arg, Lys, Gln and Asn Or a non-acidic amino acid residue, wherein the composition is one or more pharmaceutically acceptable There is provided a pharmaceutical composition further comprising a carrier and / or a diluent. X aa is XaanAnd n is preferably amino acid position 13. Xaa Arg is preferred.   In another related aspect, the invention relates to a pharmaceutical composition capable of antagonizing IL-5 Wherein the modified IL-5 has the following amino acid in its first α-helix: Having an arrayXaa is preferably selected from Arg, Lys, Gln and Asn Certain compositions are provided.   Xaa is preferably Arg.   The pharmaceutical composition contains other pharmaceutically active molecules, including other IL-5 variants. You can also. The modified IL-5 molecule and other components in the pharmaceutical composition are Hereinafter referred to as "active agent" or "active compound".   Pharmaceutical dosage forms suitable for injectable use include sterile aqueous solutions (if soluble in water) Or sterile for immediate preparation of sterile dispersions and sterile injectable solutions or dispersions Powder. It must be stable under the conditions of manufacture and storage; It must be protected against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and mold. Carrier For example, a solvent containing water, mannitol glycine or a suitable mixture thereof. Or a dispersion medium. Prevention of the action of microorganisms is based on various antibacterial agents and Antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, It can be done with thirmerosal and the like. Many places In this case, it is preferable to include isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride. injection Possible long-term absorption of the composition can result in the use of substances that delay absorption in the composition More can be done.   Sterile injectable solutions are prepared by dissolving the required amount of the active compound in an appropriate solvent, as described above. Mix with the required ingredients and filter sterilize. It is prepared by Generally, the dispersant must be in the basic dispersion medium and above. By mixing various sterilized active ingredients in a sterilized vehicle containing other essential ingredients Prepared. Preferred in the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions The method of preparation was to pre-sterilize the powder of the active ingredient plus the necessary additional ingredients by pre-filtering them A vacuum drying method and a freeze drying method formed from a solution. Mannitol glycine Is a particularly useful formulation, and the modified IL-5 molecule is This is especially so when administered by intravenous drip.   The invention also extends to dosage forms suitable for nasal spray or nebulizer-type inhalation. Also controlled release Compositions can be prepared in a manner similar to a series of implants. With appropriate modifications, These molecules can also be creams, lotions or gels. cream, Carriers suitable for lotions or gels include glycerol, propylene glycol Tools, liquid polyethylene glycols and the like. Not limited.   Pharmaceutically acceptable carriers and / or diluents include any or all All solvents, dispersion media, and antibacterial and antifungal agents are included. Pharmaceutically The use of such media and substances for active substances is well known in the art. You. Therapeutic compositions unless normal media or substances are contraindicated with this active ingredient Their use in objects is contemplated by the present invention. Supplemental active ingredients It can also be incorporated into the composition.   Dosage unit form should be used for ease of administration and uniformity of dosage. It is especially advantageous to formulate parenteral compositions. Dosage unit dosage form As used herein, suitable as a single dose for the mammal to be treated. Refers to a physically distinct unit. Each unit produces the desired therapeutic effect Containing the pre-measured amount of active substance together with the required pharmaceutical carrier I have. The specifications for the novel dosage unit dosage form of the present invention include: Properties and specific therapeutic effects to be achieved, and (b) the IL-5 molecule or Has disease states associated with abnormalities in IL-5 levels and promoted thereby Constraints inherent in the technology of formulating such active substances for the treatment of diseases of living organisms, Depends on and directly depends on   The main active ingredients have been disclosed so far to allow convenient and effective administration An effective amount is prepared together with a suitable pharmaceutically acceptable carrier in such dosage unit form. Are combined. Dosage unit forms may contain, for example, from 0.5 μg to about 2 μg of the principal active compound. It can be included in amounts ranging from 000 mg / ml. Expressed in proportion, the active compound is Generally, from about 0.5 μg to about 2000 mg per ml of carrier. Supplementary In the case of a composition containing an active ingredient, the dose may be adjusted according to the usual dose of the ingredient and the manner of administration. Determined by reference to the law.   