JP2001510340A

JP2001510340A - プログラムされた細胞死のインデューサー及びインヒビターを同定する方法

Info

Publication number: JP2001510340A
Application number: JP53310198A
Authority: JP
Inventors: ロイズマン，バーナード; ビン，ヒー
Original assignee: アーチデベロプメントコーポレイション
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1998-01-30
Publication date: 2001-07-31
Also published as: DE69826698T2; WO1998033933A3; EP1019524A2; CA2279486C; DE69826698D1; EP1019524B1; DK1019524T3; ATE278033T1; PT1019524E; WO1998033933A2; CA2279486A1; AU6050798A; ES2227802T3

Abstract

(57)【要約】無細胞系においてプログラムされた細胞死のインデューサー及びインヒビターを同定する方法を記載する。これらの方法は、プログラムされた細胞死が細胞性蛋白質合成の停止及びｅＩＦ−２αのリン酸化を伴い、ｅＩＦ−２αの脱リン酸化が蛋白質合成の停止を防止するという発見を利用している。

Description

【発明の詳細な説明】プログラムされた細胞死のインデューサー及びインヒビターを同定する方法米国政府は、国立癌研究所(ＣＡ４７４５１)、国立アレルギー及び感染症研究所(ＡＩ２４００９)並びに米国公衆衛生局からの助成金に拠ったこの発明に一定の権利を有する。発明の背景プログラムされた細胞死即ちアポトーシスは、活性な細胞機構であり、幾つかの重要な意味を有する。第１に、かかる活性なプロセスが、細胞数並びに細胞の生物学的活性を調節する付加的手段を与えることができることは明らかである。第２に、アポトーシスを増強する突然変異又は細胞事象は、未成熟細胞の死を生じ得る。第３に、特異的な活性な細胞機構に依存する細胞死の形態は、少なくとも潜在的に抑制され得る。最後に、プログラムされた細胞死の阻害は、異常な細胞生存を生じることが予想され、発癌に寄与することが予想できよう(逆に、腫瘍細胞の自殺がアポトーシス即ちプログラムされた細胞死により誘導され得ることが考えられるが)。一般に、プログラムされた細胞死は、ＤＮＡの核濃縮及びオリゴヌクレオソーム断片への分解を含む特有の形態的変化を包含する。ある環境においては、アポトーシスが蛋白質合成の変化により引き起こされ、又は該変化がアポトーシスに先行することは明白である。例えば、細胞の蛋白質合成は、有意にダウンレギュレートされ得る。上記のＤＮＡ分解は、細胞の生合成活性の停止の数日後に起きる「遅い」プロセスであり得る。アポトーシスは、細胞破壊のための非常にみごとなプロセスを与えるようであり、該プロセスにおいて、細胞は、特異的な認識及びファゴサイトーシスにより処理されてから破裂する。この様式において、細胞を、組織から、周囲の細胞にダメージを与えずに除去することができる。従って、プログラムされた細胞死は、形態的発達、免疫系におけるクローン選択並びに他の組織及び臓器系における正常な細胞の成熟及び死を含む多くの生理学的プロセスにとって重要であると思われる。細胞が環境刺激に応答してアポトーシス即ちプログラムされた細胞死を受け得るということも示されている。例には、刺激の出現例えば未成熟胸腺細胞に対する糖質コルチコイドの出現、又は刺激の消失例えばインターロイキン２の成熟リンパ球からの撤収若しくはコロニー刺激因子の造血系前駆細胞からの除去が含まれる(文献の総説としては、Williams，Cell，65:1097-1098[1991]を参照されたい)。その上、標的の除去若しくはアクシオトミー(axiotomy)を真似る樹立された神経細胞培養からの神経成長因子の除去又は他の方法の栄養因子の除去に対する応答が自殺プログラム又はプログラムされた細胞死を引き起こすことが最近示された。[Johnson等，Neurobiol．of Aging，10:549-552(1989)参照]。その著者は、「死のカスケード」又は「死のプログラム」を提案し、栄養因子の欠乏が、新たなｍＲＮＡの転写とそれに続くそのｍＲＮＡの死に関係する蛋白質への翻訳を開始し、該蛋白質が順次的に作用して最終的に「キラー蛋白質」を生成することを構想している。かかる細胞内機構は、上記のアポトーシスの特性例えば有害物質の放出を伴わず且つ組織の完全性の破壊を伴わない特異的な細胞死とよく適合する。その上、その著者は、高分子合成のインヒビターが神経成長因子の不在時にニューロンの死を防止したことを示している。腫瘍細胞が人為的に誘発されたアポトーシスにより排除され得るという可能性を探るための研究が行われてきた。抗ＡＰＯ−１モノクローナル抗体は、幾つかのトランスフォームされたヒトＢ及びＴ細胞株においてアポトーシスを誘導する。この抗体は、５２ｋｄの表面蛋白質に結合して、正の死の誘導シグナルを真似ることにより又は生存に必要な因子の活性をブロックすることによって作用することができよう。抗ＦＡＳ抗体は、類似の効果を有する。ＦＡＳ抗原の遺伝子の最近のクローニングと配列決定は、それが６３キロダルトンの膜貫通レセプターであることを示した。Itoh等，Cell，66:233-243(1991)。しかしながら、ＡＰＯ−１もＦＡＳも、専ら細胞死の引き金として機能するということは、ありそうにない。両者は、全く異なる細胞性応答を別の環境下で活性化することのできる細胞表面レセプターである。その上、これらの抗原は、腫瘍細胞に限られず、それらの正常細胞に対する効果は、確かに重要な問題(もはやこれらの抗原を示さない変異体の可能な出現)である。ある範囲の細胞毒性の薬物(癌の治療で数回使用されるものを含む)により誘導される細胞死がアポトーシスの形態であることも見出されているということも示された[Barry等，Biochem.Blopharmacol.,40:2353-2362(1990)]。これは、多くの場合、γ線又はＸ線照射後の細胞死についても真実である[Williams，Cell，6 5:1097-1098(1991)]。事実、腫瘍細胞においてアポトーシス即ちプログラムされた細胞死が無いことは、細胞数の生理的制御の回避だけでなく、自然の防御及び臨床的治療に対する抵抗性に対する寄与においても、基本的に重要なことである。ｂｃｌ−２遺伝子の発現は、アポトーシスによる死を阻止することが示されている。ｂｃｌ−２遺伝子は、最も一般的なヒトのリンパ腫である濾胞性Ｂ細胞リンパ腫において高率で見出される第１４及び第１８染色体間の転座のブレークポイントから単離された。転座は、ｂｃｌ−２遺伝子と免疫グロブリン重鎖遺伝子座を集め、Ｂ細胞で異所的に増大したｂｃｌ−２発現を生じる。続いて、Hender son等[Cell，65:1107-1115(1991)]は、エプスタイン−バールウイルスに感染した細胞における潜在的膜蛋白質１の発現が感染Ｂ細胞のｂｃｌ−２遺伝子の発現の誘導によりプログラムされた細胞死を防止することを示した。Sentman等[Cell ，67:879-888(1991)]は、ｂｃｌ−２遺伝子の発現が、多くの形態のアポトーシスを阻止することができることを示した(但し、胸腺における負の選択を阻止しない)。Strasser等[Cell，67:889-899(1991)]は、ｂｃｌ−２トランスジーンの発現がＴ細胞死を阻害し、胸腺の自己検閲を混乱させることを示した。Clem等[S cience，245:1388-1390(1991)]は、特異的なバキュウロウイルス遺伝子産物を、昆虫細胞におけるアポトーシスのブロッキングの原因であるとして同定した。Ga gliardini等[Science，263:826-828(1994)]は、ｃｒｍＡ遺伝子産物の、神経成長因子を欠乏させたニワトリの背根神経節細胞におけるアポトーシスを防止する能力を示した。