JP2001510988A - プロテアーゼ活性化受容体３およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 マウスおよびヒトから得られるプロテアーゼ活性受容体３（ＰＡＲ３）をコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ、このようなｃＤＮＡから発現される組換えポリペプチドを開示する。細胞表面で発現される組換え受容体ポリペプチド、受容体断片およびアナログを、候補化合物のトロンビンとＰＡＲ３との間の相互作用の効果に対して作用物質または拮抗物質として作用する能力についてのスクリーニング法において使用する。作用物質を、創傷、血栓症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、炎症および他のトロンビン活性化障害の治療用の治療物質として用いる。拮抗物質を治療物質として用いて血液の凝集を制御し、これによって心発作および脳卒中を治療する。拮抗物質は、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺炎症（ＡＲＤＳ）および糸球体硬化症をはじめとする様々な疾患や通常の創傷治癒で認められる、傷害に対する炎症反応および増殖反応を媒介する。プロテアーゼ活性化受容体３（または受容体断片またはアナログ）に特異的な抗体およびその治療物質としての使用についても開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 プロテアーゼ活性化受容体３およびその使用 技術分野 本発明は、核酸、その核酸にコードされるプロテアーゼ活性化受容体３タンパ ク質、およびプロテアーゼ活性化受容体３タンパク質の作用物質と拮抗物質のス クリーニングアッセイに関する。 発明の背景 トロンビンすなわち血管損傷部位で生成される凝固プロテアーゼは、血小板、 白血球および間葉細胞を活性化する（Ｖｕ、Ｔ．−Ｋ．Ｈ．他（１９９１）Ｃｅ ｌｌ ６４：１０５７〜１０６８）。トロンビンによる血小板の活性化は止血お よび血栓症においては重要視されている。動物モデルでは、トロンビン阻害剤は ヒトの心発作および脳卒中の主な原因である血小板依存性血栓症を阻止する。ヒ トについて得られているデータから、動脈での血栓症を血小板機能阻害剤および トロンビン阻害剤によって阻止できる可能性があることが分かる。このため、心 発作および脳卒中の原因となる血餅の形成には血小板に対するトロンビンの作用 が関与している可能性がある。血管内皮細胞および平滑筋細胞、白血球および線 維芽細胞に対するトロンビンのもう１つの作用によって、通常の傷害および様々 な疾患（アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺炎症（ＡＲＤＳ）、糸球体硬化症 など）時に発生するような炎症反応および増殖反応が媒介されることがある。ト ロンビンが細胞をどのように活性化するかを徹底的に理解することは重要な目的 である。 トロンビンのシグナル伝達を媒介する受容体は、すでに同定されている（Ｖｕ 、Ｔ．−Ｋ．Ｈ．他（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：１０５７〜１０６８米国特許 第５，２５６，７６６号）。この受容体は新規なタンパク質分解機構による活性 を示し、ＰＡＲ１（プロテアーゼ活性化受容体１）と呼ばれている。ＰＡＲ１は 、トロンビンが結合し、ＰＡＲ１のアミノ末端エキソドメイン（ｅｘｏｄｏ ｍａｉｎ）が特異部位で切断されることで活性化される。受容体の切断によって 新たなアミノ末端が露出し、これが受容体の本体と分子間結合することによって 膜貫通シグナル伝達を起こす、繋索（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）ペプチドリガンドとし て機能する（Ｖｕ、Ｔ．−Ｋ．Ｈ．他．（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：１０５７ 〜１０６８）。この繋索リガンドドメインを模倣する合成ペプチドはＰＡＲ１作 用物質として機能し、トロンビンおよび受容体の切断とは独立して活性化する（ Ｖｕ、Ｔ．−Ｋ．Ｈ．他（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：１０５７〜１０６８）。 トロンビンの周知の細胞作用のうち、どの細胞作用がＰＡＲ１によって媒介さ れるか識別するために、近年ＰＡＲ１ノックアウトマウスが作り出された（Ｃｏ ｎｎｏｌｌｙ，Ａ．他（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８１：５１６〜５１９）。 ＰＡＲ１遺伝子の両対立遺伝子を破壊したマウスを分析することで、第２の血小 板トロンビン受容体および異なるトロンビン受容体の組織特異的な役割の決定的 な証拠が得られた。具体的には、マウスでは、ＰＡＲ１は血小板応答には重要で はないが、線維芽細胞応答で重要なものであった。 第２のプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ２）は、サブスタンスＫ受容体の類 縁を探している際にクローニングされた（Ｎｙｓｔｅｄｔ，Ｓ．，他（１９９４ ）ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９１：９２０８〜９２１２）。ＰＡＲ２の生理活性化因子 は未だに知られていない。トロンビンでは活性化されない。 発明の開示 本願明細書に開示のプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ３）は、トロンビン作 用物質および拮抗物質としての活性について化合物のライブラリーをアッセイす る際に有用である。ＰＡＲ３をコードするＤＮＡを機能的発現ベクターに配し、 株細胞で発現させ、化合物のトロンビン作用物質または拮抗物質としての活性の アッセイに利用する。 本発明は、脊椎動物の組織由来のプロテアーゼ活性化受容体３（ＰＡＲ３）を コードし、その配列を変性する実質的に純粋なＤＮＡ（ｃＤＮＡまたはゲノムＤ ＮＡ）（配列番号１、配列番号２、配列番号４および配列番号５）、及びその縮 退配列、それによってコードされる実質的に純粋なプロテアーゼ活性化受容体３ ポリペプチド、またはマウスおよびヒトから得られるアミノ酸配列配列番号６と 実質的に同一のアミノ酸配列であることを特徴とする。本発明はさらに、トロン ビンによって活性化されるＰＡＲ３受容体の断片も含む。このような断片は、配 列番号３および６と同一のアミノ酸配列を持つ場合や、あるいは配列番号３およ び配列番号６と少なくとも８０％等しいアミノ酸配列を持つ場合がある。 様々な実施例において、ＤＮＡ、受容体または受容体断片は、脊椎動物、好ま しくは、ヒトまたはマウス由来のものである。しかしながら、この遺伝子を化学 的に合成することもできる。 本発明の目的は、新規な受容体をコードするヌクレオチド配列を提供すること にある。 他の目的は、前記ヌクレオチド配列を発現するよう遺伝子的操作された細胞株 を提供することにある。 他の目的は、化合物または化合物のライブラリーが、トロンビン作用物質また は拮抗物質であるか前記ヌクレオチド配列によって発現された受容体を活性化ま たは阻止する能力を以って、アッセイ可能な方法を提供することにある。 本発明の利点は、新規なトロンビン受容体ＰＡＲ３を開示し、ＰＡＲ１または ＰＡＲ２受容体では同定することができない新規なトロンビン作用物質および拮 抗物質の同定を可能にしたことである。 本発明の特徴は、トロンビン活性およびこれによって開始される一連の生化学 機作の配列に関する情報をさらに得られるようにするという点である。 本発明の上記の目的および他の目的、利点および特徴は、本願明細書の開示の 内容を読むことで当業者らに明らかになろう。 図面の簡単な説明 図１は、マウスのプロテアーゼ活性化受容体３遺伝子コード領域ｃＤＮＡの完 全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ配列番号１および配列番号 ３）である。ヌクレオチド配列の下に示す受容体の推定アミノ酸配列は３６９個 のアミノ酸を含んでいる。推定アミノ酸配列は、ヌクレオチド５１〜５３（ＡＴ Ｇ＝Ｍｅｔ）で開始し、およびヌクレオチド１１５８〜１１６０（ＴＡＧ＝停止 コドン）で終了する。 図２は、マウスのプロテアーゼ活性化受容体３の（エキソン２を含む）ゲノム 配列（配列番号２）である。 図３は、ヒトのプロテアーゼ活性化遺伝子コード領域ｃＤＮＡのヌクレオチド および推定アミノ酸配列（それぞれ配列番号４および配列番号６）である。ヌク レオチド配列の下に示す推定アミノ酸配列は、３７４個のアミノ酸を含有してい る。ｃＤＮＡ配列のコード領域は、ヌクレオチド５８〜６０（ＡＴＧ＝Ｍｅｔ） で開始し、ヌクレオチド１１８０〜１１８２（ＴＡＧ＝ｓｔｏｐ）で終了する。 図４は、ヒトのプロテアーゼ活性化受容体３（配列番号５）のゲノム配列（エ キソン２を含む）である。 図５Ａは、マウスＰＡＲ３、ヒトＰＡＲ３、ヒトＰＡＲ１およびヒトＰＡＲ２ の推定アミノ酸配列（配列番号３、６、７、８、９）のアライメントを示す。相 同性を示すために５個の配列にギャップ（空白スペースで示す）を導入した。膜 貫通ドメインを上に並べて示してある（ＴＭＩ−７）。図５Ｂは、ヒトＰＡＲ１ 、ＰＡＲ２およびＰＡＲ３アミノ酸配列のヒルジン様部分のアライメントを示す 。 図６は、α−トロンビンの存在下および非存在下でｈＰＡＲ３またはｈＰＡＲ ３ Ｔ３９Ｐを発現するＣｏｓ７細胞上のＭ１エピトープに対するＭ１モノクロ ーナル抗体の細胞表面結合を示す棒グラフである。 図７は、Ｇａ１６の存在下および非存在下、及びα−トロンビンの存在下およ び非存在下におけるＣｏｓ７細胞でのｈＰＡＲ３シグナル伝達を示す棒グラフで ある。シグナル伝達は、ホスホイノシチドの加水分解によって測定したものであ る。 図８は、ＰＡＲ３シグナル伝達に応答して生じるホスホイノシチドの加水分解 を、Ｇα１６タンパク質の存在下および非存在下で、α−トロンビン濃度を増し てこれの関数として示すグラフである。 図９は、ＰＡＲ３シグナル伝達に応答して生じるホスホイノシチドの加水分解 を、Ｇα１６タンパク質の存在下および非存在下で、γ−トロンビン濃度を増し てこれの関数として示すグラフである。 図１０は、ＰＡＲ１およびＰＡＲ３のトロンビン特異性を比較して示すグラフ である。 