JP2001508653A - ヒトガラニンレセプターｇａｌｒ２及び該レセプターをコードするヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規なガラニンレセプターＧＡＬＲ２が記載されている。また、該レセプターをコードする核酸及び該レセプターに特異的なリガンドを同定する種々のアッセイが開示されている。このように同定されたリガンドは肥満症の治療、疼痛の治療及び認識障害の治療に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトガラニンレセプターＧＡＬＲ２及び該レセプターをコードるヌクレオチド 発明の分野 本発明は、ＧＡＬＲ２と命名された新規なガラニンレセプター、該レセプター をコードするヌクレオチド、及び、該レセプターを使用するアッセイに関する。発明の背景 ガラニンはブタの腸から初めて単離されたが、中枢及び末梢の神経系に広く分 布している。たいていの生物種のガラニンはアミド化カルボキシル末端をもつ２ ９個のアミノ酸から成るペプチドである。ヒトガラニンに特有の特徴は、３０個 のアミノ酸から成るより長いペプチドであること及びアミド化末端をもたないこ とである。ガラニン配列は高度に保存性であり、すべての種のガラニン配列の最 初の１５個のアミノ酸は完全に保存されている。ガラニンは、主として視床下部 、青斑、海馬及び下垂体前葉並びに脊髄、膵臓及び胃腸管の領域で免疫反応及び 結合を生じる。 満腹したネズミの視床下部の側脳室核（ＰＶＮ）にガラニンを注入したとき、 神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）と同様の用量依存的な摂取増進が生じる。ガラニンは ノルエピネフリンと同様に炭水化物の摂取を増進させるが、いくつかの研究はガ ラニンが脂肪摂取を強力に増進させることを証明した。巨大分子栄養素の選択順 位はガラニンによって炭水化物から脂肪に移ることが示唆された。ガラニンの注 入は摂取を増進し、エネルギー消費を抑制し、インスリン分泌を阻害する。遺伝 性肥満のラットでは視床下部のガラニン発現が痩せた同腹仔対照に比べて増進し ていることが観察される。ペプチドレセプターのアンタゴニストをＰＶＮに注入 すると、ガラニン特異的脂肪摂取増進の誘発がブロックされる。ガラニン特異的 アンチャンスオリゴヌクレオチドをＰＶＮに注入すると、ガラニン発現の特異的 減少が生じ、これに対応してタンパク質または炭水化物の摂取は殆ど変化しない が脂肪の摂取及び総熱量摂取は減少する。従ってガラニンは、脂肪の摂取挙動に 関与する有力な神経化学マーカーの１つであると考えられる。 ガラニンはラットのコリン作動性機能を阻害し、機能性記憶を損傷する。コリ ン作動性ニューロンを破壊する病変は空間認 識機能を欠損させる。アセチルコリン（ＡＣｈ）の局所投与はこの欠損をある程 度回復させるが、ガラニンはこのようなＡＣｈ介在型の回復をブロックする。ア ルツハイマー病に罹患した脳の剖検サンプルは、基底神経節でガラニン作動性（ ｇａｌｉｎｅｒｇｉｃ）神経支配が増加したことを示唆する形跡を有している。 従って、もしガラニン作動性活性の亢進がアルツハイマー病の認識能力低下の原 因であるならば、ガラニンのアンタゴニストは認識能力低下を緩和させる治療に 有効であろう。 脳室内投与、皮下投与または静注によってラットにガラニンを投与すると、血 漿中の成長ホルモンが増加する。また、健常な被験者にヒトのガラニンを注入し たときも、血漿中の成長ホルモンが増加し、ＧＨＲＨ（成長ホルモン放出ホルモ ン）に対する成長ホルモン応答が強力に増進される。 ガラニンは背根神経節に特に高レベルで存在する。座骨神経の切除によってガ ラニンのペプチド及びｍＲＮＡのレベルが劇的に上方調節される。アキソトミー （ａｘｏｔｏｍｙ）後にガラニンレセプターのアンタゴニスト（Ｍ３５、Ｍ１５ ）を反復投与すると、通常は疼痛に対する反応であると考えられている ラットの自己加害損傷挙動が明らかに亢進している。切断した座骨神経の近位端 にガラニン特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを付加すると、ガラニンペプ チドのレベル上昇が抑制され、同時に自己分裂が促進される。莢膜注入したガラ ニンはモルヒネの鎮痛作用に相乗効果を与える。このようなモルヒネの抗侵害受 容効果はガラニンレセプターのアンタゴニストによってブロックされる。従って 、ガラニンのアゴニストは神経性疼痛の緩和にある程度有効であろう。 ガラニンは、百日咳毒素感受性Ｇｉ／Ｇｏタンパク質に結合する高親和性ガラ ニンレセプターに介在され、アデニル酸シクラーゼ活性の阻害、Ｌ型Ｃａ⁺⁺チャ ンネルの閉鎖及びＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャンネルの開放などに作用する。¹²⁵Ｉ−ガ ラニン（Ｋｄ約１ｎＭ）の特異的結合は、ガラニンの免疫反応が局在する領域、 即ち、視床下部、腹側海馬、前脳基底、脊髄、膵臓及び下垂体で証明されている 。大抵の組織中では、高親和性結合及びアゴニスト活性を生じるためには、アミ ノ末端（ＧＡＬ１−１５）だけで十分である。 最近、ガラニンレセプターのｃＤＮＡがヒトＢｏｗｅｓメラノーマ細胞系から 発現クローニングによって単離された （Ｈａｂｅｒｔ−Ｏｒｔｏｌｉら，１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．，ＵＳＡ ９１：９７８０−９７８３）。このレセプターＧＡＬＲ１はヒ ト胎児の脳及び小腸で発現されるが他の場所ではその分布が殆ど知られていない 。ＣＯＳ細胞中で一過性に発現されたこのレセプターに対する¹²⁵Ｉ−ブタガラ ニンの結合を阻害する物質としてＧａｌ（１−１６）はｐＧＡＬ（３−２９）の １０００倍以上の活性を示した。レセプターのこのサブタイプがガラニン特異的 摂取挙動に介在する視床下部のレセプターであるか否かを判断することは今後の 研究課題である。 上記以外のガラニンレセプターを更に同定し、この生体システムを更に詳細に 特性決定し、ガラニンレセプターのサブタイプの選択的なアゴニスト及びアンタ ゴニストを同定することも要望されている。発明の概要 本発明は、随伴タンパク質が実質的に存在しない、ＧＡＬＲ２と命名された新 規なガラニンレセプター、及びＧＡＬＲ２に少なくとも約４０％の相同性を有し ており実質的に同じ生物活性を有しているＧＡＬＲ２様レセプターに関する。本 発明の好ま しい実施態様では、ＧＡＬＲ２様レセプターはＧＡＬＲ２に少なくとも約６０％ 、より好ましくは少なくとも約７５％、更に好ましくは少なくとも約８５％の相 同性を有している。より特定的には本発明は、随伴タンパク質が実質的に存在し ないラット、ヒト及びマウスのＧＡＬＲ２、並びに、ＧＡＬＲ２に少なくとも約 ５０％の相同性を有しており実質的に同じ生物活性を有しているレセプターに関 する。 本発明の別の目的は、霊長類または非霊長類のＧＡＬＲ２タンパク質であって 、実質的に同じ核酸配列によってコードされているが、スプライシングによる変 化またはその他のＲＮＡプロセシングに由来する修飾または突然変異に誘発され た変化を生じた結果として、発現されたタンパク質が天然形態と相同であるが天 然形態とは異なるアミノ酸配列を有しているようなＧＡＬＲ２タンパク質を提供 することである。これらの変異形態はヒト及び動物の生理学においてもｉｎ ｖ ｉｔｒｏの細胞ベースアッセイにおいても異なる及び／または追加の機能を有し 得る。 本発明の更に別の目的は、ラット、ヒト、マウス、ブタまたは他の生物種のガ ラニンレセプターまたはその機能的等価物を コードする核酸を提供することである。これらの核酸は随伴核酸が存在しないも のでもよく、または、単離もしくは精製されたものでもよい。本発明のレセプタ ーをコードする核酸は任意の種類の核酸でよい。