一層一般的には、Barinaga[Science，263:754-756(1994)]も、アポトーシスにおけるｂｃｌ−２、Ｂａｘ(ロング)、ｂｃｌＸ(ショート)及びＩＣＥの役割を論じている。多くの病気が、神経細胞のアポトーシスと関係付けられてきた。例えば、筋萎縮性側索硬化症(Lou Gehrig病)は、アポトーシスによる細胞死と関係付けられてきた。Alexianu等，J.Neurochem.63:2365-2368(1994)。棘筋萎縮症は、アポトーシスによる細胞死を生じるアポトーシス阻害性蛋白質の部分的欠失と関係している。Roy等，Cell，80．167-178(1995)。ハンチントン病も又、アポトーシスによる細胞死と関係付けらてきた。Portera-Cailliau等，J.Neurosci 15:3775-3787( 1995)。アポトーシスによる細胞死は又、アルツハイマー病と強く関係している。Gschwind等，J.Neurochem 65:292-300(1995)；及びLaFerla等，Nat.Genet.9:2 1-30(1995)。従って、アポトーシス即ちプログラムされた細胞死を例えばそれを細胞中(例えば、腫瘍細胞中)に誘導することにより制御する能力、又はアポトーシス即ちプログラムされた細胞死を阻止する能力(例えば、神経変性疾患例えばアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、棘筋萎縮症等において)が、現在治療法が殆どない病気において、治療介入を与えるであろうことは明らかである。かかる治療制御を達成するためには、スクリーニング法を、プログラムされた細胞死を誘導し又は阻止する物質を同定するために利用できるようにしなければならない。発明の要約無細胞系においてプログラムされた細胞死のインデューサー及びインヒビターを同定する方法を提供することは、この発明の目的である。一層特に、この発明は、無細胞系において試験したときに、細胞の蛋白質合成機構のエレメントと相互作用することによって効果を発揮するプログラムされた細胞死即ちアポトーシスのインヒビター又はインデューサーを同定する方法に向けられている。この発明は、プログラムされた細胞死即ちアポトーシスを誘発するある種のストレスの結果として蛋白質合成を止められた細胞がｅＩＦ−２αをリン酸化し又はその脱リン酸化を防止する能力の増大を示すという観察を利用する。この発明は又、プログラムされた細胞死を防止することが示された蛋白質例えばγ₁３４．５及びＧＡＤＤ３４がｅＩＦ−２αのリン酸化レベルを減じるという観察をも利用する。この発明によって、プログラムされた細胞死のインヒビターは、ＰＰＩα及びｅＩＦ−２αを含む無細胞系において、リン酸化されたｅＩＦ−２αのリン酸化レベルを減じる能力又はｅＩＦ−２αのリン酸化を防止する能力によって同定される。プログラムされた細胞死のインデューサーは、この発明の無細胞系において、ｅＩＦ−２αの脱リン酸化を防止する能力、ｅＩＦ−２αのリン酸化を誘導する能力及び／又はＰＫＲと相互作用する(例えば、活性化する)能力により同定される。この発明の他の目的及び利点は、下記の詳細な説明を図面及び請求の範囲と共に観れば、当業者には明らかとなろう。図面の簡単な説明図１Ａ及び１Ｂは、感染細胞及び擬似感染細胞抽出物におけるｅＩＦ−２αキナーゼ活性を示している。図２Ａ及び２Ｂは、ホスファターゼ１αのγ₁３４．５及びＭｙＤ１１６との会合を示している。図３Ａ及びＢは、オカダ酸の存在時及び不在時に示したウイルスを感染させた細胞の溶解物からの、³⁵Ｓ−メチオニンで標識した蛋白質の電気泳動により分離したオートラジオグラフィーイメージを示している。図４は、ＨＳＶ−１(Ｆ)、Ｒ３６１６及びＲ８３００に擬似感染した細胞の並びに感染した細胞の変異物との反応の後に、電気泳動により分離したｅＩＦ−２のオートラジオグラフィーイメージを描いている。図５Ａ〜Ｄは、細胞当たり２０ｐＦＵのＨＳＶ−１(Ｆ)、Ｒ３６１６又はＲ８３００に擬似感染したＨｅＬａ細胞の及び感染したかかる細胞のＳ１０画分におけるホスファターゼ活性を示している。図５Ａは、擬似感染した又は感染した細胞の様々な量のＳ１０画分との反応後のｅＩＦ−２α中の残留放射能を示している。図５Ｂは、インヒビター２の、Ｓ１０画分中のホスファターゼ活性によるｅＩＦ−２α１α³²Ｐの脱リン酸化の速度に対する効果を示している。図５Ｃは、³² Ｐ−ホスホリラーセホスファターゼ活性を示している。図５Ｄは、インヒビター２の、³²Ｐ−ホスホリラーゼホスファターゼ活性の相対的速度に対する効果を示している。詳細な説明単純ヘルペスウイルスは、それらをプログラムされた細胞死の研究に有用にする特殊な性質を有している(１９９３年１０月１４日に公開されたＷＯ９３／１９５９１及び下記で引用されている参考文献を参照のこと、これらのすべてを参考として本明細書中に援用する）。１型単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ−１)は、機能が、ウイルスＤＮＡ合成の開始に続いてすべての蛋白質合成を終了させる宿主の応答を排除することである遺伝子γ₁３４．５をコードする[Chou等，Proc.N atl.Acad.Sci.USA 89:3266-3270(1992)]。γ₁３４．５遺伝子は、ＨＳＶ−１ＤＮＡの長いユニーク配列に隣接する配列中にマップされ、それ故、ゲノム当たり２コピー存在する[Chou等，J.Virol.57:629-637(1986)]。ＨＳＶ−１(Ｆ)γ₁３４．５にコードされる２６３アミノ酸の蛋白質は、３つのドメイン、１６０アミノ酸ドメインのアミノ末端ドメイン、３アミノ酸(ＡｌａＴｈｒＰｒｏ)の１０反復、及び７３アミノ酸のカルボキシ末端ドメインよりなる[Chou等，J.Virol.64: 1014-1020(1990)]。γ₁３４．５のカルボキシ末端の６４アミノ酸のストレッチは、ＭｙＤ１１６として知られるマウスの蛋白質及びＧＡＤＤ３４として知られるチャイニーズハムスターの蛋白質のカルボキシ末端のアミノ酸の対応するストレッチと相同である[Chou等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3266-3270(1992)；Mc Geoch等,Nature(London)353:609(1991)]。ＭｙＤ１１６は、インターロイキン６による最終的分化につき誘導される骨髄性白血病細胞において誘導される一組の蛋白質の一員である[Lord等，Nucleic Acids Res.18:2823(1990)]。構造的にＭｙＤ１１６と密接に関係しているＧＡＤＤ３４も又、ＤＮＡ損傷又は細胞成長拘束に続いて誘導される蛋白質のサブセットの１つである[Fornace等，Mol.Cell.B iol.9:4196-4203(1989)；Fornace等，Ann.N.Y.Acad.Sci.663:139-153(1992)；Zh an等，Mol.Cell.Biol.14.2361-2371(1994)]。 γ₁３４．５の両コピーが不活性化され又は欠失されるヒトの細胞への単純ヘルペスウイルスの感染、特に、ヒト神経芽細胞腫の細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ又は一次ヒト包皮繊維芽細胞への感染は、宿主細胞の蛋白質合成及びウイルスの複製サイクルの殆ど完全な停止を生じる[Chou等，J.Virol.66:8304-8311(1994)]。この蛋白質合成の全体的な未成熟な停止は、これらの細胞がウイルスＤＮＡ合成のインヒビターで処理された場合又はベロ細胞においては、見られない[Chou等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 89:3266-3270(1992)]。この蛋白質合成の全体的な未成熟な停止を排除する能力は、ＭｙＤ１１６蛋白質に相同なγ₁３４．５蛋白質のカルボキシル末端ドメインにマップされる[Chou 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5247-5251(1994)]。実際、ＭｙＤ１１６のカルボキシル末端は、上首尾に、γ₁３４．５の対応するドメインの代わりになる。 γ₁３４．