好ましい実施例の詳細な説明 本プロテアーゼ活性化受容体アッセイおよびこれを使用する方法を説明する前 に、本発明は、ここに述べる特定のＤＮＡ配列、材料、方法またはプロセス（も ちろん、いずれも変更可能である）に限定されるものではないことを理解された い。また、本願明細書で用いる用語は特定の実施例を説明するためだけのもので あって、限定的なものではないことも理解されたい。本発明の範囲は添付の請求 の範囲によってのみ限定されるものである。 本願明細書および添付の請求の範囲において用いる単数形「ａ」、「ａｎｄ」 および「ｔｈｅ」は、本文中に特に明記しない限りは複数形も含むものであるこ とに注意されたい。したがって、例えば、「ＤＮＡ配列（ａ ＤＮＡ ｓｅｑｕ ｅｎｃｅ）」には、かかる配列の混合物および多数の配列を含み、「アッセイ（ ａｎ ａｓｓａｙ）」には同一の一般型のアッセイを含み、「方法（ｔｈｅ ｍ ｅｔｈｏｄ）」には本願明細書に開示の１つまたは複数の方法またはステップを 含む。 本願明細書において述べる刊行物は、本願の出願日以前に公であったものを開 示するだけのために挙げたものである。本願明細書に開示の刊行物はいずれも、 それが従来の発明であることを理由として本発明に先行するものであると解釈さ れるべきではない。 別途定義しない限り、本願明細書において用いる科学技術専門用語はいずれも 、本発明が属する技術分野の当業者らが一般に理解している意味と同一の意味を 有する。本願明細書において開示する方法および材料と同様または等価の方法お よび材料はいずれも本発明の実施または試験において利用可能であるが、本願明 細 書では好ましい方法および材料を開示する。本願明細書において開示する刊行物 はすべて、これらの刊行物を引用した関連部分の本発明の具体的な態様を開示お よび説明する目的で、その内容は参照により本願明細書に含まれるものとする。 定義 「プロテアーゼ活性化受容体３」、「ＰＡＲ３」、「ＰＡＲ３受容体」などは 、トロンビンまたはトロンビン作用物質によって特異的に活性化され、ＰＡＲ３ 媒介シグナル伝達による機作（例えば、ホスホイノシチド加水分解、Ｃａ²⁺流出 、血小板凝集など）を活性化する脊椎動物細胞表面タンパク質のすべてまたは一 部を意味する。ポリペプチドは、リガンド活性化特性（作用物質の活性化特性お よび拮抗物質の阻害特性を含む）および本願明細書で説明する組織分布を有する ものであることを特徴とする。具体的には、ＰＡＲ３受容体は配列番号２、４お よび５のＤＮＡ配列によって発現される。 「ポリペプチド」は、長さおよび翻訳後変性(例えばグリコシル化)とは無関係に アミノ酸の鎖を意味する。 「実質的に純粋な」とは、本発明によって得られるプロテアーゼ活性化受容体 ３ポリペプチドが少なくとも６０重量％を占め、タンパク質及び天然状態で付随 する天然の有機分子が夾雑していないことを意味する。好ましくは、調製物の少 なくとも７５重量％、さらに好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは 少なくとも９９重量％がＰＡＲ３ポリペプチドである。実質的に純粋なＰＡＲ３ ポリペプチドは、例えば、天然物から抽出すること、ＰＡＲ３ポリペプチドをコ ードする組換え核酸を発現させること、あるいはタンパク質を化学的に合成する ことによって得られる。純度は、例えばカラムクロマトグラフィ、ポリアクリル アミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析などの適当な任意の方法によって測定可 能である。タンパク質は、ゲル中においてバンドとして単離可能であれば実質的 に純粋である。 「実質的に同一の」アミノ酸配列とは、例えば同一クラスのアミノ酸置換であ る別のアミノ酸など、保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）なアミノ酸への置換 が起こって異なっている（例えば、ロイシンに対してバリン、リジンに対してア ルギニンなど）だけのアミノ酸配列、またはアミノ酸配列位置にある１つまたは それ以上の非保存的なアミノ酸置換、欠失または挿入断片のみが異なりながら、 変異を有する受容体の生物学的活性を破壊しないアミノ酸配列を意味する。この ような等価な受容体は、かかる受容体を天然に生成するか、あるいは以下に述べ る方法またはこれと等価な方法を用いてかかる受容体を生成するよう誘導可能な 組織または動物の細胞から抽出することによって単離することができるものであ る。あるいは、化学合成によって単離することができる。あるいは、例えばこの ような受容体をコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの単離など、標準的な組 換えＤＮＡ技術の手法を用いて単離することができる。実質的に同一の受容体は 、同一の化合物によって活性化されるなど、同一の生物学的機能を有する。 「由来の」とは、その生物のゲノムによってコードされ、その生物の細胞のサ ブセット表面に存在することを意味する。 「単離したＤＮＡ」は、本発明のＤＮＡが由来する生物の天然に発生するゲノ ムではこのＤＮＡと直接連続している（すなわち、一方が５’末端、他方が３’ 末端にある）完全コード配列と直接連続しているわけではない（すなわち、完全 コード配列と共有結合的に結合しているという意味で本来の環境には存在してい ない）ＤＮＡを意味する。したがって、この用語には、例えばベクターに組み込 まれた組換えＤＮＡ、自己複製プラスミドまたはウィルスに組み込まれた組換え ＤＮＡ、原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡの 他、他の配列とは独立して別の分子として存在する（例えば、ＰＣＲまたは制限 エンドヌクレアーゼ消化によって生成される、ｃＤＮＡ、ゲノム断片またはｃＤ ＮＡ断片）を含む。また、別のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝 子の一部である組換えＤＮＡも含む。 「単離したＤＮＡ」とは、このＤＮＡが、ベクター含有細胞中のＤＮＡによっ てコードされたタンパク質の発現を好ましくは誘導できるベクター中にあり、さ らにこのようなベクターを含有する細胞を含む（好ましくは真核生物の細胞、例 えば、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ ６１）またはＣＯＳ−７細胞 （ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ １６５１）、および上記にて引用した参考 文献Ｖｕ、Ｔ．−Ｋ．Ｈ．他．（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：１０５７〜１０６ ８）に記載されているもののようなＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞を意味することがで きる。好ましくは、このような細胞は上記のような単離したＤＮＡにより安定的 に形質移入（transfection）される。 「形質転換細胞」および「形質移入細胞」、「遺伝子的に操作された細胞」な どは、遺伝子操作によって、ＰＡＲ３をコードするＤＮＡ分子（または生物学的 に活性な断片をコードするＤＮＡ、またはそのアナログをコードするＤＮＡ）が 導入された細胞またはこれが導入された祖先を有する細胞を意味する。このよう なＤＮＡ分子は、「発現のために位置している」すなわち、ＤＮＡ分子が配列の 転写および翻訳を方向付けられたＤＮＡ配列に隣接した位置にあることを意味す る（すなわち、ＰＡＲ３タンパク質、断片またはそのアナログの生成が容易であ る）。 本願明細書において用いる「特異的に活性化する」という用語は、トロンビン 、トロンビンアナログ、ＰＡＲ３作用物質、あるいはプロテアーゼ活性化受容体 ３、受容体ポリペプチドまたは断片またはそのアナログを活性化する抗体または そのアナログなどのポリペプチドを含む他の化学物質などの試薬が本願明細書に おいて説明するようなＰＡＲ３媒介生物学的機作を開始するが、例えばプロテア ーゼ活性化受容体３ポリペプチドを含む生物学的試料などが天然に存在する際に 含んでいる他の分子とは実質的に結合しないことを意味する。 本願明細書において用いる「特異的に阻害する」という用語は、トロンビンア ナログ、ＰＡＲ３拮抗物質、あるいはプロテアーゼ活性化受容体３または受容体 ポリペプチドまたは断片またはそのアナログを活性化する抗体またはそのアナロ グなどのポリペプチドを含む他の化学物質などの試薬が、トロンビンを阻害する か、あるいはトロンビンまたは他のＰＡＲ３活性化因子によるＰＡＲ３の活性化 を阻止することを意味する。好ましくは、該試薬は自己が結合するタンパク質の ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける生物学的活性を活性化または阻 害する。 「生物学的活性」は、プロテアーゼ活性化受容体３がトロンビンまたはＰＡＲ ３作用物質に結合する能力、および生物学的機作（例えば、本願明細書で説明す るようなホスホイノシチド加水分解、Ｃａ²⁺流出および血小板凝集などの適当な カスケードをシグナル伝達する能力を意味する。 「実質的な増加」は、単なる活性の増加または他の測定可能な表現型の特徴の 対照アッセイにおいてその対照実験に比較した活性が、対照実験レベルと比較し て少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも 約１０倍に増える増加を意味する（対照実験アッセイは活性化因子の非存在下で 実施する）。 「実質的な減少」または「実質的な低下」は、活性または他の測定可能な表現 型の特徴が、対照レベルと比較して約８０％、好ましくは約５０％、より好まし くは対照レベルの約１０％以下まで減少または低下することを意味する。 「スクリーニング法」および「アッセイ法」という用語は、候補化合物のＰＡ Ｒ３リガンド作用物質として作用する能力についてのスクリーニング方法を説明 するのに用いられている。この方法は、ａ）候補作用物質化合物と組換えプロテ アーゼ活性化受容体３（またはＰＡＲ３作用物質−結合断片もしくはアナログ） とを接触させ、ｂ）受容体、受容体ポリペプチド、受容体断片またはアナログの 活性を測定し、ｃ）作用物質化合物を組換え受容体と相互作用しＰＡＲ３活性化 を引き起こすものとして同定することを含む。