【発明の詳細な説明】
ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、およびガレクチン10SV
発明の背景
発明の分野
本発明は、新規のガレクチンに関する。より具体的には、ヒトガレクチン8、
ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVをコードする単離された
核酸分子が提供される。ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、および
ガレクチン10:SVのポリペプチド、それらのポリペプチドを産生するベクター、
宿主細胞、および組換え方法もまた提供される。本発明は、さらに、ガレクチン
8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVの活性のアゴニスト
およびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。細胞増殖
障害を検出するための診断方法ならびに自己免疫疾患、ガン、および炎症性疾患
を含む細胞増殖障害のための治療方法もまた、提供される。
関連技術分野
レクチンは、特定の炭水化物構造に結合するタンパク質であり、従って特定の
糖結合体を認識し得る。Barondesら、J.Biol.Chem.269(33):20807-20810(1994
)。ガレクチンは、関連アミノ酸配列を有するβガラクトシド結合レクチンのフ
ァミリーのメンバーである(概論については、Barondesら、Cell 76:597-598(19
94);Barondesら、J.Blol.Chem.269(33):20807-20810(1994年8月)を参照の
こと)。ガレクチン1(L-14-1、L-14、RL−14.5、ガラプチン、MGBP、GBP、BHL
、CHA、HBP、HPL、HLBP 14、rIML-1としてもまた知られる)は、14,500のサブユ
ニット分子量を有するホモダイマーであり、これは、平滑筋および骨格筋に豊富
に存在しており、多くの他の細胞型に存在する(Couraudら、J.Biol.Chem.264:1
310-1316(1989))。ガラクチン2は、元来、肝ガンに見い出された。そして、こ
れは、14,650のサブユニット分子量を有するホモダイマーである(Gittら、J.Bi
ol.
Chem.267:10601-10606(1992))。ガレクチン3(Mac-2、EPB、CBP-35、CBP-30、
およびL-29としてもまた知られる)は、活性化マクロファージおよび上皮細胞に
豊富に存在し、そして26,320と30,300との間の見かけ上の分子量を有するモノマ
ーである(Cherayliら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:7324-7326(1990))。ガレ
クチン4は、36,300の分子量を有し、2つの炭水化物結合ドメインを単一のポリ
ペプチド鎖内に含む(Odaら、J.Biol.Chem.268:5929-5939(1993))。ガレクチン
5およびガレクチン6は、Barondesら、Cell 76:597-598(1994)に言及されてい
る。ヒトガレクチン7は、15,073の分子量を有し、そして主に重層扁平上皮に見
い出される(Madsenら、J.Biol.Chem.270(11):5823-5829(1995))。
動物レクチンは、一般に、細胞−細胞相互作用および細胞−マトリクス相互作
用を調節するのにおいてしばしば機能する。ガレクチン1は、それが存在する細
胞型に依存して、細胞接着を促進するかまたは阻害するかのいずれかであること
が示されている。ガレクチン1は、骨格筋における細胞−マトリクス相互作用を
阻害する(Cooperら、J.Cell.Biol.115:1437-1448(1991))。他の細胞型におい
て、ガレクチン1は、細胞−マトリクス接着を、おそらく、細胞表面と基質複合
多糖を架橋することにより促進する(Zhouら、Arch.Biochem,Biophys.300:6-17(
1993);Skrincoskyら、Cancer Res.53:2667-2675(1993))。
ガレクチン1はまた、細胞増殖(Wellsら、Cell 64:91-97(1991))およびいく
つかの免疫機能(Offnerら、J.Neuroimmunol.28:177-184(1990))の調節に関与
する。ガレクチン1は、T細胞のアポトーシスを媒介することにより免疫応答を
制御することが示されている(Perilloら、Nature 378736-739(1995))。
ガレクチン3は、制限された培養条件下で培養された細胞の増殖を促進する(
Yangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93.6737-6742(1996年6月))。細胞中のガレ
クチン3発現は、アポトーシスに対する耐性を付与し、これは、ガレクチン3が
アポトーシスの通常の経路を妨害する細胞死サプレッサーであり得ることを示す
(同上)。
従って、当該分野において、免疫応答を調節するための治療および診断の開発
における有用なツールとして役立ち得る新規のガレクチンの同定についての必要
性が存在する。
発明の要旨
本発明は、それぞれ配列番号1、2A〜2B、3A〜3B、および4A〜4B(それぞれ、
配列番号2、4、6、および8)に示されるアミノ酸配列を有するガレクチン8
、ガレクチン9、ガレクチン10またはガレクチン10SVのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子、または1996年9月24日にATCC受
託番号97732、97733、および97734として細菌宿主中に寄託されたcDNAクローン
によりコードされたアミノ酸配列を提供する。
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこ
の組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞
を作製する方法およびガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10またはガレク
チン10SVのポリペプチドまたはペプチドの組換え技術による産生のためにそれら
を使用する方法に関する。
本発明は、さらに、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドによりコードさ
れるアミノ酸配列を有する、単離されたガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチ
ン10またはガレクチン10SVのポリペプチドを提供する。
本発明はまた、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10またはガレクチン
10SVにより誘導される細胞応答を増強し得るかまたは阻害し得る化合物を同定す
るスクリーニング方法を提供する。この方法は、ガレクチン8、ガレクチン9、
ガレクチン10またはガレクチン10SVを発現する細胞を候補化合物と接触させるこ
と、細胞応答をアッセイすること、およびこの細胞応答と標準の細胞応答(この
標準は、候補化合物の非存在下で接触がなされる場合にアッセイされる)とを比
較することを包含し、それにより、標準に対して増大した細胞応答は化合物がア
ゴニストであることを示し、そして標準に対して減少した細胞応答は化合物がア
ンタゴニストであることを示す。
別の局面において、βガラクトシダーゼ糖に結合しているガレクチン8、ガレ
クチン9、ガレクチン10またはガレクチン10SVに対して候補化合物が有する効果
を決定することを含む、アゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニ
ングアッセイが提供される。特に、この方法は、βガラクトシダーゼ糖とガレク
チン8、ガレクチン9、ガレクチン10またはガレクチン10SVのポリペプチドと候
補化合物とを接触させること、ならびにβガラクトシダーゼ糖に結合しているガ
レクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10またはガレクチン10SVが候補化合物の
存在に起因して増大するかまたは減少するかを決定することを包含する。
本発明は、障害の診断の間に有用な診断方法を提供する。
本発明のさらなる局面は、体内におけるガレクチン8、ガレクチン9、ガレク
チン10またはガレクチン10SVの活性のレベルの増大が必要とされる個体を処置す
る方法に関し、この方法は、治療有効量の単離された本発明のガレクチン8、ガ
レクチン9、ガレクチン10またはガレクチン10SVのポリペプチドまたはそれらの
アゴニストを含む組成物をそのような個体に投与することを包含する。
本発明のなおさらなる局面は、体内におけるガレクチン8、ガレクチン9、ガ
レクチン10またはガレクチン10SVの活性のレベルの減少を必要とする個体を処置
する方法に関し、この方法は、治療有効量のガレクチン8、ガレクチン9、ガレ
クチン10またはガレクチン10SVアンタゴニストを含む組成物をそのような個体に
投与することを包含する。
図面の簡単な説明
図1は、ガレクチン8のヌクレオチド(配列番号1)および推定アミノ酸(配
列番号2)の配列を示す。タンパク質は、約36kDaの推定分子量を有する。
図2A〜2Bは、ガレクチン9のヌクレオチド(配列番号3)および推定アミノ酸
(配列番号4)の配列を示す。タンパク質は、約34.7kDaの推定分子量を有する
。
図3A〜3Bは、全長ガレクチン10のヌクレオチド(配列番号5)および推定アミ
ノ酸(配列番号6)の配列を示す。タンパク質は、約35.7kDaの推定分子量を有
する。
図4A〜4Bは、ガレクチン10スプライシング変異体(ガレクチン10SV)のヌクレ
オチド(配列番号7)および推定アミノ酸(配列番号8)の配列を示す。タンパ
ク質は、約22.4kDaの推定分子量を有する。
図5A〜5Eは、ガレクチン8、ガレクチン9、およびガレクチン10のアミノ酸
配列と、ヒトガレクチン2(配列番号9)、ヒトガレクチン3(配列番号10)、
ラットガレクチン4(配列番号11)、ラットガレクチン5(配列番号12)、ヒト
ガレクチン7(配列番号13)、ラットガレクチン3(配列番号14)、ラットガレ
クチン8(配列番号15)およびヒトガレクチン1(配列番号16)との間のアミノ
酸配列類似性の領域を示す。
図6は、ガレクチン10SVタンパク質とラットRL30タンパク質(配列番号17)と
の間のアミノ酸配列類似性の領域を示す。
図7は、ガレクチン10タンパク質とガレクチン10SVタンパク質との間の相同
性比較を示す。
図8、9、10、および11は、それぞれ、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレク
チン10、およびガレクチン10SVのアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、
およびコイルの領域;親水性および疎水性;両親媒性領域;可撓性領域;抗原性
指数および表面確率を示す。「抗原性指数-Jameson-Wolf」グラフにおいて、図
1(配列番号2)のアミノ酸残基55〜101、137〜162、180〜193、216〜266、図2
A〜2B(配列番号4)のアミノ酸残基62〜102、226〜259、197〜308、図3A〜3B(
配列番号6)のアミノ酸残基25〜77、84〜105、129〜140、156〜183、195〜215
、および241〜257、ならびに図4A〜4B(配列番号8)の25〜77、84〜105、129〜
140、および156〜183は、それぞれ、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン1
0、またはガレクチン10SVのタンパク質の、示された高度な抗原性領域に対応す
る。
詳細な説明
本発明は、それぞれ図1、2A〜2B、3A〜3B、および4A〜4B(それぞれ、配列番
号2、4、6、および8)に示されるアミノ酸配列(これは、クローン化された
cDNAを配列決定することにより決定された)を有するガレクチン8、ガレクチン
9、ガレクチン10またはガレクチン10SVのポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドを含む単離された核酸分子を提供する。本発明のガレクチン8、ガレクチ
ン9、ガレクチン10およびガレクチン10SVのタンパク質は、他のガレクチンおよ
びラットRL30タンパク質(図5A〜5Eおよび6)(配列番号9〜17)と配列相同性
を共有する。図1、2A〜2B、および4A〜4B(それぞれ、配列番号1、3、および
7)に示されるヌクレオチド配列は、HSIAL77、HTPBR22、およびHETAS87クロー
ン(これらは、1996年9月24日にアメリカンタイプカルチャーコレクション、12
301 Park Lawn Drive,Rockville,Maryland 20852に寄託され、そしてそれぞれ
受託番号第9T732号、同第97733号、および同第97734号を与えられた)を配列決
定することにより得られた。寄託されたクローンは、pBluescriptSK(-)プラスミ
ドに含まれる(Stratagene,LaJolla,CA)。
図3A〜3B(配列番号5)に示されるヌクレオチド配列(これは、全長ガレクチ
ン10タンパク質をコードする)は、ヒト子宮内膜ガンライブラリーから得られた
cDNAクローンを配列決定することにより得られた。
核酸分子
他に示されない限り、本明細書中でDNA分子を配列決定することによって決定
されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化DNA配列決定機(例えば、Applied B
iosystems,Inc.からのModel 373)を用いて決定され、そして本明細書中で決定
されるDNA分子によってコードされるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク
質のすべてのアミノ酸配列は、上記のように決定されるDNA配列の翻訳によって
予想された。従って、この自動化アプローチによって決定された任意のDNA配列
について当該分野において公知のように、本明細書中で決定される任意のヌクレ
オチド配列はいくつかの誤りを含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチ
ド配列は、配列決定されるDNA分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的
には少なくとも約90%の同一、より代表的には少なくとも約95%から少なくとも
約99.99%の同一である。実際の配列は、当該分野において周知の手動DNA配列決
定方法を含む他のアプローチによってより正確に決定され得る。当該分野におい
てまた公知のように、実際の配列と比較した、決定されるヌクレオチド配列にお
ける単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフト
を引き起こし、その結果、決定されるヌクレオチド配列によってコードされる予
想されるアミノ酸配列は、挿入または欠失のような点にて始まる配列決定される
DNA分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる。
本明細書中に提供される情報(例えば、図1、2A〜2B、3A〜3B、および4A〜4B
に示されるヌクレオチド配列)を用いて、それぞれ、ガレクチン8、ガレクチン
9、ガレクチン10またはガレクチン10SVのポリペプチドをコードする本発明の核
酸分子が、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順(例えば、出発材料
としてmRNAを用いてcDNAをクローニングするための手順)を用いて得られ得る。
本発明の例として、図1、2A〜2B、3A〜3B、および4A〜4Bに記載される核酸分子
(それぞれ、配列番号1、3、5、および7)は、それぞれ、ヒト成人小腸、ヒ
ト膵臓腫瘍、ヒト子宮内膜腫瘍、およびヒト子宮内膜腫瘍に由来するcDNAライブ
ラリーにおいて見い出された。これらの遺伝子はまた、以下の組織(膵臓、結腸
、小腸、脳、骨髄、腎臓、肺、脾臓、および精巣組織)に由来するcDNAライブラ
リーにおいて同定された。ガレクチン8(配列番号1)は、ヒト結腸および小腸
の細胞に主に発現するようである。
それぞれ図1、2A〜2B、3A〜3B、および4A〜4Bのガレクチン8、ガレクチン9
、ガレクチン10またはガレクチン10SVのcDNAの決定されたヌクレオチド配列(配
列番号1、3、5、および7)は、それぞれ、323、311、317、および200アミノ
酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(それぞれ、図
1、2A〜2B、3A〜3B、および4A〜4Bのヌクレオチド配列(配列番号1、3、5、
および7)の、それぞれ52〜54、16〜18、118〜120、および118〜120における開
始コドンを伴う)、およびそれぞれ、約36、34.7、35.7、および22.4kDaの推定
分子量を含む。それぞれ、図1、2A〜2B、3A〜3B、および4A〜4Bに示されたガレ
クチン8、ガレクチン9、ガレクチン10およびガレクチン10SVのタンパク質(配
列番号2、4、6、および8)は、他のガレクチンと相同性を共有する(例えば
、図5A〜図5Eを参照のこと)。
当業者が理解するように、上記の配列決定の誤りの可能性、ならびに異なる既
知タンパク質についてのプロセシング部位の多様性に起因して、寄託されたcDNA
によりコードされる推定のガレクチン8およびガレクチン9のポリペプチドは、
約323アミノ酸および約311アミノ酸(だが、300〜333アミノ酸の範囲のどこかで
あり得る)を含む。同様に、推定のガレクチン10のポリペプチドは、約317アミ
ノ酸(だが、305〜329アミノ酸の範囲のどこかであり得る)を含む。さらに、推
定のガレクチン10SVのポリペプチドは、約200アミノ酸(だが、190〜210アミノ
酸の範囲のどこかであり得る)を含む。
ガレクチン10SVは、ガレクチン10のスプライス変異体であると考えられる。本
明細書中で使用される句「スプライス変異体」は、最初は同一のゲノムDNA配列
から転写されるが、オルタナティブRNAスプライシングを受けたRNA分子から産生
されるcDNA分子をいう。オルタナティブRNAスプライシングは、一次RNA転写物が
、一般にイントロンの除去のためにスプライシングを受ける場合に起こる。これ
により、各々が異なるアミノ酸配列をコードし得るmRNAを2つ以上生成する。用
語「スプライス変異体」は、上記のcDNA分子によりコードされるタンパク質もま
たいう。
示されるように、本発明の核酸分子は、RNA(例えば、mRNA)の形態、またはD
NAの形態(例えば、cDNA、およびクローニングによって得られるか、または合成
的に生成されるゲノムDNAを含む)なかに存在し得る。DNAは、二本鎖または一本
鎖であり得る。一本鎖DNAまたはRNAは、コード鎖(センス鎖としても知られる)
であり得るか、またはそれは、非コード鎖(アンチセンス鎖としても知られる)
であり得る。
「単離された」核酸分子によって、天然の環境から取り出された核酸分子(DN
AまたはRNA)が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えDNA分子は、
本発明の目的のために単離されることが考慮される。単離されたDNA分子のさら
なる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えDNA分子、または溶液中の
精製された(部分的または実質的)DNA分子を含む。単離されたRNA分子は、本発
明のDNA分子のインビボまたはインビトロでのRNA転写物を含む。本発明に従って
単離された核酸分子は、合成的に生成されるような分子をさらに含む。
本発明の単離された核酸分子は、それぞれ、図1、2A〜2B、3A〜3B、および4A
〜4Bに示されるオープンリーディングフレーム(ORF)(配列番号1、3、5、
および7)を含むDNA分子;および上記に記載される配列とは実質的に異なるが
、遺伝コードの縮重性に起因して、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10
またはガレクチン10SVのタンパク質をなおコードする配列を含むDNA分子を含む
。当然、遺伝コードは当該分野で周知である。従って、このような縮重変異体を
産生することは当業者には日常である。
さらに、本発明は、配列番号1の伸長部分に関するヌクレオチド配列を有する
核酸分子を提供する。これは、以下に関するcDNAクローンから決定されている:
HSIAL77R(配列番号18)、HGBDK55R(配列番号19)、HCNAH29R(配列番号20)、
HKCAA85R(配列番号21)、HCNAI55R(配列番号22)、HCNAI87R(配列番号23)、
HCNAS74R(配列番号24)、およびHCNAF43R(配列番号25)。
さらに、本発明は、配列番号3の伸長部分に関するヌクレオチド配列を有する
核酸分子を提供する。これは、以下に関するcDNAクローンから決定されている:
HMSCP11R(配列番号26)、HMSEU32R(配列番号27)、HTPAO71R(配列番号28)、
HJAAV54R(配列番号29)、HMSEU43R(配列番号30)、HILBP03R(配列番号31)、
HTPCG81R(配列番号32)、HTBAA21R(配列番号33)、およびHFXBU26R(配列番号
34)。
さらに、本発明は、配列番号5の伸長部分に関するヌクレオチド配列を有する
核酸分子を提供する。これは、以下に関するcDNAクローンから決定されている:
HTNBX92R(配列番号35)、HLTAZ64RB(配列番号36)、HJBAI38R(配列番号37)
、HETAS87R(配列番号38)、およびHETAR45R(配列番号39)。
さらに、本発明は、配列番号7の伸長部分に関するヌクレオチド配列を有する
核酸分子を提供する。これは、以下に関するcDNAクローンから決定されている:
HTNBX92R(配列番号35)、HLTAZ64RB(配列番号36)、HBNAF37R(配列番号40)
、およびHETAS87R(配列番号38)。
別の局面において、本発明は、プラスミド(1996年9月24日に、ATCC受託番号
第97732号、第97733号、および第97734号としてそれぞれ寄託された)に含まれ
るcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列を有する、ガレクチン8、ガレ
クチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのポリペプチドをコードする単
離された核酸分子を提供する。さらなる実施態様において、N末端メチオニンを
欠除する全長ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10
SVのポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。本発明はさらに、図1、
2A〜2B、3A〜3B、もしくは4A〜4B(配列番号1、3、5、もしくは7)に示されるヌ
クレオチド配列、または上記の寄託されたクローンに含有されるガレクチン8、
ガレクチン9、ガレクチン10、もしくはガレクチン10SV cDNAのヌクレオチド配
列を有する単離された核酸分子、あるいは上記配列の1つに対して相補的な配列
を有する核酸分子を提供する。このような単離された分子(特にDNA分子)は、
染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングのプロ
ーブとして、およびヒト組織におけるガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン
10、またはガレクチン10SV遺伝子の発現の検出(例えば、ノーザンブロット分析
による)のためのプローブとして有用である。
本発明はさらに、本明細書中で記載される単離された核酸分子のフラグメント
に指向される。寄託されたcDNAのヌクレオチド配列、または図1、2A〜2B、3A〜
3B、もしくは4A〜4B(配列番号1、3、5、もしくは7)に示されるヌクレオチド配
列を有する単離された核酸分子のフラグメントにより、少なくとも約15nt、およ
びより好ましくは少なくとも約20nt、なお好ましくは少なくとも約30nt、ならび
にさらにより好ましくは、少なくとも約40nt長のフラグメントが意図され、これ
らは本明細書中に記載される診断プローブおよびプライマーとして有用である。
当然のことながら、配列番号1に示されるより長いDNAフラグメント50、100、15
0、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850
、900、1000、11050、1100、または1115nt長の配列もまた、ATCC受託番号97732
として寄託されるか、または配列番号1に示されるプラスミド中に含有されるcD
NAクローンの全てではないにしろ、ほとんどのヌクレオチド配列に対応するフラ
グメントと同様に、本発明に従って有用である。同様に、配列番号3に示される
より長いDNAフラグメント50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、
550、600、650、700、750、800、850、900、1000、1050、1100、1150、1200、12
50、1300、1350、1400、1450、1500、または1525nt長の配列もまた、ATCC受託番
号97733として寄託されるか、または配列番号3に示されるプラスミド中に含有
されるcDNAクローンの全てではないにしろ、ほとんどのヌクレオチド配列に対応
するフラグメントと同様に、本発明に従って有用である。同様に、配列番号5に
示されるより長いDNAフラグメント50、100、150、200、250、300、350、400、45
0、500、550、600、650、700、750、800、850、900、1000、1050、1100、1150、
1200、1250、1300、1350、1400、1450、または1464nt長の配列もまた、配列番号
5に示されるcDNA分子の全てではないにしろ、ほとんどのヌクレオチド配列に対
応するフ
ラグメントと同様に、本発明に従って有用である。さらに、配列番号7に示され
るより長いDNAフラグメント50、100、150、200、250、300、350、400、450、500
、550、600、650、700、750、800、850、900、1000、1050、1100、1150、1200、
1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、
1850、1900、および1908nt長の配列もまた、ATCC受託番号97734として寄託され
るか、または配列番号7に示されるプラスミド中に含有されるcDNAクローンの全
てではないにしろ、ほとんどのヌクレオチド配列に対応するフラグメントと同様
に、本発明に従って有用である。例えば、少なくとも20nt長のフラグメントによ
り、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列または配列番号1、3、5、または7に
示されるヌクレオチド配列由来の20以上の連続した塩基を含むフラグメントが意
図される。
本発明の好ましい核酸フラグメントには、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレ
クチン10、またはガレクチン10SVのタンパク質のエピトープ保有部分をコードす
る核酸分子が含まれる。詳細には、本発明のこのような核酸フラグメントには、
以下をコードする核酸分子が含まれる:図1(配列番号2)における約55〜101
、137〜162、180〜193、216〜266、図2A〜2B(配列番号4)における62〜102、2
26〜259、197〜308、図3A〜3B(配列番号6)における25〜77、84〜105、129〜1
40、156〜183、1915〜215、および241〜257、ならびに図4A〜4B(配列番号8)
における25〜77、84〜105、129〜140、および156〜183からのアミノ酸残基を含
むポリペプチド。本発明者らは、上記のポリペプチドフラグメントが、ガレクチ
ン8、ガレクチン9、ガレクチン10、およびガレクチン10SVのタンパク質の抗原
性領域であることを決定した。ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、お
よびガレクチン10SVのタンパク質の他のこのようなエピトープ保有部分の決定方
法は、以下に詳細に記載されている。
別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下で、上記の本発明の核酸分子(例えば、ATCC受託番号第97732号、第97733号
、および第97734号に含まれるcDNAクローン)中のポリヌクレオチドの一部にハ
イブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離した核酸分子を提供する。「スト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件」によって、以下:50%ホルムアミ
ド、
5×SSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウ
ム(pH7.6)、5×デンハート液、10%硫酸デキストラン、および20g/mlの変性剪
断サケ精子DNA、を含む溶液中で42℃にて一晩のインキュベーション、続く約65
℃にて0.1×SSC中でフィルターを洗浄することが意図される。
ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって
、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約15ヌクレオチド(nt)、そしてより好ま
しくは少なくとも約20nt、さらにより好ましくは少なくとも約30nt、そしてさら
により好ましくは約30〜70ntにハイブリダイズするポリヌクレオチド(DNAまた
はRNAのいずれか)が意図される。これらは、以上、および以下でより詳細に考
察されるような診断用プローブおよびプライマーとして有用である。
例えば、「少なくとも20nt長」のポリヌクレオチドの一部により、参照ポリヌ
クレオチドのヌクレオチド配列(寄託されたcDNA、または図1、2A〜2B、3A〜3B
、もしくは4A〜4B(配列番号1、3、5、または7)に示されるようなヌクレオ
チド配列)由来の20以上の連続したヌクレオチドが意図される。当然のことなが
ら、ポリA配列(例えば、それぞれ、図1、2A〜2B、3A〜3B、または4A〜4B(配
列番号1、3、5、または7)に示されるガレクチン8、ガレクチン9、ガレク
チン10、またはガレクチン10SV cDNAの3'ポリ(A)トラクト)にのみ、またはT
(またはU)残基の相補的伸長にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発
明の核酸の一部にハイブリダイズさせるために使用される本発明のポリヌクレオ
チドに含まれない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ(A)伸長
またはその相補体(例えば、特に任意の二本鎖cDNAクローン)を含む任意の核酸
分子にハイブリダイズするからである。
示されるように、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレク
チン10SVのポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、以下を含み得るが、
それらに限定されない:それ自体によって、ポリペプチドのアミノ酸配列をコー
ドする核酸分子;ポリペプチドのコード配列および付加的配列(例えば、プレタ
ンパク質配列またはプロタンパク質配列またはプレプロタンパク質配列のような
アミノ酸リーダー配列あるいは分泌配列をコードする配列);ポリペプチドのコ
ード配列で、上記の付加的コード配列を含むかまたは含まず、付加的非コード配
列とともに集まっており、この配列は、例えば、イントロンおよび非コード5'お
よび3'配列(スプライシングおよびポリアデニル化シグナル(例えば、リボソー
ム結合およびmRNAの安定性を含む、転写、mRNAプロセシングにおいて役割を担う
、転写された非翻訳配列))を含むがこれらに限定されない;さらなる機能性を
提供するような付加的アミノ酸をコードする付加的コード配列。従って、ポリペ
プチドをコードする配列は、マーカー配列(例えば、融合されたポリペプチドの
精製を容易にするペプチドをコードする配列)に融合され得る。本発明のこの局
面の特定の好ましい実施態様において、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサーヒス
チジンペプチド(例えば、pQEベクター(Qiagen,Inc.)において提供されるタグ
)、とりわけ、それらの多くは市販されている。例えば、Gentzら、Proc.Natl
.Acad.Sci.USA 86:821-824(1989)において記載されるように、ヘキサヒスチ
ジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「HA」タグは、インフルエン
ザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別の
ペプチドであり、それは、Wilsonら、Cell 37:767(1984)によって記載されてい
る。以下で考察されるように、他のそのような融合タンパク質には、N末端また
はC末端にてFcに融合されるガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、また
はガレクチン10SVが含まれる。
本発明は、さらに、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレ
クチン10SVのタンパク質の一部、アナログ、または誘導体をコードする本発明の
核酸分子の変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然
に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座
を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の1つが意図される。Genes II,Le
win,B.編、John Wiley & Sons,New York(1985)。天然に存在しない変異体は、
当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
このような変異体には、1つ以上のヌクレオチドを含み得るヌクレオチド置換
、欠失、または付加により産生される変異体が含まれる。変異体は、コード領域
、非コード領域、または両方において改変され得る。コード領域における改変は
、保存または非保存アミノ酸置換体、欠失体、または付加体を産生し得る。これ
らの間で特に好ましいのは、サイレントな置換体、付加体、または欠失体である
。
これらは、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SV
のタンパク質、またはそれらの一部の特性および活性を変化させない。この点に
関してまた特に好ましいのは、保存的置換体である。
本発明のさらなる実施態様には、(a)図1、2A〜2B、3A〜3B、または4A〜4B
(配列番号1、3、5、または7)におけるアミノ酸配列を有するガレクチン8
、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列;(b)図1、2A〜2B、3A〜3B、または4A〜4B(配列番号
1、3、5、または7)におけるアミノ酸配列を有するが、N末端メチオニンを
欠除するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;(c)1996年9月24日のA
TCC受託番号第97732号、第97733号、または第97734号に含まれるcDNAクローンに
よりコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;あるいは、(d)
(a)、(b)、または(c)における任意のヌクレオチド配列に相補的なヌク
レオチド配列、に対して、少なくとも95%の同一、そしてより好ましくは少なく
とも96%、97%、98%、または99%の同一のヌクレオチド配列を有するポリヌク
レオチドを含む単離された核酸分子が含まれる。
ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのポリペ
プチドをコードする参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、95%「同一」
のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、このポリヌクレオチド
配列が、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVの
ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり5
つまでの点変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
が、参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照ヌクオチド配
列と少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得
るために、参照配列における5%までのヌクレオチドが欠失され得るかもしくは
別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列において全ヌクレオチドの
5%までの多数のヌクレオチドが、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれ
らの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端位置でか、または参照配
列内のヌクレオチドの中で個々に、もしくは参照配列内の1つ以上の連続した群
でのいずれかで散在されて、これらの末端位置の間のどこかで生じ得る。
実際には、任意の特定の核酸分子が、図1、2A〜B、3A〜3B、または4A〜4B(
配列番号1、3、5、または7)に示されるヌクレオチド配列または寄託された
cDNAクローンのヌクレオチド配列に、少なくとも95%、96%、97%、98%、また
は99%同一であるか否かは、例えば、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence A
nalysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University
Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)のような公知のコン
ピュータープログラムを用いて従来通りに決定され得る。Bestfitは、Smithおよ
びWaterman,Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)の局所的相同
性アルゴリズムを用いて、2つの配列間の相同性の最適のセグメントを見出す。
Bestfitまたは任意の他の配列整列プログラムを使用して、特定の配列が、例え
ば本発明による参照配列に95%同一であるか否かを決定する場合、パラメーター
は、もちろん、同一性の割合が、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算さ
れるように、そして参照配列の総ヌクレオチド数の5%までの相同性におけるギ
ャップが許容されるように、設定される。
本出願は、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10
SVの活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係なく、図1、2A〜B、3
A〜3B、または4A〜4B(配列番号1、3、5、または7)に示される核酸配列ま