５蛋白質を欠くウイルス又は蛋白質のカルボキシル末端を発現できないウイルスは、全体的に、ＨＳＶ−１感染のマウス脳炎モデルにおいて無発病性である[Chou等，Science 250:1262-1266(1990)；Whitley等，J.Clin.Invest.91: 2837-2843(1993)；McKie等，J.Gen.Virol.75:733-741(1994)]。 Chou等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10516-10520(1995)は、これらの観察を拡張し、野生型又は変異型の感染細胞において、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ(ＰＫＲ)が活性化されることを示した。しかしながら、この蛋白質のカルボキシル末端をコードするγ₁３４．５ドメインを欠くγ₁３４．５^-変異体が感染した細胞においてのみ、ｅＩＦ−２αのαサブユニットがリン酸化された。プログラムされた細胞死と関係する蛋白質合成の未成熟な停止は、幾つかの興味深い疑問、即ち何が宿主の応答を引き起こすのか、蛋白質合成を止める機構は何か、そしてγ₁３４．５が宿主の応答を排除する機構は何かという疑問を持ち上げる。以下に示すデータは、(ｉ)ＭｙＤ１１６のカルボキシ末端が酵母中のプロテインホスファターゼ１αと相互作用し、ＭｙＤ１１６とγ₁３４．５の両者がプロテインホスファターゼ１αとイン・ビトロで相互作用すること；(ii)感染細胞における蛋白質合成がオカダ酸、ホスファターゼ１インヒビターにより強く阻害されること；及び(iii)イン・ビトロでリン酸化された精製されたｅＩＦ−２のα サブユニットが、野生型の感染細胞のＳ１０画分により、特異的に、擬似感染細胞の３０００倍の速度で脱リン酸化されるが、γ₁３４．５^-ウイルスに感染した細胞のｅＩＦ−２α−Ｐホスファターゼ活性は、擬似感染細胞のそれよりも低いということを示す。ｅＩＦ−２α−Ｐホスファターセ活性は、蛋白質ホスファターゼインヒビター２に対して感受性である。ｅＩＦ−２α−Ｐホスファターゼ活性と対照的に、擬似感染細胞の抽出物は、[³²Ｐ]ホスホリラーゼに対して、感染細胞の抽出物の２倍より高いホスファターゼ活性を示す。これらの結果は、感染細胞においては、γ₁３４．５がホスファターゼと相互作用し、ｅＩＦ−２αを脱リン酸化して、活性化されたＰＫＲの存在にもかかわらず、継続された蛋白質合成を可能にすることを示す。ＧＡＤＤ３４蛋白質は、真核細胞において、類似の機能を有し得る。二本鎖ＲＮＡの蓄積にもかかわらずに蛋白質合成を維持する機構は、今日まで調べられたウイルスについて記載されたものとは、異なっている。前記の観察を一層広い状況に置くと、ＨＳＶ−１に感染した細胞においては、ＤＮＡ合成の開始後に、対称的な転写物の蓄積がＰＫＲの活性化を生じる。ウイルス蛋白質γ₁３４．５は、ＰＰ１αにおそらくそのカルボキシ末端を介して結合し、その酵素活性を、それ自身により又は他の蛋白質と共に、ｅＩＦ−２αを脱リン酸化するように向け直す。結果として、ＰＫＲが活性化されているにもかかわらず、蛋白質合成が衰えずに継続される。下記のデータは、この筋書きを支持する。野生型及びγ₁３４．５変異型の両方に感染した細胞においては、ＰＫＲは、リン酸化されるが、γ₁３４．５遺伝子の全部又は３’ドメインを欠く変異体に感染した細胞においてのみ、蛋白質合成が停止され、ｅＩＦ−２αがリン酸化される。蛋白質合成の停止をブロックするのに必要なγ₁３４．５配列は、遺伝子の３’ドメイン中にマップされ、機能を失うことなくＭｙＤ１１６の対応するドメイン、マウスＧＡＤＤ３４遺伝子で置換され得る。ここに報告するｅＩＦ−２α−Ｐホスファターゼ活性は、ｅＩＦ−２α−Ｐと以前にγ₁３４．５^-ウイルス感染した細胞において記載された蛋白質合成との定常状態における差異を説明することができる[Chou等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10516-10520(1995)]。ＰＫＲは、擬似感染細胞においては活性化されないので、観察された中程度のｅＩＦ−２α−Ｐホスファターゼ活性は、蛋白質合成を阻止するのに必要なｅＩＦ−２αのリン酸化の程度を防止するのに十分であろう。野生型ＨＳＶ−１の感染は、ＰＫＲの活性化を生じない[Chou等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 92:10516-10520(1995)]が、その効果は、おそらく、ｅＩＦ−２α−Ｐホスファターゼにおいて、約３０００倍増を超えて対抗するであろう。このｅＩＦ−２α−Ｐホスファターゼ活性における顕著な増加は、γ₁３４．５^-変異体の感染がｅＩＦ−２α−Ｐホスファターゼ活性の減少(これは、ＰＫＲの活性化に際してｅＩＦ−２αのリン酸化及び蛋白質合成の阻害を生じる)と関係しているので、γ₁３４．５遺伝子産物の発現によるものである[Chou等，Proc.Natl.Acad .Sci.USA 92:10516-10520(1995)]。酵母の２ハイブリッド系において、ＭｙＤ１１６のカルボキシル末端は、ヒトのＰＰ１αと相互作用した。ＰＰ１αとＭｙＤ１１６又はγ₁３４．５蛋白質との相互作用も又、イン・ビトロのプルダウン実験において示すことができる。擬似感染又は感染細胞の細胞質画分で測定されるｅＩＦ−２αホスファターゼ活性はＰＰ１に由来するという仮説は、それがインヒビター２に感受性であったという観察により強められる。それにもかかわらず、２つの証拠が、この活性がｅＩＦ−２αに向け直されたＰＰ１αの改変型を表し得るということを示唆している。特に、ｅＩＦ−２α−Ｐホスファターゼ活性は、擬似感染細胞のものより、インヒビター２に対して一層感受性が低かったし、更に、ＰＰ１の既知の機能であるホスホリラーゼホスファターゼ活性は、未感染細胞において、感染細胞におけるよりも一層強力であった。この仕事は又、ＧＡＤＤ３４の推定上の機能にも光を落とす。上記のように、マウスＧＡＤＤ３４遺伝子のカルボキシル末端(ＭｙＤ１１６)は、γ₁３４．５の対応するドメインに相同であり、それの代わりとなり得る[He等，J.Virol.,70 :84-90(1996)]。ＰＰ１αがγ₁３４．５及びＭｙＤ１１６キメラ蛋白質の両方とイン・ビトロで相互作用するということも示されている(下記、参照)。これらの結果は、ＧＡＤＤ３４遺伝子の機能の少なくとも１つがγ₁３４．５遺伝子のそれと類似していること及びγ₁３４．５遺伝子がその哺乳動物細胞の相同物を置き換えて、普通ｅＩＦ−２αのリン酸化によって蛋白質合成を完全に破壊するストレスにもかかわらず蛋白質合成を維持するのに有用であり得るということを主張している。最後に、現在までに研究された殆どのウイルスは、二本鎖ＲＮＡに結合する蛋白質、例えば、ワクシニアのＥ２Ｌ[Davies等，J.Virol.67.1688-1692(1993)；C arroll等，J.Biol.Chem.268:12837-12842(1993)；及びYuwen等，Virology 195:7 32-744(1993)]、レオ及びロタウイルスのα３蛋白質[Langland等，J.Virol.68:3 821-3829(1994)；Beattie等，J.Virol.69:499-505(1995)；Imani等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 85:7887-7891(1988)；及びLloyd等，J.Virol.66:6878-6884(1992) ]及びインフルエンザのＮＳ１蛋白質[Lu等，Virology 214:222-228(1995)]又はＰＫＲをそれに結合することにより不活性化する蛋白質若しくはＲＮＡ、例えば、ワクシニアＫ３Ｌ、エプスタイン−バールウイルスＥＢＥＲＳ１及び２[Sharp 等，Nucleic Acids Res.21:4483-4490(1993)]、アデノウイルスＶＡ１ＲＮＡ[Sh arp等，Nucleic Acids Res.21:4483-4490(1993)；及びGhade等，J.Virol.68:413 7-4151(1994)]、インフルエンザウイルス感染細胞ｐ５８蛋白質[Lee等，Mol.Cel l.Biol.14:2331-2342(1994)]をコードすることによってｅＩＦ−２αのリン酸化をブロックし、又はＰＫＲを分解する(ポロウイルス)[Black等，J.Virol.67:71- 800(1993)]。