JP2001346581A - Promoter gene and method for assaying promoter activity - Google Patents
Promoter gene and method for assaying promoter activityInfo
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Landscapes
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、免疫グロブリンA
(IgA)の受容体であるFcαR遺伝子のプロモーター遺伝子
に関する。また、前記プロモーター遺伝子を用いたプロ
モーター活性の測定方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an immunoglobulin A
The present invention relates to a promoter gene of the FcαR gene which is a receptor for (IgA). The present invention also relates to a method for measuring promoter activity using the promoter gene.
【０００２】[0002]
【従来の技術】免疫グロブリンにおいて、IgAは最も産
生量が多く、全免疫グロブリンの６０％以上を占めるこ
とが知られている。産生されたIgAの大部分は粘膜に分
泌され、様々な外来性抗原の侵入を防ぎ、粘膜における
免疫防御機構の主役として機能している。2. Description of the Related Art Among immunoglobulins, it is known that IgA produces the largest amount and accounts for 60% or more of all immunoglobulins. Most of the produced IgA is secreted into the mucous membrane, preventing the invasion of various foreign antigens and functioning as the main role of the immune defense mechanism in the mucosa.
【０００３】一方、IgAの受容体であるFcαRは、好中
球、単球、好酸球等に発現していることが知られてお
り、IgAを介してFcαRが架橋され凝集することにより食
作用、活性酸素産生、脱顆粒、炎症性ケミカルメディエ
ーターの放出及び抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(a
nti-body-dependent cell-mediated cytotoxicity)等の
引き金となることが知られている。また、FcαRをコー
ドする遺伝子配列の解明が進められており、ヒトFcαR
をコードするゲノムDNA及びｃDNAがクローニングされる
とともに、ｃDNAは５つのエクソンからなり、２つの免
疫グロブリン様ドメイン及び膜貫通領域をコードする遺
伝子であることが明らかにされている（TonP. M. de Wi
t, et al., J. Immunol. 155:1203-1209,1995）。[0003] On the other hand, FcαR which is a receptor for IgA is known to be expressed on neutrophils, monocytes, eosinophils and the like. Action, active oxygen production, degranulation, release of inflammatory chemical mediators and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (a
It is known to be a trigger for nti-body-dependent cell-mediated cytotoxicity). Also, the gene sequence encoding FcαR has been elucidated, and human FcαR
The genomic DNA and cDNA encoding E. coli have been cloned, and the cDNA has been shown to consist of five exons and encode two immunoglobulin-like domains and a transmembrane region (TonP. M. de Wi
t, et al., J. Immunol. 155: 1203-1209, 1995).
【０００４】ところで、原発性糸球体腎炎の中でも最も
高頻度に見られる腎炎であるIgA腎症患者において、そ
の単球及び好中球においてFcαRの発現が上昇している
との報告(Monteiro R.C. et al. Contrib Nephrol 111:
116-122,1995等)がされている。一方、IgA腎症患者の単
球及び好中球においてFcαRの発現が減少しているとの
報告(Grossetete B, Kidney Int 53:1321-1335,1998)も
あり、IgA腎症とFcαRとの直接的な関連が示唆されてい
る。これは、FcαRの発現調節とIgA腎症との間になんら
かの関連があることを示唆するものであり、IgA腎症を
はじめとする、FcαRが関与すると考えられる疾病の発
症及び症状の悪化のメカニズム解明及び前記疾病の診断
方法の開発に期待が寄せられている。[0004] By the way, in IgA nephropathy patients who are the most frequent nephritis among primary glomerulonephritis, it has been reported that the expression of FcαR is increased in monocytes and neutrophils (Monteiro RC et al. al. Contrib Nephrol 111:
116-122, 1995). On the other hand, there is a report that the expression of FcαR is decreased in monocytes and neutrophils of patients with IgA nephropathy (Grossetete B, Kidney Int 53: 1321-1335, 1998), and there is a direct relationship between IgA nephropathy and FcαR. Is suggested. This suggests that there is some relationship between the regulation of FcαR expression and IgA nephropathy, and the mechanism of the onset and deterioration of symptoms that are considered to be related to FcαR, including IgA nephropathy. Expectations are growing for elucidation and development of methods for diagnosing the disease.
【０００５】しかしながら、FcαR遺伝子の発現を調節
する領域については未だ同定されておらず、FcαR遺伝
子の発現を制御するメカニズムについては不明であっ
た。[0005] However, the region that regulates the expression of the FcαR gene has not yet been identified, and the mechanism that controls the expression of the FcαR gene has not been clarified.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来技
術の有する課題に鑑みてなされたものであり、FcαR遺
伝子のプロモーター遺伝子及び前記プロモーター遺伝子
を用いたプロモーター活性測定方法を提供することを目
的とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and has as its object to provide a promoter gene for the FcαR gene and a method for measuring promoter activity using the promoter gene. And
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、FcαR遺伝子の上
流域に前記遺伝子の発現を制御するプロモーター遺伝子
を見出すとともに、前記プロモーター遺伝子を用いてプ
ロモーター活性の測定を行う方法を見出すことに成功
し、また、本発明のプロモーター活性の測定方法を用い
ることにより、FcαR遺伝子のプロモーター調節領域及
びプロモーター調節因子のスクリーニングをする方法を
見出すことに成功し、本発明を完成した。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have found a promoter gene that controls the expression of the gene in the upstream region of the FcαR gene, Succeeded in finding a method for measuring the promoter activity by using the method, and a method for screening a promoter regulatory region and a promoter regulatory factor of the FcαR gene by using the promoter activity measuring method of the present invention. And completed the present invention.
【０００８】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
に記載のＤＮＡ配列からなるＤＮＡであることを特徴と
するプロモーター遺伝子を提供する。[0008] That is, the present invention relates to SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
And a promoter gene characterized by being a DNA consisting of the DNA sequence described in (1).
【０００９】また、本発明は、配列表の配列番号１に記
載のＤＮＡ配列を含むＤＮＡであることを特徴とするプ
ロモーター遺伝子を提供する。[0009] The present invention also provides a promoter gene, which is a DNA comprising the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
【００１０】さらに、本発明は、配列表の配列番号２に
記載のＤＮＡ配列からなるＤＮＡであることを特徴とす
るプロモーター遺伝子を提供する。Further, the present invention provides a promoter gene, which is a DNA comprising the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
【００１１】ここで、本発明は、配列表の配列番号１ま
たは２のいずれかに記載のＤＮＡ配列からなるＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプ
ロモーター活性を有するＤＮＡであることを特徴とする
プロモーター遺伝子を提供する。Here, the present invention relates to a DNA which hybridizes with a DNA consisting of the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 under stringent conditions and has a promoter activity. Provide a promoter gene characterized.
【００１２】また、本発明は、配列表の配列番号１また
は２のいずれかに記載のＤＮＡ配列またはこれらのＤＮ
Ａとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤ
ＮＡ配列のいずれかのＤＮＡ配列を含むプロモーター遺
伝子の下流にレポーター遺伝子を連結したプラスミドベ
クターを作製する工程と、前記プラスミドベクターを培
養細胞に導入する工程と、前記培養細胞から得た抽出液
中に含まれる前記レポーター遺伝子産物の活性を測定す
る工程と、からなることを特徴とするプロモーター活性
測定方法を提供する。特には、前記レポーター遺伝子が
ルシフェラーゼをコードする遺伝子であることが好まし
い。Further, the present invention relates to a DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing or a DN sequence thereof.
A that hybridizes with A under stringent conditions
A step of preparing a plasmid vector in which a reporter gene is linked downstream of a promoter gene containing any DNA sequence of the NA sequence, a step of introducing the plasmid vector into cultured cells, and a step of extracting a plasmid vector from the cultured cells. Measuring the activity of the reporter gene product contained in the reporter gene product. In particular, it is preferable that the reporter gene is a gene encoding luciferase.
【００１３】さらに、本発明は、前記のプロモーター活
性測定方法を用いて行うことを特徴とするプロモーター
調節領域及びプロモーター調節因子のスクリーニング方
法を提供する。Further, the present invention provides a method for screening a promoter regulatory region and a promoter regulatory factor, which is carried out using the above-mentioned method for measuring promoter activity.
【００１４】また、本発明は、前記のスクリーニング方
法を用いて得られることを特徴とするプロモーター調節
領域及びプロモーター調節因子を提供する。[0014] The present invention also provides a promoter regulatory region and a promoter regulatory factor obtained by using the above-mentioned screening method.
【００１５】[0015]
【発明の実施の形態】以下、本発明の好適な実施形態に
ついて詳細に説明する。DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Preferred embodiments of the present invention will be described below in detail.
【００１６】本明細書中、「プロモーター」とはDNA上
に存在する塩基配列であって、RNA合成（転写）を開始
させたり終了させたりする指令、またはその頻度を調節
する指令を司る役割を果たすシグナル配列を指す。As used herein, the term "promoter" refers to a nucleotide sequence present on DNA, and plays a role in instructing the initiation or termination of RNA synthesis (transcription) or in regulating the frequency thereof. Refers to the signal sequence to be fulfilled.
【００１７】また、本明細書中、「プロモーター活性」
とは、前記プロモーターが上述のように転写の開始、終
了及びその調節を行う働きをすることを指す。In the present specification, “promoter activity”
Means that the promoter functions to initiate, terminate and regulate transcription as described above.