Pharmaceutical compositions can be used to transfect target cells, such as vectors. Genetic molecules can also be included. Here, the vector is a modified IL-5 expression Or is responsible for a nucleic acid molecule capable of modulating the activity of a modified IL-5 Things. Such a vector can be, for example, a viral vector. .   Yet another aspect of the invention relates to modified IL-5 molecules and derivatives thereof. Antibodies. Such antibodies are monoclonal or polyclonal And specific for modified IL-5 or derivatives thereof Can be produced. In the latter case, modified IL-5 or its induction The conductor may need to be mixed with the carrier molecule first. The antibodies of the present invention And / or recombinant modified IL-5 or its derivative as therapeutic or diagnostic agent Particularly useful.   For example, modified IL-5 and its derivatives are not naturally occurring with respect to IL-5. Can be used to screen for antibodies. These are, for example, It can occur in some autoimmune diseases. Also, specific antibodies may be modified or It can be used to screen for atypical IL-5. like this Techniques for assays are well known in the art and include, for example, sandwich assays. Method and ELISA. Knowledge of IL-5 levels is important for certain cancers or cancers Therapeutic prosthesis for the diagnosis of a predisposition to or when a modified IL-5 molecule is used Tocol can be important for monitoring.   Antibodies to the modified IL-5 of the present invention can be monoclonal or polyclonal. Can be Antibody fragments such as Fab fragments can also be used. In addition, the invention extends to recombinant and synthetic antibodies, and to antibody hybrids. Extend to "Synthetic antibody" as used herein includes antibody fragments and hybrids. Thinking You. The antibodies of this aspect of the invention are particularly useful in immunotherapy, Diagnosis to evaluate (apoptosis) or to monitor treatment programs It can also be used as a tool.   For example, specific antibodies may be used to screen for modified IL-5 proteins. Can be used for The latter can be used, for example, in cell extracts or other biological fluids. For screening the levels of modified IL-5 or by recombinant means It is important as a means for purifying the modified IL-5 produced from the culture supernatant. Will be. Techniques for the assays contemplated herein are known in the art. For example, sandwich assays and ELISAs are included.   A second antibody (monoclonal, polyclonal, or Or antibody fragments or synthetic antibodies) within the scope of the present invention. You. The first and second antibodies can both be used in a detection assay, or The first antibody can be used with a commercially available anti-immunoglobulin antibody . Antibodies contemplated in the present invention are specific for some portion of the modified IL-5. And any antibody.   Both polyclonal and monoclonal antibodies are immunized with enzymes or proteins And either type can be used for immunoassays. Can be. Methods for obtaining both types of sera are well known in the art . Polyclonal sera is less preferred, but modified I.I. Injecting an effective amount of L-5 or an antigenic portion thereof, collecting serum from the animal, Comparison by isolating specific sera by any of the known immunosorbent methods It can be easily prepared. Antibodies prepared by this method It can also be used in immunoassays, but this is due to the potential heterogeneity of the preparation. Therefore, it is generally not preferred.   The use of monoclonal antibodies in immunoassays means the ability to produce them in large quantities and the Particularly preferred for product homogeneity. Sensitized to immortalized cell lines and immunogen preparations For monoclonal antibody production induced by fusion of isolated lymphocytes The preparation of the human cell line can be performed by techniques well known to those skilled in the art. Can be.   Another aspect of the present invention relates to modifying modified IL-5 in a biological sample obtained from a subject. Claims: A method for detecting a modified IL-5 or a derivative or homologue thereof The antibody-modified IL-5 complex is formed between the specific antibody and the biological sample. Contacting for a time and under conditions sufficient to detect and then detect the complex Providing a method comprising:   The present invention relates to a PC for detecting a modified IL-5 gene or a derivative thereof. Genetic assays such as those involving R analysis are also provided. Alternatively, single-stranded DN A higher order polymorphism (SSCP) and specific oligonucleotide hybridization Direct nucleotide sequencing or mutation scanning of You.   The present invention extends to nucleic acid molecules encoding the modified IL-5 of the present invention. like this Such a nucleic acid molecule may be DNA or RNA. The nucleic acid molecule is in DNA form When it is, it can be genomic DNA or cDNA. The core of the present invention The RNA form of the acid molecule is generally mRNA.   