たは寄託されたcDNAの核酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、または99
%同一であるこのような核酸分子に関する。これは、特定の核酸分子がガレクチ
ン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVの活性を有するポリ
ペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、核酸分子をどのようにして、例
えば、ハイブリダイゼーションプローブ、またはポリメラーセ連鎖反応(PCR)の
プライマーとして使用するかをなお知るからである。ガレクチン8、ガレクチン
9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVの活性を有するポリペプチドをコード
しない本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ(1)ガレクチン8、ガレク
チン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SV遺伝子またはその対立遺伝子変異
体をcDNAライブラリーから単離すること;(2)Vermaら,Human Chromosomes:a
Manual of Basic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)に記載の、ガ
レクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SV遺伝子の正
確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体展開物に対するインサイチュハ
イブリダイゼーション(FISH);および、(3)特定の細胞型(例えば、活性化単
球)におけるガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10
SVmRNA発現を検出するためのノーザンブロット分析、が挙げられる。
しかし、図1、2A〜2B、3A〜3B、もしくは4A〜4B(配列番号1、3、5、また
は7)に示される核酸配列、または寄託されたcDNAのうちの1つの核酸配列(こ
れは、実際に、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン
10SVタンパク質活性を有するポリペプチドをコードする)に対して、少なくとも
95%、96%、97%、98%、または99%同一な配列を有する核酸分子が好ましい。
特定の生物学的アッセイにおいて測定した場合、「ガレクチン8、ガレクチン9
、ガレクチン10、またはガレクチン10SVの活性を有するポリペプチド」により、
本発明のガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVの
タンパク質の活性と必ずしも同一ではないが、類似の活性を示すポリペプチドが
意図される。例えば、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレタチン10、またはガレ
クチン10SVのタンパク質活性は、ラクトース結合アッセイを使用して測定され得
る。
発現されたガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10
SVのラクトース結合活性は、ニトロセルロース(Amersham)上に固定化されたア
シアロフェチュイン(Sigma)に対するインサイチュ結合活性の免疫検出により
アッセイされる(Madsenら、J.Biol.Chem.270(11)5823-5829(1995))。3μ
lの水に溶解した30μgのアシアロフェチュインを、ニトロセルロースの1cm2
ストリップ上にスポットする。次いで、ニトロセルロース断片を24ウェル組織培
養プレート中に配置し、そして緩衝液B(58mM Na2HPO4、18mM KH2PO4、75mM Na
Cl、2mM EDTA、および3% BSA、pH7.2)中で、22℃での一定の振盪により、一晩
インキュベードする。インキュベーションの後、ブロッキング培地を吸引し、そ
してニトロセルロース断片を緩衝液A(58mM Na2HPO4、18mM KH2PO4、75mM NaCl
、2mM EDTA、4mM β-メルカプトエタノール、および0.2% BSA、pH7.2)中で3回
洗浄する。細胞抽出物(好ましくは、COS細胞)を、1%BSAおよび150mMラクト
ース(105μlの一次抽出物緩衝液A中10%BSAの15μl、および緩衝液A中0.75
Mラクトースの30μlまたは緩衝液A30μlのいずれか)を含むかまたは含まな
いを含
むように調製する。固定化したアシアロフェチインを、抽出物とともに2時間イ
ンキュベートし、そして緩衝液Aで5回洗浄する。次いで、ニトロセルロース断
片を、PBS(58mM Na2HPO4、18mM KH2PO4、75mM NaCl、2mM EDTA、pH7.2)中の2
%ホルマリン中で1時間固定し、結合したガレクチンの損失を予防する。PBS中
でのさらなる洗浄後、断片を、ウサギ抗ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチ
ン10、またはガレクチン10SVのポリクローナル血清(PBS中1:100希釈)ととも
に2時間、22℃にてインキュベートした。次いで断片をPBSで洗浄し、そしてペ
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体(DAKO)とともにインキュベートした。2
時間、22℃でのインキュベーションの後、断片をPBSで洗浄し、そして基質を添
加する。ニトロセルロース断片を発色するまでインキュベートし、そして反応を
蒸留水で洗浄することによって停止する。
当然のことながら、遺伝子コードの縮重により、当業者は、寄託されたcDNAの
核酸配列または図1、2A〜B、3A〜3B、または4A〜4B(それぞれ、配列番号1、
3、5、または7)に示される核酸配列に、少なくとも95%、96%、97%、98%
、または99%同一である配列を有する多数の核酸分子が「ガレクチン8、ガレク
チン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのタンパク質活性を有するポリペ
プチド」をコードすることをすぐに理解する。実際、これらのヌクレオチド配列
の縮重変異体がすべて同じポリペプチドをコードするので、このことは、上記の
比較アッセイを行うことなく当業者に明らかである。縮重変異体でないような核
酸分子について、正当な数の核酸分子もまた、ガレクチン8、ガレクチン9、ガ
レクチン10、またはガレクチン10SVのタンパク質活性を有するポリペプチドをコ
ードすることをさらに理解する。これは、当業者が、タンパク質機能(例えば、
第2の両親媒性アミノ酸による1つの両親媒性アミノ酸の置換)にそれほど重要
でないかまたは重要でないようであるかのいずれかであるアミノ酸置換体を、完
全に理解するからである。
例えば、どのように表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製するかに関す
るガイダンスは、Bowie,J.U.ら,「タンパク質配列中のメッセージを解読する
こと:アミノ酸置換に対する寛容」,Science 247:1306-1310(1990)に提供され
る。ここで著者らは、タンパク質がアミノ酸置換に対して意外にも寛容であるこ
とを示す。
ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明の単離されたDNA分子を含むベクター、組換えベクター
で遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるガレクチン8、ガレクチ
ン9、ガレクチン10、もしくはガレクチン10SVのポリペプチドまたはそのフラグ
メントの産生に関する。
ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択マーカーを含むベクター
に結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物の
ような沈澱物中か、または荷電された脂質との複合体中で導入される。ベクター
がウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてイン
ビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
DNAインサートは、適切なプロモーター(例えば、少し名を挙げると、ファー
ジλPLプロモーター、E.coli lacプロモーター、trpプロモーター、およびtacプ
ロモーター、SV40初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウ
イルスLTRのプロモーター)に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプ
ロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、さらに、転写開始、転写終
結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含む
。構築物によって発現される転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチ
ドの始めに翻訳開始を含み、そして終わりに適切に位置される終止コドン(UAA、
UGA、またはUAG)を含む。
示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも1つの選択マーカー
を含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉
酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびE.coliおよび他の細菌における
培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙
げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞(例えば、E.coli細胞、
Streptomlyces細胞、およびSalmonella typhimurium細胞);真菌細胞(例えば
酵母細胞);昆虫細胞(例えば、Drosophila S2細胞およびSpodoptera Sf9細胞
);動物細胞(例えば、CHO細胞、COS細胞、およびBowes黒色脛細胞);なら
びに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための
適切な培養培地および条件は当該分野で公知である。
細菌における使用に好ましいベクターの中には、pQE70、pQE60、およびpQE-9
(Qiagenから入手可能);pBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベク
ター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratageneから入手可能);ならびにpt
rc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmaciaから入手可能)が含ま
れる。好ましい真核生物ベクターの中には、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl、お
よびpSG(Stratageneから入手可能);ならびにpSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVL
(Pharmacicaから入手可能)がある。他の適切なベクターは、当業者に容易に明
らかである。
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE
デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクシ
ョン、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもたら
され得る。このような方法は、Davisら,Basic Methods in Molecular Biology(
1986)のような多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そし
て分泌シグナルだけでなく、付加的な異種の機能的領域も含み得る。例えば、付
加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間の、
または続く操作および保存の間の、安定性および持続性を改善するために、ポリ
ペプチドのN末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易にするた
めにポリペプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製
の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性を改善す
るため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへの付加は
、当該分野でよく知られており、そして日常的な技術である。好ましい融合タン
パク質は、タンパク質の可溶化に有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。
例えば、EP-A-0 464 533(カナダ対応出願2045869)は、別のヒトタンパク質ま
たはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タ
ンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のFc部分は、治療および診
断における使用に十分に有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特
性
を生じる(EP-A 0232 262)。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が
、記載される有利な様式で、発現され、検出され、および精製された後にFc部分
が欠失され得ることが望ましい。これは、Fc部分が、治療および診断における使
用の妨害であると判明する場合(例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原と
して使用されるべき場合)である。薬物探索において、例えばhIL-5のようなヒ
トタンパク質は、hIL-5のアンタゴニストを同定するための高処理能力スクリー
ニングアッセイの目的でFc部分と融合されている。D.Bennettら,Journal of Mo
lecular Recognition Vol.8:52-58(1995)、およびK.Johansonら,The Journal o
f Biological Chemistry Vol.270,No.16,9459-9471頁(1995)を参照のこと。
ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのタンパ
ク質は、硫安沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換
クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト
クロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によ
って組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。最も好ましくは、高
速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)が精製のために用いられる。本発明のポ
リペプチトは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主また
は真核生物宿主(例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、およ
び哺乳動物細胞を含む)から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え
産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコ
シル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明のポリペプ
チドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチ
オニン残基を含み得る。
ガレクチン8、ガレクチン9、およびガレクチン10ポリペプチドならびにフラグ
メント
本発明はさらに、以下を有する、単離したガレクチン8、ガレクチン9、ガレ
クチン10、またはガレクチン10SVのポリペプチドを提供する:(1)cDNAのうちの
1つによってコードされるアミノ酸配列、(2)図1、2A〜2B、3A〜3B、もしくは4
A〜4B(それぞれ、配列番号2、4、6、または8)中のアミノ酸配列、または(
3)ペプチド、もしくは上記のポリペプチドの一部を含むポリペプチドのアミノ酸
配列。
ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのポリペ
プチドのいくつかのアミノ酸配列が、このタンパク質の構造または機能に有意に
影響することなく改変され得ることが、当該分野で認識される。配列内のこのよ
うな差異が意図される場合、活性を決定するタンパク質の重要な領域が存在する
ことを覚えておくべきである。
従って、本発明は、さらに、実質的なガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチ
ン10、またはガレクチン10SVのポリペプチド活性を示すか、または下記に考察さ
れるタンパク質部分のようなガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、もし
くはガレクチン10SVのタンパク質の領域を含むガレクチン8、ガレクチン9、ガ
レクチン10、またはガレクチン10SVのポリペプチドの改変体を含む。このような
変異体は、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換を含む。上記に詳細に示
されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうかに関す
るさらなるガイダンスは、Bowie,J.U.ら「タンパク質配列中のメッセージを解
読すること:アミノ酸置換に対する寛容」,Scicnce 247:1306-1310(1990)に見
出され得る。
従って、配列番号2、配列番号4、配列番号6、もしくは配列番号8のポリペ
プチドまたは寄託されたcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、
誘導体、もしくはアナログは、(i)1つ以上のアミノ酸残基が保存的または非
保存的アミノ酸残基(好ましくは保存的アミノ酸残基)で置換されるものであり
、このような置換されたアミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるもので
あるかそうでなくてもよく、または(ii)1つ以上のアミノ酸残基が置換基を含
むもの、または(iii)成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させ
る化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような別の化合物と融合される
もの、または(iv)さらなるアミノ酸が、IgG Fc融合領域ペプチドまたはリーダ
ーまたは分泌配列あるいは成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製に
使用される配列のような成熟ポリペプチドに融合されるもの、であり得る。この
よ
うなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の
範囲内であると考えられる。
特に興味深いものは、別の荷電したアミノ酸での、および中性または負電荷の
アミノ酸での荷電したアミノ酸の置換である。後者は減少した正電荷を有するタ
ンパク質を生じ、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチ
ン10SVのタンパク質の特徴を改良する。凝集の防止が高度に所望される。タンパ
ク質の凝集は、活性の損失を生じるだけでなく、それらは免疫原性であり得るの
で、薬学的処方物を調製する場合にも問題であり得る(Pinckardら、Clin.Exp.I
mmunol.2:331-340(1967);Robbinsら、Diabetes 36:838-845(1987);Cleland
ら、Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377(1993))。
示されるように、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意に影響しない保存的
アミノ酸置換のような、小さな性質の変化が好ましい(表1を参照のこと)。表1。保存的アミノ酸置換体。 当然、当業者が作製するアミノ酸置換体の数は多くの因子に依存し、上記およ
び下記のものを含む。一般には、任意の所定のガレクチン8、ガレクチン9、ガ
レクチン10、もしくはガレクチン10SVのポリペプチドまたはその変異体について
の置換体の数は、目的物に依存して50、40、30、20、10、5、または3より多く
はない。
機能に必須である、本発明のガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、ま
たはガレクチン10SVのタンパク質におけるアミノ酸は、部位特異的変異誘発また
はアラニン走査型変異誘発のような当該分野に公知の方法により同定され得る(
CunninghamおよびWells,Science 244:1081-1085(1989))。後者の手順は、分
子内の全ての残基に1つのアラニン変異を導入する。リガンド結合に重要な部位
はまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識のような構造分析により決定
され得る(Smithら、J.Mol.Biol.224:899-904(1992)およびde Vosら、Scienc
e 255:306-312(1992))。
本発明のポリペプチドは、単離形態において好ましくは提供される。「単離さ
れたポリペプチド」により、その天然の環境から除去されたポリペプチドが意図
される。従って、組み換え宿主細胞内で産生され、そして/またはその細胞内に
含まれるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。また
、「単離されたポリペプチド」は、組換え宿主細胞から、部分的にまたは実質的
に精製されたポリペプチドが意図される。例えば、組換え的に産生されたバージ
ョンのガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのポ
リペプチドは、SmithおよびJohnson,Gene 67:31-40(1988)に記載される一工程
方法により実質的に精製され得る。
本発明のポリペプチドは、寄託されたcDNAによってコードされるポリペプチド
;配列番号2の約1〜約323、配列番号4の約1〜約311、配列番号6の約1〜約
317、および配列番号8の約1〜約200のアミノ酸を含むポリペプチド;配列番号
2の約2〜約323、配列番号4の約2〜約311、配列番号6の約2〜約317、およ
び配列番号8の約2〜約200のアミノ酸を含むポリペプチド;ならびに上記のポ
リペプチドと少なくとも95%同一、さらにより好ましくは少なくとも96%、97%
、98%、または99%同一であるポリペプチドを含み、そしてまた、少なくとも30
アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも50アミノ酸を有するこのような
ポリペプチドの部分を含む。
ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのポリペ
プチドの参照アミノ酸配列に少なくとも、例えば、95%「同一な」アミノ酸配列
を有するポリペプチドにより、ポリペプチド配列がガレクチン8、ガレクチン9
、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのポリペプチドの参照アミノ酸配列の各
100アミノ酸毎に5つまでのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、ポリペプチ
ドのアミノ酸配列は参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参
照アミノ酸配列に少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得
るために、参照配列において5%までのアミノ酸残基が、欠失されるかもしくは
別のアミノ酸で置換され得、または参照配列における5%までの総アミノ酸残基
の多数のアミノ酸が参照配列に挿入され得る。これらの参照配列の改変は、参照
アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置で、または参照配列
の残基間で個々に、もしくは参照配列内で1つ以上の近接したグループ内のいず
れかに分散した、末端位置の間のどこかで、起こり得る。
実際には、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図1、2A〜2B、3A〜3B、ま
たは4A〜4B(それぞれ、配列番号2、配列番号4、配列番号6、または配列番号
8)に示されるアミノ酸配列、または奇託されたcDNAクローン(ATCC受託番号97
732、同97733、および同97734)のうちの1つによりコードされるアミノ酸配列
に対して、少なくとも95%、96%、97%、98%、または99%同一であるかどうか
は、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package,Unix用バージ
ョン8、Genetics Computer Group,University Rcscarch Park,575 Science D
rive,Madison,WI 53711)のような公知のコンピュータープログラムを使用し
て慣習的に決定され得る。特定の配列が、例えば、本発明の参照配列に95%同一
であるかどうかを決定するために、Bestfitまたは任意の他の配列アラインメン
トプログラムを使用する場合、当然、同一性の百分率が参照アミノ酸配列の全長
にわたって計算され、そして参照配列内のアミノ酸残基の総数の5%までの相同
性におけるギャップが許容されるようなパラメーターが設定される。
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いて、SDS-PAGEゲルに対す
る、または分子ふるいゲル濾過カラムに対する分子量マーカーとして使用され得
る。
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を
含む、ペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチドのエピトープ
部分は、本明細書中に記載の免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫原
性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタ
ンパク質の一部として定義される。一方では、抗体が結合し得るタンパク質分子
の領域は、「抗原性エピトープ」と定義され得る。タンパク質の免疫原性エピト
ープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Geysenら
,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002(1983)を参照のこと。
抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド(すなわち、抗体が
結合し得るタンパク質分子の領域を含む)の選択に関して、タンパク質配列の一
部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応
する抗血清を日常的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば、Sutcli
ffe,J.G.,Shinnick,T.M.,Green,N.およびLearner,R.A.(1983)「タンパク
質上の予め決定された部位と反応する抗体」Science 219:660-666(1983)を参照
のこと。タンパク質-反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配
列で頻繁に示され、そして単純な化学的法則のセットにより特徴付けられ得、そ
してインタクトなタンパク質の免疫優性領域(すなわち、免疫原性エピトープ)
にも、アミノ末端またはカルボキシル末端にも、制限されない。
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、それゆえ、本
発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を惹起す
るのに有用である。例えば、Wilsonら,Cell 37:767-778(1984)の777を参照のこ
と。
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは本
発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる少なくとも7、より好ましくは
少なくとも9、そして最も好ましくは約15〜約30アミノ酸の間の配列を含む。
ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SV特異的抗
体を産生するために使用され得る抗原性ポリペプチドまたはペプチドの非限定的
な例には、それぞれ以下が挙げられる:図1(配列番号2)における約55〜101、
137〜162、180〜193、216〜266、図2A〜2B(配列番号4)における62〜102、226
〜259、197〜308、図3A〜3B(配列番号6)における25〜77、84〜105、129〜140
、156〜183、195〜215、および241〜257、ならびに図4A〜4B(配列番号8)にお
ける25〜77、84〜105、129〜140、および156〜183由来のアミノ酸残基を含むポ
リペプチド。上記に示されるように、本発明者らは、上記ポリペプチドフラグメ
ントがガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチンッ0、またはガレクチン10SVの
タンパク質の抗原性領域であることを決定した。
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびエピトープ保有ポリペプチドはまた、
任意の従来手段により産生され得る。Houghten,R.A.(1985)General mothod fo
r the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides:specifici
ty of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acid
s.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5131-5135。この「同時複製ペプチド合成(Simu
ltaneous Multiple Peptide Synthesis)(SMPS)」プロセスは、さらにHoughtenら
(1986)の米国特許第4,631,211号に記載されている。
当業者が理解するように、本発明のガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン
10、またはガレクチン10SVのポリペプチドおよび上記のそのエピトープ保有フラ
グメントは、免疫グロブリン(IgG)の定常ドメインの一部と結合し得、キメラ
ポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてイ
ンビボで増加した半減期を示す。これは、例えば、ヒトCD4-ポリペプチドの最初
の2つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の
種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている(EPA394,827;
Trauneckerら、Nature 33184-86(1988))。IgG部分によるジスルフィド結合ダ
イマー構造を有する融合タンパク質はまた、他の分子の結合および中和において
、モノマーのガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10
SVのタンパク質単独もしくはタンパク質フラグメントよりも効率的であり得る(
Fountoulakisら、J.Biochem.270:3958-3964(1995))。
診断および予後
特定の疾患(ガン、自己免疫疾患、炎症性疾患、喘息、およびアレルギー性疾
患)を有する哺乳動物における特定の組織は、対応する「標準的な」哺乳動物(
すなわち、その疾患を有さない同じ種の哺乳動物)と比較した場合に、有意に変
化(増大または減少)したレベルのガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10
、またはガレクチン10SVのタンパク質およびガレクチン8、ガレクチン9、ガレ
クチン10、またはガレクチン10SVのタンパク質をコードするmRNAを発現する。さ
らに、変化したレベルのガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガ
レクチン10SVのタンパク質が、疾患を有さない哺乳動物に由来する血清と比較し
た場合に、疾患を有する同じ種の哺乳動物由来の特定の体液(例えば、血清、血
漿、尿、および髄液)において検出され得る。従って、本発明は、診断の間に有
用な診断方法を提供する。これは、哺乳動物の細胞または体液中のガレクチン8
、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのタンパク質をコードす
る遺伝子の発現レベルをアッセイすること、およびその遺伝子発現レベルと標準
的なガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVの遺伝
子発現レベルとを比較することを含み、それによって、標準を上回る遺伝子発現
レベルにおける増大が、疾患の指標となる。
診断が、通常の方法に従ってすでに行われた場合、本発明は、予後指標物とし
て有用であり、それによって変化したガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン
10、またはガレクチン10SVの遺伝子発現を示す患者は、正常レベルで遺伝子を発
現する患者と比較してより悪い臨床結果を経験する。
「ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのタン
パク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイすること」により、最初の生
物学的サンプルにおけるガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、もしくは
ガレクチン10SVのタンパク質レベルまたはガレクチン8、ガレクチン9、ガレク
チン10、もしくはガレクチン10SVのタンパク質をコードするmRNAレベルを、直接
的(例えば、絶対タンパク質レベルまたは絶対mRNAレベルを測定また評価するこ
とにより)または相対的(例えば、第二の生物学的サンプルにおけるガレクチン
8、ガレクチン9、ガレクチン10、もしくはガレクチン10SVのタンパク質レベル
またはmRNAレベルと比較することにより)のいずれかで、定性的または定量的に
測定および評価することが意図される。
好ましくは、第一の生物学的サンプルにおけるガレクチン8、ガレクチン9、
ガレクチン10、もしくはガレクチン10SVのタンパク質レベル、またはmRNAレベル
は、標準的なガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、もしくはガレクチン
10SVのタンパク質レベル、またはmRNAレベルと比較して測定または評価される。
標準は、ガンを有さない個体から得られた第二の生物学的サンプルから採取され
る。当該分野において理解されるように、一旦、標準のガレクチン8、ガレクチ
ン9、ガレクチン10、もしくはガレクチン10SVのタンパク質レベル、またはmRNA
レベルが知られると、それは比較のための標準として繰り返し使用され得る。
「生物学的サンプル」によって、個体、細胞株、組織培養物、あるいはガレク
チン8、ガレクチン9、ガレクチン10、もしくはガレクチン10SVのタンパク質ま
たはmRNAを含む他の供給源から得られる任意の生物学的サンプルが意図される。
示されるように、生物学的サンプルは、分泌された成熟ガレクチン8、ガレクチ
ン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのタンパク質を含む哺乳動物の体液
(例えば、血清、血漿、尿、滑液、および随液)、ならびに卵巣、前立腺、心臓
、胎盤、膵臓、肝臓、脾臓、肺、胸部、および臍帯組織を含む。
本発明は、哺乳動物の疾患(例えば、ガン、自己免疫疾患、炎症性疾患、喘息
、およびアレルギー性疾患)の検出に有用である。特に本発明は、哺乳動物の以
下のタイプのガン(黒色腫、腎臓星細胞腫、ホジキン病、乳ガン、卵巣ガン、前
立腺ガン、骨ガン、肝ガン、肺ガン、膵臓ガン、および脾臓ガン)の診断の間に
有用である。好ましい哺乳動物として、サル(monkey)、尾なしザル(ape)、
ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、およびヒトが挙げられる。特に好まし
いのはヒトである。
全細胞RNAは、ChomczynskiおよびSacchi,Anal.Biochem.162:156-159(1987)
に記載されている単一工程のグアニジン-チオシアネート-フェノール-クロロホ
ルム法を使用して生物学的サンプルから単離され得る。次いで、ガレクチン8、
ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのタンパク質をコードする
mRNAのレベルが、任意の適切な方法を用いてアッセイされる。これらは、ノーザ
ンブロット分析(Haradaら、Cell 63:303-312(1990)、S1ヌクレアーゼマッピング
(Fijitaら、Cell 49:357-367(1987))、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ポリ
メラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写(RT-PCR)(Makinoら、Technique 2:295-3
01(1990)、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写反応(RT-LCR)を含む
。
生物学的サンプル中のガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガ
レクチン10SVのタンパク質レベルをアッセイする工程は、抗体ベース技術により
行われ得る。例えば、組織中のガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、ま
たはガレクチン10SVのタンパク質発現は、古典的な免疫組織学的方法によって研
究され得る(Jalkanen,M.ら、J.Cell.Biol.101:976-985(1985);Jalkanen,M.
