JP2001505220A - 腫瘍の治療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （i）第一の化合物、（ii）腫瘍抗原に特異的に結合しないが、哺乳動物の血管コンパートメントに投与した後哺乳動物の腫瘍に吸収することができ、かつ第一の化合物を第二の化合物に転換することができる、触媒性巨大分子、ならびに(iii)上記の血管コンパートメントに投与した後、血管コンパートメントでの上記の触媒転換活性のレベルを減少させる阻害剤、を含んでなる３成分治療薬系。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍の治療法発明の背景 薬剤、放射性同位体および毒素を用いる癌のターゲッティングでは、腫瘍関連 抗原に指定された抗体またはこれらの抗体の断片が用いられてきた。一般に、腫 瘍関連抗原に指定された抗体は、腫瘍細胞への結合に既知の根拠を全く持たない あらゆる種類の他の分子より効果的に腫瘍に蓄積する。腫瘍マス内での分子の蓄 積の過程およびそれらの分布に影響を与える要因は、様々な著者によって報告さ れている（Jain，１９８９年、Szerkerke & Driscoll，１９７７年）。ヒトの癌 異種移植片を有するヌードマウスでの腫瘍１ｇ当たりの投与量の百分率として表 した抗体値は、通常は２〜１０％の範囲となる。ヒトでは、この値は約１０００ 分の１であるが（March et al.，１９８０年、Dykes et al.，１９８７年）、身 体質量に比例して投与量を増加することによって腫瘍中の抗体濃度がマウスモデ ルで得られた値に匹敵する値になる。 薬剤を抗体または抗体断片に結合することによって調製した接合体は、通常の 薬剤投与よりも効果が大きいことが記載されているが（Garnett & Baldwin，１ ９８６年）、いずれもこれまでのところは臨床的に受け入れられるに至っていな いのである。抗体のような大分子は、通常の遊離薬剤の投与によって送達するこ とができるより少量の薬剤を送達する傾向を有するが、これは、結合活性を損失 せずに抗体に結合することができる薬剤の量は限定されており、大きなサイズの 抗体では、腫瘍に結合する抗体の量が限定されており、抗体−薬剤接合体は薬剤 を放出するのにインターナリゼーションを必要とすることが多いからである。 この薬剤送達の限界を克服するため、酵素が腫瘍部位に局在化する時間経過の 後、酵素の基質であり、触媒作用の最終生成物が細胞毒性化合物であるプロドラ ッグを投与するコンセプトが提案されている。この方法の目的は、腫瘍内部の薬 剤の濃度を最大にし、正常組織の薬剤の濃度を最小限にすることである。この系 は、「抗体指定酵素プロドラッグ療法(antibody directed enzyme prodrug ther apy)」（ＡＤＥＰＴ）として記載されている。ＡＤＥＰＴ法の開発の最初から、 解決しなければならない３つの主要な問題があることは明らかであった（Bagsha we，１９８９年）。第一の問題は、半減期が短く、腫瘍部位から漏れ出し、次い で骨髄のような傷付きやすい正常組織に影響を与える薬剤の量を最小限にする薬 剤を生じるプロドラッグが必要なことであった。第二に、プロドラッグは正常組 織中に細胞毒性薬剤を生成することがあり投与量が限定されるので、プロドラッ グを投与するときには酵素が正常組織中に含まれないようにする必要があった。 第三に、ヒトの相同器官を持たないヒト以外の種から誘導された酵素を接合して 、内在性酵素による活性化を回避するようにするのが有利であることが認められ た。しかしながら、細菌性酵素によって得られた作用の特異性により、免疫原性 が高いという問題点などがあった。 ＡＤＥＰＴ法に作成した初期のプロドラッグは、半減期が長い薬剤を生じたが 、半減期が短い薬剤を生じるプロドラッグが続いて開発された（Blakey et al. ，１９９６年、Jungheim & Shepherd，１９９４年）。 プロドラッグを投与するときに血液および正常組織中に酵素がほとんどまたは 全く含まれないようにする問題点には、様々な可能な解決法が見られた（Sharma et al.，１９９４年）。有効であることが明らかになっている一つの方法は、 抗体−酵素接合体が腫瘍中で局在化した後でかつプロドラッグを投与する前に酵 素を指定したモノクローナル抗体を投与することであった（Bagshawe，１９８９ 年、ＷＯ８９／１０１４０号明細書、Sharma et al.，１９９４年）。酵素を不 活性化する抗体が、最も有効であることが明らかになった。このような抗体は、 血中、正常組織中、および腫瘍部位で酵素を不活性化することができた。血中か らの酵素不活性化抗体のクリアランスを促進することにより腫瘍の浸透を最小限 に抑えるため、追加のガラクトース残基を抗体に結合させた。ガラクトシル化し た抗酵素抗体を投与すると、ガラクトシル化抗体およびそれと抗体−酵素接合体 との間に形成された複合体の血中からのクリアランスが速やかとなった。この証 拠は、ガラクトースレセプターを発現する肝細胞によって吸収される抗酵素抗体 および複合体と一致している。抗体−酵素接合体に続いてガラクトシル化抗酵素 抗体を投与されたヌードマウスから取り出した腫瘍では、血中の酵素活性が用い ている分光光度分析法の検出限界以下の値に速やかに減少したが、酵素活性に有 意な減少は見られなかった。臨床的に用いると、酵素活性の血中クリアランスに ついての結果は、マウスで得られたものと同様であった。 基本的なＡＤＥＰＴ法の幾つかの変法があった。ＷＯ９３／１３８０５号明細 書(Bagshawe)では、酵素は、細胞毒性の高くないプロドラッグをより細胞毒性の 高い薬剤へ転換する代わりに、細胞毒性化合物の全身的に提供される阻害剤を阻 害作用の余り高くない化合物に局所的に転換した。ＷＯ９３／１３８０６号明細 書(Bagshawe)では、細胞毒性化合物の阻害剤（ＡＤＥＰＴ法によって局所的に生 成した）血管コンパートメントに拘束されており、細胞毒性化合物は、腫瘍部位 から離れるときに阻害または不活性化された。 これらのＡＤＥＰＴ型の公表物のいずれにおいても、酵素の腫瘍への送達は、 腫瘍特異的抗体またはその断片または変異体を用いることによって達成された。 腫瘍関連抗原に指定された抗体およびその断片は、同じ抗体または断片の正常 組織での濃度と比較して測定すると、あらゆる他の種類の分子よりも高濃度で標 的抗原を発現する腫瘍部位に蓄積するが、巨大分子は腫瘍に非特異的に蓄積する ことが以前から知られていた（Duran-Reynolds，１９３９年）。この巨大分子の 非特異的蓄積は、実際には腫瘍関連抗原に指定された抗体の好ましい腫瘍：非腫 瘍分布における１成分である。腫瘍に非特異的に蓄積することが知られている巨 大分子としては、アルブミン、免疫グロブリン、トランスフェリン、リポソーム 、ナノ粒子、およびデキストラン、ポリエチレングリコール、ポリリシンおよび ヒドロキシプロピルメチルアクリルアミドのような生物分解性ポリマーが挙げら れる。巨大分子は、ヌードマウス中のヒト異種移植腫瘍に、腫瘍１ｇ当たり投与 量約２．０％まで蓄積する。ポリエチレングリコールおよびデキストランのよう な巨大分子は、それらが結合する物質のクリアランス速度を改良し、腫瘍中のそ れらの濃度を改良することが見出だされている（Melton et al.，１９８７年、E no-Amooquaye et al.，１９９６年）。例外的な腫瘍では、非特異的巨大分子が 分泌抗原に指定された抗体より高濃度で蓄積することがある（Searle et al.， １９８１年）。 このような巨大分子が固形主要組織に蓄積するという発見は「強化浸透性およ び保持(enhanced permeability and retention)」効果（ＥＰＲ効果）と呼ばれ ており、腫瘍毛細血管の「漏れ易さ」(leakiness)および不完全リンパドレナー ジによるものである（Matsumura，Y．& Macda，H.，１９８６年）。 巨大分子は薬剤のキャリヤーとして用いられており（Blair & Ghose，１９８ ３年）、巨大分子に結合した薬剤が遊離の薬剤よりも優れた効力を有することが 主張されている（Duncan et al.，１９８８年）。部分的には、その優れた効力 により接合薬剤の毒性が減少したことに基づいている。腫瘍と非腫瘍組織との間 における巨大分子の蓄積差は、巨大分子によって送達される薬剤の濃度が遊離薬 剤の投与によって送達される濃度を超過することができないことがある。これは 、巨大分子に結合することができる薬剤分子は一定数であり、低分子量薬剤と比 較して任意の組織に送達することができる巨大分子の数は更に少ないことに由来 しており、すなわち巨大分子のモル濃度は低めである。これが、この分野で活動 している人々が、ＡＤＥＰＴ法において酵素を送達するために巨大分子の非特異 的 摂取を用いることを想定しなかった理由とすることができる。 Jacquesy et al.の米国特許第５，５６１，１１９号明細書は、グリコシル化 プロドラッグ、およびそれらの癌の治療のための腫瘍特異的免疫酵素接合体との 使用に関する。 Seymour（1992）Crit．Rev．Ther．Drug Carrier Systems 9，135-187には、 腫瘍における可溶性巨大分子と薬剤接合体の蓄積が記載されている。 欧州特許第０ ０２８ ９１７号明細書には、脂質小泡を用いるトレーサー分 子または薬剤の送達が記載されている。これらの小泡は、リンパ系および／また は肺、牌臓または肝臓に優先的に蓄積される。 欧州特許第０ １４２ ９０５号明細書には、腫瘍細胞に対する免疫ターゲッ ティングの限界、特に腫瘍細胞の不均一性によって引起こされるものが、記載さ れており、免疫ターゲッティングを用いて細胞毒性化合物を腫瘍領域へ送達する 方法であって、毒性効果が適当な抗原を有する細胞に限定されない方法を示唆し ている。 ＷＯ９１／０８７７０号明細書には、腫瘍部位における診断または治療薬の蓄 積であって、この蓄積が、抗体が選択的に結合することができる部位に固定され た抗体酵素接合体による可溶性基質−薬剤複合体の開裂の結果であること、が記 載されている。 カナダ国特許CA第１ ２２７ ４２７号明細書には、コンドロイチンポリスル フェート、トリプシンおよびシクロホスファミド(cyclosphosphamide)の投与に よる腫瘍の発達に対する相乗効果が記載されているが、これら３種類の薬剤は腫 瘍で連結せずかつ蓄積されないことが記載されていない。 Pimm & Hudecz（1996）J．Cancer Res．Clin．Oncol．122，45-54には、マウ スでの放射能標識した巨大分子の分布が記載されている。 ＷＯ９２／１３５７０号明細書は、真核細胞による核酸の吸収を促進する複合 体に関する。 ポリマーの形態での巨大分子は、Ｌ−アスパラギナーゼ（Kneating et al（19 93）Leukaemia Lymphoma 10，153-157）、ウリカーゼ（Chuma et al（1988）Ann als Int．Med．109(2)，114-117）、フェニルアラニン(phenylalanmine)アンモ ニアリアーゼ（wieder et al（1979）J．Biol．Chem．254，12579-12587）、グ ルタミナーゼーアスパラギナーゼ（Abuchowski et al（1981）Cancer Treat．Re p．65，1077−1081）、およびトリプトファナーゼ（Yoshlmoto et al（1985）En zyme 36，261）などの酵素に結合させた。これら総ての例において、目的は、酵 素に組織中の天然に存在する基質に効果を発揮させることであった。発明の概要 本発明者は、腫瘍による巨大分子の非特異的（ＥＰＲ効果）吸収が、系のＡＤ ＥＰＴ型において適当な濃度の酵素を送達するのに十分であり、酵素−巨大分子 接合体が腫瘍から離れているときには除去されまたは阻害される場合には、腫瘍 関連細胞毒性薬剤対非腫瘍関連薬剤の適当な比を得ることができることを見出だ した。