本発明は特定的にＲＮＡも包含 するが、好ましい形態はゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡのようなＤＮＡである。核酸 構築物はまた、１つまたは複数のプロモーター領域、終止領域及び所望の場合に はエンハンサー領域のような転写及び翻訳の調節領域を含み得る。核酸は、平均 的な知識をもつ当業者に公知の汎用技術に従って、プラスミドのような公知の任 意のベクターに挿入され、適当な宿主細胞をトランスフェクトするために使用さ れる。 本発明の別の目的は、ＧＡＬＲ２をコードする核酸を含むベクター、及び、こ れらのベクターを含む宿主細胞を提供することである。本発明の更に別の目的は 、ＧＡＬＲ２をコードする核酸を含むベクターを培養条件下で宿主細胞に導入す る段階から成るＧＡＬＲ２の製造方法を提供することである。 本発明のまた別の目的は、本発明のレセプター及び／または核酸を利用するＧ ＡＬＲ２リガンドのアッセイを提供することである。このアッセイの好ましい実 施態様では、ＧＡＬＲ２に 対する推定ＧＡＬＲ２リガンドの結合とガラニンの結合とを比較する。図面の簡単な説明 図１は、５’及び３’非翻訳領域を含むラットＧＡＬＲ２（クローン２７Ａ） の核酸配列（配列１）である。 図２は、開始コドンＭｅｔから終止コドンまでのＧＡＬＲ２（クローン２７Ａ ）の核酸配列（配列２）である。 図３は、ＧＡＲＬ２（クローン２７Ａ）の概略図、並びに、ＧＡＬＲ２（クロ ーン２７Ａ）の核酸配列及び推定アミノ酸配列（配列３及び４）である。 図４は、ＧＡＬＲ２（クローン２７Ａ）の推定アミノ酸配列（配列５）である 。 図５は、ラットＧＡＬＲ１のアミノ酸配列（配列６）とラットＧＡＬＲ２（配 列７）のアミノ酸配列との比較（重層位置合せ）である。 図６は、ＧＡＬＲ２を単離するために使用したｃＤＮＡプローブの核酸配列（ 配列８）である。 図７は、ヒトＧＡＬＲ２遺伝子のＤＮＡ配列（配列９）である。 図８は、ヒトＧＡＬＲ２遺伝子のＤＮＡ配列（読取り枠だけ）（配列１０）で ある。 図９は、ヒトＧＡＬＲ２の推定アミノ酸配列（配列１１）である。 図１０は、ヒト及びラットのＧＡＬＲ２の薬理学を示す。 図１１は、ＧｑまたはＧｓ共役応答（色素分散）及びＧｉ共役応答（色素凝集 ）を示す。 図１２は、マウスＧＡＬＲ２遺伝子のＤＮＡ配列（配列１２）である。 図１３は、マウスＧＡＬＲ２遺伝子のアミノ酸配列（配列１３）である。 図１４は、ＧＡＬＲ遺伝子ファミリーに属する遺伝子の高度な配列保存性を示 すヒト、ラット及びマウスのＧＡＬＲ１及びＧＡＬＲ２のタンパク質配列の比較 である。 図１５は、ヒトＧＡＬＲ２のＲＮＡ発現プロフィルである。 図１６は、ラットＧＡＬＲ２の脳内発現を示す。発明の詳細な説明 明細書及び請求の範囲で使用した用語を以下に定義する。 “随伴タンパク質が実質的に存在しない”という表現は、レ セプターの少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％が、ガラニンレ セプターを発現する生存哺乳類細胞中で通常は検出される他の細胞膜タンパク質 を随伴していないことを意味する。 “随伴核酸が実質的に存在しない”という表現は、核酸の少なくとも約９０％ 、好ましくは少なくとも約９５％が、ガラニンレセプター遺伝子を天然に発現す る生存哺乳類細胞中で通常は検出される他の核酸を随伴していないことを意味す る。 “実質的に同じ生物活性”という表現は、レセプター−ガラニン結合定数がＧ ＡＬＲ２とガラニンとの結合定数の５倍以内、好ましくはＧＡＬＲ２とガラニン との結合定数の２倍以内であることを意味する。 “緊縮性ポストハイブリダイゼーション洗浄条件”は、６５℃の０．１×標準 生理的クエン酸塩溶液（ＳＳＣ）を意味する。 “標準ポストハイブリダイゼーション洗浄条件”は、５５℃の６×ＳＳＣを意 味する。 “緩和ポストハイブリダイゼーション洗浄条件”は、３０℃の６×ＳＳＣ、ま たは５５℃の１〜２×ＳＳＣを意味する。 “機能性等価物”は、選択的スプライシング、欠失、突然変 異または付加の結果として天然産生ＧＡＬＲ２タンパク質に完全に等しいアミノ 酸配列を有していないが、天然産生レセプターの生物活性の少なくとも１％、好 ましくは１０％、より好ましくは２５％を保存しているレセプターを意味する。 このような誘導体は天然ＧＡＬＲ２に有意な相同性を有しており、ＧＡＬＲ２か ら得られたＤＮＡ配列と共に低緊縮性ハイブリダイゼーションを行わせることに よって検出できる。機能性等価物をコードしている核酸は天然産生レセプターの 核酸に対してヌクレオチドレベルで少なくとも約６０％の相同性を有している。 第二のガラニンレセプターが存在することが本発明によって知見され、ＧＡＬ Ｒ２と命名され。ラット、ヒト及びマウスのＧＡＬＲ２配列をそれぞれ図４、図 ９及び図１３に示し、実施例で説明する。しかしながら、本発明が生物の種に関 わりなくＧＡＬＲ２を特定的に包含すること、特に齧歯類（ラット及びマウスを 含む）、アカゲザル、ブタ、ニワトリ、ウシ及びヒトのＧＡＬＲ２を特定的に包 含することを理解されたい。ガラニン２レセプターはどの種においても高度に保 存されており、平均的な知識をもつ当業者は、本文中に示したラット、ヒト及び ／またはマウスの配列に基づいて他の生物種のＧＡＬＲ２を得るためのプローブ を容易に設計できる。 ＧＡＬＲ２タンパク質は、細胞膜中でレセプターを固定する１つまたは複数の ドメイン、少なくとも１つのリガンド結合ドメイン、などのような種々の機能性 ドメインを含む。多くのレセプタータンパク質と同様に、多くのアミノ酸の修飾 、特にリガンド結合ドメインに検出されないが出発レセプターの生物活性を少な くともある程度のパーセンテージで保存しているアミノ酸の修飾が可能である。 従って、本発明は特定的に、Ｎ末端部分の欠失、欠損または突然変異を有する機 能的に等価の修飾されたＧＡＬＲ２を包含する。また、本発明は特定的に、機能 的活性の低下を随伴しない修飾及び／または欠失を他のドメインに有している機 能的に等価の修飾されたＧＡＬＲ２を包含する。 更に、第二のメッセンジャーエフェクター系と相互作用するドメインのような 他の機能性ドメインを結合特異性及び／または選択性を改変することによって修 飾することも可能である。このような機能的に等価の突然変異レセプターも本発 明の範囲内に包含される。 本発明のタンパク質は、７つのトランスメンブランドメイン（ＴＭ）を有する Ｇタンパク質に結合したレセプターのスーパーファミリー（ＧＰＣ−Ｒまたは７ −ＴＭレセプター）の典型的な構造的特徴を有していることが知見された。従っ て、ＧＡＬＲ２タンパク質はレセプターファミリ−ＧＰＣ−Ｒの新規な構成員と なる。本発明の完全形のＧＡＬＲ２は、７つのトランスメンブラン領域、細胞内 及び細胞外の３つのループ、ＧＰＣ−Ｒタンパク質のシグナチャー（ｓｉｇｎａ ｔｕｒｅ）配列、のようなＧＰＣ−Ｒの一般的特徴を有していることが知見され た。ＴＭドメイン及びＧＰＣ−Ｒタンパク質のシグナチャー配列は、ＧＡＬＲ２ のタンパク質配列にも認められる。機能を果たすために全部の領域が必要である とは限らないので、本発明は必須でない１つまたは複数のドメインが欠失した機 能性レセプターも包含する。 ヌクレオチド配列の決定は、ＧＡＬＲ２がイントロン含有のＧＰＣ−Ｒのクラ スに属することを示した。ポリ（Ａ）領域で終結する前駆体ｍＲＮＡであるクロ ーン２７Ａは１１１９ｂｐの読み取り枠をコードしており、この読み取り枠は約 ５００ｂｐの１つのイントロンによって２つのエキソンに分割されている （図４）。エキソン１は予測されたＴＭ−３を含むＮ末端の細胞外ドメインをコ ードしており、エキソン２はＣ末端細胞内ドメインを含む第二の予測された細胞 外ループをコードしている。完全に保存されたスプライスドナー部位（Ｇ／ｇｔ ）はヌクレオチド３６８に検出され、これはＧタンパク質に結合したレセプター のシグナル芳香族トリプレット（Ｄ，Ｅ）ＲＹの第二残基に一致する。 