JP2008195673A - Life prolongation-effective substance, and infection-protecting effect and vaccine effect-promoting substance, construct for assaying the above substances, and application of the above substances - Google Patents
Life prolongation-effective substance, and infection-protecting effect and vaccine effect-promoting substance, construct for assaying the above substances, and application of the above substances Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008195673A JP2008195673A JP2007034115A JP2007034115A JP2008195673A JP 2008195673 A JP2008195673 A JP 2008195673A JP 2007034115 A JP2007034115 A JP 2007034115A JP 2007034115 A JP2007034115 A JP 2007034115A JP 2008195673 A JP2008195673 A JP 2008195673A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- substance
- effect
- lactic acid
- gene
- life
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
本発明は、延命効果物質、および感染防御効果・ワクチン効果促進物質、前記物質の検定用コンストラクト、並びにそれらの用途に関する。 The present invention relates to a life-prolonging effect substance, an infection protection effect / vaccine effect promoting substance, a test construct for the substance, and uses thereof.
老化・寿命制御に関するこれまでの研究で、酵母、線虫、ショウジョウバエ等においてはカロリー制限が延命・抗老化を実現するための有効な処理であること、更には、熱や有毒化学薬品などのストレスに対する抵抗性も増強すること、そして、それらのカロリー制限による延命の実現には、ＮＡＤ依存性脱アセチル化酵素活性を有するサーチュイン（Ｓｉｒｔｕｉｎ）であるＳｉｒ２が関与していることが明らかになっている。酵母Ｓｉｒ２の哺乳類ホモログとしてはＳＩＲＴ１〜７が知られており、なかでもＳＩＲＴ１は脂肪動員の増強、神経軸索変性の抑制、β細胞からのインスリン分泌、肝臓での糖新生等の制御に係わり（非特許文献１参照）、その制御を通じて延命を実現しているものと考えられている。
サーチュインを増強あるいは活性化する因子としては、赤ワイン中のポリフェノールであるレスベラトロールをはじめとした植物性ポリフェノール類が知られているに過ぎない（非特許文献２参照）。従って、サーチュイン遺伝子を増強する物質や、該物質を探索するための手段が望まれていた。
In previous studies on aging and lifespan control, caloric restriction is an effective treatment for prolonging life and anti-aging in yeast, nematodes, fruit fly, etc., and stress such as heat and toxic chemicals. It has been clarified that Sir2, a sirtuin having NAD-dependent deacetylase activity, is involved in the realization of life extension by calorie restriction and also the increase in resistance to urine. . SIRT1-7 are known as mammalian homologues of yeast Sir2, among which SIRT1 is involved in the control of enhancement of fat mobilization, suppression of neuronal axonal degeneration, insulin secretion from β cells, gluconeogenesis in the liver ( It is considered that the life extension is realized through the control.
As factors that enhance or activate sirtuins, only plant polyphenols such as resveratrol, which is a polyphenol in red wine, are known (see Non-Patent Document 2). Therefore, a substance that enhances the sirtuin gene and a means for searching for the substance have been desired.
一方、Ｂ細胞のクラススイッチ（ｃｌａｓｓ−ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；ＣＳＲ）に必須の遺伝子であるＡＩＤ（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）遺伝子は、老化に伴いその発現が低下し、同時に抗体レパトアも減少することが報告されている（非特許文献３および４参照）。すなわち、ＡＩＤの減少により高齢者は感染症にかかりやすくなる可能性が示唆され、感染防御におけるＡＩＤ発現が重要なファクターである可能性がある。また、感染防御において最も重要な免疫器官の１つである腸管においてＩｇＡ濃度が上昇すると病原菌などを体外に排除する力が強くなるが、ＩｇＡへの産生にはＡＩＤ活性化による抗体のクラススイッチが必須である。
On the other hand, the AID (Activation-Induced Cytidine Deminase) gene, which is an essential gene for B-cell class-switch recombination (CSR), has been reported to decrease in expression as well as antibody repertoire. (See Non-Patent
ＡＩＤはこのように種々の免疫系疾患治療の為のターゲット因子になりうるものと認識されながら、その制御機構、さらにはその発現・活性を制御するような食品成分に関しては報告されていない。また、タンパク質−核酸複合体がＢ細胞レセプター（Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＢＣＲ）とＴｏｌｌ様レセプター（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）の両方に結合すると、ＢＣＲのみに結合するときよりもＢ細胞の活性化や抗体産生が促進されることが知られている（非特許文献５および６参照）。しかし、特に非タンパク質性抗原に対しては親和性と持続性に優れた中和抗体を誘導することは難しく、そのため有効なワクチンが未開発な例も多かった。そこで、抗体産生応答だけでなくＢ細胞の親和性成熟過程をも活性化することのできる物質、および該物質を探索するための手段が望まれていた。 While it is recognized that AID can be a target factor for the treatment of various immune system diseases as described above, no report has been made on the control mechanism, and also on food ingredients that control its expression and activity. In addition, when a protein-nucleic acid complex binds to both a B cell receptor (BCR) and a Toll-like receptor (TLR), activation of the B cell and It is known that antibody production is promoted (see Non-Patent Documents 5 and 6). However, it is difficult to induce neutralizing antibodies excellent in affinity and persistence particularly for non-protein antigens, and therefore, there are many examples in which an effective vaccine has not been developed. Therefore, a substance capable of activating not only an antibody production response but also an affinity maturation process of B cells and a means for searching for the substance have been desired.