この方法は、上記のＡＤＥＰＴ系のいずれ適用することもできるが、ＤＭ ＥＰＴ（巨大分子指定酵素プロドラッグ療法）と呼ぶべきかもしれない。 従って、本発明の一つの態様では、（i）第一の化合物、（ii）腫瘍抗原に特 異的に結合しないが、哺乳動物の血管コンパートメントに投与した後哺乳動物の 腫瘍に吸収することができ、かつ第一の化合物を第二の化合物に転換することが できる、触媒性巨大分子(catalytic macromolecule)、および(iii)上記の血管コ ンパートメントに投与した後、血管コンパートメントおよび正常組織での上記の 触媒転換活性のレベルを減少させる阻害剤、を含んでなる３成分治療薬系、が提 供される。 「腫瘍」という用語は、肺、肝臓、血液細胞、皮膚、膵臓、胃、結腸、前立腺 、子宮、乳房、リンパ節および膀胱の腫瘍などの総ての形態の腫瘍性細胞成長を 表 すものと理解すべきである。固形腫瘍が特に適当である。 この目的に非抗体巨大分子を用いることの潜在的な利点は、相当なものである 。第一に、非免疫原性である非特異的巨大分子を選択することができる。第二に 、巨大分子は、ヒューマナイズド(humanised)抗腫瘍抗体よりも遥かに廉価に生 成させることができる。第三に、ポリマーによっては、それらに結合した酵素な どのタンパク質の免疫原性を減少または除去することが示されている（Abuchows ki et al.，１９７７年、Wileman et al.，１９８６年、Mikolajczyk et al.， １９９６年）。第四に、抗体は限定された範囲の癌だけに結合する（抗体は全悪 性腫瘍の約６０％に対してだけ存在する）が、巨大分子の腫瘍による吸収はこれ までに検討を行った総ての固形癌に共通な特徴であると思われる。 従って、選択的抗体がこれまで報告されていない肉腫のような多くの腫瘍は、 この原理でターゲッティングすることができる。 正常組織酵素のレベルが例えばガラクトシル化抗酵素抗体を用いることによっ て阻害される場合にのみ、非特異的巨大分子を有する腫瘍と非腫瘍組織との間の 差異が比較的低いことを利用することができる。酵素が非特異的巨大分子に接合 しているときに、所要量の酵素を腫瘍部位に送達するには、特異的な抗体−酵素 接合体を用いる場合よりも多量の接合体を投与する必要があるが、前者の方が廉 価であることによりその効力が低いことが相殺されることとなる。 好ましくは、本発明で用いられる巨大分子は親水性であり、かつ体液および非 経口投与のための通常の流体に可溶性であることを特徴とする。適当なことには 、巨大分子は生物分解性であって、反復投与による全身的蓄積が回避される。し かしながら、これは分解が速過ぎて腫瘍部位に蓄積することができないものであ ってはならないことは明らかである。好ましくは、選択された酵素に接合すると 、血中濃度を有効血液：腫瘍濃度勾配を提供するのに十分とするのに役立つので 、接合体の分子量および大きさは、尿中排泄の腎閾値（分子量６０，０００）を 上 回る。少なくとも８００，０００まで、例えば１６０，０００までの分子量が、 一般に適当である。巨大分子は、好ましくは網内皮細胞系によって容易に捕捉さ れないものである。これを触媒性にするため、巨大分子を単純な化学的方法によ って、結合した酵素を分解しない二官能価化合物を用いて１以上の酵素分子に接 合することができる。好ましくは、出発巨大分子は、これが接合する免疫原性酵 素に対する免疫原性が減少する。 与えられた分子量は、水和水を総て除外している。 サブユニットとして利用できかつ生物分解性でない巨大分子を生物分解性結合 単位によって結合して、非生物分解性成分を腎臓で濾過して、尿中に排泄するこ とができる。 あるいは、巨大分子を作成するのに用いられるポリマーが生物分解性でない場 合には、接合体の任意の非生物分解性部分の分子量は腎閾値（約７０，０００） 未満とし、生物分解性部分の分解の後、残りの非生物分解性部分が腎臓から排泄 されるようにするのが好ましい。 幾つかの巨大分子は、細胞によってインターナリゼーションされることが知ら れていないが、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミドのような 他のものは２種類以上の機構によってインターナリゼーションされる（Duncan e t al.，１９９６年）。 巨大分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるのが好ましい。タンパ ク質のポリエチレングリコールによる誘導体形成により、それらの血中寿命を増 加させ、かつそれらの抗原性および免疫原性を減少させることが何度も示されて いる。多種多様な方法がＰＥＧをタンパク質にカップリングさせる目的で開発さ れており、これらは第１表にまとめている。 好都合なことには、巨大分子は、デキストラン、ポリアミノ酸、または免疫グ ロブリン、アルブミンまたはトランスフェリンのような非腫瘍特異的タンパク質 のいずれであってもよい。これは、スチレンと無水マレイン酸のコポリマーであ ることができ、またはポリアスパラギン酸、ポリ−Ｌ−リシンまたはポリエチレ ンイミンであることが適当である。 触媒性巨大分子は、腫瘍に特異的ではない。従って、例えば、これは抗体また はその部分であって、腫瘍関連抗原に特異的に結合するものからなっていない。 しかしながら、これは非特異的免疫グロブリンを含んでなることができる。 酵素を腫瘍部位にターゲッティングするために非抗体巨大分子を用いることが できることの利点は、腫瘍に配置された酵素の他の応用にも敷行される。分子に よっては、特に幾つかのポリマーは、腫瘍細胞によって容易にインターナリゼー ションされ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ホスフ ェート）の還元型）のような細胞内補助因子を必要とするニトロレダクターゼの ような酵素を利用して、これもまたインターナリゼーションされるプロドラッグ を活性化し、これらを極めて強力な細胞毒性物質に転換することが知られている 。従って、このような細胞毒性化合物は、巨大分子である酵素およびプロドラッ グをインターナリゼーションする細胞を殺し、十分な毒性薬剤を細胞内空間に放 出して、隣接細胞にとって致死量である細胞毒性薬剤の濃度を得ることができる （１９９５年１２月２９日に出願された米国特許出願第６０／００９，３６１号 明細書であって、その内容は、その開示の一部として本明細書に引用され、ＷＯ ９７／２４１４３号明細書；ＰＣＴ／ＧＢ９６／０３２５４として公表されてい るものを参照されたい）。例えば、接合体は、E．coliニトロレダクターゼと巨 大分子（例えば、ヒドロキシプロピルメチルアクリルアミド）との間に形成する ことができ、これは細胞中でインターナリゼーションされる。 場合によっては、血管内二トロレダクターゼを（例えば、抗ニトロレダクター ゼ抗体、好ましくはポリガラクトシル化体で）不活性化または除去した後（下記 も参照されたい）、プロドラッグＣＢ１９５４（Knox et al（1993）Cancer & M etastasis Rev．12，195-212）を投与して腫瘍細胞中で選択的に活性化させるが 、（i）腫瘍細胞は高濃度のニトロレダクターゼを含み、（ii）ニトロレダクタ ーゼは、（細胞内）補助因子ＮＡＤ（Ｐ）ＨまたはＮＲＨ（ニコチンアミドリボ シド）の存在下でのみ機能するからである。アクチノマイシンＤのベンジルオキ シカルボニル誘導体をプロドラッグ（アクチノマイシンＤを放出する、Mauger e t al（1994）J．Med．Chem．37，3452-3458を参照されたい）としてこのレダク ターゼを基剤とした系と共に用いることもできる。 本発明の好ましい態様では、ヒト酵素ＮＱＯ２が用いられる。ＮＱＯ２はＮＡ Ｄ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ２であり、ＣＢ１９５４（５−（アジ リジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミド）のようなプロドラッグと 組合せた腫瘍標的療法でのその使用は、親出願ＧＢ９７１２３７０．７号明細書 に記載されており、上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に 引用される。好ましくは、この態様では、ニコチン酸のような細胞から除外され る補助因子が用いられる。 ヒトＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンレダクターゼ２（ＮＱＯ２）をコードするｃＤＮ ＡはJaiswal et al（1990）Biochemistry 29，1899-1906に記載されており、Ｎ ＱＯ２遺伝子の遺伝子構造はJaiswal（1994）J．Biol．Chem．269，14502-14508 に記載されており、上記特許明細書の内容はいずれも、その開示の一部として本 明細書に引用される。技術者であれば、周知であり、その幾つかはSambrook et al(1989)，「分子クローニング、実験室マニュアル(Molecular cloning，a labo ratory manual)」，Cold Spring Harbor Laboratory Press，コールド・スプリ ング・ハーバー，ニューヨークに記載されている遺伝子工学および組換えＤＮＡ 技術を用いて本明細書に記載の教示に基づいてＮＱＯ２をコードするＤＮＡを容 易に得て、操作することができる。 ＮＱＯ２の変異体または断片または融合体または誘導体を、所定のプロドラッ グに対してＮＱＯ２と実質的に同じ活性を有する場合には、所定のアミノ酸配列 を有するＮＱＯ２の代わりに用いることができる。酵素ＮＱＯ２は、例えばプロ ドラッグＣＢ１９５４およびそのプロドラッグ類似体の転換を触媒する。従って 、好ましくは、ＮＱＯ２の変異体または断片または融合体または誘導体は、ＮＱ Ｏ２自身と実質的に同じＣＢ１９５４に対する活性を有する。好都合には、上記 の変異体または断片または融合体または誘導体は、ＮＱＯ２のｋ_cat／Ｋ_mが少な くとも０．１×であり、更に好ましくは少なくとも０．５×であり、更に一層好 ましくはＮＱＯ２のｋ_cat／Ｋ_mが少なくとも０．９×である。 好ましくは、ＮＱＯ２の変異体または断片または融合体または誘導体は、補助 因子特異性も実質的に同じである。好ましくは、ＮＱＯ２の変異体または断片ま たは融合体または誘導体は、ニコチン酸を補助因子として用いることができる。 好ましくは、ＮＱＯ２の変異体または断片または融合体または誘導体は、ＮＱＯ ２自身の少なくとも０．１×、更に好ましくは少なくとも０．５×、更に一層好 ましくは少なくとも０．９×で補助因子と結合する。 好ましくは、プロドラッグのＮＱＯ２による活性化は細胞内空間で起こり、細 胞中にインターナリゼーションされないニコチン酸のような補助因子が用いられ る。 本発明を基本的ＡＤＥＰＴ法または上記の開発法のいずれかに適用するときに は、酵素およびプロドラッグ系は、以前に提案されたもののいずれであってもよ い。細胞毒性物質は、アルキル化剤、ＤＮＡ中に挿入する化合物、ジヒドロ葉酸 レダクターゼ、チミジンシンターゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、ヌクレオ シドキナーゼまたはトポイソメラーゼのような任意のキー酵素を阻害する化合物 、または任意の他の細胞成分と相互作用することによって細胞死をもたらす化合 物のような任意の現在用いられている抗癌薬剤であることができる。エトポシド は、トポイソメラーゼ阻害剤の一例である。 報告されているプロドラッグ系としては、E．coli β−グルクロニダーゼによ って活性化されるフェノールマスタードプロドラッグ（Wang et al.，１９９２ 年、およびRoffler et al.，１９９１年）、ヒトβ−グルクロニダーゼによって 活性化されるドキソルビシンプロドラッグ（Bosslet et al.，１９９４年）、コ ーヒー豆α−ガラクトシダーゼによって活性化される他のドキソルビシンプロド ラッグ（Azoulay et al.