イントロンの除去は、クローン２７Ａが図４の下線部分で示したような７つの 予測されたＴＭドメインと共に３７２個のアミノ酸から成る全長ラットガラニン レセプターポリペプチドをコードしていることを示す。核酸及びタンパク質の配 列のデータベースを検索すると、読み取り枠の配列は１つであり、ラットのガラ ニン１レセプター（ＧＡＬＲ１）に極めて近縁であり、核酸は５５％及びタンパ ク質は３８％の配列一致を有することが判明した。ラットのＧＡＬＲ１及びＧＡ ＬＲ２のタンパク質配列の位置合せを図５に示す。ＧＰＣ−Ｒが有している複数 の保存された特徴、即ち、ＴＭ−３に隣接のシグナチャー芳香族トリプレット配 列（Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ）、ジスルフィド結合し得る最初の２つの細胞外ル ープ中のＣｙｓ−９８及び Ｃｙｓ−１５３、推定アミノ末端のＮグリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅ ｒ／Ｔｈｒ）、カルボキシル末端及び第三の細胞質ループ中のリン酸化部位、Ｔ Ｍ−４、５、６及び７中の保存プロリン残基、がラットＧＡＬＲ２でも同定され た。 第二のｃＤＮＡクローンを単離し、クローン１６．６と命名した。このクロー ンはイントロン非含有であり従ってＧＡＬＲ２の完全読み取り枠を含む連続的ｃ ＤＮＡである。クローン１６．６はクローン２７Ａと同様に約５００ｂｐの５’ 非翻訳領域と、７−ＴＭドメインをコードする連続的ＧＡＬＲ２読み取り枠（１ １１９ｂｐ）と、約３２０ｂｐの３’非翻訳領域と、ポリ（Ａ）領域とを含む。 クローン２７Ａ及びクローン１６．６の読み取り枠は、読み取り枠のヌクレオチ ド１０９（予測されたＴＭ−１に存在する）以外は等しい配列を有している。ク ローン２７Ａは１０９位にＴを含むがクローン１６．６はＣを含む。従って、Ｇ ＡＬＲ２タンパク質のアミノ酸３７はクローン１６．６中ではフェニルアラニン でありクローン２７Ａ中ではイソロイシンである。クローン２７Ａ及びクローン １６．６の双方のＤＮＡはそれぞれのタンパク質と同様に本発明の目的となる。 ヒトＧＡＬＲ２タンパク質の配列はラットＧＡＬＲ２オルト ログに顕著な一致及び類似を示す。ヒト形態及びラット形態の顕著な違いの１つ は、ヒトＧＡＬＲ２のＣ末端細胞内ドメインに追加の１５個のアミノ酸が存在す ることである。マウスのタンパク質配列もまた、ＧＡＬＲ遺伝子ファミリーに極 めて顕著な一致及び類似を示す。 本発明はまた、ＧＡＬＲ２の欠損形態、特にレセプターの細胞外部分を含むが レセプターの細胞内シグナル発生部分が欠失した欠損形態、及び、これらの欠損 形態をコードする核酸に関する。このような欠損レセプターは種々の結合アッセ イで有用である。従って本発明は特定的に、Ｎ末端部分の欠失、欠損または突然 変異を有する機能的に等価の修飾されたＧＡＬＲ２を包含する。また、本発明は 特定的に、機能的活性の低下を随伴しない修飾及び／または欠失を他のドメイン に有しているレセプターキメラのような機能的に等価の修飾されたＧＡＬＲ２を 包含する。 更に、第二のメッセンジャーエフェクター系と相互作用するドメインのような 他の機能性ドメインを結合特異性及び／または選択性を改変することによって修 飾することも可能である。このような機能的に等価の突然変異レセプターも本発 明の範囲 内に包含される。 本発明の別の目的を構成するアッセイは、結合アッセイ（¹²⁵Ｉ−ガラニン結 合に対する競合）、共役活性測定アッセイ（ガラニンレセプター発現細胞中のフ ォルスコリン刺激アデニル酸シクラーゼのガラニン介在阻害を含む）、ガラニン レセプター発現細胞中のガラニン刺激カルシウム遊離の測定（例えばエクオリン アッセイ）、ガラニンレセプター発現細胞中の内部整流カリウムチャンネルの刺 激（ＧＩＲＫチャンネル、電圧変化によって測定）、マイクロフィジオメーター （微量生理機能測定計）によって測定されるガラニンレセプター発現細胞のガラ ニン刺激によるｐＨ変化の測定、などである。 宿主細胞はＧＡＬＲ２を産生するための適正条件下で培養し得る。レセプター をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは組換え宿主細胞中でレセプターを発現 させるために使用し得る。組換え宿主細胞は原核細胞または真核細胞のいずれで もよく、その非限定例としては、大腸菌のような細菌、酵母のような真菌類細胞 、ヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類に由来の細胞系を非限定例とする哺乳類細 胞、ショウジョウバエ、ヨトウムシ、カイコに由来の細胞系を非限定例とする昆 虫細胞がある。哺乳 動物種に由来の市販の適当な細胞系の非限定例は、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（Ａ ＴＣＣ ＣＣＬ １．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、２９ ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、Ｃ Ｖ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０ ）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ Ｃ ＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７１（ＡＴ ＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）及びＭＲ Ｃ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）である。 レセプターに対する親和性を示す化合物の結合特異性は、クローン化したレセ プターでトランスフェクトした細胞またはこれらの細胞に由来の膜に対する化合 物の親和性を測定することによって示される。クローン化したレセプターを発現 させ、これらの細胞に対する放射性標識リガンドの結合を阻害する化合物をスク リーニングする方法は、レセプターに対して高い親和性をもつ化合物を迅速に選 択するための合理的な方法である。上記アッセイによって同定されたこれらの化 合物は、レセプタ ーのアゴニストでもアンタゴニストでもよく、ペプチド、タンパク質または非タ ンパク質性有機分子でよい。あるいは、レセプターの活性に影響を与える化合物 をスクリーニングするためにレセプターの機能アッセイを使用してもよい。この ような機能アッセイはｅｘ ｖｉｖｏの筋肉収縮アッセイからレセプターを発現 する細胞中の第二のメッセンジャーレベルを測定するアッセイまでの範囲に及ぶ 。第二メッセンジャーアッセイの非限定例は、サイクリックＡＭＰもしくはカル シウムのレベルを測定するアッセイまたはアデニリルシクラーゼ活性を測定する アッセイである。上記アッセイによって同定されたこれらの化合物はレセプター のアゴニスト、アンタゴニスト、サプレッサーまたはインデューサーのいずれで もよい。これらの化合物の機能的活性は組織中で先天的に発現されたレセプター またはクローン化され外的に発現されたレセプターを用いて最良に評価される。 本発明のアッセイを使用してガラニンのアゴニスト及びアンタゴニストを同定 し得る。ガラニンのアゴニストは、ガラニン擬似物のようなＧＡＬＲ２に結合し ガラニンの細胞応答に少なくともほぼ等しいかまたは上回る細胞応答を生じる化 合物であ る。このような化合物はガラニン不足を原因とする食欲不振状態または疼痛の治 療に有効であろう。 また、アッセイのこの実施態様を使用してガラニンのアンタゴニストを同定し てもよい。ガラニンのアンタゴニストは、ＧＡＬＲ２に結合できるが天然型ガラ ニンの応答よりも少ない応答を生じる化合物である。このような化合物は肥満の 治療に有効であろう。 