Although the nucleic acid molecules of the invention are generally in isolated form, they are vector molecules, particularly expressed Incorporated, ligated, or incorporated into other genetic molecules, such as vector molecules Can be fused or combined in other ways. Vectors and expression vectors Are generally capable of replication and, where applicable, prokaryotic or true. It can be expressed in one or both of the nuclear cells. Prokaryotic cells are Escherichia coli and bees Lus species (Bacillus sp) and Pseudomonas sp. Good. Preferred eukaryotic cells include yeast cells, mold cells, mammalian cells and kelp cells. Insect cells.   Accordingly, another aspect of the present invention is a genetic construct, comprising a vector portion and a mammalian construct. And more preferably a human modified IL-5 gene portion. The modified IL-5 polypeptide is a modified IL-5 polypeptide or a functionally modified IL-5 polypeptide. Or a derivative thereof that can interact immunologically A genetic construct is provided.   The modified IL-5 gene portion of the gene construct is Operably linked to the promoter and the modified Controlling the expression of the L-5 gene portion It is preferable that the material can be used.   In addition, the modified IL-5 gene portion of the gene construct may contain glutathione -S-transferase or a nucleotide sequence encoding a part thereof, such as It may also include all or part of the gene fused to another gene sequence.   Thus, another aspect of the present invention relates to encoding modified IL-5 or encoding it. An isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence complementary to a coding sequence, The modified IL-5 comprises an amino acid sequence having a first α-helix. One of the exposed amino acids having acidic or acid-like properties in the first α-helix One or more of which are substituted with basic amino acid residues or non-acidic amino acid residues An isolated nucleic acid molecule is provided.   The nucleotide sequence includes the following amino acid sequence in the first α-helix: Encoding human modified IL-5 or a mammalian homolog; Xaa is preferably a basic selected from Arg, Lys, Gln and Asn Or a non-acidic amino acid residue, wherein the modified IL-5 is induced by IL-5. It is preferable that the compound has an antagonistic effect on the mitogenic effect. Xaa Is XaanAnd n is a It is preferably amino acid position 13. Xaa is preferably Arg.   The present invention extends to such genetic constructs, and to prokaryotic cells containing such genetic constructs. Vesicles or eukaryotic cells.   The present invention relates to allergy, some myeloid leukemias (eosinophilic myeloid leukemia, etc.), Allergic inflammation such as eosinophilic syndrome, asthma, rhinitis and skin allergy The use of the modified IL-5 as described above in the manufacture of a therapeutic for treatment Provides further use.   The invention will now be described with reference to the following non-limiting examples and / or drawings. This will be described below. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 (a) Schematic representation of p5P31, an IL-5E13R bacterial expression plasmid. And (b) MHYHThree-DNA / amid of IL-5 (E13R) No acid sequence. The E13R mutation is circled.   FIG. 2 measures the ability to antagonize the proliferation of TF1.8 cells mediated by IL-5. 5 is a graphical representation showing the titration of E13R to perform the titration.   FIG. 3A measures the ability to antagonize the proliferation of TF1.8 cells mediated by IL-5. 3 shows a titration of E13R for determination. This value is the value of Agonis that E13R can detect. No activity is shown.   FIG. 3B shows that E13R antagonizes IL-3 mediated proliferation of TF1.8 cells. Indicates that it cannot be obtained.   FIG. 3C shows that E13R antagonizes GM-CSF-mediated proliferation of TF1.8 cells. Indicates that it cannot be resisted.  FIG. 4 shows titration of IL-3 to measure mitogenic effect on TF1.8 cells. FIG. And high levels of E13R cannot interfere with this activity. To indicate that   FIG. 5 is a graphical representation showing a growth test of TF1.8 against IL-5.   WTIL-5 (HI) was prepared as inclusion bodies in bacteria and dimerized in 2M urea And purified by reverse phase HPLC and concentrated in PBS by buffer exchange. Never dry Did not dry.   IL-5WT was prepared in the same way as WTIL-5 (HI) but after concentration The material was dried and dissolved in 25 mM glycine and 1.25 mg / ml mannitol. It differs in understanding.   FIG. 6 shows that GM-CSF was used to measure the mitogenic effect on TF1.8 cells. FIG. 6 is a graphical representation showing titration, showing that high levels of E13R cannot interfere with this activity. And   FIG. 7 shows that E13R is mediated by eosinophil antibody-dependent cells induced by IL-5 Is a graph showing that the You.   In the absence of GM-CSF and IL-5,51Cr-release% is 4% Was.   FIG. 8 shows that E13R inhibits eosinophil colony formation induced by IL-5. It is a graph display showing the following.   