JP2001505765A

JP2001505765A - Variants of tissue-type plasminogen activator (t-PA): compositions and methods of use

Info

Publication number: JP2001505765A
Application number: JP52266198A
Authority: JP
Inventors: エル．マディスン、エドウィン
Original assignee: ザスクリプスリサーチインスティテュート
Priority date: 1996-11-12
Filing date: 1997-11-12
Publication date: 2001-05-08
Also published as: CA2271697A1; AU735519B2; WO1998021320A2; EP0950095A2; CN1244894A; AU5585098A; CA2271697C; WO1998021320A3

Abstract

(57)【要約】組織プラスミノーゲン因子の変異体は、有意に強いフィブリン刺激、フィブリン補因子（コファクター）間の劇的に高い識別力、ＰＡＩ‐１による阻害に対しての著明な抵抗性、ならびに実質的に高いチモーゲン性、すなわち酵素の治療的有用性を高める特性の組合せを示す。 (57) [Summary] Mutants of tissue plasminogen factor show significantly stronger fibrin stimulation, dramatically higher discrimination between fibrin cofactors (cofactors), marked resistance to inhibition by PAI-1 and substantial Exhibit a high zymogenicity, a combination of properties that enhances the therapeutic utility of the enzyme.

Description

【発明の詳細な説明】組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）の変異体：組成物およびその使用方法関連出願の参照本出願は、参照してここに組み込まれる１９９６年１１月１２日出願の米国仮出願連続番号第６０／０３０，６５５号に基づくものである。政府の権利本発明は、合衆国政府、国立衛生研究所からの援助、補助金ＨＬ５２４７５およびＨＬ３１９５０を得て為されたものであり、合衆国政府は本発明に何らかの権利を有する。本発明は、ｔ−ＰＡとも称される組織型プラスミノーゲンアクチベーターのタンパク質一本鎖変異体ならびにそのような組織型プラスミノーゲンアクチベーターのタンパク質一本鎖変異体をコードする核酸を含む。ｔ−ＰＡタンパク質変異体は、野生型一本鎖ｔ−ＰＡ形態よりも高いチモーゲン性（zymogenicity）を持つ。ｔ−ＰＡ変異体組成物を作製し、使用する方法についても述べる。発明の背景組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）は、プラスミノーゲンをタンパク質分解酵素であるプラスミンへ活性化することにより、フィブリン溶解の過程、すなわち血餅の溶解において重要な役割を果たすセリンプロテアーゼである。ｔ−ＰＡは、基礎となるＤＮＡ配列および演鐸アミノ酸配列によって十分に同定され、特性付けられてきた。Ｐｅｎｎｉｃａら、Ｎａｔｕｒｅ，３０１：２１４（１９８３）および１９８９年８月１日発行の米国特許第４，８５３，３３０号参照。これらの教示するところは参照してここに組み込まれる。ヒトｔ−ＰＡのヌクレオチド配列および演鐸したアミノ酸の一次配列を図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃに示す。成熟ｔ−ＰＡ配列のすぐ前の−３５から−１までのアミノ酸残基群は「プロ」配列である。成熟ｔ−ＰＡ分子（アミノ酸残基１−５２７）は、トリプシン、キモトリプシン、プラスミノーゲン、プロトロンビン、フィブロネタチン、および上皮増殖因子（ＥＧＦ）のような様々な他のタンパク質において同定された、相同なあるいはさもなければ同様の構造を参照して定義された５つの領域（ドメイン）を含む。これらの領域は、成熟ｔ−ＰＡのアミノ酸配列のＮ末端から始まって、１）アミノ酸残基１から約４４までを含むものとして様々に定義されるフィンガー領域（Ｆ）、２）およそアミノ酸残基４５から９１まで伸びる（ＥＧＦとの相同性基づく）、様々に定義される成長因子領域（Ｇ）、３）およそアミノ酸残基９２から約アミノ酸残基１７３まで伸びると定義されているクリングル１（Ｋ１）、４）およそアミノ酸残基１８０から約アミノ酸残基２６１まで伸びると定義されているクリングル２（Ｋ２）、ならびに、５）一般に約アミノ酸残基２６４からアミノ酸残基５２７の分子のＣ末端まで伸びると定義されている、いわゆるセリンプロテアーゼ領域（Ｐ）、と称される。概して互いに隣接して位置するか、もしくは短い「リンカー」領域によって分けられたこれらの領域は、成熟形態のｔ−ＰＡの１から５２７までのアミノ酸残基のアミノ酸配列全体を示す。各々の領域は、何らかの生物学的に重要な特異的特性に寄与するとして様々に記述されてきた。フィンガー領域は、少なくともフィブリンへの高い結合親和力のために少なからぬ重要性を持つ配列を含むものとして特性付けられてきた。（この活性は、フィブリンに富む血栓の座で血餅溶解に関してｔ−ＰＡが発揮する高い特異性のために重要であると考えられる。）成長因子様領域はまた、細胞表面結合活性にも関連づけられてきた。クリングル２領域も、フィブリン結合およびフィブリンがｔ−ＰＡの活性を刺激する能力に強く結びつけられてきた。セリンプロテアーゼは、プラスミンを生じるプラスミノーゲンの酵素的開裂の責任を担う。ｔ−ＰＡは、その前駆体の酵素活性のレベルに関してプロテアーゼの中では並はずれている。一般にプロテアーゼは、チモーゲン（酵素原）、すなわち実質的な触媒活性を発現するためにはタンパク質分解酵素で処理されるかあるいは特異的補因子に結合しなければならない不活性前駆体として合成される。チモーゲン活性化後の触媒効率の上昇すなわちチモーゲン性の上昇は、キモトリプシン族の個々の成員間では大きな変動があるが、ほとんどすべての場合に劇的である。たとえば、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、あるいはプラスミノーゲンのような強力なチモーゲン、すなわち高いチモーゲン性を持つものは、ほぼ完全に不活性であり、チモーゲン性は１０⁴ から１０⁶と測定される（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｎ．Ｃ．，Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｈ．およびＷａｌｓｈ，Ｋ．Ａ．（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１２，４２０‐４２６；Ｇｅｒｔｌｅｒ，Ａ．，Ｗａｌｓｈ，Ｋ．Ａ．およびＮｅｕｒａｔｈ，Ｈ．（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３，１３０２‐１３１０）。他のセリンプロテアーゼは中間的なチモーゲン性を示す。たとえば、第ＸII ａ因子の酵素活性はその対応するチモーゲン、第ＸII因子の活性より４０００倍高く（Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇ，Ｍ．とＫａｐｌａｎ，Ａ．Ｐ．（１９８２）Ｂｌｏｏｄ６０，６４）、ウロキナーゼの触媒効率はプロウロキナーゼよりも２５０倍高い（Ｌｉｊｎｅｎ，Ｈ．Ｒ．，ＶａｎＨｏｅｆ，Ｂ．，Ｎｅｌｌｅｓ，Ｌ．およびＣｏｌｌｅｎ，Ｄ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，５２３２‐５２３６）。これに対し、一本鎖および二本鎖ｔ−ＰＡの触媒活性は５‐１０の率でしか変化しない。一本鎖前駆体形態に対する成熟開裂した二本鎖酵素の活性の比率として表わされるチモーゲン性は、ほとんどあるいは全く触媒活性を持たない他のプロテアーゼの他の前駆体と異なって、野生型ｔ−ＰＡについて５ ‐１０にすぎない。従って、野生型ｔ−ＰＡの一本鎖形態は本当のチモーゲンではない。遺伝子工学によってｔ−ＰＡの有用性を改善するために多くの試みが為されてきた。これらの努力は部分的にしか成功していない。Ｋｒａｕｓｅ，Ｊ．＆Ｔａｎｓｗｅｌｌ，Ｐ．Ａｒｚｎｅｉｍ．‐Ｆｏｒｓｃｈ．３９：６３２‐６３７（１９８９）によって、また米国特許第５，６１６，４８６号において技術水準が検討されており、これらの教示するところは参照してここに組み込まれる。血餅溶解剤としての天然ｔ−ＰＡが関連する重要な利点にもかかわらず、かかる天然タンパク質が必ずしもすべての状況下で至適ｔ−ＰＡ剤であるとは考えられない。それ故、ｔ−ＰＡの特異的な特性を高めるためにいくつかの変異体が提案あるいは案出されてきた。それらの変異体の一部は、半減期がより長いあるいはクリアランス速度がより緩慢な物質が好ましい状況、たとえば深静脈血栓症の治療と梗塞患者のその後の再潅流において、または一本鎖物質が好ましい状況において、天然ｔ−ＰＡの使用に関連した不都合を対象としている。たとえば、フィンガー領域の全部あるいは実質的な部分の除去は、フィブリン結合特性が実質的に低下し、その代わりに、生じる物質の全体的なクリアランス率が低下している分子を生じる ―１９８９年１月１２日公開のＷＯ８９／００１９７号参照。２７５、２７６および２７７位のタンパク質分解性開裂部位にアミノ酸置換を持つ変異体がＥＰＯ特許願公開番号１９９，５７４号に述べられている。２７５位にアルギニン以外のアミノ酸を持つｔ−ＰＡ変異体として優先的に特性付けられるこれらの変異体は、一本鎖あるいは二本鎖形態のいずれかで存在しうる天然ｔ−ＰＡと異なり、２７５位のプロテアーゼ開裂に対して耐性であり、それ故インビボで代謝的に二本鎖形態に変換されない、プロテアーゼ耐性一本鎖ｔ−ＰＡ変異体と称される。この形態は、フィブリン結合およびフィブリン刺激が二本鎖ｔ−ＰＡに比べて高められていながら、より安定であるという点で生物学的および商業的にある種の利点を持つと考えられる。さらに、プラスミノーゲンアクチベーターは、フィブリンと相互作用することができる一つの領域とウロキナーゼのプロテアーゼ領域とを含むことが記述されており、一つの実施態様は二本鎖ウロキナーゼを形成しにくいように変性されたウロキナーゼである。１９８８年７月１４日公開のＷＯ８８／０５０８１号参照。ｔ−ＰＡのプロテアーゼ開裂部位の一次変異に関するさらなる特許文献については、たとえばＥＰＯ特許番号２４１，２０９号；１９８６年１１月１２日公開のＥＰ２０１，１５３号；１９８７年８月１９日公開のＥＰ２３３，０１３号；１９８８年１１月２３日公開のＥＰ２９２，００９号；１９８８年１２月７日公開のＥＰ２９３，９３６号；および１９８８年１２月７日公開のＥＰ２９３，９３４号；ならびにＷＯ８８／１０１１９号参照。１１７‐１１９、１８４‐１８６および４４８‐４５０位のグリコシル化突然変異体は、炭水化物のモルパーセントが低下すると共により高い比活性を示した。１９８７年７月１日公開のＥＰＯ公開番号２２７，４６２号参照。本特許出願はさらに、フィブリン／フィブリン分解産物のアッセイの使用を開示し、また２７２‐２８０位でｔ−ＰＡ分子を修飾しうること、あるいはＣ末端から２５個までのアミノ酸を除去しうることを教示する。さらに、Ｎ−グリコシル化部位がＤＮＡ修飾によって選択的に除去されているが、残りのＯ−結合炭水化物を含む、Ａｓｎ１１９、Ａｌａ１８６およびＡｓｎ４５０を持つｔ−ＰＡ突然変異体は、インビトロでの溶解アッセイにおいて、メラノーマｔ−ＰＡよりも約２倍の効力を示すことが認められた。１９８７年６月１０日公開のＥＰＯ公開番号２２５，２８６号参照。ｔ‐ＰＡの４４９位のアミノ酸をアルギニン以外のアミノ酸で置換してグリコシル化部位を修飾すること、ならびにＡｒｇ２７５の修飾あるいは−３から９１までの領域の欠失も教示されている。１９８７年８月１３日公開のＷＯ８７／０４７２２号参照。ｔ−ＰＡの４４８位のアミノ酸置換が、グリコシル化を除去するために望ましいものとして開示されている。１９８８年１２月２８日公開のＥＰＯ公開番号２９７，０６６号参照。４４８‐４５０位の修飾とＮ末端１‐８２個のアミノ酸の欠失の組合せが、１９８９年１月１２日公開のＷＯ８９／００１９１号に開示されている。さらに、ウロキナーゼは、グリコシル化を防ぐためにＡｓｐ３０２‐Ｓｅｒ３０３‐Ｔｈｒ３０４の領域で修飾されている。１９８９年１月１８日公開のＥＰＯ公開番号第２９９，７０６号参照。しかし、グリコシル化部位の変更、特にアミノ酸１１７における変更は、常に、付加的に変化した循環中の半減期パターンおよび／あるいはフィブリン結合特性をもたらす可能性のある、影響を受けた溶解特性を持つ分子を生じると思われる。１９８７年９月２３日公開のＥＰＯ特許公開番号２３８，３０４号参照。ｔ−ＰＡの成長因子領域が欠失しているときには、Ａ．Ｊ．ｖａｎＺｏｎｎｅｖｅｌｄら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．５４（１）：４（１９８５）が報告しているように、得られる変異体はまだ活性を有し、フィブリンに結合する。成長因子領域の様々な欠失も特許文献中で報告されている。ＥＰＯ公開番号２４１，２０９号（５１‐８７の欠失）、ＥＰＯ公開番号２４１，２０８号（５１‐８７の欠失および５１‐１７３の欠失）、ＰＣＴ８７／０４７２２号（Ｎ末端１‐９１の一部あるいは全部の欠失）、ＥＰＯ公開番号２３１，６２４号（成長因子領域全部の欠失）、およびＥＰＯ公開番号２４２，８３６号、ならびに日本特許公開番号６２‐２６９６８８号（成長因子領域の一部あるいは全部の欠失）参照。さらに、ｔ−ＰＡは第一クリングル領域と成長因子領域の両方で修飾することができ、循環中の半減期の上昇をもたらすことも示されている。１９８７年１０月１４日公開のＥＰＯ特許公開番号２４１，２０８号参照。アミノ酸５１から８７までの両端を含む領域をｔ−ＰＡから欠失させて、血漿からのクリアランスがより緩徐な変異体を生じることができる。Ｂｒｏｗｎｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５９９‐１６０２（１９８８）。また、特定のアミノ酸残基の欠失によってあるいは１個またはそれ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することによって、好ましくない生物学的影響を伴わずに、成熟天然ｔ−ＰＡのアミノ酸６７‐６９の領域においてｔ−ＰＡを修飾することもできる。１９８７年１０月７日公開のＥＰＯ特許公開番号２４０，３３４号参照。アミノ酸２７３‐５２７を含むｔ−ＰＡの領域を用いたｔ−ＰＡ／ウロキナーゼのハイブリッドも開示されている。１９８８年１１月９日公開のＥＰＯ２９０，１１８号参照。２９６‐３０２欠失ｔ−ＰＡ（del294-302 t-PA）、Ｒ３０４Ｓｔ‐ＰＡ、およびＲ３０４Ｅｔ− ＰＡを含めて、プロテアーゼ領域に変化を有するヒトｔ−ＰＡのセルピン耐性突然変異体がＭａｄｉｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３９：７２１−７２４（１９８９）に開示されている。上記のリストは記述されている数多くのｔ−ＰＡ変異体の網羅的は検討ではない。標的部位における有効な血餅溶解にもかかわらず、前駆体ｔ−ＰＡの触媒活性の結果として、望ましくないタンパク質分解が全身的に起こり、循環中のフィブリノーゲン、α２‐抗プラスミンおよびプラスミノーゲンの有害な枯渇を生じる。必要とされるのは、全身的なタンパク質分解作用が低減されていながら有効な局所的血餅溶解を提供する、よりチモーゲン性の高いｔ−ＰＡ変異体タンパク質である。発明の要約本発明は、野生型ヒトｔ−ＰＡと比較して、少なくとも２個の塩基性残基が中性あるいは酸性アミノ酸残基で置換されている一本鎖変異体ｔ−ＰＡタンパク質、ならびにそのような一本鎖変異体ｔ−ＰＡタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の一本鎖変異体ｔ−ＰＡタンパク質は、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、チロシン、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸から成る群から選択されるアミノ酸残基によって置換されたＲ２７５アミノ酸残基を持つ。好ましくは、本発明の一本鎖変異体ｔ−ＰＡタンパク質は、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基から成る群から選択されるアミノ酸残基によって、最も好ましくはグルタミン酸残基によって置換されたＲ２７５アミノ酸残基を持つ。本発明の一本鎖変異体ｔ−ＰＡタンパク質は付加的に、アスパラギン酸４７７とリシン４２９の間の、野生型一本鎖ｔ−ＰＡにおいて通常認められる塩架橋相互作用を分断するように、セリンプロテアーゼ領域内に非塩基性アミノ酸によって置換された少なくとも１個の他の塩基性アミノ酸残基を持つ。好ましくは、塩基性アミノ酸が極性あるいは酸性アミノ酸で置換されており、より好ましくは、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、チロシン、グルタミン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から成る群から選択されるアミノ酸残基で置換されている。アスパラギン酸４７７とリシン４２９の間の塩架橋相互作用は、４７７位あるいは４２９位の置換によって、あるいはアスパラギン酸４７７およびリシン４２９の少なくとも１つについて代替塩架橋相互作用パートナーを提供するセリンプロテアーゼ領域内の位置での適当な置換によって分断することができる。一つの好ましい実施態様では、Ｈ４１７アミノ酸残基が、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、チロシン、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸から成る群から選択されるアミノ酸残基によって置換されている。より好ましくは、本発明の一本鎖変異体ｔ−ＰＡタンパク質は、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基から成る群から選択されるアミノ酸残基によって置換されたＲ２７５アミノ酸残基とＨ４１７アミノ酸残基の両方を持つ。２つの好ましい例示的一本鎖変異体ｔ−ＰＡタンパク質は、Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７ＥおよびＲ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｄと称されるｔ−ＰＡ変異体である。他の好ましい実施態様では、Ｋ４２９アミノ酸残基が、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、チロシン、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸から成る群から選択されるアミノ酸残基によって置換されている。より好ましくは、本発明の一本鎖変異体ｔ−ＰＡタンパク質は、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、チロシン、グルタミン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から成る群から選択されるアミノ酸残基によって置換されたＲ２７５アミノ酸残基とＫ４２９アミノ酸残基の両方を持つ。１つの好ましい一本鎖変異体ｔ−ＰＡタンパク質は、Ｒ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙと称されるｔ−ＰＡ変異体である。本発明の一本鎖変異体ｔ−ＰＡタンパク質は、野生型一本鎖ｔ−ＰＡタンパク質に比べて、一本鎖前駆体形態に対する成熟開裂した二本鎖酵素の活性の比として表されるより大きなチモーゲン性を示す。本発明の一本鎖変異体ｔ−ＰＡタンパク質は、少なくとも１０、好ましくは約５０から約２００のチモーゲン性を有する。本発明の一本鎖変異体ｔ−ＰＡタンパク質は、野生型一本鎖ｔ−ＰＡタンパク質に比べて、フィブリンの存在下と不在下とで触媒効率の比率として表わされる、より大きなフィブリン刺激係数を示す。本発明の一本鎖変異体ｔ−ＰＡタンパク質は、少なくとも７，０００、好ましくは約２０，０００から約５０，０００のフィブリン刺激係数を持つ。本発明の一本鎖変異体ｔ−ＰＡタンパク質は、野生型一本鎖ｔ−ＰＡタンパク質に比べて、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１型（ＰＡＩ−１）による阻害の低下を示す。本発明の一本鎖変異体ｔ−ＰＡタンパク質は、野生型一本鎖ｔ−ＰＡタンパク質に比べて、少なくとも５の係数、好ましくは少なくとも約９の係数、最も好ましくは少なくとも約２００の係数で、ＰＡＩ‐１による阻害を受けない。本発明の一本鎖変異体ｔ−ＰＡタンパク質は、野生型一本鎖ｔ−ＰＡタンパク質に比べて、フィブリノーゲンの存在下に対するフィブリンの存在下での触媒効率の比率として表わされる、より大きなフィブリン選択性係数を示す。本発明の一本鎖変異体ｔ−ＰＡタンパク質の好ましい実施態様は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００のフィブリン選択性係数を持つ。図面の簡単な説明図の中で、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、完全な長さのヒトｔ−ＰＡｃＤＮＡのヌクレオチド配列と演鐸したアミノ酸配列を示す；また図２は、緩衝剤（白い四角）、ＤＥＳＡＦＩＢ（白いダイアモンド形）、フィブリノーゲン（白い丸）、フィブリノーゲンの臭化シアン断片（白い三角）あるいは刺激ペプチドＰ３６８（縞陰を付けた四角）の存在下でのブラスミノーゲン活性化の標準的比色分析（chromogenic assay）の結果をグラフで表わしたものである。好ましい実施態様の詳細な説明本文中で使用するとき、「野生型ｔ−ＰＡ」はヒトにおいて天然に生じるｔ− ＰＡタンパク質をさす。このヒトｔ−ＰＡは図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示すアミノ酸配列によって例示されるが、野生型ｔ−ＰＡの語は、天然に生じる対立遺伝子変異体を包含すると理解されるべきである。ｔ−ＰＡ変異体組成物本発明のｔ−ＰＡ変異体ｃＤＮＡおよび対応する発現された組換えタンパク質は、本文中で述べるようにフィブリン溶解のセリンプロテアーゼ媒介の制御において機能する有用な化合物である。本発明のｔ−ＰＡ変異体ｃＤＮＡは、開裂不能の一本鎖ｔ−ＰＡ変異体、すなわち通常の条件下ではプラスミンによって開裂されない一本鎖ｔ−ＰＡ変異体をコードするｔ−ＰＡｃＤＮＡを生じる少なくとも１個のヌクレオチドの置換を含む。かかるヌクレオチドの置換は、開裂不能変異体を創製する役割を担うｔ−ＰＡ前駆体において、アミノ酸残基２７５（あるいはキモトリプシンナンバリングシステムを用いると１５位）のアルギニン（Ｒ）のグルタミン酸（Ｅ）による置換を生じる。キモトリプシンナンバリングシステムの１５、１４４、１５６および１９４位は、図１に示すようにｔ−ＰＡナンバリングシステムにおいて各々２７５、４１７、４２９および４７７位に相当する。置換突然変異体である当該変異体は、野生型ヒトｔ−ＰＡアミノ酸残基の１文字コードと、図１に示すような成熟ヒトｔ−ＰＡのアミノ末端に対する残基の位置と、そしてその後に成熟ヒトｔ−ＰＡにおけるアミノ酸残基を置換したアミノ酸残基の１文字コードとによって表わされる。２７５位におけるアルギニンのグルタミン酸による置換はＲ２７５Ｅと称される。開裂不能の一本鎖ｔ−ＰＡを創製する同等の置換は当該技術において既知である（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｌ．ら、（１９９０）ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｓ．５７：５２７−５３９）。Ｒ２７５Ｅ置換に加えて、本発明の変異体ｃＤＮＡはさらに、少なくとも２個のアミノ酸置換を持つｔ−ＰＡ変異体を創製するために別個の部位に少なくとも１個の他のヌクレオチド置換を含む。好ましいｃＤＮＡ変異体は、アミノ酸残基４１７位のヒスチジンの代わりに、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、チロシン、グルタミン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から成る群から選択されるアミノ酸残基のアミノ酸置換を生じる、少なくとも１個のヌクレオチド置換を含む。好ましい実施態様はＲ２７５Ｅ，Ｈ４１７ＤおよびＲ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｅと称される。さらなるｃＤＮＡ変異体は、アミノ酸残基４２９位のリシン（Ｋ）の代わりに、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、チロシン、グルタミン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から成る群から選択されるアミノ酸残基の置換を生じる、少なくとも１個のヌタレオチド置換を含む。一つのそのような好ましい実施態様はＲ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙと称される。本発明の変異体ｔ−ＰＡｃＤＮＡは、上述の組換え発現変異体ｔ−ＰＡを生成するのに有用である。別の実施態様では、変異体ｔ−ＰＡｃＤＮＡは、以下に記述するとおり遺伝子療法での治療用途を示す。本発明は、変異体ｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡが、以下に記述されるとおりの方法で使用するための組換え変異体ｔ−ＰＡの発現を提供するように機能的に結合されている、発現ベクターまたはプラスミドのような実施態様を包含する。１つの好ましい実施態様は、変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能的に結合したｐＳＶＴ７発現ベクターを含むＣＯＳ１細胞によって変異体ｔ−ＰＡタンパク質が発現される。構築されるべき、そして導入しうる発現ベクターが開示される。別の実施態様では、一過性的におよび安定にトランスフェクトされた細胞は、変異体ｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡを含有する。