，１９９５年）、コーヒー豆α−Ｄ−ガラクトシダーゼ によって活性化されるダウノルビシンプロドラッグ（Gesson et al.，１９９４ 年）、E．coli β−Ｄ−ガラクトシダーゼによって活性化される５−フルオロウ リジンプロドラッグ（Abraham et al.，１９９４年）、およびカルボキシペプチ ダーゼＡによって活性化されるメトトレキセートプロドラッグ（例えば、メトト レキセートアラニン）（Kuefner et al.，１９９０年、Vitols et al.，１９９ ２年、およびVitols et al.，１９９５年）が挙げられる。これらおよび他のも のは、下表に含まれている。（この表は、Bagshawe（1995）Drug Dev．Res．34，220-230からの翻案であり、 これらの各種の系についての詳細な文献をこれから得ることができ、タキソール 誘導体はRodrigues et al(1995)に記載されている。） 本発明の触媒性巨大分子の部分を形成するのに適当な酵素としては、カルボキ シペプチダーゼＧ、Ｇ１およびＧ２（グルタミル化マスタードプロドラッグにつ いて）、カルボキシペプチダーゼＡおよびＢ（ＭＴＸを基剤とするプロドラッグ について）、およびアミノペプチダーゼ（２−α−アミノシルＭＴＣプロドラッ グについて）のようなエキソペプチダーゼ；例えば、トロンボリシン（トロンビ ンプロドラッグについて）のようなエンドペプチダーゼ；ホスファターゼ（例え ば、アルカリホスファターゼ）またはスルファターゼ（例えば、アリールスルフ ァターゼ）のようなヒドロラーゼ（ホスフィル化またはスルフェート化プロドラ ッグについて）；ペニシリンアミダーゼおよびアリールアシルアミダーゼのよう なアミダーゼ；β−ラクタマーゼのようなラクタマーゼ；β−グルクロニダーゼ （β−グルクロノミドアントラサイクリンについて）、α−ガラクトシダーゼ（ アミグダリンについて）およびβ−ガラクトシダーゼ（β−ガラクトースアント ラサイクリンについて）のようなグリコシダーゼ；シトシンデアミナーゼ（５Ｆ Ｃについて）のようなデアミナーゼ；ウロキナーゼおよびチミジンキナーゼ（ガ ンシクロビールについて）のようなキナーゼ、ニトロレダクターゼ（ＣＢ１９５ ４および類似体について）、アゾレダクターゼ（アゾベンゼンマスタードについ て）、およびＤＴ−ジアホラーゼおよびＮ２０ Ｎ２０２（いずれもＣＢ１９５ ４について）のようなレダクターゼ；グルコースオキシダーゼ（グルコースにつ いて）、キサンチンオキシダーゼ（キサンチンについて）およびラクトペルオキ シダーゼのようなオキシダーゼ；ＤＬ−ラセマーゼ、触媒抗体、およびシクロデ キストリンが挙げられる。 巨大分子の触媒部分、典型的には酵素またはその部分は、巨大分子の残りから の単離において活性であると思われるが、（a）これが巨大分子の残りと組み合 わされており、（b）触媒性巨大分子が標的細胞に結合、隣接またはインターナ リゼーションしているときにのみ活性であることが必要である。 触媒性巨大分子の２個の官能基は、その離れた部分に配置することができる。 このそれぞれの部分がポリペプチドであるときには、２個の部分は、O'Sullivan et al（1979）Anal．Biochem．100，100-108に概説的に記載されているような 通常の方法の架橋のいずれかによって互いに結合することができる。例えば、ポ リペプチド部分はチオール基の濃度を高くし、酵素部分は例えばヨード酢酸のＮ −ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＩＡ）またはＮ−スクシンイミド−３−（２ −ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のようなチオール基と反応する ことができる二官能価化合物と反応させることができる。例えばｍ−マレイミド ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで得られるアミドおよびチ オエーテル結合は、一般にイン・ビボではジスルフィド結合よりも安定である。 あるいは、化合物を組換えＤＮＡ技術によって融合化合物として生成させ、Ｄ ＮＡの長さが、互いに隣接しているかまたは化合物の所望な特性を破壊しないリ ンカーペプチドをコードする領域によって分離されている本発明の化合物の２つ の部分をコードするそれぞれの領域を含んでなるようにすることができる。この 化合物の２つの部分は、完全にまたは部分的に重なりあっていることがあると思 われる。 次に、ＤＮＡを適当な宿主で発現させ、本発明の化合物を含んでなるポリペプ チドを生成させる。 本発明の３成分系の重要な部分は、阻害剤である。これは、血管コンパートメ ントの酵素の活性を阻害しまたはその量を減少させ、正常組織における酵素を減 少させることにより、腫瘍と身体の残りの部分における酵素の量または効果に適 当な差異を生じさせるのである。触媒部位の不活性化および／または触媒性巨大 分子のクリアランスは、ＷＯ８９／１０１４０号明細書に記載の方法で行うこと ができる。 例えば、触媒部位またはその近くに結合することによって、触媒部位をブロッ クする抗体を用いることができ、このような抗体（好ましくは、モノクローナル またはヒューマナイズド）は、現在では常法である方法によって生じさせまたは 発現させることができる。触媒性巨大分子のクリアランスは、追加のガラクトー ス残基またはクリアランスを促進する目的で添加される他の糖を有するかまたは 脱シアリル化することができる抗体を用いて促進することができる。抗体をガラ クトシル化することにより、肝細胞上のガラクトースレセプターによる吸収によ って血中から速やかにクリアランスを生じる。あるいは、または更に、抗体−酵 素接合体はガラクトシル化され、肝臓ガラクトースレセプターがアシアロ−ウシ 顎下腺のムコタンパク質または肝臓ガラクトースレセプターに指定された抗体ま たはガラクトースレセプターに対して高い親和性を有する他の分子によってブロ ックされた後に生じる。ブロック物質は２４時間まで血漿中に保持されて、抗体 −酵素複合体が腫瘍部位に局在化するようにするが、ガラクトースレセプターの ブロックの中断の後に、ガラクトシル化抗体−酵素は利用可能なガラクトースレ セプターを介して速やかに除去される。抗体の機能は触媒性巨大分子を除去する ことであり、触媒作用をブロックすること（または少なくともブロックすること だけ）ではないので、抗体を触媒性巨大分子の任意の部分に指定することができ る。あるいは、小分子の酵素阻害剤を用いることができ、これらは、例えばＷＯ ９７／２０５８０号明細書に記載されており、上記特許明細書の内容は、その開 示の一部として本明細書に引用される。いずれの所定の酵素に対しても、好まし い小分子阻害剤は、ＷＯ９７／２０５８０号明細書の酵素について好ましいこと が示されているものである。 好ましくは、酵素を不活性化する小化合物は、第一の化合物の第二の化合物へ の有用な程度までの転換を阻害する化合物である。阻害の程度は、好ましくは＞ ５％であり、更に好ましくは＞１０％であり、更に一層好ましくは＞５０％であ り、最も好ましくは＞９０％である。 好ましくは、触媒性巨大分子が酵素または触媒活性を有する他の巨大分子を含 んでなるときには、上記阻害剤はこの酵素または他の巨大分子の活性部位に結合 する。 「活性部位」とは、この部位が触媒作用の部位であろうとなかろうと触媒作用 に影響を与える酵素または他の巨大分子上の任意の部位を包含する。 更に好ましくは、上記阻害剤は酵素または他の巨大分子の活性部位に結合し、 更に一層好ましくは、上記分子は酵素または巨大分子の表面上に露出していない 。 好ましくは、阻害剤は、比較的小分子であり、更に好ましくは、この分子の相 対分子質量が１００００未満であり、更に好ましくは５０００未満であり、最も 好ましくは１０００末満である。 阻害剤は、実質的に不可逆的阻害剤であるのが特に好ましい。「実質的に不可 逆的阻害剤」とは、阻害剤が酵素または触媒活性を有する他の巨大分子に結合し たならば、触媒活性を実質的に阻害触媒かつ未結合となるとは思われない阻害剤 を包含する。 上記酵素または触媒活性を有する他の巨大分子のｋ_catが阻害剤に対して＜１ ０ｓ^-1であり、好ましくは＜１ｓ^-1であり、更に好ましくは＜０．１ｓ^-1であり 、更に一層好ましくは＜０．０１ｓ^-1であり、最も好ましくは実質的に０ｓ^-1で あるのが特に好ましい。 また、上記酵素または触媒活性を有する他の巨大分子のＫ_iが、阻害剤に対し て＜１００μＭであり、好ましくは＜１μＭであり、更に好ましくは＜１ｎＭで あり、更に一層好ましくは実質的に０であるのが特に好ましい。 ＷＯ９７／２０５８０号明細書には、ＣＰＧ２の阻害剤が記載されており、上 記特許明細書の内容は総て、その開示の一部として本明細書に引用される。 他の酵素（表記）と共に用いられる阻害剤としては、下記のものが挙げられる 。 a) カルボキシペプチダーゼＡ（Haenseler et al（1992）Biochemistry 31，21 4-220:遊離のカルボキシル基に隣接した末端ペプチド結合を加水分解する。 広汎な特異性を有し、芳香族側基を有すると最大活性を示す（第６図、この 酵素に対する可能な阻害剤も示されている、第７図）。 b) グルクロニダーゼ（Mitaku et al（1994）Ann．Oncol．5(Suppl．5)，76:糖 ラクトンがこの酵素の阻害剤であることが知られており、例えばβ−グルク ロニダーゼに対するＤ−サッカリン酸−１，４−ラクトンである。 c) β−ラクタマーゼ（Svensson et al（1993）Bioconj．Chem．3，176-181:ク ラブラン酸はこの酵素の既知の阻害剤である。サルバクタム、チエナマイシ ンおよびイミペネムのような他の構造も知られている。この科の強力な抗生 物質はβ−ラクタマーゼ阻害特性を有し、数千個の誘導体を生じる。しかし ながら、上記化合物は現在までに知られている最も強力なものである。 阻害剤分子の塩を本発明の実施に用いることができることが理解されるであろ う。 もう一つの態様では、阻害剤は前駆体の形態で提供されるのが好ましい。 上記の阻害剤の前駆体は、患者のような宿主に上記阻害剤を放出することがで きる形態での上記分子を含んでなるのが適当である。従って、前駆体は結合を介 して実体(entity)に結合した上記阻害剤を含んでなることができ、上記の結合は 生物分解性（従って、宿主内で開裂可能）であり、または前駆体は結合を介して または介さずに実体に結合した上記阻害剤を含んでなり、上記実体が生物分解性 であることができる。いずれの場合にも、阻害剤は、治療を行う患者のような宿 主中で前駆体から放出される。 小分子酵素不活性化系を更に改質して、生物分解性巨大分子を包含することも できる。この態様は共有結合した分子の阻害剤を有し、巨大分子−阻害剤は酵素 が巨大分子に結合している場合には酵素を阻害することができないことがある。 しかしながら、正常組織で分解する場合には、阻害剤が放出されて、拡散し、隣 接する総ての酵素を阻害する。巨大分子−阻害剤の特徴を化学的に改質して、治 療に要する分布の部位に合わせ、腫瘍部位での阻害を回避することができる。こ の種の系の例はＷＯ９７／２０５８０号明細書に開示されており、上記特許明細 書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される。 あるいは、活性な細胞毒性薬剤と自発的に反応するまたは適当な触媒の存在下 で更に効果的に反応する化学的残基を用いることができる。例えば、アルキル化 剤が薬剤の場合には、阻害剤はチオール含有物質および血管コンパートメントに グルタチオントランスフェラーゼを拘束するための実体中または上に支持された グルタチオントランスフェラーゼを含んでなることができる（下記において更に 詳細に説明する）。従って、このような阻害剤は、（i）不活性化部分（すなわ ち、化学的残基に作用する化学的残基または酵素）、および(ii)拘束部分(restr aining portion)を含んでなる。 