【００１８】また、本明細書中、「ストリンジェントな
条件下でハイブリダイズし」とは、二つのDNA断片がサ
ムブルックら（Sambrook,J.）の「大腸菌におけるクロ
ーン遺伝子の発現（Expression of cloned genes in E.
coli）」（Molecular Cloning：A laboratory manual
（1989））Cold Spring harbor Laboratory Press, New
York, USA, 9. 47-9. 62及び11.45-11.61に記載された
ハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイ
ズすることを意味する。As used herein, the term "hybridizes under stringent conditions" refers to the expression of a cloned gene in Escherichia coli by the expression of two DNA fragments by Sambrook, J., et al. (Sambrook, J.). genes in E.
coli) ”(Molecular Cloning: A laboratory manual
(1989)) Cold Spring harbor Laboratory Press, New
Under the hybridization conditions described in York, USA, 9.47-9.62 and 11.45-11.61, it means to hybridize to each other.
【００１９】より具体的には、「ストリンジェントな条
件」とは約４５℃にて６．０×ＳＳＣでハイブリダイゼ
ーションを行った後に、５０℃で２．０×ＳＳＣで洗浄
することを指す。ストリンジェンシーの選択のため、洗
浄工程における塩濃度を、例えば低ストリンジェンシー
としての約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジ
ェンシーとしての約０．１×SSC、５０℃まで選択する
ことができる。さらに、洗浄工程の温度を低ストリンジ
ェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェン
シー条件の約６５℃まで増大させることができる。More specifically, "stringent conditions" refers to hybridization at 6.0 × SSC at about 45 ° C. followed by washing with 2.0 × SSC at 50 ° C. For selection of stringency, the salt concentration in the washing step can be selected, for example, from about 2.0 × SSC at 50 ° C. as low stringency to about 0.1 × SSC at 50 ° C. as high stringency. it can. Further, the temperature of the washing step can be increased from low stringency conditions at room temperature, about 22 ° C., to high stringency conditions at about 65 ° C.
【００２０】また、本明細書中、「レポーター遺伝子」
とは、ある遺伝子が発現したかどうかを調べる場合に用
いられる遺伝子で、ある遺伝子のプロモーター遺伝子を
レポータータンパク質をコードする遺伝子の上流につな
いだプラスミドベクターを準備し、前記プラスミドベク
ターを哺乳動物培養細胞に導入した後、レポーター遺伝
子にコードされたタンパク質の活性を測定することで間
接的にプロモーター活性を測定することができる。一般
に（１）活性測定が容易であること、（２）細胞に毒性
がないこと、（３）細胞に内在性の活性をもたないこ
と、がレポーター遺伝子として好適な条件であり、具体
的には、例えば、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコー
ル・アセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β−ガラク
トシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）及びＧ
ＦＰ(Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ)等をそれぞれコードする遺伝子が挙げられる。In the present specification, “reporter gene”
Is a gene used to check whether a certain gene has been expressed, a plasmid vector prepared by connecting a promoter gene of a certain gene upstream of a gene encoding a reporter protein is prepared, and the plasmid vector is cultured in a mammalian cell culture. After the introduction, the promoter activity can be measured indirectly by measuring the activity of the protein encoded by the reporter gene. In general, (1) easy activity measurement, (2) non-toxicity of cells, and (3) no endogenous activity of cells are preferred conditions for a reporter gene. Are, for example, luciferase, chloramphenicol acetyltransferase (CAT), β-galactosidase and G
FP (Green Fluorescent Prot)
ein) and the like.
【００２１】本発明者らは、単球細胞であるU937細胞よ
り得られたゲノムDNAより、免疫グロブリンの１種であ
るIgAの受容体であるFcαR遺伝子の転写プロモーター領
域を同定した。また、同時に、FcαR遺伝子の転写プロ
モーター領域に存在する遺伝的多型、すなわち、FcαR
遺伝子の転写開始点上流１１４番目（配列表の配列番号
２において７番目）の塩基または下流５６番目（配列表
の配列番号２において１７６番目）の塩基がCである場
合とTである場合があり、この違いによってFcαR遺伝子
の転写プロモーター活性の強度に違いが生じることを見
出した。従って、本発明のFcαR遺伝子のプロモーター
遺伝子を用いたより詳細な解析を行うことにより、IgA
腎症を始めとするFcαR遺伝子の発現量に関与する様々
な疾病の発症及び症状の悪化の原因の解明が可能となる
とともに、前記疾病の診断方法確立が可能となる。ここ
で、ヒトFcαR遺伝子の転写開始点とは、de Wit et al.
(1995)J.Immunol.155:116-122によって同定された転写
開始点を便宜的に転写開始点下流１番目とする。The present inventors have identified the transcription promoter region of the FcαR gene, which is a receptor for IgA, one of immunoglobulins, from genomic DNA obtained from U937 cells, which are monocytes. At the same time, a genetic polymorphism present in the transcription promoter region of the FcαR gene, that is, FcαR
The 114th base (7th in SEQ ID NO: 2) or the 56th base (176th in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing) upstream of the transcription start site of the gene may be C or T It has been found that the difference causes a difference in the intensity of the transcription promoter activity of the FcαR gene. Therefore, by performing a more detailed analysis using the promoter gene of the FcαR gene of the present invention, IgA
It is possible to elucidate the causes of the onset and deterioration of various diseases related to the expression level of the FcαR gene including nephropathy, and to establish a diagnostic method for the diseases. Here, the transcription start site of the human FcαR gene refers to de Wit et al.
(1995) J. Immunol. 155: 116-122.
【００２２】まず、本発明において、配列表の配列番号
１に記載のFcαR遺伝子のプロモーターについて説明す
る。First, in the present invention, the promoter of the FcαR gene represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing will be described.
【００２３】すなわち、本発明の第１のプロモーター遺
伝子は、配列表の配列番号１に記載のDNA配列、すなわ
ちFcαR遺伝子の転写開始点下流５９番目の塩基（T）か
ら１９７番目の塩基（G）までからなるDNAであり、この
領域を最小単位として含むことにより、FcαR遺伝子の
プロモーターとして機能する。That is, the first promoter gene of the present invention is a DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, that is, the 59th base (T) to the 197th base (G) downstream of the transcription start site of the FcαR gene. And functions as a promoter of the FcαR gene by including this region as a minimum unit.
【００２４】また、本発明の第２のプロモーター遺伝子
は、前記配列番号１に記載の配列を含むDNAであり、前
記配列番号１に記載のDNA配列以外の部分のDNA配列は特
に制限されないが、通常ヒトゲノムDNA上で配列番号１
及び配列番号１に隣接するDNA配列からなるDNAであるこ
とが好ましい。Further, the second promoter gene of the present invention is a DNA containing the sequence of SEQ ID NO: 1, and the DNA sequence other than the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 is not particularly limited, Usually SEQ ID NO: 1 on human genomic DNA
And a DNA consisting of a DNA sequence adjacent to SEQ ID NO: 1.
【００２５】さらに、本発明の第３のプロモーター遺伝
子は、前記配列表の配列番号２に記載のDNA配列からな
るDNAである。前記配列番号２に記載のDNA配列は、前記
配列番号１に記載のDNA配列を含み、かつFcαR遺伝子の
転写開始点上流１２０番目の塩基（G）から下流１９７
番目の塩基（G）までからなるDNAであり、前記配列番号
１に記載のDNA配列を含むDNAのみの場合より強いプロモ
ーター活性を有する。Further, the third promoter gene of the present invention is a DNA comprising the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the above sequence listing. The DNA sequence of SEQ ID NO: 2 contains the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 and is 197 downstream from the 120th base (G) upstream of the transcription start site of the FcαR gene.
It is a DNA consisting of up to the Nth base (G), and has a stronger promoter activity than the case of only the DNA containing the DNA sequence of SEQ ID NO: 1.
【００２６】本発明の第４のプロモーター遺伝子は、上
記配列番号１または２のいずれかに記載のDNA配列を含
むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつプロモーター活性を有するDNAであってもよ
く、この条件を満足する限りにおいてはDNA配列は特に
制限されない。具体的には、例えば、上記配列番号１ま
たは２のいずれかに記載のDNAの塩基のいくつかに欠
失、置換、付加等があり、かつプロモーター活性を有す
るDNAが挙げられる。ここで、欠失、置換、付加とは、
１〜１０塩基の短い欠失、置換、付加のみならず、１０
〜１００塩基の長い欠失、置換、付加も含む。The fourth promoter gene of the present invention is a DNA that hybridizes with a DNA containing the DNA sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 and 2 under stringent conditions and has promoter activity. The DNA sequence is not particularly limited as long as this condition is satisfied. Specifically, for example, DNAs having deletions, substitutions, additions, and the like in some of the bases of the DNAs described in any of SEQ ID NOS: 1 and 2, and having promoter activity are mentioned. Here, deletion, substitution, and addition are:
Short deletions, substitutions and additions of 1 to 10 bases as well as 10
Also includes long deletions, substitutions and additions of up to 100 bases.
【００２７】次に、本発明のFcαR遺伝子のプロモータ
ー遺伝子を用いてプロモーター活性の測定を行う方法に
ついて説明する。Next, a method for measuring promoter activity using the promoter gene of the FcαR gene of the present invention will be described.