In the absence of GM-CSF and IL-5, eosinophil colonies are detected Did not.Example 1 Having IL-5 antagonist activity, Production of charge reversal mutants of interleukin-5 (IL-5)   The present inventors have found that the glutamic acid residue at position 13 (E13) is an arginine residue (R) Expression and purification of the charged reversal mutant of IL-5 [E13R] did. This mutant, E13R, is responsible for the mitogenic effect of IL-5 in vitro. It shows specific antagonism. To maximize expression, this protein is currently MHYH which is a leader sequenceThree(MHYHHH) (SEQ ID NO: 3) It is expressed as Park. This leader sequence corresponds to the sequence in SEQ ID NOs: 1 and 2. Contains amino acids 1-6. However, removal of this leader sequence (or another That its replacement with the leader sequence of E3R) would adversely affect the antagonistic effect of E13R. There is no reason to be. MHYHThreeA schematic representation of the sequence of E13R and E13R is shown in FIG. is there. The nucleotide sequence of E13R and the corresponding amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 1. And 2.                           Example 2 Encodes MHYH 3 IL-5 (E13R) Production of bacterial expression plasmids   The coding sequence for the human IL-5E13R mutant was site-specific from the IL-5 wild-type sequence. Induced by mutagenesis.   Codon 13 was converted to an Arg codon.   The additional codon changes listed here are useful for translational efficiency in E. coli. It is based on bacterial codon preferences to increase the rate of It did not bring.   Mutant DNA fragments are obtained by polymerase chain reaction using primers. Modified with leader MHYH at 5 'endThreeEncodes a stop codon at the 3 'end Created an array. The amplified fragment was subcloned into plasmid pEC611. Then, an expression plasmid pPP31 containing the trc promoter was prepared.                           Example 3 MHYH 3 IL-5 (E13R) Production, isolation and refolding   Fermentation is performed by the fed-batch method. E13R-expression plasmid E. coli MM294 / pACYCLacI transformed with certain pPP31q3 Grow in minimal medium at 7 ° C. The pH is adjusted to NH during bacterial growth.FourWith the addition of OH Keep constant at pH 7.0. Expression of IL-5 (E13R) is high cell density (OD600> 20) Add IPTG Or by the addition of lactose. Induction is 5 hours (including the induction period). First), the protein is expressed as insoluble inclusion bodies (IBs). Cells Dissolve by high pressure homogenization. Primary fraction of insoluble inclusion bodies from cell fragments Separation by differential centrifugation followed by insoluble encapsulation Wash body and homogenize again. Final centrifugation step for regeneration A sufficiently clean insoluble inclusion body is isolated.   The conditions for fermentation, induction, isolation and regeneration are as follows. 1.fermentation A. Inoculation 1. E. coli MM294 / pACYClacI carrying pPP31qThe ampi Minimum containing sylin (100 μg / ml) and kanamycin (30 μg / ml) Plate from -80 ° C glycerin stock on media plate and grow at 37 ° C overnight. I let you. 2. By microscopic examination of a 20 ml shake flask culture containing the inducer, Depends on colony size on agar plate in the presence or absence of inducer A number of colonies were evaluated for IL-5 (E13R) expression levels. Guidance IPTG was used as the substance. 3. One colony selected from the agar plate was Nitrogen (100 μg / ml) + kanamycin (30 μg / ml) The cells were transplanted into 20 ml of the minimum medium (2), and cultured at 37 ° C. overnight with shaking. 4. Sterilize 10 liters of C2 in a 22 liter fermentor and allow overnight culture Inoculated at low density. The growth is performed at 37 ° C. and the pH is NHFourOH or HTwoSOFourof It was maintained at 7.0 by addition. 5. Shaking is controlled manually, and aeration is controlled automatically at oxygen saturation level, with 10% v / v vpOTwoThe above was maintained. After glucose depletion in 16-20 hours Then, a concentrated glucose solution containing salt added to the cells was fed. Nutrient feed Flow rates were determined by pH or oxygen saturation level.B. Guidance 1. A600=> 20 optical density, recombinant E13R antagonist development The reality has been induced. In this case, induction can be achieved by changing to a lactose-based nutrient feed. went. Induction was continued at 37 ° C., pH 7.0 for 5 hours. Sample immediately before induction and Samples were taken every hour after induction and examined microscopically for the presence of insoluble inclusion bodies. That rhino Was measured by disk centrifugation. 2. Cultures were stored overnight at 4 ° C. 2.Primary isolation of IL-5 (E13R) inclusion bodies 1. Homogenization-Step 1   Cultures were passed five times through a Gaurin 30CD homogenizer at 13,500 psi. I let you. During the passage, the homogenate was cooled. The homogenate is then replaced with an equal volume of R OHTwoDiluted with O. The size of the insoluble inclusion bodies was re-measured by disk centrifugation. 2. Centrifugation-Step 1   The homogenate is treated with insoluble inclusion bodies in Westfalia SB-7 separator. Centrifugation was performed at a constant flow rate of 9,210 rpm at a flow rate determined by the size.   