ＨＩＶ−１のＴＡＲ配列は、細胞性のＴＡＲ結合性蛋白質及びＰＫＲに結合するようである[McMillan等，Virology 213:413-424(1995)；Park等，P roc.Natl.Acad.Sci.USA 91:4713-4717(1994)；及びConsentino等Proc.Natl.Acad .Sci.USA 92:9445-9449(1995)]。例外は、イン・ビトロで大いに二本鎖ＲＮＡよりなるにもかかわらずＰＫＲを活性化しない肝炎デルタウイルス[McNair等，J.G en.Virol.75:1371-1378(1994)]及び大型Ｔ抗原がＰＫＲのポスト活性化ステップに作用するシミアンウイルス４０[Swaminahan等，J.Virol.219:321-323(1996)] であろう。これらのデータは、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２が、ＰＫＲ又は二本鎖ＲＮＡよりもリン酸化されたｅＩＦ−２αを標的とすることにより、非常に異なった機構を利用して、蛋白質合成の停止を排除するということを示唆している。これらの機構の解明は、プログラムされた細胞死のインデューサー及びインヒビターの両方のスクリーニングに有用な新規な無細胞の方法を開発する能力を提供し、かかるプログラムされた細胞死のインヒビター又はインデューサーは、プログラムされた細胞死の誘導と関係する病気の予防に有用な治療剤並びに、プログラムされた細胞死を誘導することが望ましい病気例えば広範囲の腫瘍形成性疾患の何れかの治療剤を与えることができる。かかる系は又、ここで論じた及び以下に例示する機構によって、感染細胞におけるプログラムされた細胞死に影響を与える抗ウイルス性物質を同定するのにも有用である。下記の実施例は、この発明の実施を例示するものであり、請求の範囲に列記した発明の範囲を制限することを意図したものではない。実施例１は、研究に使用した細胞及びウイルスを記載する。実施例２は、ｅＩＦ−２αのリン酸化が、Ｒ３６１６(γ₁３４．５^-)が感染した細胞のリボソームに富み、蛋白質合成が停止された画分に存在するキナーゼと関係していることを示す。これらのデータは又、[γ³²Ｐ]−ＡＴＰとの反応後に、同画分からのＰＫＲの免疫沈降が幾らかのリン酸化されたポリペプチを生成したことをも示している。実施例３は、ヒトのプロテインホスファターゼ１αのクローニング及び発現を記載している。実施例４は、ｅＩＦ−２αホスファターゼ活性の測定を記載している。実施例５は、ホスホリラーゼ及びホスファターゼの活性の測定を記載している。実施例６は、ＧＡＤＤ３ｙ(ＭｙＤ１１６)の酵母２ハイブリッドアッセイにおけるＰＰ１αとの相互作用及びＰＰ１αの同定を記載している。実施例７は、ＭｙＤ１１６及びγ₁３４．５のイン・ビトロでのＰＰ１αへの結合を記載している。実施例８は、感染細胞における蛋白質合成におけるホスファターゼ活性の役割を記載している。実施例９は、野生型又はＲ８３００組換えウイルス感染細胞におけるｅＩＦ− ２αホスファターゼの活性を記載している。実施例１０は、ｅＩＦ−２αホスファターゼ活性のＰＰαインヒビター２に対する感受性を記載している。実施例１１は、活性化されたホスファターゼ活性がｅＩＦ−２αに特異的であることを示す。実施例１２は、無細胞系において、プログラムされた細胞死のインデューサー及びインヒビターを同定する方法を記載している。実施例１細胞及びウイルスベロ細胞、ＨｅＬａ細胞及びヒトの神経芽細胞腫細胞(ＳＫ−Ｎ−ＳＨ)を、Am erican Type Culture Collection(メリーランド、Rockville,Parklawn Drive 12301在) から入手して、５％(ベロ及びＨｅＬａ細胞)及び１０％(ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞)のウシ胎児血清をそれぞれ補ったダルベッコ改変イーグル培地にて増殖させた。ＨＳＶ−１(Ｆ)は、これらの研究で用いたプロトタイプのＨＳＶ−１株である(Eje rcoto等，J.Gen.Virol.2:357-364(1968))。ＨＳＶ−１組換えＲ３６１６は、以前に記載されている[Chou等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3266-3270(1992)；Ch ou等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5247-5251(1994)；Chou等，Science 250:126 2-1266(1990)]。Ｒ３６１６ウイルスは、γ₁３４．５遺伝子の両コピーのコーディングドメインからの１Ｋｂを欠いている。組換えウイルスＲ８３００において、γ₁３４．５遺伝子のカルボキシル末端ドメインをコードする配列は、He等，J ．Virol.70:84-90(1996)に記載されたように、ＭｙＤ１１６遺伝子の対応するドメインで置換された。実施例２ｅＩＦ−２αキナーゼ活性は、 γ₁３４．５^-ウイルスが感染した細胞のリボソーム画分と結合している Chou等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10516-10520(1995)に記載された結果を考慮して、一連の研究を行って、Ｒ３６１６に感染したヒトの神経芽細胞腫細胞における蛋白質合成の未成熟な停止が翻訳開始因子ｅＩＦ−２のαサブユニットのｅＩＦ−２αキナーゼ活性による修飾(リン酸化)によるものかどうかを測定した。これらの実験では、ＨｅＬａ細胞を、ｅＩＦ−２がこの細胞株の溶解物において一層安定であるらしい限り用いた。ＨｅＬａ細胞も、現在まで研究された殆どのヒトの細胞株と同様に、γ₁３４．５^-ウイルスに感染した細胞における蛋白質合成の未成熟の停止によって影響を受ける。ＨｅＬａ細胞の複製培養に、ＨＳＶ−１(Ｆ)又はＲ３６１６ウイルスを、Chou 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10516-10520(1995)に記載されたように、擬似感染又は感染させた。感染の７時間後に、これらの細胞を採取して、すべての細胞質物質(ミトコンドリアを除く)を含むＳ１０画分を、Pollard及びClemensにより記載された手順(Pollard等，Methods in Molecular Biology:New Nucleic Acid Techniques(Walker，J.M.,編)第５章、４７〜６０頁、ニュージャージー、Clifton，Huma na Press,(1988))に従って調製した。Ｓ１００画分(ポストリボソーム)は、Ｓ１０画分から、Beckman SW41ローターにて、４℃で、２９，０００ｒｐｍで３時間の遠心分離後に調製された上清液体であった。この画分は、殆どの可溶性蛋白質を含んだが、リボソームを含まなかった。ウサギのｅＩＦ−２を、ウサギの網状赤血球溶解物から、Grass等，J.Biol.Chem.,255:6270-6275(1980)に記載された方法に従って精製し、これらの抽出物中に存在するｅＩＦ−２αキナーゼ活性を検出するのに用いた。０．２μｇのｅＩＦ−２を、[γ³²Ｐ]−ＡＴＰ(試料当たり１００μＣｉ、比活性６０００Ｃｉ／ｍモル、NEN,マサチューセッツ、Boston)の存在下で、Ｓ１０又はＳ１００画分と、３０℃で２０分間反応させた。次いで、これらの反応混合物を、可溶化し、Ｎ’Ｎ’−ジアリルタルタルジアミドで架橋した変性用１２％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離し、ニトロセルロースシート上にトランスファーし、そして以前に記載されたようにしてオートラジオグラフィーにかけた(Chou等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3266-3270(1992) )。