【００２８】本発明のプロモーター活性測定方法は、上
記配列番号１または２のいずれかに記載のDNA配列を含
むDNAの下流にレポーター遺伝子を連結し、前記連結し
たDNAとレポーター遺伝子をベクターに導入したプロモ
ーター活性測定用レポータープラスミドを作製する工程
と、前記プラスミドベクターを培養細胞に導入する工程
と、前記培養細胞から得た抽出液中に含まれる前記レポ
ーター遺伝子産物の活性を測定する工程と、からなるこ
とを特徴とするものである。According to the method for measuring promoter activity of the present invention, a reporter gene is ligated downstream of a DNA containing the DNA sequence of either SEQ ID NO: 1 or 2, and the ligated DNA and reporter gene are introduced into a vector. A step of preparing a reporter plasmid for measuring promoter activity, a step of introducing the plasmid vector into cultured cells, and a step of measuring the activity of the reporter gene product contained in an extract obtained from the cultured cells. It is characterized by the following.
【００２９】すなわち、上記配列番号１または２のいず
れかに記載のDNA配列を含むDNAをレポーター遺伝子、好
ましくはルシフェラーゼをコードする遺伝子を含む市販
のプラスミド、例えばｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（プロメガ
社製）等のレポーター遺伝子上流に連結する。また前記
プラスミドとして、レポーター遺伝子としてＣＡＴを用
いる場合にはｐＣＡＴ３−ｂａｓｉｃ、レポーター遺伝
子としてＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを用いる場合に
はｐＲＬ−ｎｕｌｌを用いてもよい。このようにして準
備されたレポータープラスミドを培養細胞に導入する。
ここで用いられる前記培養細胞の種類は特に制限され
ず、プロモーター活性の測定を行うに好適な培養細胞が
用いられる。That is, a DNA containing the DNA sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 and 2 is used to prepare a reporter gene, preferably a commercially available plasmid containing a gene encoding luciferase, such as pGL3-basic (promega). Connect upstream of the reporter gene. As the above-mentioned plasmid, pCAT3-basic may be used when CAT is used as a reporter gene, and pRL-null may be used when Renilla luciferase is used as a reporter gene. The reporter plasmid thus prepared is introduced into cultured cells.
The type of the cultured cell used here is not particularly limited, and a cultured cell suitable for measuring the promoter activity is used.
【００３０】また、前記培養細胞にレポータープラスミ
ドを導入する方法として、例えば、リン酸カルシウム
法、エレクトロポレーション法及びリポフェクション法
等が挙げられる。Examples of a method for introducing a reporter plasmid into the cultured cells include a calcium phosphate method, an electroporation method and a lipofection method.
【００３１】さらに、前記レポータープラスミドを含む
培養細胞から細胞抽出液を抽出する方法としては、当業
者に周知の方法が用いられるが、例えば、前記培養細胞
を凍結融解させることにより細胞膜を破壊する方法が挙
げられる。この場合の凍結とはドライアイスメタノール
バスで１〜１０分間インキュベートすることを指し、融
解とは３７℃の恒温槽で１〜１０分間インキュベートす
ることを指す。Further, as a method for extracting a cell extract from cultured cells containing the reporter plasmid, a method well known to those skilled in the art is used. For example, a method for destroying a cell membrane by freezing and thawing the cultured cells is used. Is mentioned. Freezing in this case refers to incubating for 1 to 10 minutes in a dry ice methanol bath, and thawing refers to incubating for 1 to 10 minutes in a thermostat at 37 ° C.
【００３２】培養細胞から抽出されたFcαR遺伝子のプ
ロモーター遺伝子を含むレポータープラスミドを用いて
FcαR遺伝子のプロモーター遺伝子におけるプロモータ
ー活性を測定するには、公知の方法を用いることができ
る。すなわち、レポーター遺伝子にルシフェラーゼを用
いた場合には「遺伝子発現と転写因子」堀越正美訳（メ
ディカルサイエンスインターナショナル）８１〜９９頁
に記載の方法等によりプロモーター活性の測定を行えば
よい。また。レポーター遺伝子にＣＡＴを用いた場合に
は、サムブルック（Sambrook,J.）らの「Strategies fo
r Studying Gene Regulation」（Molecular Cloning：A
laboratory manual（1989））Cold Spring harbor Lab
oratory Press, New York, USA, 16.56-16.67に記載の
方法、または新細胞工学実験プロトコール(秀潤社)354
‐361頁に記載の方法等によりプロモーター活性の測定
を行えばよい。Using a reporter plasmid containing the promoter gene of the FcαR gene extracted from the cultured cells,
A known method can be used to measure the promoter activity of the FcαR gene in the promoter gene. That is, when luciferase is used as the reporter gene, the promoter activity may be measured according to the method described in “Gene Expression and Transcription Factor”, translated by Masami Horikoshi (Medical Science International), pp. 81-99. Also. When CAT was used as the reporter gene, Sambrook, J. et al., "Strategies fo
r Studying Gene Regulation ”(Molecular Cloning: A
laboratory manual (1989)) Cold Spring harbor Lab
oratory Press, New York, USA, 16.56-16.67, or New Cell Engineering Experimental Protocol (Shujunsha) 354
The measurement of the promoter activity may be performed by the method described on page 361 or the like.
【００３３】また、上記プロモーター活性の測定方法を
用いてプロモーター調節領域及びプロモーター調節因子
をスクリーニングすることが可能である。ここで、プロ
モーター調節領域とは、プロモーターの活性を増強また
は抑制する機能を有する遺伝子であり、具体的には、例
えば、プロモーターの上流あるいは下流に存在し、転写
を妨げる機能を有するサイレンサー(silencer)、プロモ
ーターの上流あるいは下流に存在し転写効率を促進する
機能を有するエンハンサー(enhancer)等が挙げられる。
また、プロモーター調節因子としては、プロモーターの
活性を増強または抑制する機能を有するＤＮＡ結合転写
因子、あるいは、プロモーター調節領域には直接結合せ
ず、ＤＮＡに結合した転写因子と相互作用することによ
りプロモーターの転写効率を制御する転写コファクター
等が挙げられる。Further, it is possible to screen a promoter regulatory region and a promoter regulatory factor by using the above-mentioned method for measuring promoter activity. Here, the promoter regulatory region is a gene having a function of enhancing or suppressing the activity of the promoter.Specifically, for example, a silencer having a function of inhibiting transcription is present upstream or downstream of the promoter (silencer). And an enhancer which is present upstream or downstream of the promoter and has a function of promoting transcription efficiency.
As the promoter regulatory factor, a DNA-binding transcription factor having a function of enhancing or suppressing the activity of the promoter, or a promoter that interacts with a transcription factor bound to DNA without directly binding to the promoter regulatory region, is used. And a transfer cofactor that controls the transfer efficiency.
【００３４】前記プロモーター調節領域として機能する
遺伝子をスクリーニングする方法としては、上記のプロ
モーター活性の測定法によってプロモーター活性を測定
する際に、例えば、上記で用いたレポーター遺伝子を含
むベクターにプロモーター活性を有すると考えられるFc
αR遺伝子のタンパク質コード領域より上流域をできる
だけ長い範囲、好ましくは１００〜２０００塩基、を挿
入し、市販のディレーションキット等を用いて挿入され
た塩基配列が様々な塩基配列長になるような複数のディ
レーション変異体を含むプラスミドを作製した後、作製
されたプラスミドを哺乳動物培養細胞に導入し、上述の
プロモーター活性測定方法によりプロモーター活性を測
定する。または、前記プロモーター活性を有すると考え
られる領域において、適当な領域をPCRにより増幅し、
上記のレポーター遺伝子を有するベクターに導入し、さ
らに細胞に導入した後、上述のプロモーター活性測定方
法によりプロモーター活性を測定する。前記で作製され
たプラスミドを含む哺乳動物培養細胞には、FcαR遺伝
子のプロモーター領域において、プロモーターのみを含
む塩基配列、前記塩基配列に隣接する塩基配列を含む塩
基配列、または全くプロモーター活性に寄与しない塩基
配列等がランダムに導入されていることになる。As a method for screening for a gene that functions as the promoter regulatory region, when the promoter activity is measured by the above-mentioned method for measuring promoter activity, for example, the vector containing the reporter gene used above has the promoter activity. Fc which is thought to be
Insert a region as long as possible in the upstream region from the protein coding region of the αR gene, preferably 100 to 2000 bases, and use a commercially available dilation kit or the like to insert a plurality of base sequences having various base sequence lengths. Is prepared, the prepared plasmid is introduced into cultured mammalian cells, and the promoter activity is measured by the above-described promoter activity measurement method. Alternatively, in the region considered to have the promoter activity, an appropriate region is amplified by PCR,
After introduction into the vector having the above-described reporter gene and further into cells, the promoter activity is measured by the above-described promoter activity measurement method. In the cultured mammalian cells containing the plasmid prepared above, in the promoter region of the FcαR gene, a base sequence containing only the promoter, a base sequence containing a base sequence adjacent to the base sequence, or a base that does not contribute to the promoter activity at all This means that sequences and the like are randomly introduced.
