JP2001503974A - 心不全の患者の同定および治療のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 AMPD1遺伝子の変異対立遺伝子を有する患者を同定することにより、うっ血性心不全を罹患する患者の臨床上の結果を予測する方法が提供される。AMPD1活性を阻害する組成物を投与することによりうっ血性心不全を罹患する患者の寿命期間を増加させるための方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 心不全の患者の同定および治療のための組成物および方法序論 本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）により後援さ れる研究の中でなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。発明の背景 うっ血性心不全は、減退した心収縮機能並びに低下した運動耐久力により特徴 付けられる複雑な臨床上の症候群である。医学的な治療の進歩にも拘わらず、40 ％の患者が診断から１年以内に死亡し、そして70％が５年以内に死亡する。 心不全における寿命に関する多くの臨床上の予報値（predcitors）が同定され 、年齢、低下した心拍出量および高血圧を含んだ。しかしながら、臨床上のパラ メーターのみでは、うっ血性心不全の患者における寿命を予測することに限界が あった。個人の遺伝上の背景が鍵ともなるらしい。したがって、心不全の患者に おける改良されたかまたは低下した寿命に関連した遺伝マーカーを同定する必要 性が存在する。 アデノシンモノホスフェートデアミナーゼ１（AMPD1）遺伝子は、成人の心筋 細胞並びに成人骨格筋において発現されるAMPD複数遺伝子ファミリーの主要なメ ンバーである。約20％の白色人（Caucasions）およびアフリカ在住のアメリカ人 （African Americans）は、単一変異の対立遺伝子AMPD（+/-）に関してヘテロで あり、この遺伝子の第２コーディングエクソン中のナンセンス変異を特定する。 この変異は、前成熟ペプチド鎖停止、および触媒としては不活性な末端削除され たペプチドの生成に通じる。AMPD（+/-）遺伝子型によりもたらされる筋細胞中 のこの酵素活性の欠損は、いくつかの代謝における重要性の一つを有するらしい 。筋細胞中のAMPD1活性の顕著な低下は、AMPの脱アミノ化を制限することにより 、筋細胞中のアデニレートエネルギーの電荷を低下させるらしい。この酵素の活 性の部分的な低下は、筋細胞が、ATP異化作用に続いて、より多くのアデノシン を生成することを引き起こす。アデノシンは強力な心臓保護作用を有することが 知られているので、増大したアデノシンの生成は有益でありうる。うっ血性心不 全の患者においては、残りの心筋細胞がより大きな代謝の要求を経験して；よっ て、 AMPD活性の低下は、心機能を改良できるアデノシン生成の増大に通じるらしい。 したがって、AMPD活性を阻害する組成物および方法が望まれる。さらに、うっ 血性心不全を発症するかもしれない患者を同定する方法、または心臓移植により 利益を受けるかもしれない患者を同定する方法も、望まれる。発明の概要 AMPデアミナーゼ活性は、心不全の患者における臨床上の結果に影響すること が、今、見いだされた。AMPデアミナーゼ１遺伝子（AMPD1）の変異対立遺伝子を 有する患者は、彼らがうっ血性心不全を発症したならば、その変異対立遺伝子を 持たない患者に比して、顕著に長い余命を有することが見いだされた。さらに、 この変異対立遺伝子少なくとも１コピーを遺伝により受け継ぐ患者は、野生型対 立遺伝子に関してホモである患者に比して、心臓移植の推薦を要求する前に、心 不全の症状のより長い期間を示す。したがって、低下したAMPD活性の代謝の重要 性の一つまたは複数は、このAMPD変異対立遺伝子を遺伝により受け継ぎ、その後 心不全を発症する人々のための、改良された予後および寿命における利点を提供 するらしい。即ち、野生型対立遺伝子に関してホモであってうっ血性心不全を罹 患した人々におけるAMPD活性の低下は、これらの人々における予後並びに寿命の 利点を改良する。 したがって、本発明の目的は、うっ血性心不全の患者の治療のために、AMPD1 酵素またはAMPD1遺伝子ファミリーからの関連酵素を阻害するための組成物およ び方法を提供することである。 本発明の他の目的は、うっ血性心不全を罹患した患者の臨床上の結果を予測す るための方法、および心臓移植からもっとも利益を受けそうな患者を同定する方 法を提供することであって、この方法は、AMPD1遺伝子の変異対立遺伝子を用い て患者を同定することからなる。発明の詳細な説明 うっ血性心不全（CHF）は、しばしば、極めて短時間に致命的となる、人類共 通の疾患である。