ら、J.Cell.Biol.105:3087-3096(1987))。
ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのタンパ
ク質の遺伝子発現を検出するのに有用な他の抗体ベース法は、免疫アッセイ(例
えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)およびラジオイムノアッセイ(RIA))を
含む。
適切な標識が当該分野で公知であり、そして酵素標識(例えば、Glucose oxid
ase)放射性同位体(例えば、ヨウ素(125I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S
)、トリチウム(3H)、インジウム(112In)、およびテクネチウム(99mTc))、
および蛍光標識(例えば、フルオレセインおよびローダミン)、ならびにビオチン
を含む。
治療薬
以下の考察は、特にヒト患者に関するが、その教示はガレタチン8、ガレクチ
ン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVを発現する任意の動物にも適用可能
である。
上記のように、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、およびガレクチ
ン10SVは、他のガレクチンと有意な相同性を共有する。ガレクチン1は、T細胞
およびT細胞白血病細胞株のアポトーシスを誘導する。従って、ガレクチン8、
ガレクチン9、ガレクチン10、およびガレクチン10SVは、増殖調節活性、免疫調
節活性、細胞-細胞および細胞-基質相互作用、ならびにアポトーシスを調節する
ことにおいて活性であると本発明者らによって考えられている。
細胞増殖活性を調節するガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、または
ガレクチン10SVの能力は、このような細胞調節障害の臨床的徴候の処置に治療的
に役立ち得る。処置される障害は、自己免疫疾患、ガン(好ましくは、黒色腫、
腎臓ガン、星細胞腫、ホジキン病)、炎症疾患、創傷治癒、動脈硬化症、他の心
臓疾患、微生物感染(ウイルス、真菌、細菌、および寄生動物)、喘息、および
アレルギー疾患を含むが、これらに限定されない。
ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、およびガレクチン10SVによって
調節される活性を考慮すると、標準または「正常」なレベルと比較した、個体中
の実質的に変化(増大または減少)したレベルのガレクチン8、ガレクチン9、
ガレクチン10、またはガレクチン10SVの発現が、上記のような病理状態を産生す
ることが容易に明らかである。本発明のガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチ
ン10、またはガレクチン10SVのタンパク質が、その標的細胞においてその調節し
た活性を発揮することが当業者によって理解され得る。それゆえ、個体における
ガレクチン8、ガレクチン9、ガレタチン10、またはガレクチン10SVの活性の標
準または正常レベルにおける減少によって引き起こされる状態は、ガレクチン8
、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのタシパク質もしくはそ
のアゴニストの投与によって処置され得る。従って、本発明は、増大したレベル
のガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVの活性を
必要とする個体を処置する方法をさらに提供する。この方法は、そのような個体
におけるガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVの
活性レベルを増大するための量の単離された本発明のガレクチン8、ガレクチン
9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのポリペプチドもしくはそのアゴニス
トを含む薬学的組成物をそのような個体に投与する工程を含む。
本発明のなおさらなる局面は、体内のガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチ
ン10、またはガレクチン10SVの活性のレベルの減少を必要とする個人を処置する
方法に関し、この方法は、治療有効量のガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチ
ン10、またはガレクチン10SVのアンタゴニストを含む組成物をこのような個人に
投与することを包含する。本発明の使用に好ましいアンタゴニストは、ガレクチ
ン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVに特異的な抗体であ
る。
投与様式
個体におけるガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、もしくはガレクチ
ン10SVの活性の標準レベルまたは正常レベルにおける減少により引き起こされる
状態が、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVの
タンパク質あるいはそのアゴニストの投与により処置され得ることが理解される
。従って、本発明はさらに、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、また
はガレクチン10SVの活性の増加したレベルを必要とする個体を処置する方法を提
供する。この方法は、このような個体におけるガレクチン8、ガレクチン9、ガ
レクチン10、またはガレクチン10SVの活性を増大するのに効果的な、有効量の本
発明の単離されたガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチ
ン10SVのポリペプチド(特に、成熟形態のガレクチン8、ガレクチン9、ガレク
チン10、またはガレクチン10SV)を含む薬学的組成物をそのような個体に投与す
る工程を含む。
一般的提案として、1用量あたりで非経口投与されるガレクチン8、ガレクチ
ン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのポリペプチドの総薬学的有効量は
、患者の体重の約1μg/kg/日〜10mg/kg/日の範囲であるが、上記のように、こ
れは治療的自由裁量に供される。より好ましくは、この用量は、少なくとも0.01
mg/kg/日、そして最も好ましくはヒトについてホルモンで、約0.01〜1mg/kg/日
である。連続的に与えられる場合、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10
、またはガレクチン10SVのポリペプチドは、代表的には、約1μg/kg/時間〜約
50μg/kg/時間の用量速度で、1日あたり1〜4回の注射、または例えば、ミニ
ポンプを用いる連続的皮下注入のいずれかにより投与される。静脈内バック溶液
もまた用いられ得る。
本発明のガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SV
のポリペプチドを含む薬学的組成物は、経口、直腸、非経口、槽内(intraciste
mally)、膣内、腹腔内、局所(粉末、軟膏、点眼薬、または経皮パッチによる
ような)、頬に、または経口もしくは鼻腔内スプレーとして投与され得る。「薬
学的に受容可能なキャリア」とは、任意の型の非毒性の固体、半固体、または液
体の賦形剤、希釈剤、カプセル化材料、または処方助剤を意味する。本明細書中
で用いられる用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨下、皮下、およ
び関節内の注射および注入を含む投与態様をいう。
染色体アッセイ
本発明の核酸分子はまた、染色体同定のために役立つ。配列は、個々のヒト染
色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてそれとハイブリダイズし得る
。本発明による、DNAの染色体へのマッピングは、これらの配列を、疾患に関連
する遺伝子に相関させることにおける重要な最初の段階である。
これに関しての特定の好ましい実施態様において、本明細書中に開示されるcD
NAは、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのタ
ンパク質の遺伝子のゲノムDNAをクローン化するために使用される。これは、種
々の周知の技術およびライブラリー(これは一般に市販されている)を使川して
達成され得る。次いで、ゲノムDNAは、インサイチュ染色体マッピングのために
、この目的のために周知の技術を使用して、用いられる。
さらに、いくつかの場合には、配列は、cDNAからPCRプライマー(好ましくは1
5〜25bp)を調製することによって、染色体にマッピングされ得る。この遺伝子
の3'非翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムDNAにおいて1つより多いエキ
ソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑にしないプライマーを迅速に選択
するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含
む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングのために使用される。
cDNAクローンの分裂中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリダイゼー
ション(「FISH」)は、1工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得
る。この技術は、50または60bpほど短いcDNA由来のプローブとともに使用され得
る。この技術の総説については、Vermaら、Human Chromosomes:A Manual of Bas
ic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)を参照のこと。
一旦配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的
位置は、遺伝子地図データと相関付けられ得る。そのようなデータは、例えば、
Johns Hopkins University,Welch Medical Libraryを通じてオンラインで利用
可能であるV.McKusick,Mendelian Inheritance In Manにおいて見出される。
次いで、遺伝子と、同じ染色体領域にマッピングされている疾患との間の関係は
、連鎖解析(物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝)を通して同定される。
次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNAまたはゲノム配列における差異を決
定することが必要である。変異が、いくらかのまたは全ての罹患個体においては
観察されるが、いかなる正常個体においても観察されない場合、変異は、疾患の
作因でありそうである。
本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することに
よってより容易に理解される。これらは、説明のために提供されるものであり、
限定することを意図しない。
実施例
実施例1:E.coliにおけるガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、および
ガレクチン10SVの発現および精製
寄託されたcDNAクローン中のガレクチン9タンパク質をコードするDNA配列を
、ガレクチン9タンパク質のアミノ酸末端配列、および遺伝子に対して3'のベ
クター配列に特異的なPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。ク
ローニングを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、5'お
よび3'の配列に添加した。
寄託されたcDNA中のガレクチン8またはガレクチン10SVのタンパク質をコード
するDNA配列を、ガレクチン8またはガレクチン10SVのタンパク質のアミノ酸末
端配列をコードするヌクレオチド配列、および遺伝子に対して3'のベクター配
列に特異的なPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した。クローニン
グを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、5'および3'の
配列に添加した。
ガレクチン10タンパク質をコードするcDNA配列を、ガレクチン10タンパク質の
アミノ末端配列をコードするヌクレオチド配列および遺伝子に対して3'のベク
ター配列に特異的なPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ヒト子宮内膜
腫瘍またはヒト胎児心臓のcDNAライブラリーのいずれかから増幅する。クローニ
ングを容易にする制限酵素部位を含むさらなるヌクレオチドを5'および3'配列
に付加する。
5'ガレクチン8オリゴヌクレオチドプライマーは、配列5' cgc ccATGg CCTAT
GTCCCCGCACCG 3'(配列番号41)を有し、これは下線を付したNcoI制限部位およ
び図1(配列番号1)のガレクチン8タンパク質コード配列のヌクレオチド56〜
72を含む。
3'ガレクチン8プライマーは、配列5' cgc AAG CTT TTAGATCTGGACATAGGAC 3'
(配列番号42)を有し、これは下線を付したHindIII制限部位、続いて図1(配
列番号1)のガレクチン8タンパク質コード配列の位置1005〜1023に相補的なヌ
クレオチドを含む。
5'ガレクチン9オリゴヌクレオチドプライマーは、配列5' cgc ccATGg CCTTC
AGCGGTTCCCAG 3'(配列番号43)を有し、これは下線を付したNcoI制限部位およ
び図2A〜2B(配列番号3)のガレクチン9タンパク質コード配列のヌタレオチド
20〜36を含む。
3'ガレクチン9プライマーは、配列5' cgc AAG CTT CAGGGTTGGAAAGGCTG 3'(
配列番号44)を有し、これは下線を付したHindIII制限部位、続いて図2A〜2B(
配列番号3)のガレクチン9タンパク質コード配列の位置1029〜1045に相補的な
ヌクレオチドを含む。
5’ガレクチン10およびガレクチン10SVオリゴヌクレオチドプライマーは、配
列5' cgc CCATGc TGTTGTCCTTAAACAAC 3'(配列番号45)を有し、これは下線を付
したSphI制限部位および図3A〜3B(配列番号5)のガレクチン10タンパク質コー
ド配列のヌクレオチド122〜138を含む。
3'ガレクチン10プライマーは、配列5' cgcCTG CAG CACAGAAGCCATTCTG 3'(配
列番号46)を有し、これは下線を付したPstI制限部位、続いて図3A〜3B(配列番
号5)のガレクチン10タンパク質コード配列の位置1105〜1120に相補的なヌクレ
オチドを含む。
3'ガレクチン10SVプライマーは、配列5' CGCCTGCAGCTATGCAACTTTATAAAATATTC
C 3'(配列番号47)を有し、これは下線を付したPstI制限部位、続いて図4A〜4B
(配列番号7)のガレクチン10SVのタンパク質コード配列の3'末端に相補的な
ヌクレオチドを含む。
制限部位は、細菌発現ベクターpQE60(ガレクチン8および9)またはpQE6(
ガレクチン10)の制限酵素部位に対して都合良く、これらの実施例において細菌
発現のために使用した(Qiagen,Inc.9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,913
11)。pQE60は、アンピシリン抗生物質耐性(「Ampr」)をコードし、そして細
菌の複製起点(「ori」)、IPTG誘導プロモーター、リボソーム結合部位(「RBS
」)、6-Hisタグ、および制限酵素部位を含む。
増幅されたガレクチン8、9、または10SV DNAおよびベクターpQE60またはpQE
6の両方を、NcoIおよびHindIII(ガレクチン8および9について)またはSphIおよ
びpstI(ガレクチン10について)で消化し、次いで消化されたDNAを一緒に連結
する。ガレタチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのタ
ンパク質DNAの制限されたpQE60またはpQE6ベクターへの挿入は、ガレクチン8、
ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのタンパク質コード領域を
、ベクターのIPTG誘導プロモーターの下流に、かつこれに作動可能に連結するよ
うに、そしてガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10
SVのタンパク質の翻訳のために適切に位置される開始AUGにインフレームで配置
する。
連結混合物を、標準的な手順を用いて、コンピテントなE.coli細胞に形質転換
する。このような手順は、Sambrookら、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUA
L、第2版;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.