相互作用は、受容体を切断して分 子間受容体活性化ペプチドをアンマスキングすることであるか、または分子間受 容体活性化ペプチドを模倣することによる。繋索リガンドは、遊離作用物質より もブロックするのが困難な場合がある。このため、トロンビンのブロッキングは 、他のトロンビン基質によって応答を阻止する作用物質についての厳格な基準と なる。 「作用物質」は、特定の活性、すなわち本願の場合はＰＡＲ３リガンドとの相 互作用を、通常であれば相互作用（例えば、ホスホイノシチド加水分解、Ｃａ²⁺ 流出および血小板凝集）によって生じる生物学的機作を活性化によって引き起こ すように模倣する分子を意味する。好ましくは、作用物質とは活性化因子または 候補作用物質の非存在下で対照アッセイに対する受容体活性の実質的な増加を開 始するものである。作用物質は、天然発生ＰＡＲ３リガンドと同一、これよりも 低いまたは高い活性を有することがある。 「拮抗物質アッセイ」、「拮抗物質スクリーニング」などの用語は、天然発生 の活性化リガンドまたは作用物質とＰＡＲ３との間の相互作用と拮抗する能力に ついての候補化合物のスクリーニング方法を示す。この方法は、ａ）候補拮抗物 質化合物と、組換えＰＡＲ３（または作用物質−結合断片またはアナログ）を含 む第１の化合物とを接触させる一方、他方ではトロンビンまたはＰＡＲ３作用物 質を含む第２の化合物と接触させ、ｂ）第１および第２の化合物が候補化合物と 相互作用したかまたは該候補化合物により相互作用が防止されたかを判断し、ｃ ）拮抗物質化合物を、第１の化合物（ＰＡＲ３受容体）の第２の化合物（ＰＡＲ ３作用物質）に対する相互作用に干渉し、これによって実質的にトロンビンまた はＰＡＲ３作用物質により活性化される生物学的機作（例えば、ホスホイノシチ ド加水分解、Ｃａ²⁺流出および血小板凝集）を実質的に低下させるものとして同 定することを含む。 「拮抗物質」とは、ＰＡＲ３受容体の活性化を阻止する分子を意味する。これ は、例えばプロテアーゼ活性受容体３と相互作用して、このような相互作用（例 えばホスホイノシチド加水分解、Ｃａ²⁺流出および血小板分泌または血小板凝集 ）によって生じる生物学的機作を引き起こすトロンビンの能力などの特定の活性 を阻害することによって行うことができる。拮抗物質は、ＰＡＲ３受容体と結合 することによってその活性化を阻止することができる。 「治療」、「治療用」、「治療する」などの用語は、本願明細書では主に、所 望の薬理的および／または生理的効果を得ることを意味する語として用いられる 。この効果は、その疾患または症状を完全または部分的に防止するという意味で 予防的なものであり、かつ／または疾患および／またはその疾患に関与している 副作用を部分的または完全に治癒するという意味で療法的なものである場合があ る。本願明細書において用いる「治療」には、哺乳類、特にヒトにおける疾患の あらゆる治療が包含され、以下の事項が含まれる。 （ａ） 疾患または症状の素因がある場合もあるが、このような疾患または症 状があると診断はされていない患者の、疾患または症状の発生を防止すること、 （ｂ） 疾患症状を防止、すなわちその進行を停止させること、または （ｃ） 疾患症状を緩和、すなわち疾患の退行を引き起こすこと。 好ましい実施例 両方のスクリーニング法の好ましい実施例では、通常は表面に実質的にＰＡＲ ３が存在しない脊椎動物細胞（すなわち、ＰＡＲ活性化因子の存在下で有意なト ロンビン媒介ホスホイノシチド加水分解またはＣａ²⁺流出を呈することのない細 胞）によって組換えＰＡＲ３が安定して発現される。この脊椎動物細胞は、哺乳 類細胞、Ｒａｔ １細胞またはＣｏｓ７細胞である。候補拮抗物質または候補作 用物質は、トロンビンアナログ、ＰＡＲ３ペプチド断片またはアナログまたは抗 体などのポリペプチドを含む他の化学物質である。 本発明の受容体タンパク質は、負傷ならびに胚の発達時におけるシグナル伝達 の媒介に応答に際し、脊椎動物血小板、白血球および間葉細胞の活性化に関与す ることが多い。このようなタンパク質、特にＰＡＲ３拮抗物質は、血栓症、アテ ローム性動脈硬化症、再狭窄、通常の創傷治癒やアテローム性動脈硬化症、再狭 窄、肺炎症（ＡＲＤＳ）および糸球体硬化症を含む様々な疾患に伴う炎症などの 状態を治療するための有用な治療物質である。好ましい治療物質としては、１） 作用物質、例えば、トロンビンアナログ、ＰＡＲ３ペプチド断片またはそのアナ ログ、あるいはトロンビンとプロテアーゼ活性化受容体３との相互作用を模倣す る、または分子間受容体活性化ペプチドの作用を模倣する他の化合物など、及び 、２）拮抗物質、例えば、トロンビンアナログ、抗体、トロンビン-受容体相互 作用に干渉するかまたは受容体分子間活性化ペプチドに干渉することによってト ロンビンまたはプロテアーゼ活性化受容体３機能をブロックする他の化合物など が含まれる。用量は、既存の抗炎症剤に匹敵する値であると予想され、患者の年 齢、性別、体重および状態に応じて、少量から開始して応答性および毒性に基づ いて徐々に増加させて調節すべきである。 受容体コンポーネントは組換え手法によって生成可能であり、候補作用物質お よび拮抗物質は形質転換細胞、培養細胞を用いてスクリーニングできるため、本 発明では有用な治療物質を同定するための単純かつ短時間で行われる方法を提供 する。ＰＡＲ３遺伝子を（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡとして）単離することで 、通常はＰＡＲ３を表面に持たない細胞型においてこれを発現させ、トロンビン -受容体相互作用および受容体活性化をアッセイするための系を提供することが できる。 実施例 以下の実施例は、受容体タンパク質およびこのようなタンパク質をコードする 配列をどのように得るか、ならびにこのようなＤＮＡ配列およびタンパク質を見 出すための方法をどのように実施するかについて当業者に完全な開示および説明 を与えるためのものであり、本発明としてみなされるものの範囲を限定すること を意図したものではない。使用する数量（例えば量、温度など）に関して精度を 保証するための努力はしてはいるが、若干の実験誤差および偏差が存在すること は念頭におかれたい。特に明記しない限り、部または重量部、分子量は重量平均 分子量である。温度は摂氏である。圧力は大気圧前後である。 以下、マウスおよびヒト由来のプロテアーゼ活性化受容体３のｃＤＮＡ、ゲノ ムＤＮＡおよび受容体タンパク質をクローニングして特徴付けることについて説 明する。ＰＡＲ３ ＤＮＡを含有し、かつこれを発現することができる発現ベク ター、ならびに本発明のＤＮＡを含有し、かつこれを発現することができる形質 転換細胞についても説明する。さらに、考え得るＰＡＲ３作用物質および拮抗物 質ならびに受容体作用物質および受容体拮抗物質のスクリーニングアッセイにつ いても説明する。 実施例１ マウスプロテアーゼ活性化受容体３の単離 ＰＡＲ３を探索してクローニングするにあたり、ＲＮＡ源としてラット血小板 を用いた。ラット血小板はマウス血小板と比べると豊富であり、マウス血小板と 同様にＰＡＲ１作用物質ペプチドには応答しないためである(Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ，Ａ．他（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８１：５１６〜５１９；およびＣｏｎｎ ｏｌｌｙ，Ｔ．Ｍ．他（１９９４）Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ７２：６ ２７〜３３）。 トリゾール試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を用いて全てのＲＮＡをラット血 小板から調製した。次いでランダム六量体プライマーおよびスーパースクリプト 逆転写酵素系（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を用いてｃＤＮＡを調製した。次いで 、Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ ９６^(R) （Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ）と、２０μＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０μＭのＫＣｌ、１． ５μＭのＭｇＣｌ２、０．２μＭのｄＮＴＰおよび５０Ｕ／μｌのＴａｑポリメ ラーゼ中のプライマー５’−ＧＴＩＴＡＣＡＴＧＣＴＩ（Ａ／Ｃ）ＡＣ（Ｃ／Ｔ ）ＴＩＧＣＩ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＴＩＧＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＧＡ−３’（配列 番号１０）および５’−ＧＧＡＴＡＩＡＣＩＡＣＩＧＣＩＡ（Ａ／Ｇ／Ｔ）（Ａ ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）ＡＩＣ（Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＴＣ−３’（配列番号１ １）５μＭとを使用して、上記のｃＤＮＡをＰＣＲ増幅のテンプレートとして用 いた。ポリメラーゼ連鎖反応温度は以下の通り変化させた。９４℃で４分；９４ ℃で４５秒、３９℃で６０秒および７２℃で９０秒を３０サイクル：次いで７２ ℃で７分。ＴＡクローニングキット（カリフォルニア州Ｓａｎ ＤｉｅｇｏのＩ ｎＶｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてＰＣＲ生成物をサブクローニングした。約２０ ０ｂｐの挿入断片を含むラットｃＤＮＡクローンを核酸シークエンシングによっ て分析した。新規なＧタンパク質であると予測された１つの配列は、ＰＡＲ１お よびＰＡＲ２に関連した受容体と結合していた。この配列を用いて、ＰＣＲおよ びハイブリダイゼーション（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他（１９８９）「 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ ｌ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）と組み合わせてマウスおよびヒトのｃＤＮＡおよびゲノ ムクローンを得た。