この疾患の処置のための効果的な治療の選択は、限られてきた 。しかしながら、CHFの患者において、AMPD1変異対立遺伝子がCHF症状の開始後 の延長された寿命に関連していることが、今、見いだされた。 臨床データは、進行したうっ血性心不全の132の連続する（consecutive）患者 （平均年齢52.8±11.2歳）から集められた。患者らは、評価されて（evaluated ）臨床データベースが構築されたが、医学的な経緯、体力測定、心室機能並びに 血液動力学の評価、および運動能力の測定を含んだ。左心室フラクション（LVEF ）を、標準エコー心電図またはゲート化血液プール分析（MUGA）により測定した 。心拍出量および血液動力学は、心臓カテーテル法実験室における熱希釈技術を 用いて測定された。運動能力は、ブレスバイブレス(breath-by-breath)、オンラ イン呼吸ガス分析を用いて標準最大運動試験プロトコルにより測定した。これら のデータは、初期の評価のときに得られ、全ての患者は心不全に関する最適な医 学治療に基づいて判断されたが、この研究時におけるアンギオテンシン変換酵素 阻害剤、利尿剤およびジゴキシンを含んだ。これらの患者は、心臓血管の疾患を 持たないそれぞれ91人および416人のボランティアを含む２つの異なる対照群と 比較された。 ゲノミックDNAを、各々の患者からの末梢白血球細胞から調製した。AMPD1遺伝 子型は、PCRに基づくアッセイである、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド検 出アッセイを用いて測定された。簡単に言えば、迅速な溶解技術によりゲノミッ クDNAを全血から抽出して、１×PCRバッファーおよび1.25ＵのTaq DNAポリメラ ーゼを用いてPCR増幅した。PCRプライマーは、以下：AMP 5’GCAATCTACATGTGTCT ACC（配列番号：１）およびAMP 3’ATAGCCATGTTTCTGAATTA（配列番号：２）であ った。94℃30秒間(変性)、55℃30秒間（アニール）および72℃30秒間（伸長合成 ）からなる30サイクルを実施した。PCR産物は、変性して、陽性対照と陰性対照 と共にナイロン膜上のスロットに二通りブロットした。このフィルターは、cDNA のヌクレオチド34において、正常または変異配列を表すキナーゼ標識オリゴヌク レオチドとハイブリダイズさせた。ヌクレオチド34における変異に関してホモの 人々からのDNAは、正常および変異オリゴヌクレオチドの両方とハイブリダイズ した。 CHFの患者および対照群のAMPD1(+/+)，AMPD1（+/-）およびAMPD1（-/-）遺伝 子型の頻度を比較した。遺伝子型頻度は、フィッシャーの精密な試験を用いて、 ケースと対照の間で比較された。AMPD1（+/+）とAMPD1（+/-）(-/-)遺伝子型の 間の心不全の症状の平均期間および中間の期間（median duration）を測定した 。 分析は、疾患の期間がAMPD1（+/+）とAMPD１（+/-）(-/-)遺伝子型の間で異なっ たか否かを、寿命分析技術を用いて評価することにより実施した。カプランマイ ヤー（Kaplan-Meier）および比例ハザードモデルの両方が適合した(Daniel，W． W．Applied Non-parametric Statistics，第２版、ボストン：PWS-Kent出版社（ 1990）；およびShapiro，S．S．and Wilk，M.B."An Analysis of Variance Test for Normality(Complete Subjects)"，Biometrika1965；52：591−611)。唯一 一人のCHF患者が、変異AMPD1対立遺伝子に関してホモであった。この研究の目的 のために、一人のAMPD1（-/-）の人を変異対立遺伝子ヘテロ群に含ませた；分析 からのこの人の除外は、あらゆる統計分析の結果を変化させなかった。全ての連 続変数は、平均±１標準偏差（S．D.）により計算された。 心不全の発症は、CHFの診断に関する最初の病院の入院により定義された。こ の日は、過去のチャートの再調査、直接の患者のインタビューおよび／または患 者の遺伝子型を知らされていない一人の研究者による推薦外科医との議論の何れ かにより確立および実証された。寿命の分析に関して、心不全の期間は、CHFに 関して最初の病院の入院から心臓移植、死亡、または研究観察期間の終了の何れ かまでの疾患症状の期間として定義された。さらに、全疾患期間は、直線復帰に よるカプランマイヤー分析の比例ハザードモデルの前の、年齢および性別に関し て適合された。ｐ値≦0.05において価値のない仮設が拒絶されうるなら、優位性 が確立された。 心臓移植の評価に関する推薦の時、132人のCHF患者の平均年齢は52.8±11.2歳 であった。平均LVEFは19.7％±6.7％であって、平均ピークＶＯ₂最大値は13.9± 4.9ml/kg/分であった。