(1989)に記載されている。複数のコピーのプラスミドpREP4(これは、lacリプレ
ッサーを発現し、そしてカナマイシン耐性(「Kanr」)を付与する)を含有する
E.coli株M15/rep4を本明細書中に記載の実施例を行うにあたって使用する。この
株(これは、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10
SVのタンパク質を発現するために適切である多くの株の内の唯一である)は、Qi
agenから市販されている。
形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下でLBプレート上で増
殖するそれらの能力により同定する。プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し
、
そしてクローン化DNAの同定を制限分析により確認する。
所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン(100μg/ml)とカナマイシン
(25μg/ml)との両方を補充したLB培地における液体培養で一晩(「O/N」)増
殖する。
O/N培養物を用いて約1:100〜1:250の希釈で大規模培養に接種した。細胞を、0
.4と0.6との間の600nmでの吸光度(「OD600」)にまで増殖させる。次いで、イ
ソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド(「IPTG」)を加えて1mMの最終濃度
にし、lacIリプレッサーを不活性化することにより、lacリプレッサー感受性プ
ロモーターからの転写を誘導する。細胞をさらに3〜4時間引き続きインキュベ
ートする。次いで、標準的方法によって細胞を遠心分離により採集し、そして破
壊する。日常的な回収技術を用いて破壊した細胞から封入体を精製し、そしてタ
ンパク質を封入体から8M尿素中へ可溶化する。可溶化したタンパク質を含む8
M尿素溶液を、2×リン酸緩衝化生理食塩水(「PBS」)中でPD-10カラムを通し
、それによって尿素を除去し、緩衝液を交換し、そしてタンパク質を再び折り畳
む。タンパク質をクロマトグラフィーのさらなる工程によって精製してエンドト
キシンを除去する。次いで、濾過滅菌する。濾過滅菌したタンパク質調製物を、
95μ/mlで濃度の2×PBS中で保存する。
実施例2:パキュロウイルス発現系におけるガレクチン8、ガレクチン9、ガレ
クチン10、およびガレクチン10SVのタンパク質のクローニングおよび発現
寄託されたクローンにおける完全長ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン
10、またはガレクチン10SVのタンパク質をコードするcDNA配列を、この遺伝子の
5'配列および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増
幅する:
5'ガレクチン8オリゴヌクレオチドプライマーは、下線を付したSmaI制限部
位および図1(配列番号1)のガレクチン8タンパク質コード配列のヌクレオチ
ド55〜70を含む、配列5' cgc CCCGGG GCCTATGTCCCCGCAC 3'(配列番号48)を有
する。
3'ガレクチン8プライマーは、下線を付したAsp718制限部位、続いて図1(
配列番号1)のガレクチン8タンパク質コード配列の1005〜1023位に相補的なヌ
クレオチドを含む、配列5' cgc GGT ACC TTAGATCTGG ACATAGGAC 3'(配列番号49
)を有する。
5'ガレクチン9オリゴヌクレオチドプライマーは、下線を付したSmaI制限部
位および図2A-2B(配列番号3)のガレクチン9タンパク質コード配列のヌクレ
オチド19〜36を含む、配列5' cgc CCCGGG GCCTTCAGCGGTTCCCAG 3'(配列番号50
)を有する。
3'ガレクチン9プライマーは、下線を付したAsp718制限部位、続いて図2A-2B
の配列(配列番号3)のガレクチン9タンパク質コード配列の1029〜1045位に相
補的なヌクレオチドを含む、配列5' cgc GGT ACC CAGGGTTGG AAAGGCTG 3'(配列
番号51)を有する。
5'ガレクチン10オリゴヌクレオチドプライマーは、下線を付したSmaI制限部
位および図3A〜3B(配列番号5)のガレクチン10タンパク質コード配列のヌクレ
オチド124〜142を含む、配列5' cgc CCCGGG TTGTCCTTAAACAACCTAC 3'(配列番号
52)を有する。
3'ガレクチン10プライマーは、下線を付したAsp718制限部位、続いて図3A〜3
Bの配列(配列番号5)のガレクチン10タンパク質コード配列の1105〜1120位に
相補的なヌクレオチドを含む、配列5' cgc GGT ACC CACAGAAGCCATTCTG 3'(配列
番号53)を有する。
3'ガレクチン10SVプライマーは、下線を付したAsp718制限部位、続いて図4A-
4Bの配列(配列番号7)のガレクチン10SVのタンパク質コード配列の3'末端に
相補的なヌクレオチドを含む、配列5' CGCGGTACC CTATGCAACTTTATAAAATATTCC 3'
(配列番号54)を有する。
真核生物細胞における翻訳の開始に有効なシグナルは、Kozak,M.,J.Mol.Bio
l.196:947-9:50(1987)によって記載されるように、構築物のベクター部分に適
切に配置される。
増幅されたフラグメントを、市販のキット(「Geneclean」BIO 101 Inc.,La
Jolla,Ca.)を用いて、1%アガロースゲルより単離する。次いで、このフラ
グメントをXbaIIで消化し、そして1%アガロースゲルで再び精製する。このフ
ラグメントを、本明細書中でF2と命名する。
ベクターpA2-GPを用いて、Summersら、A MANUAL OF METHODS FOR BACULOVIRUS
VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PROCEDURES,Texas Agricultural Experime
ntal Station Bulletin No.1555(1987)に記載の標準的な方法を用いて、ガレ
クチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのタンパク質を
バキュロウイルス発現系において発現する。発現ベクターは、Autographa calif
ornica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の強力なポリヘドリンプロモーター、それ
に続く都合のいい制限部位を含む。AcMNPV gp67のシグナルペプチド(N末端メ
チオニンを含む)は、BamHI部位のちようど上流に位置する。シミアンウイルス4
0(「SV40」)のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用い
る。組換えウイルスの容易な選択のために、E.coli由来のβガラクトシダーゼ遺
伝子をポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入し、そしてポリヘドリン遺伝子
のポリアデニル化シグナルが続く。ポリヘドリン配列を、野生型ウイルスDNAと
の細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列によって両側に隣接させ、クロー
ン化ポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを生成する。
当業者が容易に理解するように、構築が転写、翻訳、輸送などのために適切に
位置したシグナル(例えば、必要ならばインフレームでのAUGおよびシグナルペ
プチド)を提供する、多くの他のバキュロウイルスベクター(例えば、pAc373、
pVL941、およびpAcIM1)が、pA2-GPの代わりに用いられ得る。このようなベクタ
ーは、とりわけ、Luckowら、Virology,170:31-39に記載される。
当該分野で公知の日常的な手順を用いて、プラスミドを制限酵素SmaIおよびAs
p718で消化し、次いでウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。次いで、
市販のキット(「Geneclean」BIO 101 Inc.,La Jolla,Ca)を用いてDNAを1%
アガロースゲルから単離する。このベクターDNAを、本明細書中で「V2」と命名
する。
フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼでともに連
結する。E.coli HB101細胞を連結混合物で形質転換し、そして培養プレート上に
播く。XbaIを用いて個々のコロニーからのDNAを消化し、次いでゲル電気泳動に
よって消化産物を分析することによって、ヒトガレクチン8、ガレクチン9、ガ
レクチン10、またはガレクチン10SV遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定
する。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認する。このプ
ラスミドを、本明細書中でpBacgalectin8,9,10,または10SVと命名する。
5μgのプラスミドpBacgalectin8,9,10,または10SVを、FelgnerらProc.Nat
l.Acad.Sci.USA 84:7413-7417(1987)によって記載されるリポフェクション法
を用いて、1.0μgの市販の線状化バキュロウイルスDNA(「BaculoGoldTM bacul
ovirus DNA」,Pharmingen,San Diego,CA.)とともに同時トランスフェクトす
る。1μgのBaculoGoldTMウイルスDNAおよび5μgのプラスミドpBacgalectin8,
9,10,または10SVを、50μlの無血清グレース培地(Life Technologies Inc.,G
aithersburg,MD)を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合する
。その後、10μlのリポフェクチンおよび90μlのグレース培地を添加し、混合
し、そして室温にて15分間インキュベートする。次いで、そのトランスフェクシ
ョン混合物を、無血清グレース培地1mlを有する35mm組織培養プレート内に播種
されたSf9昆虫細胞(ATCC CRL 1711)に滴下する。次いでプレートを、27℃で5
時間インキュベートする。5時間後、トランスフェクション溶液をプレートから
除去し、そして10%ウシ胎児血清を補充した1mlのグレース昆虫培地を添加する
。プレートをインキュベーターに戻し、そして27℃で4日間培養を続ける。
4日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith(上記で引用)に記載され
るようにプラークアッセイを行う。青く染色されたプラークを産生するgal発現
クローンの容易な同定および単離を可能にするために、「Blue Gal」(Life Tec
hnologies Inc.,Gaithersburg)を有するアガロースゲルを用いる。(このタイ
プの「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Life Technologies Inc.、Gait
hersburg、で配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド
(9〜10頁)においても見い出され得る)。
連続希釈の4日後、ウイルスを細胞に添加する。適切なインキュベーションの
後、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾う。次いで
、組換えウイルスを含む寒天を、200μlのグレース培地を含むエッペンドルフ
チューブ中に再懸濁する。寒天を、短時間の遠心分離により除去し、そして組換
えバ
キュロウイルスを含む上清を、35mmディッシュに播種されたSf9細胞に感染する
ために用いる。4日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いでそれら
を4℃で保存する。適切に挿入されたhESSB I、II、およびIIIを含むクローンを
、この制限マッピングおよび配列決定を含むDNA分析によって同定する。これを
、本明細書中で、v-galectin8,9,10,または10SVと命名する。
Sf9細胞を、10%熱不活化FBSを補充したグレース培地中で増殖する。細胞を、
約2(約1〜約3)の感染多重度(「MOI」)で組換えバキュロウイルスV-galec
tin8,9,10,または10SVで感染させる。6時間後、その培地を除去し、そしてメチ
オニンおよびシステインを除いたSF900 II培地(Life Technologies Inc.,Gait
hersburgから入手可能)に置き換える。42時間後、5μCiの35S-メチオニン
および5μCiの35S-システイン(Amershamから入手可能)を添加する。細胞
をさらに16時間インキュベートし、次いで細胞を遠心分離により収集し、溶解し
、そして標識されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより
可視化する。
実施例3:哺乳動物細胞におけるクローニングおよび発現
哺乳動物細胞における、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、または
ガレクチン10SVのタンパク質の遺伝子配列の一過的発現に使用されるベタターの
ほとんどは、SV40複製起点を有するはずである。このことは、ウイルスDNA合成
の開始に必要なT抗原を発現する細胞(例えば、COS細胞)において、高コピー
数のベクターの複製を可能にする。任意の他の哺乳動物細胞株もまた、この目的
に利用し得る。
代表的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメント(mRNAの転写の開
始を媒介する)、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポ
リアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハン
サー、ドナーによって隣接するKozak配列および介在配列、ならびにRNAスプライ
シングのためのアクセプター部位が挙げられる。非常に有効な転写を、SV40由来
の初期および後期プロモーター、レトロウイルス(例えば、RSV、HTLVI、HIVI)
由来の長末端反復(LTR)ならびにサイトメガロウイルス(CMV)の初期プロモー
ターで達成し得る。しかし、細胞シグナルもまた使用され得る(例えば、ヒトア
クチンプロモーター)。本発明の実施における使用に適切な発現ベクターとして
は、例えば、pSVLおよびpMSG(Pharmacia,Uppsala,Sweden)、pRSVcat(ATCC
37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)、ならびにpBC12MI(ATCC 67109)のようなベ
クターが挙げられる。使用し得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトHela、283、H
9およびJurkat細胞、マウスNIH3T3およびC127細胞、Cosl、Cos7およびCVl、アフ
リカミドリザル細胞、ウズラQCl-3細胞、マウスL細胞、ならびにチャイニーズハ
ムスター卵巣細胞が挙げられる。
あるいは、遺伝子は、染色体に取り込まれるその遺伝子を含む安定な細胞株に
おいて発現され得る。選択マーカー(例えば、dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイ
グロマイシン)どの同時トランスフェクションは、トランスフェクト細胞の同定
および単離を可能にする。
トランスフェクトされた遺伝子はまた、増幅されて大量のコードされるタンパ
タ質を発現し得る。DHFR(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)は、目的の遺伝子の数百
または数千ものコピーを有する細胞株を開発するのに有用なマーカーである。別
の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ(GS)である(Murphyら、
Biochem J.2:27:277-279(1991);Bebbingtonら、Bio/Technology 10:169-175(19
92))。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地において増殖さ
せ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は染色体に取
り込まれる増幅遺伝子(単数または複数)を含む。チャイニーズハムスター卵巣
(CHO)細胞は、タンパク質の産生にしばしば使用される。
発現ベクターpC1およびpC4は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター(LT
R)(Cullenら、Molecular and Cellular Biolugy,438-4470(1985年3月))
およびCMV-エンハンサーのフラグメント(Boshartら、Cell 41:521-530(1985)
)を含む。複数のクローニング部位(例えば、制限酵素切断部位BamHI、XbaI、
およびAsp718)は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターはさら
に、ラットプレプロインシュリン遺伝子の3'イントロン、ポリアデニル化、およ
び終結シグナルを含む。
実施例3(a):COS細胞におけるクローニングおよび発現
発現プラスミドpgalectin8,9,10,または10SVを、ガレクチン8、ガレクチン9
、ガレクチン10、またはガレクチン10SVをコードするcDNAを発現ベクターpcDNAI
/Amp(Invitrogen),InC.から入手し得る)内へクローニングすることによって作
製する。
発現ベクターpcDNAI/ampは以下:(1)E.coliおよび他の原核生物細胞におけ
る増殖に効果的なE.coli複製起点;(2)プラスミド含有原核生物細胞の選択の
ためのアンピシリン耐性遺伝子;(3)真核生物細胞における増殖のためのSV40
複製起点;(4)CMVプロモーター、ポリリンカー、SV40イントロン;および、c
DNAが、都合良くCMVプロモーターの発現制御下におかれ、そしてポリリンカーに
おける制限部位によってSV40イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可
能に連結し得るように配列されたポリアデニル化シグナルを含む。
ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのタンパ
ク質をコードするDNAフラグメントおよびその3'末端にインフレームで融合したH
Aタグを、ベクターのポリリンカー順域にクローン化し、その結果組み換えタン
パク質発現はCMVプロモーターによって導かれる。HAタグは、Wilsonら、Cell 37
:767-778(1984)によって記載されるインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来
のエピトープに対応する。標的タンパク質へのHAタグの融合は、HAエピトープを
認識する抗体を用いる組換えタンパタ質の簡単な検出を可能にする。
プラスミド構築ストラテジーは以下のようである。寄託されたクローンのガレ
クチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SV cDNAを、上記
のE.coliにおけるガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチ
ン10SVの発現のための発現ベクターの構築について記載されるのとほとんど同じ
ように、都合の良い制限部位を含むプライマーを用いて増幅する。発現されたガ
レクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVの検出、精製
、および特徴づけを容易にするために、プライマーのうちの1つは、上記のよう
に赤血球凝集素タグ(「HAタグ」)を含む。
本実施例に、おいて使用される適切なプライマーは、以下を含む。5'ガレクチ
ン8プライマーは、下線を付したSmaI制限酵素部位、続いて図1(配列番号1)
の
ヌクレオチド配列52〜67を含む、配列5' cgc CCC GGG gcc atc ATGGCCTATGTCCCC
G 3'(配列番号55)を有する。
3'ガレクチン8プライマーは、Asp718制限酵素部位、続いて図1(配列番号1
)に示すガレクチン8コード配列のヌクレオチド1005〜1023に相補的なヌクレオ
チドを含む、配列5' cgc GGT ACC TTAGATCTGGACATAGGAC 3'(配列番号56)を有
する。
5'ガレクチン9プライマーは、下線を付したSmaI制限酵素部位、続いて図2A〜
2B(配列番号3)の塩基16〜32のヌクレオチド配列を含む、配列5' cgc CCC GGG
gcc atc ATGGCCTTCAGCGGTTC 3'(配列番号57)を有する。
3'ガレクチン9プライマーは、Asp718制限酵素部位、続いて停止コドンを含む
図2A〜2B(配列番号3)に示すガレクチン9コード配列のヌクレオチド1029〜10
45に相補的なヌクレオチドを含む、配列5' cgc GGT ACC CAGGGTTGGAAAGGCTG 3'
(配列番号58)を有する。
5'ガレクチン10および10SVプライマーは、下線を付したSmaI制限酵素部位、続
いて図3A〜3B(配列番号5)のヌクレオチド配列118〜135を含む、配列5' cgc C CC GGG
gcc atc ATGATGTTGTCCTTAAAC 3'(配列番号59)を有する。
3'ガレクチン10プライマーは、Asp718制限酵素部位、続いて図3A〜3B(配列番
号5)に示すヌクレオチド1105〜1120に相補的なヌクレオチドを含む、配列5' c
gc GGT ACC CACAGAAGCCATTCTG 3'(配列番号60)を有する。
3'ガレクチン10SVプライマーは、Asp718制限酵素部位、続いて図4A〜4B(配列
番号7)に示すガレクチン10SVコード配列の3'末端に相補的なヌクレオチドを含
む、配列5' CCCGGTACCCTATGCAACTTTATAAAATATTCC 3'(配列番号54)を有する。
PCR増幅DNAフラグメントおよびベクターpcDNAI/AmpをHindIIIおよびXhoIで消
化し、次いで連結する。連結混合物を、E.coli株SURE(Stratagene Cloning Syst
ems,11099 North Torrey Pines Road,La Jolla,CA 92037より入手可能)へ形
質転換し、そして形質転換培養物を、次いでインキュベートしてアンピシリン耐
性コロニーの増殖を可能にするアンピシリン培地プレートへプレーティングする
。
プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレ
クチン10、またはガレクチン10SVコードフラグメントの存在について制限分析ま
たはゲルサイズ分画によって試験する。
組換えガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVの
発現のために、COS細胞を、例えば、Sambrookら,MOLECULAR CLONING:A LABORAT
ORY MANUAL,Cold Spring Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1
989)に記載のようにDEAE-DEXTRANを用いて、上記のように発現ベクターでトラン
スフェクトする。細胞をベクターによるガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチ
ン10、またはガレクチン10SVの発現のための条件下でインキュベートする。
ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SV HA融合
タンパク質の発現を、例えば、Harlowら,ANITIBODIES:A LABORATORY MANUAL,
第2版;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York
(1988)に記載の方法を用いて放射標識化および免疫沈降法によって検出する。こ
の目的を達するため、トランスフェクションの2日後に、細胞を、35S-システイ
ンを含む培地中で8時間インキュベートすることによって標識する。細胞および
培地を回収し、そして細胞を洗浄し、そしてWilsonら(上記に引用される)に記
載されるように界面活性剤含有RIPA緩衝液:150mM NaCl、1% NP-40、0.1% SD
S、1% NP-40、0.5% DOC、50mM TRIS、pH7.5で溶解する。タンパク質を、HA特
異的モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物および培養培地から沈降する。次い
で、沈降されたタンパク質をSDS-PAGEゲルおよびオートラジオグラフィーによっ
て分析する。期待されるサイズの発現産物が細胞溶解物において観察され、これ
はネガティブコントロールにおいては観察されない。
実施例3(b):CHO細胞におけるクローニングおよび発現
ベクターpC1を、ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレク
チン10SVのタンパク質の発現のために使用する。プラスミドpC1は、プラスミドp
SV2-dhfr[ATCC受託番号37146]の誘導体である。この両プラスミドは、SV40初期
プロモーターの制御下で、マウスDHFR遺伝子を含む。これらのプラスミドでトラ
ンスフェクトされるジヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細
胞または他の細胞は、化学治療剤メトトレキサートを補充した選択培地(αマイ
ナスMEM、Life Technologies)中で細胞を増殖させることによって選択され得る
。
メトトレキサート(MTX)に耐性である細胞におけるDHFR遺伝子の増幅は、よく
考証されている(例えば、Alt,F.W.,Kellems,R.M.,Bertino,J.R.およびSch
imke,R.T.,1978,J.Biol.Chem.253:1357-1370、Hamlin,J.L.およびM,C.
1990,Biochem.et Biophys.Acta,1097:107-143、Page,M.J.およびSydenham
,M.A.,Biotechnology 9:64-68(1991)を参照のこと)。漸増濃度のMTXにおいて
増殖した細胞は、DHFR遺伝子の増幅の結果として、標的酵素DHFRを過剰産生する
ことによって薬物への耐性を発現する。第二の遺伝子がDHFR遺伝子に連結される
場合、通常、同時増幅され、そして過剰発現される。遺伝子の1,000を越えるコ
ピーを有する細胞株を開発することは最先端技術である。続いて、メトトレキサ
ートが取り除かれる場合、細胞株は、染色体(単数または複数)に取り込まれた
増幅遺伝子を含む。
プラスミドpC1は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルス(Culle
nら、Molecular and Cellular Biology,1985年3月:438-4470)の長末端反復
(LTR)の強力なプロモーターの遺伝子、およびヒトサイトメガロウイルス(CMV
)(Boshartら、Cell 41:521-530,1985)の最初期遺伝子のエンハンサーから単
離されたフラグメントを含む。プロモーターの下流は、遺伝子の取り込みを可能
にする、次の単一の制限酵素切断部位である:BamHl、PvuIIおよびNruI。これら
のクローニング部位の後ろに、プラスミドは、3つ全てのリーディングフレーム
中の翻訳停止コドン、続いてラットプレプロインシュリン遺伝子の3'イントロン
およびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーターもまた、発現のため
に使用され得る(例えば、ヒトβアクチンプロモーター、SV40初期もしくは後期
プロモーター、または他のレトロウイルス(例えば、HIVおよびHTLVI)からの長
末端反復)。mRNAのポリアデニル化のために、他のシグナル(例えば、ヒト成長
ホルモンまたはグロビン遺伝子由来)も同様に使用され得る。
染色体に組み込まれた目的の遺伝子を有する安定な細胞株もまた、選択マーカ
ー(例えば、gpt、G418、またはハイグロマイシン)での同時トランスフェクト
に基づいて選択され得る。初めに2つ以上の選択マーカー(例えば、G418および
メトトレキサート)を使用することが有用である。
プラスミドpC1を制限酵素BamHIで消化し、次いで仔ウシ腸ホスファターゼ(pho
sphate)を用いて、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化する。次いで、ベ
クターを、1%アガロースゲルから単離する。
ガレクチン8、9、または10SVをコードするDNA配列(それぞれ、ATCC受託番
号97732、97733、および97734)は、遺伝子の5'配列および3'配列に対応するPCR
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅される。ガレクチン10配列は、ヒト
子宮内膜腫瘍またはヒト胎児心臓のcDNAライブラリーから同様に増幅される。
5'ガレクチン8プライマーは、下線を付したSmaI制限酵素部位、続いて図1(
配列番号1)のヌクレオチド配列52〜67を含む、配列5' cgcCCCGGGgccatcATGGCC
TATGTCCCCG 3'(配列番号55)を有する。下記のように、発現ベクター中に挿入
されると、ヒトガレクチン8をコードする増幅フラグメントの5'末端は、有効な
シグナルペプチドを提供する。Kozak,M.,J.Mol.Blol.196:947-950(1987)に
記載されるような真核生物細胞における翻訳の開始に有効なシグナルは、構築物
のベクター部分に適切に配置される。
3'ガレクチン8プライマーは、Asp718制限酵素部位、続いて図1(配列番号1
)に示すガレクチン8コード配列のヌクレオチド1005〜1023に相補的なヌクレオ
チドを含む、配列5' cgc GGT ACC TTAGATCTGGACATAGGAC 3'(配列番号56)を有
する。
5'ガレクチン9プライマーは、下線を付したSmaI制限酵素部位、続いて図2A〜
2B(配列番号3)の塩基16〜32のヌクレオチド配列を含む、配列5' cgc CCC GGG
gcc atc ATGGCCTTCAGCGGTTC 3'(配列番号57)を有する。下記のように、発現
ベクター中に挿入されると、ヒトガレクチン9をコードする増幅フラグメントの
5'末端は、有効なシグナルペプチドを提供する。Kozak,M.,J.Mol.Biol.196
:947-950(1987)に記載されるような真核生物細胞における翻訳の開始に有効なシ
グナルは、構築物のベクター部分に適切に配置される。
3'ガレクチン9プライマーは、Asp718制限酵素部位、続いて停止コドンを含む
図2A〜2B(配列番号3)に示すガレクチン9コード配列のヌクレオチド1029〜10
45に相補的なヌクレオチドを含む、配列5' cgc GGT ACC CAGGGTTGGAAAGGCTG 3'
(配列番号58)を有する。
5'ガレクチン10および10SVプライマーは、下線を付したSmaI制限酵素部位、続
いて図3A〜3B(配列番号5)のヌクレオチド配列118〜135を含む、配列5' cgc C CC GGG
gcc atc ATGATGTTGTCCTTAAAC 3'(配列番号59)を有する。下記のように
、発現ベクター中に挿入されると、ヒトガレクチン10をコードする増幅フラグメ
ントの5'末端が有効なシグナルペプチドを提供する。Kozak,M.,J.Mol.Biol
.196:947-950(1987)に記載されるような真核生物細胞における翻訳の開始に有
効なシグナルは、構築物のベクター部分に適切に配置される。
3'ガレクチン10プライマーは、Asp718制限酵素部位、続いて図3A〜3B(配列番
号5)に示すヌクレオチド1105〜1120に相補的なヌクレオチドを含む、配列5' c
gcGGTACCCACAGAAGCCATTCTG 3'(配列番号60)を有する。
3'ガレクチン10SVプライマーは、Asp718制限酵素部位、続いて図4A〜4B(配列
番号7)に示すガレクチン10SVコード配列の3'末端に相補的なヌクレオチドを含
む、配列5' CGCGGTACCCTATGCAACTTTATAAAATATTCC 3'(配列番号54)を有する。
増幅させたフラグメントを、上記のように1%アガロースゲルから単離し、次
いでエンドヌクレアーゼSmaIおよびAsp718で消化し、次いで1%アガロースゲル
で再び精製する。
次いで、単離したフラグメントおよび脱リン酸化ベクターをT4 DNAリガーゼで
連結する。次いで、E.coli HB101細胞を形質転換し、そして制限酵素SmaIを用い
て正しい配向に挿入されたプラスミドpC1を含む細菌を同定する。挿入した遺伝
子の配列を、DNA配列決定によって確認する。
CHO-DHFR細胞のトランスフェクション
活性なDHFR酵素を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェ
クションのために使用する。5μgの発現プラスミドC1を、リポフェクチング方
法(Felgnerら、前出)を用いて、0.5μgのプラスミドpSV2neoとともに同時ト
ランスフェクトする。プラスミドpSV2-neoは優性選択マーカー(G418を含む一群
の抗生物質への耐性を与える酵素をコードするTn5由来の遺伝子neo)を含む。細
胞を、1mg/mlのG418を補充したαマイナスMEMに播種する。2日後、細胞をトリ
プシン処理し、ハイブリドーマクローニングプレート(Greiner,Germany)に播
種し、そして10〜14日培養する。この期間の後、単一のクローンをトリプシン処
理
し、次いで異なる濃度のメトトレキサート(25nM、50nM、100nM、200nM、400nM
)を用いて、6ウェルペトリ皿に播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサー
トで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート(500nM、1μM、
2μM、5μM)を含む新たな6ウェルプレートに移す。同じ手順を、クローン
が100μMの濃度で増殖するまで繰り返す。
所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ウエスタンブロット分析およびSDS-PAGE
によって分析する。
実施例4:タンパク質発現の組織分布
ノーザンブロット分析を行って、とりわけSambrookら(上記に引用される)に
よって記載される方法を用いて、ヒト組織におけるガレクチン8、ガレクチン9
、ガレクチン10、またはガレクチン10SV遺伝子の発現レベルを調べる。ガレクチ
ン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SVのタンパク質の全ヌ
クレオチド配列(それぞれ、配列番号1、3、5、または7)を含むcDNAプロー
ブを、redlprimeTM DNA標識システム(Amersham Life Sci ence)を製造者の説明
書に従って用いて32Pで標識する。標識後、プローブを、CHROMA SPIN-100TMカラ
ム(Clontech Laboratories,Inc.)を製造者のプロトコル番号PT1200-1に従っ
て用いて精製する。次いで、精製した標識プローブを用いて、種々のヒト組織を
ガレクチン8、ガレクチン9、ガレクチン10、またはガレクチン10SV mRNAにつ
いて調べる。
種々のヒト組織(H)またはヒト免疫系組織(IM)を含む複数組織のノーザン
(MTN)ブロットを、Clontechから入手し、そしてExprecssHybTMハイブリダイゼ
ーション溶液(Clontech)を製造者のプロトコル番号PT1190-1に従って用いて標
識プローブを用いて調べる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、ブロットを
マウントし、そして−70℃にて一晩フィルムに曝し、そしてフィルムを標準的な
手順に従って現像する。
本発明が、前述の説明および実施例に詳細に記載される以外に実施され得るこ
とは明白である。
本発明の多数の改変および変異が、上記の教示に照らして可能であり、それゆ
え添付の請求の範囲の範囲内である。
本明細書中に参考として援用される全ての刊行物(特許、特許出願、学術誌、
研究室マニュアル、書籍、または他の文書を含む)の開示の全体が、これによっ
て本明細書で参考として援用される。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, and Galectin 10 SV
Background of the Invention
Field of the invention
The present invention relates to a novel galectin. More specifically, human galectin 8,
An isolated encoding galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV
A nucleic acid molecule is provided. Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, and
Galectin 10: SV polypeptides, vectors producing those polypeptides,
Host cells and recombinant methods are also provided. The present invention further provides a galectin.