図１は、この分析の結果を示している。外因性のｅＩＦ−２を加えたレーンは、一番左端に示した。ｅＩＦ−２αの位置を右に示してある。図１に示したように、パネルＡ、ｅＩＦ−２αサブユニットは、Ｒ３６１６感染細胞のＳ１０抽出物において甚だしくリン酸化され、野生型細胞又は擬似感染細胞においては最小限度リン酸化され、そして細胞抽出物の内場合には全くリン酸化されなかった。これらの結果は、γ₁３４．５^-ウイルス感染細胞のＳ１０画分がｅＩＦ−２αキナーゼ活性(これは、擬似感染細胞又は野生型細胞の同様の抽出物中ではずっと少ないか又はなかった)を含んだことを示している。この活性は、調べたすべてのＳ１００画分に存在せず、これは、キナーゼ活性がリボソームと結合していることを示唆している。外因性ｅＩＦ−２の不在時には、内因性ｅＩＦ−２の最小のリン酸化が細胞内の定常状態のリン酸化及び脱リン酸化プロセスのためにすべての抽出物において認められた。図１、パネルＢは、ｅＩＦ−２αに特異的なモノクローナル抗体で染色した分離された蛋白質を含むニトロセルロースシートの写真を示している(Scorsone等，J.Biol.Chem.262:14538-14543(1987))。適当な二次抗体との反応の後に、ブロットを、Promega(ウィスコンシン、Madison在)より提供された呈色試薬で発色させて、ｅＩＦ−２αポリペプチドを同定した。矢印は、パネルＡ中のリン酸化ｅＩＦ− ２αポリペプチドをパネルＢ中の抗体染色したｅＩＦ−２αポリペプチドと向きを合わせて整列させるために用いた点を示している。図１のパネルＢ中のデータは、ｅＩＦ−２αのレベルがそれを加えたすべての試料において同様であったことを示している。この活性は、擬似感染した又は野生型の感染細胞には、存在しなかった。ｅＩＦ−２は、Ｍｅｔ−ｔＲＮＡ^f及びＧＴＰと３成分複合体で結合し、それは、次いで、リボソームサブユニットと前開始(pre-initiation)複合体にて会合する(M errick，W.C.，Microbiological Reviews 56:291-315(1992);Hershey，J.W.B.， Annu.Rev.Biochem.60:717-755(1991))。開始後に、ｅＩＦ−２は、ｅＩＦ−２Ｂ、他の翻訳因子の助成により、８０Ｓ複合体から再循環される。翻訳を調節する事象の１つは、ｅＩＦ−２複合体のαサブユニットのリン酸化である。ｅＩＦ− ２αのリン酸化は、ウイルス感染、熱ショック、重金属、血清、アミノ酸若しくはグルコースの欠乏により引き起こされる成長阻害、細胞ストレスに応答して、ヘム制御された造血細胞における蛋白質合成の停止と相関する(Hershey，J.W.B. ，Annu.Rev.Biochem.60:717-755(1991)；Sarre，T.，BioSystems 22:311-325(19 89))。これらの効果は、ｅＩＦ−２αのＳｅｒ₅₁の、ＰＫＲ(分子量６８，０００のキナーゼで、ｄｓＩとしても知られる、自身を自己リン酸化する二本鎖ＲＮＡ活性化されたｅＩＦ−２αキナーゼ)又はＨＲＩ(へム制御されるｅＩＦ−２α キナーゼ)によるリン酸化とリンクされてきた(Merrick，W.C.，Micro biologica l Reviews 56:291-315(1992)；Hershey，J.W.B.，Annu.Rev.Biochem.60:717-755 (1991))。Ｓｅｒ₅₁のリン酸化の蛋白質合成の調節における第一の役割は、Ｓｅｒ₅₁のＡｌａによる置換がリン酸化を排除して蛋白質合成を維持するという観察により支持されている(Pathak等，Mol Cell Biol，8:993-995(1988))。実施例３ヒトのプロテインホスファターゼα(ＰＰ１α)のクローニング及び発現ヒトのプロテインホスファターゼ１α(ＰＰ１α)をコードする１．３７ＫｂのｃＤＮＡを含むプラスミドｐＲＢ４８９１を、市販の脳ｃＤＮＡライブラリー(S tratagene)から単離した。ｐＲＢ４８９０を構築するために、ＭｙＤ１１６のコドン５２４〜６５７をコードするＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、He等，J.Viro l.70:84-90(1996)により記載された遺伝子のｃＤＮＡコピーから、プライマーTG ACTGGATGCAGAGGCGGCTCAGATTGTTC(SEQ ID NO:１)及びAGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAG (SEQ ID NO:２)を用いてＰＣＲによって増幅させ、ｐＧＢＴ９(Clontech)のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入して、２ハイブリッド系において、「餌」として働かせた。ＰＣＲの条件は、９４℃で２分間、６０℃で３分間及び７２℃で３分間を２５サイクルであった。キメラのＧＳＴ−ＰＰ１α遺伝子を含むｐＲＢ４８９２を、ＰＰ１αの完全なコード配列(但し、最初のメチオニンコドンを除く)を含む０．９ＫｂのＰＣＲ断片をｐＧＥＸ４Ｔ−１(Pharmacia)のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位に連結することにより構築した。オリゴヌクレオチドプライマーは、 GCACTGAATTCTCCGACAGCGAGAAGCTCAAC(SEQ ID NO:３)及びGCACTGTCGACATCTGGGGCAC AGGGTGGTGT(SEQ ID NO:４)であった。キメラのグルタチオンＳトランスフェラーゼ(ＧＳＴ)−γ₁３４．５のカルボキシル末端ドメイン[ＧＳＴ−γ₁３４．５(Ｃ )]を有するｐＲＢ４８９３を構築するために、ｐＲＢ７１からのγ₁３４．５のコドン１４６〜２６３をコードするＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片及びｐＧＥＸ４Ｔ −１のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位にクローン化した。ＧＳＴにイン・フレームで融合されたＭｙＤ１１６の３’末端の１７４コドンをコードするＡｃｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片[ＧＳＴ−ＭｙＤ１１６(Ｃ)]を含むｐＲＢ４８７３の構築を、He等， J.Virol.70:84-90(1996)により報告されたように行った。ＧＳＴ−ＭｙＤ１１６ (Ｃ)、ＧＳＴ−γ₁３４．５(Ｃ)及びＧＳＴ−ＰＰ１融合蛋白質の発現を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを、プラスミドｐＲＢ４８７３、ｐＲＢ４８９２又はｐＲＢ４８９２でトランスフォームした大腸菌ＢＬ２１細胞を含む培地に加えることにより誘導し、次いで、細菌溶解物からの融合蛋白質のアフィニティー精製をグルタチオンと結合体化したアガロースビーズにて行った。実施例４ｅＩＦ−２αのホスファターゼ活性の測定翻訳開始因子ｅＩＦ−２を、Gross等，J.Biol.Chem.255:6270-6275(1980)の方法に従って、ウサギの網状赤血球リボソームから精製した。ヘミン制御された翻訳リプレッサー(ＨＣＲ)を、Gross等，Biochem.Biophys.Res.Comm.50:832-838(1 983)に従って、ステップ４まで部分精製した。ｅＩＦ−２(２０ｐモル又は２．７μｇ)をステップ４ＨＣＲと、０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、４０ｍＭＫＣｌ、２．０ｍＭＭｇＣｌ₂及び０．１７ｍＭ[γ³²Ｐ]ＡＴＰ(２〜１０Ｃｉ又は７４〜３７０ＧＢｑ／ｍモル)(最終容積１２μｌ)中で、２５分間、３４℃で反応させて、リン酸化したｅＩＦ−２α及びｅＩＦ−２β(それぞれ、ｅＩＦ−２１モル当たり１．０及び０．７モル)を生成した。ＨｅＬａ細胞を、細胞当たり２０ＰＦＵのＨＳＶ−１(ｆ)、Ｒ３６１６又はＲ８３００での擬似感染又は感染の１５時間後に採取した。