ここに記述される結果となる組換え発現ｔ−ＰＡは、１種またはそれ以上の以下の構造および機能特性を示すものとして特徴づけられる：１）ｔ−ＰＡ変異体は、ｔ−ＰＡ活性化酵素による切断を避けるＲ２７５Ｅアミノ酸置換またはその同等物を含有する非切断一本鎖タンパク質の形態である；２）ｔ−ＰＡ変異体は、セルピンプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、Ｉ型（ＰＡＩ−１）による阻害に対する耐性が増加していることを示す；３）ｔ−ＰＡ変異体は、フィブリンのようなコファクター（co-factor）の不在下で、プラスミノーゲンのような基質における触媒活性を減少させた；４）ｔ−ＰＡ変異体は、フィブリンによって刺激が増大されたことを示す；５）ｔ−ＰＡ変異体は、フィブリンのようなコファクターの存在下で、プラスミノーゲンのような基質に対する触媒活性を示す；および６）生じる特性の点で、得られたｔ−ＰＡ変異体は、幅広い全身性のタンパク質分解なしに局所的繊維素（フィブリン）溶解の機能に有効であり、それにより、野生型のヒト一本鎖ｔ−ＰＡ前駆体で見られるとおり、循環中のフィブリノーゲン、α２−抗プラスミンおよびプラスミノーゲンの消失をなくする。得られた好ましい組換え発現ｔ−ＰＡ変異体は、Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｄ、Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７ＥおよびＲ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙ、そしてそれらの保存的置換を包含する。一般に、保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの非極性（疎水性）残基を別のものに置換すること、１つの極性（疎水性）残基をアルギニンおよびリシンの間、グルタミンおよびアスパラギンの間、グリシンおよびセリンの間のような別のものに置換すること、リシン、アルギニンまたはヒスチジンのような１つの塩基性残基を別のものに置換すること、またはアスパラギン酸またはグルタミン酸のような１つの酸残基を別のものに置換することが挙げられる。アミノ酸のクラス分けの別の検討としては、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ａ．Ｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２版、ＷｏｒｔｈＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ニューヨーク、７１−９４頁、１９７５年参照。語句「保存的置換」は、このようなタンパク質が不可欠な結合活性を示す場合に、非誘導残基の代わりに化学的に誘導された残基を利用することが含まれる。「化学的に誘導体」は、官能性側鎖の基の反応によって化学的に誘導される１つまたはそれ以上の残基を有する目的のタンパク質に該当する。このような誘導分子としては、例えば遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾシキ基、ｔ− ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するような分子が挙げられる。遊離カルボキシル基が誘導体化されて、塩、メチルおよびエチルエステルまたは他の型のエステルまたはヒドラジンを形成しうる。遊離のヒドロキシル基が誘導体化されて、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成しうる。ヒスチジンのイミダゾール窒素が誘導体化されて、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成することができる。化学的誘導体として含まれるのは、２０種の標準のアミノ酸の１つまたはそれ以上の天然に生じるアミノ酸誘導体を含有するこれらのペプチドでもある。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンに置換でき；５−ヒドロキシリシンは、リシンに置換でき、３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンに置換でき；ホモセリンは、セリンに置換でき；そしてオルニチンは、リシンに置換できる。Ｄ−アミノ酸は、１つまたはそれ以上のＬ−アミノ酸の代わりに含まれてもよい。本発明の特定の場合には、塩基性アミノ酸、すなわちアルギニン、リシンおよびヒスチジンは、非塩基性アミノ酸に置換される。好ましくは塩基性アミノ酸は、極性または酸性アミノ酸、すなわち、グリシン、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン、グルタミン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から構成される基から選択されるアミノ酸残基で置換しうる。したがって、保存的置換は、本発明の目的のために、成熟野生型ヒトｔ− ＰＡで特定の塩基性アミノ酸を置換する非塩基性アミノ酸が、非塩基性アミノ酸の基から、好ましくはグリシン、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン、グルタミン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から構成される基から、そしてさらに好ましくは、チロシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から構成される基から選択でされること意味することと定義できる。例えば、ヒスチジン残基を置換するのにグルタミン酸の代わりにアスパラギン酸を使用するのが、保存的置換である。好ましい変異体は、実施例１に記述されるＲ２７５Ｅ．Ｈ４１７ＤおよびＲ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｅ、および実施例２に記述されるＲ２７５Ｈ，Ｋ４２９Ｙ変異体である。少なくとも２種のアミノ酸置換を有する発現組換えｔ−ＰＡ変異体、例えばＲ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｄ、Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７ＥおよびＲ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙは、さらに特徴的な特性を示す。Ｒ２７５ＥおよびＲ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｅは、フィブリノーゲンおよびフィブリンの両方によって活性化される一方、Ｒ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙは、フィブリンによって最初に活性化されるが、フィブリノーゲンに感受性でない。後者は、ＰＡＩ−１による阻害に対して、Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７ＤおよびＲ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｅより一層耐性がある。これらの特徴は、以下にさらに示されるとおり治療的血栓崩壊性組成物として化合物を投与する際にさらなる利点を供する。さらに、ここに記述されるｔ−ＰＡ変異体は、以下に記述されるとおり治療用途に有用である。ｔ−ＰＡ変異体組成物を製造および使用する方法製造の方法上述されるｔ−ＰＡ変異体ｃＤＮＡおよび組換え発現変異体タンパク質は、実施例１および２で記述されるとおり多くの方法論的態様において有用である。特に、単離ｃＤＮＡクローンは、本発明のコード化ｔ−ＰＡ変異体タンパク質を生成する発現ベクター系で有用である。したがって、発現ベクターを含む細胞を含めた、そこに機能的に結合されたｔ−ＰＡ変異体ｃＤＮＡを有する発現ベクター系が、本発明の組換え発現変異体タンパク質を生成することが予想される。診断用途好ましい診断の方法論的態様がここに記述される。特に、本発明の組換え発現ｔ−ＰＡ変異体は、改変された活性を示すフィブリンおよびフィブリン分解産物を検出する診断的アッセイに有用である。したがって、そのアッセイは、血栓症状で示される。ｔ−ＰＡ変異体に対する抗体を含むキットを含めた他の診断用途は、当業者によく知られている。治療用途本発明のｔ−ＰＡ変異体ｃＤＮＡは、急性および慢性症状の両方を含めた血栓性疾患を改善するのに使用する遺伝子治療用途に有用である。急性症状としては、中でも、熱射および脳卒中の両方が挙げられる一方で、慢性状況としては、動脈および深部血管の血栓症および再狭窄のものが挙げられる。したがって、好ましい治療用組成物としては、ウイスルのベクターデリバリー系または他のベクター基本の遺伝子発現デリバリー系の一部として存在するか、リポソームデリバリー系などに存在するそれ自身裸のＤＮＡとしてのｃＤＮＡ化合物が挙げられる。本発明の組換え発現ｔ−ＰＡ変異体タンパク質は、上で概説されるのと同じ症状を改善する血栓溶解性治療剤となることが意図される。上で記述される種々のｔ−ＰＡ変異体タンパク質の個々の構造上および機能上の特性に基づいて、特定のｔ−ＰＡ変異体の選択は、所望の治療結果によって決定される。例えば、外因性のヒトｔ−ＰＡのフィブリノーゲン媒介活性化は、交配によって活性化され、その後、広範な歓迎されない全身性応答を生じる。したがって、全身的なタンパク分解活性を同時に予防しながら、急性または慢性の血栓溶解性症状でのいずれかで局所的に血栓溶解工程に導くために、特に、フィブリノーゲンではなく、フィブリンによって最初に活性化されるｔ−ＰＡ変異体、特にＲ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙを使用する。血栓溶解療法剤として使用する組成物には、一般に製薬上適切な賦形剤中に生理学上有効な量のｔ−ＰＡ変異体を含む。投与の方法および治療されるべき症状によって、血栓溶解性治療剤を、単独または複数の用量で投与する。「ボーラス」用量を投与する場合、約０．０１から約０．６ｍｇ／ｋｇの用量、好ましくは約０．０５から約０．２ｍｇ／ｋｇの用量が、ｔ −ＰＡ血液濃度を約３μグラム／ｍｌに維持するために約０．１から約０．２ｍｇ／ｋｇの連続投与とともに、一般に投与される。当業者は、用量における変化は、治療されるべき症状によることが理解できるであろう。他の用途では、ゲル組成物中の変異体ｔ−ＰＡの組成物は、接着物の形成を防ぐときに有用である。本発明の他の変化および使用は、当業者には明らかである。実施例１Ｔ−ＰＡの変異体をコードする発現ベクターの部位指向性突然変異および構築体Ｋｕｎｋｅｌ（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２、４８８−４９２頁（１９８５年））により改変されるとおりのＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｉ．およびＳｍｉｔｈ，Ｍ．、ＤＮＡ３、４７９−４８８（１９８４年））の方法によって、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的突然変異を行った。突然変異を、予めバクテリオファージＭ１３ｍｐ１８でサブクローン化されたｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡの２９０ｂｐＳａｃＩ−ＳｍａＩ断片に導入した。突然変異プライマーは、以下のヌクレオチド配列を示した： H417D:5'-CTACGGCAAGGACGAGGCCTTTGT-3'(SEQ ID NO:8) H417E:5'-CATCGGCAAGGAGGAGGCCCTTGT-3'(SEQ ID NO:9) 突然変異に続いて、全２９０ｂｐＳａｃＩ−Ｓｍａｌ断片に対応するｓｓＤＮＡを、完全にシーケンシングして、所望の突然変異の存在およびあらゆる追加の突然変異が存在しないことを確認した。Ｈ４１７Ｄ突然変異の２９０ｂｐＳａｃＩ−ＳｍａＩ断片に対応する配列は、配列番号：５に示され、Ｈ４１７Ｅ突然変異に対応の配列は、配列番号：６に示される。適切なファージに対する複製形態（ＲＦ）のＤＮＡを調製し、そして突然変異された２９０ｂｐＳａｃＩ−ＳｍａＩ断片を、ＳａｃＩおよびＳｍａＩを用いたＲＦＤＮＡの消化、そしてアガロースゲル上の消化産物の電気泳動の後に回収した。単離した突然変異ＳａｃＩ− ＳｍａＩ断片を使用して、野生型ヒトｔ−ＰＡまたはｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅをコードする全長のｃＤＮＡで対応の断片を置換して、ｔ−ＰＡ／Ｈ４１７Ｄ；ｔ− ＰＡ／Ｈ４１７Ｅ；ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｄ（配列番号１）；およびｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｅ（配列番号２）をコードする新規な全長ｃＤＮＡを得た。ＣＯＳ細胞の遷移遺伝子導入による酵素の発現ｔ−ＰＡ；ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ；ｔ−ＰＡ／Ｈ４１７Ｄ；ｔ−ＰＡ／Ｈ４１７Ｅ；ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｄおよびｔ−ＰＡ／Ｒ２７５ＥをコードするｃＤＮＡを、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３３９、７２１ −７２４頁（１９８９年）；Ｂｉｒｄ，Ｐ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅ１ｌＢｉｏｌ．１０５：２９０５−２９１４頁（１９８７年）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３：４５９−４８１頁（１９８６年）によって記述され一過性発現ベクターｐＳＶＴ７にライゲートした。ｐＳＶＴ７の構造および用途、並びにメリーランド州、ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１番のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションへの、他のｐＳＶＴ７ｔ−ＰＡ構築物を包含する培養物の寄託について記述される米国特許第５，５５０，０４２号も参照。これを参照して本明細書に組込む。その後、ライゲートｃＤＮＡ挿入物を有するベクターを、バイオラッドのジーンパルサーを用いた電気穿孔によってＣＯＳ１細胞に導入した。２０μgのｃＤＮＡ、１００μｇの担体ＤＮＡおよびおよそ１０⁷のＣＯＳ細胞を含有するアリコートを、０．４ｃｍのキュベットに入れ、そして３２０Ｖ、９６０μＦＤ、およびΩ＝∞で電気穿孔を行った。電気穿孔に続いて、摂氏３７度で、１０％子牛血清および５ｍＭ酪酸ナトリウムを含有するＤＭＥＭ中で、細胞を一夜インキュベートした。その後、細胞を血清を含まない培地で洗浄し、そして摂氏３７度で４８時間、ＤＭＥＭでインキュベートした。血清不含培地を用いたインキュベーションの後、順化培地を収集した。ＥＬＩＳＡによって、アリコート中の収集した順化培地中の酵素濃度を測定した。間接色素原アッセイ（chromogenic assay）を用いたプラスミノーゲン活性化の速度論的分析ｔ−ＰＡの直接色素原アッセイは、基質ｌｙｓ−プラスミノーゲン（コネチカット州、グリーンウィッチのＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）およびスペクトロザイムＰＬ（Spectrozyme PL）（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を利用し、そして先に記述（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．、Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｊ．、Ｇｅｒａｒｄ，Ｒ．Ｄ．、Ｇｅｔｈｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．、およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｆ．、Ｎａｔｕｒｅ３３９、７２１−７２４（１９８９年）；Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．，Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｊ．，Ｇｅｒａｒｄ，Ｒ．Ｄ．、Ｇｅｔｈｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｆ．およびＢａｓｓｅｌ−Ｄｕｂｙ，Ｒ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７、３５３０−３５３３頁（１９９０年）；Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．，Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｊ．，Ｇｅｔｈｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｆ．およびＧｅｒａｒｄ，Ｒ．Ｄ．、ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６５、２１４２３−２１４２６頁（１９９０年））されたとおり行った。コファクターＤＥＳＡＦＩＢ（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）の存在および不存在の両方でアッセイを行った。ｌｙｓ−プラスミノーゲンの濃度は、ＤＥＳＡＦＩＢの存在下で０．０１２５−０．２μＭに、コファクターの不在下で０．９−１５μＭに変化させた。小型の合成基質を用いたｔ−ＰＡ活性の速度論的分析直接色素原アッセイは、基質のメチルスルホニル−Ｄ−シクロヘキシルチロシル−グリシル−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン（スペクトロザイムｔ−ＰＡ、ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を使用し、そして先に記述（Ｓｔｒａｎｄｂｅｒｇ，Ｌ．、およびＭａｄｉｓｏｎ，Ｆ．Ｌ．、Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７０、２３４４４−２３４４９頁（１９９５年）；Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｗ．、Ｔａｃｈｉａｓ，Ｋ．およびＭａｄｉｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、３０４８６−３０４９０頁（１９９５年））されるとおり行った。ＰＡＩ−１による阻害の二次反応速度定数の測定野生型のヒトｔ−ＰＡおよび変異体ｔ−ＰＡの阻害についての二次反応速度定数を、先に記述されるとおりの擬一次の条件下で測定した。簡潔には、酵素および阻害剤を、摂氏２３度で、０−３０分の間時間を変えて、プレインキュベートした。プレインキュベーションに続いて、混合液を希釈し、そして標準間接色素原アッセイで残存する酵素活性を測定した。おのおの酵素について、酵素および阻害剤の濃度、およびプレインキュベーションの時間を選択して、残存する酵素活性が、当初の活性の２０％および８０％の間で変化するいくつかのデータ点を得た。プレインキュベーション時間に対して（残存する活性／初期活性）の比の自然対数をプロットし、得られる勾配を測定することによって、データを分析した。−［Ｉ］によるこの勾配の逆数（division）により、示されるような二次反応速度定数を得た。ｔ−ＰＡのヒスチジン４１７を酸性残基に置換することで、一本鎖ｔ−ＰＡの触媒活性を選択的に抑制することが分かった。ヒスチジン４１７を、アスパルテートまたはグルタメート残基のいずれかに置換して、２つの変異体ｔ−ＰＡ／Ｈ４１７Ｄおよびｔ−ＰＡ／Ｈ４１７Ｅを得た。しかし、このアッセイで生じたプラスミンが、Ｒ２７５−１２７６ペプチド結合を切断することによって、一本鎖酵素をそれらの成熟した２本鎖形態に迅速に変換するので、これら２つの変異体の一本鎖形態のプラスミノーゲンに対する酵素活性の正確な測定は、困難であることが立証された。結果的に、この技術的困難さを克服するために、我々は、付加突然変異Ｒ２７５Ｅを、現存の突然変異体に導入することによって、切断できない形態の２つの変異酵素を構築もした。野生型ヒトｔ−ＰＡ、ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ、および位置４１７に突然変異を含む４つの変異体の全ては、ＣＯＳ−１細胞の遷移発現によって発現される。この手段は、一本鎖酵素を予め優先的に生じるので、酵素標品をプラスミン−セファロース（Ｓｔｒａｎｄｂｅｒｇ，Ｌ．およびＭａｄｉｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２３４４４−２３４４９頁（１９９５年））で処理することによって、二本鎖ｔ−ＰＡが生成される。酵素がそれらの成熟した二本鎖形態に定量的に変換されることは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。予測されるとおり、突然変異Ｒ２７５Ｅを含む変異体を合成し、そしてもっぱら一本鎖酵素として分泌させ、そしてプラスミン−セファロースによって切断されなかった。一本鎖または二本鎖形態の野生型ヒトｔ−ＰＡおよび小さな合成基質に対するおのおのの変異体の酵素活性は、以下の表Ｉに列記される。ヒスチジン４１７の突然変異は、二本鎖酵素の活性における非常に最適な効果のみを示した。二本鎖ｔ−ＰＡ／Ｈ４１７Ｄおよびｔ−ＰＡ／Ｈ４１７Ｅは、このアッセイで二本鎖の野生型ヒトｔ−ＰＡ酵素の活性の、それぞれ、６７％または８０％を示した。しかし、Ｈ４１７ＤおよびＨ４１７Ｅ突然変異体は、一本鎖酵素の活性にさらに目立った効果を示した。一本鎖ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅに比べて、一本鎖ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｄ（配列番号１）およびｔ−ｐＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｅ（配列番号２）は、一本鎖ｔ−ｐＡ／Ｒ２７５Ｅの活性それぞれの約１６％または２５％を示した。表１一本および二本鎖ｔ−ＰＡ変異体による色素原基質、スペクトロザイムｔ−ＰＡの切断についての速度論的定数分析された変異体の全ては、コファクターであるフィブリン（下の表ＩＩ）の存在下で、自然の基質、プラスミノーゲンに対する酵素活性を高く維持した。野生型ヒトｔ−ＰＡ、ｔ−ＰＡ／Ｈ４１７Ｄ、およびｔ−ＰＡ／Ｈ４１７Ｅの二本鎖形態の触媒活性は、わずか１．４の係数によって変化した。同様に、一本鎖ｔ −ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ、ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｄ、およびｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ、Ｈ４１７Ｅの活性は、１．８より低い因子まで異なった。表II フィブリンの存在下での一本および二本鎖ｔ−ＰＡ変異体によるプラスミノーゲンの活性化についての速度論的定数コファクターの不在下で、部位４１７での突然変異は、プラスミノーゲンに対する二本鎖ｔ−ＰＡの活性にほとんど影響を示さなかったが、しかし、これらの突然変異は、一本鎖ｔ−ＰＡの触媒効率を際立って減少させた（下の表III）。一本鎖ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅのものに比べて、それぞれ、およそ１４または６の因子まで、ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｄおよびｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｅの活性を減少させた。このアッセイで、「チモーゲン性」あるいは二本鎖および一本鎖形態の特定の酵素の活性の比率は、野生型ｔ−ＰＡについておよそ９であった。反対に、Ｈ４１７ＤまたはＨ４１７Ｅ突然変異を含有する変異体については、この比率は、それぞれ、およそ１５０または５０まで増加した（表III）。表III コファクターの不在下での一本および二本鎖ｔ−ＰＡ変異体によるプラスミノーゲンの活性化についての速度論的定数２種のタンパク質の間の複数の点の接点をほとんど確実に含む複雑な過程てある、フィブリンによるｔ−ＰＡの刺激の分子部分は、不明瞭さを残す。二本鎖ｔ −ＰＡのフィブリン刺激が、単一の機構を通して生じうる一方、しかし、フィブリンのコファクターによる一本鎖ｔ−ＰＡの刺激は、少なくとも２つの際立った機構を活用するようにみえる。最初に、フィブリンは、鋳型機構によって一本鎖および二本鎖ｔ−ＰＡの両方を明らかに刺激し、それにより酵素および基質の局所濃度を非常に増大する三重複合体の形成を生じる。第二に、一本鎖および二本鎖ｔ−Ｐは、フィブリンの不在ではなくて存在下で同等の活性を示すので、フィブリンに対する結合は、一本鎖ｔ−ＰＡの活性ドメインでコンフォメーションの変化を誘導するように見える。ストレプトキナーゼに対する結合におけるプラスミノーゲンの同様の活性化、並びにスタフィロコアギュラーゼに対する結合によるプロトロンビンの活性化は、先に記述された。セリンプロテアーゼチモーゲンのこの古典的でない非タンパク質分解活性の機構は、完全に不明確さを残すが、一本鎖ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｄおよびｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｅの作用は、Ｈｉｓ４１７が、この過程での基礎的役割を果たさないことを示す。さらに、二本鎖ｔ−ＰＡ／Ｈ４１７Ｄおよびｔ−ＰＡ／Ｈ４１７Ｅの特性は、Ｈｉｓ４１７が、典型的なタンパク質分解機構を通したｔ−ＰＡのチモーゲン活性化の間に基礎的役割を果たさないことを示す。Ｈ４１７ＤおよびＨ４１７Ｅ突然変異の一次的効果は、フィブリンの不在下での一本鎖ｔ−ＰＡの活性の選択的減少、そして結果的に、酵素のチモーゲン性での増加であった。分子レベルでは、一本鎖ｔ−ＰＡのほとんど活発でない新たなコンフォメーションを安定することによるか、または活性の低いコンフォメーションに対して際立った活性を示す１つまたはそれ以上の現存するコンフォメーションの間の平衡を切替えることによってこの効果は仲介された。単独の仮説にとらわれることなく、トリプシノーゲン、トリプシン、キモトリプシノーゲンおよびキモトリプシンの構造研究に基づいて、活性ドメインの複数のコンフォメーションの中での平衡の存在が、キノトリプシノーゲンのファミリーのチモーゲンの一般的特徴であるようである。