不活性化部分は当該技術分野で知られている結合法によって拘束部分に接合し て、本発明の化合物を血管コンパートメントに保持することができる。 拘束部分は、血液および身体器官の総ての機能と生物学的に適合するものでな ければならず、分解が徐々に起こることがあるとしても生物分解性であるべきで ある。拘束部分の腫瘍の細胞外空間への進入は最小限にすることが必要である。 後者の要件から、不活性化部分は、遊離の不活性化部分が血液から速やかに除去 されて腫瘍細胞外空間への接近が制限されるのでなければ、拘束部分から遊離の 状態で放出されないことになる。 拘束部分は、赤血球であることができる。好ましくは、分子の赤血球中への進 入を引起こすための当該技術分野で知られている手法を用いて化合物を赤血球上 または内に包含させることができる。不活性化部分は赤血球膜に結合させること ができ、または赤血球に進入させて、その中に保持することができる。 所望な薬剤を哺乳類の赤血球に細胞内容物を許容できないほど損失することな く導入する方法は報告されている（米国特許第４，９３１，２７６号明細書、上 記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）。この方 法は、（a）細胞中にまたはから容易に拡散する化合物であって、化合物の濃度 が細胞中への拡散を引起こすのに十分であり、細胞の内容物が高張性となるよう なものを含む溶液に細胞を懸濁してインキュベーションし、（b）高張性細胞を 含む溶液を、導入を行い水の細胞中への拡散を引起こし、その結果膨潤を生じ、 外膜の透過性が増加する少なくとも１種類の薬剤の存在下で等張性の水性媒質で 希釈することによって膜貫通浸透圧グラディエントを速やかに生成させ、（c） 膜の透過性の増加を、薬剤を細胞中へ輸送しかつこの化合物を細胞から拡散させ ることだけに十分な時間保持することを含んでなる。この方法は、細胞の載荷の ための米国特許第４，４７８，８２４号明細書の「浸透パルス(osmotic pulse) 」機構で特に有用である。 米国特許第４，６５２，４４９号明細書（上記特許明細書の内容は、その開示 の一部として本明細書に引用される）には、哺乳類の赤血球に生物学的活性を有 する物質のカプセル化のもう一つの方法であって、（a）赤血球の水性懸濁液を 透析ユニットの主コンパートメントに連続的に供給し、透析ユニットの第二のコ ンパートメントには赤血球懸濁液と比較して高張性である水溶液を含み、赤血球 のリーシスを行うようにし、（b）赤血球の溶解生成物を生物学的活性を有する （複数の）化合物と接触しておりまたは接触させた後、溶解生成物の腫脹および ／または浸透圧を増加することによって赤血球膜を再シールすることを含んでな る方法が記載されている。 あるいは、拘束部分は、リポソーム、またはデキストランのような高分子量（ ＞２５，０００ダルトン、好ましくは少なくとも４０，０００ダルトン）ポリマ ー、またはマクログロブリンのようなタンパク質であることもできる。 循環時間が長いリポソームは、不活性化部分の潜在的なキャリヤーでもある。 循環時間が長いリポソームは、様々な方法で構築されている。これらの方法とし ては、ガングリオシドＧＭ１、またはスフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコ リンおよびコレステロールの混合物、または他の比較的堅いキャリヤー脂質の使 用が挙げられる。それぞれの型のリポソームについては、サイジングによる最適 化が長時間血管内滞留を最適にするのにも望ましい。Gabizon and Papahadjopou los（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．USA85，6949-6953)は、１００ｎｍの平均 粒径が最適であることを見出だした。しかしながら、リポソームが腫瘍において 有意な吸収を示さないときにのみ、循環時間の長いリポソームが適当である。 デキストランは、主として１〜６個の結合によって結合されたα−Ｄ−グルコ ース単位からなる多糖類である。部分的に加水分解して分画化されたデキストラ ンが、血漿拡張剤(blood plasma expander)として広く用いられている。それら は、肝臓、脾臓、腎臓、腸粘膜および結腸に存在するデキストラナーゼによって 除去される（Rosenfeld et al（1959）Biokhimia［Engl］24，965-970;Ammon（1 963）Enzymologia 25，245-251;Serry & Hehre（1959）J．Bacteriol．71，373- 380）。血管コンパートメントに保持されているデキストランは、平均分子量が ４０ｋＤ（Gentran 40，Rheomacrodex）、７０〜７５ｋＤ（Gentran 70，Macrod ex）、および１１０ｋＤを有するものが広く用いられている。それらは、潜在的 に抗原性であり、人によっては先在的抗体を有するが、デキストランに対する反 応は他の広く用いられている医薬品以下であり、性質が温和である（Goodman an d Gilman、治療薬の薬理学的基礎(The Pharmacological Basis of Therapeutics )、第８版、Pergamon Press、ニューヨーク、オックスフォード、１９９０年） 。 他のポリマー性薬剤キャリヤーは、炭水化物、ペプチドおよび脂質から開発さ れている。これらの幾つかは、ここで定義された基準を満足する場合には、不活 性化部分に対する適当な代替拘束部分であることができる。 拘束部分は、有利なことには陰電荷を有することができ、低い親油性を有する ことができる。拘束部分は生物分解性であるのが適当である。「生物分解性」と は、拘束部分が患者の身体中で分解し、従って半減期が比較的短く、他と７２時 間未満であり、好ましくは４８時間未満であることを意味する。 あるいは、阻害剤は、例えば活性薬剤に結合するが相当するプロドラッグには 結合せず、または更に限定された範囲までしか結合しない抗体またはその部分で あることができる。 細胞毒性薬剤のような低分子量化合物に対する抗体の産生は、ハプテン付加の 周知の手法であって、低分子量分子を、キーホール・リンペット・ヘモシアニン (keyhole limpet haemocyanin)または他のキャリヤー分子のような免疫原性の高 いタンパク質に接合させる方法によって促進することができる。プロドラッグを 、プロドラッグの残基の接触開裂によって活性薬剤に転換する場合には、プロド ラッグでは、非活性残基が抗薬剤抗体のプロドラッグの隠された薬剤部分への結 合を立体的に阻害することができるので、プロドラッグと活性薬剤とを識別する ことができる抗体の産生が好ましい。 あるいは、触媒性巨大分子を、正常な代謝成分が存在しかつ抗代謝物の作用を ブロックするのに用いることができる細胞毒性抗代謝物化合物に関して有効に用 いることができる。この場合には、上記の「第一の化合物」は正常な代謝物であ り、「第二の化合物」は細胞毒性抗代謝物の作用をブロックしない正常な代謝物 の誘導体である。触媒性巨大分子（例えば、巨大分子−酵素接合体）を用いて、 腫瘍部位の代謝物を分解し、代謝物が正常組織を保護するようにすることができ る。この場合には、巨大分子酵素接合体を最初に投与し、放置して腫瘍部位に局 在化させる。抗−酵素抗体を例えば酵素接合体の２４時間後に投与し、血液およ び正常組織の酵素活性を減少させ、次いで同時投与した抗代謝物および代謝物が 正常組織を保護する代謝物を生じ、一方腫瘍組織では、残存している酵素が代謝 物を不活性化することによって、腫瘍細胞を抗代謝物の作用に暴露させるように する効果を有する。ＷＯ９３／１３８０５号明細書を参照されたい。特に、ＷＯ ９３／１３８０５号明細書の第２図は、標的細胞に指定されたＣＰＧ２に関し、 かつ腫瘍部位からフォリン酸を除去してトリメトレキセートの作用を最早阻害し ないようにするのに用いられる系が例示されている（上記特許明細書の内容は、 その開示の一部として本明細書に引用される）。 従って、本来の状態では、細胞毒性化合物の効果を阻害することができる任意 の十分に非毒性の物質を、上記細胞毒性化合物に対して余り効果を持たない物質 に転換することができる。適当な化合物は、フォリン酸である。フォリン酸は例 えば酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼに作用する細胞毒性化合物トリメトレキセー トの生物学的効果を逆転させる。フォリン酸を脱グルタミン酸化して、酵素カル ボキシペプチダーゼＧ２および他の脱グルタミン酸酵素によってトリメトレキセ ートに対して不活性にする。 薬剤トリメトレキセート（ＮＳＣ３５２１２２；２，４−ジアミの−５−メチ ル−６−［３，４，５−トリメトキシアニリノメチル］キナゾリン）は、ジヒド ロ葉酸レダクターゼに結合することによって作用し、メトトレキセートは葉酸レ セプターを介して細胞に進入し、トリメトレキセートは（複数の）代替機構によ って進入する。トリメトレキセートの合成は、Baker著（1967）の部位指定不可 逆的酵素阻害剤のデザイン(Design of site-directed irreversible enzyme inh ibitors)、Wiley、ニューヨーク、およびElslager et al著(1974)の複素環式化 学の講義(Lectures in heterocyclic chemistry)、第２巻、９７／５〜１３３頁 （Castle & Townsend監修）、Hetero Corp、オーレン、ユタに開示されている。 トリメトレキセートは、一般にUS Biosciences、ワン・タワー・ブリッジ、１０ ０フロンと・ストリート、スイート４００、ウェスト・コンショホッケン、ペン シルバニア１９４２８、米国から入手可能である。 メトトレキセートは、カルボキシペプチダーゼＧ２によって開裂することがで きる末端グルタミン酸残基を有する点で天然の葉酸に類似しているが、トリメト レキセートはこの酵素の作用を受けにくい(Bagshawe（1985）Clinical radiol． 36，545-551)。イン・ビトロ(in vitro)でのトリメトレキセートの結腸癌細胞に 対する作用は、培地に葉酸分解酵素カルボキシペプチダーゼＧ２を添加すること によつて増進することができる（Searle et al（1990）Biochemical Pharmacol ．39，1787-1791）。 メトトレキセートおよびトリメトレキセートの生物学的効果は、それらがブロ ックする反応の最終生成物を投与することによって、またはフォリン酸［５−ホ ルミルテトラヒドロ葉酸］として知られている一層容易に入手可能な類似体によ って逆転することができる。フォリン酸は、例えばCyanamid Incからロイコボリ ンとして広く入手可能であるが、Wellcome IncおよびFarmitaliaからも入手可能 である。フォリン酸をメトトレキセートまたはトリメトレキセートと同時に十分 な量で投与すると、それらの作用がブロックされる。 同じ原理を他の抗細胞毒性薬剤物質に適用することができる。例えば、チミジ ンはＣＢ３７１７およびＩＣＩ Ｄ１６９４（Jodrell et al 1991，BJC 64，83 3-8;Jones et al（1986）J．Med．Chem．29，468-472）のような、酵素チミジン シンテターゼに作用する細胞毒性化合物の効果をブロックする。従って、チミジ ン分解酵素（例えば、ジヒドロチミンデヒドロゲナーゼ、Shiotani & Weber 198 1 J．Biol．Chem．256，219-224）またはチミジンキナーゼ（Shiotani et al（1 989）Cancer Res．49，1090-1094）を用いて、チミジンを細胞毒性化合物に対し て無効にすることができる。 同様な考察は、ヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡ中への組入れの通常工程は 、腫瘍部位を標的とした適当な酵素によって分解することができる通常の代謝物 によって潜在的に可逆的であるので、これらの工程を妨げる他の化合物に関する 。 