8, an agonist of the activity of galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV
And screening methods for identifying antagonists. Cell proliferation
Diagnostic methods for detecting disorders and autoimmune diseases, cancer, and inflammatory diseases
Also provided is a method of treating a cell proliferative disorder comprising:
Related technical fields
Lectins are proteins that bind to specific carbohydrate structures and therefore
Can recognize glycoconjugates. Barondes et al., J. Biol. Chem. 269 (33): 20807-20810 (1994
). Galectins are a family of β-galactoside-binding lectins with related amino acid sequences.
(For a review, see Barondes et al., Cell 76: 597-598 (19
94); Barondes et al., J. Blol. Chem. 269 (33): 20807-20810 (August 1994)
thing). Galectin 1 (L-14-1, L-14, RL-14. 5, Galaptin, MGBP, GBP, BHL
, CHA, HBP, HPL, HLBP 14, also known as rIML-1)
A homodimer with knit molecular weight, which is abundant in smooth and skeletal muscle
In many other cell types (Couraud et al., J. Biol. Biol. Chem. 264: 1
310-1316 (1989)). Galactin 2 was originally found in liver cancer. And this
It is a homodimer with a subunit molecular weight of 14,650 (Gitt et al., J. Am. Bi
ol.
Chem. 267: 10601-10606 (1992)). Galectin 3 (Mac-2, EPB, CBP-35, CBP-30,
And also known as L-29) activate activated macrophages and epithelial cells
Monomers that are abundant and have an apparent molecular weight between 26,320 and 30,300
(Cherayli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7324-7326 (1990)). Galle
Kuching 4 has a molecular weight of 36,300 and combines two carbohydrate binding domains into a single
Contained within the peptide chain (Oda et al., J. Am. Biol. Chem. 268: 5929-5939 (1993)). Galectin
5 and galectin 6 are mentioned in Barondes et al., Cell 76: 597-598 (1994).
You. Human galectin 7 has a molecular weight of 15,073 and is found mainly in stratified squamous epithelium.
(Madsen et al., J. Biol. Chem. 270 (11): 5823-5829 (1995)).
Animal lectins generally involve cell-cell and cell-matrix interactions.
Often works in regulating usage. Galectin 1 is the cell in which it resides.
Either promote or inhibit cell adhesion, depending on the cell type
It is shown. Galectin 1 regulates cell-matrix interactions in skeletal muscle
Inhibits (Cooper et al., J. Cell. Biol. 115: 1437-1448 (1991)). Smells other cell types
Thus, galectin 1 promotes cell-matrix adhesion, presumably
Promoted by cross-linking polysaccharides (Zhou et al., Arch. Biochem, Biophys. 300: 6-17 (
1993); Skrincosky et al., Cancer Res. 53: 2667-2675 (1993)).
Galectin 1 also promotes cell proliferation (Wells et al., Cell 64: 91-97 (1991)).
Some immune functions (Offner et al., J. Neuroimmunol. 28: 177-184 (1990))
I do. Galectin-1 mediates T cell apoptosis and thereby stimulates the immune response
Have been shown to control (Perillo et al., Nature 378736-739 (1995)).
Galectin 3 promotes the growth of cells cultured under restricted culture conditions (
Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93. 6737-6742 (June 1996)). Galleries in cells
Kuctin 3 expression confers resistance to apoptosis, which indicates that galectin 3
Shows that it may be a cell death suppressor that disrupts the normal pathway of apoptosis
(Id.)
Accordingly, there is a need in the art for the development of therapeutics and diagnostics to modulate the immune response.
For the identification of novel galectins that can serve as useful tools in the field
Sex exists.
Summary of the Invention
The present invention provides SEQ ID NOs: 1, 2A-2B, 3A-3B, and 4A-4B (respectively,
Galectin 8 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 8)
Encoding a galectin 9, galectin 10 or galectin 10 SV polypeptide
An isolated nucleic acid molecule containing a polynucleotide or an ATCC on September 24, 1996.
CDNA clones deposited in bacterial hosts as accession numbers 97732, 97733, and 97732
Provides the amino acid sequence encoded by
The present invention also provides a recombinant vector comprising the isolated nucleic acid molecule of the present invention, and
Cells containing the recombinant vectors of the invention, and such vectors and host cells
, Galectin 8, galectin 9, galectin 10 or galectin
Chin 10SV polypeptides or peptides for recombinant production
On how to use.
The invention further relates to a polynucleotide encoded by a polynucleotide described herein.
Galectin 8, Galectin 9, Galecti having the amino acid sequence of
The present invention provides polypeptides of protein 10 or galectin 10 SV.
The present invention also relates to galectin 8, galectin 9, galectin 10 or galectin.
Identify compounds that can enhance or inhibit the cellular response induced by 10SV
To provide a screening method. This method comprises galectin 8, galectin 9,
Contacting cells expressing Galectin 10 or Galectin 10 SV with a candidate compound
Assaying the cellular response and the cellular response and the standard cellular response (this
The standard is assayed when contact is made in the absence of the candidate compound).
Comparing the compound with the standard to increase the cellular response to the standard.
Gonists, and a reduced cellular response to the standard indicates that the compound
Indicates that he is an antagonist.
In another aspect, galectin 8 bound to β-galactosidase sugar, galectin
Effect of candidate compounds on Kuching 9, Galectin 10 or Galectin 10 SV
Screening for agonists and antagonists, including determining
A testing assay is provided. In particular, this method involves the use of β-galactosidase sugar
Polypeptide of Tin 8, Galectin 9, Galectin 10 or Galectin 10 SV
Contacting with a co-compound, and binding to a β-galactosidase sugar.
Lectin 8, galectin 9, galectin 10 or galectin 10 SV are candidate compounds
Deciding whether to increase or decrease due to its presence.
The present invention provides diagnostic methods useful during the diagnosis of a disorder.
A further aspect of the invention relates to galectin 8, galectin 9, galectin 9 in the body.
Treating individuals in need of increased levels of activity of Tin 10 or Galectin 10 SV
The method comprises administering to a subject a therapeutically effective amount of an isolated galectin 8 of the invention.
Lectin 9, Galectin 10 or Galectin 10 SV polypeptides or their polypeptides
Administering a composition comprising the agonist to such an individual.
Yet a further aspect of the invention relates to galectin 8, galectin 9,
Treating an individual in need of a reduced level of lectin 10 or galectin 10 SV activity
The method comprises treating a therapeutically effective amount of galectin 8, galectin 9, galectin 9,
A composition comprising a Kuching 10 or Galectin 10 SV antagonist is administered to such an individual.
Administration.
BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
FIG. 1 shows galectin 8 nucleotides (SEQ ID NO: 1) and deduced amino acids (SEQ ID NO: 1).
2 shows the sequence of column number 2). The protein has a predicted molecular weight of approximately 36kDa.
2A-2B show galectin 9 nucleotides (SEQ ID NO: 3) and deduced amino acids.
2 shows the sequence of (SEQ ID NO: 4). About 34. Has an estimated molecular weight of 7 kDa
.
3A-3B show the nucleotides of full-length galectin 10 (SEQ ID NO: 5) and the predicted amino acids.
SEQ ID NO: 6 shows the sequence of the acid (SEQ ID NO: 6). About 35. Has an estimated molecular weight of 7 kDa
I do.
4A and 4B show the galectin 10 splicing mutant (galectin 10 SV) nucleic acid.
The sequence of otide (SEQ ID NO: 7) and deduced amino acids (SEQ ID NO: 8) are shown. Tampa
The quality is about 22. It has an estimated molecular weight of 4 kDa.
5A-5E show the amino acids of Galectin 8, Galectin 9, and Galectin 10.
Sequence and human galectin 2 (SEQ ID NO: 9), human galectin 3 (SEQ ID NO: 10),
Rat galectin 4 (SEQ ID NO: 11), rat galectin 5 (SEQ ID NO: 12), human
Galectin 7 (SEQ ID NO: 13), rat galectin 3 (SEQ ID NO: 14), rat galectin
Amino acids between Kuching 8 (SEQ ID NO: 15) and human galectin 1 (SEQ ID NO: 16)
2 shows regions of acid sequence similarity.
FIG. 6 shows that galectin 10SV protein and rat RL30 protein (SEQ ID NO: 17)
The region of amino acid sequence similarity between.
FIG. 7 shows the homology between Galectin 10 protein and Galectin 10 SV protein.
The gender comparison is shown.
8, 9, 10, and 11 show galectin 8, galectin 9, galectin, respectively.
2 shows an analysis of the amino acid sequences of tin 10 and galectin 10SV. α, β, turn,
And coil regions; hydrophilic and hydrophobic; amphiphilic regions; flexible regions;
Shows the index and surface probability. In the "antigenicity index-Jameson-Wolf" graph,
1 (SEQ ID NO: 2) at amino acid residues 55-101, 137-162, 180-193, 216-266, FIG.
Amino acid residues 62 to 102, 226 to 259, 197 to 308 of A to 2B (SEQ ID NO: 4), FIGS. 3A to 3B (
Amino acid residues 25 to 77, 84 to 105, 129 to 140, 156 to 183, 195 to 215 of SEQ ID NO: 6)
, And 241-257, and 25-77, 84-105, 129- of FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 8).
140 and 156 to 183 are respectively galectin 8, galectin 9, and galectin 1
0, or corresponding to the indicated highly antigenic region of the galectin 10SV protein.
You.
Detailed description
The present invention relates to FIGS. 1, 2A-2B, 3A-3B, and 4A-4B, respectively (SEQ ID NO:
Nos. 2, 4, 6, and 8), which were cloned
galectin 8 (determined by sequencing the cDNA)
9. Galectin 10 or a polynucleotide encoding a galectin 10 SV polypeptide
Provided is an isolated nucleic acid molecule comprising an otide. Galectin 8 of the present invention, galecti
The proteins of Galectin 9, Galectin 10 and Galectin 10 SV are
And rat RL30 proteins (Figures 5A-5E and 6) (SEQ ID NOS: 9-17) and sequence homology
To share. 1, 2A-2B, and 4A-4B (SEQ ID NOs: 1, 3, and
The nucleotide sequence shown in 7) is HSIAL77, HTPBR22, and HETAS87 clones.
(These were the American Type Culture Collection, September 24, 1996, 12
Deposited at 301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, and each
Accession numbers 9T732, 97733, and 97934).
Obtained by The deposited clone was pBluescriptSK (-) plasmid
(Stratagene, LaJolla, CA).
The nucleotide sequence shown in FIGS. 3A-3B (SEQ ID NO: 5), which is a full-length galectic
(Encoding protein 10) was obtained from a human endometrial cancer library
Obtained by sequencing cDNA clones.
Nucleic acid molecule
Unless otherwise indicated, determined by sequencing a DNA molecule herein.
All sequenced nucleotide sequences are automatically sequenced by an automated DNA sequencer (eg, Applied B
iosystems, Inc. Determined using Model 373) and determined herein.
Peptide, polypeptide, or protein encoded by the DNA molecule
All amino acid sequences of quality are obtained by translation of the DNA sequence determined as described above.
As expected. Therefore, any DNA sequence determined by this automated approach
As is known in the art for any of the nucleic acids determined herein.
Otide sequences can contain some errors. Nucleochy determined by automation
Sequence is representative of the actual nucleotide sequence of the DNA molecule to be sequenced.
Has at least about 90% identity, more typically at least about 95% to at least
About 99. 99% identical. The actual sequence is determined by manual DNA sequencing as is well known in the art.
It can be determined more accurately by other approaches, including fixed methods. In the field
As is also known, the nucleotide sequence determined is compared to the actual sequence.
A single insertion or deletion in the nucleotide sequence translates into a frameshift
And consequently the prediction encoded by the determined nucleotide sequence.
The putative amino acid sequence is sequenced starting at a point such as an insertion or deletion.
It is completely different from the amino acid sequence actually encoded by the DNA molecule.
The information provided herein (eg, FIGS. 1, 2A-2B, 3A-3B, and 4A-4B
, The galectin 8 and the galectin, respectively.
9. The nucleus of the present invention encoding a galectin 10 or galectin 10 SV polypeptide
The acid molecule is subjected to standard cloning and screening procedures (eg, starting material
Procedure for cloning cDNA using mRNA as
As an example of the present invention, the nucleic acid molecules described in FIGS. 1, 2A-2B, 3A-3B, and 4A-4B
(Respectively, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, and 7) correspond to human adult small intestine and human, respectively.
Live pancreatic tumors, human endometrial tumors, and cDNAs derived from human endometrial tumors
Found in the rally. These genes are also found in the following tissues (pancreas, colon)
CDNA libraries from, small intestine, brain, bone marrow, kidney, lung, spleen, and testis tissue)
Lee. Galectin 8 (SEQ ID NO: 1) is found in human colon and small intestine
Seems to be mainly expressed in cells.
Galectin 8 and galectin 9 of FIGS. 1, 2A-2B, 3A-3B, and 4A-4B, respectively.
Determined nucleotide sequence of cDNA for galectin 10 or galectin 10 SV
Column numbers 1, 3, 5, and 7) are 323, 311, 317, and 200 amino acids, respectively.
An open reading frame encoding a protein with acid residues (Fig.
The nucleotide sequences of 1, 2A-2B, 3A-3B, and 4A-4B (SEQ ID NOs: 1, 3, 5,
And 7) open at 52-54, 16-18, 118-120, and 118-120, respectively.
With the start codon), and about 36, 34, respectively. 7, 35. 7, and 22. 4kDa estimation
Including molecular weight. The galleries shown in FIGS. 1, 2A-2B, 3A-3B, and 4A-4B, respectively.
Proteins of Kuching 8, Galectin 9, Galectin 10 and Galectin 10 SV
Column numbers 2, 4, 6, and 8) share homology with other galectins (eg,
5A-E).
As will be appreciated by those skilled in the art, the potential for sequencing errors described above, as well as different
Deposited cDNA due to diversity of processing sites for intellectual proteins
The putative galectin 8 and galectin 9 polypeptides encoded by
About 323 amino acids and about 311 amino acids (but somewhere in the 300-333 amino acid range
Possible). Similarly, the putative galectin 10 polypeptide has about 317 amino acids.
Notic acid (but can be anywhere in the range of 305-329 amino acids). In addition,
The constant galectin 10SV polypeptide has about 200 amino acids (but 190-210 amino acids).
(Which can be anywhere in the range of acids).
Galectin 10 SV is considered to be a splice variant of galectin 10. Book
As used herein, the phrase "splice variant" refers to an initially identical genomic DNA sequence.
From alternative RNA spliced RNA molecules
CDNA molecule. Alternative RNA splicing involves the primary RNA transcript
Commonly occurs when splicing is performed to remove introns. this
As a result, two or more mRNAs each encoding a different amino acid sequence are produced. for
The term "splice variant" also refers to the protein encoded by the cDNA molecule described above.
Say.
As shown, the nucleic acid molecules of the invention can be in the form of RNA (eg, mRNA), or D
NA forms (e.g., obtained by cDNA and cloning or synthetic
(Including genomic DNA that is produced in nature). DNA is double-stranded or single-stranded
Can be a chain. Single-stranded DNA or RNA is the coding strand (also known as the sense strand)
Or it is the non-coding strand (also known as the antisense strand)
Can be
An “isolated” nucleic acid molecule allows nucleic acid molecules (DN
A or RNA) is intended. For example, a recombinant DNA molecule contained in a vector is:
It is contemplated that it is isolated for the purposes of the present invention. Further isolation of isolated DNA molecules
Examples are recombinant DNA molecules maintained in heterologous host cells, or in solution.
Includes purified (partially or substantially) DNA molecules. The isolated RNA molecule is
Includes in vivo or in vitro RNA transcripts of defined DNA molecules. According to the present invention
Isolated nucleic acid molecule further includes those molecules that are produced synthetically.
The isolated nucleic acid molecules of the present invention are shown in FIGS. 1, 2A-2B, 3A-3B, and 4A, respectively.
Open reading frames (ORFs) shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5,
And 7) a DNA molecule comprising; and substantially different from the sequence described above,
Due to the degeneracy of the genetic code, galectin 8, galectin 9, galectin 10
Or contains DNA molecules that still contain sequences that encode the galectin 10SV protein
. Of course, the genetic code is well known in the art. Therefore, such degenerate mutants
Producing is routine for those skilled in the art.
Further, the invention has a nucleotide sequence for the extension of SEQ ID NO: 1.
Provide a nucleic acid molecule. It has been determined from cDNA clones for:
HSIAL77R (SEQ ID NO: 18), HGBDK55R (SEQ ID NO: 19), HCNAH29R (SEQ ID NO: 20),
HKCAA85R (SEQ ID NO: 21), HCNAI55R (SEQ ID NO: 22), HCNAI87R (SEQ ID NO: 23),
HCNAS74R (SEQ ID NO: 24), and HCNAF43R (SEQ ID NO: 25).
Further, the invention has a nucleotide sequence for the extension of SEQ ID NO: 3.
Provide a nucleic acid molecule. It has been determined from cDNA clones for:
HMSCP11R (SEQ ID NO: 26), HMSEU32R (SEQ ID NO: 27), HTPAO71R (SEQ ID NO: 28),
HJAAV54R (SEQ ID NO: 29), HMSEU43R (SEQ ID NO: 30), HILBP03R (SEQ ID NO: 31),
HTPCG81R (SEQ ID NO: 32), HTBAA21R (SEQ ID NO: 33), and HFXBU26R (SEQ ID NO:
34).
Further, the invention has a nucleotide sequence for the extension of SEQ ID NO: 5.
Provide a nucleic acid molecule. It has been determined from cDNA clones for:
HTNBX92R (SEQ ID NO: 35), HLTAZ64RB (SEQ ID NO: 36), HJBAI38R (SEQ ID NO: 37)
, HETAS87R (SEQ ID NO: 38), and HETAR45R (SEQ ID NO: 39).
Further, the present invention has a nucleotide sequence for the extension of SEQ ID NO: 7.
Provide a nucleic acid molecule. It has been determined from cDNA clones for:
HTNBX92R (SEQ ID NO: 35), HLTAZ64RB (SEQ ID NO: 36), HBNAF37R (SEQ ID NO: 40)
, And HETAS87R (SEQ ID NO: 38).
In another aspect, the present invention relates to a plasmid (ATCC Accession No.
Nos. 97732, 97733, and 97334), respectively.
Galectin 8, having an amino acid sequence encoded by a cDNA clone
A simple encoding polypeptide of Kuching 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV
Providing an isolated nucleic acid molecule. In a further embodiment, the N-terminal methionine is
Full length galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin 10 to be deleted
Provided are nucleic acid molecules that encode the SV polypeptide. The present invention further relates to FIG.
Nus shown in 2A-2B, 3A-3B, or 4A-4B (SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7)
A nucleotide sequence, or galectin 8, contained in the deposited clone described above;
Nucleotide sequence of galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV cDNA
Isolated nucleic acid molecule having a sequence, or a sequence complementary to one of the above sequences
A nucleic acid molecule having the formula: Such isolated molecules (especially DNA molecules)
Gene mapping professional by in situ hybridization with chromosomes
Galectin 8, galectin 9, galectin as a probe and in human tissues
10, or detection of galectin 10SV gene expression (eg, Northern blot analysis
).
The present invention further provides fragments of the isolated nucleic acid molecules described herein.
Be oriented to The nucleotide sequence of the deposited cDNA, or FIGS. 1, 2A-2B, 3A-
3B or the nucleotide sequence shown in 4A-4B (SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7)
With a fragment of an isolated nucleic acid molecule having a sequence, at least about 15 nt, and
And more preferably at least about 20 nt, even more preferably at least about 30 nt, and
Even more preferably, fragments of at least about 40 nt in length are contemplated,
Are useful as diagnostic probes and primers described herein.
Naturally, the longer DNA fragments 50, 100, 15 shown in SEQ ID NO: 1
0, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850
, 900, 1000, 11050, 1100, or 1115 nt long also have ATCC accession number 97732.
CD contained in the plasmid shown in SEQ ID NO: 1
Flags corresponding to most, if not all, of the NA clones
As well as pigments are useful according to the invention. Similarly, shown in SEQ ID NO: 3
Longer DNA fragments 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500,
550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 12
Sequences 50, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, or 1525 nt in length are also ATCC accession numbers.
No. 97733 or contained in the plasmid set forth in SEQ ID NO: 3
For most, if not all, cDNA clones
As well as fragments that are useful, they are useful according to the invention. Similarly, in SEQ ID NO: 5
Longer DNA fragments 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 45 shown
0, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1050, 1100, 1150,
A 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, or 1464 nt long sequence is also a SEQ ID NO.
Most, if not all, of the cDNA molecules shown in FIG.
Respond
As with fragments, they are useful according to the invention. Further, as shown in SEQ ID NO: 7,
Longer DNA fragments 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500
, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200,
1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800,
Sequences 1850, 1900, and 1908 nt in length have also been deposited under ATCC Accession No. 97733.
Or all of the cDNA clones contained in the plasmid set forth in SEQ ID NO: 7.
Most, if not all, fragments of most nucleotide sequences
In addition, it is useful according to the present invention. For example, at least 20 nt long fragments
The nucleotide sequence of the deposited cDNA or SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7.
Fragments containing 20 or more contiguous bases from the indicated nucleotide sequence are contemplated.
Illustrated.
Preferred nucleic acid fragments of the invention include galectin 8, galectin 9, galectin
Encodes an epitope-bearing part of the protein of Kuching 10 or Galectin 10 SV
Nucleic acid molecules. In particular, such nucleic acid fragments of the invention include:
Included are nucleic acid molecules that encode: about 55-101 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2).
137-162, 180-193, 216-266, 62-102, 2 in FIGS. 2A-2B (SEQ ID NO: 4).
26-259, 197-308, 25-77, 84-105, 129-1 in FIGS. 3A-3B (SEQ ID NO: 6).
40, 156-183, 1915-215, and 241-257, and FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 8)
Amino acid residues from 25-77, 84-105, 129-140, and 156-183 in
Polypeptide. The present inventors have found that the above polypeptide fragment is
Antigens of protein 8, galectin 9, galectin 10, and galectin 10 SV
Sex region. Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10,
For determining such and other epitope-bearing portions of the protein of galectin 10SV
The method is described in detail below.
In another aspect, the invention relates to stringent hybridization conditions.
In some cases, the nucleic acid molecule of the present invention described above (for example, ATCC Accession Nos. 97732 and 97733)
And some of the polynucleotides in the cDNA clones contained in
An isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide that hybridizes is provided. "Strike
According to the "Lingent hybridization conditions", the following: 50% formamide
Do
5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate
(PH 7. 6) 5x Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 g / ml denatured shear
Overnight incubation at 42 ° C. in a solution containing disrupted salmon sperm DNA, followed by about 65
0 ° C. It is intended to wash the filters in 1 × SSC.
By a polynucleotide that hybridizes to a "portion" of the polynucleotide
At least about 15 nucleotides (nt) of the reference polynucleotide, and more preferably
Or at least about 20 nt, even more preferably at least about 30 nt, and even more
More preferably, a polynucleotide (DNA or DNA) that hybridizes to about 30 to 70 nt.