これらの値はニューヨーク心臓関連機能クラスII−IV心 不全症候学と一致する。CHFの病因は：１）冠状動脈疾患(ｎ＝69)；２）突発性 心筋(ｎ＝48)；および３）「その他」（Ｎ＝15，４弁膜症；２侵潤（infiltrative ）；３先天性；２心筋炎；４アルコール）を含んだ。臨床上の特徴のこの分布は 、心臓移植に関して評価されたもっとも推薦された集団に、極めて類似している (Loh et al．Card．Rev．1，218−227(1993))。アジア人はこれらの患者に含ま れなかったが、AMPD1変異対立遺伝子はこの集団に存在しないらしいので、重要 な排除であった(Morisaki et al．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 1992 89，6457 − 6461)。この研究に登録された132人の患者のうち、111人は野生型対立遺伝子に 関してホモであり(+/+)、そして20人がヘテロ（+/-）であり、そして一人が変異 対立遺伝子に関してホモ（-/-）であった。 最初の評価のとき、全ての患者は、重症な最終段階の心不全の生理学を示した (表１を参照)。LVEF、心係数(cariac index)、くさび法肺毛細管圧、ＶＯ₂最大 値および肺血管耐性（pulmonary vascular resistance）は、（+/+）遺伝子型対 （+/-）(-/-)遺伝子型のCHF患者の比較において顕著に異ならなかった。＊ｐ＜0.001＝AMPD1(+/-)(-/-)対AMPD1(+/+) 他の全ての比較ｐ＞0.05 全ての値＝平均±S．D. ＡＭＰＤ１(+/+)：野生型対立遺伝子に関してホモ ＡＭＰＤ１(+/-)：変異対立遺伝子に関してヘテロ ＡＭＰＤ１(-/-)：変異対立遺伝子に関してホモ ＣＡＤ：冠態動脈疾患 ＩＤＣＭＰ：突発性拡張性（dilated）心筋症 ＰＣＷＰ：くさび法肺毛細管圧 ＰＶＲ：肺血管耐性（pulmonary vascular resistance） ＶＯ₂:最大酸素消費 CHF症状に関する最初の病院の入院から、死亡または心臓移植の臨床上の終点 までの時間は、AMPD1(+/-)(-/-)患者とAMPD1(+/+)の間で顕著に異なり；AMPD1(+ /-)または(-/-)の7.6±6.5年対AMPD1(+/+)の3.2±3.6年であった(ｐ＜0.0001)。 心臓移植評価に関する最初の推薦の時に、変異AMPD1対立遺伝子を有する患者は 、AMPD1（+/+）ホモよりも年齢が高い傾向にあった。AMPD1(+/-)(-/-)患者の平 均年齢は56.8±7.1歳であったが、AMPD1(+/+)患者の平均年齢は52.1±11.6歳で あった(ｐ＝0.07；等しくない分散を予測するｔ-試験)。 最終段階のCHF症候学および心臓移植評価の推薦までの時間または進行の違い は、心不全の病因または遺伝子型間の性別における違いにより説明されない(表 １参照)。さらなるブラインドによるチャートの再調査は、医学的看護への接近 、処方された医学的養生法または患者の従順において、違いを検出しなかった。 しかしながら、カプランマイヤー分析は、一つまたは複数の変異AMPD1対立遺 伝子を有する人は、野生型対立遺伝子に関してホモの患者と比べて、最初のCHF 症状に関する入院加療の後、顕著に長い時間移植無しで生きることを証明した。 比例ハザードモデルは性別および年齢調節疾患期間に関して4.65の危険率（95％ 信頼区間：1.67、12.99）を示す。 心不全患者のAMPD1遺伝子型の頻度も測定された。CHF患者を２群に分類したが 、一方はCHF症状に関する最初の入院加療が５年以内であり、他方はCHF症状に関 する最初の入院加療が５年以上であった。CHF症状に関する最初の入院加療が５ 年以内の群に関しては、97人のうちの７人（16.7％）が変異AMPD1対立遺伝子を 遺伝により受け継いでいた。CHFに関する最初の入院加療から５年以上の群にお いては、35人のうちの14人が変異AMPD1対立遺伝子を遺伝により受け継いでいた( 43％)。マンテル-ヘンステル（Mantel-Haenstel）の分析法を用いると、AMPD1変 異対立遺 伝子を有する患者は、野生型対立遺伝子に関してホモの人に比して、心臓移植ま たは死亡までCHFを有して５年またはそれ以上の、8.6の優劣差の比（odds ratio ）を有する。 CHF患者のこれら２つの亜群のAMPD1遺伝子型頻度を正常ボランティア群と比較 した場合、CHFに関して入院加療後５年未満のCHF患者は、対照集団（25.3％）に 比して変異対立遺伝子頻度が低いこと（16.7％）が見いだされた。対照的に、CH Fに関する最初の入院加療から５年以上のCHF患者は、対照集団（25.3％）に比し て変異対立遺伝子頻度が高い（43％）傾向を示した。