【００３５】また、前記プロモーター調節因子をスクリ
ーニングする方法としては、FcαR遺伝子のプロモータ
ー調節因子として推定されるタンパク質の遺伝子を発現
ベクターに挿入し、これをFcαR遺伝子のプロモーター
領域を含むレポータープラスミドと共に細胞へ導入して
プロモーター活性への影響を調べる方法がある。また、
ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子を直接スクリ
ーニングする方法としてサウスウエスターンブロット法
（「遺伝子工学ハンドブック」（羊土社）９５〜１００
頁）が挙げられる。As a method of screening for the promoter regulatory factor, a gene of a protein putative as a promoter regulatory factor of the FcαR gene is inserted into an expression vector, and this is inserted into cells together with a reporter plasmid containing the promoter region of the FcαR gene. There is a method of examining the effect on promoter activity by introduction. Also,
As a method for directly screening a gene encoding a DNA-binding protein, Southwestern blotting (“Genetic Engineering Handbook” (Yodosha) 95-100)
Page).
【００３６】次に、上記のプロモーター活性測定方法に
よって得られた結果をもとに、例えば、プロモーター遺
伝子として機能する最小の塩基配列のみが含まれること
がわかっているプラスミドと比較して、プロモーター活
性が上昇している場合には、そのベクターに挿入された
塩基配列のうち、前記最小の塩基配列を除いた領域がFc
αR遺伝子のプロモーター調節領域として機能している
と判断できる。また、逆に、プロモーター遺伝子として
機能する最小の塩基配列のみを含むベクターと比較して
プロモーター活性が減少している場合には、そのベクタ
ーに挿入された塩基配列のうち、前記最小の塩基配列を
除いた領域がFcαR遺伝子のプロモーター調節領域とし
て機能していると判断できる。従って、前記のプロモー
ター活性測定方法により、プロモーター遺伝子調節因子
のスクリーニングを行うことが可能となり、FcαR遺伝
子の発現のメカニズムがさらに詳細に解明できるように
なるとともに、FcαR遺伝子の発現量が関与すると考え
られる疾病の発症及び症状の悪化のメカニズム解明及び
前記疾病の診断方法の開発が可能となる。Next, based on the results obtained by the above-described method for measuring promoter activity, for example, compared with a plasmid known to contain only a minimal base sequence that functions as a promoter gene, When is increased, of the base sequence inserted into the vector, the region excluding the minimum base sequence is Fc
It can be determined that it functions as the promoter regulatory region of the αR gene. Conversely, when the promoter activity is reduced as compared to a vector containing only the minimum nucleotide sequence that functions as a promoter gene, the minimum nucleotide sequence among the nucleotide sequences inserted into the vector is It can be determined that the removed region functions as a promoter regulatory region of the FcαR gene. Therefore, the promoter activity measurement method described above makes it possible to screen for a promoter gene regulatory factor, whereby the mechanism of expression of the FcαR gene can be elucidated in more detail, and it is considered that the expression level of the FcαR gene is involved. It becomes possible to elucidate the mechanism of the onset of the disease and the deterioration of the symptoms and to develop a method for diagnosing the disease.
【００３７】[0037]
【実施例】実施例１ （FcαR遺伝子の５’フランキング領域の増幅及びダイ
レクトシークエンス）まず、以下で用いるゲノムDNAを
得るため、健常者から得られた白血球からゲノムDNAを
抽出した。ゲノムDNAの抽出には市販のキットDnaQUICK
(大日本製薬社製)またはQIAamp Blood kit(キアゲン社
製)を用いた。EXAMPLES Example 1 (Amplification and Direct Sequencing of 5 'Flanking Region of FcαR Gene) First, genomic DNA was extracted from leukocytes obtained from healthy subjects to obtain genomic DNA used in the following. For extraction of genomic DNA, commercially available kit DnaQUICK
(Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) or QIAamp Blood kit (Qiagen).
【００３８】FcαR遺伝子の5'フランキング領域及びタ
ンパク質をコードする領域の一部をを含む931bpのフラ
グメントは既知の配列(GenBank アクセッションナンバ
ーX87767)を元にPCRによって増幅した。前記PCRには、
センスプライマーとして、FcαR遺伝子の転写開始点上
流７０１から６７２塩基に相補的なオリゴヌクレオチド
PS-701（5'-TACAACAAACCCCCATGACACAAGTTTACC-3'：配列
番号３）を用い、アンチセンスプライマーとして、転写
開始下流２３０から２０１塩基に相補的なPR＋２３０
(5'-AAGACACAGGAGGGTGGTCTGTTTGGGGTC-3'：配列番号４)
を用いた。次に、上記で得た染色体DNA 250ng、前記2種
のプライマー 各々5pmol、LATaqポリメラーゼ（宝酒造
社製）1.25ユニット、0.4mM dNTP混合液、2.5mM MgCl2
及び10×LA PCR緩衝液II（宝酒造社製）2.5μlを含み純
水で全量を25μlとしたPCR反応液を準備した。PCRは94
℃で１分間の解離反応後、94℃で20秒、61℃で1分及び7
2℃で2分からなる増幅反応を30回行い、最後に72℃で10
分間の伸長反応により反応を停止した。A 931 bp fragment containing the 5 'flanking region of the FcαR gene and a part of the region encoding the protein was amplified by PCR based on a known sequence (GenBank accession number X87767). In the PCR,
Oligonucleotides complementary to bases 701 to 672 upstream of the transcription start site of the FcαR gene as sense primers
Using PS-701 (5′-TACAACAAACCCCCATGACACAAGTTTACC-3 ′: SEQ ID NO: 3), as an antisense primer, PR + 230 complementary to nucleotides 230 to 201 bases downstream from the start of transcription
(5'-AAGACACAGGAGGGTGGTCTGTTTGGGGTC-3 ': SEQ ID NO: 4)
Was used. Next, 250 ng of the chromosomal DNA obtained above, 5 pmol of each of the two primers, 1.25 units of LATaq polymerase (manufactured by Takara Shuzo), a mixed solution of 0.4 mM dNTP, 2.5 mM MgCl 2
Then, a PCR reaction solution containing 2.5 μl of 10 × LA PCR buffer II (Takara Shuzo) and a total volume of 25 μl with pure water was prepared. PCR 94
1 minute at 94 ° C, 1 minute at 61 ° C and 7 minutes
Perform 30 amplification reactions consisting of 2 minutes at 2 ° C, and finally
The reaction was stopped by an extension reaction for minutes.
【００３９】前記PCR反応で得られた増幅産物は、QIApr
ep PCR purification kit（キアゲン社製）を用いて精
製し、得られた約48μlの増幅産物を含む溶液のうち4μ
lを直接シーケンス反応に使用した。シーケンス反応に
は、FcαR遺伝子の転写開始点上流４５０〜４３０塩基
に相補的なPS-450M（5'-TCGACGCGTAATAGTGCCAGAGAAAATG
CC-3'：配列番号５）、転写開始点上流６２〜４２塩基
に相補的なPS-62M(5'-ATCACGCGTCCAACATAGAAAGACCCCATC
-3'：配列番号６)（相補的な配列を下線で示す）、転写
開始点下流１９７〜１７７塩基に相補的なPR+197X（5'-
CTACTCGAGCGTGCTGACACGGCCTCAGCC-3'：配列番号７）、
転写開始点上流１３４〜１５４塩基に相補的なPR-134
（5'-GATGAGAAACGAATGAGAAGT-3'：配列番号８）及び転
写開始点下流４３０〜４５０塩基に相補的なPR-430（5'
-GGCATTTTCTCTGGCACTATT-3'：配列番号９）等のプライ
マーを用いた。また、シーケンス反応は、ABI PRISM Dy
e Termination Cycle Sequencing Ready Reaction kit
（パーキンエルマー・アプライドバイオシステム社製）
を用いたサイクルシークエンス法によって行い、ABIPRI
SM 310 DNA シークエンサー（パーキンエルマー・アプ
ライドバイオシステム社製）等の蛍光シークエンサーに
よって塩基配列を決定した。The amplification product obtained by the above PCR reaction is QIApr
Purified using ep PCR purification kit (manufactured by Qiagen), 4 μl of the obtained solution containing about 48 μl of the amplification product was used.
l was used directly in the sequencing reaction. In the sequencing reaction, PS-450M (5′-TCGACGCGT AATAGTGCCAGAGAAAATG) which is complementary to 450 to 430 bases upstream of the transcription start site of the FcαR gene was used.
CC- 3 ': SEQ ID NO: 5), PS-62M (5'-ATCACGCGT CCAACATAGAAAGACCCCATC complementary to 62 to 42 bases upstream of the transcription start site
-3 ': SEQ ID NO: 6) (complementary sequence is underlined), PR + 197X complementary to 197 to 177 bases downstream of the transcription start point (5'-
CTACTCGAG CGTGCTGACACGGCCTCAGCC -3 ': SEQ ID NO: 7),
PR-134 complementary to bases 134 to 154 upstream of the transcription start site
(5′-GATGAGAAACGAATGAGAAGT-3 ′: SEQ ID NO: 8) and PR-430 (5 ′) complementary to 430 to 450 bases downstream of the transcription start site.
Primers such as -GGCATTTTCTCTGGCACTATT-3 ': SEQ ID NO: 9) were used. In addition, the sequence reaction was performed using ABI PRISM Dy
e Termination Cycle Sequencing Ready Reaction kit
(PerkinElmer Applied Biosystems)
Performed by the cycle sequence method using
The nucleotide sequence was determined using a fluorescent sequencer such as SM 310 DNA Sequencer (manufactured by PerkinElmer Applied Biosystems).