例えば、広く用いられている細胞毒性５−フルオロウラシル（Roche Products Incから発売）の細胞毒性効果をウリジンによって少なくとも部分的に減衰させ ることができることが示されている（Groeningen et al（1989）J．Natl．Cance r Inst．81，157-162）。従って、巨大分子とウリジン分解酵素との接合を、５ −フルオロウラシルおよびウリジンと共同で用いることができる。このような組 み合わせは、５−フルオロウラシルが最も有効な細胞毒性化合物の一つである結 直腸癌および乳癌において特に適切であることがある。このような化合物の組合 せを、５−フルオロウラシルの細胞毒性を高めるフォリン酸と、または更にチミ ジンおよびチミジン不活性化酵素と組合せることもできる。 この酵素は、ヒトまたは非ヒト由来のものであることができる。通常の酵素を 用いる必要はないかもしれない。触媒能を有する抗体が開発されており（Tramon tano et al Science 234，1566-1570）、「アブザイム」(abzymes)として知られ ている。これらは、ヒューマナイズによりそれらの免疫原性を減少させることか できる潜在的な利点を有する。 細菌性酵素カルボキシペプチダーゼＧ１およびＧ２（ＣＰＧ１およびＣＰＧ２ ）は、メトトレキセートを含む葉酸を末端グルタミン酸の開裂によって分解する 。２種類の酵素の作用は同一であると思われる。下記の本発明の好ましい態様の 説明はＣＰＧ２に関するものであるが、ＣＰＧ１および同じ基質に作用する任意 の他の酵素、および同じ基質に作用するアブザイムにも同様に適用することがで きる。 Pseudomonas sp．菌株ＲＳ−１６由来のカルボキシペプチダーゼＧ２の単離、 精製および特性の幾つかは、Sherwood et al（1984）Eur．J．Biochem．148，44 7-453に開示されている。上記カルボキシペプチダーゼＧ２をコードする遺伝子 のクローニング、そのヌクレオチド配列およびE．coliにおけるその発現は、Min ton et al（1984）Gene 31，31-38およびMinton et al（1983）J．Bacteriol．1 56，1222-1227に開示されている。ＣＰ２Ｇ２は、Division of Biotechnology、 Center for Applied Microbiological Research、ポートン・ダウン、サリスバ リー、英国から発売されている。カルボキシ−ペプチダーゼＧ１（ＣＰＧ１）は 、Chabner et al（1972）Cancer Res．32，2114-2119に開示されている。 あるいは、細胞毒性／薬剤は、ＷＯ９３／１３８０６号明細書（この特許明細 書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）に記載されているよ うに、血管コンパートメントに選択的に配置されている化合物（通常は酵素）に よって毒性の低いものに転換することができる。特に、系は標的細胞（例えば、 腫瘍）にターゲッティングされ、Ａｌａ−メトトレキセートをメトトレキセート に転換するカルボキシペプチダーゼＡ、および血管系に拘束されておりかつ脱グ ルタメート化によってメトトレキセートを不活性化するカルボキシペプチダーゼ Ｇ−２に関してＷＯ９３／１３８０６号明細書の第４図に例示されている。 成分は、異種タンパク質に対する宿主免疫応答によって賦課されるされること がある拘束を回避する必要があることがある。この成分の性質は、免疫学的制御 の方法の開発の段階によって変化することがある。異種タンパク質に対する宿主 応答を克服するのに用いることができる方法は、当該技術分野で知られている。 異種タンパク質の免疫原性を減少させ、巨大分子−酵素接合体および阻害酵素接 合体に適用可能な手法は、ポリエチレングリコールの形態（Wilkinson et al（1 987）J．Immunol．139，326-331）または低分子量デキストラン（Mikolajezck e t al，１９９６年、またはMelton et al，１９８７年）に対する接合の手法であ る。 あるいは、または更に免疫原性の問題は、免疫抑制剤または免疫トレランス誘 発剤を投与することによって克服することができる。シクロスポリンおよびＦＫ ５０６は、組織移植における免疫抑制を行うための広く用いられている薬剤であ る。シクロスポリンは、異種タンパク質に対する宿主抗体応答を遅らせることが 示されている（Lederman et al（1988）Br．J．Cancer 58，562-566および654-6 57）。リンパ球上のＣＤ４エピトープに指定された抗体を収容した後に、宿主が 最初に異種の問題と遭遇するときの異種タンパク質に対するトレランスが開示さ れている（Waldman et al(1988)、１６〜３０頁、アレルギーの進歩(Progress i n Allergy)（Shizata & Woksman監修、ニューヨーク）。これを達成するための 他の手段は他に記載されており、異種抗原に対する宿主抗体応答の制御において 改良が行われるので変化することがある。触媒抗体（アブザイム）を「ヒューマ ナイズ」(humanized)して、それらの免疫原性を減少させまたは除去することが できる。 本発明のもう一つの態様では、宿主中で標的細胞を破壊する方法であって、宿 主に上記の様々な成分を投与することを含んでなる方法が提供される。 本発明の成分は、任意の適当な経路で、通常は非経口的に、例えば希釈剤およ びキャリヤーの標準的な滅菌した発熱物質不含処方物中に静脈内、腹腔内または 膀胱内に投与される。巨大分子の血中濃度は、数時間毎に測定することができる 。典型的には、２４時間後に、腫瘍中の巨大分子の濃度はその血中濃度より高く なる。 ポリエチレングリコールまたは低分子量デキストランに接合した酵素は、低免 疫原性であることが期待されることがある。このような巨大分子は、最適濃度の 酵素を腫瘍部位に局在化するのに十分な投与量で低速の静脈内輸液によって投与 することができる。放置（通常は２４時間）して接合体を腫瘍部位に局在化させ た後、酵素阻害剤を低速の静脈内輸液によって投与することができる。阻害剤は 接合体に指定されたモノクローナル抗体であることができ、またはこれは更に特 異的に指定されて、酵素を不活性化することがあり、後者の場合には、抗体をガ ラクトシル化して、血液からの速やかな除去を促進し、腫瘍部位の酵素を不活性 化するのを防止することができる。あるいは、阻害剤は、酵素の活性部位に適合 するがそれによって触媒されない小分子であることができる（例えば、適当な阻 害剤系は、ＷＯ９７／２０５８０号明細書に記載されており、上記特許明細書の 内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）。このような阻害剤を、 血液および正常組織中の酵素を不活性化するが、腫瘍に配置された酵素の小画分 を不活性化するだけであるような投与量で投与する。この方法では、正常および 腫瘍組織の間の酵素濃度に大きな差別をつけることができる。酵素活性が血液試 料に最早検出されないときには、酵素の基質であるプロドラッグを反復ボーラス 注射によってまたは輸液によって投与し、腫瘍中の酵素濃度が有効値を下回るよ うになるまで継続する。腫瘍中の酵素濃度は、接合体の小成分を、単光子射出コ ンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）の手法を用いて¹³¹ヨウ素のような適当な 放射性同位体に接合させるときに、ガンマー線カメラによって監視することがで きる。腫瘍部位における酵素を定量することができるアルゴリズムは完全に確立 されている。得られた値を、腫瘍生験でＨＰＬＣによって得られたものと綿密に 比較する。 癌を撲滅するための試みにおいて、腫瘍標的に対する所定の効果は、本明細書 に記載の系では遥かに小さいことが予想されるが、造血機能の抑制（骨髄抑制） を回避することができないことがある。同様に、所定の程度の骨髄抑制に対して は、遥かに大きな腫瘍効果が予想される。従って、造血組織に作用する成長因子 または生長阻害因子を、本明細書に記載の系と組合せて好ましく用いることがで きる。 本明細書に記載の系は、他の形態の治療法と共同で用いることができる。これ らの形態としては、通常の細胞毒性化合物、および２種類以上の代謝物を不活性 化するための複数酵素送達の使用が挙げられる。 同様に、巨大分子によって腫瘍部位に送達される酵素は、プロドラッグを活性 化し、代謝物を不活性化して正常組織を保護する機能を行うことができる。カル ボキシペプチダーゼＧ２は、腫瘍部位のフォリン酸を不活性化して、主細胞をト リメトレキセートに対して未保護にする。同じ腫瘍に配置された酵素は、安息香 酸プロドラッグを活性化して、細胞毒性マスタードを形成することができる(Bag shawe（1989）Brit．J．Cancer 60，275-281）。 本発明のもう一つの態様は、腫瘍抗原に特異的に結合しないが、哺乳類の血管 コンパートメントに投与した後に哺乳類の腫瘍に吸収することができ、かつ患者 の腫瘍を治療するための医薬の製造において第一の化合物を第二の化合物に転換 することができる、触媒性巨大分子の使用であって、患者が第一の化合物を投与 される前、投与の際、もしくは投与後、ならびに、上記血管コンパートメントへ 投与した後に、血管コンパートメントおよび正常（非腫瘍）組織における上記触 媒転換活性のレベルを減少させる阻害剤を患者が投与される前、投与の際、もし くは投与後におけるその使用、を提供する。 本発明の化合物および方法を、特に、酵素カルボキシペプチダーゼＧ２によっ て不活性化される化合物メトトレキセートを用いる細胞毒性療法に関して下記の 実施例で説明する。化合物アミノプテリンは、酵素カルボキシペプチダーゼＧ２ によって不活性化されるもう一つの強力な細胞毒性化合物である。 本発明を、下記の実施例および図面について更に詳細に説明する。 第１図は、¹²⁵Ｉ−［ＰＥＧ−ＣＰＧ２］の生体分布を示す（実施例９を参照 されたい）。 第２ａ図 ＰＥＧ５０００分子量に接合したＣＰＧ２、ＣＰＧ２ １分子当た り平均３２個のＰＥＧ分子、２０μｇ／マウスｉ．ｖ．。図は、組織１ｇ当たり の注射投与量の百分率を示す。 第２（ｂ）図 相当する腫瘍対正常組織の比。 第３（ａ）図 ＰＥＧ２０００分子量に接合したＣＰＧ２、ＣＰＧ２ １分子 当たり平均２７個のＰＥＧ分子、２５酵素単位／マウス。ＨＰＬＣによる検討。 第３（ｂ）図 相当する腫瘍対器官の比。クリアランスなし。 第４（ａ）図 ガラクトシル化ＳＢ４３（清澄化抗体）の使用の後のＣＰＧ２ 活性の生体分布。マウスに、ＰＥＧ２０００分子量に接合したＣＰＧ２であって 、ＣＰＧ２ １分子当たり平均２２モルのＰＥＧを、時間０にマウス当たり２５ 単位静脈内投与した。ガラクトシル化モノクローナル抗体ＳＢ４３を、１９、２ ０および２１時間後に腹腔内経路で投与した。マウスを、ＣＰＧ２の投与から２ ４時間後に屠殺した。 第４（ｂ）図 上記プロトコールによる腫瘍対器官比。 第５図 ＰＥＧ５０００（ＭＤＥＰＴ）またはＣＰＧ２に接合したモノクロー ナル抗体Ａ５Ｂ７−（Ｆａｂ’）２（ＡＤＥＰＴ）に接合したＣＰＧ２ ２０単 位を比較するＬＳ１７４Ｔ腫瘍におけるＣＰＧ２活性。 第６図 ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有するヌードマウスに、ＣＰＧ２−ＰＥＧ（２２ のＰＥＧ分子、ＰＥＧ５０００）２５酵素単位を投与した後、２０時間、２３時 間、２６時間後にガラクトシル化ＳＢ４３を投与した。ＣＰＧ２−ＰＥＧの投与 から４８時間後に、フェノールプロドラッグ（４−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロ エチル）アミノ］−フェノキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸）２５ｍｇ／ｋｇ を腹腔内に投与し、１時間間隔で全部で３回反復投与した。 