Ｌｙｓ４２９についての選択的静電気相互作用を提供することによって、Ｈｉｓ４１７を酸性残基に変換することによって生じる効果は、Ａｓｐ４７７およびＬｙｓ４２９の間の重要な塩架橋を中断することによって仲介されると考えられる。この相互作用の段差および形状は、この研究での単位細胞の２つの構成員である程度変化するが、二本鎖ｕ−ＰＡのプロテアーゼドメインの最近報告された構造でのＫ４２９とＥ４１７との間の静電気相互作用の観察は、この仮説に対する信頼を導く。さらに、Ｌｙｓ４２９は、二本鎖酵素でのＡｓｐ４７７と相互に作用しないので、この研究で観察されるとおり、Ｌｙｓ４２９およびＡｓｐ／Ｇｌｕ４１７の間の新規塩架橋の形成は、一本鎖ｔ−ＰＡの活性を選択に抑制することが予測された。代わりに、二本鎖ｔ−ＰＡでは、他の成熟キモトリプシン様酵素でと同様に、成熟アミノ末端が、活性ポケットに挿入し、そしてこの役割を果たす。結局、観察された二本鎖ｔ−ＰＡ／Ｈ４１７Ｄおよびｔ−ＰＡ／Ｈ４１７Ｅは、高い触媒活性を維持することが予測される。したがって、酸性残基を位置４１７に含むｔ−ＰＡの変異体は、チモーゲン性が際立って増大していることを示す。表IV ｔ−ＰＡの変異体についての触媒有効性におけるフィブリンの刺激効果この研究で試験した一本鎖形態の突然変異酵素によって示されたフィブリン刺激の範囲は、野生型ｔ−ＰＡによって示されるものより際立って大きい。野生型の二本鎖ｔ−ＰＡは、フィブリンの存在または不在下で、およそ４６０の触媒有効性の比率として規定されるフィブリン刺激因子を所有する（上の表ＩＶ）。二本鎖変異体は、２９０（ｔ−ＰＡ／Ｈ４１７Ｄ）および４１０（ｔ−ＰＡ／Ｈ４１７Ｅ）の同様の刺激因子を示す。６３００のフィブリン剌激因予を示す一本鎖野生型ｔ−ＰＡは、鋳型機構を通してのみならず、非タンパク質溶解性チモーゲン活性化を導入することによって一本鎖酵素を刺激するフィブリンの能力におそらく影響を及ぼしながら、二本鎖酵素より実質的に高い程度まで刺激した。Ｈ４１７ＤまたはＨ４１７Ｅ突然変異によって、一本鎖ｔ−ＰＡの刺激を、さらに増大させた。一本鎖ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｄおよびｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｅについてのフィブリン刺激因子は、それぞれ４８，２００および２５，４００である（上の表IV）。変異体のフィブリン刺激が増大すると、フィブリンの存在下での増加活性から生じなかったが、むしろ刺激剤の不在下での減少した活性から生じ、観察は、これらの突然変異の効果が、Ｌｙｓ４２９およびＡｓｐ４７７の間の塩架橋の中断によって仲介されるという考えと密接に結びつく。一本鎖形態のｔ−ＰＡのチモーゲン様変異体は、基質に対して（上の表ＩおよびIII）のみならず、特異的阻害剤に対して活性が減少していることを示すと予測される。これを例示するために、我々は、セルピン・プラスミノーゲン活性化阻害剤１型（ＰＡＩ−１）によって、一本鎖ｔ−ｐＡ／Ｒ２７５Ｅ、ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｄおよびｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｅの阻害についての二桁の速度定数を測定した（下の表Ｖ）。予測されるとおり、位置４１７に突然変異を含む両方の変異体は、ＰＡＩ−１による阻害に対する耐性を示した。ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅに比較して、それぞれ、ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｄまたはｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７ＥのＰＡＩ− １による阻害についての二桁の速度定数を、およそ１２または９の因子まで減少させた。表ＶＰＡＩ−１によるｔ−ＰＡの野生型および変異体の阻害ｔ−ＰＡは、一本鎖酵素として通常に高い触媒活性を、そして結果的に非常に低いチモーゲン性を示す。反対に、密接に関連した酵素ウロキナーゼ（ｕ−ＰＡ）は、一本鎖酵素として、いっそう低い触媒活性、そして実質的に高いチモーゲン性を示す。この研究の重要な知見は、位置４１７および４２９での残基の間の好ましい静電気的相互作用の存在または不在が、２つのヒトプラスミノーゲン活性化剤の間のこの主要な機能的差異の主要な決定基であるように見えることである。野生型ｔ−ＰＡ、ｕ−ＰＡ、および位置４１７にアスパルテートを含有するｔ−ＰＡのチモーゲン性は、それぞれ、およそ９、２５０および１５０である。これらの研究は、ｔ−ＰＡの活性化ドメイン内の構造／機能の関係を例示し、そしてｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡの間の重要な機能的差異の分子概念を明らかにした。これらの結果は、改善された血栓溶解剤の設計の助けにもなる。例えば、ｔ −ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｈ４１７Ｄは、実質的に増大したフィブリン刺激、ＰＡＩ −１による阻害に対する耐性、および非常に増大したチモーゲン性、酵素の治療利用性を増強する特性の有用な組合せを示す。実施例２Ｔ−ＰＡの変異体をコードする発現ベクターの部位指向性突然変異および構築実施例１で記述されるとおり、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的突然変異を行った。バクテリオファージＭ１３ｍｐ１８に予め遺伝子導入されたｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡの２９０ｂｐのＳａｃＩ−Ｓｍａｌ断片にＫ４２９Ｙ突然変異を導入した。突然変異プライマーは、以下のヌクレオチド配列を示した。 5'-CGGAGCGGCTGTATGAGGCTCATGT-3'(SEQ ID NO:10) 突然変異に続いて、全２９ｂｐのＳａｃＩ−Ｓｍａｌ断片に対応するｓｓＤＮＡを十分にシーケンシングして、所望の突然変異の存在およびあらゆる付加突然変異がないことを確認した。Ｋ４２９Ｙの２９０ｂｐのＳａｃＩ−Ｓｍａｌ断片に対応する配列は、配列番号：７で示される。適切なファージについて、複製形態（ＲＦ）ＤＮＡを製造し、そしてＳａｃＩおよびＳｍａｌを用いたＲＦＤＮＡの消化の後に、突然変異した２９０ｂｐのＳａｃＩ−Ｓｍａｌ断片を回収し、そしてアガロースゲル上の消化産物を電気穿孔にかけた。単離された、突然変異ＳａｃＩ−Ｓｍａｌ断片を使用して、対応の断片を、野生型のｔ−ＰＡまたはｔ −ＰＡ／Ｒ２７５Ｅをコードする全長のｃＤＮＡに置換して、ｔ−ＰＡ／Ｋ４２９Ｙおよびｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙをコードする新規な全長のｃＤＮＡを得た。ＣＯＳ細胞の遷移形質導入による酵素の発現ｔ−ＰＡ、ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ、ｔ−ＰＡ／Ｋ４２９Ｙおよびｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｋ４２９ＹをコードするｃＤＮＡを、遷移発現ベクターｐＳＶＴ７にライゲートし、そしてその後、実施例１に記述されるとおり、バイオラッドのジーン・パルスを用い、電気穿孔によってＣＯＳ細胞に導入した。電気穿孔に続いて、摂氏３７度で、１０％子牛血清および５ｍＭ酪酸ナトリウムを含有するＤＭＥＭ中で、細胞を一夜インキュベートした。その後、細胞を血清不含培地で洗浄し、そして摂氏３７度で４８時間、ＤＭＥＭでインキュベートした。血清不含培地を用いたインキュベーションの後、順化培地を収集し、そしてＥＬＩＳＡによって、順化培地中の酵素濃度を測定した。野生型およびｔ−ＰＡの突然変異された変異体の精製ＦＰＬＣシステムおよび１ｍｌのＨｉＴｒａｐキレートカラム（ＰａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｔｅｃｈ）を使用して、ｔ−ＰＡの野生型および突然変異された変異体を精製した。カラムに、０．１ＭのＣｕＳＯ₄溶液を負荷し、５−１０ｍｌの蒸留水で洗浄し、そして出発緩衝液（０．０２ＭＮａＨＰＯ₄、ｐＨ７．２、１ＭＮａＣｌおよび１Ｍイミダゾール）で平衡化した。ｔ−ＰＡの野生型または変異体を含有する順化培地を１ＭＮａＣｌに調整し、そして５０ｍｌスーパループ付きのカラム（ＰａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）に注入した。その後、カラムを１０カラム容積の出発緩衝液で洗浄し、そして同じ緩衝液中のイミダゾールの０−０．３２Ｍのリニアー勾配を用いて溶出させた。ピークの画分を収集し、そして貯蔵した。精製したｔ−ＰＡサンプルを、濃縮させ、そして緩衝液を、セントリプラス３０濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ）を使用しながら、２５ｍＭトリス（ｐＨ＝７．５）、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡに交換した。小型の合成基質を用いたｔ−ＰＡ活性の動的分析直接色素原アッセイは、基質メチルスルホニル−Ｄ−シクロヘキシルチロシル −グリシル−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン（スペクトロザイムｔ−ＰＡ、ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を使用し、そして実施例１に記述したとおり行った。間接的色素原アッセイを用いたプラスミノーゲン活性化の速度論的分析ｔ−ＰＡの間接的色素原アッセイは、基質ｌｙｓ−プラスミノーゲン（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）およびスペクトロザイムＰＬ（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を使用し、そして先に実施例１に記述したとおり行った。コファクターＤＥＳＡＦＩＢ（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）の存在下および不在下の両方で、アッセイを行った。種々のフィブリンコファクターの存在下での間接的色素原アッセイ標準の間接的色素原アッセイを行った。簡便には、０．２５−１ｎｇの酵素、０．２μＭのｌｙｓ−プラスミノーゲンおよび０．６２ｍＭストレプトザイムＰＬは、１００μｌの総容積で存在した。２５μｌ／ｍｌＤＥＳＡＦＩＢ、１００μｇ／ｍｌフィブリノーゲン、１００μｇ／ｍｌのフィブリノーゲンの臭化シアノゲン断片（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）である緩衝液の存在下、または１００μｇ／ｍｌの刺激剤、１３個のアミノ酸ペプチドＰ３６８のいずれかで、アッセイを行った。Ｐ３６８は、ＭａｒｓｈａｌｌＲｕｎｇｅ（テキサス州、ガルベストンのテキサス大学医療センター）によって親切に提供された。マイクロタイター平板で、アッセイを行い、そして４０５ｎｍでの光学密度を、３０秒毎に１時間、分子装置サーモマックスで測定した。摂氏３７度で反応を行った。ＰＡＩ−１による阻害についての二次反応速度定数の測定野生型および突然変異したｔ−ＰＡの阻害についての二次反応速度定数を、実施例１に記述されるとおり偽一次の条件下で測定した。オリゴヌクレオチド間接的部位特異的突然変異原性を使用して、一本鎖ｔ−ＰＡの触媒活性を選択的に抑制したｔ−ＰＡのＬｙｓ４２９を生成した。リシン４２９を、チロシン残基に変換して、ｔ−ＰＡ／Ｋ４２９Ｙを生じた。さらに、一本鎖形態のこの変異体のプラスミノーゲンに対する酵素的活性の正確な測定を可能にするために、付加突然変異Ｒ２７５Ｅを現存の非切断性形態の突然変異酵素を構築して、Ｒ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙ変異体を生成した。野生型ｔ−ＰＡ、ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ、ｔ−ＰＡ／Ｋ４２９Ｙおよびｔ−ＰＡ／Ｔ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙは、実施例１で記述されるとおりＣＯＳ１細胞での一過性の発現ベクターによって発現された。この手段は、一本鎖酵素を予め優先的に生じるので、二本鎖ｔ−ＰＡは、プラスミン−セファロースで酵素標品を処理することによって生成された。酵素をそれらの成熟した二本鎖形態に定量的変換することは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された。先に例示したとおり、突然変異Ｒ２７５Ｅを含有する変異体を合成し、そして一本鎖酵素として専ら分泌し、そしてプラスミン−セファロースによって切断されなかった。表VI 一本鎖および二本鎖ｔ−ＰＡ変異体の色素原性基質ストレプトザイムｔ−ＰＡの切断についての速度論的定数小型の合成基質に対する一本鎖および二本鎖形態の野生型およびｔ−ＰＡの酵素活性は、上の表ＶＩに列記される。リシン４２９の突然変異は、二本鎖ｔ−ＰＡの活性にほとんど影響を示さなかった。二本鎖ｔ−ＰＡ／Ｋ４２９Ｙは、このアッセイで二本鎖の野生型酵素の活性のおよそ９０％を示した。反対に、Ｋ４２９Ｙ突然変異は、一本鎖ｔ−ＰＡの活性に非常に実質的な影響を示した。一本鎖ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙは、一本鎖ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅの活性のおよそ２％を示した。この研究で、特定の酵素の一本鎖形態のものに対する二本鎖の活性の比として規定されるチモーゲン性は、野生型ｔ−ＰＡについておよそ２．５であった。反対に、Ｋ４２９Ｙ突然変異を含む変異体については、この比は、およそ１１７まで増加した（表VI）。コファクターの不在下で、Ｋ４２９Ｙ突然変異は、プラスミノーゲンに対する二本鎖ｔ−ＰＡの活性にほとんど影響を示さなかった。しかし、この突然変異は、一本鎖ｔ−ＰＡの触媒的効率を際立って減少させた（下の表VII）。一本鎖ｔ −ＰＡ／Ｒ２７２５Ｅのものと比較して、一本鎖ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙの活性は、１７の因子まで減少された。反対に、二本鎖ｔ−ＰＡおよびｔ− ＰＡ／Ｋ４２９Ｙの活性は、わずか１．２の因子と異なった。表VII コファクターの不在下でｔ−ＰＡの一本鎖および二本鎖によるプラスミノーゲンの活性化についての速度論的定数この研究で分析された変異体の全ては、コファクターフィブリンの存在下で天然の基質プラスミノーゲンに対する酵素活性を相当に高く維持した（下の表VIII ）。しかし、Ｋ４２９Ｙ突然変異を含む変異体の一本鎖形態を、対応の成熟な二本鎖酵素よりわずかに大きな範囲に影響を及ぼした。二本鎖ｔ−ＰＡ／Ｋ４２９Ｙは、二本鎖ｔ−ＰＡの活性のおよそ７５％を保有する一方で、一本鎖ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙは、一本鎖ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅの活性のおよそ４０％を示した。表VIII フィブリンの存在下での一本鎖および二本鎖ｔ−ＰＡ変異体によるプラスミノーゲンの活性化についての速度論的定数一本鎖形態のｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙによって示されるフィブリン刺激の範囲は、野生型ｔ−ＰＡによって示されるものより際立って大きい。野生型の二本鎖ｔ−ＰＡは、フィブリンの存在および不在下での触媒効率の比率として規定されるおよそ２５０のフィブリン刺激因子を保有する（下の表IX）。二本鎖ｔ−ＰＡ／Ｋ４２９Ｙ変異体は、２３０の同様の刺激因子を示す。鋳型機構を通してのみならず、非タンパク質溶解性チモーゲン活性化を導入することによって一本鎖酵素を刺激するフィブリンの能力におそらく影響を及ぼしながら、３８００のフィブリン刺激因子を示す一本鎖野生型ｔ−ＰＡを、二本鎖酵素より実質的に大きな程度まで刺激する。Ｋ４２９Ｙ突然変異によって、一本鎖ｔ−ＰＡの刺激を、さらに増大させた。一本鎖ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙについてのフィブリン刺激因子は、およそ２６，０００である。変異体のフィブリン刺激が増大すると、フィブリンの存在下での増加活性から生じなかったが、むしろ刺激剤の不在下での減少した活性から生じ、観察は、これらの突然変異の効果が、Ｌｙｓ４２９およびＡｓｐ４７７の間の塩架橋の中断によって仲介されるという我々の目的と密接に結びつく。表IX ｔ−ＰＡの変異体についての触媒効率におけるフィブリンの刺激効果突然変異酵素ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙは、ｔ−ＰＡより溶解性フィブリンにより際立って大きな範囲まで刺激される（上の表IX）のみならず、野生型酵素よりフィブリンコファクター内で実質的にさらに区別する（図２）。二本鎖形態の野生型ｔ−ＰＡおよびｔ−ＰＡ／Ｋ４２９Ｙの両方は、可溶性フィブリンモノマー（ＤＥＳＡＦＩＢ）、フィブリノーゲン、フィブリノーゲンのＣＮＢｒ断片および１３のアミノ酸ペプチド（Ｐ３６８）に強力に刺激される。他方、一本鎖ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅは、可溶性フィブリンおよびフィブリノーゲンによって強力に剌激され、そしてＣＮＢｒ断片およびペプチドＰ３６８によって中程度に刺激される。これらの酵素に対する攻撃で、フィブリンモノマーによって劇的に刺激されるが、一本鎖ｔ−ＰＡ／Ｐ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙは、フィブリノーゲン、フィブリノーゲンのＣＮＢｒ断片、ペプチドＰ３６８に対して実質的には応答なしである。フィブリノーゲン、または「フィブリン選択性因子」の存在下でのものに対してフィブリンの存在下でのプラスミノーゲン活性剤の特定の活性の比は、酵素がインビボで示す「クロット選択性」の１つの指標である。増強されたフィブリン選択性を示す酵素は、充分な血栓溶解を達成できる一方で、全身性活性が減少したことを示している。ここに報告されるアッセイの条件下で、フィブリン選択性は、二本鎖ｔ−ＰＡについては１．５で、二本鎖ｔ−ＰＡ／Ｋ４２９Ｙについては１．５で、一本鎖ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅについては１．０である。しかし、一本鎖ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５，Ｋ４２９Ｙについてのフィブリン選択性因子は、１４６である。したがって、この二重突然変異体は、一本鎖または二本鎖野生型ｔ− ＰＡのいずれかよりフィブリンおよびフィブリノーゲンの間をよりいっそう識別するおよそ二桁のオーダーのものである。ｔ−ＰＡの一本鎖形態のチモーゲン様変異体は、基質（上の表VIおよびVIII）に対してのみならず、特定の阻害剤に対しても活性が減少されることを示すことが予測される。Ｉ型（ＰＡＩ−１）ｔ−ＰＡの一次生理学的阻害剤であるセルピン・プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤による一本鎖形態のｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅおよびｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙの両方を阻害する二次反応速度定数は、下の表Ｘで示される。予測されるとおり、ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙは、ＰＡＩ−１による阻害に対する耐性を示した。二次反応速度定数は、ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅと比較した。表ＸＰＡＩ−１によるｔ−ＰＡの野生型および変異体の阻害この研究での重要な知見は、リシン４２９のチロシン残基への変換は、一本鎖ｔ−ＰＡの活性を選択的に抑制させ、そしてそれにより酵素のチモーゲンを実質的に増強することである。さらに、我々は、一本鎖ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙは、いっそう際立ってフィブリンを刺激し、そして一本鎖または二本鎖の野生型ｔ−ｐＡのいずれかより実質的にいっそうフィブリン選択性である。一本鎖ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙも、ＰＡＩ−１による阻害に対して際立った耐性を示す。この突然変異の効果は、一本鎖で存在するが二本鎖ｔ−ＰＡで存在しないと仮定されたＬｙｓ４２９およびＡｓｐ４７７によって形成される重要な塩架橋の中断により仲介されると考えられる。この仮定塩架橋の主要な役割は、一本鎖ｔ−ＰＡの活性なコンフォメーションの安定化であると考えられる。したがって、二本鎖ｔ−ＰＡ／Ｋ４２９Ｙは、この研究に例示されるとおり、高い酵素活性を維持することが予測される。この結果は、改善された血栓溶解剤の設計の助けとなる。例えば、ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ，Ｋ４２９Ｙは、フィブリン刺激が目立って増強され、フィブリンコファクターでの識別を劇的に増大させ、ＰＡＩ−１による阻害に対して耐性を際立たせることを示し、そして実質的に、酵素の治療利用性を増大する特性の組合せであるチモーゲン性が増加したことを示した。先行のものは、本発明の例示うることを意図するものであって、限定されない。本発明の多数の変異および改変は、本発明の概念および範囲から逸脱することなく有効になりうる。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Tissue-type plasminogen activator (t-PA) Variants: Compositions and Methods of Use ThereofReference to related application This application is a pending provisional application filed Nov. 12, 1996, which is hereby incorporated by reference. It is based on application serial number 60 / 030,655.Government rights This invention is supported by US Government, National Institutes of Health, Grant HL52475 and And HL31950. The United States Government Have rights. The present invention relates to a tissue-type plasminogen activator, also called t-PA. Protein single-chain variants and such tissue-type plasminogen activator And a nucleic acid encoding a single-chain mutant of the protein. t-PA protein mutation The body has a higher zymogenicity than the wild-type single-chain t-PA form. One. Methods for making and using t-PA variant compositions are also described.Background of the Invention Tissue-type plasminogen activator (t-PA) Plastic protease By activating to sumin, the process of fibrinolysis, that is, the dissolution of blood clot It is a serine protease that plays an important role in t-PA is the basis Well-identified and characterized by DNA and dakutaku amino acid sequences Was. Pennica et al., Nature, 301: 214 (1983) and 19 See U.S. Pat. No. 4,853,330 issued Aug. 1, 1989. Teach these Where incorporated by reference. The nucleotide sequence of human t-PA and The primary sequences of the deduced amino acids are shown in FIGS. 1A, 1B and 1C. The amino acid residues from −35 to −1 immediately before the mature t-PA sequence are “pro” Is an array. Mature t-PA molecule (amino acid residues 1-527) is Motrypsin, plasminogen, prothrombin, fibronatin, and Phases identified in various other proteins such as epidermal growth factor (EGF) Five regions (domains) defined with reference to the same or otherwise similar structures Including). These regions start at the N-terminus of the amino acid sequence of mature t-PA. 1) variously defined as containing from amino acid residue 1 to about 44 Nger region (F), 2) extends from about amino acid residue 45 to 91 (with EGF ), Variously defined