このように、延命・抗老化効果を有する物質や感染防御効果・ワクチン効果を有する物質を選抜することは、機能性食品、医薬品、化粧品の開発につながるものである。しかし、このような因子は従来知られていなかった上に、これらの因子を正確に、短時間で効率よく検定する方法は、従来知られていなかった。 Thus, selecting a substance having a life-prolonging / anti-aging effect or a substance having an infection-protecting effect / vaccine effect leads to the development of functional foods, pharmaceuticals, and cosmetics. However, such factors have not been conventionally known, and a method for accurately and efficiently assaying these factors in a short time has not been known.
本発明の目的は、延命・抗老化効果を有する物質や感染防御効果・ワクチン効果を有する物質、およびこれらの物質を効率的に検定するための手段を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a substance having a life-prolonging / anti-aging effect, a substance having an infection-protecting effect / a vaccine effect, and a means for efficiently assaying these substances.
本発明者らはヒトＳＩＲＴ１（ｈＳＩＲＴ１）のプロモーター領域を取得し、その転写活性化をＧＦＰ蛍光強度で追跡することのできるシステムを構築した。本システムを動物培養細胞に導入し、ｈＳＩＲＴ１プロモーターを活性化しうる乳酸菌群を探索した結果、各種乳酸菌及びビフィズス菌が、ｈＳＩＲＴ１プロモーターを活性化することが明らかとなった。 The present inventors acquired a promoter region of human SIRT1 (hSIRT1), and constructed a system capable of following the transcriptional activation with GFP fluorescence intensity. As a result of introducing this system into cultured animal cells and searching for a group of lactic acid bacteria that can activate the hSIRT1 promoter, it was revealed that various lactic acid bacteria and bifidobacteria activate the hSIRT1 promoter.
また、本発明者らはヒトＡＩＤのプロモーター領域を取得し、その転写活性化をＧＦＰ蛍光強度で追跡することのできるシステムを構築した。本システムを動物培養細胞に導入し、ＡＩＤプロモーターを活性化しうる乳酸菌群を探索した結果、各種乳酸菌が、ＡＩＤプロモーターを活性化することが明らかとなった。本システムを用いることで、感染防御能を有する乳酸菌やワクチン生産への応用が可能な乳酸菌の育種も可能になるものと考えられる。 In addition, the present inventors have obtained a promoter region of human AID and constructed a system that can trace its transcriptional activation with GFP fluorescence intensity. As a result of introducing this system into cultured animal cells and searching for a group of lactic acid bacteria that can activate the AID promoter, it was found that various lactic acid bacteria activate the AID promoter. By using this system, it is considered that breeding of lactic acid bacteria having an ability to prevent infection and lactic acid bacteria that can be applied to vaccine production is also possible.