【００４０】実施例２ （遺伝子型の決定）FcαR遺伝子の転写開始点上流１１
４番目の塩基及び下流５６番目の塩基がCまたはTのいず
れであるかの決定を行うため、以下の実験を行った。 Example 2 (Determination of genotype) Upstream of transcription start site 11 of FcαR gene
The following experiment was performed to determine whether the fourth base and the 56th base downstream were C or T.
【００４１】実施例１で得た染色体DNAからPCRによって
FcαR遺伝子上流域及びFcαRをコードする領域を含む９
３１塩基対のDNA断片を増幅した。ここで、プライマー
は、FcαR遺伝子上流域に相補的な配列を有する５’プ
ライマーとして、転写開始点上流７０１〜６７２塩基に
相補的なPS-701（5'-TACAACAAACCCCCATGACACAAGTTTACC-
3'：配列番号３）を、FcαRコード領域に相補的な配列
を有する３’プライマーとして、転写開始点下流２３０
〜２０１塩基に相補的なPR+230（5'-AAGACACAGGAGGGTGG
TCTGTTTGGGGTC-3'：配列番号４）を用いた。From the chromosomal DNA obtained in Example 1 by PCR
9 including upstream region of FcαR gene and region encoding FcαR
A 31 base pair DNA fragment was amplified. Here, the primer is a 5 'primer having a sequence complementary to the upstream region of the FcαR gene, and a PS-701 (5'-TACAACAAACCCCCATGACACAAGTTTACC-
3 ′: SEQ ID NO: 3) was used as a 3 ′ primer having a sequence complementary to the FcαR coding region,
PR + 230 (5'-AAGACACAGGAGGGTGG) complementary to ~ 201 bases
TCTGTTTGGGGTC-3 ': SEQ ID NO: 4) was used.
【００４２】最初のPCRにおいては、染色体DNA 250ng、
前記プライマー各々5pmol、LATaqポリメラーゼ（宝酒造
社製）1.25ユニット、0.4mM dNTP混合液、2.5mM MgCl2
及び10×LA PCR緩衝液II（宝酒造社製）2.5μlを含み純
水で全量を25μlとしたPCR反応液を準備した。PCRは94
℃で１分間の解離反応後、94℃で20秒間の解離反応、61
℃で1分間の会合反応及び72℃で2分間伸長反応からなる
増幅反応を30回行い、最後に72℃で10分間の伸長反応に
より反応を停止した。前記PCR反応で得られた増幅産物
は、QIAprep PCR purification kit（キアゲン社製）を
用いて精製後、蒸留水で50分の1に希釈した。In the first PCR, 250 ng of chromosomal DNA,
5 pmol of each of the above primers, 1.25 units of LATaq polymerase (Takara Shuzo), 0.4 mM dNTP mixture, 2.5 mM MgCl 2
Then, a PCR reaction solution containing 2.5 μl of 10 × LA PCR buffer II (Takara Shuzo) and a total volume of 25 μl with pure water was prepared. PCR 94
C. for 1 minute at 94.degree. C., 20 seconds at 94.degree.
An amplification reaction consisting of an association reaction at 1 ° C. for 1 minute and an extension reaction at 72 ° C. for 2 minutes was performed 30 times, and finally the reaction was stopped by an extension reaction at 72 ° C. for 10 minutes. The amplification product obtained by the PCR reaction was purified using a QIAprep PCR purification kit (manufactured by QIAGEN), and then diluted to 1/50 with distilled water.
【００４３】前記PCRで得られた増幅産物を鋳型とし
て、FcαR遺伝子の転写開始点上流１１４塩基及び下流
５６塩基の遺伝的多型（以下、それぞれを-114C/T多型
及び+56C/T多型と示す）について遺伝子型の決定を行っ
た。遺伝子型の決定には、ミスマッチ塩基を含むプライ
マーを用いて再度PCRを行った。なお、ミスマッチ・プ
ライマーとは、鋳型となるDNA配列の相補的な塩基配列
と比較して、その塩基配列が完全に一致せず、好ましく
は１〜１０塩基、より好ましくは１〜３塩基が異なって
いるオリゴヌクレオチドプライマーを指す。ここで用い
たミスマッチ・プライマーは、各々の遺伝的多型におい
て一方の対立遺伝子に由来する増幅産物のみが特定の制
限酵素により認識されるようにデザインされたプライマ
ーであり、逆方向のプライマーとしては転写開始点下流
８６〜５７塩基に相補的でかつミスマッチを有するプラ
イマーPR+56/C（5'-TCAGGGAATTTCCACATCTATTGCCTtgCA-
3'：配列番号１０）（ミスマッチ塩基を小文字で示す）
を、正方向のプライマーとしては転写開始上流２１〜１
塩基に相補的なプライマーPS-21M(5'-GACACGCGTTATATAT
GTCTTCTCTTGGGC-3'：配列番号１１)（相補的な塩基配列
を下線で示す）を使用してPCRを行った。Using the amplification product obtained by the PCR as a template, a genetic polymorphism of 114 bases upstream and 56 bases downstream of the transcription start site of the FcαR gene (hereinafter referred to as -114C / T polymorphism and + 56C / T polymorphism, respectively) Genotype). To determine the genotype, PCR was performed again using a primer containing a mismatched base. The mismatched primer differs from the complementary base sequence of the template DNA sequence in that its base sequence does not completely match, and preferably differs from 1 to 10 bases, more preferably 1 to 3 bases. Oligonucleotide primer. The mismatch primer used here is a primer designed so that only an amplification product derived from one allele in each genetic polymorphism is recognized by a specific restriction enzyme. Primer PR + 56 / C (5'-TCAGGGAATTTCCACATCTATTGCCTtgCA-) complementary to and having a mismatch with 86 to 57 bases downstream of the transcription start site
3 ': SEQ ID NO: 10) (The mismatched base is shown in lower case)
Are used as primers in the forward direction,
Primer PS-21M (5'-GACACGCGT TATATAT) complementary to base
PCR was performed using GTCTTCTCTTGGGC- 3 ′: SEQ ID NO: 11) (complementary nucleotide sequence is underlined).
【００４４】PCR反応液として、前記希釈PCR増幅産物0.
6μl、前記プライマー各々10pmol、AmpliTaqGoldポリメ
ラーゼ（パーキンエルマー・アプライドバイオシステム
社製）1ユニット、0.2mM dNTP混合液、10×PCR緩衝液
（パーキンエルマー・アプライドバイオシステム社製）
3μlを含み、純水で全量を30μlとしたものを準備し
た。PCR反応は94℃で9分間の解離反応後、94℃で1分間
の解離反応、55℃で40秒間の会合反応及び72℃で20秒間
の伸長反応からなる増幅反応を30回行い、最後に72℃で
10分間の伸長反応により反応を停止した。前記PCR反応
で得られた増幅産物は、QIAprep PCR purification kit
（キアゲン社製）を用いて精製し、塩基配列GCNGCを認
識する制限酵素Fnu4HIを用いて処理した場合、PR+56/C
をプライマーとして用いたPCRの増幅産物は、+56Cの対
立遺伝子に由来するものは前記制限酵素によって切断さ
れるが、+56Tに由来するものは切断されなかった(図２
A)。各レーンのサンプルは以下のとおりである。 レーン１及び７：分子量マーカー（φX174/HinfI） レーン２：転写開始点下流５６番目の塩基がＣであるホ
モ接合健常人 レーン３〜５：転写開始点下流５６番目の塩基がＴ及び
Ｃであるヘテロ接合健常人 レーン６：転写開始点下流５６番目の塩基がＴであるホ
モ接合健常人。As a PCR reaction solution, the diluted PCR amplification product
6 μl, 10 pmol of each of the above primers, 1 unit of AmpliTaqGold polymerase (manufactured by PerkinElmer Applied Biosystems), 0.2 mM dNTP mixture, 10 × PCR buffer (manufactured by PerkinElmer Applied Biosystems)
A solution containing 3 μl and made up to 30 μl with pure water was prepared. After a 9-minute dissociation reaction at 94 ° C, the PCR reaction was performed 30 times with an amplification reaction consisting of a dissociation reaction at 94 ° C for 1 minute, an association reaction at 55 ° C for 40 seconds, and an extension reaction at 72 ° C for 20 seconds. At 72 ° C
The reaction was stopped by an extension reaction for 10 minutes. The amplification product obtained by the PCR reaction is a QIAprep PCR purification kit
(Qiagen) and treated with a restriction enzyme Fnu4HI that recognizes the base sequence GCNGC, PR + 56 / C
The amplification product of PCR using as a primer was cleaved by the restriction enzyme when it was derived from the + 56C allele, but not when it was derived from + 56T (FIG. 2).
A). The samples in each lane are as follows. Lanes 1 and 7: Molecular weight marker (φX174 / HinfI) Lane 2: Homozygous healthy person whose base 56 at the downstream of the transcription start point is C Lane 3 to 5: T and C at the 56th base downstream of the transcription start point Heterozygous healthy individuals Lane 6: Homozygous healthy individuals in which the 56th base downstream of the transcription start point is T.