ヌクレオチド配列を図１乃至図４に示す。 次いで、このラットＰＣＲ生成物を用いて全長マウスｃＤＮＡおよびゲノムＤ ＮＡクローンをクローニングした。マウスＰＡＲ３のヌクレオチド配列および推 定アミノ酸配列を図１および図２に示す。 以下に示す機能面の研究に用いたヒトＰＡＲ３ ｃＤＮＡは、λｇｔ１０腸管 ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）からクローニングした。ヒトＰＡ Ｒ３’アミノ酸配列の特徴を、ＰＡＲ３の推定アミノ酸配列とＰＡＲ１およびＰ ＡＲ２の配列をアライメントして図５Ａおよび５Ｂに示す。図中、予測膜貫通（ ＴＭ）ドメインは上線で示し、ＰＡＲ３の予測Ａｓｎ結合グリコシル化部位は下 線で示す。切断部位（^）、ＰＡＲ１およびＰＡＲ２の繋索リガンドドメインお よびＰＡＲ３の予測繋索リガンドドメイン（下線部）を含む、アミノ末端エキソ ドメインを図５ｂにおいて比較する。ＰＡＲ３のヒルジン様ドメイン（ＦＥＥＦ Ｐ）にも下線を施してある。ヒルジンおよびＰＡＲ１における同様のＦＥＥＩＰ およびＹＥＰＦＷ配列は各々、トロンビンのフィブリノーゲン結合エキソ部位（ ｅｘｏｓｉｔｅ）を結合することが知られている。 ヒトＰＡＲ３ ｃＤＮＡは、３７４個のアミノ酸推定Ｇタンパク質結合受容体 をコードする読み取り枠を含有していた（図３）。ＧｅｎｂａｎｋおよびＥＳＴ データベースに対してＢＬＡＳＴによる検索を行ったところ、このタンパク質は 、ヒトＰＡＲ１およびＰＡＲ２（図５ａ、表Ｉ）と２８％および３０％アミノ酸 配列同一性を有する新規なものであることが明らかになった。そのアミノ末端エ キソドメインはトロンビン切断部位の可能性があり、極めてヒルジンに類似した 配列（図５ｂ）であることが明らかになった。ヒルジン自体のカルボキシル末端 と同様に、ＰＡＲ１のヒルジン様配列もトロンビンのフィブリノーゲン結合エキ ソ部位とドッキングすることが知られている。これは、トロンビンによる効率的 なＰＡＲ１切断のために重要な相互作用である(Ｖｕ，Ｔ．−Ｋ．Ｈ．他（１９ ９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５３：６７４〜６７７；Ｌｉｕ，Ｌ．他（１９９１） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６６：１６９７７〜１６９８０；Ｍａｔｈｅｗｓ ，Ｉ．Ｉ．他（１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍ ３３ ３２６６〜７９；Ｉｓｈｉ ｌ，Ｋ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７０：１６４３５〜１６４４ ０、これらの文は参照により本願明細書に含まれるものとする)。これらの観察 から、上記の新規な受容体は新規なトロンビン受容体である可能性があることが 分かった。 ヒト、マウスおよびＸｅｎｏｐｕｓから得たＰＡＲ推定アミノ酸配列の比較結 果を以下の表Ｉに示す。表中、全配列の同一性（％）と膜貫通領域の同一性（％ ）とを示してある。 ｈ＝ヒト ｍ＝マウス ｘ＝Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ （アフリカツメガエル） 実施例２ ポリペプチド発現 本発明によるポリペプチドは、適当な宿主細胞を、ＰＡＲ３コードｃＤＮＡ断 片（例えば上述したｃＤＮＡなど）の全部または一部を用いて適当な発現用運搬 手段（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｈｉｃｌｅ）で形質転換し、受容体を発現さ せることによって生成できる。 分子生物学の当業者であれば、様々な発現系のいずれを用いて組換え受容体タ ンパク質を得てもよいことは理解できよう。使用する宿主細胞の詳細は本発明で は重要なことではない。受容体は、原核生物の宿主（例えばＥ．ｃｏｌｉ）から 得てもよいし真核生物の宿主（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅまたは哺乳類細胞、例えば、ＣＯＳ−６Ｍ、ＣＯＳ−７、ＮＩＨ／３ Ｔ３またはチャイニーズハムスター卵巣細胞）から得てもよい。このような細胞 は、様々なソース（例えばメリーランド州ＲｏｃｋＶｉｌｌｅのＡｍｅｒｉｃａ ｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から人手することがで きる。形質移入方法と、どの発現用運搬手段を用いるかとは、選択する宿主系に よって異なる。形質転換および哺乳類細胞への形質移入方法は、例えば、Ａｕｓ ｕｂｅｌ他．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ 、（１９８９））に説明されている。発現用運搬手段は、例えば、Ｃｌｏｎｉｎ ｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｐｏｕｗｅｌ ｓ，Ｐ．Ｈ．他．、（１９８５）、Ｓｕｐｐ．１９８７）から提供されているも のなどから選択できる。 特に好ましい発現系は、受容体タンパク質またはその生物学的に活性な断片を 含有または発現する発現ベクターを形質移入したＶｕ他のＸｅｎｏｐｕｓ卵母細 胞（上記Ｖｕ他、Ｃｅｌｌ（１９９１））および昆虫細胞（ＳＦ９−バキュロウ ィルス）である。ヒトまたはマウスＰＡＲ３または適当な受容体断片またはアナ ログ（上述）をコードするＤＮＡを、発現できるように設計された向きで発現ベ クターに挿入する。あるいは、安定的に形質移入された哺乳類株細胞によってＰ ＡＲ３（または生物学的に活性な受容体断片またはアナログ）を発現させる。上 記の発現用運搬手段と共に使用可能な他の好ましい宿主細胞としては、ＮＩＨ／ ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣアクセス番号１６５８）が挙げられる。この発現を本発明 のスクリーニング法（後述）で使用してもよい。あるいは、必要であれば、組換 え受容体タンパク質を後述するように単離してもよい。 哺乳類細胞への安定した形質移入に適した多数のベクターが一般に利用可能で ある。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ他．（上記）を参照のこと。このような株細胞を 構築するための方法も一般に利用可能である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ他．（上 記 ）を参照のこと。一例として、この受容体（または受容体断片またはアナログ ）をコードするｃＤＮＡを、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含む発 現ベクターにクローンする。ＰＡＲ３コード遺伝子の、プラスミドへの、および 結果として宿主細胞染色体への組込みは、（上記Ａｕｓｕｂｅｌ他．に記 載されているように）に０．０１〜３００μＭのメトトレキセート含有細胞培地 によって選択される。この優性選択は、ほとんどの細胞型において達成可能であ る。組換えタンパク質発現は、形質移入した遺伝子のＤＨＦＲ媒介増幅によって 高めることが可能である。遺伝子増幅を有する株細胞の選択方法は、Ａｕｓｕｂ ｅｌ他．（上記）に記載されている。このような方法は一般に、メトトレキセー ト濃度を徐々に増加させた培地において延長培養（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｃｕｌｔ ｕｒｅ）することを必要とする。この目的で一般に用いられているＤＨＦＲ含有 発現ベクターとしては、ｐＣＶＳＥＩＩ−ＤＨＦＲおよびｐＡｄＤ２６ＳＶ（Ａ ）（上記Ａｕｓｕｂｅｌ他．に記載）が挙げられる。上記にて述べた宿主細胞の いずれか、あるいは、好ましくはＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ株細胞（例えば、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞、ＡＴＣＣアクセス番号ＣＲＬ ９０９６）は、安定的に形質移入 された株細胞またはＤＨＦＲ媒介遺伝子増幅のＤＨＦＲ選択に好ましい宿主細胞 に含まれる。 特に好ましい安定的発現系の１つとして、ｐｃＤＮＡＩ／ＮＥＯ発現ベクター （カリフォルニア州Ｓａｎ ＤｉｅｇｏのＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社製）で安定し て形質移入されたＲａｔ−１細胞（ＡＴＣＣ）がある。 組換え受容体（例えば本願明細書に記載の任意の発現系から生成）の発現は、 組換え細胞抽出物のウェスタンブロットまたは免疫沈降分析などの免疫学的な手 順、あるいは無傷組換え細胞の免疫蛍光法（例えば上記Ａｕｓｕｂｅｌ他．に記 載の方法を使用）によってアッセイ可能である。組換え受容体タンパク質は、こ の受容体向けの抗体を用いて検出される。以下に述べるのは、無傷受容体または 適当なプロテアーゼ活性受容体３エピトープを含むペプチドを免疫原として用い て、抗プロテアーゼ活性化受容体３抗体を生成するための方法である。ＰＡＲ３ 断片またはアナログの発現を検出するために、上記の断片またはアナログに含ま れるエピトープを免疫原として使用して抗体を生成することが好ましい。 組換えＰＡＲ３タンパク質（または断片またはそのアナログ）が発現すれば、 例えば免疫親和性クロマトグラフィを用いてこれを単離する。一例として、抗Ｐ ＡＲ３抗体をカラムに取り付けて無傷受容体または受容体断片またはアナログの 単離に使用する。アフィニティクロマトグラフィに先立って、標準的な方法（例 えば、上記Ａｕｓｕｂｅｌ他．を参照のこと）で受容体を包む細胞の溶解および 分取を行ってもよい。単離後、必要であれば、例えば高性能液体クロマトグラフ ィなどによって上記組換えタンパク質をさらに精製することができる(例えば、 Ｆｉｓｈｅｒ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、ｅｄｓ．、 Ｗｏｒｋ ａｎｄ Ｂｕｒｄｏｎ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、（１９８０）を参照のこ と)。 