本発明の１つのアッセイは、（ａ）ＧＡＬＲ２レセプターを発現する細胞を化 合物の存在下で培養し、（ｂ）ＧＡＬＲ２レセプター活性または第二メッセンジ ャー活性を測定する段階から成るＧＡＬＲ２レセプターを変調する化合物の同定 方法である。所望の場合、上記で測定した活性を、例えば化合物としてガラニン を用いて測定した標準に比較し得る。好ましい実施態様では、細胞を形質転換さ せ、ＧＡＬＲ２レセプターを発現させる。 ハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをプローブするために、補助ｃ ＤＮＡクローン（または例えば１５ヌクレオチドの長さの短縮部分）を使用し、 核酸がハイブリダイズできる十分に類似の他のレセプターを発見してもよい。こ のような クローンは他の種からライブラリーをスクリーニングするために特に有効である 。この段階のハイブリダイゼーション条件が極めて緊縮性の条件から緩和された 条件まで広い範囲で変化できることは平均的な当業者には理解されよう。適正な 温度、塩濃度及びバッファは公知である。 本発明をより十分に説明するために以下の非限定実施例を与える。実施例１ ラットの視床下部に由来のｃＤＮＡライブラリーをプラスミド主体の哺乳類ベ クターｐｃＤＮＡ−３（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中 で構築した。ＲＮａｇｅｎｔｓ全ＲＮＡ単離キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔ ｅｃｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、新しく摘出したラットの視床下部（ 液体窒素中で瞬間冷凍）から全ＲＮＡを、１ｇ（湿潤重量）の視床下部組織から 約０．５ｍｇの収率で単離した。ポリＡ領域ｍＲＮＡの単離システムＩＩＩ（Ｐ ｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡを、０．５μ ｇの全ＲＮＡから約６μｇの収率で選択した。次に、ランダムヘキサマー及びオ リゴ（ｄＴ）−Ｎｏｔ Ｉプライミングの 双方をもつキット（Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）を用いるｃＤＮＡ合成 の鋳型として３μｇのポリ（Ａ）⁺を使用した。ｐＣＤＮＡ−３のＢｓｔＸＩ部 位に挿入するために二重鎖ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ−ＢｓｔＸＩアダプターを用い て改造し、電気穿孔によって大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換させた。得られたラ イブラリーは約７５０，０００の一次形質転換体を含んでおり、９０％のクロー ンがインサート（平均サイズ１−２ｋｂ）を含んでいた。ライブラリー（約７０ ０，０００ｃｆｕ）をアンピシリンとクロラムフェニコールとを含むＬＢプレー トで平板培養し、約２８０ｂｐのＰＣＲフラグメント（配列８）でプローブした 。５０％のホルムアミドと４×デンハルト溶液と０．１％のＳＤＳと１０％の硫 酸デキストランと３０μｇ／ｍｌの剪断したサケ精子ＤＮＡとを２×１０６ｃｐ ｍ／ｍｌの³²Ｐ−標識プローブと共に含む５×ＳＳＰＥバッファ中でハイブリダ イゼーションを３２℃で１８時間行った。〔α〕³²Ｐ−ｄＣＴＰによるランダム プライミングによってプローブを１０⁹ｄｐｍ／μｇよりも大きい比活性まで放 射性標識した。次に、フィルターを１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中 で５５℃で洗浄し、フィルム（Ｋｏｄａｋ Ｘ−ｏｍａｔ）に４８時間露光した 。独立の２つの陽性クローンを同定し（クローン２７Ａ及び１６．６）、更に分 析処理した。実施例２ ＧＡＬＲ２の配列解析 ＷｉｚａｒｄのＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉ ｓｏｎ，ＷＩ）を用いて一夜培養物からＤＮＡを調製し、ＡＢＩ ３７７器具に 載せたＰＲＩＳＭ色素デオキシターミネーターサイクル配列決定キット（Ａｐｐ ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて全 自動配列解析処理した。初期配列決定プライマーはｐｃＤＮＡ−３中のＴ７及び ＳＰ６のプロモーター部位に相補的であり、追加のプライマーをインサートＤＮ Ａに相補的にした。データベース検索（Ｇｅｎｂａｎｋ，ＥＭＢＬ，Ｓｗｉｓｓ −Ｐｒｏｔ，ＰＩＲ，ｄＥＳＴ，Ｐｒｏｓｉｔｅ，ｄｂＧＰＣＲ）、配列位置合 せ及びガラニンレセプターのヌクレオチド及びタンパク質の配列解析を、ＧＣＧ 配列解析ソフトウェアパッケージ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；ペプチド構造及びモ チーフの重層プログラム）、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴ検索プログラム、ＰＣ／ Ｇｅｎｅソフトウェアスーツ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓａｎ Ｆｒ ａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；タンパク質解析プログラム）を用いて行った。実施例３ ＧＡＬＲ２の発現ベクターの構築 ５μｇの哺乳類発現ベクタ−ｐＣＩ．ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ ｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を２０単位のＥｃｏＲＩで３７℃で２時間消化した 。次に消化物を仔ウシ腸ホスファターゼで処理し、次いで１×ＴＡＥバッファ中 の１％のＳｅａｐｌａｑｕｅゲルで電気泳動にかけ、直鎖化したベクターに対応 するバンドを切り出した。Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲシステム（Ｐ ｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて６５℃で融解後の切片からＤＮＡを回 収した。１％のＴＢＥゲル上の標準と共に電気泳動によってＤＮＡを定量した。 ｐＣＤＮＡ−３／２７Ａに由来の１００ｎｇの２２００ｂｐのＥｃｏＲＩインサ ート（イントロンを含む）を５０ｎｇのベクターｐＣＩ．ｎｅｏに１０ｍｌの反 応容量で室温で１時間結合させた。１μｌのこの結合混合物を使用して５０μｌ のコンピテントＤＨ５α細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転 換させた。 ＢａｍＨＩによる消化後に正しい配向のクローンを選択した。次に、Ｑｉａｇｅ ｎ Ｍａｘｉプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用い てトランスフェクション品質のＤＮＡを調製した。哺乳類のＣＯＳ−７細胞を電 気穿孔によってトランスフェクトした。ＣＯＳ−７細胞（１×１０⁷）を０．８ ５ｍｌのリンゲルバッファに浮遊させ、１５ｍｇのｐＣＩ．ｎｅｏ／２７Ａクロ ーンを０．４ｍｍの電気穿孔キュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）に加えた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ電気穿孔デバイスを使用して電流を印加し（９ ６０μＦ，２６０Ｖ）、細胞をＴ−１８０フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した 。発現を７２時間進行させた。