Is intended for any of the RNA). These are discussed in more detail above and below.
It is useful as a diagnostic probe and primer as may be expected.
For example, a portion of a polynucleotide "at least 20 nt long" may
Nucleotide sequence (deposited cDNA, or FIGS. 1, 2A-2B, 3A-3B
Or a nucleoside as set forth in 4A-4B (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, or 7)
20 or more contiguous nucleotides from the peptide sequence are contemplated. Of course
The poly A sequence (eg, FIG. 1, 2A-2B, 3A-3B, or 4A-4B (
Galectin 8, Galectin 9, Galectin shown in column numbers 1, 3, 5, or 7)
Tin 10 or Galectin 10SV cDNA 3 'poly (A) tract only) or T
Polynucleotides that hybridize to the complementary extension of (or U) residues
Polynucleotides of the invention used to hybridize to a portion of a defined nucleic acid
Not included in the tide. Because such polynucleotides have poly (A) extension
Or any nucleic acid comprising its complement (eg, especially any double-stranded cDNA clone)
This is because it hybridizes to the molecule.
As shown, galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin
A nucleic acid molecule of the invention that encodes a polypeptide of Tin 10SV can include:
Not limited to: encoding the amino acid sequence of the polypeptide by itself
A nucleic acid molecule that encodes the coding sequence and additional sequences for the polypeptide (eg,
Such as protein sequence or proprotein sequence or preproprotein sequence
Sequence encoding an amino acid leader sequence or secretory sequence);
Sequence, with or without the additional coding sequence described above, and additional non-coding sequence.
Clustered together with the sequence, which includes, for example, introns and non-coding 5 'and
And 3 'sequences (splicing and polyadenylation signals (eg, ribosomal
Plays a role in transcription and mRNA processing, including protein binding and mRNA stability
, Transcribed untranslated sequences));
Additional coding sequences encoding additional amino acids as provided. Therefore, the polype
The sequence encoding the peptide may include a marker sequence (eg, a fused polypeptide).
(A sequence encoding a peptide that facilitates purification). This station of the present invention
In certain preferred embodiments of the aspect, the marker amino acid sequence is hexa-histidine.
Thidine peptide (for example, pQE vector (Qiagen, Inc. Tags provided in
), Among others, many of them are commercially available. See, for example, Gentz et al., Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989).
Gin provides for convenient purification of the fusion protein. The “HA” tag is
Another useful for purification corresponding to epitopes from the hemagglutinin protein
Peptide, which is described by Wilson et al., Cell 37: 767 (1984).
You. As discussed below, other such fusion proteins include N-terminal or
Is Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10 fused to Fc at the C-terminus, or
Contains galectin 10SV.
The present invention further provides galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin.
The present invention, which encodes a part, analog, or derivative of a Kuching 10SV protein
It relates to variants of nucleic acid molecules. Variants are naturally occurring, like natural allelic variants
Can occur. By "allelic variant", a given locus on the chromosome of an organism
One of several interchangeable forms of the gene occupying is contemplated. Genes II, Le
win, B. Ed., John Wiley & Sons, New York (1985). Non-naturally occurring variants are
It can be produced using mutagenesis techniques known in the art.
Such variants include nucleotide substitutions that may include one or more nucleotides.
, Deletions, or additions. Variants are coding regions
, Non-coding regions, or both. Modifications in the coding region
, Conserved or non-conserved amino acid substitutions, deletions, or adducts. this
Particularly preferred among them are silent substitutions, additions, or deletions.
.
These are galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV
Does not alter the properties and activities of the proteins, or some of them. In this regard
Also particularly preferred in this regard are conservative substitutions.
Further embodiments of the present invention include: (a) Figure 1, 2A-2B, 3A-3B, or 4A-4B
Galectin 8 having the amino acid sequence of (SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7)
Encoding a galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV polypeptide
(B) Figure 1, 2A-2B, 3A-3B, or 4A-4B (SEQ ID NO:
1, 3, 5, or 7) but has an N-terminal methionine
A nucleotide sequence encoding the polypeptide to be deleted; (c) A of September 24, 1996
For cDNA clones contained in TCC Accession Nos. 97732, 97733, or 97732
A nucleotide sequence encoding a more encoded amino acid sequence; or (d)
A nucleotide complementary to any nucleotide sequence in (a), (b), or (c)
At least 95%, and more preferably less than,
Polynucleic acids having the same nucleotide sequence of 96%, 97%, 98%, or 99%
Included are isolated nucleic acid molecules that contain leotide.
Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV
At least 95% "identical" to the reference nucleotide sequence encoding the peptide
The polynucleotide having the nucleotide sequence
The sequence corresponds to Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV
5 per 100 nucleotides of the reference nucleotide sequence encoding the polypeptide
The nucleotide sequence of the polynucleotide, except that it may contain up to
Is intended to be identical to the reference sequence. In other words, the reference nucleotide sequence
Obtaining a polynucleotide having a nucleotide sequence at least 95% identical to the sequence
Up to 5% of the nucleotides in the reference sequence can be deleted or
Can be replaced by another nucleotide, or
As many as 5% of nucleotides can be inserted into the reference sequence. This in the reference array
These mutations may be at the 5 'or 3' end of the reference nucleotide sequence, or
One or more contiguous groups within a reference sequence, individually within nucleotides within a sequence
And may occur somewhere between these terminal positions.
In fact, any particular nucleic acid molecule can be represented in FIG. 1, 2A-B, 3A-3B, or 4A-4B (
SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7) or the deposited
at least 95%, 96%, 97%, 98%, or
Are 99% identical or not, for example, using the Bestfit program (Wisconsin Sequence A
nalysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University
Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711).
It can be determined conventionally using a pewter program. Bestfit is Smith and
And Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)
A sex algorithm is used to find the best segment of homology between the two sequences.
Using Bestfit or any other sequence alignment program, if a particular sequence is
For example, to determine if it is 95% identical to a reference sequence according to the invention, the parameters
Is, of course, the percent identity calculated over the entire length of the reference nucleotide sequence.
And in homology up to 5% of the total nucleotide number of the reference sequence
It is set so that caps are allowed.
The present application relates to galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin 10
1, 2A-B, 3 regardless of whether they encode a polypeptide having SV activity.
A to 3B or 4A to 4B (SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7).
Or at least 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% of the nucleic acid sequence of the deposited cDNA.
Such nucleic acid molecules that are% identical. This means that certain nucleic acid molecules are
Having the activity of galectin 9, galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV
Even if they do not encode a peptide, those skilled in the art will know how to
For example, hybridization probes or polymerase chain reaction (PCR)
This is because they still know whether to use them as primers. Galectin 8, Galectin
9. Encoding a polypeptide having the activity of galectin 10 or galectin 10 SV
Examples of the use of the nucleic acid molecule of the present invention include (1) galectin 8, galectin
Chin 9, galectin 10, or galectin 10 SV gene or allelic variation thereof
Isolating the body from a cDNA library; (2) Verma et al., Human Chromosomes: a
Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988)
Correction of lectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV gene
In situ on metaphase chromosome spreads to provide a robust chromosome location
And (3) a specific cell type (eg, activated
Galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin 10
Northern blot analysis to detect SV mRNA expression.
However, FIG. 1, 2A-2B, 3A-3B, or 4A-4B (SEQ ID NOs: 1, 3, 5,
Is the nucleic acid sequence shown in 7) or one of the deposited cDNAs (this
It is actually galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin.
Encoding a polypeptide having 10 SV protein activity)
Nucleic acid molecules having a sequence that is 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical are preferred.
As measured in certain biological assays, "galectin 8, galectin 9
, A galectin 10, or a polypeptide having the activity of galectin 10 SV ''
Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV of the present invention
A polypeptide that is not necessarily identical to the activity of a protein but has similar activity
Intended. For example, galectin 8, galectin 9, galetatin 10, or galectin
Kutin 10 SV protein activity can be measured using a lactose binding assay.
You.
Expressed galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin 10
The lactose binding activity of SV was determined by the immobilization on nitrocellulose (Amersham).
By immunodetection of in situ binding activity to sialofetuin (Sigma)
Assayed (Madsen et al., J. Mol. Biol. Chem. 270 (11) 5823-5829 (1995)). 3μ
30 μg of asialofetuin dissolved in 1 l of water was added to 1 cm of nitrocellulose.Two
Spot on the strip. The nitrocellulose fragments were then transferred to a 24-well tissue culture.
Place in a culture plate and add buffer B (58 mM NaTwoHPOFour, 18mM KHTwoPOFour, 75 mM Na
Cl, 2 mM EDTA, and 3% BSA, pH 7.2) by constant shaking at 22 ° C overnight.
Incubate. After incubation, aspirate blocking medium and allow
Nitrocellulose fragments to buffer A (58 mM NaTwoHPOFour, 18mM KHTwoPOFour, 75 mM NaCl
, 2 mM EDTA, 4 mM β-mercaptoethanol, and 0.2% BSA, pH 7.2) three times
Wash. Cell extract (preferably COS cells) is 1% BSA and 150 mM
Source (105 μl of primary extract 15% of 10% BSA in buffer A and 0.75 in buffer A)
With or without 30 μl of M lactose or 30 μl of buffer A)
Including
Prepare as needed. Immobilized asialofetin with extract for 2 hours
Incubate and wash 5 times with buffer A. Then, cut the nitrocellulose
A piece was prepared using PBS (58 mM NaTwoHPOFour, 18mM KHTwoPOFour, 75 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 7.2)
Fix in 1% formalin for 1 hour to prevent loss of bound galectin. In PBS
After further washing with, the fragments were purified from rabbit anti-galectin 8, galectin 9, galecti.
10 or Galectin 10SV polyclonal serum (1: 100 dilution in PBS)
For 2 hours at 22 ° C. The fragments are then washed with PBS and
Incubated with luoxidase labeled goat anti-rabbit antibody (DAKO). 2
After incubation at 22 ° C for hours, the fragments are washed with PBS and the substrate is added.
Add. Incubate the nitrocellulose fragments until they develop color, and
Stop by washing with distilled water.
Of course, due to the degeneracy of the genetic code, one of skill in the art
The nucleic acid sequence or Figure 1, 2A-B, 3A-3B, or 4A-4B (SEQ ID NO: 1,
3, 5, or 7) has at least 95%, 96%, 97%, 98%
Or a number of nucleic acid molecules having a sequence that is 99% identical to “Galectin 8, Galectin.
Polypeptide having protein activity of chin 9, galectin 10, or galectin 10 SV
Understand immediately to code "peptide". In fact, these nucleotide sequences
This is because the degenerate variants of all encode the same polypeptide.
It will be clear to the skilled person without performing a comparative assay. Nucleus that is not a degenerate mutant
For acid molecules, the correct number of nucleic acid molecules is also Galectin 8, Galectin 9,
Polypeptide having protein activity of lectin 10 or galectin 10 SV
Understand how to load. This is because one skilled in the art will recognize that protein function (eg,
Less important for the replacement of one amphipathic amino acid by a second amphipathic amino acid)
Amino acid substitutions that either do not appear to be important or
Because they fully understand.
For example, how to make phenotypically silent amino acid substitutions.
For guidance, see Bowie, J.U., et al., "Decoding Messages in Protein Sequences."
That: Tolerance to Amino Acid Substitutions, "Science 247: 1306-1310 (1990).
You. Here the authors report that the protein is surprisingly tolerant of amino acid substitutions.
And
Vectors and host cells
The present invention also relates to a vector comprising the isolated DNA molecule of the present invention, a recombinant vector.
Cells genetically engineered with, and galectin 8, galecti by recombinant technology
Polypeptide of galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV or its flag
For the production of
The polynucleotide is a vector comprising a selectable marker for propagation in a host.
Can be combined. Generally, a plasmid vector contains a calcium phosphate precipitate.
It is introduced in such a precipitate or in a complex with a charged lipid. vector
If is a virus, the vector is imported using the appropriate packaging cell line.
It can be packaged in vitro and then transduced into host cells.
The DNA insert is compatible with a suitable promoter (eg, to name a few
DiλPL promoter, E. coli lac promoter, trp promoter, and tac promoter
Motor, SV40 early and late promoters, and retroviruses.
Irs LTR). Other suitable
Motors are known to those skilled in the art. The expression constructs further include transcription initiation, transcription termination.
Includes a site for ligation and a ribosome binding site for translation in the transcribed region
. The coding part of the transcript expressed by the construct is the polypeptide to be translated.
A stop codon (UAA,
UGA, or UAG).
As indicated, the expression vector preferably comprises at least one selectable marker.
including. Such markers include dihydro leaf for eukaryotic cell culture.
Acid reductase or neomycin resistance, and in E. coli and other bacteria
For culture, tetracycline resistance genes or ampicillin resistance genes were listed.
I can do it. Representative examples of suitable hosts include bacterial cells (eg, E. coli cells,
Streptomlyces cells, and Salmonella typhimurium cells); fungal cells (eg,
Yeast cells); insect cells (eg, Drosophila S2 cells and Spodoptera Sf9 cells)
); Animal cells (eg, CHO cells, COS cells, and Bowes black shin cells);
And plant cells, but are not limited thereto. For the above host cells
Suitable culture media and conditions are known in the art.
Among the preferred vectors for use in bacteria are pQE70, pQE60, and pQE-9.
(Available from Qiagen); pBS vector, Phasescript vector, Bluescript vector
PNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (available from Stratagene); and pt
Includes rc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (available from Pharmacia)
It is. Among preferred eukaryotic vectors are pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, and
And pSG (available from Stratagene); and pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVL
(Available from Pharmacica). Other suitable vectors will be readily apparent to one of skill in the art.
It is easy.
Introduction of the construct into host cells can be achieved by calcium phosphate transfection, DEAE
Dextran-mediated transfection, cationic lipid-mediated transfection
By electroporation, electroporation, transduction, infection or other methods
Can be done. Such methods are described in Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (
1986) in many standard laboratory manuals.
The polypeptide can be expressed in a modified form, such as a fusion protein, and
Not only secretion signals but also additional heterologous functional regions may be included. For example,
Additional amino acids, especially regions of charged amino acids, may be used in host cells during purification.
Or to improve stability and durability during subsequent operations and storage
It can be added to the N-terminus of the peptide. The peptide moiety also facilitates purification.
To the polypeptide. Such regions may be used for final preparation of the polypeptide.
Can be removed before Improve stability, especially due to secretion or excretion
Addition of the peptide moiety to the polypeptide to facilitate and purify
Is well known in the art, and is a matter of routine. Preferred fusion tongue
Proteins contain heterologous regions from immunoglobulins that are useful for solubilizing proteins.
For example, EP-A-0 464 533 (Canadian application 2045869) describes another human protein or protein.
A fusion tag comprising various portions of the constant region of an immunoglobulin molecule
Disclose protein. In many cases, the Fc portion of the fusion protein is
Pharmacokinetic characteristics, and thus, for example,
sex
(EP-A 0232 262). On the other hand, for some uses, the fusion protein
Fc portion after being expressed, detected and purified in the advantageous manner described
Desirably can be deleted. This is because the Fc portion is used in therapy and diagnostics.
If the fusion protein proves to be an interference for
If it should be used). In drug search, for example, humans such as hIL-5
Protein is a high-throughput screen for identifying hIL-5 antagonists
It has been fused with the Fc portion for the purpose of a ning assay. D. Bennett et al., Journal of Mo
lecular Recognition Vol. 8: 52-58 (1995), and K. Johanson et al., The Journal o
f See Biological Chemistry Vol.270, No.16, pp.9459-9471 (1995).
Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV
The material is ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange.
Chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography
Chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite
Chromatography and well-known methods, including lectin chromatography.
Can be recovered from recombinant cell culture and purified. Most preferably, high
High performance liquid chromatography ("HPLC") is used for purification. The present invention
Lipeptites are products of natural purification, products of chemical synthetic procedures, and prokaryotic hosts or
Are eukaryotic hosts (eg, bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insect cells, and
And mammalian cells). Recombinant
Depending on the host used in the production procedure, the polypeptide of the invention may be glycosylated.
It can be silylated or non-glycosylated. Further, the polypep of the present invention
Pide may also, in some cases, result in altered methylation of initiation, as a result of host-mediated processes.
It may include an onine residue.
Galectin 8, galectin 9, and galectin 10 polypeptides and flags
Ment
The present invention further provides an isolated galectin 8, galectin 9, galette comprising:
Provide a polypeptide of Kutin 10 or Galectin 10 SV: (1) of the cDNA
The amino acid sequence encoded by one, (2) FIG. 1, 2A-2B, 3A-3B, or 4
The amino acid sequence in A-4B (SEQ ID NOs: 2, 4, 6, or 8, respectively), or (
3) peptide, or amino acid of a polypeptide containing a part of the above polypeptide
Array.
Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV
Some amino acid sequences of the peptide significantly affect the structure or function of this protein.
It is recognized in the art that it can be modified without effect. This in the array
When such differences are intended, there are key regions of the protein that determine activity
You should remember that.
Therefore, the present invention further provides a substantially galectin 8, a galectin 9, a galectin.
Show the activity of the polypeptides of protein 10 or galectin 10 SV or are discussed below.
Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, if the protein part
Galectin 8, Galectin 9, Galectin 9 containing the SVectin protein region
Includes variants of the lectin 10 or galectin 10 SV polypeptides. like this
Variants include deletions, insertions, inversions, repeats, and type substitutions. Detailed above
As described, which amino acid changes are likely to be phenotypically silent
For further guidance, see Bowie, J.U., et al., "Understanding Messages in Protein Sequences.
Reading: Tolerance to Amino Acid Substitutions, "Science 247: 1306-1310 (1990).
Can be issued.
Therefore, the polypeptide of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8
Fragments of the polypeptide encoded by the peptide or the deposited cDNA,
A derivative or analog is characterized in that (i) one or more amino acid residues are conservative or non-conservative.
Is replaced by a conservative amino acid residue (preferably a conservative amino acid residue)
Such substituted amino acid residues are those encoded by the genetic code.
May or may not be present, or (ii) one or more amino acid residues contain a substituent.
Or (iii) the mature polypeptide increases the half-life of the polypeptide.
Fused with another compound such as a compound (eg, polyethylene glycol)
Or (iv) the additional amino acid is an IgG Fc fusion region peptide or leader.
-Or secretory sequences or mature polypeptide or proprotein sequences
It can be one that is fused to a mature polypeptide, such as the sequence used. this
Yo
Such fragments, derivatives and analogs will be readily apparent to one of skill in the art from the teachings herein.
Considered to be within range.
Of particular interest are those with another charged amino acid and neutral or negatively charged
Replacement of a charged amino acid with an amino acid. The latter has a reduced positive charge
Produce protein, galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin
Improve the characteristics of 10SV protein. Prevention of agglomeration is highly desirable. Tampa
Aggregation of proteins not only results in a loss of activity, they may also be immunogenic.
Can also be a problem when preparing pharmaceutical formulations (Pinckard et al., Clin. Exp.I.
mmunol. 2: 331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland
Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 307-377 (1993)).
As shown, a conservative that does not significantly affect protein folding or activity
Small changes in properties, such as amino acid substitutions, are preferred (see Table 1).Table 1. Conservative amino acid substitutions. Naturally, the number of amino acid substitutions made by one of skill in the art will depend on many factors,
And the following: In general, any given galectin 8, galectin 9,
About lectin 10 or galectin 10SV polypeptide or its variant
Is more than 50, 40, 30, 20, 10, 5, or 3 depending on the target.
There is no.
Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, and the like of the present invention, which are essential for function.
Amino acids in the galectin 10SV protein can be site-directed mutagenesis or
Can be identified by methods known in the art such as alanine scanning mutagenesis (
Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)). The latter step is a minute
One alanine mutation is introduced at every residue in the offspring. Important sites for ligand binding
Also determined by structural analysis such as crystallization, nuclear magnetic resonance, or photoaffinity labeling
(Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) and de Vos et al., Scienc.
e 255: 306-312 (1992)).
The polypeptides of the present invention are preferably provided in an isolated form. "Isolated
A polypeptide that has been removed from its natural environment
Is done. Thus, it is produced in a recombinant host cell and / or
Included polypeptides are considered isolated for the purposes of the present invention. Also
An "isolated polypeptide" is partially or substantially free from recombinant host cells.
Purified polypeptides are contemplated. For example, a recombinantly produced barge
Galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV
The repeptide is a one-step process described in Smith and Johnson, Gene 67: 31-40 (1988).
It can be substantially purified by the method.
The polypeptide of the present invention is a polypeptide encoded by the deposited cDNA.
About 1 to about 323 of SEQ ID NO: 2, about 1 to about 311 of SEQ ID NO: 4, and about 1 to about 3 of SEQ ID NO: 6;
317, and a polypeptide comprising about 1 to about 200 amino acids of SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 8
2, about 2 to about 323, SEQ ID NO: 4 about 2 to about 311, SEQ ID NO: 6, about 2 to about 317, and
And a polypeptide comprising about 2 to about 200 amino acids of SEQ ID NO: 8;
At least 95% identical to the polypeptide, even more preferably at least 96%, 97%
, 98%, or 99% identical, and also comprises at least 30%
Amino acids, and more preferably such having at least 50 amino acids
Including a portion of a polypeptide.
Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV
An amino acid sequence at least, eg, 95%, “identical” to the reference amino acid sequence of the peptide
Has a polypeptide sequence of galectin 8, galectin 9
, Galectin 10, or each of the reference amino acid sequences of Galectin 10 SV polypeptides
Polypeptides except that they can contain up to 5 amino acid changes for every 100 amino acids
The amino acid sequence of the amino acid sequence is intended to be identical to the reference sequence. In other words,
Obtaining a polypeptide having an amino acid sequence at least 95% identical to a reference amino acid sequence
Up to 5% of the amino acid residues in the reference sequence have been deleted or
Up to 5% total amino acid residues in the reference sequence, which can be replaced by another amino acid
Can be inserted into the reference sequence. Modification of these reference sequences
At the amino or carboxy terminal position of the amino acid sequence, or a reference sequence
Of the residues individually or within one or more contiguous groups within the reference sequence
Somewhere between the terminal positions, which can be dispersed, can occur.
In practice, any particular polypeptide can be used, for example, in FIG. 1, 2A-2B, 3A-3B, or
Or 4A-4B (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO:
8) or a deposited cDNA clone (ATCC Accession No. 97)
732, 97733, and 97732).
At least 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to
Is the Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Unix version
8, Genetics Computer Group, University Rcscarch Park, 575 Science D
rive, Madison, WI 53711) using known computer programs.
Can be determined conventionally. A particular sequence is, for example, 95% identical to a reference sequence of the invention.
Bestfit or any other sequence alignment to determine if
When using a program, the percentage identity is, of course, the total length of the reference amino acid sequence.
Over 5% of the total number of amino acid residues in the reference sequence
Parameters are set such that gaps in gender are tolerated.
The polypeptides of the present invention can be run on SDS-PAGE gels using methods well known to those of skill in the art.
Or can be used as a molecular weight marker for molecular sieve gel filtration columns.
You.
In another aspect, the present invention provides an epitope-bearing portion of a polypeptide of the present invention.
Or a peptide or polypeptide. Epitope of this polypeptide
The portion is an immunogenic or antigenic epitope described herein. "Immunogen
A "neutral epitope" is a protein that elicits an antibody response when the entire protein is the immunogen.
Defined as part of the protein. On the other hand, protein molecules to which antibodies can bind
Region may be defined as an "antigenic epitope." Protein immunogenic epithelium
The number of loops is generally less than the number of antigenic epitopes. For example, Geysen et al.
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1983).
A peptide or polypeptide bearing an antigenic epitope (ie, an antibody
(Including regions of protein molecules that can bind).
Relatively short synthetic peptide mimicking part reacts with partially mimicked protein
It is well known in the art that antisera can be routinely induced. For example, Sutcli
ffe, J.G., Shinnick, T.M., Green, N.A. And Learner, R.A. (1983) `` Protein
Antibodies Reacting with Predetermined Sites on Quality, Science 219: 660-666 (1983).