growth factor regions (G), 3) approximately amino acids Kringle 1 (defined as extending from residue 92 to about amino acid residue 173) K1), 4) about amino acid residues Kringle 2 (K) defined to extend from 180 to about amino acid residue 261 2) and 5) generally from about amino acid residue 264 to amino acid residue 527 The so-called serine protease region (P ). "Linkers" generally located next to each other or short These regions, separated by regions, range from 1 to 527 of the mature form of t-PA. 2 shows the entire amino acid sequence of the amino acid residue in FIG. Each region is differently contributing to some biologically important specific property. Has been described. The finger region has at least a high binding affinity for fibrin Have been characterized as containing sequences of considerable importance. ( This activity is exerted by t-PA with respect to clot lysis at the locus of fibrin-rich thrombus It is considered important for high specificity. ) Growth factor-like regions are also It has also been linked to surface binding activity. The Kringle 2 region also has fibrin binding and And fibrin have been strongly linked to their ability to stimulate the activity of t-PA. Auction Proteases are responsible for the enzymatic cleavage of plasminogen to produce plasmin. Carry. t-PA is among the proteases with respect to the level of enzymatic activity of its precursor. It is off. Generally, proteases are zymogens, Treated with proteolytic enzymes or express specific catalytic activity Have to bind to a specific cofactor Synthesized as an active precursor. Increase in catalyst efficiency after zymogen activation Increased morgenicity can vary greatly between individual members of the chymotrypsin family , In almost every case is dramatic. For example, trypsinogen, Kimotori Psinogen, or a powerful zymogen like plasminogen, Those with high zymogenicity are almost completely inactive and have a zymogenicity of 10^Four From 10⁶(Robinson, NC, Neuroth, H .; And Walsh, K .; A. (1973) Biochemistry 12,4 20-426; Gertler, A .; , Walsh, K .; A. And Neura th, H .; (1974) Biochemistry 13, 1302-1310. ). Other serine proteases exhibit intermediate zymogenicity. For example, XII The enzymatic activity of factor a is 4000 times greater than that of its corresponding zymogen, factor XII High (Silverberg, M. and Kaplan, AP (1982) Bl. wood 60, 64), the catalytic efficiency of urokinase is 25 times higher than that of pro-urokinase. 0 times higher (Lijnen, HR, Van Hoef, B., Nelles, L. And Collen, D .; (1990) J. Am. Biol. Chem. 265, 5232-5236). In contrast, the catalytic activity of single- and double-stranded t-PA is It only changes at a rate of 5-10. Of mature cleaved double-stranded enzyme to single-chain precursor form Zymogenicity, expressed as a ratio of activities, has little or no catalytic activity. Unlike other precursors of other proteases that do not have It's just -10. Thus, the single-stranded form of wild-type t-PA is a true zymogen There is no. Many attempts have been made to improve the usefulness of t-PA by genetic engineering. Came. These efforts have been only partially successful. Krause, J.M. & T answell, P .; Arzneim. -Forsch. 39: 632-637 (1989) and in US Pat. No. 5,616,486. Are discussed, and these teachings are incorporated herein by reference. Despite the significant advantages associated with natural t-PA as a clot dissolving agent, Are not necessarily the best t-PA agents under all circumstances Not. Therefore, several variants have been proposed to enhance the specific properties of t-PA. It has been or has been devised. Some of these variants have longer half-lives In situations where substances with slower clearance rates are preferred, e.g. for deep vein thrombosis In treatment and subsequent reperfusion of infarcted patients, or in situations where single-chain substances are preferred In the context of the disadvantages associated with the use of natural t-PA. For example, removal of all or a substantial portion of the finger region Substantially reduced bonding characteristics Instead of producing molecules that have a reduced overall clearance rate of the resulting substance -See WO 89/00197 published Jan. 12, 1989. Amino acid substitutions at the proteolytic cleavage sites at positions 275, 276 and 277 Such variants are described in EPO Patent Application Publication No. 199,574. 275 Preferentially characterized as a t-PA variant having an amino acid other than arginine at the position These variants are naturally occurring, which can exist in either single-stranded or double-stranded form. Unlike t-PA, it is resistant to protease cleavage at position 275 and therefore Protease-resistant single-stranded t-PA that is not metabolically converted to double-stranded form in vivo Called mutant. In this form, fibrin binding and fibrin stimulation are double-stranded. It is biologically and biologically stable in that it is more stable than t-PA. And have certain commercial advantages. In addition, plasminogen activator Beta is a region that can interact with fibrin and urokinase One embodiment is described in US Pat. It is urokinase modified so as not to form rokinase. 1988 7 See WO 88/05081 published on March 14. For further patent literature on primary mutations in the protease cleavage site of t-PA For example, EPO Patent No. 241,209; published on November 12, 1986 EP of No. 201,153; EP 233,013 published on Aug. 19, 1987; 198 EP 292,009 published on November 23, 1988; E published on December 7, 1988 P 293,936; and EP 293,934 published December 7, 1988. And WO88 / 10119. Sudden glycosylation at positions 117-119, 184-186 and 448-450 Mutants showed higher specific activity with decreasing carbohydrate mole percent . See EPO Publication No. 227,462 published July 1, 1987. This patent application Further discloses the use of a fibrin / fibrin degradation product assay; Ability to modify the t-PA molecule at positions 72-280, or up to 25 from the C-terminus Teach that the amino acids at can be removed. In addition, the N-glycosylation site Including the remaining O-linked carbohydrates but selectively removed by NA modification. The t-PA mutant with Asn119, Ala186 and Asn450, Approximately 2 times more potent than melanoma t-PA in in vitro lysis assays Was observed. EPO Publication No. 225, published on June 10, 1987 See No. 286. Substitution of amino acid at position 449 of t-PA with an amino acid other than arginine for glycosylation Modifying the silation site and modifying Arg275 or -3 to 91 The deletion of the region up to is also taught. August 13, 1987 See WO 87/04722 in Open. The amino acid substitution at position 448 of t-PA is It is disclosed as desirable for removing cosylation. 1988 12 See EPO Publication No. 297,066 published on March 28. Modifications at positions 448-450 And a deletion of the N-terminal 1-82 amino acids was published on January 12, 1989. It is disclosed in WO 89/00191. In addition, urokinase is a glycosyl Modified in the region of Asp302-Ser303-Thr304 to prevent ing. See EPO Publication No. 299,706 published Jan. 18, 1989. However, changes in the glycosylation site, especially at amino acid 117, are always Circulating half-life patterns and / or fibrin binding characteristics Likely to produce molecules with affected dissolution properties You. See EPO Patent Publication No. 238,304 published September 23, 1987. When the growth factor region of t-PA is deleted, J. van Zone eveld et al., Thrombos. Haemostas. 54 (1): 4 (19 85) report that the resulting mutant is still active and Join. Various deletions of the growth factor region have also been reported in the patent literature. EPO public Open No. 241,209 (deletion of 51-87), EPO Pub. No. 241,208 No. (deletions 51-87 and 51-173), PCT 87/04722 (One of N-terminal 1-91 Part or all deletions), EPO Publication No. 231,624 (all growth factor regions) Deletion), and EPO Publication No. 242,836, and Japanese Patent Publication No. No. 62-269688 (deletion of part or all of the growth factor region). Furthermore, t-PA must be modified in both the first kringle region and the growth factor region. Has been shown to result in increased half-life in the circulation. 1987 10 See EPO Patent Publication No. 241,208, published on March 14. Amino acids 51-8 The region containing both ends up to 7 was deleted from t-PA to increase the clearance from plasma. Slower variants can be generated. Browne et al. Biol. Ch em. 263: 1599-1602 (1988). In addition, specific amino acid residues By deletion or replacing one or more amino acids with different amino acids This allows access to mature native t-PA without undesired biological effects. T-PA can also be modified in the region of amino acids 67-69. 1987 See EPO Patent Publication No. 240,334, published October 7th. T-PA / urokiner using region of t-PA containing amino acids 273-527 Ze hybrids are also disclosed. EPO290 published on November 9, 1988 , 118. 296-302 deleted t-PA (del294-302 t-PA), R304 St-PA and R304E t- Serpin-resistant projections of human t-PA with changes in the protease region, including PA Naturally, the mutant is described in Madison et al., Nature, 339: 721-724 (198). 9). The above list describes the number of t-PA variants described. Exhaustive is not considered. Catalytic activity of precursor t-PA despite effective clot lysis at target sites As a result, unwanted proteolysis occurs systemically and Causes harmful depletion of linogen, α2-antiplasmin and plasminogen . What is needed is an effective but reduced systemic proteolytic effect More zymogenic t-PA mutant protein providing local clot lysis It is.Summary of the Invention The present invention provides that at least two basic residues are intermediate compared to wild type human t-PA. Single-chain mutant t-PA protein substituted with an acidic or acidic amino acid residue And a polynucleotide encoding such a single-chain mutant t-PA protein Provide Otide. The single-chain mutant t-PA protein of the present invention includes glycine, Phosphorus, threonine, asparagine, tyrosine, glutamine, aspartic acid, Substituted by an amino acid residue selected from the group consisting of It has 275 amino acid residues. Preferably, the single-chain mutant t-PA protein of the present invention The protein is selected from the group consisting of aspartic acid residues and glutamic acid residues. Amino acid residues, most preferably glutamic acid residues R275 amino acid residues. The single-chain mutant t-PA protein of the invention additionally comprises 477 aspartic acid. Salt cross-linking phase normally found in wild-type single-chain t-PA between lysine and lysine 429 Non-basic amino acids within the serine protease region may disrupt the interaction. Having at least one other basic amino acid residue substituted. Preferably, salt The basic amino acid is substituted with a polar or acidic amino acid, more preferably, Glycine, serine, threonine, asparagine, tyrosine, glutamine, Aspa Substituted with an amino acid residue selected from the group consisting of arginic acid and glutamic acid ing. The salt bridging interaction between aspartic acid 477 and lysine 429 is at position 477 Or by substitution at position 429, or aspartic acid 477 and lysine 42 Providing alternative salt bridging interaction partners for at least one of the nine Disruption can be achieved by appropriate substitutions at positions within the Rotase region. One In a preferred embodiment, the H417 amino acid residue is glycine, serine, threonine. , Asparagine, tyrosine, glutamine, aspartic acid, and glutamine It has been replaced by an amino acid residue selected from the group consisting of an acid. More preferred Alternatively, the single-chain mutant t-PA protein of the present invention comprises an aspartic acid residue and Amino acid residues selected from the group consisting of glutamic acid residues It has both R275 and H417 amino acid residues. Two preferred examples The exemplary single-chain mutant t-PA proteins are R275E, H417E and R27. 