The concentrate collected from this first step is diluted to 2.5% w / v or less. Was. 3. Homogenization process 2   The suspension of the insoluble inclusion body was made into a Gaurin 30CD homogenizer at 13,500 psi. Passed once.   The size of the insoluble inclusion bodies was measured again by disk centrifugation. 4. Centrifugation-Step 2   The homogenate was placed in a Westphalia SA-1 separator to remove insoluble inclusion bodies. Centrifugation was performed at a constant flow rate of 9,700 rpm at a flow rate determined by the size.   For regeneration, the insoluble inclusion bodies were first prepared with 5-10 mM dithiothreitol Dissolve in 6M guanidine-HCl buffered in H9.5. MHYHTwoIL- 5 (E13R) reduced IL-5 monomer was then added with 5 mM dithiothreitol. Gel filtration chromatography in 6M guanidine-HCl buffered to pH 9.5. (Size Exclusion Chromatography) (eg, Superose 12 (Pharmacia)) To purify from the non-reduced protein. The purified reduced monomer is then pH In 2M urea buffered to 9.5, the final protein concentration is 0.01-0.1 mg By diluting to / ml, it is regenerated into a dimer. Correctly folded Purification of the immers is accomplished by using a suitable column (eg, Brownley butyl-silica, buffered As solution A, 0.1% v / v trifluoroacetic acid (TFA) in water and buffer B Liquid chromatography using 0.1% v / v TFA in acetonitrile) Performed by reverse phase chromatography on matography (HPLC). Purified Also, the correctly folded protein is mannitol added as an excipient and Recovered in biological buffer after lyophilization from HPLC buffer in the presence of glycine can do. The identity of the purified protein was determined by mass spectrometry and N-terminal sequencing. It can be confirmed using a constant.                           Example 4 Assay for antagonistic activity against IL-5   A biological assay for IL-5 antagonism by E13R was induced by IL-5. The incorporation of radiolabeled thymidine is used to detect induced cell proliferation. Use The cell line used, TF1.8, develops receptors for IL-3 and GM-CSF. Emerging human erythroleukemia cell lines Is a subline of TF1. TF1.8 is associated with IL-5 receptor expression It differs from TF1 in that it is selected. Of TF1.8 proliferation by IL-5 Stimulation is inhibited by 50% in the presence of a 30-fold excess of E13R, and 300-fold It is extinct in the presence of excess (FIG. 2). However, IL-3 or GM -Stimulation of TF1.8 proliferation by CSF is not affected by the presence of E13R . These results indicate that E13R is a specific and potent antagonist of IL-5. Is to prove that       Prior to the assay (1500 rpm / 5 min / RT), the cells were washed for 24 hours, It is then resuspended in a cytokine-free medium.         The standard solution and the sample are brought to the required concentration (for example, 1000 (ranging from ng / ml to 1 pg / ml).         Dilutions were performed in triplicate.         Final volume of 100 μl in sterile 96-well flat bottom microtiter plate The appropriate standard solution (GM-CSF, IL-3, IL-5, etc.) and sample dilution Dispense the diluent equally.         The viability of the washed cells is checked and then 5 × 10FourCell / well concentration Resuspend the cells with.         Each well contains 100 μl of diluted standard / sample + 100 μl of resuspended cells including.       Plate is humidified COTwoIncubate at 37 ° C for 72 hours in an incubator (48 hours for TF-1 and TF1.8 cells).       CellsThreeH-thymidine (stock solution diluted 1/20, then 10 μl per well Pulse at 0.5 μCi / well.       Humidification COTwoPlates are incubated at 37 ° C for 5 hours in an incubator. To       Harvest the contents of each well on a filter paper using a cell harvester. The radioactivity incorporated into the DNA is measured by measurement of the radioactivity.   The results are shown in FIGS. These results indicate that E13R has no effect on IL-5 activity. But does not interfere with GM-CSF activity or IL-3 activity. To indicate that In particular, these figures show that E13R is TF1 induced by IL-3. . GM-CSF-induced increase in TF1.8 cells without antagonizing proliferation of 8 cells It does not antagonize reproduction.Example 5 Example 6 Example 7 Example 8 Example 9 Antagonistic activity of E13R on eosinophils   To determine the effects of E13R on eosinophil function, antibody-dependent cells Mediated cytotoxicity (ADCC) assay was used. This assay is radiolabeled with chromium. Killed target cells that express certain antibodies recognized by eosinophils Measure eosinophil capacity (Vadas et al., J. Immunol.130: 795,1983). Blood is healthy Eosinophils were collected from a healthy donor and eosinophils were depleted of red blood cells with dextran and then leukocytes were collected. Prepared by gradient separation of metrizamide (Vada Su et al., J. Immunol.1221228, 1979). Eosinophil Net The degree exceeded 95%. The eosinophils were then reduced to a ratio of 100 eosinophils per target cell. Incubate with target cells at GM-CSF (10 ng / ml) Or a fixed dose of IL-5 (10 ng / ml) and titration of E13R . FIG. 7 shows that E13R dose-dependently antagonized IL-5-induced ADCC Had no effect on ADCC induced by GM-CSF Is shown. Values are the mean of triplicates and their standard errors.                         