本発明の受容体、特に短い受容体断片は、化学合成（例えば、Ｓｏｌｉｄ Ｐ ｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ 、（１９８４）第２版、イリノ イ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｔｈｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．に記 載されている方法）によっても生成可能である。 実施例３ 組換えプロテアーゼ活性化受容体３の切断および活性化の研究 ＰＡＲ３は、Ｃｏｓ７細胞の表面で発現させるとトロンビンに対する基質とな ることが示された（図６）。部位アミノからトロンビン切断部位においてＦＬＡ Ｇエピトープ（アミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤ（配列番号１２））を示している受容 体をコードするように修正されたヒトＰＡＲ１またはＰＡＲ３のｃＤＮＡを、Ｃ ｏｓ７細胞において一時的に発現させた。エピトープタグを施したＰＡＲ１につ いては、従来説明されている（Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．他．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ．２６８：９７８０〜９７８６）。エピトープタグを施した類似のＰ ＡＲ３ ｃＤＮＡを構築し、プロラクチンシグナルペプチド、推定シグナルペプ チダーゼ部位（／）、ＦＬＡＧエピトープＤＹＫＤＤＤＤ（配列番号１２）およ びＰＡＲ３においてアミノ酸１７に融合した結合ＶＥを表す配列ＭＤＳＫＧＳＳ ＱＫＧＳＲＬＬＬＬＬＶＶＳＮＬＬＬＣＱＧＶＶＳ／ＤＹＫＤＤＤＤＶＥ−ＴＦ （配列番号１３）で、新たなアミノ末端をコードできるようにした。 哺乳類発現ベクターｐＢＪｌにｃＤＮＡをサブクローニングした。受容体切断 の研究のため、Ｉｓｈｉｉ他．（Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．他．（１９９３）（上述）） に記載の手順で、細胞表面のＦＬＡＧエピトープに結合しているＭ１抗体（Ｋｏ ｄａｋ）のトロンビン媒介ロスおよびＤＥＡＥ−デキストランを用いてＣｏｓ７ 細胞を形質移入した。この系では９５％を超えるＭ１抗体結合が形質移入依存性 であった。２０ｎＭトロンビン（図６）の存在下（開放カラム）または非存在下 （閉鎖カラム）で細胞を３７℃で５分間インキュベートした。切断部位の生化学 的同定のため、可溶性ＰＡＲ３アミノ末端エキソドメインのトロンビンによる切 断を以下の通リアッセイした。アミノ末端エキソドメイン残基２１〜９４が翻訳 開始タグとヘキサヒスチジンタグとの間に挟まれた（すなわち、ＭＧ−［ＰＡＲ ３ ２１−９４］−ＶＥＨＨＨＨＨＨ；ここで、ＶＥＨＨＨＨＨＨは配列番号１ ８である）組換えＰＡＲ３可溶エキソドメインを調製した。組換えタンパク質を Ｅ．ｃｏｌｉ内で可溶性ポリペプチドとして発現させ、精製し、ＰＡＲ１の類似 の領域について上述した方法（Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ ｈｅｍ．２７０：１６４３５〜１６４４０）でトロンビン切断前後に分析した。 ５０ｎＭトロンビン溶液で３７℃にて１時間かけて組換え可溶性アミノ末端エキ ソドメインを切断した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。トロンビン濃度 を高めてインキュベート時間を延ばしても、検出可能な切断機作は１例しか得ら れず、ＰＡＲ３エキソドメインに存在するトロンビン切断部位は１つしかないこ とが分かった。切断生成物のアミノ酸シークエンシングによって、配列ＴＦＲＧ （図１ｂ参照）を有する新規なアミノ末端は１つしかないことが明らかになった 。このため、トロンビンはアミノ酸Ｋ３８とＴ３９との間のアミノ末端エキソド メインでＰＡＲ３を高い特異性で認識および切断する。 実施例４ ＰＡＲ３シグナル伝達活性 ＰＡＲ３がトロンビンによってシグナル伝達を媒介する能力を試験した。エピ トープタグを施したヒトＰＡＲ３（ｈＰＡＲ３）、Ｔ３９Ｐ切断部位突然変異ま たはＦ４０Ａ繋索リガンドドメイン突然変異を有するｈＰＡＲ３をコードするｃ ＲＮＡをＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞に微量注入した。トロンビンで引き起こされた⁴⁵ Ｃａ放出をＶｕ他．（Ｖｕ，Ｔ．−Ｋ．Ｈ．他．（１９９１）（上述）） に記載されているようにして測定した。Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．他．の方法（Ｉｓｈｉ ｉ，Ｋ．他（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１６４３５〜１６４ ４０およびＩｓｈｉｉ，Ｋ．他（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８： ９７８０〜９７８６、いずれもその内容は参照により本願明細書に含まれるもの とする）で、Ｍ１抗体結合によって野生型および変位株受容体の表面発現を確認 した。 Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞にヒトＰＡＲ３ ｃＲＮＡを微量注入することで、こ の系での作用物質により引き起こされるホスホイノシチド加水分解を反映してい るトロンビン依存性⁴⁵Ｃａ流動（図７）が起こった。ＰＡＲ３のトロンビン切断 部位の突然変異はトロンビンシグナル伝達を除去し、トロンビンは、１μＭとい う高い濃度でもＰＡＲ３を活性化できない活性部位阻害剤ＰＰＡＣＫによってタ ンパク質分解的に不活性になった。これらのデータから、ＰＡＲ３をトロンビン で活性化するにはＫ３８−Ｔ３９ペプチド結合の切断が必要である可能性が非常 に高いことが分かる。 ＰＡＲ３およびＰＡＲ１シグナル伝達の特異性についても検討した。プロテア ーゼで引き起こされた⁴⁵Ｃａ放出を、様々な濃度のアルギニン／リジン特異セリ ンプロテアーゼトリプシン、Ｘａ因子、ＶＩＩａ因子、組織プラスミノーゲン活 性化因子またはプラスミンで刺激したヒトＰＡＲ１またはＰＡＲ３を発現するＸ ｅｎｏｐｕｓ卵母細胞において測定した。キモトリプシン、エラスターゼおよび カテプシンＧも試験した。ＰＡＲ３は少なくともトロンビン受容体ＰＡＲ１と同 様のトロンビン特異性を有していた（図１０）。 Ｃｏｓ７細胞のＰＡＲ３シグナル伝達も試験した。Ｃｏｓ７細胞にヒトＰＡＲ １またはＰＥＲ３を形質移入した。次に、Ｉｓｈｉｉ他．およびＮａｎｅｖｉｃ ｚ他．（Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．他（１９９３）（上述）；およびＮａｎｅｖｉｃｚ， Ｔ．他（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７０２〜７０６）に記載 されているようにして、³Ｈ−イノシトールで細胞を代謝標識し、図示のα−ト ロンビン濃度（図８）またはγ−トロンビン濃度（図９）に応答してのホスホイ ノシチド加水分解を測定した。 造血株細胞（Ａｍａｔｒｕｄａ ＩＩＩ，Ｔ．Ｔ．他．（１９９１）Ｊ．Ｂｉ ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：５５８７〜５５９１）において発現させたＧタンパク 質αサブユニットであるα１６の同時形質移入によって、３回の実験それぞれに おいて上記の細胞でのトロンビンに対する最大ＰＡＲ３媒介応答が５０〜１５０ ％上昇した（図７）。 この系でのＰＡＲ３によるトロンビンシグナル伝達のＥＣ₅₀は約０．２ｎＭで あった。これは、ＰＡＲ１において認められる値に匹敵し、生理学的に達成可能 なトロンビン濃度範囲に十分おさまっている（図８）。アニオン結合エキソ部位 において欠失のあるγ−トロンビン（Ｒｙｄｅｌ，Ｔ．Ｊ．他．（１９９４）Ｊ ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２０００〜２２００６）は、α−トロンビン よりも対数単位が２つ小さかった（ＥＣ₅₀＝２０ｎＭ；図９）。同様に、α−ト ロンビンをフィブリノーゲン結合エキソ部位ブロッカーヒルゲン（ｈｉｒｕｇｅ ｎ）（Ｓｋｒｚｙｐｃｚａｋ，Ｊ．Ｅ．他（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２１ ：１３７９〜１３９３）と共にインキュベートすると、用量応答曲線２対 数（図示せず）が右シフトする。ヒルジンおよびＰＡＲ１（図５Ｂ）との類似性 から、トロンビンのフィブリノーゲン結合エキソ部位とドッキングすると予測さ れる残基である、ＰＡＲ３のヒルジン様配列におけるＦ ４８およびＥ ４９で のアラニン置換もＰＡＲ３によるトロンビンシグナル伝達を低下させた。これら のデータから、ＰＡＲ３はＰＡＲ１と同様の方法でトロンビンと相互作用する可 能性が高いことが分かる（Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｉ．Ｉ．他．（１９９４）Ｂｉｏｃ ｈｅｍ．３３：３２６６〜３２７９）。具体的には、ＰＡＲ３アミノ酸４８〜５ ２（ＦＥＥＦＰ、配列番号１４）がトロンビンのフィブリノーゲン結合エキソ部 位とドッキングし、一方アミノ酸３５〜３８（ＬＴＰＫ、配列番号１５）がトロ ンビンの活性中心とドッキングしてＫ ３８−Ｔ ３９ペプチド結合の切断を引 き起こすことが多い。 受容体タンパク質分解によってアンマスキングされた新たなアミノ末端を模倣 する合成ペプチドすなわち、いわゆる「繋索リガンドドメイン」は、ＰＡＲ１お よびＰＡＲ２に対する作用物質として作用する（Ｖｕ，Ｔ．Ｋ．−Ｈ．他（１９ ９１）Ｃｅｌｌ ６４：１０５７〜１０６８；Ｎｙｓｔｅｄｔ，Ｓ．他（１９９ ４）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１：９２０８〜９２１２および米国特許第５，２５６ ，７６６号、これらの内容は参照により本願明細書に含まれるものとする）。 ＰＡＲ３の繋索ドメインと相同なペプチドをＰＡＲ３活性の潜在的な作用物質 として試験してもよい。２個のペプチドすなわちＴＦＲＧＡＰ（配列番号１６） およびＴＦＲＧＡＰＰＮＳ（配列番号１７）を合成し、ホスホイノシチド加水分 解で測定されるＰＡＲ３シグナル伝達を引き起こすことによって、トロンビンの 作用を模倣する機能について試験した。