5E, a t-PA mutant designated H417D. In another preferred embodiment, the K429 amino acid residue is glycine, serine, or glycine. Leonin, asparagine, tyrosine, glutamine, aspartic acid, and glue It has been replaced by an amino acid residue selected from the group consisting of tamic acid. Than Preferably, the single-chain mutant t-PA protein of the present invention is glycine, serine, Threonine, asparagine, tyrosine, glutamine, aspartic acid and glue R275 amino acid substituted by an amino acid residue selected from the group consisting of It has both amino acid residues and K429 amino acid residues. One preferred single-stranded variant The t-PA protein is a t-PA mutant called R275E, K429Y. You. The single-chain mutant t-PA protein of the present invention is a wild-type single-chain t-PA protein. The ratio of the activity of the mature cleaved double-stranded enzyme to the single-chain precursor form compared to the quality Greater zymogenicity expressed as Single chain mutant t-PA tan of the present invention The protein has a zymogenicity of at least 10, preferably from about 50 to about 200. I do. The single-chain mutant t-PA protein of the present invention is a wild-type single-chain t-PA protein. Expressed as the ratio of catalytic efficiency in the presence and absence of fibrin compared to quality , Indicating a greater fibrin stimulation factor. Single chain mutant t-PA tamper of the present invention Quality is at least 7,000, preferably from about 20,000 to about 50,000 Has a fibrin stimulation coefficient of The single-chain mutant t-PA protein of the present invention is a wild-type single-chain t-PA protein. Plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) Shows reduced inhibition. The single-stranded mutant t-PA protein of the present invention is a wild-type single-chain. Compared to the t-PA protein, a factor of at least 5, preferably at least about 9 Of inhibition of PAI-1 by a factor of I do not receive. The single-chain mutant t-PA protein of the present invention is a wild-type single-chain t-PA protein. Catalytic effect in the presence of fibrin on the presence of fibrinogen compared to the quality Shows a greater fibrin selectivity coefficient, expressed as a percentage ratio. Of the present invention A preferred embodiment of the single-chain mutant t-PA protein is at least 10, preferably Or at least 50, more preferably at least 100 fibrin selectivity agents Have a number. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES In the figure, FIGS. 1A, 1B and 1C show the nucleosides of the full-length human t-PA cDNA. Shows the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence; Figure 2 shows buffer (white square), DESAFIB (white diamond), Brinogen (white circles), cyanogen bromide fragment of fibrinogen (white triangles) Or plasminogen in the presence of the stimulating peptide P368 (shaded square) A graphical representation of the results of a standard chromogenic assay for activation It is.Detailed Description of the Preferred Embodiment As used herein, “wild-type t-PA” refers to naturally occurring t-PA in humans. Refers to PA protein. This human t-PA was isolated from the amino acids shown in FIGS. 1A, 1B and 1C. As exemplified by the amino acid sequence, the term wild-type t-PA refers to a naturally occurring allele. It should be understood to include offspring variants.t-PA mutant composition T-PA mutant cDNAs of the invention and corresponding expressed recombinant proteins Has a role in serine protease-mediated control of fibrinolysis, as described in the text. It is a useful compound that functions. The t-PA mutant cDNA of the present invention is a single non-cleavable cDNA. Chain t-PA mutant, ie not cleaved by plasmin under normal conditions At least one resulting in a t-PA cDNA encoding a single-stranded t-PA variant Nucleotide substitutions. Such nucleotide substitutions may result in non-cleavable variants In the t-PA precursor that plays the role of creation, amino acid residue 275 (or Using the motrypsin numbering system, arginine (R) at position 15) This results in substitution by glutamic acid (E). Chymotrypsin numbering system Positions 15, 144, 156, and 194 are t-PA nambarine as shown in FIG. 275, 417, 429 and 477, respectively, in the system. The mutant, which is a substitution mutant, has a single amino acid residue of wild-type human t-PA. Character code and the position of the residue relative to the amino terminus of mature human t-PA as shown in FIG. And then amino acid substituted amino acid residues in mature human t-PA And the one-letter code for the acid residue. Arginine at position 275 Substitution with glutamic acid is designated R275E. Creates non-cleavable single-chain t-PA Equivalent substitutions to make are known in the art (Higgins, DL et al. , (1990) Thrombosis Res. 57: 527-539). In addition to the R275E substitution, the mutant cDNA of the invention may further comprise at least two At a separate site to create a t-PA variant with the amino acid substitution of One Contains other nucleotide substitutions. A preferred cDNA variant is amino acid residue 417 Glycine, serine, threonine, asparagine, th Selected from the group consisting of rosin, glutamine, aspartic acid and glutamic acid. At least one nucleotide substitution resulting in an amino acid substitution of the amino acid residue including. Preferred embodiments are R275E, H417D and R275E, H41. No. 7E. An additional cDNA variant is a lysine at amino acid residue 429 ( Glycine, serine, threonine, asparagine, tyrosine, An amino selected from the group consisting of glutamine, aspartic acid and glutamic acid Including at least one nucleotide substitution resulting in a substitution of an acid residue. One of that Such a preferred embodiment is designated R275E, K429Y. The mutant t-PA cDNA of the present invention produces the above-mentioned recombinant expression mutant t-PA. Useful to achieve. In another embodiment, the mutant t-PA cDNA comprises: Therapeutic uses in gene therapy are described as described in. The present invention provides a method for constructing a cDNA encoding a mutant t-PA as described below. Functionally to provide expression of the recombinant mutant t-PA for use in the method of Includes embodiments, such as expression vectors or plasmids, that are linked. One preferred embodiment relates to a polynucleotide encoding a variant protein. COS1 cells containing an operably linked pSVT7 expression vector Thus, a mutant t-PA protein is expressed. Should be built and introduced An expression vector is disclosed. In another embodiment, the transiently and stably transient The transfected cells contain the cDNA encoding the mutant t-PA. The resulting recombinantly expressed t-PA described herein may comprise one or more of the following: Characterized as exhibiting the following structural and functional properties: 1) t-PA variants Is the R275E amino acid substitution or its substitution to avoid cleavage by t-PA activating enzyme In the form of an uncleaved single-chain protein containing the equivalent; 2) the t-PA variant is By serpin plasminogen activator inhibitor, type I (PAI-1) 3) shows increased resistance to inhibition; 3) the t-PA mutant In the absence of a co-factor, such as plasminogen 4) t-PA mutant was reduced by fibrin 5) t-PA mutants show a co-stimulation such as fibrin. Shows catalytic activity on substrates such as plasminogen in the presence of factor And 6) in terms of resulting properties, the resulting t-PA variants are broadly systemic Effective for the function of local fibrin dissolution without proteolysis Circulating fibrils as seen in the wild-type human single-chain t-PA precursor. No loss of linogen, α2-antiplasmin and plasminogen I do. The preferred recombinantly expressed t-PA variants obtained are R275E, H417D, R 275E, H417E and R275E, K429Y, and their conservative arrangements Inclusive. In general, examples of conservative substitutions include isoleucine, valine, leu Replace one non-polar (hydrophobic) residue such as syn or methionine with another That one polar (hydrophobic) residue is between arginine and lysine, glutamine And between asparagine and another such as between glycine and serine That one basic residue such as lysine, arginine or histidine is Substituting one or one such as aspartic acid or glutamic acid Substituting an acid residue for another. Another test for amino acid classification For discussion, see Lehninger, A. et al. L. , Biochemistry, 2nd edition Worth Publishers, New York, pp. 71-94, 1975. See year. The phrase "conservative substitution" means that such a protein exhibits essential binding activity Includes utilizing chemically derived residues in place of non-derived residues. A “chemically derivative” is one that is chemically derived by the reaction of a group on a functional side chain. Or it corresponds to the target protein having more residues. Such induction Examples of the substituent include a free amino group being derivatized to give an amine hydrochloride, p-toluene. Sulfonyl group, carbobenzoxy group, t- Form butyloxycarbonyl, chloroacetyl or formyl groups Molecule. The free carboxyl group is derivatized to give salts, methyl and Ethyl esters or other types of esters or hydrazines may be formed. Free Hydroxyl groups are derivatized to form O-acyl or O-alkyl derivatives Can. The imidazole nitrogen of histidine is derivatized to give N-im-benzyl Histidine can be formed. Included as chemical derivatives are 20 Containing one or more naturally occurring amino acid derivatives of the standard amino acids Also these peptides. For example, 4-hydroxyproline replaces proline 5-hydroxylysine can be substituted for lysine, 3-methylhistidine Can be substituted for histidine; homoserine can be substituted for serine; and ornithi Can be replaced with lysine. D-amino acids may include one or more L-amino acids. It may be included in place of the acid. In the particular case of the present invention, the basic amino acids, namely arginine, lysine and And histidine are replaced with non-basic amino acids. Preferably the basic amino acid is , Polar or acidic amino acids, ie, glycine, serine, threonine, aspa Consists of lagin, tyrosine, glutamine, aspartic acid and glutamic acid Amino acid residues selected from the following groups. Thus, a conservative substitution is For purposes of the present invention, mature wild-type human t- Non-basic amino acids that substitute a specific basic amino acid with PA are non-basic amino acids From the group of, preferably glycine, serine, threonine, asparagine, tyrosine From the group consisting of, glutamine, aspartic acid and glutamic acid And more preferably composed of tyrosine, aspartic acid and glutamic acid. Can be defined as being selected from the groups For example, histidine residue Using aspartic acid instead of glutamic acid to replace the group Is a permutation. A preferred variant is the R275E. H417 D and R275E, H417E, and R275H, K described in Example 2. 