【００４５】同様に、-114C/T多型の場合は、正方向の
プライマーとして転写開始点上流１３９〜１１５塩基に
相補的でかつミスマッチ塩基を有するPS-114/C（5'-CTC
ATCTGAAACATAAATAGAtgTA-3'：配列番号１２）（ミスマ
ッチ塩基を小文字で示す）を用い、逆向きプライマーと
して転写開始点下流３〜上流２７塩基に相補的なPR+3
(5'-GGAGCCCAAGAGAAGACATATATATGTATA-3'：配列番号１
３)を用いてPCRを行った。前記PCRで得られた増幅産物
を、塩基配列GTACを認識する制限酵素AfaIを用いて処理
した場合、PS-114/Cをプライマーとして用いたPCRの増
幅産物は、-114Cの対立遺伝子に由来するものは前記酵
素によって切断されるが、-114Tに由来するものは切断
されなかった(図２B)。各レーンのサンプルは以下のと
おりである。 レーン１及び７：分子量マーカー（φX174/HinfI） レーン２：転写開始点上流１１４番目の塩基がＣである
ホモ接合体健常人 レーン３〜５：転写開始点上流１１４番目の塩基がＴ及
びＣであるヘテロ接合体健常人 レーン６：転写開始点上流１１４番目の塩基がＴである
ホモ接合体健常人実施例３ （FcαRプロモーター遺伝子及びルシフェラーゼ遺伝子
を含むプラスミドの構築）まず、以下の実験に必要なプ
ラスミドの構築を行った。すなわち、シミアンウイルス
４０アーリープロモーター(simian virus40 early prom
oter)の下流にホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子が挿
入されたpGL3-promoter（プロメガ社製）を制限酵素Bgl
II及びHindIIIで切断し、切断面をKlenow酵素で平滑末
端とした後、自己連結（セルフライゲーション）を行
い、シミアンウイルス４０アーリープロモーター(simia
n virus40 early promoter)部分を除いたベクターpGL3-
dBHを構築した。Similarly, in the case of the −114C / T polymorphism, PS-114 / C (5′-CTC) complementary to the 139 to 115 bases upstream of the transcription start site and having a mismatched base as a forward primer
ATCTGAAACATAAATAGAtgTA-3 ': SEQ ID NO: 12 (mismatched base is shown in lower case), and PR + 3 complementary to 3 to 27 bases downstream from the transcription start site as a reverse primer as a reverse primer
(5'-GGAGCCCAAGAGAAGACATATATATGTATA-3 ': SEQ ID NO: 1
PCR was performed using 3). When the amplification product obtained by the PCR is treated with the restriction enzyme AfaI that recognizes the nucleotide sequence GTAC, the amplification product of the PCR using PS-114 / C as a primer is derived from the -114C allele. Those were cleaved by the enzyme, but those derived from -114T were not cleaved (FIG. 2B). The samples in each lane are as follows. Lanes 1 and 7: molecular weight marker (φX174 / HinfI) Lane 2: homozygous healthy subject whose 114th base upstream of transcription start point is C Lanes 3 to 5: 114th base upstream of transcription start point are T and C Certain healthy heterozygotes Lane 6: Homozygous healthy subjects in which the 114th base upstream of the transcription start site is T Example 3 (Construction of plasmid containing FcαR promoter gene and luciferase gene) First, necessary for the following experiments Plasmid construction was performed. That is, Simian virus 40 early promoter
oter) downstream of the firefly-derived luciferase gene inserted pGL3-promoter (Promega) into the restriction enzyme Bgl
After cleavage with II and HindIII, the cut surface was blunt-ended with Klenow enzyme, self-ligation (self ligation) was performed, and Simian virus 40 early promoter (simia
vector pGL3- excluding n virus40 early promoter)
A dBH was constructed.
【００４６】次にU937細胞由来のゲノムDNAよりヒトFc
αR遺伝子の５’フランキング領域929bpをPCRを用いて
増幅し単離した。PCR反応は、染色体DNA 500ng、プライ
マー各々10pmol、LATaqポリメラーゼ（宝酒造社製）2.5
ユニット、0.4mM dNTP混合液、2.5mM MgCl2及び10×LA
PCR緩衝液II（宝酒造社製）5μlを含み純水で全量を50
μlとしたPCR反応液を、１分間の解離反応後、94℃で20
秒間、52℃で1分間及び72℃で2分間からなる増幅反応を
30回行い、最後に72℃で10分間の伸長反応により反応を
停止した。プライマーは５’側がPS-732M(5'-TCGACGCGT
AAGCTTATTACCTAGGTGATG-3'：配列番号１４)（下線部はM
luI認識部位）及び３’側がPR+197X(5'-CTACTCGAGCGTGC
TGACACGGCCTCAGCC-3'：配列番号７)（下線部はXhoI認識
部位）を用いた。前記ＰＣＲによって増幅された産物は
制限酵素MluI及びXhoIで切断してアガロースゲルで分離
した後、上記のベクターｐGL3-dBHのMluI及びXhoIサイ
トにクローニングした。完成したプラスミドベクターを
pGL-732とした。Next, human genomic DNA derived from U937 cells was
The 929 bp 5 ′ flanking region of the αR gene was amplified and isolated using PCR. The PCR reaction was performed using 500 ng of chromosomal DNA, 10 pmol each of primers, LATaq polymerase (Takara Shuzo) 2.5
Unit, 0.4 mM dNTP mixture, 2.5 mM MgCl 2 and 10 × LA
Including 5 μl of PCR buffer II (Takara Shuzo), make up to 50
After dissociation reaction for 1 minute,
Amplification reaction consisting of 1 minute at 52 ° C and 2 minutes at 72 ° C.
The reaction was performed 30 times, and finally the reaction was stopped by an extension reaction at 72 ° C. for 10 minutes. The primer is PS-732M (5'-TCG ACGCGT
AAGCTTATTACCTAGGTGATG-3 ': SEQ ID NO: 14)
luI recognition site) and 3 'side are PR + 197X (5'-CTA CTCGAG CGTGC
TGACACGGCCTCAGCC-3 ': SEQ ID NO: 7) (XhoI recognition site is underlined). The product amplified by the PCR was cleaved with restriction enzymes MluI and XhoI, separated on an agarose gel, and cloned into the MluI and XhoI sites of the vector pGL3-dBH. Completed plasmid vector
It was pGL-732.
【００４７】次に、FcαR遺伝子の転写開始点上流450b
p、272bp、62bp及び59bpより上流を欠失した変異体、及
び下流58bpより下流を欠失した変異体を上記ｐGL-732ベ
クターをテンプレートとしてそれぞれPCRにより増幅し
た。プライマーはそれぞれの変異体を増幅するに適当な
プライマーを用い、５’側のプライマーにはそれぞれMl
uI認識配列を、また３’側のプライマーにはそれぞれXh
oI認識配列を付加したプライマーを用いた。得られた増
幅産物はｐGL3-dBHのMluI及びXhoIサイトにクローニン
グした。完成したベクターはそれぞれ、ｐGL-450、ｐGL
-272、ｐGL-62、ｐGL+59、ｐGL-732/+58とした。Next, 450b upstream of the transcription start site of the FcαR gene
Mutants deleted at p, 272 bp, 62 bp and 59 bp, and mutants deleted at 58 bp downstream were amplified by PCR using the above pGL-732 vector as a template. As the primers, primers suitable for amplifying each mutant were used, and the 5 '
uI recognition sequence and 3 '
A primer to which an oI recognition sequence was added was used. The obtained amplification product was cloned into the MluI and XhoI sites of pGL3-dBH. The completed vectors are pGL-450 and pGL, respectively.
-272, pGL-62, pGL + 59, and pGL-732 / + 58.
【００４８】また、ラウスサルコーマウイルス(Rous sa
rcoma virus:RSV)プロモーターとホタル由来ルシフェラ
ーゼを有するベクターｐGL-RSVを構築した。まず、RSV
ロングターミナルリピートプロモーター(RSV long-term
inal repeat promoter)を含むNheI-NsiI断片をpBK-RSV
ファージミドベクター(ストラタジーン社製)から切りだ
した後平滑末端とし、ｐGL3-ｄBHベクターのSmaI部位に
連結した。コントロールベクターとして、SV40アーリー
プロモーター下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子が連結
され、かつ、さらにその下流にSV40エンハンサーが挿入
されたｐGL3-controlを用いた(プロメガ社製)。Further, the Rous sarcoma virus (Rous sa
rcoma virus (RSV) promoter and firefly-derived luciferase vector pGL-RSV was constructed. First, RSV
Long terminal repeat promoter (RSV long-term
The NheI-NsiI fragment containing the (inal repeat promoter) was converted to pBK-RSV
After excising from a phagemid vector (Stratagene), it was blunt-ended and ligated to the SmaI site of the pGL3-dBH vector. As a control vector, pGL3-control in which the firefly luciferase gene was ligated downstream of the SV40 early promoter and further inserted with the SV40 enhancer downstream thereof was used (manufactured by Promega).