実施例４ ＧＡＬＲ２の薬理学 トランスフェクト細胞を無酵素の解離溶液（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｍｅｄｉａ ，Ｌａｖａｌｌｅｔｔｅ，ＮＪ）中で解離させた後、氷冷した膜バッファ（１０ ｍＭのトリス，ｐＨ７．４、１０ｍＭのＰＭＳＦ、１０μＭのホスホルアミドン 及び４０μｇ／ｍｌのバシトラシン）中でダウンスホモジナイザーで破壊するこ とによって膜を調製した。低速遠心（１１００×ｇで１０分、４℃） 及び高速遠心（３８，７００×ｇで１５分間、４℃）した後、膜をバッファに再 懸濁させ、タンパク質濃度を測定した（Ｂｉｏ−Ｒａｄアッセイキット）。２５ ｍＭのトリス，ｐＨ７．４、０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、４０μｇ ／ｍｌのバシトラシン、４μｇ／ｍｌのホスホルアミドン及び１０μＭのロイペ プトンを含む総量２５０μｌのバッファを用いて膜における¹²⁵Ｉ−ヒトガラニ ン（比活性＝２２００Ｃｉ／ミリモル、ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）の結合を測定し た。７０ｐＭの¹²⁵Ｉ−ヒトガラニンを使用した。膜を加えて反応を開始させ、 インキュベーションを室温で１時間進行させた。非特異的結合は１μＭの低温ガ ラニンの存在下で残留している結合放射能の量であると定義した。競合試験では 、種々の濃度のペプチド（ｈＧａＩ、ｐＧａｌ、ｈＧａｌ（１−１６）、ｒＧＡ Ｌ（２−２９）、ｒＧＡＬ（３−２９）、ｈＧａｌ（１−１９））またはキメラ ペプチド（Ｃ７、Ｍ１５、Ｍ４０、Ｍ３５）が¹²⁵Ｉ−ｈＧａｌ（７０ピコモル ）と共に含まれていた。ＴＯＭＴＥＣ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＴ）細胞ハーベスター を使用し、０．１％のポリエチルアミンに予浸したＧＦ／Ｃフィルターを通す高 速濾過によってインキュベーションを終了させた。Ｐｒｉｓｍソフ トウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて 結果を分析した。ラットＧＡＬＲ１タンパク質及びラットＧＡＬＲ２タンパク質 の双方のリガンド結合プロフィルを以下の表に示す（表はクローン２７Ａを示す ；クローン１６．６は同様の結果を生じた）。ラットＧＡＬＲ２に対する¹²⁵Ｉ −標識ヒトガラニンの結合ＫＤは０．２ｎＭであった。 実施例５ ラットＧＡＬＲ２の発現 ラット脳内のＧＡＬＲ２ ｍＲＮＡの分布をマップするために、³²Ｐ−標識Ｇ ＡＬＲ２ ＯＲＦフラグメントをハイブリダイゼーションプローブとして用いて ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。Ｏ’Ｄｏｗｄ，Ｂ．Ｆ．ら， １９９５Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２８：８４−９１参照。図１６に示すように、多数 の脳核及び領域、特に上−、前−（ＰＭＤ／ＰＭＶ）、内−及び外−乳頭核、歯 状回（ＤＧ）、帯状回（ＣＧ）、視床後核（ＰＨ）、視索下部後核及び弓状核（ Ａｒｃ）で特異的ハイブリダイゼーションが検出された。前頭部及び頭頂部の皮 質領域も標識した。ヒトＧＡＬＲ２のクローン単離；縮重ＰＣＲによる部分的ＧａｌＲ２遺伝子のク ローニング ソマトスタチンレセプター及びソマトスタチン近縁遺伝子によってコードされ たレセプターＳＬＣ−１のトランスメンブラン（ＴＭ）領域をコードする配列Ｔ Ｍ３（Ｐ１：５’−ＣＴＧ ＡＣＣ ＧＹＣ ＡＴＧ ＲＳＣ ＡＴＴ ＧＡＣ ＳＧＣ ＴＡＣ；配列１４；Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｓ＝Ｃまたは Ｇ） 及びＴＭ７（Ｐ２：５’−ＧＧＧ ＧＴＴ ＧＲＳ ＧＣＡ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＧＣ ＲＴＡ；配列１５）に基づいて設計した縮重オリゴヌクレオチドを用い たＰＣＲによってヒトゲノムＤＮＡを増幅した。９５℃で１分間の変性、５５℃ 、４５℃または３８℃で１分間のアニーリング及び７２℃で２．５分の伸長を３ ０サイクル繰返し、次いで７２℃で７分間の伸長を行うＰＣＲ条件を使用した。 得られたＰＣＴ産物をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させ、 Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、クレノウ酵素によって平滑末端を 形成した。次いで、０．５％低融点アガロースで電気泳動にかけ、予想したサイ ズのフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングした。コロ ニーを選択し、プラスミドＤＮＡを精製し、インサートを配列決定した。実施例６ 遺伝子の配列及び構造：ヒトＧａｌＲ２ゲノムＤＮＡのクローニング及び配列決 定 ＥＭＢＬ３ ＳＰ６／Ｔ７ヒトゲノムライブラリー(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａ ｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ)をスクリーニングするためのプロ ーブとして、ニックトランスレーションによって〔³²Ｐ〕ｄＣＴＰで放射性標識 したＤＮＡフラグメント（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用した。Ｍａｒｃｈｅｓｅら ，１９９４〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２３，６０９−６１８〕に記載の手順で、陽性フ ァージクローンをプラーク精製し、ＤＮＡを調製し、制限酵素消化し、アガロー スゲルで電気泳動にかけ、ナイロン膜に移し、ライブラリーをスクリーニングす るために使用した同じプローブとハイブリダイズさせた。ファージＤＮＡを消化 し、得られたフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにサブクローニン グすることによって陽性ファージをサブクローニングした。ＡＢＩ３７２全自動 シークエンサー〔Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用し標準方法でクローンのＤＮＡ 配列を決定した。図７に示すように、決定された配列は、１８００ｂｐのイント ロンによって中断された合計２つのエキソンをもつ遺伝子を示す。完全読み取り 枠（図８）の推定アミノ酸配列（図９）は、７つのトランスメンブランアルファ 螺旋ドメインを含むＧタンパク質結合レセプターの典型的な特徴をもつ３８７個 のアミノ酸から成るタンパク質を与える。図１４はＧＡＬＲ１及びＧＡＬＲ２ のタンパク質配列を位置合わせし、７つのトランスメンブランドメインに下線を 付けて示している。ヒトＧＡＬＲ２タンパク質はラットのＧＡＬＲ２オルトログ に高度な配列の一致及び類似を有している。ヒトの形態及びラットの形態の顕著 な違いは、ヒトＧＡＬＲ２のＣ末端細胞内ドメインに追加の１５個のアミノ酸が 存在することである。実施例７ レセプター発現：ヒト及びラットのＧＡＬＲ２：ヒトＧａｌＲ２発現プラスミド の構築 ヒトゲノムクローンからヒトＧａｌＲ２発現構築物をＰＣＲによって組立てた 。各エキソンを標準条件を用いてＰＣＲ増幅した。