この発見は、AMPD1変異対 立遺伝子が、心臓移植の重要さに関する推薦を必要とする前に、穏やかかまたは より延長された進行の心不全を有する患者を同定するマーカーであることと整合 する。 したがって、本発明の一つの態様において、心不全の危険のある患者の同定の ための方法が提供される。この方法においては、患者が変異AMPD1対立遺伝子を 有するか否かについて患者を試験する。AMPD1遺伝子の変異対立遺伝子を有する 患者は、うっ血性心不全を発症する場合に、優位に延長された寿命を有する。即 ち、このマーカーを有さない患者は心不全に関してより高い危険性を有し、そし て変異対立遺伝子を有する患者に比して、より厳重な監視並びにより攻撃的な臨 床介入を必要とするかもしれない。AMPD1遺伝子型の患者を同定することにより 、もっとも適切な処置計画を選択することが可能である。心不全に関してもっと も高い危険性の患者を同定することができ、従って治療できる。本発明は、即ち 、心不全の患者のための臨床結果を予測並びに管理する手段を提供する。 本発明は、野生型AMPD1に関してホモのうっ血性心不全を罹患する患者におけ る処置、そしてより特定すれば寿命の延長のための方法および組成物も提供する 。ヒトにおいては、AMPD1は心筋細胞において発現される複数遺伝子ファミリー の主要メンバーである。心筋は極めて低レベルのAMPD酵素活性を有し；正常な心 筋は骨格筋に見いだされるほんの２％の活性を有する。以前の研究は、AMPD1（- /-）対立遺伝子に関してホモの患者からの骨格筋が、正常心臓に見いだされるの に匹敵する残余AMPD活性を有することを示した。この低レベルの残余AMPD活性は 、骨格筋におけるATP異化作用に続く増大したアデノシン生成に関連する。 アデノシンは、冠状動脈血流を高め、不整脈を抑圧し、虚血に予め備える応答 （ischemic preconditioning response）を誘導し、そしてサイトカイン生成を 抑圧する、強力な心臓保護薬剤である。アデノシン生成が高められたことによる これらの心臓保護効果は、少なくとも１コピーの変異AMPD1対立遺伝子を有する 心不全患者における増加した寿命を導くと信じられる。低下したAMPD1活性の結 果として局所的なアデノシン生成を高める組成物および方法は、よって、心不全 の患者に有用なはずである。したがって、AMPD酵素の阻害剤は、CHFを罹患する 患者における処置、およびより特定すれば寿命の延長に有用であると信じられる 。さらに、酵素活性のわずか50％程度の低下でさえも利益を受けると予測される 。 アデノシン自体は、インビボにおける極めて短い半減期（秒）のため、心不全 の処置のための所望性が証明されていない。さらに、アデノシンは冠状動脈への 選択的な侵入により投与されなければならず、しばしばアンギーナ（angina）を もたらす。したがって、AMPD酵素の阻害剤は心不全の処置に好ましい。本発明は 、心不全の処置のために、AMPD酵素阻害のための組成物および方法を提供する。 本発明によれば、効果的な量のAMPD阻害剤が心不全の患者に投与される。「効 果的な量」とは、AMPD酵素活性を少なくとも50％低下させる、本発明の組成物の 濃度を意味する。酵素レベルの50％の低下は、変異AMPD1対立遺伝子に関してヘ テロの人により享受される通常の良好な健康に基づけば、非毒性であるらしい。 投与される阻害剤の濃度は、本開示に基づいて当業者により、そして当業界にお いて既に公知のことがらにより、日常的に決定することができる。本発明の阻害 剤は、薬学上受容可能なキャリアー中で投与してよい。適切なキャリアーは、当 業界においてよく知られており、そして意図された投与ルート並びに標準の薬学 の習慣に従い投与される。例えば、静脈内投与のための製剤化は滅菌水溶液を含 んでよい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ロー，エヴァン アメリカ合衆国ペンシルバニア州19066, メリオン・ステイション，ブルックウェ イ・ロード 423 (72)発明者 スウェイン，ジュディス アメリカ合衆国ペンシルバニア州19096, ウィンウッド，ミル・クリーク・ロード 403

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アデノシンモノホスフェートデアミナーゼ１遺伝子の変異対立遺伝子を有 する患者を同定することからなる、うっ血性心不全を罹患する患者の臨床結果を 予測する方法。 ２．アデノシンモノホスフェートデアミナーゼ１遺伝子を阻害する組成物を、 うっ血性心不全を罹患する患者に投与することからなる、うっ血性心不全を罹患 する患者の寿命期間を増加させる方法。 ３．アデノシンモノホスフェートデアミナーゼ１の阻害剤および薬学上受容可 能なキャリアーからなる、うっ血性心不全を罹患する患者の寿命期間を増加させ る組成物。