ヒトＰＡＲ３を発現しているＣｏｓ７細 胞を最大１００μＭの濃度でペプチドと共にインキュベートした。対照レベルを 上回るホスホイノシチド加水分解は観察されなかったことから、これらの条件下 では合成ペプチドはＰＡＲ３によって検出可能なシグナル伝達を起こしていない ことが分かった。一方、同一のアッセイ条件下でαトロンビンのＥＣ₅₀は０．２ ｎＭであることが分かった。これらの結果から、ホスホイノシチド加水分解をモ ニタリングすることで、潜在的な薬剤として用いるためのＰＡＲ３シグナル伝達 についての活性に対する潜在的な作用物質を評価するための有用な手段が得られ ることが分かる。 ＰＡＲ３の繋索リガンドドメインは、トロンビンによるＰＡＲ３活性化に必要 なものであった。ＰＡＲ１繋索リガンドにおいて重要なＰｈｅ ４３（Ｓｃａｒ ｂｏｒｏｕｇｈ，Ｒ．Ｍ．他．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７： １３１４６〜１３１４９）と類似のＰｈｅ ４０をＡｌａと置換すること（Ｆ４ ０Ａ ＰＡＲ３変位株）で、ＰＡＲ３シグナル伝達は起こったが、トロンビンに よるＰＡＲ３切断は起こらなかった。Ｌｙｓ３８−Ｔｈｒ３９ペプチド結合の切 断はＰＡＲ３活性化に必要であるという観察結果から、ＰＡＲ３はおそらくＰＡ Ｒ１および２で用いられているのと同一の繋索リガンドによって活性化されるの ではないかと思われる。 実施例５ マウスおよびヒトにおけるＰＡＲ３の組織発現 マウス組織を切片上ハイブリダイゼーションしたところ、マウス脾臓の巨核球 にＰＡＲ３ ｍＲＮＡが存在することが明らかになった。検討対象とした組織( 脳、眼、胸腺、心臓、肺、肝臓、脾臓、膵臓、胃、小腸、大腸、腎臓、膀胱、子 宮、卵巣、精巣、骨格筋、末梢神経,および皮膚）では、バックグラウンドに対 して明らかなクリアカット（ｃｌｅａｒｃｕｔ）ハイブリダイズした細胞は脾臓 の巨核球のみであった。センス鎖プローブ対照を用いてハイブリッド形成を実施 した対照実験試料では、すべての細胞でネガティブであった。マウス組織のＰＡ Ｒ３ ｍＲＮＡについてノーザン分析を行ったところ、脾臓および肺にシグナル が認められ、脳、心臓および他の組織で低レベルであった。脾臓はマウスの造血 器官であり、巨核球が肺の微小血管系に捕捉されたように見える場合がある。こ のため、ノーザン分析のデータとin situハイブリダイゼーションのデータの両 方から、ＰＡＲ３はマウスの巨核球で最も豊富に発現されるものと思われる。 Ｃｏｓ細胞におけるｈＰＡＲ３活性化の薬理は、マウス血小板活性化の薬理に 類似している。これらの応答はいずれも、α−トロンビンによる活性化について ｎＭ以下のＥＣ₅₀を示しており、トロンビン活性部位であり、フィブリノーゲン 結合エキソ部位依存性である。これらの観察結果は、ＰＡＲ３のマウスにおける 相同体は、マウス血小板におけるトロンビン応答を媒介するトロンビン受容体で あるという概念を支持するものである。ヒト血小板におけるヒトＰＡＲ３の機能 であるかは判断されていない。 in situハイブリダイゼーションを以下のようにして実施した。麻酔をしたＣ ５７ＢＬ／６マウス成体を４％パラホルムアルデヒドで還流固定した。被験器官 を解剖し、トリミングし、４％パラホルムアルデヒド中にて４時間浸漬固定した 。処理した組織をパラフィンに埋め込み、５ｍｍの断片を切り取った。ｐＢｌｕ ｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ^-（カリフォルニア州Ｓａｎ ＤｉｅｇｏのＳｔｒ ａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲ１部位にサブクローニングしたマウスＰＡＲ２ ｃ ＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏでセンスまたはアンチセンス³⁵Ｓ−リボプローブを 転写した。ハイブリダイゼーション、洗浄および現像の条件はマウスＰＡＲ１で 報告されている通り（Ｓｏｉｆｅｒ，Ｓ．Ｊ．他（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔ ｈｏｌ．１４４：６０〜６９）とした。ノーザン分析を実施するために、 膜貫通ドメイン２〜３を表すマウスｃＤＮＡコドンに対応するＰＣＲ増幅ＤＮＡ 断片のランダムプライミング（Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩキット；ＳＴｒａｔａｇ ｅｎｅ社製）によってマウスメッセージ用の³²Ｐ−標識プローブを生成した。ス トリンジェント度の高いハイブリダイゼーションおよび洗浄を、ノーザン分析用 のＣｌｏｎｔｅｃｈ社プロトコルにより実施した。 ヒトの組織をノーザン分析したところ、小腸、骨髄、心臓、膵臓、肺、肝臓、 副腎、気管、リンパ節、胃および末梢血白血球にシグナルが認められ、ＰＡＲ３ ｍＲＮＡは広く分布していることがあきらかになった。このような様々なヒト 組織におけるＰＡＲ３の役割は未定義である。ヒトの骨髄および白血球における ＰＡＲ３についての所見は、ＰＡＲ３がトロンビンによって血小板および他の造 血細胞の活性化を媒介する役割を持っているという見方と一致している。 実施例６ プロテアーゼ活性化受容体３機能についてのアッセイ 本発明の有用な受容体断片またはアナログは、トロンビンと相互作用し、活性 化されてトロンビンに関連した機作のカスケードすなわち受容体相互作用を開始 するものである。このような相互作用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイ法（例 えばホスホイノシチド加水分解アッセイ、⁴⁵Ｃａ流出アッセイまたは本願明細書 で述べる血小板凝集アッセイなど）によって検出できる。この方法は、コンポー ネントとして、トロンビンと、トロンビン結合を可能にするように構築された組 換えプロテアーゼ活性化受容体３（または適当な断片またはアナログ）(例えば 、本願明細書に記載のポリペプチドなど)とを含む。トロンビンは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）または同様の提供 業者から入手することができる。 このプロテアーゼ活性化受容体３コンポーネントは、自然な状態では実質的に 受容体が表面に存在しない細胞によって生成されたもの、例えば、このような細 胞を操作して適当な発現系で受容体コンポーネントをコードする核酸を含むよう にしたものなどであると好ましい。適した細胞としては、例えば、Ｒａｔ−１細 胞またはＣＯＳ−７細胞など、組換え受容体の生成に関して上述したものなどが 挙げられる。 実施例７ プロテアーゼ活性化受容体３活性化因子拮抗物質および作用物質のスクリーニン グ 拮抗物質 上述したように、本発明の一態様は、トロンビン（または他のＰＡＲ３活性化 化合物）とプロテアーゼ活性化受容体３との間の相互作用を阻害する化合物をス クリーニングし、この相互作用によって媒介される機作のカスケードを防止また は低減することを特徴とするものである。スクリーンの要素は、ＰＡＲ３活性化 因子（トロンビンなど）、候補拮抗物質の他、ＰＡＲ３活性化因子、拮抗物質お よびＰＡＲ３機能の検出が可能なように構築された組換えＰＡＲ３（または上記 にて概説した適当な受容体断片またはアナログ）である。さらに他の要素として 、ホスホイノシチドなどの下流側の基質があってもよい。この場合、ホスホイノ シチドの加水分解を用いてトロンビン活性（Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．他．（１９９３） 上述；およびＮａｎｅｖｉｃｚ，Ｔ．他．（１９９６）上述）を測定する。 トロンビン誘導血小板凝集の阻害は、ＰＡＲ３受容体活性化の拮抗物質のモニ タリング手段としても使用することができる。トロンビンを候補阻害化合物（ペ プチドなど）と共に５分間インキュベートし、次いでこの混合物を洗浄した血小 板に添加し、蛍光凝集計測（ｌｕｍｉａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｒｙ）によって血小 板ＡＴＰ分泌時に血小板活性化が行われる（例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ａ．Ｊ ．他．Ｎａｔｕｒｅ ３８１：５１６〜５１９（１９９６）；および米国特許第 ５，２５６，７６６号を参照のこと）。あるいは、血小板を候補ＰＡＲ３拮抗物 質と共に５分間インキュベートする。その後、トロンビンに対する応答を測定す る。 スクリーニングアッセイでトロンビンと共に潜在的な拮抗物質を含ませること で、確証的な受容体拮抗物質をスクリーニングし、血小板凝集などのトロンビン 媒介機作を減少させるものとして同定することができる。 適当な候補トロンビン拮抗物質としては、ＰＡＲ３断片、特に、細胞外にある ためトロンビンまたは繋索リガンドと結合しやすいと予測されたタンパク質の断 片が含まれる。このような断片は、５個以上のアミノ酸を含むものであると好ま しい。候補ＰＡＲ３拮抗物質は、トロンビンアナログならびに他のペプチドおよ び非ペプチド化合物および抗ＰＡＲ３抗体を含む。 作用物質 本発明の他の態様は、ＰＡＲ３リガンド作用物質として作用する化合物のスク リーニングを特徴とするものである。トロンビンまたは作用物質によるＰＡＲ３ の活性化によって、ホスホイノシチド加水分解、Ｃａ²⁺流出および血小板凝集な どの機作のカスケードが引き起こされ、トロンビンまたは他の作用物質活性を測 定するために都合のよい手段が得られる。 本発明の作用物質スクリーニングアッセイでは、ＰＡＲ３機能を検出できるよ うに構築した組換えＰＡＲ３（または本願明細書で概説した受容体断片またはア ナログ）を発現する組換え細胞を用いている。あるいは、白血球、血小板または 間葉細胞などの自然の状態でＰＡＲ３を発現する細胞を用いてもよい。スクリー ンの他の要素としては、放射線標識ホスホイノシチドなどのＰＡＲ３活性化の検 出可能な下流側基質が挙げられる。この場合、ホスホイノシチドの加水分解によ って検出可能な生成物が生じることで、候補作用物質によるＰＡＲ３活性化が示 される。 ＰＡＲ３を発現する細胞からの⁴⁵Ｃａ流出を、候補作用物質による受容体活性 化を測定するための手段として用いられよう（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ＪＡ．