Ｓ１０画分を、Chou等，Proc.Natl.Acad.Sci .USA 92:10516-10520(1995)に記載されたようにして擬似感染細胞又は感染細胞の溶解物から調製し、０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、５０ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ₂及び０．１ｍＭＥＤＴＡで最終的容積１８μｌまで希釈した。次いで、ＡＴＰを終濃度０．８ｍＭまで加えた。３４℃で３０秒後に、各試料に、１．２μｌ(２ｐモル)のｅＩＦ−２(α³²Ｐ)を加えて、３４℃でインキュベートした。ｅＩＦ−２(α³²Ｐ)のリン酸化速度を、Gross等，Biochim.Bio phys.ACTA 740:255-263(1983)の方法により、６．０μｌのアリコートを図に示した時点でＳＤＳを含む溶液中に入れ、その後、記載したように７％変性ポリアクリルアミドゲル上で２１時間にわたって４４Ｖ(３Ｖ／ｃｍ)で電気泳動にかけ、クーマシーブルー又は銀で染色し、乾燥しそしてオートラジオグラフィーをとることによって測定した。ｅＩＦ−２(α³²Ｐ)中に残っている³²Ｐを、このバンドを切り出して、そのチェレンコフ放射を、更にインキュベートすることなく並行して電気泳動にかけたｅＩＦ−２(α³²Ｐ)の同等のアリコートのものと比較することによって定量した。実施例５ホスホリラーゼ及びホスファターゼ活性の測定ホスホリラーゼｂ(３２μｇ、Sigma)を、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、２．０ｍＭＭｇＣｌ₂及び０．１３ｍＭ[γ³²Ｐ]ＡＴＰ(３Ｃｉ又は１１１ＧＢｑ／ｍモル)(最終容積１５μｌ)中で、３．３μｇのホスホリラーゼキナーゼ(Sigma、ミズーリ、St.Louis)と、３４℃で、１０分間インキュベートすることによりリン酸化した。脱リン酸化を、４．４μｇの[³²Ｐ]ホスホリラーゼを、実施例４に記載のように構成されてインキュベートされた試料に最終容積２７μｌで加えることにより測定した。１．５分、３分、６及び１０分の時点で、６．０ μｌのアリコートを取り出して、ホスファターゼ活性の測定のために上記のように処理した。実施例６マウスＧＡＤＤ３４蛋白質のカルボキシル末端(ＭｙＤ１１６)は、酵母の２ハイブリッド系においてＰＰ１αと相互作用するプラスミドｐＲＢ４８９０でトランスフォームしてＴｒｐ^-選択培地で生育させている酵母Ｙ１９０(１６)株をヒトの脳ｃＤＮＡライブラリー(CLONTECH)でトランスフォームし、２５ｍＭの３−アミノトリアゾール(Sigma)の存在下でＴｒｐ^-／Ｌｅｕ^-／Ｈｉｓ^-培地での選択にかけた。プレートしてから５日後に中位乃至早い成長のコロニーをＴｒｐ^-／Ｌｅｕ^-／Ｈｉｓ^-培地上で再度画線培養した。このライブラリー由来のプラスミドを、全酵母ＤＮＡ調製物を用いる大腸菌ＨＢ１０１のトランスフォーメーションにより回収し、次いで、以前に、Durfee 等，Gene Devel.7:555-569(1993)に記載されたように、Ｌｅｕ^-／アンピシリン⁺ 培地上で選択した。β−ガラクトシダーセについてのフィルターアッセイを、Cl ontechが勧めるように行った。上に簡単に述べたように、２ハイブリッド系は、関心のある蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする遺伝子のクローニングには、特に有用である。Fields等，Nature 340:245-246(1989)及びChien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9578-95 82を参照されたい。ＭｙＤ１１６のカルボキシル末端は、(ｉ)γ₁３４．５とアミノ酸配列相同性を共有し[Chou等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5247-5251(1994)及びMcGeoch等，Nature(London)353:609(1991)参照]、(ii)ＭｙＤ１１６のカルボキシル末端は、γ₁３４．５蛋白質のそれを機能的に代行することができ、そして(iii)MｙＤ１１６哺乳動物遺伝子のコドンの使用は、ＨＳＶ−１のそれよりも酵母のそれに一層近いので、該カルボキシ末端を、２ハイブリッド系の餌として選択した。スクリーニングした１０⁶の酵母のコロニーの内で、唯一つのコロニーが、β−ガラクトシダーゼ発現について陽性であった。このコロニーから回収したｃＤＮＡを、融合蛋白質をコードする種々の対照用プラスミドを用いて、酵母Ｙ１９０株に再トランスフォームした。これらの研究は、ＭｙＤ１１６のカルボキシル末端のみが単離されたｃＤＮＡによりコードされる蛋白質と相互作用することを示した。ＤＮＡ配列分析は、単離されたｃＤＮＡがプロテインホスファターゼ１α(ＰＰ１α)の触媒性サブユニットをコードすることを明らかにした。 Song等，Gene 129:291-295(1993)を参照されたい。実施例７ＭｙＤ１１６及びγ₁３４．５蛋白質は、両方とも、イン・ビトロで、ＰＰ１αに結合するＭｙＤ１１６とＰＰ１αが酵母において相互作用するという観察を確認して、拡張するために、実施例３に記載したように構築したキメラのＧＳＴ−ＰＰ１α 遺伝子を大腸菌で発現させた。複製ＨｅＬａ細胞培養を、１０ｍＭＨｅｐｅｓ (ｐＨ７．６)、２５０ｍＭＮａＣＬ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１％トリトンＸ −１００、０．５ｍＭＰＭＳＦ及び２ｍＭベンザミディンを含む溶解緩衝液にて細胞当たり１０ＰＦＵのＨＳＶ−１(Ｆ)又はＲ８３００での擬似感染又は感染の１８時間後に採取した。氷水上での３０分及び低速遠心分離で核を取り出した後に、上清液をＧＳＴ−ビーズで予備清澄化し、次いで、ＧＳＴ−ホスファターゼ１結合したビーズと４℃で一晩反応させた。多数回すすいだ後に、ビーズに結合した蛋白質を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．０)、０．５％β−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ及び２．７５％シュークロースを含む破壊緩衝液中で煮沸することにより可溶化し、変性１２％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離し、ニトロセルロースシートにトランスファーし、そしてブロットを、 γ₁３４．５とＲ８３００により発現されるキメラのγ₁３４．５−ＭｙＤ１１６キメラ蛋白質の両方に存在するＡｌａＴｈｒＰｒｏに対する抗γ₁３４．５血清をプローブとして検査した。γ₁３４．５蛋白質の位置及びキメラ蛋白質γ₁３４．５−ＭｙＤ１１６の位置を図２Ａに示す。図２Ａに示したように、ＧＳＴ−ＰＰ１α蛋白質は、ＨＳＶ−１(Ｆ)感染細胞の溶解物からのγ₁３４．５及びＲ８３００が感染した細胞からの一層ゆっくり移動するγ₁３４．５−ＭｙＤ１１６キメラ蛋白質の両方と結合した。ＧＳＴ単独では、何れの適当な細胞溶解物中の蛋白質とも反応しなかった。第２の実験において、精製したＰＰ１αを、ＧＳＴを有するビーズと又は、γ₁ ３４．５のアミノ酸１４６〜２６３に若しくはＭｙＤ１１６のアミノ酸４８５〜６５７に融合させたＧＳＴよりなるキメラ蛋白質を有するビーズと混合した( 下記の通り)。ビーズに結合させたＧＳＴ−ＰＰ１α融合蛋白質のアリコートを、２５単位のトロンビン(Sigma，ミズーリ、St.Louis)とＰＢＳ緩衝塩溶液中で室温で反応させた。８時間後に、この混合物を卓上遠心機で回し、次いで、ＰＰ１αを含むその上清液を溶解緩衝液に対して透析し、ビーズに結合されたＧＳＴ、ＧＳＴ−ＭｙＤ１１６(Ｃ)若しくはγ₁３４．５(Ｃ)と反応させ、そしてパネルＡに記載したように処理した。ＰＰ１を、抗ホスファターセ１α抗体(Upstate Biotechnology I ncorporated)を用いて検出した。