429Y mutant. Expressed recombinant t-PA variants having at least two amino acid substitutions, such as R 275E, H417D, R275E, H417E and R275E, K429Y Shows more characteristic characteristics. R275E and R275E, H417E are While activated by both fibrinogen and fibrin, R275 E, K429Y is first activated by fibrin, but fibrinogen Not sensitive to The latter, R275E, H4 against PAI-1 inhibition. More resistant than 17D and R275E, H417E. These features are: When administering the compound as a therapeutic thrombolytic composition as further shown below Provides additional benefits. Further, the t-PA variants described herein are described below. Stated It is useful for therapeutic use as it is.Methods of making and using t-PA variant compositions Manufacturing method The t-PA mutant cDNA and recombinantly expressed mutant protein described above Useful in many methodological aspects as described in Examples 1 and 2. Special In addition, the isolated cDNA clone produces the encoded t-PA variant protein of the invention. It is useful in the resulting expression vector system. Therefore, cells containing the expression vector Expression vector having t-PA mutant cDNA operably linked thereto It is expected that the system will produce a recombinantly expressed mutant protein of the invention. Diagnostic applications Preferred diagnostic methodological aspects are described herein. In particular, the recombinant expression of the present invention t-PA variants exhibit altered activity of fibrin and fibrin degradation products Useful in diagnostic assays to detect Therefore, the assay is Is shown in the form. Other diagnostic uses, including kits containing antibodies to t-PA variants Are well known to those skilled in the art. Therapeutic applications The t-PA mutant cDNA of the present invention can be used for thrombosis including both acute and chronic conditions. Useful for gene therapy applications used to ameliorate sexually transmitted diseases. As acute symptoms ,Inside However, chronic conditions include both arterial and arterial And deep vessel thrombosis and restenosis. Therefore, a favorable cure Therapeutic compositions include virus vector delivery systems or other vector-based Exist as part of the gene expression delivery system for And cDNA compounds present as naked DNA. The recombinantly expressed t-PA variant protein of the invention has the same disease as outlined above. It is intended to be a thrombolytic therapeutic that improves the condition. The various described above Identification based on individual structural and functional properties of t-PA variant proteins The selection of the t-PA variant of is determined by the desired therapeutic outcome. For example, extrinsic Fibrinogen-mediated activation of sex human t-PA is activated by mating, Subsequently, a widespread unwelcome systemic response results. Therefore, systemic tampa Whether in acute or chronic thrombolytic conditions, while simultaneously preventing thrombolytic activity. In particular, instead of fibrinogen, the T-PA mutants first activated by ibulin, especially R275E, K42 Use 9Y. Compositions used as thrombolytic therapies are generally pharmaceutically suitable A physiologically effective amount of the t-PA variant in a suitable excipient. Administration method and treatment Depending on the condition to be treated, one or more thrombolytic therapeutic agents Administer at a dose of When administering a "bolus" dose, about 0.01 to about 0.6 mg / kg, preferably from about 0.05 to about 0.2 mg / kg, About 0.1 to about 0.2 m to maintain the PA blood concentration at about 3 μg / ml It is generally administered with a continuous dose of g / kg. Those skilled in the art will recognize that Will depend on the condition to be treated. In other applications, gel The composition of the mutant t-PA in the composition is useful in preventing the formation of an adhesive. Other variations and uses of the present invention will be apparent to those skilled in the art. Example 1 Site Orientation of Expression Vectors Encoding T-PA Mutants Sex mutations and constructs Kunkel (Kunkel, TA, Proc. Natl. Acad. S. ci. U. S. A. 82, 488-492 (1985)). Zoller and Smith as described (Zoller, MI and Smi th, M .; , DNA 3, 479-488 (1984)). Rigonucleotide-directed site-directed mutagenesis was performed. The mutation is CD encoding t-PA subcloned with lyophage M13mp18 It was introduced into a 290 bp SacI-SmaI fragment of NA. Mutation primers The following nucleotide sequence was shown: H417D: 5'-CTACGGCAAGGACGAGGCCTTTGT-3 '(SEQ ID NO: 8) H417E: 5'-CATCGGCAAGGAGGAGGCCCTTGT-3 '(SEQ ID NO: 9) Following the mutation, the ssDN corresponding to the entire 290 bp SacI-Smal fragment A is completely sequenced to determine the presence of the desired mutation and any additional The absence of the mutation was confirmed. 290 bp Sac of H417D mutation The sequence corresponding to the I-SmaI fragment is shown in SEQ ID NO: 5 and has the H417E mutation. The corresponding sequence is shown in SEQ ID NO: 6. Replication form for appropriate phage (RF) DNA was prepared and mutated 290 bp SacI-Sma The I fragment was digested with RF DNA using SacI and SmaI, and The product was collected after electrophoresis of the digestion product on a gel. The isolated mutant SacI- Using the SmaI fragment, wild-type human t-PA or t-PA / R275E Substituting the corresponding fragment with the full-length cDNA to be loaded, t-PA / H417D; PA / H417E; t-PA / R275E, H417D (SEQ ID NO: 1); Novel full-length cD encoding t-PA / R275E, H417E (SEQ ID NO: 2) NA was obtained. Enzyme expression by transgene introduction into COS cells t-PA; t-PA / R275E; t-PA / H417D; t-PA / H41 7E; codes for t-PA / R275E, H417D and t-PA / R275E The cDNA to be cloned is described in Madison, E .; L. Et al., Nature 339, 721 -724 (1989); Bird, P .; M. J. et al. Cell Biol. 105: 2905-2914 (1987); and Sambrook, J. et al. Et al., Mol. Biol. Med. 3: 459-481 (1986) It was ligated to the described transient expression vector pSVT7. Structure of pSVT7 And uses, and Parklone Drive 123, Rockville, MD Other pSVT7 to the 01 American Type Culture Collection U.S. Pat. No. 5,5 which describes depositing a culture containing a t-PA construct See also 50,042. This is incorporated herein by reference. Then ligated The vector containing the cDNA insert was transferred to a BioRad Gene Pulser. The cells were introduced into COS1 cells by air perforation. 20 μg cDNA, 100 μg load Body DNA and approximately 10⁷Aliquots containing 0.4% COS cells And electroporated at 320 V, 960 μFD, and Ω = ∞ Was done. Following electroporation, at 37 degrees Celsius, 10% calf serum and 5 mM butyric acid. Incubate cells overnight in DMEM containing sodium I did it. The cells are then washed with serum free medium and incubated at 37 degrees Celsius for 48 hours. Incubated in DMEM for hours. Incubation using serum-free medium After conditioning, the conditioned medium was collected. The order of collection in aliquots by ELISA The enzyme concentration in the activated medium was measured. Of plasminogen activation using an indirect chromogenic assay Kinetic analysis The direct chromogenic assay for t-PA was performed using the substrate lys-plasminogen (Connecticca). American Diagnostica of Greenwich, Utah and And Spectrozyme PL (American Diagnostic) stica) and described earlier (Madison, EL, Gold) Smith, E .; J. Gerard, R .; D. Gething, M .; J. , And Sambrook, J. et al. F. , Nature 339, 721-724 (1 989); Madison, E .; L. Goldsmith, E .; J. , Ge rad, R .; D. Gething, M .; J. Sambrook, J .; F. And Bassel-Duby, R.A. S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 3530-3533 (1990); Madis. on, E. L. Goldsmith, E .; J. Gething, M .; J. , Sambrook, J .; F. And Gerard, R.A. D. , J Bio l. Chem 265, 21423-21426 (1990)). I went. Cofactor DESAFIB (American Diagnostic) Assays were performed in both the presence and absence of ica). lys-plasmino The concentration of the gene was 0.0125-0.2 μM in the presence of DESAFIB. In the absence of the reactor. Kinetic analysis of t-PA activity using a small synthetic substrate The direct chromogenic assay uses the substrate methylsulfonyl-D-cyclohexyltyrosine Ru-glycyl-arginine-p-nitroaniline (Spectrozyme t-PA, American Diagnostica) and described earlier (St. Randberg, L .; And Madison, F .; L. J. Biol C hem. 270, 23444-23449 (1995); W. Tachias, K .; And Madison, E .; L. J. Biol. Chem. 270, 30486-30490 (1995)) Was. Measurement of second-order rate constant of inhibition by PAI-1 Second-Order Kinetic Determination for Inhibition of Wild-Type Human and Mutant t-PA The numbers were measured under pseudo-first order conditions as described above. Briefly, enzymes and And inhibitors at 23 degrees Celsius for 0-30 minutes with varying times. Re-incubated. Following pre-incubation, the mixture is diluted and The remaining enzyme activity was measured in a standard indirect chromogenic assay. Each enzyme The concentration of enzymes and inhibitors, and the time of preincubation. The remaining enzyme activity varies between 20% and 80% of the original activity Several data points were obtained. For preincubation time (remaining activity / By plotting the natural log of the ratio (initial activity) and measuring the resulting slope And analyzed the data. -By the reciprocal of this gradient according to [I] Second order rate constants were obtained. By substituting histidine 417 of t-PA with an acidic residue, single-chain t-PA can be substituted. It was found that the catalyst activity was selectively suppressed. Histidine 417, asparte Two mutant t-PA / H 417D and t-PA / H417E were obtained. However, any Rasmin cleaves the R275-1276 peptide bond to form a single-chain These two mutants, because they rapidly convert enzymes to their mature, double-stranded form Measurement of enzymatic activity against plasminogen in single-chain form is difficult It was proved. Consequently, to overcome this technical difficulty, we have The addition mutation R275E can be cleaved by introducing it into an existing mutant. An absent form of two mutant enzymes was also constructed. Mutations at wild-type human t-PA, t-PA / R275E, and position 417 All four mutants are expressed by transitional expression of COS-1 cells. This Since the single-strand enzyme is preferentially generated in advance, the enzyme preparation can be used in plasmin-seph. Arlose (Strandberg, L. and Madison, EL, J. Mol. Biol. Chem. 270, 23444-23449 (1995)). By processing, double-stranded t-PA is produced. Enzymes are those mature two The quantitative conversion to the main chain form was confirmed by SDS-PAGE. Forecast As measured, a mutant containing the mutation R275E was synthesized and exclusively It is secreted as a main-chain enzyme and is not cleaved by plasmin-sepharose. won. For single- or double-stranded forms of wild-type human t-PA and small synthetic substrates The enzymatic activity of each variant is listed in Table I below. Histidine 417 The mutation showed only a very optimal effect on the activity of the double-stranded enzyme. Double strand t-PA / H417D and t-PA / H417E are double-stranded in this assay. 67% or 80% of the activity of the wild-type human t-PA enzyme, respectively. I However, the H417D and H417E mutants have a further focus on single-stranded enzyme activity. Showed a standing effect. Compared to single-chain t-PA / R275E, single-chain t-PA / R275E R275E, H417D (SEQ ID NO: 1) and tp A / R275E, H417E (SEQ ID NO: 2) is the single-stranded t-pA / R275E It showed about 16% or 25% of the activity, respectively. Table 1 Chromogenic substrate with single and double stranded t-PA variants, spectrozyme t-PA Kinetic constant for cutting All of the variants analyzed were of the cofactor fibrin (Table II below). In the presence, the enzyme activity on the natural substrate, plasminogen, was kept high. field Two of live human t-PA, t-PA / H417D and t-PA / H417E The catalytic activity of the chain form varied by a factor of only 1.4. Similarly, single-stranded t -PA / R2 75E, t-PA / R275E, H417D, and t-PA / R275E, H The activity of 417E varied up to factors below 1.8. Table II Plasminogen by single and double stranded t-PA mutants in the presence of fibrin Kinetic constants for activation of In the absence of the cofactor, the mutation at site 417 was associated with plasminogen. Had little effect on the activity of the double-stranded t-PA The mutation markedly reduced the catalytic efficiency of single-stranded t-PA (Table III below). Compared to single-chain t-PA / R275E In all, t-PA / R275E, H4 up to approximately 14 or 6 factors, respectively. The activity of 17D and t-PA / R275E, H417E was reduced. This app Activity of certain enzymes in "zymogenic" or double- and single-stranded forms Was approximately 9 for wild-type t-PA. Conversely, H417D also For mutants containing the H417E mutation, this ratio is approximately It increased to around 150 or 50 (Table III). Table III Plasminnow by