Example 10 Effect of E13R on proliferation and differentiation of eosinophil ancestry   Bone marrow was collected from healthy donors and subjected to density centrifugation (Lymphopr ep.). Simply Nuclear cells were purified from GM-CSF (10 ng / ml) or IL-5 (10 ng / ml). ) Plated on agar supplemented with the fixed dose and titrated for E13R . Cells were grown for 2 weeks at 37 ° C. The agar plate is then glutaraldehyde After fixation with plate, stain the plate with Luxor Fast Blue and colonize eosinophils. Was detected. FIG. 8 shows that E13R dose-dependently antagonized the colony growth effect of IL-5. E13R, on the other hand, did not respond to GM-CSF stimulation of eosinophil colony formation. Does not have any effect. The numerical value is the average of triplicate and its standard deviation. It is.   Those skilled in the art will appreciate that the invention described herein is not specifically described. It will be appreciated that changes and modifications may be made outside. The present invention It is to be understood that all such changes and modifications are to be encompassed. The present invention is a book Steps, features, or compositions referred to or indicated individually or collectively in the specification. And compounds And any combination of any two or more of the above steps or features And any and all of

【手続補正書】 【提出日】平成１１年１２月９日（１９９９．１２．９） 【補正内容】 （１） 明細書第３７頁の実施例７の配列番号：７における第１２位の「Ｌａ」 を「Ｌｅｕ」に訂正致します。 （２） 明細書第３７頁の実施例８の配列番号：８における第４位の「Ｌａ」を 「Ｌｅｕ」に訂正致します。 （３） 配列表の配列番号：７における第１２位の「Ｌａ」を「Ｌｅｕ」に訂正 致します。 （４） 配列表の配列番号：８における第４位の「Ｌａ」を「Ｌｅｕ」に訂正致 します。[Procedure amendment] [Submission date] December 9, 1999 (1999.12.29) [Correction contents] (1) "La" at the 12th position in SEQ ID NO: 7 of Example 7 on page 37 of the specification Will be corrected to "Leu". (2) “La” at the fourth position in SEQ ID NO: 8 of Example 8 on page 37 of the specification is changed. It will be corrected to "Leu". (3) Correction of “La” at position 12 in SEQ ID NO: 7 in Sequence Listing to “Leu” I will. (4) "La" at the fourth position in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing was corrected to "Leu". To do.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ Ｃ０７Ｋ 14/54 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 エンゼル ロペス オーストラリア国、エス．エイ．5081、メ ディンディー、アーサー ストリート 15 番地 (72)発明者 マスュー ヴァダス オーストラリア国、エス．エイ．5152、ス ターリング、ブランチ ロード ８番地 (72)発明者 フランセス シャノン オーストラリア国、エス．エイ．5152、ク ラファース、ザ クレセント ８番地 (72)発明者 スタン バスティラス オーストラリア国、エス．エイ．5000、ア ーデルエイド、ボニソン クローズ 21番 地 (72)発明者 アラン ウイリアム ヘイ オーストラリア国、エス．エイ．5244、ウ ッドサイド、ハチェンス ロード 12番地──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 37/08 C12P 21/02 K C07K 14/54 (C12P 21/02 C12P 21/02 C12R 1:19) // (C12P 21/02 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:19) A61K 37/02 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE) , LS, MW, SD, SZ, UG), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR , KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU (72) Inventor Angel Lopez S. A. 5081, Medindi, 15 Arthur Street (72) Inventor Masue Vadas S., Australia. A. 5152, Sterling, Branch Road 8 (72) Inventor Frances Shannon S. S., Australia. A. 5152, Crafers, The Crescent 8 (72) Inventor Stan Bastille, S.S., Australia. A. 5000, Adelaide, Bonnison Close 21 (72) Inventor Alan William Hay, S.S., Australia. A. 5244, Woodside, Hatchens Road 12

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． 第１のα−ヘリックスを持つアミノ酸配列を含んで成る修飾されたインタ ーロイキン−５（ＩＬ−５）であって、該第１のα−ヘリックス内にある酸性ま たは酸様の性質を有する露出したアミノ酸の一つ以上が塩基性アミノ酸残基また は非酸性アミノ酸残基で置換されており、該修飾されたＩＬ−５がＩＬ−５のア ンタゴニストとして作用するものである修飾されたＩＬ−５。 ２． 修飾を受けるＩＬ−５が哺乳類起源のものである請求項１記載の修飾され たＩＬ−５。 ３． 修飾を受けるＩＬ−５がヒト起源のものである請求項２記載の修飾された ＩＬ−５。 ４． この修飾がアミノ酸位置１３または同等な位置にあるＧｌｕをＡｒｇまた はＬｙｓまたはそれらの化学的同等物またはそれらの誘導体で置換することであ る請求項３記載の修飾されたＩＬ−５。 ５． この修飾がアミノ酸位置１３または同等な位置にあるＧｌｕをＧｌｎまた はＡｓｎまたはそれらの化学的同等物またはそれらの誘導体で置換することであ る請求項３記載の修飾されたＩＬ−５。 ６． 第１のα−ヘリックス内に下記のアミノ酸配列を含んで成る修飾されたヒ トＩＬ−５またはその哺乳類同族体、 ここで、Ｘａａは好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎから選択され る塩基性または非酸性アミノ酸残基であり、該修飾されたＩＬ−５がＩＬ−５に より誘導される分裂促進効果(mitogeniceffects)に拮抗作用を示すものである。 ７． ＸａａがＡｒｇである請求項６記載の修飾されたヒトＩＬ−５またはその 哺乳類同族体。 ８． ＸａａがＬｙｓである請求項６記載の修飾されたヒトＩＬ−５またはその 哺乳類同族体。 ９． ＸａａがＧｌｎである請求項６記載の修飾されたヒトＩＬ−５またはその 哺乳類同族体。 １０． ＸａａがＡｓｎである請求項６記載の修飾されたヒトＩＬ−５またはそ の哺乳類同族体。 １１． その第１α−ヘリックス内のアミノ酸配列に修飾を受けているＩＬ−５ 分子を含んで成るＩＬ−５アンタゴニストであって、アミノ酸残基１３が塩基性 アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残基により置換されているものであるＩＬ− ５アンタゴニスト。 １２． アミノ酸残基１３がＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎから選択され るものである請求項１１記載のＩＬ−５アンタゴニスト。 １３． 配列番号：２に実質的に記載されているアミノ酸配列を含んで成る請求 項１１または請求項１２記載のＩＬ−５アンタゴニスト。 １４． 修飾されたＩＬ−５を含んで成る薬学的組成物であって、該修飾された ＩＬ−５が第１α−ヘリックスを持つアミノ酸配列を含むものであり、該第１α −ヘリックス内の酸性または酸様性質を有する露出したアミノ酸の一つ以上が塩 基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残基で置換されているものであり、該組 成物が一つ以上の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤をさらに含む ものである組成物。 １５． 修飾を受けるＩＬ−５が哺乳類起源のものである請求項１４記載の薬学 的組成物。 １６． 修飾を受けるＩＬ−５がヒト起源のものである請求項１５記載の薬学的 組成物。 １７． この修飾がアミノ酸位置１３または同等な位置にあるＧｌｕをＡｒｇま たはＬｙｓまたはそれらの化学的同等物またはそれらの誘導体で置換することで ある請求項１６記載の薬学的組成物。 １８． この修飾がアミノ酸位置１３または同等な位置にあるＧｌｕをＧｌｎま たはＡｓｎまたはそれらの化学的同等物またはそれらの誘導体で置換することで ある請求項１６記載の薬学的組成物。 １９． 配列番号：２に実質的に記載されたアミノ酸配列を有する修飾されたＩ Ｌ−５を含んで成る請求項１７記載の薬学的組成物。 ２０． 修飾されたヒトＩＬ−５またはその哺乳類同族体を含んで成る薬学的組 成物であって、該修飾されたＩＬ−５が第１α−ヘリックス内に下記のアミノ酸 配列を含むものであり、 Ｘａａが好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎから選択される塩基性 または非酸性アミノ酸残基であり、該組成物が一つ以上の薬学的に許容され得る 担体および／または希釈剤をさらに含むものである組成物。 ２１． このＩＬ−５のＸａａがＡｒｇである請求項２０記載の薬学的組成物。 ２２． このＩＬ−５のＸａａがＬｙｓである請求項20記載の薬学的組成物。 ２３． このＩＬ−５のＸａａがＧｌｎである請求項２０記載の薬 学的組成物。 ２４． このＩＬ−５のＸａａがＡｓｎである請求項２０記載の薬学的組成物。 ２５． 修飾されたＩＬ−５が配列番号：２に実質的に記載されたアミノ酸配列 を含むものである請求項２０記載の薬学的組成物。 ２６．治療を行うのに十分な時間および条件の下で修飾されたＩＬ−５の有効量 を哺乳類に投与する工程を含んで成る該哺乳類を治療する方法であって、該修飾 されたＩＬ−５が第１α−ヘリックス内にアミノ酸配列を含むものであり、該第 １α−ヘリックス内の酸性または酸様性質を有する露出したアミノ酸の一つ以上 が塩基性アミノ酸残基または非酸性アミノ酸残基で置換されているものである方 法。 ２７． 修飾を受けるＩＬ−５が哺乳類起源のものである請求項２６記載の方法 。 ２８． 修飾を受けるＩＬ−５がヒト起源のものである請求項２７記載の方法。 ２９． この修飾がアミノ酸位置１３または同等な位置にあるＧｌｕをＡｒｇま たはＬｙｓまたはそれらの化学的同等物またはそれらの誘導体で置換することで ある請求項２０記載の方法。 ３０． この修飾がアミノ酸位置１３または同等な位置にあるＧｌｕをＧｌｎま たはＡｓｎまたはそれらの化学的同等物またはそれらの誘導体で置換することで ある請求項２０記載の方法。 ３１． 治療を行うのに十分な時間および条件の下で修飾されたＩＬ−５の有効 量を哺乳類に投与する工程を含んで成る該哺乳類を治療する方法であって、該修 飾されたＩＬ−５が第１α−ヘリックス内に下記のアミノ酸配列を含むものであ り、 Ｘａａが好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎから選択される塩基性 または非酸性アミノ酸残基であり、該修飾されたＩＬ−５がＩＬ−５により誘導 される分裂促進効果に対し拮抗作用を示すものである方法。 ３２． このＩＬ−５のＸａａがＡｒｇである請求項３１記載の方法。 ３３． このＩＬ−５のＸａａがＬｙｓである請求項３１記載の方法。 ３４． このＩＬ−５のＸａａがＧｌｎである請求項３１記載の方法。 ３５． このＩＬ−５のＸａａがＡｓｎである請求項３１記載の方法。 ３６． 配列番号：２に実質的に記載されたアミノ酸配列を有する修飾されたＩ Ｌ−５の投与を含んで成る請求項２６または請求項３１記載の方法。 ３７． 組換えタンパクを製造する方法であって、ヌクレオチド配列を発現して 該組換えタンパクを製造することができる遺伝子構築物を細胞内に導入する工程 、この細胞を該ヌクレオチド配列の発現を許す条件下に置く工程、封入体の形で 発現される組換えタンパクを収集する工程および該封入体を該組換えタンパクを 分散させ、部分的に巻き戻すのに十分高いｐＨの条件の下でカオトロピック剤（ chaotropic agent）中で溶解させる工程、該巻き戻された組換えタンパクを希釈 しそれを再生条件下に置く工程および次いで該再生された組換えタンパクを精製 する工程を含んで成る方法。 ３８． このカオトロピック剤が尿素である請求項３７記載の方法。 ３９． 請求項３８記載の方法であって、組換えタンパクが第１α−ヘリックス を持つアミノ酸配列を含む修飾されたＩＬ−５であり、該第１α−ヘリックス内 の酸性または酸様性質を有する露出したアミノ酸の一つ以上が塩基性アミノ酸残 基または非酸性アミノ酸残基で置換されているものであり、該修飾されたＩＬ− ５がＩＬ−５のアンタゴニストとして作用するものである方法。 ４０． 請求項３８記載の方法であって、修飾されたＩＬ−５が第１α−ヘリッ クス内に下記のアミノ酸配列を含むものであり、 Ｘａａが好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｎおよびＡｓｎから選択される塩基性 または非酸性アミノ酸残基であり、該修飾されたＩＬ−５がＩＬ−５により誘導 される分裂促進効果に対し拮抗作用を示すものである方法。 ４１． ヌクレオチド配列が該組換えタンパクに融合したリーダー配列をさらに コードするものである請求項３７記載の方法。 ４２． リーダー配列がアミノ酸配列Met His Tyr His His Hisである請求項４ １記載の方法。[Claims] 1. A modified interleukin-5 (IL-5) comprising an amino acid sequence having a first α-helix, wherein the exposed interleukin-5 has acidic or acid-like properties within the first α-helix. A modified IL-5, wherein one or more of the amino acids has been replaced with a basic amino acid residue or a non-acidic amino acid residue, wherein the modified IL-5 acts as an antagonist of IL-5. 2. 2. The modified IL-5 of claim 1, wherein the IL-5 to be modified is of mammalian origin. 3. 3. The modified IL-5 of claim 2, wherein the IL-5 to be modified is of human origin. 4. 4. The modified IL-5 of claim 3, wherein the modification is to replace Glu at amino acid position 13 or an equivalent position with Arg or Lys or a chemical equivalent or derivative thereof. 5. 4. The modified IL-5 of claim 3, wherein the modification is to replace Glu at amino acid position 13 or an equivalent position with Gln or Asn or a chemical equivalent or derivative thereof. 6. A modified human IL-5 or a mammalian homolog thereof comprising the following amino acid sequence in the first α-helix: Here, Xaa is a basic or non-acidic amino acid residue preferably selected from Arg, Lys, Gln and Asn, wherein the modified IL-5 is a mitogenic effect induced by IL-5. Exhibit antagonism. 7. 7. The modified human IL-5 or a mammalian homolog thereof according to claim 6, wherein Xaa is Arg. 8. 7. The modified human IL-5 or a mammalian homolog thereof according to claim 6, wherein Xaa is Lys. 9. 7. The modified human IL-5 or a mammalian homolog thereof according to claim 6, wherein Xaa is Gln. 10. 7. The modified human IL-5 or a mammalian homolog thereof according to claim 6, wherein Xaa is Asn. 11. An IL-5 antagonist comprising an IL-5 molecule having an amino acid sequence modified in the first α-helix, wherein amino acid residue 13 is replaced by a basic amino acid residue or a non-acidic amino acid residue. An IL-5 antagonist. 12. The IL-5 antagonist according to claim 11, wherein the amino acid residue 13 is selected from Arg, Lys, Gln and Asn. 13. 13. An IL-5 antagonist according to claim 11 or claim 12, comprising the amino acid sequence substantially as set forth in SEQ ID NO: 2. 14． A pharmaceutical composition comprising a modified IL-5, wherein the modified IL-5 comprises an amino acid sequence having a first α-helix, wherein the acid or acid within the first α-helix Wherein one or more of the exposed amino acids having the same properties has been replaced by a basic amino acid residue or a non-acidic amino acid residue, and the composition comprises one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or A composition further comprising a diluent. 15. 15. The pharmaceutical composition according to claim 14, wherein the IL-5 to be modified is of mammalian origin. 16. 16. The pharmaceutical composition according to claim 15, wherein the IL-5 to be modified is of human origin. 