ＧＳＴ又はキメラ蛋白質に結合した蛋白質を、可溶化し、変性ゲル上での電気泳動にかけ、そして抗ＰＰ１α抗体と反応させた。図２Ａ及び２Ｂに示したように、両キメラ蛋白質(ＧＳＴではない)は、見かけ分子量３８，０００を有し(分子量マーカーは、示してない)、抗ＰＰ１α抗体と反応した蛋白質を下げた。実施例８ホスファターゼ活性は、感染細胞における蛋白質合成に必須であるホスファターゼ活性が感染細胞における持続的蛋白質合成に必須であるかどうかを測定するための試験を行った。細胞溶解物からの[³⁵Ｓ]メチオニン標識された蛋白質を、オカダ酸(ＯＡ)の存在下で又は不在時に示したウイルスに感染させた。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を、細胞当たり２０ＰＦＵのＨＳＶ−１(Ｆ)、Ｒ３６１６又はＲ８３００に擬似感染又は感染させた。これらのウイルスにさらしてから２時間後に、これらの細胞を、オカダ酸(２５ｎｇ／ｍｌ)を補った又は補ってない１９９Ｖ培地[Ackermann等，J.Virol.58:843-850(1986)]に重層した。感染の１４時間後に、これらの細胞に、メチオニンを欠くが５０μＣｉの[³⁵Ｓ]メチオニン(比活性＞１０００Ｃｉ／ｍモル：Amersham)を１時間にわたって補った１９９Ｖ培地１ｍｌを１時間にわたって重層し、次いで、採取し、破壊緩衝液中に可溶化し、変性１２％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動にかけ、ニトロセルロースシートにトランスファーし、そして他所[Chou等，Proc.Natl.Acad.Sci．USA ，89:3266-3270(1992)]に記載のようにオートラジオグラフィーにかけた。これらの結果(図３Ａ)は、オカダ酸が、野生型ＨＳＶ−１(Ｆ)、γ₁３４．５^-ウイルスＲ３６１６又はＲ８３００組換え体(γ₁３４．５−ＭｙＤ１１６キメラ蛋白質を発現する)に感染した細胞における蛋白質合成を全体的に阻害したことを示している。対照的に、オカダ酸は、擬似感染細胞における蛋白質合成に対する見かけの効果を有しなかった。オカダ酸が何らかの様式で感染細胞におけるγ₁３４．５又はγ₁３４．５−ＭｙＤ１１６蛋白質の合成をブロックしたというありふれた仮説を試験するために、野生型及び組換え型ウイルスに感染した細胞の溶解物を可溶化し、変性ゲルでの電気泳動にかけ、ニトロセルロースシートに電気泳動によりトランスファーして、γ₁３４．５蛋白質に対する抗体と反応させた。図３Ｂに示すように、ＨＳＶ−１(Ｆ)又はＲ８３００に感染した細胞の溶解物は、それぞれ、γ₁３４．５又はγ₁３４．５−ＭｙＤ１１６蛋白質を発現した。この抗体は、擬似感染細胞又はγ₁３４．５^-ウイルスに感染した細胞の溶解物と反応しなかった。実施例９ｅＩＦ−２(α³²Ｐ)ホスファターゼ活性は、野生型又はＲ８３００組換え型ウイルスに感染した細胞において非常に豊富であり、 γ₁３４．５^-ウイルスに感染した細胞において有意に減じている γ₁３４．５^-ウイルスＲ３６１６に感染した細胞における蛋白質合成の停止がｅＩＦ−２αホスファターゼ活性のレベルによって決定されるのかどうかを確認するための実験を行った。Ｓ１０画分を、感染又は擬似感染したＨｅＬａ細胞の溶解物から調製して、ｅＩＦ−２(α³²Ｐ)を脱リン酸化する能力について試験した。未反応のｅＩＦ−２(α³²Ｐ)(図４、レーン１、１４、１８)は、ｅＩＦ−２ α、ｅＩＦ−２β(矢印)及び少量の分子量３９，０００の蛋白質(矢印)(ｅＩＦ −２αから区別される夾雑物)に対応する３つの標識されたバンドを示した[Gros s等，J.Biol.Chem.255:6270-6275(1980)参照]。このｅＩＦ−２の、擬似感染細胞からのＳ１０画分との反応は、ｅＩＦ−２(α³²Ｐ)からの放射能の消失の中位の速度を示した(図４及び図５Ａ〜５Ｄ)。このｅＩＦ−２(α³²Ｐ)ホスファターゼ活性は、γ₁３４．５^-ウイルスに感染した細胞において約３倍減少した。鮮明に対照的に、野生型ウイルス又はＲ８３００変異型ウイルスに感染した細胞のＳ１０画分は、非常に顕著なレベルのｅＩＦ−２(α³²Ｐ)ホスファターゼ活性を示したので、事実上すべての加えたｅＩＦ−２(α³²Ｐ)の放射能は、反応の最初の２０秒以内に除去された(図４、レーン２及び１１)。このホスファターゼ活性は、反応混合物をＳＤＳ変性溶液と混合した後には続かないということを確かめるために、それを試験して、ｅＩＦ−２(α³²Ｐ)が、ＳＤＳと野生型又はＲ８３００組換え型ウイルスに感染した細胞からのＳ１０画分の混合物に加えた後において、全く安定であるということが見出された。ＨｅＬａ細胞の野生型又はＲ８３００組換え型のウイルス感染と関係するｅＩＦ−２(α³²Ｐ)ホスファターゼ活性の増加を定量するために、これらの細胞からのＳ１０画分を、ｅＩＦ−２(α³²Ｐ)のリン酸化速度が正確に測定できるまで、漸進的に希釈した。野生型感染細胞のＳ１０画分を６００倍希釈したときにのみｅＩＦ−２(α³²Ｐ)ホスファターゼ活性が正確に測定でき、それは、やはり、擬似感染細胞より５倍強かった(図４及び図５Ａ〜５Ｄ)。これらの発見は、野生型感染細胞のｅＩＦ−２(α³²Ｐ)ホスファターゼ活性が約３０００倍増大したことを示している。同様の分析は、Ｒ８３００組換え型ウイルスに感染した細胞においては、この活性は、約５０倍増大したことを示した(図４及び５Ａ〜５Ｄ)。これらの試料中の放射能の除去は、それがｅＩＦ−２α蛋白質の消失(染色により測定する)と関係しない限りは、脱リン酸化に相当し、蛋白質分解を表すものではなかった。加えて、野生型ウイルスに感染した細胞のＳ１０画分で見られた顕著に増大したｅＩＦ−２(αＰ)ホスファターゼ活性は、分子量３９，０００の燐蛋白質もｅＩＦ−２(β³²Ｐ)も同じ条件下で有意に影響を受けなかった限り、ｅＩＦ−２αに特異的であり得る(図４)。最後に、図４及び図５Ａ〜５Ｄに示した結果は、再現可能であり、擬似感染又は感染したＨｅＬａ細胞からの３つのＳ１０画分の各々についての２つの測定において得られた。実施例１０ｅＩＦ−２(αＰ)ホスファターゼ活性は、ＰＰ１αインヒビター２に対して感受性であるｅＩＦ−２(α³²Ｐ)がＰＰ１αによって脱リン酸化されるかどうかを測定するために、ｅＩＦ−２(α³²Ｐ)の脱リン酸化速度を、ＰＰ１の公知のインヒビターであるインヒビター２の濃度の関数として測定した。図５、パネルＢに示したように、野生型ウイルス又はＲ８３００ウイルスに感染した細胞からのＳ１０画分中のｅＩＦ−２(α³²Ｐ)ホスファターゼは、同様に、インヒビター２に感受性であったが、脱リン酸化速度は、それぞれ、約９０及び１２０μｇ／ｍｌのインヒビター２で５０％減少していた。これは、活性化されたｅＩＦ−２(α³²Ｐ)ホスファターゼがＰＰ１に由来することを示唆する。しかしながら、活性化ｅＩＦ− ２(αＰ)ホスファターゼの阻害に必要なインヒビター２の濃度は、擬似感染細胞においてｅＩＦ−２(α³²Ｐ)ホスファターゼを阻害するのに要する濃度よりずっと高いようであり、細胞抽出物においてＰＰ１αを阻害するのに要する濃度よりもずっと高いようである。Coher，Methods in Enzymology 201:389-398(1991)を参照されたい。これは、γ₁３４．５のＨｅＬａ細胞ＰＰ１αとの可能な会合によるといえよう。これは、図４に示した結果により示唆されるように、ｅＩＦ− ２(αＰ)に特異的なホスファターゼ活性を生じる。実施例１１活性化されたホスファターゼ活性は、ｅＩＦ−２αに特異的であるｅＩＦ−２(α³²Ｐ)ホスファターゼが感染細胞において特異的に活性化されるということを確かめるために、擬似感染した又は野生型ウイルスに感染したＨｅＬａ細胞の溶解物による[³²Ｐ]ホスホリラーゼ(セリン／スレオニンホスファターゼの公知の基質)の脱リン酸化を調べた。その結果(図５Ｃ)は、ＨＳＶ−１(Ｆ )に感染した細胞の³²Ｐ−ホスホリラーゼホスファターゼ活性が擬似感染細胞のそれの１／２でしかないということを示した。野生型ウイルスに感染した細胞における³²Ｐ−ホスホリラーゼの脱リン酸化の原因の活性は、インヒビター２に感受性である(図５Ｄ)。