エキソンＩのプライマーは、 順方向エキソンＩ（５’−ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＧＴ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＣ ＧＴＣ ＴＣＧ ＧＧＣ ＴＧＣ ＣＣ−３’；配列１６）及び逆方向 エキソンＩ（５’−ＧＧＴ ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＧＧ ＣＣＡ ＧＡＴ ＡＣＣ ＴＧＴ ＣＴＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＣＧＧ ＣＧＧ ＣＣ−３’；配列１７） であった。エキソンＩＩのプライマーは、順方向エキソンＩＩ（５′−ＧＧＣ ＣＧＣ ＣＧＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＴＡ ＴＣＴ ＧＧＣ ＣＡＴ ＣＣＧ ＣＴＡ ＣＣ−３’；配列１８）及び逆方向 エキソンＩＩ（５’−ＧＧＣ ＣＧＣ ＣＧＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＡＧＡ ＣＡ Ｇ ＧＴＡ ＴＣＴ ＧＧＣ ＣＡＴ ＣＣＧ ＣＴＡ ＣＣ−３’；配列１９ ）であった。ＰＣＴ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし、配列 決定した。エキソンＩ産物をプラスミドｐＣＩＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄ ｉｓｏｎ，ＷＩ）のＥｃｏＲＩ部位及びＸｂａＩ部位にサブクローニングした。 次に、エキソンＩＩをＸｂａＩ部位にクローニングし、適当な制限消化物及びＤ ＮＡ配列決定によってその向きを決定した。実施例８ 放射性リガンド結合アッセイ Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、電気穿孔によってＣＯＳ−７細胞に トランスフェクトした。簡単に説明すると、０．８５μｌのリンゲルバッファ中 のＣＯＳ−７細胞（１．２×１０⁷／ｍｌ）と２０μｇのＤＮＡとを０．４ｍｍ の電気穿孔キュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中で混合し 、Ｂｉｏ−Ｒａｄ電気穿孔デバイスを用いて 電流（９６０μＦ、２６０Ｖ）を印加した。細胞を新しい培地と共にＴ−１８０ フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移し、発現を７２時間進行させた。トランスフェ クト細胞を無酵素の解離溶液（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｍｅｄｉａ，Ｌａｖａｌｌ ｅｔｔｅ，ＮＪ）中で解離させた後、氷冷した膜バッファ（１０ｍＭのトリス， ｐＨ７．４、１０ｍＭのＰＭＳＦ、１０μＭのホスホルアミドン及び４０μｇ／ ｍｌのバシトラシン）中でダウンスホモジナイザーで破壊することによって膜を 調製した。低速遠心（１１００×ｇで１０分、４℃）及び高速遠心（３８，７０ ０×ｇで１５分間、４℃）した後、膜をバッファに懸濁させ、タンパク質濃度を 測定した（Ｂｉｏ−Ｒａｄアッセイキット）。２５ｍＭのトリス，ｐＨ７．４、 ０．５％のＢＳＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、４０μｇ／ｍｌのバシトラシン、４μ ｇ／ｍｌのホスホルアミドン及び１０μＭのロイペプトンを含む総量０．２５ｍ ｌのバッファを用いて膜における¹²⁵Ｉ−ヒトガラニン（比活性＝２２００Ｃｉ ／ミリモル、ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）の結合を測定した。７０ｐＭの¹²⁵Ｉ−ヒ トガラニンを使用した。膜を加えて反応を開始させ、インキュベーションを室温 で１時間進行させた。非特異的結合は１μＭの低温ガラニンの存在下 で残留している膜結合放射能の量であると定義した。競合試験では、種々の濃度 のペプチド（ｈＧａｌ、ｐＧａｌ、ｈＧａｌ（１−１６）、ｒＧＡＬ（２−２９ ）、ｒＧＡＬ（３−２９）、ｈＧａｌ（１−１９））またはキメラペプチド（Ｃ ７、Ｍ１５、Ｍ４０、Ｍ３５）が¹²⁵Ｉ−ｈＧａｌ（７０ピコモル）と共に含ま れていた。ＴＯＭＴＥＣ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＴ）細胞ハーベスターを使用し、０ ．１％のポリエチルアミンに予浸したＧＦ／Ｃフィルターを通す高速濾過によっ てインキュベーションを終了させた。Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（Ｇｒ ａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて結果を分析した。 一過性にトランスフェクトされたＣＯＳ−７中のヒトＧＡＬＲ２結合部位の組 換え発現を利用して、クローン化されたレセプターの薬理学を定量した。¹²⁵Ｉ −ヒトガラニンは、クローン化したレセプターＧＡＬＲ２に、５ｎＭのＫＤとい う高い親和性で飽和可能にかつ特異的に結合した。図１０に要約したように、種 々のガラニン由来ペプチド及びキメラペプチドアンタゴニスト／部分アゴニスト と¹²⁵Ｉ−ヒトガラニンとの競合はヒトレセプターＧＡＬＲ２がラットＧＡＬＲ ２と同様の結合薬理学を 有することを示した。実施例９ 機能性キャラクタリゼーション：ポストレセプターシグナル伝達メカニズム：カ エル黒色素胞アッセイ アフリカツメガエルの黒色素胞及び線維芽細胞を従来技術に記載の手順（Ｐｏ ｔｅｎｚａ，Ｍ．Ｎ．ら，１９９２、Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．３： ３８−４３）で増殖させた。簡単に説明すると、線維芽細胞馴化増殖培地で黒色 素胞を増殖させた。線維芽細胞馴化増殖培地を調製するために、２０％の熱失活 ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）と１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンと１００ 単位／ｍｌのペニシリンと２ｍＭのグルタミンとを補充した７０％のＬ−１５培 地（Ｓｉｇｍａ），ｐＨ７．３中で線維芽細胞を２７．５℃で増殖させた。線維 芽細胞が増殖した培地を回収し、０．２μｍのフィルターで濾過し（線維芽細胞 馴化増殖培地）、黒色素胞を培養するために２７．５℃で使用した。 ＢＴＸ ＥＣＭ６００電気穿孔デバイス（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用した電気穿孔によってプラスミドＤＮＡを黒 色素胞に一過性にトランスフェクト した。新しいカエル線維芽細胞馴化培地の存在下で黒色素胞を１時間インキュベ ートした後で細胞を回収した。トリプシン処理し（０．２５％のトリプシン、Ｊ ＨＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、次いでカエル線維芽細胞馴化培地でトリプシ ンを失活させるこによって黒色素胞単層を分離させた。２００×ｇで４℃で５分 間遠心することによって細胞を収集した。細胞をカエル線維芽細胞馴化培地で一 回洗浄し、再度遠心し、氷冷した７０％のＰＢＳ，ｐＨ７．０中で５×１０⁶細 胞／ｍｌの濃度で再浮遊させた。２μｇのｐｃＩｎｅｏ；ヒトガラニン２レセプ タープラスミドＤＮＡを、ＤＮＡ総量が２０μｇとなるように対照レセプターｃ ＤＮＡ及びヌードベクターＤＮＡと混合し、この混合物を入れた予冷エッペンド ルフ管に、ＰＢＳ中の細胞の４００μｌのアリコートを加えた（総量４０μｌ中 の各２μｇのｐｃＤＮＡ１ａｍｐ：カンナビノイド２及びｐｃＤＮＡ３：トロン ボキサンＡ２レセプタープラスミドＤＮＡと１８μｇのｐｃＤＮＡ３．１プラス ミドＤＮＡ、または、総量４０μｌ中の各２μｇのｐｃＤＮＡ１ａｍｐ：カンナ ビノイド２及びｐｃＤＮＡ３：トロンボキサンＡ２レセプタープラスミドＤＮＡ と２０μｇのｐｃＤＮＡ３．１プラスミドＤＮＡを対照とし た）。