第７図 ７２時間後の本来のＣＰＧ２およびＰＥＧ−ＣＰＧ２の生体分布を示 す。腫瘍（ヌードマウスに異種移植したＬＳ１７４Ｔ）でのＣＰＧ２活性を示す 。マウスにＣＰＧ２−ＰＥＧまたは本来のＣＰＧ２ ２５単位を注射した。 第８図 ＬＳ１７４Ｔを異種移植したヌードマウスでの、¹²⁵Ｉを標識した本 来のＣＰＧ２およびＰＥＧ−ＣＰＧ２の生体分布を示す。実施例１： Ａｌａ−メトトレキセートカルボキシペプチダーゼＡおよびＧ２を 用いる治療系 広く用いられている化合物であるメトトレキセートは葉酸拮抗薬であり、その 作用は、食物因子である葉酸を酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼによってその還元 形態である５−メチルテトラヒドロ葉酸（フォリン酸、シトロボラム因子）への 転換をブロックすることである。フォリン酸は、ＤＮＡの合成における１炭素転 移に用いられる。フォリン酸の非存在下では、細胞の再生産は、Ｓ相でブロック され、細胞死が続く。メトトレキセートは、広汎な悪性疾患の治療に用いられる 。これも、既述の機構により正常細胞再生組織に細胞死を引き起こす。その効果 の大きさは主として薬剤に対する組織の暴露時間の関数であり、時間が長くなれ ば毒性効果が大きくなる。メトトレキセートの作用に対する感受性は、薬剤のポ リグルタメート化から生じ、細胞内でのその分解および細胞からの排泄を遅らせ ることによって作用が延長されると考えられる。メトトレキセートの効果は、一 般に５−ホルミルテトラヒドロ葉酸の形態で投与されるフォリン酸によって回避 することができる。メトトレキセートをフォリン酸と共に慎重に時間を設定しか つ投与量を制御した投与は、幾つかの癌の治療にメトトレキセート単独の使用よ りも有利であることが分かった。従って、メトトレキセートの大量投与の後に、 通常は１２〜２４時間後にフォリン酸「助剤(rescue)」が投与される。同様に、 低用量のメトトレキセートを１日置きに、またフォリン酸をその翌日に投与する ことが、幾つかの形態のトロホブラスト腫瘍(trophoblastic tumour)の多くの患 者にとって好ましくかつ毒性の低い治療となることが分かった(Bagshawe et al （1989）Brit．J．Ob．Gynae 96，795-802）。 メトトレキセートのαカルボキシルにアミド結合を介してアラニン残基を導入 することによってメトトレキセートを改質するときには、生成する化合物は細胞 から効果的に排除され、アラニン形態での毒性はイン・ビトロでの標的細胞にお ける本来のメトトレキセートの毒性の５０〜１００分の１であることが示されて いる（Kuefner et al（1989）Biochemistry 28，2288-2297）。アラニン残基は 、酵素カルボキシペプチダーゼＡの作用によって開裂して、本来のメトトレキセ ー トが残る。アラニンメトトレキセートは、酵素カルボキシペプチダーゼＧ２によ って代謝されない。カルボキシペプチダーゼＧ２は、メトトレキセートと天然の 葉酸をグルタミン酸残基の開裂によって分解する。 本実施例では、本発明の系の触媒性巨大分子は、ポリエチレングリコール、デ キストランまたはカルボキシペプチダーゼＡに接合した免疫グロブリンのような 巨大分子を含んでなる。カルボキシペプチダーゼＡ以外の同じ基質特異性を有す るカルボキシペプチダーゼを、カルボキシペプチダーゼＡの代わりに用いること ができる。 カルボキシペプチダーゼＡは、ウシおよび細菌の供給源（例えば、Calbiochem 、ノッチンガム、英国）から入手可能であり、ヒトの膵臓にも存在する。この酵 素は、ポリペプチド鎖のＣ末端から、または遊離カルボキシル基を有する接合ア ミノ酸を含む他の化合物からオリゴペプチドを加水分解する。カルボキシペプチ ダーゼＡは、芳香族残基に対して優先的である。これは、通常は膵臓によって産 生された３種類のサブユニットの複雑な集合体のトリプシン化によって哺乳類の 供給源から形成される。 ＣＰＡを、例えばＷＯ９０／１３５４０号明細書に記載の方法などの通常の手 法によってＰＥＧまたはデキストランに接合させる。 「第一の化合物」は、プロドラッグであるアラニンメトトレキセート（Kuefne r et al，１９８９年）であり、これからカルボキシペプチダーゼＡの作用によ って活性薬剤であるメトトレキセート（「第二の化合物」）が生成する。 「阻害剤」は、デキストランのような巨大分子構造に接合したカルボキシペプ チダーゼＧ２である。この巨大分子の目的は、ＣＰＧ２活性を血管コンパートメ ントに制限することである。 例えば、ＣＰＧ２は、Melton et al(1987)の方法によって可溶性デキストラン （Lomodex 40、Lomodex70、Dextraven 110およびDextraven 150、いずれも商 品名、Frison、ローボロー、レスターシャー、英国）にカップリングすることが できる。０．９％ＮａＣｌにデキストラン１ｇを含むデキストラン製剤の一定容 量を０．９％ＮａＣｌで１００ｍｌに希釈して、臭化シアン（ＣＮＢｒ；Sigma 、プール、ドーセット、英国）と反応させた。４０−および７０，０００ダルト ンのデキストランを活性化するのに、ＣＮＢｒ（０．５ｇ）を用い、更に高分子 量のデキストランには０．４ｇを用いた。この還元は、１１０，０００および１ ５０，０００ダルトンのデキストランの沈澱を防止するのに必要であった。反応 混合物を室温で激しく攪拌し、２Ｍ ＮａＯＨを添加することによってｐＨ−ス タット（Radiometer、コペンハーゲン、デンマーク）でｐＨ１０．７±０．１単 位に保持した。ＣＮＢｒを微粉砕した粉末として２つに等分して２０分の間隔で 加え、第二の分量を反応混合物のｐＨが１０．７で安定するまで反応させた後、 ｐＨを９．０に調整し、混合物を流水に対して４℃で２時間透析した。ｐＨを１ Ｍ ＮａＯＨで９．０に戻し、０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．３の １ｍｌ酵素溶液（１２６５Ｕ、２．３ｍｇ）を加えた。混合物を４℃で一晩反応 させた後、０．２５ｇのグリシンを加えて、過剰の反応部位をブロックした。混 合物を更に３０分間攪拌した後、PM10限外濾過膜（Amicon、ストーンハウス、英 国）を用いて２０２型濃縮装置で４０ｍｌの容積まで濃縮した。次に、混合物（ ４０ｍｌ）を４．４×８７ｃｍカラム中のSephadex G150の１．３リットルのベ ッド容積上でクロマトグラフィーを行い（Pharmacia、ウプサラ、スウェーデン ）、０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０で溶出した。画分（１０ｍｌ ）を集めて、酵素活性を測定し、炭水化物含量は、デキストラン−７０を標準物 として０〜１００μｇ／ｍｌの範囲で用いてフェノール−硫酸法（M．Dubois et al（1956）Analyt．Chem．28，350）によって測定した（Sephadexは商品名であ る）。ピーク画分をプールして、上記と同様に１０〜１２ｍｌの容積まで濃縮し た。酵素活性および炭水化物含量を測定し、タンパク質含量は、ウシ血清ア ルブミン画分Ｖを標準物として０〜１００μｇ／ｍｌの範囲で用いてクマシーブ ルー法によって測定した（M.M．Bradford（1976）Analyt．Biochem．72，248） 。濃縮した材料を濾過滅菌し（Millipore「Millex GS」、細孔度０．２２μｍ） 、−２０℃で保管した。Millex GSは、商品名である。 巨大分子−カルボキシペプチダーゼＡ接合体は、ウシ由来の酵素を含んでなる ときには、免疫原性である。同様に、カルボキシペプチダーゼＧ２巨大分子接合 体も、ＣＰＧ２が細菌性であるので、免疫原性である。従って、それらの免疫原 性を減少させまたは免疫抑制または免疫トレランスを誘発する手段を用いるのが 望ましいことがある。実施例２： 使用法 異種タンパク質に対する宿主応答を克服することができる成分の投与は、触媒 性巨大分子の投与の４８時間前に開始することができる。初期試験を行い、タン パク質成分のいずれかに対する患者による異常反応を可能な限り除外することが できる。ＣＰＡ接合体を、静脈内に、好ましくは低速輸液によって、典型的には ２時間に亙って投与する。ＣＰＡ接合体の最大腫瘍濃度は、数時間後に達成され るが、この時点では血漿中に未だ高濃度のＣＰＡ活性がある。プロドラッグを投 与する前にこの活性を可能な限り除去することが望ましい。この除去工程は、非 腫瘍部位からＣＰＡの促進クリアランスまたは不活性化を行うことができる成分 （例えば抗−ＣＰＡ抗体であって、ガラクトシル化していてもよい）を投与する ことによって行われる。この成分を静脈内に数時間、典型的には６〜２４時間に 亙って、または酵素が血漿中に最早検出されなくなるまで投与し、プロドラッグ の投与時間中低濃度で輸液することができる。この時間中に、細胞外流体中の酵 素は、酵素の血漿濃度が低下するので、血漿中に逆拡散する。血漿からの酵素活 性の試験を、典型的には８〜２４時間継続して、血漿のＣＰＡ活性が検出されな いようにする。ＣＰＡ活性を除去する上記成分は、必要ならば、一層多量に投与 する。促進クリアランスの代替法は記載した。 次に、ＣＰＧ接合体を、一連のボーラス注射または低速輸液によって投与する が、プロドラッグを同時に投与するのが好ましい。 プロドラッグは、一連のボーラス注射または低速輸液によって投与することが できる。プロドラッグとＣＰＧ接合体の投与は、通常は焼く４〜７日間継続する 。 ＣＰＡ接合体の投与から約７〜１０日後に、腫瘍部位の酵素活性を測定するの が望ましい。異種タンパク質に対する宿主応答を克服することができる成分の投 与を継続し、プロドラッグを投与停止し、ＣＰＧ接合体を停止することができる 。 ＣＰＡ接合体を上記と同様にして再輸液した後、血漿ＣＰＡ活性を除去する化 合物を上記と同様にして再輸液する。上記と同様な手続きを行った後、プロドラ ッグを再度投与開始する。 このサイクルは反復することができる。制限因子は、アラニンメトトレキセー トによる毒性であり、または異種タンパク質のいずれかに対する宿主抗体の展開 が用いられる。実施例３： キナゾリン抗葉酸の使用 実施例１および２に開示したのと同様な系を、報告されている一連のキナゾリ ン抗葉酸の少なくとも幾つかと共に用いることができる（Jones et al（1986）J ．Med．Chem．29，468-472;Jodrell et al（1991）Brit．J．Cancer 64，833-8; Harrap et al（1989）Advances in enzyme reaction 29，161;Jackman et al（1 991）Advances Enzyme Regulat．31，13;Jodrell et al（1990）Proc．Am．Asso c．Cancer Res．31，341）。これらの化合物は、例えばＮ¹⁰位およびベンゾイル 環における置換に関して天然の葉酸およびメトトレキセートと異なるが、天然の 葉酸およびメトトレキセートと同様に、ベンゾイル環に結合した末端グルタミン 酸残基を有している。従って、このシリーズの薬剤の少なくとも幾つかは、グル タミン酸のα位のアラニンのようなペプチド置換によって不活性化され、こ のようなアラニン−または他のペプチド一置換誘導体は、Kuefner et al、上記 引用に記載の方法、または当該技術分野で知られているその変法を用いて合成さ れる。同様に、このようなキナゾリン抗葉酸は、カルボキシペプチダーゼＧ２ま たは同様な酵素によって脱グルタミン酸化され、従って不活性化される。これら の化合物は、チミジレートシンテターゼの阻害によって作用するので、特に興味 深いものである。このような薬剤の化学的応用は、カルボキシペプチダーゼＡ、 およびカルボキシペプチダーゼＧ２によって分解された血漿中の活性薬剤によっ て活性化合物に転換されたプロドラッグ形態で投与することによって大幅に伸長 することができる。