single and double stranded t-PA mutants in the absence of cofactor Kinetic constants for gen activation. A complex process that almost certainly involves multiple point contacts between two proteins The molecular part of the stimulation of t-PA by fibrin leaves ambiguity. Double strand t -Fibrin stimulation of PA can occur through a single mechanism, but Stimulation of single-chain t-PA by phosphorus cofactors has at least two prominent Seems to utilize the mechanism. First, fibrin is single-stranded by the template mechanism. And apparently stimulate both double-stranded t-PA, thereby enzymatic and substrate localization. This results in the formation of a ternary complex which greatly increases the concentration of the complex. Second, single-stranded and double-stranded The chain tP shows equivalent activity in the presence, but not the absence, of fibrin, Binding to Brin is conformational with the active domain of single-chain t-PA. Seems to induce change. Plus in binding to streptokinase Similar activation of minogen and binding to staphylocoagulase Activation of prothrombin has been described previously. Serine protease zymogen Although the mechanism of this non-classical non-proteolytic activity of Single-chain t-PA / R275E, H417D and t-PA / R275E, H41 The effect of 7E indicates that His417 does not play a fundamental role in this process. You. Furthermore, the properties of the double-stranded t-PA / H417D and t-PA / H417E are , His417 is a zymogen of t-PA through a typical proteolytic mechanism Played a fundamental role during activation Indicates no. The primary effect of the H417D and H417E mutations was in the absence of fibrin Selective reduction of the activity of single-chain t-PA and, consequently, the zymogenicity of the enzyme Was an increase. At the molecular level, little-active new single-chain t-PA Conformation stabilization or low activity conformation One or more existing conformations that show prominent activity against the This effect was mediated by switching the equilibrium between the options. To a single hypothesis Trypsinogen, trypsin, chymotrypsinogen and Based on structural studies of chymotrypsin, multiple conformations of the active domain The existence of an equilibrium in the cynotrypsinogen family It seems to be a general feature. By providing a selective electrostatic interaction for Lys429, Hi The effect produced by converting s417 to an acidic residue is that Asp477 and It is thought to be mediated by interrupting the important salt bridge between Lys429. You. The step and shape of this interaction are the two members of the unit cell in this study. Although varying to some extent, recently reported protease domains of double-stranded u-PA Observation of the electrostatic interaction between K429 and E417 in the structure suggests this hypothesis. Lead trust. In addition, Lys429 interacts with Asp477 in the double-stranded enzyme. Lys429 and Asp / G as observed in this study since they do not work. Formation of a novel salt bridge between lu417 selectively suppresses the activity of single-chain t-PA It was predicted. Instead, in double-stranded t-PA, other mature chymotrypsin-like As with enzymes, the mature amino terminus inserts into the active pocket and plays this role. Fulfill. Finally, the observed double-stranded t-PA / H417D and t-PA / H41 7E is expected to maintain high catalytic activity. Therefore, acidic residues The variant of t-PA contained in position 417 has significantly increased zymogenicity. Is shown. Table IV Stimulating effect of fibrin on catalytic efficacy for variants of t-PA Fibrin sting demonstrated by the single-stranded form of the mutant enzyme tested in this study The intensity range is significantly larger than that exhibited by wild-type t-PA. Wild type Double-stranded t-PA has approximately 460 catalysts in the presence or absence of fibrin. Possessing fibrin stimulating factor defined as efficacy ratio (Table IV above). two The main chain variants were 290 (t-PA / H417D) and 410 (t-PA / H4D). 17E) shows a similar stimulus. Single strand showing 6300 fibrin stimulus prognosis Wild-type t-PA not only passes through the template mechanism, but also Fibrin's ability to stimulate single-stranded enzymes by introducing It was stimulated to a substantially higher degree than the double-stranded enzyme, with an easy effect. H4 17D or H417E mutation further increases single-chain t-PA stimulation Great. Single-chain t-PA / R275E, H417D and t-PA / R275 E, Fibrin stimulating factors for H417E were 48,200 and 25,400 (Table IV above). Increased fibrin stimulation of the mutants It did not result from increased activity in the presence of Bryn, but rather decreased in the absence of stimulants. Arising from little activity, observations indicate that the effects of these mutations indicate that Lys429 and Lys429 Closely linked to the idea that it is mediated by interruption of the salt bridge during Asp477 Good. The zymogen-like variant of t-PA in single-chain form is Activity (Tables I and III above) as well as activity against specific inhibitors It is expected to show that To illustrate this, we have Plasminogen activation inhibitor type 1 (PAI-1) allows single-chain t-pA / R275E, t-PA / R275E, H417D and t-PA / R275E, Two-digit rate constants for inhibition of H417E were measured (Table V below). Predicted As shown, both mutants containing a mutation at position 417 were inhibited by PAI-1. Showed resistance to Compared to t-PA / R275E, respectively, t-PA / R275E, H417D or PAI of t-PA / R275E, H417E- Reduced double-digit rate constant for inhibition by 1 to a factor of approximately 12 or 9 I let it. Table V Inhibition of wild-type and variants of t-PA by PAI-1 t-PA has usually high catalytic activity as a single-stranded enzyme and consequently very high Shows low zymogenicity. Conversely, the closely related enzyme urokinase (u-PA ) Is one As a chain enzyme, exhibits lower catalytic activity and substantially higher zymogenicity . An important finding of this study is the favorable static between residues at positions 417 and 429. The presence or absence of an electrical interaction between the two human plasminogen activators Is to appear to be the major determinant of this major functional difference. Wild type t-PA, u-PA and t-PA containing aspartate at position 417 The zymogenicity is approximately 9, 250 and 150, respectively. These studies illustrate the structure / function relationships within the activation domain of t-PA, And elucidate the molecular concept of important functional differences between t-PA and u-PA Was. These results also aid in the design of an improved thrombolytic agent. For example, t -PA / R275E, H417D has substantially increased fibrin stimulation, PAI -1 resistance and greatly increased zymogenicity, enzyme treatment Figure 2 shows a useful combination of properties that enhances utility. Example 2 Site Orientation of Expression Vectors Encoding T-PA Mutants Sex mutation and construction Oligonucleotide-directed site-directed mutagenesis as described in Example 1. Was done. T-PA previously transfected into bacteriophage M13mp18 290 bp SacI-Smal fragment of cDNA encoding Was introduced with a K429Y mutation. The mutated primer has the following nucleotides The sequence is shown. 5'-CGGAGCGGCTGTATGAGGCTCATGT-3 '(SEQ ID NO: 10) Following the mutation, the ssDN corresponding to the entire 29 bp SacI-Smal fragment A is fully sequenced to determine the presence of the desired mutation and any additional It was confirmed that there was no mutation. 290 bp SacI-Smal fragment of K429Y Is shown in SEQ ID NO: 7. For the appropriate phage, replicate form (RF) DNA and RF DN using SacI and Smal After digestion of A, the mutated 290 bp SacI-Smal fragment was recovered, The digests on the agarose gel were then electroporated. Isolated, mutation Using the SacI-Smal fragment, the corresponding fragment was converted to wild-type t-PA or t-PA. -By substituting the full-length cDNA encoding PA / R275E, t-PA / K42 Novel full-length cDN encoding 9Y and t-PA / R275E, K429Y A was obtained. Expression of enzymes by transition transduction of COS cells t-PA, t-PA / R275E, t-PA / K429Y and t-PA / R The cDNA encoding 275E, K429Y was inserted into the transition expression vector pSVT7. Reige And then, as described in Example 1, Bio-Rad Gene Pulses were used to introduce into COS cells by electroporation. Following electroporation, At 37 degrees Celsius in DMEM containing 10% calf serum and 5 mM sodium butyrate The cells were incubated overnight. The cells are then washed with a serum-free medium and And incubated in DMEM at 37 degrees Celsius for 48 hours. Use serum-free medium After incubation, the conditioned media was collected and by ELISA, The enzyme concentration in the conditioned medium was measured. Purification of wild-type and mutated variants of t-PA FPLC system and 1 ml HiTrap chelate column (Parmac ia Biottech) using wild-type and mutated t-PA The mutant was purified. The column contains 0.1 M CuSO_FourLoad solution, 5-10m Wash with 1 l of distilled water and start buffer (0.02 M NaHPO_FourPH 7.2 , 1 M NaCl and 1 M imidazole). t-PA wild type Or the conditioned medium containing the mutants was adjusted to 1 M NaCl and 50 ml Injected into a column with Parup (Parmacia Biotech). That Afterwards, the column is washed with 10 column volumes of starting buffer and the immi- Elution was performed with a linear gradient of dazole from 0-0.32M. The fraction of the peak Collect and store did. The purified t-PA sample was concentrated, and the buffer was centrifuged. 25 mM Tris (pH = 7.5) while using a Concentrator 30 (Amicon). ), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA. Dynamic analysis of t-PA activity using a small synthetic substrate The direct chromogenic assay uses the substrate methylsulfonyl-D-cyclohexyltyrosyl -Glycyl-arginine-p-nitroaniline (Spectrozyme t-PA, A American Diagnostics) and described in Example 1. I went as I did. Kinetic analysis of plasminogen activation using an indirect chromogenic assay An indirect chromogenic assay for t-PA was performed using the substrate lys-plasminogen (Ame). Rician Diagnostica) and Spectrozyme PL (Amer ican Diagnostica) and described in Example 1 above. I went as follows. Cofactor DESAFIB (American Diagnostic) The assay was performed both in the presence and absence of stica). Indirect chromogenic assay in the presence of various fibrin cofactors A standard indirect chromogenic assay was performed. Conveniently, 0. 