本発明は、以下の各発明を提供するものである。
〔１〕 サーチュイン遺伝子の活性を増強することを特徴とする延命効果物質。
〔２〕 サーチュイン遺伝子が、ＳＩＲＴ１遺伝子またはＳｉｒ２遺伝子である、〔１〕記載の延命効果物質。
〔３〕 乳酸菌または乳酸菌由来成分である、〔１〕または〔２〕に記載の延命効果物質。
〔４〕 乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである〔３〕に記載の延命効果物質。
〔５〕 〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の延命効果物質を含有する食品、医薬品または化粧品。
〔６〕 サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備えることを特徴とする、延命効果物質検定用コンストラクト。
〔７〕 サーチュイン遺伝子が、ＳＩＲＴ１遺伝子またはＳｉｒ２遺伝子である、〔６〕記載のコンストラクト。
〔８〕 〔６〕または〔７〕に記載のコンストラクトを含む細胞。
〔９〕 〔６〕または〔７〕に記載のコンストラクトまたは〔８〕に記載の細胞を含む、延命効果物質の検定用キット。
〔１０〕 〔８〕に記載の細胞と試料とを接触させ、サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を測定することを特徴とする、延命効果物質の検定方法。
〔１１〕 前記延命効果物質は、乳酸菌または乳酸菌由来成分である〔１０〕に記載の検定方法。
〔１２〕 前記乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである〔１１〕に記載の検定方法。
〔１３〕 ＡＩＤ遺伝子の活性を増強することを特徴とする感染防御効果・ワクチン効果促進物質。
〔１４〕 乳酸菌または乳酸菌由来成分である、〔１３〕に記載の感染防御効果・ワクチン効果促進物質。
〔１５〕 前記乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである〔１４〕に記載の感染防御効果・ワクチン効果促進物質。
〔１６〕 〔１３〕〜〔１５〕のいずれか一項に記載の感染防御効果・ワクチン効果促進物質を含有する食品、医薬品または化粧品。
〔１７〕 ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備えることを特徴とする、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクト。
〔１８〕 〔１７〕に記載のコンストラクトを含む細胞。
〔１９〕 〔１７〕に記載のコンストラクトまたは〔１８〕に記載の細胞を含む、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用キット。
〔２０〕 〔１８〕に記載の細胞と試料とを接触させ、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を測定することを特徴とする、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定方法。
〔２１〕 前記感染防御効果・ワクチン効果促進物質は、乳酸菌または乳酸菌由来成分である〔２０〕に記載の検定方法。
〔２２〕 前記乳酸菌が、ラクトバチルス・アシドフィルスである〔２１〕に記載の検定方法。
The present invention provides the following inventions.
[1] A life-prolonging effect substance characterized by enhancing the activity of a sirtuin gene.
[2] The life-prolonging effect substance according to [1], wherein the sirtuin gene is a SIRT1 gene or a Sir2 gene.
[3] The life-prolonging effect substance according to [1] or [2], which is a lactic acid bacterium or a component derived from lactic acid bacteria.
[4] The life-prolonging effect substance according to [3], wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus acidophilus.
[5] A food, drug or cosmetic containing the life-prolonging effect substance according to any one of [1] to [4].
[6] A life-prolonging effect substance assay construct comprising a polynucleotide having a promoter activity of a sirtuin gene.
[7] The construct according to [6], wherein the sirtuin gene is a SIRT1 gene or a Sir2 gene.
[8] A cell comprising the construct according to [6] or [7].
[9] A kit for assaying a life-prolonging effect substance, comprising the construct according to [6] or [7] or the cell according to [8].
[10] A method for assaying a life-prolonging effect substance, comprising contacting the cell according to [8] with a sample and measuring the promoter activity of a sirtuin gene.
[11] The assay method according to [10], wherein the life-prolonging effect substance is lactic acid bacteria or a component derived from lactic acid bacteria.
[12] The assay method according to [11], wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus acidophilus.
[13] A substance that enhances the activity of the AID gene and promotes infection protection and vaccine effect.
[14] The infection protective effect / vaccine effect promoting substance according to [13], which is a lactic acid bacterium or a lactic acid bacterium-derived component.
[15] The infection protective effect / vaccine effect promoting substance according to [14], wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus acidophilus.
[16] A food, pharmaceutical or cosmetic containing the infection protective effect / vaccine effect promoting substance according to any one of [13] to [15].
[17] A construct for assaying a substance that promotes infection protection and vaccine effects, comprising a polynucleotide having an AID gene promoter activity.
[18] A cell comprising the construct according to [17].
[19] A kit for assaying a substance that promotes infection protection and vaccine effects, comprising the construct according to [17] or the cell according to [18].
[20] A method for assaying a substance that promotes infection protection and vaccine effects, comprising contacting the cell according to [18] with a sample and measuring the promoter activity of the AID gene.
[21] The assay method according to [20], wherein the infection protective effect / vaccine effect promoting substance is a lactic acid bacterium or a component derived from lactic acid bacteria.
[22] The assay method according to [21], wherein the lactic acid bacterium is Lactobacillus acidophilus.
本発明により、延命・抗老化という新たな機能性を有する物質が提供されると共に、該物質を検定し、選抜することができるので、延命を実現する新たな機能性食品の開発に繋げることができる。
また、本発明は、ｈＳＩＲＴ１プロモーターの活性化を通じて延命を実現しうる相互作用の解明、つまり乳酸菌菌体の有する糖鎖・ＤＮＡ等のリガンドとサーチュイン遺伝子を発現する動物細胞上のＴｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒとの間の相互作用の解明に応用することができ、延命を実現しうるスーパーアンチエイジング乳酸菌の探索・創製への応用が期待できる。
According to the present invention, a substance having a new functionality of prolonging life and anti-aging is provided, and the substance can be tested and selected, which can lead to the development of a new functional food that can prolong life. it can.