That. Peptides that can induce protein-reactive sera are the primary proteins
Frequently presented in columns and can be characterized by a simple set of chemical laws,
And immunodominant regions of intact proteins (ie, immunogenic epitopes)
Nor the amino or carboxyl terminus.
The antigenic epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention are therefore
Elicit antibodies, including monoclonal antibodies, that specifically bind to a polypeptide of the invention
Useful for See, for example, 777 in Wilson et al., Cell 37: 767-778 (1984).
When.
The antigenic epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention are preferably
At least 7, more preferably within the amino acid sequence of the polypeptide of the invention
It comprises a sequence of at least 9, and most preferably between about 15 and about 30 amino acids.
Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV specific anti
Non-limiting antigenic polypeptides or peptides that can be used to produce the body
Examples include, respectively: about 55-101 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2);
137-162, 180-193, 216-266, 62-102, 226 in FIGS. 2A-2B (SEQ ID NO: 4)
259, 197-308, 25-77, 84-105, 129-140 in FIGS. 3A-3B (SEQ ID NO: 6).
, 156-183, 195-215, and 241-257, and FIGS. 4A-4B (SEQ ID NO: 8).
Containing amino acid residues from 25-77, 84-105, 129-140, and 156-183.
Ripeptide. As shown above, the present inventors have determined that the polypeptide fragment
Of galectin 8, galectin 9, galectin 0, or galectin 10 SV
It was determined to be an antigenic region of the protein.
The epitope-bearing peptide and the epitope-bearing polypeptide of the present invention also include:
It can be produced by any conventional means. Houghten, R.A. (1985) General mothod fo
r the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: specifici
ty of antigen-antibody interaction at the level of individual amino acid
s. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82: 5131-5135. This "co-replicating peptide synthesis (Simu
ltaneous Multiple Peptide Synthesis) (SMPS) process.
(1986) in U.S. Pat. No. 4,631,211.
As those skilled in the art will appreciate, the galectins 8, 9 and 9 of the present invention
10, or galectin 10SV polypeptide and its epitope-bearing flag as described above.
Fragment can bind to a portion of an immunoglobulin (IgG) constant domain,
This results in a polypeptide. These fusion proteins facilitate purification and
Shows increased half-life in vivo. This is, for example, the first of the human CD4-polypeptides.
Two domains and the constant region of a heavy or light chain of a mammalian immunoglobulin.
Chimeric proteins composed of various domains have been shown (EPA394,827;
Traunecker et al., Nature 33184-86 (1988)). Disulfide bond with IgG moiety
Fusion proteins with an immer structure are also useful in binding and neutralizing other molecules.
, Monomeric galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin 10
It may be more efficient than SV protein alone or protein fragment (
Fountoulakis et al. Biochem. 270: 3958-3964 (1995)).
Diagnosis and prognosis
Certain diseases (cancer, autoimmune diseases, inflammatory diseases, asthma, and allergic diseases)
Certain tissues in a mammal having a (diseased) disease are identified in the corresponding "standard" mammal (
That is, when compared to a mammal of the same species without the disease),
(Increase or decrease) levels of galectin 8, galectin 9, galectin 10
Or galectin 10 SV protein and galectin 8, galectin 9, galectin
It expresses mRNA encoding the protein of Kuching 10 or Galectin 10 SV. Sa
In addition, altered levels of galectin 8, galectin 9, galectin 10, or
Lectin 10SV protein is compared to serum from a disease-free mammal
When a specific body fluid (eg, serum, blood, etc.) from a mammal of the same species
Plasma, urine, and cerebrospinal fluid). Therefore, the present invention is useful during diagnosis.
To provide a useful diagnostic method. This is due to galectin 8 in mammalian cells or body fluids.
Encoding the galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV protein
Assaying the expression level of a gene, and comparing the gene expression level with a standard
Of Genetic Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV
Comparing gene expression levels with offspring, thereby increasing gene expression above normal
An increase in the level is indicative of the disease.
If the diagnosis has already been made according to the usual methods, the present invention may be used as a prognostic indicator.
, Galectin 9, galectin 9, and galectin modified thereby
Patients with gene expression of 10 or galectin 10SV express the gene at normal levels.
Experience worse clinical outcomes as compared to the manifesting patient.
"Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV
Assaying the expression level of the gene encoding the protein "
Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or in a physical sample
Galectin 10 SV protein level or Galectin 8, Galectin 9, Galectin
MRNA levels encoding the proteins for Tin 10 or Galectin 10 SV
(E.g., measuring or evaluating absolute protein or mRNA levels)
Or relative (eg, galectin in a second biological sample)
8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV protein level
Or qualitatively or quantitatively (by comparing to mRNA levels)
It is intended to be measured and evaluated.
Preferably, galectin 8, galectin 9, in the first biological sample
Galectin 10 or galectin 10 SV protein level or mRNA level
Is a standard galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin
It is measured or evaluated relative to the protein level of 10 SV or mRNA level.
Standards are taken from a second biological sample obtained from an individual without cancer.
You. As will be understood in the art, once the standard galectin 8, galecti
Protein level of galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV, or mRNA
Once the level is known, it can be used repeatedly as a standard for comparison.
Depending on the "biological sample", an individual, cell line, tissue culture,
Proteins such as Tin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV
Or any biological sample obtained from other sources, including mRNA.
As shown, the biological sample contained secreted mature galectin 8, galectin.
Fluid of mammals containing protein 9, galectin 10, or galectin 10 SV protein
(Eg, serum, plasma, urine, synovial fluid, and sputum), and ovaries, prostate, heart
, Placenta, pancreas, liver, spleen, lung, breast, and umbilical cord tissue.
The present invention relates to mammalian diseases (eg, cancer, autoimmune diseases, inflammatory diseases, asthma).
, And allergic diseases). In particular, the present invention provides
Lower types of cancer (melanoma, renal astrocytoma, Hodgkin's disease, breast cancer, ovarian cancer, previous
Prostate cancer, bone cancer, liver cancer, lung cancer, pancreatic cancer, and spleen cancer)
Useful. Preferred mammals include monkeys, tailless monkeys (ape),
Cats, dogs, cows, pigs, horses, rabbits, and humans. Especially preferred
It is a human.
Total cellular RNA was obtained from Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987)
Single-step guanidine-thiocyanate-phenol-chloropho
It can be isolated from a biological sample using the Lumm method. Then galectin 8,
Encodes a galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV protein
mRNA levels are assayed using any suitable method. These are Noza
Blot analysis (Harada et al., Cell 63: 303-312 (1990), S1 nuclease mapping
(Fijita et al., Cell 49: 357-367 (1987)), polymerase chain reaction (PCR), poly
Reverse transcription (RT-PCR) in combination with the merase chain reaction (Makino et al., Technique 2: 295-3
01 (1990), including reverse transcription (RT-LCR) combined with ligase chain reaction
.
Galectin 8, galectin 9, galectin 10 or galectin in a biological sample
Assaying protein levels of lectin 10SV involves antibody-based technology
Can be done. For example, galectin 8, galectin 9, galectin 10, or
Or galectin 10SV protein expression was studied by classical immunohistological methods.
(Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); Jalkanen, M. et al.
Et al., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (1987)).
Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV
Other antibody-based methods useful for detecting gene expression in proteins are immunoassays (eg,
For example, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) and radioimmunoassays (RIA)
Including.
Suitable labels are known in the art, and enzyme labels (eg, Glucose oxid
ase) radioisotope (for example, iodine (125I,121I), carbon (14C), sulfur (35S
), Tritium (ThreeH), indium (112In), and technetium (99mTc)),
And fluorescent labels (e.g., fluorescein and rhodamine), and biotin
including.
Remedies
The following discussion relates specifically to human patients, the teaching of which is Galetatin 8, Galecti
Applicable to any animal that expresses galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV
It is.
As described above, galectin 8, galectin 9, galectin 10, and galectin
10SV shares significant homology with other galectins. Galectin 1 is a T cell
And induces apoptosis of T cell leukemia cell lines. Therefore, galectin 8,
Galectin 9, Galectin 10, and Galectin 10SV have growth-regulating activity,
Regulates nodal activity, cell-cell and cell-substrate interactions, and apoptosis
It is considered by the present inventors to be active in that matter.
Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, which regulates cell growth activity, or
The ability of galectin 10SV is therapeutic for the treatment of such clinical signs of cell dysregulation.
Can help. The disorder to be treated is an autoimmune disease, cancer (preferably melanoma,
Kidney cancer, astrocytoma, Hodgkin's disease), inflammatory diseases, wound healing, arteriosclerosis, other heart
Organ diseases, microbial infections (viruses, fungi, bacteria, and parasites), asthma, and
Including but not limited to allergic diseases.
By Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, and Galectin 10 SV
Taking into account the activity to be modulated, the level in the individual compared to a standard or "normal" level
Substantially changed (increased or decreased) levels of Galectin 8, Galectin 9,
Expression of galectin 10 or galectin 10 SV produces the pathological condition as described above.
It is readily apparent that Galectin 8, Galectin 9, Galecti of the present invention
10 or galectin 10 SV protein regulates its regulation in its target cells.
It will be appreciated by those skilled in the art that they exert such activities. Therefore, in the individual
Marker of Galectin 8, Galectin 9, Galetatin 10, or Galectin 10 SV activity
Conditions caused by a decrease in sub- or normal levels include galectin 8
Of galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV
May be treated by the administration of an agonist. Thus, the present invention provides an increased level
The activity of Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV
Further provided are methods of treating an individual in need. This method is used for such individuals
Of galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV in
Galectin 8, an isolated galectin 8 of the invention to increase the level of activity
9, Galectin 10, or Galectin 10 SV polypeptide or agonis thereof
Administering to such an individual a pharmaceutical composition comprising the same.
A still further aspect of the invention relates to galectin 8, galectin 9, galectin in the body.
Treating an individual in need of reduced levels of activity of galactin 10 or galectin 10 SV
The method comprises a therapeutically effective amount of galectin 8, galectin 9, galectin.
A composition comprising an antagonist of galactin 10 or galectin 10 SV is administered to such an individual.
Administration. Preferred antagonists for use in the present invention are galecti
Antibody specific for Galectin 9, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV
You.
Mode of administration
Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galecti in an individual
Caused by a decrease in normal or normal levels of 10SV activity
If the condition is Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV
It is understood that treatment can be performed by administration of a protein or an agonist thereof.
. Therefore, the present invention further provides galectin 8, galectin 9, galectin 10, and
Provides a method to treat individuals in need of increased levels of galectin 10 SV activity
Offer. The method comprises treating galectin 8, galectin 9, gallectin 9 in such individuals.
An effective amount of a book effective to increase the activity of lectin 10 or galectin 10 SV
The isolated galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galecti of the invention
10SV polypeptides (particularly the mature forms of galectin 8, galectin 9, galectin 9)
A pharmaceutical composition comprising (tin 10, or galectin 10 SV) is administered to such an individual.
Including the step of performing
As a general proposal, Galectin 8, Galecti administered parenterally per dose
The total pharmaceutically effective amount of the polypeptide of protein 9, galectin 10, or galectin 10 SV is
The patient's body weight ranges from about 1 μg / kg / day to 10 mg / kg / day.
It is subject to therapeutic discretion. More preferably, the dose is at least 0.01
mg / kg / day, and most preferably about 0.01-1 mg / kg / day for humans with hormones
It is. Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10 when given continuously
Or galectin 10SV polypeptide is typically from about 1 μg / kg / hr to about 1 μg / kg / hr.
One to four injections per day at a dose rate of 50 μg / kg / hr, or eg mini
It is administered by either continuous subcutaneous infusion using a pump. Intravenous bag solution
Can also be used.
Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV of the present invention
Pharmaceutical compositions containing the polypeptides of the invention can be administered orally, rectally, parenterally,
mally), vaginal, intraperitoneal, topical (powder, ointment, eye drops, or transdermal patch)
), Buccally, or as an oral or intranasal spray. "medicine
A `` chemically acceptable carrier '' refers to any type of non-toxic solid, semi-solid, or liquid
By body excipients, diluents, encapsulating materials, or formulation aids. In this specification
The term "parenteral" as used in is used for intravenous, intramuscular, intraperitoneal, substernal, subcutaneous, and
And administration modes including intra-articular injection and infusion.
Chromosome assay
The nucleic acid molecules of the invention are also useful for chromosome identification. The sequence contains individual human stains.
Can be specifically targeted to and hybridize with a specific location on a chromosome
. The mapping of DNA to chromosomes according to the present invention allows these sequences to be linked to disease.
This is an important first step in correlating genes to
In certain preferred embodiments in this regard, the cDs disclosed herein
NA is the type of galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV.
Used to clone the genomic DNA of the protein gene. This is a seed
Using various well-known technologies and libraries (which are generally commercially available)
Can be achieved. The genomic DNA is then used for in situ chromosome mapping.
, Using well-known techniques for this purpose.
Further, in some cases, the sequence is derived from the cDNA by PCR primers (preferably
5 to 25 bp) can be mapped to the chromosome. This gene
Analysis of the 3 'untranslated region of genomic DNA
Quick selection of primers that do not span sons and thus do not complicate the amplification process
Used to These primers then contain individual human chromosomes.
Used for PCR screening of somatic cell hybrids.
Fluorescence in situ hybridization of cDNA clones to metaphase chromosomal spreads
("FISH") can be used to provide accurate chromosomal location in one step
You. This technique can be used with probes from cDNA as short as 50 or 60 bp.
You. For a review of this technology, see Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Bass.
See ic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).
Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical
The location can be correlated with genetic map data. Such data, for example,
Johns Hopkins University, available online through Welch Medical Library
V. Possible McKusick, found in Mendelian Inheritance In Man.
Then the relationship between the gene and the disease mapped to the same chromosomal region is
, And linkage analysis (simultaneous inheritance of physically adjacent genes).
Next, the differences in the cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals were determined.
Need to be determined. The mutation is in some or all affected individuals
If observed but not in any normal individual, the mutation is
It is likely to be a cause.
Having generally described the invention, the invention will be described with reference to the following examples.
Therefore, it is more easily understood. These are provided for illustration,
Not intended to be limiting.
Example
Example 1 Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, and E. coli
Expression and purification of galectin 10SV
DNA sequence encoding galectin 9 protein in the deposited cDNA clone
, The amino acid terminal sequence of the galectin 9 protein, and the 3 '
Amplification was performed using PCR oligonucleotide primers specific to the vector sequence. K
Additional nucleotides containing restriction sites to facilitate cloning are added 5 ′ and
And 3 'sequences.
Encodes galectin 8 or galectin 10 SV protein in the deposited cDNA
The DNA sequence to be converted is determined by the amino acid sequence of the galectin 8 or galectin 10 SV protein.
A nucleotide sequence encoding the terminal sequence, and a vector sequence 3 ′ to the gene.
Amplification was performed using PCR oligonucleotide primers specific to the row. Clonin
Additional nucleotides containing restriction sites to facilitate logging are added to the 5 'and 3'
Added to the sequence.
The cDNA sequence encoding galectin 10 protein is
3 'vector relative to the nucleotide sequence encoding the amino terminal sequence and the gene
Human endometrial membrane using PCR oligonucleotide primers specific to the
Amplify from either a tumor or human fetal heart cDNA library. Cloni
5 'and 3' sequences containing additional restriction enzyme sites to facilitate
To be added.
The 5 'galectin 8 oligonucleotide primer has the sequence 5' cgcccATGg CCTAT
GTCCCCGCACCG 3 ′ (SEQ ID NO: 41), which is an underlined NcoI restriction site and
And nucleotides 56- of the galectin 8 protein coding sequence of FIG.
Including 72.
The 3 'galectin 8 primer has the sequence 5' cgcAAG CTT TTAGATCTGGACATAGGAC 3 '
(SEQ ID NO: 42), which is underlined by the HindIII restriction site, followed by FIG.
SEQ ID NO: 1) a nucleotide complementary to positions 1005-1023 of the galectin 8 protein coding sequence.
Contains nucleotides.
The 5 'galectin 9 oligonucleotide primer has the sequence 5' cgcccATGg CCTTC
AGCGGTTCCCAG 3 '(SEQ ID NO: 43), which is an underlined NcoI restriction site and
And the nucleotides of the galectin 9 protein coding sequence of FIGS.
Including 20-36.
The 3 'galectin 9 primer has the sequence 5' cgcAAG CTT CAGGGTTGGAAAGGCTG 3 '(
SEQ ID NO: 44), which is underlined HindIII restriction site, followed by FIGS.
Complementary to positions 1029-1045 of the galectin 9 protein coding sequence of SEQ ID NO: 3)
Contains nucleotides.
The 5 'galectin 10 and galectin 10 SV oligonucleotide primers were
Row 5 'cgcCCATGc TGTTGTCCTTAAACAAC 3 '(SEQ ID NO: 45), which is underlined
SphI restriction site and the galectin 10 protein code of FIGS. 3A-3B (SEQ ID NO: 5)
Sequence nucleotides 122-138.
The 3 'galectin 10 primer has the sequence 5' cgcCTG CAG CACAGAAGCCATTCTG 3 '(distribution
Column number 46), which is underlined PstI restriction site, followed by FIGS.
No. 5) Nucleic acid complementary to positions 1105-1120 of the galectin 10 protein coding sequence
Including otide.
The 3 'galectin 10SV primer has the sequence 5' CGCCTGCAGCTATGCAACTTTATAAAATATTC
C3 '(SEQ ID NO: 47), which is an underlined PstI restriction site, followed by FIGS.
(SEQ ID NO: 7) complementary to the 3 'end of the protein coding sequence of galectin 10SV
Contains nucleotides.
Restriction sites were determined using the bacterial expression vector pQE60 (galectins 8 and 9) or pQE6 (galectins 8 and 9).
Conveniently for the restriction enzyme sites of galectin 10), in these examples the bacteria
Used for expression (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 913).
11). pQE60 is resistant to ampicillin antibiotics ("Ampr)) And code
Origin of replication ("ori"), IPTG-inducible promoter, ribosome binding site ("RBS
"), A 6-His tag, and a restriction enzyme site.
Amplified galectin 8, 9, or 10 SV DNA and vector pQE60 or pQE
6 together with NcoI and HindIII (for galectins 8 and 9) or SphI and
Digest with pstI (for galectin 10) and then ligate the digested DNA together
I do. Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV
Insertion of the protein DNA into the restricted pQE60 or pQE6 vector was performed using galectin 8,
Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV
Is operably linked to and downstream of the vector's IPTG-inducible promoter.
Sea urchin and galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin 10
Positioned in-frame at the starting AUG, which is properly positioned for SV protein translation
I do.
Transform the ligation mixture into competent E. coli cells using standard procedures
I do. Such a procedure is described in Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUA.
L, 2nd edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
(1989). Multiple copies of plasmid pREP4 (this is the lac
Expression and Kanamycin resistance ("Kanr))
E. coli strain M15 / rep4 is used in performing the examples described herein. this
Strain (this is Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10
QI is the only of many strains that are suitable for expressing proteins)
Commercially available from agen.
Transformants were grown on LB plates in the presence of ampicillin and kanamycin.
Identify by their ability to breed. Isolate plasmid DNA from resistant colonies
,
The identity of the cloned DNA is then confirmed by restriction analysis.
Clones containing the desired construct were ligated with ampicillin (100 μg / ml) and kanamycin.
Overnight ("O / N") in liquid culture in LB medium supplemented with both (25 μg / ml)
Breed.
Large scale cultures were inoculated at a dilution of about 1: 100 to 1: 250 using the O / N culture. Replace cells with 0
Grow to an absorbance at 600 nm ("OD600") of between 0.4 and 0.6. Next,
Add isopropyl-B-D-thiogalactopyranoside ("IPTG") to a final concentration of 1 mM
And inactivate the lacI repressor to increase the lac repressor sensitivity
Induces transcription from the promoter. Continue incubation of cells for another 3-4 hours.
To The cells are then harvested by standard methods by centrifugation and disrupted.
Break. The inclusion bodies are purified from the disrupted cells using routine harvest techniques and
The protein is solubilized from the inclusion bodies into 8M urea. 8 containing solubilized proteins
M urea solution is passed through a PD-10 column in 2x phosphate buffered saline ("PBS")
, Thereby removing urea, replacing the buffer, and refolding the protein
No. The protein is purified by an additional step of chromatography and
Removes xin. It is then sterilized by filtration. Filter-sterilized protein preparation
Store in 2 × PBS at a concentration of 95 μ / ml.
Example 2: Galectin 8, Galectin 9, Galle in paculovirus expression system
Cloning and expression of proteins for Kuching 10 and Galectin 10 SV
Full-length galectin 8, galectin 9, galectin in the deposited clone
10 or the galectin 10SV protein-encoding cDNA sequence
Augmentation using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' sequences
Width:
The 5 'galectin 8 oligonucleotide primer is underlined with the SmaI restriction site.
And the nucleotide sequence of the galectin 8 protein coding sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1)
Sequence 5 'cgc, includingCCCGGG With GCCTATGTCCCCGCAC 3 '(SEQ ID NO: 48)
I do.
The 3 'galectin 8 primer was an underlined Asp718 restriction site followed by FIG.
A nucleotide complementary to positions 1005 to 1023 of the galectin 8 protein coding sequence of SEQ ID NO: 1)
Sequence 5 'cgc, including nucleotidesGGT ACC TTAGATCTGG ACATAGGAC 3 '(SEQ ID NO: 49
).
The 5 'galectin 9 oligonucleotide primer is underlined with the SmaI restriction site.
2A-2B (SEQ ID NO: 3) Galectin 9 protein coding sequence nucleic acid
Sequence 5 'cgc, including Otides 19-36CCCGGG GCCTTCAGCGGTTCCCAG 3 '(SEQ ID NO: 50
).
The 3 ′ galectin 9 primer was underlined with the Asp718 restriction site, followed by FIGS. 2A-2B.
(SEQ ID NO: 3) at positions 1029 to 1045 of the galectin 9 protein coding sequence.
Sequence 5 'cgc, including complementary nucleotidesGGT ACC CAGGGTTGG AAAGGCTG 3 '(sequence
No. 51).
5 'Galectin 10 oligonucleotide primers are underlined with SmaI restriction site
3A-3B (SEQ ID NO: 5) Galectin 10 protein coding sequence nucleic acid
Sequence 5 'cgc, including otides 124-142CCCGGG TTGTCCTTAAACAACCTAC 3 '(SEQ ID NO:
52).
The 3 'galectin 10 primer has an underlined Asp718 restriction site, followed by FIGS.
At positions 1105-1120 of the galectin 10 protein coding sequence of the sequence B (SEQ ID NO: 5)
Sequence 5 'cgc containing complementary nucleotidesGGT ACC CACAGAAGCCATTCTG 3 '(sequence
No. 53).
The 3 'galectin 10 SV primer was underlined with the Asp718 restriction site, followed by Figure 4A-
At the 3 'end of the protein coding sequence of galectin 10SV of the sequence 4B (SEQ ID NO: 7)
Sequence 5 'CGC containing complementary nucleotidesGGTACC CTATGCAACTTTATAAAATATTCC 3 '
(SEQ ID NO: 54).
Effective signals for initiating translation in eukaryotic cells are described by Kozak, M., J. Mol. Bio.
l. 196: 947-9: 50 (1987).
It is arranged in a short cut.
The amplified fragment was purified using a commercially available kit (“Geneclean” BIO 101 Inc., La.
(Jolla, Ca.) using a 1% agarose gel. Next,
The digest is digested with XbaII and purified again on a 1% agarose gel. This file
The fragment is designated herein as F2.
Using the vector pA2-GP, Summers et al., A MANUAL OF METHODS FOR BACULOVIRUS
VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PROCEDURES, Texas Agricultural Experime
ntal Station Bulletin No. Using the standard method described in 1555 (1987),
Protein of Kuching 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV
It is expressed in the baculovirus expression system. The expression vector is Autographa calif
ornica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) strong polyhedrin promoter, it
Followed by convenient restriction sites. AcMNPV gp67 signal peptide (N-terminal
(Including thionine) is located just upstream of the BamHI site. Simian virus 4
The polyadenylation site at 0 ("SV40") is used for efficient polyadenylation.