野生型ウイルスに感染した細胞におけるホスホリラーゼホスファターゼ活性は、擬似感染細胞のそれと比較して有意に減少しているという観察は、ｅＩＦ−２(αＰ)ホスファターゼの活性化の機構がγ₁３４．５遺伝子産物の細胞性ＰＰ１αの一部分との会合(この画分をｅＩＦ−２(αＰ)に特異的なホスファターゼ活性に変換する)を含み得るということを示唆する。実施例１２プログラムされた細胞死のインデューサー及びインヒビターの同定のための無細胞系プログラムされた細胞死がｅＩＦ−２αのリン酸化及び蛋白質合成の停止と関係しており、γ₁３４．５及びＧＡＤＤ３４(ＭｙＤ１１６)等の蛋白質がＰＰ１ αを向け直してｅＩＦ−２αを脱リン酸化することにより蛋白質合成の停止を防止して、活性化ＰＫＲの存在にもかかわらず継続した蛋白質合成を可能にするという上記の観察は、プログラムされた細胞死の候補のインデューサー又はインヒビターを同定するための無細胞系の調製に利用された。上記の実施例から明らかなように、この発明によるプログラムされた細胞死のインヒビターを同定するための無細胞系は、リン酸化されたｅＩＦ−２α及びＰＰ１αを含む。ｅＩＦ−２αは、³²Ｐでリン酸化され得る。この系は、更に、細胞、例えばＨｅＬａ細胞、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞若しくは他の真核細胞等のポストリボソーム上清及び／又は適当な緩衝剤を含むことができる。プログラムされた細胞死の候補のインヒビターを、次いで、この系に導入し、そのｅＩＦ−２αリン酸化のレベルに対する効果を上記のように測定する。プログラムされた細胞死のインヒビターを、それらの、ｅＩＦ−２αのリン酸化レベルを例えばＰＰ１α をｅＩＦ−２αを脱リン酸化するように向け直すことにより減じる能力によって同定する。同様に、プログラムされた細胞死のインヒビターは、それらの、ｅＩＦ−２αのリン酸化を防止する能力によって同定され得る。プログラムされた細胞死の候補のインヒビターの能力も又、その無細胞系においてＰＫＲと相互作用する能力によって同定され得る。この発明による無細胞系は又、プログラムされた細胞死のインデューサーを同定するためにも有用である。従って、かかる系は、ｅＩＦ−２α、ＰＰ１α及び適当なホスフェートドナー例えばＡＴＰ又はＡＴＰアナログを含む。ＡＴＰは、 γ³²ＡＴＰであってよい。この無細胞系は、更に、真核細胞に由来するポストリボソーム上清を含むことができる。この無細胞系は、更に、ＰＫＲを含むことができる。かかるインデューサーは、それらの、リン酸化されたｅＩＦ−２αのレベルを、例えばＰＰ１α又はＰＫＲに、この無細胞系に導入された際に、適当なホスフェートドナー例えばＡＴＰ又はＡＴＰアナログ(γ³²Ｐ標識ＡＴＰであってよい)の存在下でｅＩＦ−２αをリン酸化するように指示することによってリン酸化し又は維持する能力により同定される。ｅＩＦ−２αのリン酸化のレベル、並びにｅＩＦ−２αのリン酸化及び脱リン酸化と関係するホスファターゼ及びホスホリラーゼの活性を、例えば、上記の実施例４、５及び９に記載したように測定する。ホスファターゼ及び／又はホスホリラーゼ反応の速度も又、測定することができ、そのデータを、個々の脱リン酸化及びリン酸化反応を一層完全に特性決定して定量するために、例えば、ミカエリス−メンテン分析を用いて分析することができる。この発明によって、インヒビター又はインデューサーの濃度の変更を、これらの物質がそれらの効果を発揮する最適濃度を確認するために、この発明の無細胞系に導入する。ヒトのＰＰ１α及びｅＩＦ−２αは、本発明の実施に好適である。組換えにより生成されたＰＰ１α及びｅＩＦ−２αの利用も又、この発明の範囲内にある。他の真核又は原核生物由来のｅＩＦ−２α及び／又はＰＰ１αのアナログ又は相同物も又、ｅＩＦ−２α及びＰＰ１αが組換え法により製造されるならば、この発明の範囲内にある。この発明の無細胞系で生成されたリン酸化された(標識された)ｅＩＦ−２αは、この系の他の成分から電気泳動により又はクロマトグラフィー的方法によって分離することができる。例として、標識したｅＩＦ−２αを、変性ポリアクリルアミドゲル上で分離することができ、その後、分離した成分を例えばナイロン又はニトロセルロース膜上にトランスファーし、次いで、Ｘ線フィルムに露出することができる。次いで、リン酸化の相対的レベルを、露光したＸ線フィルムを現像してｅＩＦ−２αに対応するバンドの密度を例えばデンシトメトリーにより定量した後に、測定する。このオートラジオグラフは又、バンドを標識したｅＩＦ −２αに対応して膜上に局在化させるためにも利用することができ、その後、それらを膜から切り出して液体シンチレーションその他の計数方法により計数することができる。ｅＩＦ−２α及びＰＰ１αは、哺乳動物起源のものであってよい。上記は、非制限的な例として提出したものであり、添付の請求の範囲に示した本発明を制限するものと解釈すべきではない。本願中で引用したすべての参考文献を、参考として、そのまま本明細書中に援用する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ビン，ヒーアメリカ合衆国 60637 イリノイ，シカゴ，イーストフィフティシックススストリート 934

Claims

【特許請求の範囲】１．無細胞系においてプログラムされた細胞死のインヒビターを同定する方法であって、該方法は、下記のステップ： (ａ)リン酸化されたｅＩＦ−２α及びプロテインホスファターゼ１α(ＰＰ１ α)を含む無細胞系を用意し； (ｂ)ステップ(ａ)の無細胞系にプログラムされた細胞死の候補のインヒビターを導入して、その結果生成した混合物をインキュベートし；そして (ｃ)ステップ(ｂ)で生じたｅＩＦ−２αのリン酸化レベルを測定することを含み、ここに、プログラムされた細胞死のインヒビターは、プログラムされた細胞死に伴うｅＩＦ−２αのリン酸化レベルの増加を対照と比較して減らし又は防止する、上記のプログラムされた細胞死のインヒビターを同定する方法。２．ステップ(ａ)の無細胞系が、更に、緩衝剤を含む、請求項１に記載の方法。３．リン酸化されたｅＩＦ−２αが、[³²Ｐ]標識されたｅＩＦ−２αである、請求項１に記載の方法。４．無細胞系が、哺乳動物細胞由来のポストリボソーム上清を含む、請求項１に記載の方法。５．ポストリボソーム上清が、発現可能なγ₁３４．５遺伝子を欠く単純ヘルペスウイルスに感染した哺乳動物細胞に由来する、請求項４に記載の方法。６．リン酸化されたｅＩＦ−２αが、[³²Ｐ]標識されたｅＩＦ−２αである、請求項４に記載の方法。７．リン酸化されたｅＩＦ−２αが、ｅＩＦ−２α、ヘミン制御された翻訳リプレッサー及びＡＴＰ又はそのアナログを含む混合物における反応により調製される、請求項１に記載の方法。８．混合物が、更に、緩衝剤を含む、請求項７に記載の方法。９．無細胞系においてプログラムされた細胞死のインデューサーを同定する方法であって、該方法は、下記のステップ： (ａ)ｅＩＦ−２α、プロテインホスファターゼ１α(ＰＰ１α)及びＡＴＰ又はそのアナログを含む無細胞系を用意し； (ｂ)ステップ(ａ)の無細胞系にプログラムされた細胞死の候補のインデューサーを導入して、その結果生成した混合物をインキュベートし；そして (ｃ)ステップ(ｂ)で生じたｅＩＦ−２αのリン酸化のレベルを測定することを含み、ここに、プログラムされた細胞死のインデューサーは、プログラムされた細胞死に伴うｅＩＦ−２αのリン酸化レベルの減少を対照と比較して増大させ又は防止する、上記のプログラムされた細胞死のインデューサーを同定する方法。１０．ステップ(ａ)の無細胞系が、更に、緩衝剤を含む、請求項９に記載の方法。１１．無細胞系が、更に、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ(ＰＫＲ)を含む、請求項９に記載の方法。１２．ＡＴＰが、γ³²Ｐ標識したＡＴＰである、請求項９に記載の方法。１３．無細胞系が、更に、哺乳動物細胞由来のポストリボソーム上清を含む、請求項９に記載の方法。１４．無細胞系が、更に、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ(ＰＫＲ)を含む、請求項１３に記載の方法。