サンプルを氷上で２０分間インキュベートし、７分毎に撹拌した。細胞と ＤＮＡとのミックスを、予冷した２ｍＭギャップ電気穿孔キュベット（ＢＴＸ） に移し、キャパシタンス３２５マイクロファラッド、電圧４５０ボルト及び抵抗 ７２０オームの設定値で電気穿孔した。電気穿孔の直後に、細胞をカエル線維芽 細胞馴化培地（キュベットあたり７．８５ｍｌ）と混合し、平底の９６ウエルマ イクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）に平板培養した。均質なトランスフェクシ ョン効率を確保するために、平板培養に先立って多数のキュベットの電気穿孔物 を合わせてプールした。トランスフェクションの翌日に培地を除去し、新しいカ エル線維芽細胞馴化培地を黒色素胞単層に添加し、細胞を２７℃でインキュベー トした。 ９６ウエルプレートフォーマットで行ったトランスフェクションの２日後に細 胞のレセプター発現を検定した。リガンド刺激の当日に培地を吸引によって除去 し、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．３（Ｓｉｇｍａ）を含む７０％のＬ−１５ で細胞を洗浄した。黒色素胞で色素分散を生じるＧｓ／Ｇｑ機能性共役または色 素凝集を生じるＧｉ機能性共役を検査するためにアッセイを個別の２つの部分に 分割した。Ｇｓ／Ｇｑ機能性共役応答 を検査するために以下の手順でアッセイを行った。１５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む １００μｌの７０％Ｌ−１５中の細胞を暗中、室温で１時間インキュベートし、 次いでメラトニン（最終濃度２ｎＭ）の存在下で暗中、室温で１時間インキュベ ートして、色素凝集を誘発した。リガンドを添加する前にＢｉｏ−Ｔｅｋ Ｅｌ ｘ８００マイクロプレートリーダー（ＥＳＢＥ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用 して６００ｎｍの初期吸光度を測定した。ヒトガラニン（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ） を重複ウエルに添加し、サンプルを混合し、暗中、室温で１時間インキュベート した後、６００ｎｍの最終吸光度を測定した。Ｇｉ共役応答を検査するために、 細胞単層を１００μｌの２％線維芽細胞馴化増殖培地、２ｍＭのグルタミン、１ ００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００単位／ｍｌのペニシリン及び１５ ｍＭのＨＥＰＥＳ含有の１００μｌの７０％のＬ−１５の存在下で暗中、室温で １５分間インキュベートして細胞を分散に予設定した。６００ｎｍの初期吸光度 の測定後、ヒトガラニンを細胞単層に添加し、サンプルを混合し、暗中、室温で １．５時間インキュベートし、次いで最終吸光度を測定した。色素分散を定量す るために公式：１−Ｔｆ／Ｔｉ〔式中、Ｔｉ＝６００ｎｍの初期透過度及びＴｆ ＝ ６００ｎｍの最終透過度〕を用いて吸光度の読み取り値を透過値に変換した。公 式：Ａｆ／Ａｉ−１〔式中、Ａｆ＝６００ｎｍの最終吸光度及びＡｉは６００ｎ ｍの初期吸光度〕を用いて色素凝集を定量した。 ヒトＧＡＬＲ２が黒色素胞中で機能的に発現できたか否かを判定するために、 発現プラスミドｐｃＩｎｅｏ：ｈＧＡＬＲ２を電気穿孔によって黒色素胞に一過 性にトランスフェクトし、トランスフェクト細胞をヒトガラニンで刺激した。対 照ベクターでトランスフェクトした細胞とは明らかに違って、ヒトＧＡＬＲ２で トランスフェクトした黒色素胞中ではガラニンの用量増加に伴って用量依存的な 色素分散が生じた（図１１）。ｐｃＩｎｅｏ：ｈＧＡＬＲ２でトランスフェクト した黒色素胞中のヒトガラニンの見掛けＥＣ₅₀は２０ｎＭであり、ｐｃＩｎｅｏ ：ｈＧＡＬＲ２でトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞中の特異的¹²⁵ヒトガラ ニン結合（ＩＣ₅₀〜４ｎＭ）にほぼ一致した。黒色素胞中の色素分散はＧαｓ共 役とアデニリルシクラーゼの刺激とを介してまたはＧαｑ共役とカルシウムの可 動化とを介して生じることは以前から証明されていた。 ｐｃＩｎｅｏ：ｈＧＡＬＲ２−または擬似（ｍｏｃｋ）−ト ランスフェクトした黒色素胞中で、０．００１〜１，０００ｎＭのヒトガラニン の存在下のインキュベーション後に、検出可能な色素凝集は存在しなかった。こ の結果は、ｈＧＡＬＲ２がＧαｉに介在されるシグナル伝達経路に関与しないこ とを示唆する。実施例１０ エクオリン生物発光アッセイ エクオリンを発現する安定なリポーター細胞系２９３−ＡＥＱ１７（Ｂｕｔｔ ｏｎ，Ｄら，１９９３“Ｃａ²⁺可動化の指標として使用されるエクオリンを発現 する哺乳類細胞系（Ａｅｑｕｏｒｉｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉ ａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｒｅｐｏｒｔ Ｃａ²⁺ ｍｏｂ ｉｌｉｚａｔｉｏｎ”Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ １４：６６３−６７１）中の ＧＡＬＲ２の発現を、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ Ｐｏｗｅｒ ＰＣ ６１００向けに 書かれたカスタムソフトウェアによって制御されるＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ ＲＴ 光度計（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ） を使用して測定した。２９３−ＡＥＱ１７細胞（トランスフェクション前にＴ７ ５フラスコで８×１０⁵細胞を１８時間平板培養した）を、２２μｇのラットま たはヒトのＧＡＬＲ２ プラスミドＤＮＡ：２６４μｇのリポフェクトアミンでトランスフェクトした。 約４０時間の発現後、細胞中のアポ−エクオリンに、ＥＣＢバッファ（１４０ｍ ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ〔ｐＨ＝７ ．４〕、５ｍＭのグルコース、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＣａＣｌ₂、０．１ ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）中で還元条件下（３００μＭの還元グルタチ オン）のコエレンテラジン（１０μＭ）を４時間充填した。細胞を回収し、ＥＣ Ｂ培地中で一回洗浄し、５００，０００細胞／ｍｌの濃度で再浮遊させた。次に 、１００μｌの細胞浮遊液（５×１０４細胞に対応）をテストプレートに注入し 、積分発光を０．５秒単位で３０秒にわたって記録した。２０ｍＬの溶菌バッフ ァ（０．１％の最終トリトンＸ−１００濃度）を注入し、積分発光を０．５秒単 位で１０秒にわたって記録した。各ウエルの“部分応答”の値を、初期チャレン ジに対する積分応答とトリトンＸ−１００溶菌応答を含む総積分発光との比を利 用して計算した。 エクオリン生物発光アッセイは、ホスホリパーゼＣの活性化、細胞内カルシウ ムの可動化及びプロテインキナーゼＣの活性化に導くＧｑ及びＧ１１から成るＧ ａタンパク質サブユニットフ ァミリーを介して結合するＧタンパク質結合レセプターを同定するための信頼性 の高い試験である。エクオリン生物発光アッセイを使用すると、ＧＡＬＲ２に関 する前記の黒色素胞データに基づいて、ＧＡＬＲ２の一次細胞内シグナル伝達メ カニズムが２つの可能性、即ち、Ｇαｓ共役とアデニリルシクラーゼの刺激、ま たは、Ｇαｑ共役とカルシウムの可動化、のいずれによって生じたかを識別でき た。