他（１ ９８８）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：４９３９〜４９４３；Ｖｕ，Ｔ．−Ｋ．Ｈ ．他（１９９１）、Ｃｅｌｌ ６４：１０５７〜１０６８；および米国特許第５ ，２５６，７６６号、これらの内容は参照により本願明細書に含まれるものとす る）。ＰＡＲ３をコードするｃＲＮＡを発現する卵母細胞による⁴⁵Ｃａ放出を以 下の通り評価する。簡単に言うと、５０μＣｉの⁴⁵ＣａＣｌ₂（１０〜４０ｍＣ ｉ／ｍｇ Ｃａ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を含有する３００μｌのカルシウムフ リーＭＢＳＨ中で、３０個の卵母細胞のグループを室温にて４時間インキュベー トすることによって、細胞内カルシウムプールを標識する。標識した卵母細胞 を洗浄し、次いで抗生物質なしで９０分間ＭＢＳＨ ＩＩ中にてインキュベート する。卵母細胞５個からなるグループを選択し、抗生物質なしで０．５ｍｌ／ウ ェルのＭＥＳＨ ＩＩを含む２４ウエルの組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ ３ ０４７）の各ウェルに入れる。１０分ごとに培地を取り出して新鮮な培地と交換 し、収穫した培地をシンチレーションカウントによって分析し、１０分間のイン キュベーションそれぞれの間の卵母細胞の⁴⁵Ｃａ放出を求める。単位時間あたり の⁴⁵Ｃａ放出のベースラインが安定するまで１０分間のインキュベーションを継 続する。１０分間の回収をさらに２回行った上で、作用物質を含む試験培地を添 加し、作用物質によって誘導される⁴⁵Ｃａ放出を判断する。 電位固定アッセイは、作用物質の活性をモニタリングするための別の方法であ る。単電極電位固定法を用いること以外は本質的に上述したもの(Ｊｕｌｉｕｓ ，Ｄ．他．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１：５５８〜５６３、その内容は参 照により本願明細書に含まれるものとする)と同様にして、ｃＲＮＡをコードす るトロンビン受容体を発現する電位固定卵母細胞において、作用物質によって誘 発される塩化物の内部流（inward chloridccurrcnt）を測定する。 血小板凝集もＰＡＲ３受容体活性化をモニタリングするための手段として用い ることができる（例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ａ．Ｊ．他Ｎａｔｕｒｅ ３８１ ：５１６〜５１９（１９９６）を参照のこと）。特に、マウス血小板はトロンビ ンシグナル伝達にＰＡＲ３のみを利用することができる。ヒト血小板は、ＰＡＲ １およびＰＡＲ３の両方を利用できる。このため、いずれもＰＡＲ３で対抗機能 をなくすのに有用である。 本発明において有用な作用物質は、例えばホスホイノシチド加水分解を引き起 こす経路のような、通常のトロンビン媒介シグナル伝達経路を模倣するものであ る。適した候補作用物質としては、トロンビンアナログまたはＰＡＲ３繋索リガ ンドドメイン、あるいはトロンビンまたはＰＡＲ３繋索リガンドドメインの作用 を模倣する他の試薬が挙げられる。作用物質は、拮抗物質を発見する際の補助手 段として有用である。 実施例８ 抗プロテアーゼ活性化受容体３抗体 プロテアーゼ活性化受容体３（または免疫原受容体断片またはアナログ）を用い て本発明に有用な抗体を産生させることができる。抗体の生成に好ましい受容体 断片は、細胞外性であることが推論または実験によって示された断片である。 ＰＡＲ３ペプチド向けの抗体は、以下のようにして生成される。ＰＡＲ３タン パク質の全部または一部に対応するペプチドは、ペプチド合成器を用いて標準的 な手法によって生成される。このペプチドを、ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミドエステルを用いてＫＬＨと結合する。このＫＬＨ−ペプチ ドをフロイントのアジュバントと混合し、例えばモルモットまたはヤギなどの動 物に注射し、ポリクローナル抗体を生成する。上述したＰＡＲ３ポリペプチドお よび標準的なハイブリドーマテクノロジー（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｎａｔｕ ｒｅ （１９７５）２５６：４９５、１９７５；Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ ．（１９７６）６：２９２；Ｋｏｈｌｅｒ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍ ｕｎｏｌ ．（１９７６）６：５１１；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ他、ｉｎ Ｍｏｎｏ ｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏ ｍａｓ 、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＮＹ、（１９８１）；および上記Ａｕｓｕｂｅｌ他 ）を用いてモノクローナル抗体を調製してもよい。ペプチド抗原アフィニティク ロマトグラフィによって抗体を精製する。 生成後、抗体のＰＡＲ３と結合する能力を、ウェスタンブロットまたは免疫沈 降分析（例えば上記Ａｕｓｕｂｅｌ他．、上述で述べられている方法など）によ ってＰＡＲ３−形質移入細胞の表面に対する特異結合によって試験する。 ＰＡＲ３を特異的に認識する抗体は、有用な拮抗物質の候補である場合が多い とみなされる。このような候補の、トロンビンとＰＡＲ３との間の相互作用に特 異的に干渉する能力についてさらに試験する（本願明細書にて説明する機能的拮 抗物質アッセイを使用）。トロンビン-ＰＡＲ３結合またはＰＡＲ３機能と拮抗 する抗体は、本発明における有用な拮抗物質であるとみなされる。 実施例９ 治療法 創傷治癒、血栓症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、炎症および他のトロン ビン媒介シグナル伝達性の障害の治療に特に適した治療物質は、生理食塩水など の適当な緩衝液中で組成した上述の作用物質および拮抗物質である。膜界面にお いて受容体断面コンホメーションを模倣することが特に望ましい場合では、断片 が隣接する膜貫通残基を十分数含むことがある。この場合、断片は適当な脂質画 分と付随する（例えば脂質小胞中にあるかまたは細胞膜を破壊することによって 得られる断片に付着している）ことがある。あるいは、上述したようにして生成 された抗ＰＡＲ３抗体を治療物質として使用してもよい。繰り返すが、抗体は薬 学的許容される緩衝液（例えば生理食塩水）中で投与される。適している場合に は、抗体の調製に適当なアジュバントを組み合わせて用いてもよい。 ＰＡＲ３に対する抗体は、上記にて示したようにして組成可能な有用な拮抗物 質である。他の治療的に有用な拮抗物質は、トロンビンと結合およびトロンビン をブロックし、薬学的に許容される担体と、 （１） 単離配列 ＬＰＩＫＴＦＲＧＡＰＰＮＳＦＥＥＦＰＦＳＡＬＥ； （２） 切断不能のトロンビン阻害剤 ＬＰＩＫＰＦＲＧＡＰＰＮＳＦＥＥＦＰＦＳＡＬＥ ここで、ＰＡＲ３切断部位Ｐ１’は突然変異によって切断を阻止してい る； （３） 切断不能のトロンビン阻害剤ＬＰＩ （ｈＲ）ＴＦＲＧＡＰＰＮＳＦＥＥＦＰＦＳＡＬＥ ここではＰＡＲ３切断部位Ｐ１は突然変異によって切断を阻止されて おり、ｈＲはβホモアルギニン（主鎖に加えてメチレン基が存在する）で ある； （４） 切断不能のトロンビン阻害剤 （ｄＦ）ＰＲＰＦＲＧＡＰＰＮＳＦＥＥＦＰＦＳＡＬＥ ここでは優れた活性部位結合配列ｄＦＰＲがＬＰＩＫに置換されてお り、ｄＦはＤ−フェニルアラニンである； （５） 配列ＴＦＲＧＡＰＰＮＳの全部または一部がＧＧＧなどのスペーサ 配列と置き換わった上記（１）〜（４）のうちいずれか； （６） 拮抗物質として作用する（１）〜（５）のバリエーションおよび組 み合わせ； のうち１つ以上とを含むＰＡＲ３由来のペプチドである。 治療対象の状態に応じて治療用調製物を投与する。通常、所望の応答を誘発す るのに適当なタイミングおよび期間の薬用量で静脈投与される。適当なタイミン グとは、例えば、治療用調製物が所望の応答を誘発する、創傷からの時間や治療 投与間隔などを意味する。あるいは、例えば液体またはスプレーとして、経口投 与、経鼻投与または局所投与すると都合がよい場合もある。投薬用量は、動物の 体内に運ばれて疾患症状を実質的に軽減または緩和する治療薬量となるよう決定 される。疾患症状の実質的な軽減または緩和のために必要に応じて繰り返し治療 を行ってもよい。 ＰＡＲ３活性化因子作用物質を出血の治療に用いることができる。拮抗物質は 、心発作および脳卒中の原因である血餅の形成を制御し、通常の創傷治癒におけ る炎症及び増殖反応を媒介し、また、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺炎症 （ＡＲＤＳ）、糸球体硬化症などの様々に有用であることがある。 本発明の方法を用いて、上述したアッセイによって、ホスホイノシチド加水分 解などのトロンビン媒介生物学的機作または他の細胞シグナル伝達機作を変化さ せる機能性を基に治療用受容体活性化因子作用物質および拮抗物質の有効性をス クリーニングしうる。ヒト以外の哺乳類を治療する場合またはヒト以外の動物に 対する治療物質をスクリーニングする場合には、使用するＰＡＲ３または受容体 断片またはアナログまたは抗体はその種に特異的なものであることが好ましい。 他の実施例 本発明によるポリペプチドは、（本願明細書において記載したような）任意の プロテアーゼ活性化受容体を含む。このような受容体は、どのような源由来のも のであってもよいが、例えばヒトまたはマウスなどの脊椎動物由来のものである と好ましい。これらのポリペプチドは、例えば、トロンビン-受容体相互作用を 破壊する拮抗物質またはこれを模倣する作用物質のスクリーンに用いられる。 本発明のポリペプチドはまた、トロンビンと相互作用可能なＰＡＲ３の任意の アナログまたは断片を含む。このようなアナログおよび断片を使用して、ＰＡＲ ３リガンド拮抗物質または作用物質をスクリーンすることができる。また、トロ ンビンを結合し、好ましくは可溶（または不溶であり脂質小胞中に組成される） である受容体断片またはアナログのそのサブセットは、循環濃度または局所濃度 の内因性トロンビンのｉｎ ｖｉｖｏ濃度を低下させるための拮抗物質として使 用できる。