25-1 ng enzyme, 0.2 μM lys-plasminogen and 0.62 m M streptzyme PL was present in a total volume of 100 μl. 25 μl / mlD ESAFIB, 100 μg / ml fibrinogen, 100 μg / ml fibrin Cyanogen bromide fragment of Linogen (American Diagnostica) ) In the presence of a buffer, or 100 μg / ml stimulant, 13 amino acids Assays were performed with any of the peptides P368. P368 is a Marsha II Runge (University of Texas Medical Center in Galveston, TX) Therefore it was kindly provided. Perform the assay in a microtiter plate and The optical density at 05 nm was measured every 30 seconds for 1 hour with a molecular instrument Thermomax. Was. The reaction was performed at 37 degrees Celsius. Determination of second order rate constants for inhibition by PAI-1 Second order rate constants for inhibition of wild-type and mutated t-PA were Measured under pseudo-primary conditions as described in Example 1. Using oligonucleotide indirect site-directed mutagenicity, single-stranded tP Lys429 of t-PA in which the catalytic activity of A was selectively suppressed was produced. Ricin 4 29 was converted to a tyrosine residue to yield t-PA / K429Y. Furthermore, one Plasminogen of this variant in its main-chain form In order to allow an accurate measurement of the enzymatic activity on the E was constructed by constructing an existing noncleavable form of the mutant enzyme to produce the R275E, K429Y Generated variants. Wild-type t-PA, t-PA / R275E, t-PA / K429Y and t-P A / T275E, K429Y was expressed in COS1 cells as described in Example 1. It was expressed by a transient expression vector. This means that single-stranded enzymes are given priority in advance. The double-stranded t-PA is treated with plasmin-sepharose to process the enzyme preparation. Generated by processing. Quantitative conversion of enzymes to their mature double-stranded form The conversion was confirmed by SDS-PAGE. As illustrated earlier, A mutant containing the mutation R275E is synthesized and exclusively secreted as a single-chain enzyme. And was not cleaved by plasmin-sepharose. Table VI Single and double stranded t-PA mutant chromogenic substrate streptozyme t-PA Kinetic constants for cutting Enzymes of single- and double-stranded forms of wild-type and t-PA on small synthetic substrates The elementary activities are listed in Table VI above. The mutation in ricin 429 is a double-stranded tP A had little effect on the activity of A. The double-stranded t-PA / K429Y has this The assay showed approximately 90% of the activity of the double-stranded wild-type enzyme. Conversely, K42 The 9Y mutation had a very substantial effect on the activity of single-chain t-PA. Single strand t-PA / R275E, K429Y is an activity of single-chain t-PA / R275E. It showed about 2%. In this study, the double-strand versus single-strand forms of certain enzymes Zymogenicity, defined as the ratio of the activities of . It was 5. Conversely, for variants containing the K429Y mutation, this ratio is , Increased to approximately 117 (Table VI). In the absence of a cofactor, the K429Y mutation was associated with plasminogen. It had little effect on the activity of double-stranded t-PA. However, this mutation Significantly reduced the catalytic efficiency of single-chain t-PA (Table VII below). Single strand t Single-chain t-PA / R275E, K42 compared to that of PA / R2725E The activity of 9Y was reduced by a factor of 17. Conversely, double-stranded t-PA and t-PA The activity of PA / K429Y differed by only a factor of 1.2. Table VII Plasminogen by t-PA single- and double-stranded in the absence of cofactor Kinetic constants for the activation of metals All of the variants analyzed in this study were cultivated in the presence of cofactor fibrin. The enzymatic activity on the natural substrate plasminogen remained fairly high (see Table VIII below). ). However, the single stranded form of the mutant containing the K429Y mutation was Affected a slightly larger range than the main-chain enzyme. Double-stranded t-PA / K429 Y retains approximately 75% of the activity of double stranded t-PA while single stranded t-PA / R275E, K429Y is approximately 40% of the activity of single-chain t-PA / R275E. %showed that. Table VIII Plasminnow by single- and double-stranded t-PA mutants in the presence of fibrin Kinetic constants for gen activation. Fibrin represented by t-PA / R275E, K429Y in single-stranded form The extent of stimulation is significantly greater than that exhibited by wild-type t-PA. wild Type of double-stranded t-PA is the ratio of catalytic efficiency in the presence and absence of fibrin. (Table IX below). two The chain t-PA / K429Y mutant shows 230 similar stimulators. Mold mechanism Through the introduction of non-proteolytic zymogen activation, While possibly affecting the ability of fibrin to stimulate single-stranded enzymes, 00 single-stranded wild-type t-PA exhibiting a fibrin stimulating factor of 00 To a large extent. By the K429Y mutation, single-stranded t-PA Stimulation was further increased. About single-chain t-PA / R275E, K429Y Is approximately 26,000. Mutant fibrin stimulation Increased did not result from increased activity in the presence of fibrin, but rather stinging Arising from the reduced activity in the absence of stimulant, observations indicate that the effects of these mutations It is mediated by interruption of the salt bridge between Lys429 and Asp477 Closely connected to our purpose. Table IX Stimulating effect of fibrin on catalytic efficiency for mutants of t-PA Mutant enzymes t-PA / R275E and K429Y are more soluble than t-PA. Not only is it significantly stimulated to a large extent by Blin (Table IX above), but also wild Substantial further discrimination within the fibrin cofactor than the type enzyme (FIG. 2). two Both chain forms of wild-type t-PA and t-PA / K429Y are soluble fibrils. Monomer (DESAFIB), fibrinogen, CNB of fibrinogen It is strongly stimulated by the r fragment and the 13 amino acid peptide (P368). On the other hand, Single-chain t-PA / R275E is derived from soluble fibrin and fibrinogen. And strongly stimulated by CNBr fragments and peptide P368 Stimulated every time. Attacks on these enzymes play a role in fibrin monomers Although single-stranded t-PA / P275E, K429Y is stimulated by fibrin Substantially, against the CNBr fragment of fibrinogen, peptide P368 No response. For those in the presence of fibrinogen, or "fibrin selectivity factor" The specific activity ratio of a plasminogen activator in the presence of fibrin It is one indicator of "clot selectivity" as shown in vivo. Enhanced fibrin Selective enzymes can achieve adequate thrombolysis while reducing systemic activity. It shows that. Fibrin selectivity under the conditions of the assay reported here Is 1.5 for double-stranded t-PA and 1.5 for double-stranded t-PA / K429Y. Is 1.5 and for single-chain t-PA / R275E is 1.0. But one The fibrin selectivity factor for the main chain t-PA / R275, K429Y is 14 6. Therefore, this double mutant is single-stranded or double-stranded wild-type t- More distinction between fibrin and fibrinogen than any of PA Of the order of two digits. The zymogen-like mutant in a single-chain form of t-PA is the substrate (Tables VI and VIII above) To show that the activity is reduced not only against but also against certain inhibitors Is predicted. Serpi, a primary physiological inhibitor of type I (PAI-1) t-PA Plasminogen activator blocker Single chain forms of t-PA / R275E and t-PA / R275E, K Second order rate constants that inhibit both 429Y are shown in Table X below. Predicted As shown, t-PA / R275E, K429Y inhibits PAI-1 inhibition. Resistance. Second order rate constants were compared to t-PA / R275E. Table X Inhibition of wild-type and variants of t-PA by PAI-1 An important finding in this study is that the conversion of lysine 429 to a tyrosine residue is single-stranded. It selectively inhibits the activity of t-PA, thereby substantially reducing the enzyme zymogen. It is to reinforce it. In addition, we report that single-stranded t-PA / R275E, K4 29Y stimulates fibrin more prominently and is single- or double-stranded. It is substantially more fibrin selective than any of the wild-type t-pA. One The chain t-PA / R275E, K429Y also stands out against inhibition by PAI-1. It shows resistance. The effect of this mutation is present in single-stranded but double-stranded t-PA. Lys429 and Asp4 assumed to be absent It is thought to be mediated by the interruption of the important salt bridge formed by 77. This The primary role of the salt bridge is to reduce the active conformation of single-chain t-PA. It is considered to be stabilization. Therefore, double-stranded t-PA / K429Y is It is expected that high enzymatic activity will be maintained, as illustrated in the examples. This result aids in the design of an improved thrombolytic agent. For example, t-PA / R275E and K429Y show markedly enhanced fibrin stimulation, Dramatically increased discrimination by factor and increased resistance to inhibition by PAI-1 A combination of properties that indicate to stand and substantially increase the therapeutic utility of the enzyme Increased zymogenicity. The preceding is intended to be illustrative of the invention and not limiting. . Numerous variations and modifications of the present invention depart from the spirit and scope of the present invention. It can be effective without.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) // (C12N 9/64 C12R 1:91) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, HU ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL , PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW

Claims

[Claims] 1. R275 and a serine protein substituted by a non-basic amino acid residue It has at least one other basic amino acid residue in the Mutation in which the salt-bridge interaction between platinic acid 477 and lysine 429 is disrupted -Chain human tissue-type plasminogen activator protein. 2. Non-basic amino acid residues are glycine, serine, threonine, asparagine, Select from the group consisting of tyrosine, glutamine, aspartic acid and glutamic acid 2. The protein of claim 1, wherein said protein has a zymogenicity of at least 10. 3. 2. The protein of claim 1, having at least 50 zymogenic properties. 4. 2. The protein of claim 1, having zymogenicity of at least 100. . 5. 2. The method of claim 1, having a fibrin stimulation factor of at least 10,000. Protein. 6. 2. The method of claim 1, having a fibrin stimulation factor of at least 20,000. Protein. 7. 2. The method of claim 1, having a fibrin stimulation factor of at least 10,000. Protein. 8. 3. The method of claim 2, having a fibrin stimulation factor of at least 20,000. Protein. 9. 4. The method of claim 3, having a fibrin stimulation factor of at least 20,000. Protein. 10. The protein is a wild-type single-chain human tissue-type plasminogen activator. Inhibition by PAI-1 is more than at least a factor of 5 2. The protein of claim 1, which is low. 11. The protein is a wild-type single-chain human tissue-type plasminogen activator. Inhibition by PAI-1 is greater by at least a factor of 9 compared to 2. The protein of claim 1, which is low. 12. The protein is a wild-type single-chain human tissue-type plasminogen activator. Inhibition by PAI-1 is at least a factor of 200 compared to 2. The protein of claim 1, which is lower. 13. The protein is a wild-type single-chain human tissue-type plasminogen activator. Inhibition by PAI-1 is greater by at least a factor of 9 compared to 9. The protein of claim 8, which is low. 14． The protein is a wild-type single-chain human tissue-type plasminogen activator. Inhibition by PAI-1 is at least a factor of 200 compared to 9. The protein of claim 8, which is lower. 15. A protein wherein the protein has a fibrin selectivity coefficient of at least 100; The protein according to claim 1. 16. The protein is at least 100 fibri 9. The protein of claim 8, having a selectivity factor. 17． A protein wherein the protein has a fibrin selectivity coefficient of at least 100; 15. The protein according to claim 14. 18. A polynucleotide encoding the protein of claim 1. 19. An expression vector comprising the polynucleotide of claim 18. 20. A cell comprising the expression vector of claim 19. 21. R275E, H417D. R275E, H417E and R275E, Mutated single-chain human tissue-type plasminogen selected from the group consisting of K429Y Inactivator protein. 22. A polynucleotide encoding the protein of claim 21. 23. An expression vector comprising the polynucleotide of claim 22. 24. A cell comprising the expression vector of claim 23. 25. A physiologically effective amount of the tamper of claim 1 in a pharmaceutically suitable excipient. A composition for the treatment of a thrombotic condition, comprising a substance. 26. The dose of the protein is from about 0.05 mg / kg body weight to about 0.2 mg / kg. 26. The composition of claim 25, which is up to kg body weight. 27. A diagnostic kit comprising an antibody against the protein of claim 1. 28. A diagnostic kit comprising the protein of claim 1. 29. A polynucleotide capable of hybridizing to the polynucleotide of claim 18. A diagnostic kit comprising a nucleotide. 30. A mutant single-chain human tissue-type plasmid comprising culturing the cell of claim 24. A method for producing a suminogen activator protein. 31. 31. The method of claim 30, further comprising the additional step of purifying the protein. the method of.