実施例４： 活性薬剤とプロドラッグとを識別する抗体の産生 活性薬剤(II)を認識するが、プロドラッグ(I)は認識しない抗体を生成させる ため、２種類の分子(I)および(II)の間の最大の相違の領域を表す化合物を合成 した。この領域は、安息香酸マスタード薬剤(II)の酸部分に相当する。安息香酸 自身は免疫原性を有するほど大きくはないので、酸領域に特異的な抗体を生成す る最も効果的な方法は、動物にキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ ）に以前に接合した安息香酸類似体を接種することであると考えた。アミド結合 によってアミノ安息香酸(VII)に結合したＬ−リシンアミノ酸からなる化合物を 合成した。次いで、(VII)を、分子のリシン部分のε−ＮＨ２基を用いる常法に よってＨＬＨに接合させ、総てＷＯ９３／１３８０６号明細書に記載の方法で特 異的免疫原(VIII)を生成した。実施例５： カルボキシペプチダーゼＧ２に対して反応性のモノクローナル抗体 の産生 カルボキシペプチダーゼＧ２に対して生じたモノクローナル抗体を、非腫瘍部 位の残留酵素活性のクリアランスおよび不活性化に用いた。 モノクローナル抗体は、下記の方法で作成した。Ｂａｌｂ／Ｃマウス（６〜８ 週齢）を、不完全フロイント・アジュバント中５０μｇＣＰＧ２を腹腔内に投与 した後、完全フロイント・アジュバント中ＣＰＧ２（それぞれ５０μｇＣＰＧ２ 、腹腔内）を２回１か月間隔で注射し、融合の２日前に２日間注射して（５０μ ｇおよび１００μｇ／ＰＢＳ、静脈内）免疫感作した。免疫脾臓細胞を、Koehle r and Milstein(1975)のハイブリドーマ処理法に従って非免疫グロブリン分泌Ｓ Ｐ２／０ミエローマと融合した。 抗−ＣＰＧ２抗体の存在は、固相間接ラジオイムノアッセイによって検出した 。ＣＰＧ２を０．０５Ｍリン酸緩衝液に溶解した１μｇ・ｍｌ^-1をポリビニルマ イクロタイタープレート（１００ｎｇ／ウェル）に入れ、乾燥させ、メタノール で固定し、０．０５％Tweenおよび０．１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ緩 衝液で洗浄した。上清または精製抗体試料をＰＢＳで希釈し、ＣＰＧ２をコーテ ィングしたマイクロタイタープレート（１００μｌ／ウェル）で３７℃で４時間 インキュベーションした後、¹²⁵Ｉを標識したウサギ抗マウスＩｇＧと共に１時 間インキュベーションした。ウェルをそれぞれの段階の間にＰＢＳ−Tween緩衝 液で３回洗浄し、最終洗浄の後、それぞれのウェルを切断して、ガンマーカウン ターで計数した。実施例６： 非腫瘍部位における残留酵素活性の減少 非腫瘍部位の酵素−巨大分子接合体の酵素部分を不活性化するが、腫瘍部位で は不活性化しないのが望ましい。この効果を達成する一つの方法は、本発明の化 合物を用いて治療を行う患者にガラクトース残基と接合した酵素部分に対して生 じた抗体を投与することである。 ＣＰＧ２に指定されたモノクローナル抗体は、酵素を不活性化する。抗体が腫 瘍部位の酵素を不活性化するのを防止するため、追加のガラクトース残基をこれ に接合させて、静脈内経路で投与するときに血漿中の酵素を未だ不活性化するこ とができるが、不活性化抗体は肝細胞上のガラクトースレセプターによって血漿 から速やかに除去されるようにする。 ガラクトシル化した抗−ＣＰＧ２モノクローナル抗体を投与して、血漿中の酵 素活性を除去した後、非ガラクトシル化した抗−ＣＰＧ２モノクローナル抗体の 一定量を投与して他の非腫瘍組織中の残留酵素活性を不活性化する。 モノクローナル抗体は、下記のプロトコールを用いてガラクトシル化する。活 性化誘導体の原液は、下記の方法で作成した。無水メタノール（１０ｍｌ）にシ アノメチル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラ クトピラノシド（Sigma C-4141）［４００ｍｇ］溶解したものを、無水メタノー ル１ｍｌ中ナトリウムメトキシド５．４ｍｇで室温で４８時間処理した。混合物 を、若干グリースを塗布した栓を取り付けた２５ｍｌのQuickfitコニカルフラス コに保持した。 モノクローナル抗体の原液（１．３ｍｇ／ｍｌ）は、０．２５Ｍホウ酸ナトリ ウム緩衝液、ｐＨ８．５中で調製する。活性化したガラクトシル誘導体の必要量 の分量（８０、４０、２０、１０μｌ）を、３ｍｌガラスアンプルに分配し、窒 素気流中で蒸発させてガラス状残渣とする。抗体（２００μｇ）の溶液を、残渣 が溶解するまで添加混合する。室温で２時間後、溶液をＰＢＳの３種類の変化量 に対して透析する。 製剤を、上記の容積の倍数を採ることによってスケール・アップする。実施例７： トリメトレキセートとフォリン酸助剤を用いる細胞毒性療法 本発明は、ＷＯ９３／１３８０５号明細書と同様に、腫瘍部位で連続的な抗葉 酸作用を行い、正常組織を抗葉酸作用から保護する手段を提供することができる 。 第一段階は、免疫抑制または免疫トレランス誘発剤を創始することであり、こ れは通常は、本発明の化合物を投与する２日以上前に行う。触媒性巨大分子が非 免疫原性であるときには、この段階は省略される。 巨大分子−ＣＰＧ２接合体を、静脈内または他の適当な経路によって投与する 。 数時間放置して、接合体を腫瘍部位に局在化させた後、抗体を投与する。これは 、酵素上の活性部位に指定し、この場合に追加のガラクトース残基を抗体に結合 させて肝細胞ガラクトースレセプターを介するその速やかなクリアランスが確保 されるようにすることができる。非腫瘍部位からの接合体の速やかなクリアラン スの代替機構は、上記している。酵素濃度が血漿中で極めて低いまたは検出不能 な濃度にまで低下したときには、トリメトレキセートをボーラスまたは連続輸液 によって投与し、血漿濃度を一定に保持する。トリメトレキセートと同時に、フ ォリン酸を、トリメトレキセートの毒性から正常組織を保護するのに十分な投与 量で投与する。ＣＰＧ２が局在化している腫瘍部位に到達するフォリン酸を、葉 酸と同様に脱グルタミン酸化し、不活性化した後、これは細胞に進入し、細胞を トリメトレキセートから保護することができる。この方法では、正常組織は、フ ォリン酸によってトリメトレキセートの作用から保護することができるが、保護 分子は腫瘍部位で速やかに分解する。他の抗葉酸薬剤であって、トリメトレキセ ートと同様にＣＰＧ２によって分解しないものを、トリメトレキセートの代わり に用いることができる。実施例８： チミジレートシンテターゼ阻害剤およびチミジン助剤を用いる細胞 毒性療法 同じ原理を、他の抗代謝物療法に適用することができる。例えば、ＣＢ３７１ ７およびＩＣＩ Ｄ１６９４のような重要な酵素チミジレートシンテターゼをブ ロックする薬剤の開発に対して、近年かなりの努力が向けられてきた（John et al 1991，BJC 64，833-8）。このような薬剤は、正常細胞でチミジレートシンテ ターゼもブロックするという点において通常の細胞毒性化合物と同じ制限を受け ると思われる。それらの作用は、チミジンによって可逆的である。従って、チミ ジン投与を用いて、正常組織をチミジレートシンテターゼ阻害剤から保護するこ とができるが、チミジンおよび内因性チミジンの保護作用は、例えばジヒドロチ ミンデヒドロゲナーゼのようなチミジン分解酵素、またはチミジンの腫瘍細胞へ の進入を阻害するチミジンキナーゼによって腫瘍部位に限定されることがある。 チミジン阻害剤酵素または化合物は、本発明による非特異的巨大分子によって送 達される。 ジヒドロチミンデヒドロゲナーゼは、正常なヒトのリンパ球から得ることがで きるので（Shiotani & Weber 1989 Cancer Res．49，1090-1094）、これを非免 疫原性巨大分子に接合することによって低免疫原性の巨大分子−酵素接合体を生 成することができるという利点を有する。実施例９： ＰＥＧ−酵素接合体および非腫瘍特異的ＩｇＧ−酵素接合体の腫瘍 吸収 ヌードマウスに異種移植したＬＳ１７４Ｔヒト結腸癌では、¹²⁵Ｉ−ポリエチ レングリコール−カルボキシペプチダーゼＧ２の投与量は、２４時間後には腫瘍 １ｇ当たり１．８１％となり、７２時間後でも１．２％が存在していた（第１図 を参照されたい）。本来の¹²⁵Ｉ−ＣＰＧ２では、０．３５％および０．０９％ の匹敵し得る値が得られた。 ＬＳ１７４Ｔ（ＣＥＡ陽性）およびＣＣ３（ＣＥＡ陰性）異種移植片でのカル ボキシペプチダーゼＧ２に接合した¹²⁵Ｉ抗−ＣＥＡモノクローナル抗体の組織 分布の比較では、下記の結果を得た。ＬＳ１７４Ｔは、静脈内注射の２４時間後 には、腫瘍１ｇ当たり注射投与量が１．４％であり、ＣＣ３は０．９％であった 。４８時間後には、ＬＳ１７４Ｔは１．２％であり、ＣＣ３は０．７％であり、 ７日目にはＬＳ１７４Ｔは０．３５％となり、ＣＣ３は０．３％となった。従っ て、非ＣＥＡ産生腫瘍に保持される接合体の量は、ＣＥＡ産生腫瘍に保持された 量の半分を上回った（S.K．Sharma，ＰｈＤ審査論文、ロンドン大学、１９９１ 年）。 抗体酵素接合体の広範囲の投与量に亙って（２０〜３００μｇ／マウス）、腫 瘍１ｇ当たりの注射投与量の比率は、実験限界内では一定に保たれる（１．５７ 〜１．７７％）ことも示された（S.K．Sharmaの博士論文）。 従って、腫瘍特異的抗体と比較して、非特異的巨大分子による酵素の腫瘍への 送達が余り効率的でないことは、投与量を約２倍に増加することによって補償す ることができる。 ヒト結腸癌ＬＳ１７４Ｔを有するヌードマウスにおけるＰＥＧに接合したＣＰ Ｇ２の分布も、検討した。材料および方法 分子量が５０００のメトキシポリエチレングリコール−ｐ−ニトロフェノール カーボネートは、Sigmaから入手した。分子量が２０００のメトキシポリエチレ ングリコール−ｐ−ニトロフェノールカーボネートは、Veronese，F.M.，Largaj olli，R.，Boccu，E.，Benassi，C.A.およびSchiavon，O．（1985）タンパク質 の表面改質−フェニルクロロホルメートによるモノメトキシ−ポリエチレングリ コールの活性化、およびリボヌクレアーゼおよび超酸化物ジスムターゼの改質(S urface modification of proteins-Activation of monomethoxy-polyethylene g lycols by phenyl chloroformates and modification of ribonuclease and sup er oxide dismutase）App．Biochem．Biotech．11，141-152に記載の方法によっ て合成した。４−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−フェノキシカ ルボニル−Ｌ−グルタミン酸（フェノールマスタードプロドラッグ）は、公表さ れた手続きに従って合成し、その構造を図に示す（Dowell，R.，Springer，C．J .，Davies，D.H.，Hadley，E.M.，Burke，P.J.，Boyle，F.T.，Melton，R.G.，C onnors，T.A，Blakey，D.C.およびMauger，A.B．(1996)．抗体指定酵素プロドラ ッグ療法（ＡＤＥＰＴ）のための新規なマスタードプロドラッグ：アミド結合の 代替物(New mustard prodrugs for antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT):Alternative to the amide link)J．Med．Chem．39，1100-1105）（こ のプロドラッグは、ＷＯ９４／０２４５０号明細書に記載されている。） ＰＥＧのＣＰＧ２への共有結合 分子量５０００のメトキシポリエチレングリコール＝ｐ−ニトロフェニルカー ボネート５１６ｍｇまたは分子量２０００のメトキシポリエチレングリコール＝ ｐ−ニトロフェニルカーボネート２０６．４ｍｇを、０．２Ｍリン酸ナトリウム 緩衝液（ｐＨ７．２）６．７ｍｌにＣＰＧ２ ３８．