エクオリンを発現する２９３細胞系（２９３−ＡＥＱ１７）中でヒトまたは ラットのＧＡＬＲ２が発現すると、ガラニン及び複数の近縁ペプチドによるチャ レンジに応答してエクオリン生物発光が用量依存的に増加した。Ｇｉ及びアデニ リルシクラーゼの阻害を介してシグナルを伝達するヒトＧＡＬＲ１のトランスフ ェクションは、エクオリン生物発光のガラニン依存的増加を全く生じなかった。 ヒトまたはラットのＧＡＬＲ２の活性化に対して観察された応答は飽和可能であ り、力価の順位は¹²⁵Ｉ−ヒトガラニンとの結合に対する競合試験で観察された 順位と同様であった。ヒトＧＡＬＲ２に対するＥＣ₅₀をｎＭで示すと（結果はラ ットのＧＡＬＲ２オルトログと同様であった）、ヒトガラニン，３２；ラットガ ラニン，１２；ラットガラニン（２−２９），３１；ラットガラ ニン（３−２９）＞１０，０００；Ｍ３５，４４；Ｍ４０，８．８であった。特 に注目すべきは、研究者によってはレセプターＧＡＬＲ１に対する純粋なアンタ ゴニストであると考えられていたガラニンキメラペプチドアンタゴニスト（Ｍ３ ５及びＭ４０）が、レセプターＧＡＬＲ２に対する部分的アゴニストであるらし いと認められたことである。これらのデータは、ＧＡＬＲ２に関する一次シグナ ル伝達メカニズムが、Ｇｉを介するアデニリルシクラーゼの阻害によって細胞内 シグナルを伝達するＧＡＬＲ１と違って、ホスホリパーゼＣ／プロテインキナー ゼＣ経路を経由することを示す。更に、ラット及びヒトのレセプターＧＡＬＲ２ は高い親和性及び力価でガラニンと結合し活性化されるが、ラットまたはヒトの ＧＡＬＲ１は１／１０〜１／３０の低い濃度でガラニンと結合し活性化される。 この観察は、レセプターＧＡＬＲ２のアゴニストであり得る他の未発見の天然産 生リガンド系が存在することを示唆する。実施例１１ ヒトＧａｌＲ２のＲＮＡ発現プロフィル ヒトＧＡＬＲ２ ｍＲＮＡ発現の組織特異性を評価するためにノーザンブロッ ト分析を使用した。図１５に示すように、最 も控え目な発現（１個の“＋”で示す）はラットのＧＡＬＲ２オルトログで観察 されたように種々の脳領域及び末梢組織で観察される。最も優勢な転写物のサイ ズは〜２．２ｋｂであり脾臓、胸腺及び前立腺で〜１．５ｋｂのバンドが観察さ れる。顕著に高い発現レベル（２個または３個の“＋”によって示される）をも つ組織は胎盤、胸腺及び前立腺であった。実施例１２ ヒトＧａｌＲ２遺云子の染色局在 文献に記載された手順（Ｈｅｎｇ，Ｈ．Ｈ．Ｑ．＆ Ｔｓｕｉ，Ｌ．−Ｃ．Ｍ ｏｄｅｓ ｏｆ ＤＡＰＩ ｂａｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕ ｓ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ． Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ １０２：３２５−３３２）に従って、ヒトリンパ球由来の中期拡散染色体の蛍光 ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をＤＡＰＩバンディングパ ターンと共に使用してｈＧａｌＲ２をその染色体に対してマップした。ＦＩＳＨ データは、レセプター遺伝子がヒト染色体１７ｑ２５に局在することを示す。実施例１３ マウスＧＡＬＲ２：クローン単離：マウスＧａｌＲ２ゲノムクローンのクローニ ング ヒトＧａｌＲ２遺伝子に由来のＤＮＡフラグメントをランダムオクトマーラベ リング（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）によって〔³²ｐ〕ｄＣＴＰで放射性標識し、マウ ス１２９ｓｖゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をスクリーニングす るためのプローブとして使用した。陽性ファージクローンをプラーク精製し、Ｄ ＮＡを調製し、制限酵素消化し、アガロースゲルで電気泳動にかけ、ナイロン膜 に移し、ライブラリーのスクリーニングに使用した同じプローブとハイブリダイ ズさせた。陽性のＮｏｔＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ）にサブクロほニングした。実施例１４ 遺伝子の配列及び構造 マウスＧＡＬＲ２の完全ＯＲＦをコードするＤＮＡ配列（配列１２）を図１２ に示す。１０６０ｂｐの単一のイントロンがＯＲＦを２つのエキソンに分割する 。イントロンを除去すると、図１３に示すような３７１個のアミノ酸から成る予 測された ＧＡＬＲ２ポリペプチドを与える接合的翻訳（ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎａｌ ｔｒ ａｎｓｌａｔｉｏｎ）が可能である。マウスのタンパク質配列はヒト及びラット のオルトログの双方に高度な一致（それぞれ８５％及び９６％）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (71)出願人 ユニバーシテイー・オブ・トロント カナダ国、オンタリオ、トロント、タド ル・クリーク・ロード・８ デパートメン ト・オブ・フアーマコロジー (72)発明者 サリバン，キヤスリーン アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 コラコフスキー，リー・エフ，ジユニア アメリカ合衆国、テキサス・78284、サ ン・アントニオ、フロイド・カール・ドラ イブ・7703 (72)発明者 オダウド，ブライアン カナダ国、オンタリオ、トロント、タド ル・クリーク・ロード・８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．随伴タンパク質が実質的に存在しないヒトガラニンレセプター２（ＧＡＬＲ ２）またはヒトＧＡＬＲ２に少なくとも約４０％の相同性を有しており実質的に 同じ生物活性を有しているＧＡＬＲ２様レセプター。 ２．ヒトＧＡＬＲ２に少なくとも約５０％の相同性を有していることを特徴とす る請求項１に記載のＧＡＬＲ２様レセプター。 ３．ヒトＧＡＬＲ２に少なくとも約７５％の相同性を有していることを特徴とす る請求項１に記載のＧＡＬＲ２様レセプター。 ４．ヒトＧＡＬＲ２に少なくとも約８５％の相同性を有していることを特徴とす る請求項１に記載のＧＡＬＲ２様レセプター。 ５．配列９であることを特徴とする請求項１に記載のＧＡＬＲ２。 ６．ヒトＧＡＬＲ２をコードしているかまたはヒトＧＡＬＲ２に少なくとも約４ ０％の相同性を有しており実質的に同じ生物活性を有しているＧＡＬＲ２様レセ プターをコードしていることを特徴とする結合核酸が実質的に存在しない核酸。 ７．ＧＡＬＲ２様レセプターがヒトＧＡＬＲ２に少なくとも約５０％の相同性を 有していることを特徴とする請求項６に記載 のＧＡＬＲ２様レセプターをコードする核酸。 ８．ＧＡＬＲ２様レセプターがヒトＧＡＬＲ２に少なくとも約７５％の相同性を 有していることを特徴とする請求項６に記載のＧＡＬＲ２様レセプターをコード する核酸。 ９．ＧＡＬＲ２様レセプターがヒトＧＡＬＲ２に少なくとも約８５％の相同性を 有していることを特徴とする請求項６に記載のＧＡＬＲ２様レセプターをコード する核酸。 １０．ＤＮＡであることを特徴とする請求項６に記載の核酸。 １１．請求項６に記載の核酸を含むベクター。 １２．請求項１１に記載の核酸を含む宿主細胞。 １３．化合物とヒトＧＡＬＲ２とを接触させること、および結合が生じるか否か を判定することを含む、化合物がヒトＧＡＬＲ２のリガンドであるか否かを判定 する方法。 １４．（ａ）ヒトレセプターＧＡＬＲ２を発現する細胞を化合物の存在下で培養 すること、および （ｂ）ＧＡＬＲ２のレセプター活性または第二メッセンジャー活性を測定するこ とを含む、ヒトＧＡＬＲ２のレセプター活性を変調させる化合物を同定する方法 。 １５．ヒトＧＡＬＲ２を発現するように細胞を形質転換させることを特徴とする 請求項１４に記載の方法。