受容体アナログまたは断片の有効性は、そのトロンビンと相互作用す る能力によって異なる。このような相互作用は、ＰＡＲ３機能的アッセイ（例え ば本願明細書で説明したものなど）を用いて容易にアッセイすることができる。 問題の特異的受容体アナログは、例えば同一クラスのアミノ酸である別のアミ ノ酸への置換（例えば、ロイシンに対してバリン、リジンに対してアルギニンな ど）など、保存的なアミノ酸置換のみが異なるか、あるいは受容体のトロンビン 媒介機作（例えば上記にてアッセイしたようなもの）をシグナル伝達する能力を 破壊しない、アミノ酸配列位置にある１つまたはそれ以上の非保存的なアミノ酸 置換、欠失または挿入断片のみが異なるようなアミノ酸配列を含む、全長または 部分受容体タンパク質を含む。 問題の特異的受容体断片は、例えば、推定アミノ酸配列から予測される細胞外 ドメインであるものの全部または一部など、トロンビンと相互作用可能なＰＡＲ ３の任意の部分を含む。このような断片は、（上述したように）拮抗物質として 有用な場合があり、また（例えば、受容体とトロンビンとの間の相互作用に干渉 することなどによって）in vivoにおいてＰＡＲ３の活性を中和する抗体生成用 の免疫原として有用である。図５Ｂに示す配列は、トロンビンを最も結合しやす いものである。（Ｋ３８／Ｔ３９）切断部位の変異、例えばＴ３９がプロリンに 置換されることで、ペプチドのこの部位は切断不能なものとして模倣される。こ のようなペプチドは、高い親和性でトロンビンを結合する。 新規なプロテアーゼ活性化受容体の細胞外領域は、同様の構造を有する関連タ ンパク質（例えば、Ｇタンパク質結合受容体ファミリーの他のメンバー）と比較 することによって同定できる。そのファミリーの十分に特徴付けられたメンバー の細胞外ドメインに対して相同性を呈する領域が有用な領域である。 あるいは、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ方法などの疎水性／親水性計算法（例えば 、ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７８ ）４７：２５１を参照のこと）を用いて、一次アミノ酸配列から二次タンパク質 構造、および結果として、細胞外ドメイン領域を半経験的に推論することもでき る。親水性ドメイン、特に疎水性ストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）（例えば膜貫通 ドメイン）に囲まれた親水性ドメインは、それ自体が細胞外ドメインとしての有 力な候補となる。最後に、例えばトリプシン消化分析などの標準的な酵素消化分 析を用いて細胞外ドメインを実験的に同定することができる。 本願明細書に記載のアッセイ（例えば上述したアッセイなど）によって候補断 片（例えば任意の細胞外断片）のトロンビンとの相互作用を試験する。本願明細 書に記載したアッセイを用いて、このような断片の有する、トロンビンとＰＡＲ ３などの内因性受容体との間の相互作用に拮抗する能力も試験する。（上述した ような）有用な受容体断片のアナログを生成し、（本願明細書に記載のアッセイ を用いて）スクリーニングコンポーネントまたは拮抗物質としての有効性を試験 することもできる。このようなアナログも本発明において有用であると思われる 。 トロンビンシグナル伝達を媒介する受容体を同定することで、トロンビンの望 ましくない作用を阻止あるいはトロンビンの望ましい活性を模倣する薬剤を開発 すべき潜在的な標的がわかる。不安定狭心症および心筋梗塞の状態での血小板依 存性血栓症の阻害用、または脈管損傷状態でトロンビンが内皮細胞に起こす炎症 誘発作用の阻止用として、トロンビン受容体拮抗物質を用いることができる。ト ロンビン受容体作用物質を用いて創傷部位における止血および線維芽細胞増殖を 促進してもよい。 アンマスキングした繋索リガンドドメインペプチドは、ＰＡＲ３作用物質また は拮抗物質の開発を導く構造となり得る。 本願明細書では、最も実用的かつ好ましい実施例とみなされるものについて図 面を参照して本発明を説明している。しかしながら、これらの実施例から逸脱可 能な場合もあり、かかる逸脱も本発明の範囲に包含される。また、明確な変更は ここに開示の内容を参考に当業者によってなされるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/34 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/34 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 イシハラ、ヒロアキ アメリカ合衆国 94122 カリフォルニア 州 サン フランシスコ セブンティーン ス アヴェニュー 1770 (72)発明者 コノリー、アンドリュー アメリカ合衆国 94117 カリフォルニア 州 サン フランシスコ、シュレーダー ストリート 1427

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． プロテアーゼ活性化受容体３をコードする実質的に純粋なＤＮＡ。 ２． 前記ＤＮＡが哺乳類のものである請求項１に記載のＤＮＡ。 ３． 図１のアミノ酸配列（配列番号３）をコードする、図１の配列（配列番 号１）またはその変性変異体と； 図１のアミノ酸配列（配列番号３）を含むアミノ酸配列をコードする、図 ２の配列（配列番号２）またはその縮退変異体と； 図２のアミノ酸配列（配列番号６）をコードする、図３の配列（配列番号 ４）またはその縮退変異体；及び 図３のアミノ酸配列（配列番号６）を含むアミノ酸配列をコードする、図 ４の配列（配列番号５）またはその縮退変異体 からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する実質的に純粋なＤ ＮＡ。 ４． 配列番号１、配列番号２、配列番号４および配列番号５からなる群から 選択される配列のＤＮＡ配列と５０％またはそれ以上の配列同一性を有 し、ＤＮＡ配列配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号５と それぞれハイブリダイズする配列と実質的に純粋なＤＮＡ。 ５． 単離プロテアーゼ活性化受容体３タンパク質。 ６． 図１に示す配列（配列番号３）および図２に示す配列（配列番号６）か らなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項５に記載の実質的 に純粋なタンパク質。 ７． 図１に示す配列（配列番号３）および図２に示す配列（配列番号６）か らなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるア ミノ酸配列を有する実質的に純粋なポリペプチドであって、 ａ） 前記ポリペプチドがトロンビンによって活性化され、 ｂ） 前記ポリペプチドが、該ポリペプチドを表面で発現する細 胞でのホスホイノシチド加水分解を媒介する、実質的に純粋なポリペプチ ド。 ８． トロンビンによって活性化可能なドメインを含み、かつホスホイノシチ ド加水分解を媒介する、プロテアーゼ活性化受容体３の断片またはアナロ グである実質的に純粋なポリペプチド。 ９． 請求項１に記載のＤＮＡを含むベクター。 １０． 請求項９に記載のベクターを含む細胞。 １１． 支持面と、請求項１０に記載の細胞とを含むアッセイ装置。 １２． 細胞が支持面に結合されるかまたは支持面上の懸濁液中に存在する請 求項１１に記載のアッセイ装置 １３． 候補化合物の、プロテアーゼ活性化受容体３リガンドの作用物質とし て作用する能力を試験するための方法であって、 ａ） 候補化合物と、表面に組換えプロテアーゼ活性化受容体３タンパク 質またはその生物学的に活性な断片またはそのアナログを発現する細胞 とを接触させ、 ｂ） 細胞におけるＰＡＲ３媒介応答を測定し、 ｃ） 候補化合物を作用物質として同定し、ここで前記接触によってＰＡ Ｒ３媒介応答が実質的に増大する、試験方法。 １４． 候補化合物の、プロテアーゼ活性化受容体３リガンドの拮抗物質とし て作用する能力を試験するための方法であって、 ａ） プロテアーゼ活性化受容体作用物質の存在下で、候補化合物と、表 面に組換えプロテアーゼ活性化受容体３タンパク質またはその生物学的 に活性な断片またはそのアナログを発現する細胞とを接触させ、 ｂ） 細胞におけるＰＡＲ３媒介応答を測定し、 ｃ） 候補化合物を拮抗物質として同定し、ここで候補拮抗物質の非存在 下でのＰＡＲ３媒介応答と比較して、前記接触によってＰＡＲ３媒介応答 が実質的に低下する、試験方法。 １５． 細胞が、通常は実質的にプロテアーゼ活性化受容体３が表面に存在し ない哺乳類細胞であり、ＰＡＲ３媒介応答が細胞中での細胞内ホスホイノ シチド加水分解で測定される請求項１４に記載の方法。 １６． トロンビンと血小板および同定した候補化合物とを混合し、 候補化合物の血小板凝集媒介作用を観察することをさらに含む、請求項１ ４に記載の方法。 １７． プロテアーゼ活性化受容体３リガンド作用物質と、生理学的に許容さ れる担体と、を含む治療用組成物。 １８． プロテアーゼ活性化受容体３リガンド拮抗物質と、生理学的に許容さ れる担体と、を含む治療用組成物。 １９． 拮抗物質が、 （１） 単離配列 ＬＰＩＫＴＦＲＧＡＰＰＮＳＦＥＥＦＰＦＳＡＬＥ； （２） 切断不能のトロンビン阻害剤 ＬＰＩＫＰＦＲＧＡＰＰＮＳＦＥＥＦＰＦＳＡＬＥ （ここではＰＡＲ３切断部位Ｐ１’は弱められて切断を阻止してい る）； （３） 切断不能のトロンビン阻害剤ＬＰＩ （ｈＲ）ＴＦＲＧＡＰＰＮＳＦＥＥＦＰＦＳＡＬＥ （ここで、ＰＡＲ３切断部位Ｐ１は突然変異によって切断が阻止され、 ｈＲはβホモアルギニン（主鎖に加えてメチレン基が存在する）であ る）； （４） 切断不能のトロンビン阻害剤 （ｄＦ）ＰＲＰＦＲＧＡＰＰＮＳＦＥＥＦＰＦＳＡＬＥ （ここで、優れた活性部位結合配列ｄＦＰＲがＬＰＩＫにかえて置換 されており、dFはＤ−フェニルアラニンである）； （５） 配列ＴＦＲＧＡＰＰＮＳの全部または一部がＧＧＧなどのスペー サ配列と置き換わった上記（１）〜（４）のうちいずれか；及び （６） 拮抗物質として作用する（１）〜（５）のバリエーションおよび 組み合わせ からなる群から選択される請求項１８に記載の組成物。 20．請求項18に記載の組成物を患者に治療有効量投与する治療方法。