１３ｍｇを溶解したものに 加えた（Veronese，F.M.，Largajolli，R.，Boccu，E.，Benassi，C.A.およびSc hiavon，O．（1985）タンパク質の表面改質−フェニルクロロホルメートによる モノメトキシ−ポリエチレングリコールの活性化、およびリボヌクレアーゼおよ び超酸化物ジスムターゼの改質(Surface modification of proteins-Activation of monomethoxy-polyethylene glycols by phenyl chloroformates and modifi cation of ribonuclease and superoxide dismutase)App．Biochem．Biotech．1 1，141-152）。室温で１時間後、未反応ＰＥＧを、XM-50メンブランおよび０． １Ｍリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７．２を透析溶液として用いて限外濾過セル (Amicon)中で除去した。ポリエチレングリコール改質ＣＰＧ２を、０．１Ｍリン 酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ７．２で平衡にしたスクロースS/12 HRカラム(Pharma cia)を用いてＦＰＬＣゲル濾過によって未改質タンパク質から分離し、同じ緩衝 液で溶出した。動物試験 下図（第２〜６図）は、ヒト結腸癌ＬＳ１７４Ｔを有するヌードマウスにおけ るＰＥＧに接合したカルボキシペプチダーゼＧ２の生体分布を示している。マウ スに、時点当たり４尾のマウスを用いて具体的量の酵素（酵素単位として測定） を静脈内注射した。注射から２４時間、４８時間および７２時間後、幾つかの場 合には９６時間および１２０時間後に、マウスを屠殺した。血漿中のＣＰＧ２活 性を、メトトレキセートを基質として用いて分光光度分析法によって測定した。 腫瘍および他の組織中のＣＰＧ２活性を、メトトレキセートを基質として用いて ＨＰＬＣによって測定した。 未接合ＣＰＧ２は、血液腫瘍および正常組織から速やかに除かれる。７２時間 後の本来のＣＰＧ２およびＰＥＧ−ＣＰＧ２の生体分布を、第７図および第８図 に示す。 第２ａ図 ＰＥＧ５０００分子量に接合したＣＰＧ２、ＣＰＧ２ １分子当た り平均３２個のＰＥＧ分子、２０μｇ／マウスｉ．ｖ．。図は、組織１ｇ当たり の注射投与量の百分率を示す。 第２（ｂ）図 相当する腫瘍対正常組織の比。 第３（ａ）図 ＰＥＧ２０００分子量に接合したＣＰＧ２、ＣＰＧ２ １分子 当たり平均２７個のＰＥＧ分子、２５酵素単位／マウス。ＨＰＬＣによる検討。 第３（ｂ）図 相当する腫瘍対器官の比。クリアランスなし。 第４（ａ）図 ガラクトシル化ＳＢ４３（清澄化抗体）の使用の後のＣＰＧ２ 活性の生体分布。マウスに、ＰＥＧ２０００分子量に接合したＣＰＧ２であって 、ＣＰＧ２ １分子当たり平均２２モルのＰＥＧを時間０に投与した。ガラクト シル化モノクローナル抗体ＳＢ４３を、１９、２０および２１時間後に腹腔内経 路で投与した。マウスを、ＣＰＧ２の投与から２４時間後に屠殺した。 第４（ｂ）図 上記プロトコールによる腫瘍対器官比。 第５図 ＰＥＧ５０００またはＣＰＧ２に接合したモノクローナル抗体Ａ５Ｂ ７−（Ｆａｂ’）２（ＡＤＥＰＴ）に接合したＣＰＧ２ ２０単位を比較するＬ Ｓ１７４Ｔ腫瘍におけるＣＰＧ２活性。 第６図 ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有するヌードマウスに、ＣＰＧ２−ＰＥＧ（２２ のＰＥＧ分子、ＰＥＧ５０００）２５酵素単位を投与した後、２０時間、２３時 間、２６時間後にガラクトシル化ＳＢ４３を投与した。ＣＰＧ２−ＰＥＧの投与 から４８時間後に、フェノールプロドラッグ２５ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与し、 １時間間隔で全部で３回反復投与した。 第４（ａ）図および第４（ｂ）図に関して、これらは、清澄化抗体を使用した 後の良好な腫瘍対正常組織濃度および比を示す。しかしながら、ヒト患者と同様 にマウスでも効率的に清澄化抗体を投与することはできない。 ＬＳ１７４Ｔ腫瘍モデルにおける治療濃度で、本発明者は、ＣＰＧ２当たり２ ２のＰＥＧのＰＥＧ５０００をＣＰＧ２クリアランス抗体ＳＢ４３およびフェノ ールプロドラッグと共に用いると、未処理コントロールと比較して成長が有意に 遅延することを示した。 本発明者は、酵素分子（ＣＰＧ２、分子量８３，０００）当たり１３〜３２の ＰＥＧ分子の範囲でＰＥＧ（分子量５０００）を検討し、分子量が大きくなると 、得られる酵素の血漿濃度が高くなりかつ一層延長される。血漿濃度が高くなる と、腫瘍モデルＬＳ１７４Ｔにおける腫瘍濃度が高くなる。一つの目的は、腫瘍 中にできるだけ多くの酵素を取り入れ、酵素の有効濃度が腫瘍中で維持される期 間を延長することであり、血中の酵素の最高濃度を生じる接合体が好ましい。し かしながら、接合体の選択は、酵素の所望な濃度を（複数の）腫瘍で達成した後 でかつプロドラッグを投与する前に、血液から酵素を除去する必要があることも 考慮しなければならない。血中から除去することが困難な接合体は不都合であり 、これら２つの要件の間で妥協が必要となることがある。下降部分は、ＰＥＧ（ ５０ ００）３２−ＣＰＧ２の高くかつ持続する血漿濃度は、血漿中の活性ＣＰＧ２の 濃度を低くするには、更に多量の清澄化抗体を用いるべきであることを示唆して いるものである。 ＰＥＧ５０００のＰＥＧ２０００との比較では、本発明者の検討は、酵素の腫 瘍濃度は同様であるが、ＰＥＧ２０００での血漿濃度は低い。従って、酵素１分 子当たり２０〜４０のＰＥＧ分子の範囲の分子量が２０００のＰＥＧが好ましく 、総分子量は約１３０〜１６０ｋＤａｌの範囲となるが、水和の結合水は、遥か に大きな分子量の分子と同等な分子の大きさを生じる。実施例１０： ＰＥＧ−ＮＱＯ２接合データ ＮＱＯ２は、ＣＰＧ２（分子量８００００）よりずっと小さな酵素である（分 子量２４０００）。静脈内投与の後に、ＮＱＯ２が腎臓によって容易に排泄され ず、従って腫瘍に局在化しないようにするためには、接合体の分子量が＞７００ ００となるようにするのが望ましい。これは、誘導体形成およびポリエチレング リコール分子量５０００（Ｐｅｇ５０００）への接合によって行った。ＮＱＯ２ の各分子に１４分子以上のＰｅｇ５０００が結合することによって、推定分子量 が９００００の接合体が得られた。 第２表 ＬＳ１７４Ｔ異種移植片での¹²⁵Ｉ−ＰＥＧ−ＣＰＧ２の分布 ２４時間 ％ＩＤ／ｇ組織 １．６１±０．３ ０．６３±０．０７ ０．９８±０．１５ ０．５８±０．０９ ０．３６±０．０６ ０．１４±０．０３８ １．８１±０．４７ ７２時間 ０．３８±０．０８ ０．２６±０．０４ ０．３８±０．０６ ０．１４±０．０２５ ０．１０±０．０２ ０．０３±０．０１ １．２±０．２１

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年９月２２日（１９９８．９．２２） 【補正内容】 請求の範囲 １． 下記成分(i)〜(iii)を含んでなる３成分治療薬系。 （i） 第一の化合物、 （ii）腫瘍抗原に特異的に結合しないが、哺乳動物の血管コンパートメント に投与した後哺乳動物の腫瘍に吸収することができ、かつ第一の化合物 を第二の化合物に転換することができる、触媒性巨大分子、 (iii)上記の血管コンパートメントに投与した後、血管コンパートメントお よび正常（非腫瘍）組織での上記の触媒転換活性のレベルを減少させる 阻害剤。 ２． 触媒性巨大分子が、（i）酵素またはその部分と(ii)巨大分子との、接合 体または融合体であり、この接合体または融合分子の分子量が少なくとも６ ０，０００である、請求項１に記載の系。 ３． 巨大分子が、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリアミノ酸、免 疫グロブリン、アルブミンのような非腫瘍特異的タンパク質、またはヒドロ キシプロピルメチルアクリルアミドである、請求項２に記載の系。 ４． 阻害剤が酵素を不活性化する小化合物である、請求項１〜３のいずれか一 項に記載の系。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｋ 37/48

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 下記成分(i)〜(iii)を含んでなる３成分治療薬系。 （i） 第一の化合物、 （ii）腫瘍抗原に特異的に結合しないが、哺乳動物の血管コンパートメント に投与した後哺乳動物の腫瘍に吸収することができ、かつ第一の化合物 を第二の化合物に転換することができる、触媒性巨大分子、 （iii）上記の血管コンパートメントに投与した後、血管コンパートメント および正常（非腫瘍）組織での上記の触媒転換活性のレベルを減少させ る阻害剤。 ２． 触媒性巨大分子が、（i）酵素またはその部分と、(ii)巨大分子との、接 合体または融合体であり、この接合体または融合分子の分子量が少なくとも ６０，０００である、請求項１に記載の系。 ３． 巨大分子が、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリアミノ酸、免 疫グロブリン、アルブミンまたはトランスフェリンのような非腫瘍特異的タ ンパク質、またはヒドロキシプロピルメチルアクリルアミドである、請求項 ２に記載の系。 ４． 阻害剤が酵素を不活性化する小化合物である、請求項１〜３のいずれか一 項に記載の系。 ５． 阻害剤が抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の系。 ６． 抗体阻害剤がポリガラクトシル化されている、請求項５に記載の系。 ７． 触媒性巨大分子を腫瘍細胞によってインターナリゼーションし、内因性の 細胞内補助因子の存在下ではその非存在下においてよりも上記転換を一層行 うことができる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の系。 ８． 第一の化合物がプロドラッグであり、第二の化合物が第一の化合物より細 胞毒性が高い、請求項１〜７のいずれか一項に記載の系。 ９． 第一の化合物が代謝物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の系。 １０． 請求項８に記載の３成分系と、更に抗代謝物細胞毒性化合物であって、 その細胞毒性が上記の第二の化合物の存在によるよりも上記の第一の化合物 の存在により一層減少するものと、を含んでなる４成分系。 １１． 患者の腫瘍の治療法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の３ 成分または請求項１０に記載の４成分を投与する段階を含んでなる、方法。 １２． 腫瘍抗原に特異的に結合しないが、哺乳類の血管コンパートメントに投 与した後に哺乳類の腫瘍に吸収することができ、かつ患者の腫瘍を治療する ための医薬の製造において第一の化合物を第二の化合物に転換することがで きる、触媒性巨大分子の使用であって、患者が第一の化合物を投与される前 、投与の際、若しくは投与後、ならびに、上記血管コンパートメントへ投与 した後に、血管コンパートメントおよび正常（非腫瘍）組織における上記触 媒転換活性のレベルを減少させる阻害剤を患者が投与される前、投与の際、 若しくは投与後における、その使用。 １３． 触媒性巨大分子が、（i）酵素またはその部分と、(ii)巨大分子との、 接合体または融合体であり、この接合体または融合体分子の分子量が少なく とも６０，０００である、請求項１２に記載の使用。 １４． 巨大分子がポリエチレングリコール、デキストラン、ポリアミノ酸、ま たは免疫グロブリン、アルブミンまたはトランスフェリンのような非腫瘍特 異的タンパク質、またはヒドロキシプロピルメチルアクリルアミドである、 請求項１３に記載の使用。