【００４９】FcαR遺伝子の転写開始点上流１１４番目
及び下流５６番目の塩基（T）を含むプロモーター領域
を増幅するため、上記のプライマーPS-701及びPR+230を
用いてPCRを行った。前記PCRによって得られた増幅産物
を希釈し、これを鋳型としてPS-450M及びPR+197Xプライ
マーを用いてPCRを行い、FcαR遺伝子の転写開始点上流
４５０番目から下流１９７番目のプロモーターを含む領
域を増幅した。得られた増幅産物はMluI及びXhoIで切断
した後、ｐGL3-ｄBHベクターにサブクローニングし、ｐ
GL-114T+56T-450ベクターを完成した。挿入されたDNA断
片はシークエンスによって配列を確認した。In order to amplify the promoter region containing the 114th base and 56th base (T) upstream and downstream of the transcription start point of the FcαR gene, PCR was carried out using the above primers PS-701 and PR + 230. Dilute the amplification product obtained by the PCR, perform PCR using the PS-450M and PR + 197X primers as a template, the region containing the 197-th downstream promoter from the 450-th upstream transcription start point of the FcαR gene. Amplified. The obtained amplification product was digested with MluI and XhoI, subcloned into a pGL3-dBH vector, and
The GL-114T + 56T-450 vector was completed. The sequence of the inserted DNA fragment was confirmed by sequencing.
【００５０】実施例４ （作製したベクターの培養細胞への導入）U937及びHela
細胞は、非動化済み10％(v/v)子牛血清（Gibco-BRL社
製）、２ｍMＬ-グルタミン、100units/mlペニシリン及
び100μg/mlストレプトマイシンを含むRPMI1640培地を
用いて37℃、5％CO2存在化で培養した。 Example 4 (Introduction of the prepared vector into cultured cells) U937 and Hela
Cells were cultured at 37 ° C., 5% using RPMI1640 medium containing 10% (v / v) calf serum (immobilized by Gibco-BRL), 2 mM L-glutamine, 100 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin. Culture was performed in the presence of CO 2 .
【００５１】実施例１で作製したベクターの細胞への導
入はスーパーフェクトトランスフェクションリージェン
ト(Superfect transfection reagent：キアゲン社製)を
用いて通常の方法で行った。すなわち、4mlの培地を加
えた60mmディッシュにU937細胞2.5×106個を培養し、20
μlのスーパーフェクトトランスフェクションリージェ
ントを用いて5μgの前記ベクターを細胞に導入した。He
la細胞は6穴プレートに1.7×105個/1穴ずつ培養したも
のを、前記ベクターを細胞に導入する前日に準備し、10
μlのスーパーフェクトトランスフェクションリージェ
ントを用いて2μgのDNAを細胞に導入した。その後、細
胞をPBSで洗浄し、上記の培地で培養した。DNAの細胞へ
の導入を行ったサンプル間のノーマライズのため、サイ
トメガロウイルス(cytomegalovirus:CMV)イミディエイ
トアーリープロモーター（immediate early promoter）
の下流にRenillaルシフェラーゼ遺伝子を連結したｐRV-
CMVプラスミド（プロメガ社製）を、導入した全DNAの10
％または1％にあたる量をU937細胞またはHela細胞に導
入した。The introduction of the vector prepared in Example 1 into cells was carried out by a usual method using Superfect transfection reagent (manufactured by Qiagen). That is, 2.5 × 10 6 U937 cells were cultured in a 60 mm dish to which 4 ml of medium was added, and 20
5 μg of the vector was introduced into the cells using μl of Superfect Transfection Reagent. He
La cells were prepared by culturing 1.7 × 10 5 cells / well in a 6-well plate on the day before introducing the vector into the cells.
2 μg of DNA was introduced into the cells using μl of Superfect Transfection Reagent. Thereafter, the cells were washed with PBS and cultured in the above medium. Cytomegalovirus (CMV) immediate early promoter for normalization between samples in which DNA has been introduced into cells
PRV- linked to Renilla luciferase gene downstream of
The CMV plasmid (Promega) was used for 10
% Or 1% was introduced into U937 cells or Hela cells.
【００５２】上記の細胞はベクターの導入から24時間後
に回収し、Dual-Luciferase reporter assay system(プ
ロメガ社製)を用いてルミノメーター（LumatLB9501,ber
thold,Wildbad,Germany）によりホタル及びRenillaのル
シフェラーゼ活性を測定した。統計処理はスチューデン
トのｔ検定（P<0.05）により行った。得られた結果を図
３に示す。U937細胞において、ｐGL-732ベクターのプロ
モーター活性が認められた。The cells described above were collected 24 hours after the introduction of the vector, and luminometer (LumatLB9501, ber) was obtained using a Dual-Luciferase reporter assay system (promega).
Firefly and Renilla luciferase activities were measured by thold, Wildbad, Germany. Statistical processing was performed by Student's t-test (P <0.05). FIG. 3 shows the obtained results. In U937 cells, the promoter activity of the pGL-732 vector was observed.
【００５３】また、実施例３において作製した各種ベク
ターについて、ルシフェラーゼ活性の測定を行った。結
果を図４に示す。FcαR遺伝子の転写開始点下流５９番
目〜１９７番目の配列のみを含む場合にプロモーター活
性が得られた。このことからこの領域がFcαR遺伝子の
プロモーターとして機能する最小単位であることが証明
された。The luciferase activity of each of the vectors prepared in Example 3 was measured. FIG. 4 shows the results. Promoter activity was obtained when only the 59th to 197th sequence downstream of the transcription start site of the FcαR gene was included. This proved that this region was the minimum unit functioning as a promoter of the FcαR gene.
【００５４】実施例５ （上記細胞よりRNAの抽出及びRT-PCR）RNAは4〜8×106
個の細胞よりRNA Stat60(Tel-Test,Friendswood,TX)を
用いて抽出した。抽出した全RNA3.5μl、オリゴ(dT)プ
ライマー500ng、dNTPs500ng、10mMヂチオスレイトール
（DTT）及び20units murine Moloney leukemia virus r
everse transcriptase（SuperscriptII RNase H-revers
e transcriptase,Gibco-BRL社製）を用いて、ｃDNAの合
成を行った。PCRは2μlのｃDNA、25pmolセンスプライマ
ー(5'-CTGCTCGAGATGGACCCCAAACAGACCAC-3'：配列番号１
５)、アンチセンスプライマー(5'-CATGGCGGCCGCTTACTTG
CAGACACTTGGTGTTC-3'：配列番号１６)、1.25units Ampl
iTaq Gold polymerase、0.2mM dNTPs及びPCR緩衝液を用
いて、全量が50μlになるように反応液を調製した。PCR
反応は9分の解離反応の後、94℃ 1分、58℃ 1分、72℃
1分を26サイクル行い、最後に72℃ 10分の伸長反応を行
い反応を停止した。PCR増幅産物は1.0％アガロースゲル
により分離した。得られた結果を図５に示す。U937細胞
には内在性のFcαRの発現が見られたのに対し、Hela細
胞には発現は見られなかった。この結果は図３のプロモ
ーター活性の測定結果と一致する。 Example 5 (Extraction of RNA from the above cells and RT-PCR) RNA was 4 to 8 × 10 6
Extracted from individual cells using RNA Stat60 (Tel-Test, Friendswood, TX). 3.5 μl of extracted total RNA, 500 ng of oligo (dT) primer, 500 ng of dNTPs, 10 mM thiothreitol (DTT) and 20 units murine Moloney leukemia virus r
everse transcriptase (SuperscriptII RNase H-revers
cDNA was synthesized using etranscriptase (Gibco-BRL). PCR was performed using 2 μl of cDNA and 25 pmol sense primer (5′-CTGCTCGAGATGGACCCCAAACAGACCAC-3 ′: SEQ ID NO: 1).
5), antisense primer (5'-CATGGCGGCCGCTTACTTG
CAGACACTTGGTGTTC-3 ': SEQ ID NO: 16), 1.25 units Ampl
A reaction solution was prepared using iTaq Gold polymerase, 0.2 mM dNTPs and a PCR buffer so that the total volume was 50 μl. PCR
After 9 minutes of dissociation, 94 ° C for 1 minute, 58 ° C for 1 minute, 72 ° C
26 cycles of 1 minute were performed, and finally an extension reaction was performed at 72 ° C. for 10 minutes to stop the reaction. PCR amplification products were separated on a 1.0% agarose gel. The results obtained are shown in FIG. U937 cells showed endogenous FcαR expression, whereas Hela cells did not. This result is consistent with the measurement result of the promoter activity in FIG.
【００５５】[0055]
【発明の効果】以上説明したように、本発明のプロモー
ター遺伝子及びプロモーター活性測定方法によれば、Fc
αR遺伝子の転写活性の測定が可能となり、FcαR遺伝子
の発現量が関与する疾病、例えばIgA腎症等、の診断及
び前記疾病の原因解明に有用な手段の提供が可能とな
る。また、FcαR遺伝子のプロモーター調節領域及び調
節因子をスクリーニングすることが可能となり、前記疾
病のさらに詳細な診断手段の提供が可能となる。As described above, according to the method for measuring promoter activity and promoter gene of the present invention, Fc
It becomes possible to measure the transcription activity of the αR gene, and it is possible to provide a useful means for diagnosing a disease associated with the expression level of the FcαR gene, for example, IgA nephropathy, and elucidating the cause of the disease. In addition, it becomes possible to screen the promoter regulatory region and the regulatory factor of the FcαR gene, and it is possible to provide a more detailed diagnostic means for the above-mentioned disease.