17． 17. The pharmaceutical composition according to claim 16, wherein the modification is to replace Glu at amino acid position 13 or an equivalent position with Arg or Lys or a chemical equivalent or derivative thereof. 18. 17. The pharmaceutical composition according to claim 16, wherein the modification is to replace Glu at amino acid position 13 or an equivalent position with Gln or Asn or a chemical equivalent or derivative thereof. 19. 18. The pharmaceutical composition according to claim 17, comprising a modified IL-5 having the amino acid sequence substantially as set forth in SEQ ID NO: 2. 20. A pharmaceutical composition comprising a modified human IL-5 or a mammalian homolog thereof, wherein the modified IL-5 comprises the following amino acid sequence in the first α-helix: Xaa is preferably a basic or non-acidic amino acid residue selected from Arg, Lys, Gln and Asn, wherein the composition further comprises one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or diluents. Composition. 21. 21. The pharmaceutical composition according to claim 20, wherein the Xaa of IL-5 is Arg. 22. 21. The pharmaceutical composition according to claim 20, wherein the Xaa of IL-5 is Lys. 23. 21. The pharmaceutical composition according to claim 20, wherein the Xaa of IL-5 is Gln. 24. 21. The pharmaceutical composition according to claim 20, wherein the Xaa of IL-5 is Asn. 25. 21. The pharmaceutical composition according to claim 20, wherein the modified IL-5 comprises the amino acid sequence substantially as set forth in SEQ ID NO: 2. 26. A method of treating a mammal comprising administering to the mammal an effective amount of the modified IL-5 for a time and under conditions sufficient to effect treatment, wherein the modified IL-5 comprises An amino acid sequence within the first α-helix, wherein one or more of the exposed amino acids having acidic or acid-like properties in the first α-helix are substituted with a basic amino acid residue or a non-acidic amino acid residue. The way you are. 27. 27. The method of claim 26, wherein the IL-5 to be modified is of mammalian origin. 28. 28. The method of claim 27, wherein the IL-5 to be modified is of human origin. 29. 21. The method of claim 20, wherein the modification is replacing Glu at amino acid position 13 or an equivalent position with Arg or Lys or a chemical equivalent thereof or a derivative thereof. 30. 21. The method of claim 20, wherein the modification is replacing Glu at amino acid position 13 or an equivalent position with Gln or Asn or a chemical equivalent or derivative thereof. 31. A method of treating a mammal comprising administering to the mammal an effective amount of the modified IL-5 for a time and under conditions sufficient to effect treatment, wherein the modified IL-5 comprises The first α-helix contains the following amino acid sequence, Xaa is preferably a basic or non-acidic amino acid residue selected from Arg, Lys, Gln and Asn, wherein the modified IL-5 antagonizes the mitogenic effect induced by IL-5 The way that is. 32. 32. The method of claim 31, wherein Xaa of said IL-5 is Arg. 33. The method according to claim 31, wherein Xaa of IL-5 is Lys. 34. The method according to claim 31, wherein Xaa of IL-5 is Gln. 35. 32. The method of claim 31, wherein the Xaa of IL-5 is Asn. 36. 32. The method of claim 26 or claim 31 comprising administering a modified IL-5 having the amino acid sequence substantially as set forth in SEQ ID NO: 2. 37. A method for producing a recombinant protein, comprising introducing a gene construct capable of expressing a nucleotide sequence to produce the recombinant protein into a cell, and subjecting the cell to conditions allowing expression of the nucleotide sequence. Placing, collecting the recombinant protein expressed in the form of inclusion bodies and chaotropic agents under conditions of pH high enough to disperse and partially unwind the inclusion bodies. agent), diluting the unwound recombinant protein and subjecting it to regeneration conditions, and then purifying the regenerated recombinant protein. 38. 38. The method of claim 37, wherein said chaotropic agent is urea. 39. 39. The method of claim 38, wherein the recombinant protein is a modified IL-5 comprising an amino acid sequence having a first α-helix, wherein the exposed amino acids having acidic or acid-like properties within the first α-helix. Is substituted with one or more basic amino acid residues or non-acidic amino acid residues, wherein the modified IL-5 acts as an antagonist of IL-5. 40. 39. The method of claim 38, wherein the modified IL-5 comprises the following amino acid sequence in the first α-helix: Xaa is preferably a basic or non-acidic amino acid residue selected from Arg, Lys, Gln and Asn, wherein the modified IL-5 antagonizes the mitogenic effect induced by IL-5 The way that is. 41. 38. The method of claim 37, wherein the nucleotide sequence further encodes a leader sequence fused to the recombinant protein. 42. The method according to claim 41, wherein the leader sequence is the amino acid sequence Met His Tyr His His His.
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