You. For easy selection of recombinant viruses, β-galactosidase remains from E. coli
The gene is inserted in the same direction as the polyhedrin promoter and the polyhedrin gene
Followed by a polyadenylation signal. Polyhedrin sequence is compared to wild-type viral DNA.
Flanked by viral sequences for cell-mediated homologous recombination of
Produce a viable virus that expresses the modified polynucleotide.
As will be readily appreciated by those skilled in the art, the construction must be suitable for transcription, translation, transport, etc.
Positioned signals (eg, AUG and signal pairs in frame if necessary)
Many other baculovirus vectors (eg, pAc373,
pVL941 and pAcIM1) can be used instead of pA2-GP. Vector like this
Are described, inter alia, in Luckow et al., Virology, 170: 31-39.
Using routine procedures known in the art, the plasmid was converted to the restriction enzymes SmaI and As
Digest with p718 and then dephosphorylate using bovine intestinal phosphatase. Then
1% DNA using a commercially available kit ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca)
Isolate from agarose gel. This vector DNA is designated herein as "V2".
I do.
Fragment F2 and dephosphorylated plasmid V2 were ligated together with T4 DNA ligase.
Tie. E. coli HB101 cells are transformed with the ligation mixture and plated on culture plates.
Sow. Digest DNA from individual colonies using XbaI, then run on gel electrophoresis
Therefore, by analyzing the digestion products, human galectin 8, galectin 9,
Identify bacteria containing plasmids containing lectin 10 or galectin 10 SV gene
I do. The sequence of the cloned fragment is confirmed by DNA sequencing. This
Rasmids are designated herein as pBacgalectin8, 9, 10, or 10 SV.
5 μg of the plasmid pBacgalectin 8, 9, 10, or 10 SV was transferred to Felgner et al., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417 (1987)
Using 1.0 μg of commercially available linearized baculovirus DNA (“BaculoGoldTM bacul
ovirus DNA ", Pharmingen, San Diego, CA.)
You. 1 μg BaculoGoldTMViral DNA and 5 μg of plasmid pBacgalectin8,
9, 10, or 10 SV was added to 50 μl of serum-free Grace's medium (Life Technologies Inc., G.
aithersburg, MD) in a sterile well of a microtiter plate containing
. Then add 10 μl Lipofectin and 90 μl Grace's medium and mix.
And incubate for 15 minutes at room temperature. Then, the transfection
Solution mixture in 35 mm tissue culture plates with 1 ml serum-free Grace's medium
Drop to the Sf9 insect cells (ATCC CRL 1711). The plate is then placed at 27 ° C. for 5
Incubate for hours. After 5 hours, remove the transfection solution from the plate
Remove and add 1 ml Grace's insect medium supplemented with 10% fetal calf serum
. Return the plate to the incubator and continue the culture at 27 ° C for 4 days.
After 4 days, the supernatant was collected and described in Summers and Smith (cited above).
Perform plaque assay as described. Gal expression produces blue-stained plaques
To allow for easy identification and isolation of clones, use "Blue Gal" (Life Tec
agarose gel with hnologies Inc., Gaithersburg) is used. (This Thailand
A detailed description of the “plaque assay” is also available from Life Technologies Inc., Gait
Insect cell culture and baculovirology user guide distributed in hersburg
(Also found in pages 9-10).
Four days after serial dilution, virus is added to the cells. Proper incubation
Later, the plaque stained blue is picked up with the tip of an Eppendorf pipette. Then
Agar containing recombinant virus, eppendorf containing 200 μl Grace's medium
Resuspend in tube. Agar is removed by brief centrifugation and recombined
Eba
Infection of Sf9 cells seeded in 35 mm dishes with supernatant containing culovirus
Used for Four days later, the supernatants of these culture dishes were collected and then
Is stored at 4 ° C. Clones containing properly inserted hESSB I, II, and III
, Identified by DNA analysis including restriction mapping and sequencing. this
, V-galectin 8, 9, 10, or 10 SV herein.
Sf9 cells are grown in Grace's medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS. Cells
At a multiplicity of infection ("MOI") of about 2 (about 1 to about 3), the recombinant baculovirus V-galec
Infect with tin 8, 9, 10, or 10 SV. After 6 hours, the medium is removed and
SF900 II medium without onin and cysteine (Life Technologies Inc., Gait
(available from hersburg). 42 hours later, 5 μCi35S-methionine
And 5 μCi35Add S-cysteine (available from Amersham). cell
For an additional 16 hours, then collect the cells by centrifugation, lyse
And labeled proteins by SDS-PAGE and autoradiography
Visualize.
Example 3: Cloning and expression in mammalian cells
In a mammalian cell, galectin 8, galectin 9, galectin 10, or
Galectin 10SV Better protein used for transient expression of protein sequence
Most should have an SV40 origin of replication. This means that viral DNA synthesis
High copy in cells that express the T antigen required for initiation of
Allows replication of a number of vectors. Any other mammalian cell line may also serve this purpose.
Available to
A typical mammalian expression vector is a promoter element (an mRNA transcription opener).
Mediating initiation), protein coding sequences, and termination of transcription and transcription of transcripts.
Contains signals required for liadenylation. A further element is Enhan
Kozak and intervening sequences flanked by donors, donors, and RNA splices
Acceptor sites for Thing. Very effective transcription from SV40
Early and late promoters, retroviruses (eg, RSV, HTLVI, HIVI)
Long-term repeat (LTR) and early promotion of cytomegalovirus (CMV)
Can be achieved with However, cellular signals can also be used (eg, human
Kuching promoter). Suitable expression vectors for use in the practice of the present invention
Are, for example, pSVL and pMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC
37152), pSV2dhfr (ATCC 37146), and pBC12MI (ATCC 67109).
Reactor. Mammalian host cells that can be used include human Hela, 283, H
9 and Jurkat cells, mouse NIH3T3 and C127 cells, Cosl, Cos7 and CVl,
Licamid monkey cells, quail QCl-3 cells, mouse L cells, and Chinese honey
Muster ovary cells.
Alternatively, the gene is transferred to a stable cell line containing the gene, which is integrated into the chromosome.
Can be expressed in Selectable markers (eg, dhfr, gpt, neomycin, high
Glomycin) Which co-transfection identifies transfected cells
And allows for isolation.
Transfected genes can also be amplified to encode large amounts of encoded protein.
May be expressed. DHFR (dihydrofolate reductase) contains hundreds of genes of interest
Or a marker useful for developing cell lines with thousands of copies. Another
A useful selectable marker for is the enzyme glutamine synthase (GS) (Murphy et al.,
Biochem J. 2: 27: 277-279 (1991); Bebbington et al., Bio / Technology 10: 169-175 (19
92)). Using these markers, mammalian cells can be grown in selective media.
And select the cells with the highest resistance. These cell lines integrate into chromosomes.
Contains the amplified gene (s) to be incorporated. Chinese hamster ovary
(CHO) cells are often used for the production of proteins.
The expression vectors pC1 and pC4 contain the strong promoter of Rous sarcoma virus (LT
R) (Cullen et al., Molecular and Cellular Biolugy, 438-4470 (March 1985))
And fragments of the CMV-enhancer (Boshart et al., Cell 41: 521-530 (1985))
)including. Multiple cloning sites (eg, restriction sites BamHI, XbaI,
And Asp718) facilitate cloning of the gene of interest. Vector
In addition, the 3 'intron, polyadenylation, and
And termination signals.
Example 3 (a): Cloning and expression in COS cells
The expression plasmid pgalectin8, 9, 10, or 10 SV was replaced with galectin 8, galectin 9
CDNA encoding galectin 10, or galectin 10SV, expression vector pcDNAI
/ Amp (Invitrogen), available from InC.).
To make.
The expression vector pcDNAI / amp is as follows: (1) In E. coli and other prokaryotic cells
E. coli origin of replication effective for growth; (2) selection of plasmid-containing prokaryotic cells
Ampicillin resistance gene for (3) SV40 for growth in eukaryotic cells
(4) CMV promoter, polylinker, SV40 intron; and c
DNA is conveniently placed under expression control of the CMV promoter, and
Can act on SV40 intron and polyadenylation signal depending on restriction sites
And a polyadenylation signal arranged to be operably linked.
Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV
DNA fragment encoding the protein and H fused in-frame to its 3 'end
The A tag is cloned into the polylinker region of the vector, resulting in a recombinant protein.
Protein expression is driven by the CMV promoter. The HA tag is described in Wilson et al., Cell 37.
: From influenza hemagglutinin protein described by 767-778 (1984)
Corresponding to the epitope. The fusion of the HA tag to the target protein
Enables simple detection of recombinant proteins using antibodies that recognize them.
The plasmid construction strategy is as follows. Garage of deposited clones
Cutin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV cDNA
8, Galectin 9, Galectin 10, or Galecti in E. coli
Almost the same as described for the construction of an expression vector for expression of 10SV
As described above, amplification is carried out using primers containing convenient restriction sites. Expressed moth
Detection and purification of lectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV
And, for ease of characterization, one of the primers is as described above.
Contains a hemagglutinin tag ("HA tag").
Suitable primers used in this example include: 5 'Galecti
Primer 8 is the underlined SmaI restriction enzyme site, followed by FIG. 1 (SEQ ID NO: 1)
of
Sequence 5 'cgc, comprising nucleotide sequences 52-67CCC GGG gcc atc ATGGCCTATGTCCCC
G3 '(SEQ ID NO: 55).
The 3 'galectin 8 primer was linked to the Asp718 restriction enzyme site followed by FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
) A nucleotide complementary to nucleotides 1005 to 1023 of the galectin 8 coding sequence
Sequence 5 'cgc, including tideGGT ACC Has TTAGATCTGGACATAGGAC 3 '(SEQ ID NO: 56)
I do.
The 5 'galectin 9 primer has an underlined SmaI restriction enzyme site, followed by FIGS.
Sequence 5 'cgc comprising the nucleotide sequence of bases 16 to 32 of 2B (SEQ ID NO: 3)CCC GGG
gcc atc ATGGCCTTCAGCGGTTC 3 '(SEQ ID NO: 57).
3 'Galectin 9 primer contains an Asp718 restriction enzyme site followed by a stop codon
Nucleotides 1029-10 of the galectin 9 coding sequence shown in Figures 2A-2B (SEQ ID NO: 3).
Sequence 5 'cgc, containing nucleotides complementary to 45GGT ACC CAGGGTTGGAAAGGCTG 3 '
(SEQ ID NO: 58).
The 5 'galectin 10 and 10 SV primers are underlined with the SmaI restriction enzyme site, followed by
5 'cgc comprising the nucleotide sequence 118-135 of FIGS. 3A-3B (SEQ ID NO: 5).C CC GGG
gcc atc ATGATGTTGTCCTTAAAC 3 '(SEQ ID NO: 59).
The 3 'galectin 10 primer is an Asp718 restriction enzyme site followed by FIGS. 3A-3B (SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 5'c comprising nucleotides complementary to nucleotides 1105-1120 shown in No. 5)
gcGGT ACC CACAGAAGCCATTCTG 3 '(SEQ ID NO: 60).
The 3 'galectin 10SV primer was linked to the Asp718 restriction enzyme site, followed by Figures 4A-4B (sequence
No. 7) contains a nucleotide complementary to the 3 ′ end of the galectin 10SV coding sequence.
No, sequence 5 'CCCGGTACCCTATGCAACTTTATAAAATATTCC 3 '(SEQ ID NO: 54).
Elimination of PCR amplified DNA fragment and vector pcDNAI / Amp with HindIII and XhoI
And then ligated. The ligation mixture was transferred to E. coli strain SURE (Stratagene Cloning Syst.
ems, available from 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037)
And transformants are then incubated to allow ampicillin resistance.
Plating on ampicillin medium plates to allow growth of sexual colonies
.
Plasmid DNA was isolated from the resistant colonies and treated with Galectin 8, Galectin 9, Galectin 9.
Restriction analysis for the presence of the Kuching 10 or Galectin 10 SV coding fragment
Or by gel size fractionation.
Of recombinant galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV
For expression, COS cells can be transformed, for example, using Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORAT.
ORY MANUAL, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1
989), using DEAE-DEXTRAN as described above,
Sfect. Galectin 8, Galectin 9, Galecti by vector
And incubated under conditions for expression of Galectin 10 SV.
Galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV HA fusion
Protein expression can be determined by, for example, Harlow et al., ANITIBODIES: A LABORATORY MANUAL,
Second Edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York
(1988) by radiolabeling and immunoprecipitation using the method described in (1988). This
Two days after transfection, cells are35S-Sistay
By incubating for 8 hours in a medium containing glucose. Cells and
The medium is harvested and the cells are washed and described in Wilson et al. (Cited above).
Surfactant-containing RIPA buffer as indicated: 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SD
Dissolve in S, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM TRIS, pH 7.5. Protein, HA special
Precipitate from cell lysate and culture medium using a different monoclonal antibody. Next
The precipitated proteins were analyzed by SDS-PAGE gel and autoradiography.
And analyze. Expression products of the expected size were observed in the cell lysate,
Is not observed in the negative control.
Example 3 (b): Cloning and expression in CHO cells
The vector pC1 is transformed into galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin.
Used for protein expression of Tin 10SV. Plasmid pC1 is
It is a derivative of SV2-dhfr [ATCC accession number 37146]. Both plasmids contain the SV40 early
Contains the mouse DHFR gene under the control of a promoter. With these plasmids
Infected Chinese hamster ovary cells lacking dihydrofolate activity
Vesicles or other cells are grown in selective medium (α-mycelium) supplemented with the chemotherapeutic
(Eg, eggplant MEM, Life Technologies)
.
DHFR gene amplification in cells that are resistant to methotrexate (MTX)
(Eg, Alt, F.W., Kellems, R.M., Bertino, J.R. and Sch
imke, R.T., 1978, J.A. Biol. Chem. 253: 1357-1370, Hamlin, J.L. and M, C.
1990, Biochem. et Biophys. Acta, 1097: 107-143, Page, M.J. and Sydenham
, M.A., Biotechnology 9: 64-68 (1991)). At increasing concentrations of MTX
Proliferated cells overproduce the target enzyme DHFR as a result of amplification of the DHFR gene
This manifests resistance to the drug. Second gene linked to DHFR gene
In some cases, they are usually co-amplified and overexpressed. More than 1,000 genes
Developing a cell line with a strain is state of the art. Then, methotrexa
If the plate is removed, the cell line becomes integrated into the chromosome (s)
Includes amplified gene.
Plasmid pC1 contains the Rous sarcoma virus (Culle) for expression of the gene of interest.
n et al., Molecular and Cellular Biology, March 1985: 438-4470).
(LTR) strong promoter gene, and human cytomegalovirus (CMV
) (Boshart et al., Cell 41: 521-530, 1985).
Contains released fragments. Downstream of promoter allows gene uptake
The following are the single restriction enzyme cleavage sites: BamHl, PvuII and NruI. these
Behind the cloning site, the plasmid contains all three reading frames.
Translation stop codon in the middle, followed by the 3 'intron of the rat preproinsulin gene
And a polyadenylation site. Other high efficiency promoters are also available for expression
(Eg, the human β-actin promoter, SV40 early or late
Promoters, or lengths from other retroviruses (eg, HIV and HTLVI)
Terminal repeat). Due to polyadenylation of mRNA, other signals (eg, human growth
Hormone or globin genes) can be used as well.
Stable cell lines with the gene of interest integrated into the chromosome can also be used as selection markers.
-(Eg, gpt, G418, or hygromycin) co-transfection
May be selected based on Initially, two or more selectable markers (eg, G418 and
It is useful to use (methotrexate).
Plasmid pC1 is digested with the restriction enzyme BamHI and then calf intestinal phosphatase (pho
dephosphorylation using sphate) by procedures known in the art. Next,
The isolator is isolated from a 1% agarose gel.
DNA sequence encoding galectin 8, 9, or 10 SV (each ATCC accession number)
Nos. 97732, 97733, and 97732) describe PCRs corresponding to the 5 'and 3' sequences of the gene.
Amplified using oligonucleotide primers. Galectin 10 sequence is human
It is similarly amplified from a cDNA library of endometrial tumor or human fetal heart.
The 5 'galectin 8 primer was underlined with the SmaI restriction enzyme site, followed by FIG.
Sequence 5 ′ cgc comprising the nucleotide sequences 52 to 67 of SEQ ID NO: 1)CCCGGGgccatcATGGCC
It has TATGTCCCCG 3 '(SEQ ID NO: 55). Insert into expression vector as below
The 5 'end of the amplified fragment encoding human galectin 8
Provide a signal peptide. Kozak, M., J .; Mol. Blol. 196: 947-950 (1987)
The signals effective for initiating translation in eukaryotic cells as described are constructs
Is appropriately placed in the vector portion of
The 3 'galectin 8 primer was linked to the Asp718 restriction enzyme site followed by FIG. 1 (SEQ ID NO: 1).
) A nucleotide complementary to nucleotides 1005 to 1023 of the galectin 8 coding sequence
Sequence 5 'cgc, including tideGGT ACC Has TTAGATCTGGACATAGGAC 3 '(SEQ ID NO: 56)
I do.
The 5 'galectin 9 primer has an underlined SmaI restriction enzyme site, followed by FIGS.
Sequence 5 'cgc comprising the nucleotide sequence of bases 16 to 32 of 2B (SEQ ID NO: 3)CCC GGG
gcc atc ATGGCCTTCAGCGGTTC 3 '(SEQ ID NO: 57). Expression as shown below
Once inserted into the vector, the amplified fragment encoding human galectin 9
The 5 'end provides an effective signal peptide. Kozak, M., J .; Mol. Biol. 196
: 947-950 (1987), a system effective for initiating translation in eukaryotic cells.
The signal is appropriately placed in the vector portion of the construct.
3 'Galectin 9 primer contains an Asp718 restriction enzyme site followed by a stop codon
Nucleotides 1029-10 of the galectin 9 coding sequence shown in Figures 2A-2B (SEQ ID NO: 3).
Sequence 5 'cgc, containing nucleotides complementary to 45GGT ACC CAGGGTTGGAAAGGCTG 3 '
(SEQ ID NO: 58).
The 5 'galectin 10 and 10 SV primers are underlined with the SmaI restriction enzyme site, followed by
5 'cgc comprising the nucleotide sequence 118-135 of FIGS. 3A-3B (SEQ ID NO: 5).C CC GGG
gcc atc ATGATGTTGTCCTTAAAC 3 '(SEQ ID NO: 59). As described below
When inserted into an expression vector, the amplification fragment encoding human galectin 10
The 5 'end of the fragment provides an effective signal peptide. Kozak, M., J .; Mol. Biol
. 196: 947-950 (1987) to initiate translation in eukaryotic cells.
Effective signals are suitably located in the vector portion of the construct.
The 3 'galectin 10 primer is an Asp718 restriction enzyme site followed by FIGS. 3A-3B (SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 5'c comprising nucleotides complementary to nucleotides 1105-1120 shown in No. 5)
gcGGTACCCACAGAAGCCATTCTG 3 '(SEQ ID NO: 60).
The 3 'galectin 10SV primer was linked to the Asp718 restriction enzyme site, followed by Figures 4A-4B (sequence
No. 7) contains a nucleotide complementary to the 3 ′ end of the galectin 10SV coding sequence.
Mu, sequence 5 'CGCGGTACCCTATGCAACTTTATAAAATATTCC 3 '(SEQ ID NO: 54).
The amplified fragment was isolated from a 1% agarose gel as described above,
Digested with endonucleases SmaI and Asp718, then 1% agarose gel
Purify again.
The isolated fragment and the dephosphorylated vector are then digested with T4 DNA ligase.
connect. The E. coli HB101 cells are then transformed and used with the restriction enzyme SmaI.
To identify bacteria containing plasmid pC1 inserted in the correct orientation. Heredity inserted
The offspring sequence is confirmed by DNA sequencing.
Transfection of CHO-DHFR cells
Transferring Chinese hamster ovary cells lacking active DHFR enzyme
Used for action. 5 μg of the expression plasmid C1 was transferred to a lipofecting method.
Using the method (Felgner et al., Supra), co-trigger with 0.5 μg of plasmid pSV2neo.
Transfect. Plasmid pSV2-neo is a dominant selectable marker (a group containing G418
(Neo), a gene from Tn5 encoding an enzyme that confers resistance to antibiotics. Fine
The cells are seeded in α minus MEM supplemented with 1 mg / ml G418. Two days later, the cells are
Psin-treated and seeded on hybridoma cloning plates (Greiner, Germany)
Seed and culture for 10-14 days. After this period, a single clone is trypsinized.
Reason
And then different concentrations of methotrexate (25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM
) And seed in a 6-well Petri dish. Then the highest concentration of methotrexer
Clones that grow in a higher concentration of methotrexate (500 nM, 1 μM,
2 μM, 5 μM). Same procedure, clone
Until it grows at a concentration of 100 μM.
Expression of the desired gene product can be determined, for example, by Western blot analysis and SDS-PAGE.
Analyze by
Example 4: Tissue distribution of protein expression
Northern blot analysis was performed and described, inter alia, in Sambrook et al. (Cited above).
Thus, using the method described, galectin 8, galectin 9 in human tissues
The expression level of Galectin 10, or Galectin 10 SV gene is examined. Galecti
All proteins of galectin 8, galectin 9, galectin 10, or galectin 10 SV
CDNA probe containing a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7, respectively)
The redlprimeTM Manufacturer's description of DNA labeling system (Amersham Life Science)
Use according to the book32Label with P. After labeling, the probe was changed to CHROMA SPIN-100.TMKara
(Clontech Laboratories, Inc. ) According to the manufacturer's protocol number PT1200-1
For purification. Next, various human tissues are purified using the purified labeled probe.
Galectin 8, Galectin 9, Galectin 10, or Galectin 10 SV mRNA
To find out.
Multiple tissues northern including various human tissues (H) or human immune system tissues (IM)
(MTN) blots were obtained from Clontech and ExprecssHybTMHybridization
Solution (Clontech) according to the manufacturer's protocol number PT1190-1.
Check using a sense probe. After hybridization and washing, blots are
Mount and expose to film overnight at -70 ° C, and remove film to standard
Develop according to the procedure.
The present invention may be practiced other than as specifically described in the foregoing description and examples.
Is obvious.
Numerous modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings,
It is within the scope of the appended claims.
All publications (patents, patent applications, journals,
The entire disclosure (including laboratory manuals, books, or other documents)
And incorporated herein by reference.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61P 17/02 A61P 29/00
29/00 31/04
31/04 31/10
31/10 31/12
31/12 33/00
33/00 35/00
35/00 37/06
37/06 37/08
37/08 43/00 111
43/00 111 C07K 14/47
C07K 14/47 16/18
16/18 C12N 1/21
C12N 1/21 G01N 33/53 D
G01N 33/53 A61K 37/02
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),CA,JP,US
(72)発明者 ゲンツ,ライナー エル.
アメリカ合衆国 メリーランド 20904,
シルバー スプリング,フェアランド パ
ーク ドライブ 13404
(72)発明者 ルーベン,スティーブン エム.
アメリカ合衆国 メリーランド 20832,
オルニー,ヘリテッジ ヒルズ ドライブ
18528──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 17/02 A61P 29/00 29/00 31/04 31/04 31/10 31/10 31/12 31 / 12 33/00 33/00 35/00 35/00 37/06 37/06 37/08 37/08 43/00 111 43/00 111 C07K 14/47 C07K 14/47 16/18 16/18 C12N 1 / 21 C12N 1/21 G01N 33/53 D G01N 33/53 A61K 37/02 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), CA, JP, US (72) Inventor Genz, Reiner L. United States of America 20904, Silver Spring, Fairland Park Drive 13404 (72) Inventor Ruben, Steven M. a States Maryland 20832, Olney, Heritage Hills Drive 18528