【００５６】[0056]
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. <120> Promoter gene and method to assay of said promoter activity <130> JP00-0986-XX <140> <141> <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 139 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgaggcaata gatgtggaaa ttccctgacg aggggctctg tcctcatact tcctgcggag 60 cttattgtcg taagaatatc tgtcatcctg ctaatgtgca ttgaaaggag agcaacgggg 120 ctgaggccgt gtcagcacg 139 <210> 2 <211> 317 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gaaatacagg tcttaggcag gaggatttct tgatgccaga agttagagac taccctggcc 60 aacatagaaa gaccccatct ctatttaaaa aaatatacat atatatgtct tctcttgggc 120 tccacccaag agcaacctgg aactaagtta ttcggcaacg aactgttcca ctttgctgtg 180 aggcaataga tgtggaaatt ccctgacgag gggctctgtc ctcatacttc ctgcggagct 240 tattgtcgta agaatatctg tcatcctgct aatgtgcatt gaaaggagag caacggggct 300 gaggccgtgt cagcacg 317 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligo nucleotide <400> 3 tacaacaaac ccccatgaca caagtttacc 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligo nucleotide <400> 4 aagacacagg agggtggtct gtttggggtc 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligo nucleotide <400> 5 tcgacgcgta atagtgccag agaaaatgcc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligo nucleotide <400> 6 atcacgcgtc caacatagaa agaccccatc 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligo nucleotide <400> 7 ctactcgagc gtgctgacac ggcctcagcc 30 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligo nucleotide <400> 8 gatgagaaac gaatgagaag t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligo nucleotide <400> 9 ggcattttct ctggcactat t 21 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligo nucleotide <400> 10 tcagggaatt tccacatcta ttgccttgca 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligo nucleotide <400> 11 gacacgcgtt atatatgtct tctcttgggc 30 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligo nucleotide <400> 12 ctcatctgaa acataaatag atgta 25 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligo nucleotide <400> 13 ggagcccaag agaagacata tatatgtata 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligo nucleotide <400> 14 tcgacgcgta agcttattac ctaggtgatg 30 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligo nucleotide <400> 15 ctgctcgaga tggaccccaa acagaccac 29 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic oligo nucleotide <400> 16 catggcggcc gcttacttgc agacacttgg tgttc 35[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. <120> Promoter gene and method to assay of said promoter activity <130> JP00-0986-XX <140> <141> <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 139 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgaggcaata gatgtggaaa ttccctgacg aggggctctg tcctcatact tcctgcggag 60 cttattgtcg taagaatatc tgtcat <ctgcagg> 120g gtgcagg ag <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gaaatacagg tcttaggcag gaggatttct tgatgccaga agttagagac taccctggcc 60 aacatagaaa gaccccatct ctatttaaaa aaatatacat atatatgtct tctcttgggc 120 tccacccaag agcaacctgg aactaagtta ttcggcaacg aactgttcca ctttgctgtg 180 aggcaataga tgtggaaatt ccctgacgag gggctctgtc ctcatacttc ctgcggagct 240 tattgtcgta agaatatctg tcatcctgct aatgtgcatt gaaaggagag caacggggct 300 gaggccgtgt cagcacg 317 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligo nucleotide <400> 3 tacaacaaac ccccatg aca caagtttacc 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligo nucleotide <400> 4 aagacacagg agggtggtct gtttggggtc 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligo nucleotide <400> 5 tcgacgcgta atagtgccag agaaaatgcc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220 > <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligo nucleotide <400> 6 atcacgcgtc caacatagaa agaccccatc 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligo nucleotide <400> 7 ctactcgagc gtgctgacac ggcctcagcc 30 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligo nucleotide <400> 8 gatgagaaac gaatgagaag t 21 <210 > 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligo nucleotide <400> 9 ggcattttct ctggcactat t 21 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligo nucleotide <400> 10 tcagggaatt tccacatcta ttgccttgca 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligo nucleotide <400> 11 gacacgcgtt atatatgtct tctcttgggc 30 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence < 220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligo nucleotide <400> 12 ctcatctgaa acataaatag atgta 25 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligo nucleotide <400> 13 ggagcccaag agaagacata tatatgtata 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligo nucleotide <400> 14 tcgacgcgta agcttattac ctaggtgatg 30 < 210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic o ligo nucleotide <400> 15 ctgctcgaga tggaccccaa acagaccac 29 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligo nucleotide <400> 16 catggcggcc gcttacttgc agacacttgg tgttc 35
【図１】FcαR遺伝子のプロモーター遺伝子を含む５’
フランキング領域の塩基配列を示す図である。FIG. 1. 5 ′ containing the promoter gene of FcαR gene
It is a figure which shows the base sequence of a flanking region.
【図２】（A）は、FcαR遺伝子の転写開始点下流５６番
目の遺伝的多型をRFLP法で検出した際の電気泳動写真で
ある。（B）は、FcαR遺伝子の転写開始点上流１１４番
目の遺伝的多型をRFLP法で検出した際の電気泳動写真で
ある。FIG. 2 (A) is an electrophoresis photograph when the genetic polymorphism at the 56th position downstream of the transcription start site of the FcαR gene is detected by the RFLP method. (B) is an electrophoretic photograph when the 114th genetic polymorphism upstream of the transcription start site of the FcαR gene is detected by the RFLP method.
【図３】U937細胞及びHela細胞に導入されたｐGL-732の
ルシフェラーゼ活性を測定したグラフである。FIG. 3 is a graph showing the measured luciferase activity of pGL-732 introduced into U937 cells and Hela cells.
【図４】FcαR遺伝子のプロモーター領域の塩基配列の
長さを変化させることによりプロモーター活性の変化を
調べたルシフェラーゼ活性測定の結果を示すグラフであ
る。FIG. 4 is a graph showing the results of luciferase activity measurement in which the change in promoter activity was examined by changing the length of the base sequence of the promoter region of the FcαR gene.
【図５】U937細胞及びHela細胞を用いてFcαRの発現量
を調べたRT-PCRの結果を示す電気泳動写真である。FIG. 5 is an electrophoretic photograph showing the results of RT-PCR in which the expression level of FcαR was examined using U937 cells and Hela cells.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 柘植 俊直 神奈川県鎌倉市雪の下１−２−30−104 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA20 DA03 EA04 FA02 GA11 GA18 HA09 4B063 QA05 QA08 QQ48 QQ49 QQ79 QR33 QR40 QR77 QR80 QS38 QX02 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC14 AC16 BA02 BC01 BD50 CA44 CA46 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) // (C12N 5/10 C12N 5/00 B C12R 1:91) C12R 1:91) (72) Inventor Toshinao Tsuge 1-2-30-104 Yukishita, Kamakura City, Kanagawa Prefecture F-term (reference) 4B024 AA11 AA20 CA01 CA20 DA03 EA04 FA02 GA11 GA18 HA09 4B063 QA05 QA08 QQ48 QQ49 QQ79 QR33 QR40 QR77 QR80 QS38 QX02 4B065 AA93X AAY AC93 BD50 CA44 CA46
Claims (8)
からなるＤＮＡであることを特徴とするプロモーター遺
伝子。1. A promoter gene comprising a DNA comprising the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
を含むＤＮＡであることを特徴とするプロモーター遺伝
子。2. A promoter gene comprising a DNA comprising the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
からなるＤＮＡであることを特徴とするプロモーター遺
伝子。3. A promoter gene which is a DNA comprising the DNA sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
に記載のＤＮＡ配列からなるＤＮＡとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を
有するＤＮＡであることを特徴とするプロモーター遺伝
子。4. A promoter gene which is a DNA which hybridizes with a DNA consisting of the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 under stringent conditions and has promoter activity. .
に記載のＤＮＡ配列を含むプロモーター遺伝子の下流に
レポーター遺伝子を連結したレポータープラスミドを作
製する工程と、前記レポータープラスミドを培養細胞に
導入する工程と、前記培養細胞から得た抽出液中に含ま
れる前記レポーター遺伝子産物の活性を測定する工程
と、からなることを特徴とするプロモーター活性測定方
法。5. A step of preparing a reporter plasmid in which a reporter gene is linked downstream of a promoter gene containing a DNA sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing; A method of measuring promoter activity, comprising: introducing the sample; and measuring the activity of the reporter gene product contained in an extract obtained from the cultured cells.
をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項５に
記載のプロモーター活性測定方法。6. The method according to claim 5, wherein the reporter gene is a gene encoding luciferase.
ロモーター活性測定方法を用いて行うことを特徴とする
プロモーター調節領域及びプロモーター調節因子のスク
リーニング方法。7. A method for screening a promoter regulatory region and a promoter regulatory factor, which is performed using the method for measuring promoter activity according to claim 5 or 6.
用いて得られることを特徴とするプロモーター調節領域
及びプロモーター調節因子。A promoter regulatory region and a promoter regulatory factor obtained by using the screening method according to claim 7.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008195673A (en) * | 2007-02-14 | 2008-08-28 | Nippon Meat Packers Inc | Life prolongation-effective substance, and infection-protecting effect and vaccine effect-promoting substance, construct for assaying the above substances, and application of the above substances |
-
2000
- 2000-06-06 JP JP2000169410A patent/JP2001346581A/en active Pending
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