In addition, the present invention provides an elucidation of an interaction that can prolong life through activation of the hSIRT1 promoter, that is, a ligand such as a sugar chain or DNA possessed by lactic acid bacteria and a Toll like receptor on an animal cell that expresses a sirtuin gene. It can be applied to the elucidation of the interaction between them, and can be expected to be applied to the search and creation of super anti-aging lactic acid bacteria that can prolong life.
更に、本系は、乳酸菌の刺激で活性化されていることから、本系で検索される物質は、中でも、乳酸菌由来物質は、Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒを刺激しうる物質であり、Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒによる抗原提示細胞の活性化を通じた、抗癌作用に働く免疫系の増強が期待されることより、間接的ではあるが、免疫の抗癌作用を高める物質としても期待しうる物質である。 Furthermore, since this system is activated by the stimulation of lactic acid bacteria, among the substances searched for in this system, the lactic acid bacteria-derived substance is a substance that can stimulate Toll like receptor, and antigen by Toll like receptor It is a substance that can be expected as a substance that enhances the anticancer action of immunity indirectly though it is expected to enhance the immune system acting on the anticancer action through activation of the presenting cells.
更に、本発明により、感染防御効果やワクチン効果を促進する物質といった機能性物質が提供されると共に、該物質を検定し、選抜することができるので、感染防御を実現する新規機能性食品の開発や、新規ワクチンの開発に繋げることができる。
また、本発明によれば、ＡＩＤプロモーターの活性化を通じてＡＩＤ活性化メカニズムの解明も可能であり、抗体産生応答の異常とそれに伴う疾病の改善を目的とした創薬の検索への応用も期待される。
Furthermore, the present invention provides a functional substance such as a substance that promotes an infection protection effect and a vaccine effect, and can test and select the substance, so that development of a new functional food that realizes infection protection is possible. And can lead to the development of new vaccines.
In addition, according to the present invention, it is possible to elucidate the mechanism of AID activation through the activation of the AID promoter, and it is expected to be applied to search for drug discovery for the purpose of improving abnormal antibody production responses and associated diseases. The
１．延命効果物質および感染防御効果・ワクチン効果促進物質
本発明は、延命効果物質と、感染防御効果・ワクチン効果促進物質との両者を提供するものである。以下、両発明のそれぞれに特徴的な部分について先に説明し、続いて共通する部分について説明する。
1. The present invention provides both a life-prolonging effect substance and an infection-protecting effect / vaccine effect promoting substance. Hereinafter, the characteristic parts of the two inventions will be described first, and then the common parts will be described.
（延命効果物質）
本発明の延命効果物質は、延命効果、すなわち抗癌作用をはじめとして生物の寿命を延長する効果を発揮する物質であり、サーチュイン遺伝子の活性を増強（活性化）することを特徴とする。サーチュインとは、酵母、線虫、ショウジョウバエの延命に寄与するとされるＮＡＤ依存性脱アセチル化酵素活性を有するＳｉｒ２のホモログを指し、哺乳類ではＳＩＲＴ１〜７を挙げることができる。サーチュイン遺伝子の活性を増強することの確認は、下記の延命効果物質検定用コンストラクトによりそのサーチュイン遺伝子のプロモーター活性を分析して行うことができる。
(Life-prolonging effect substance)
The life-prolonging effect substance of the present invention is a substance that exerts a life-prolonging effect, that is, an effect of prolonging the life of an organism including anticancer action, and is characterized by enhancing (activating) the activity of a sirtuin gene. A sirtuin refers to a homolog of Sir2 having NAD-dependent deacetylase activity that is considered to contribute to the survival of yeast, nematodes, and Drosophila. Examples of mammals include SIRT1-7. Confirmation of enhancing the activity of a sirtuin gene can be performed by analyzing the promoter activity of the sirtuin gene using the following life-prolonging effect substance test construct.
（感染防御効果・ワクチン効果促進物質）
本発明の感染防御効果・ワクチン効果促進物質は、感染防御効果およびワクチン効果のうちいずれかの効果、または両方の効果を発揮する物質であり、ＡＩＤ遺伝子の活性を増強（活性化）することを特徴とする。ＡＩＤ（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）遺伝子とは、Ｂ細胞のクラススイッチ（ｃｌａｓｓ−ｓｗｉｔｃｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ；ＣＳＲ）に必須の遺伝子である。ＡＩＤ遺伝子の活性を増強することの確認は、下記の感染防御効果・ワクチン効果促進物質検定用コンストラクトによりそのＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を分析して行うことができる。
(Infectious protective effect and vaccine effect promoting substance)
The substance for promoting infection defense effect / vaccine effect of the present invention is a substance that exhibits either or both of infection protection effect and vaccine effect, and enhances (activates) the activity of the AID gene. Features. An AID (Activation-Induced Cytidine Deminase) gene is an essential gene for B-cell class switch (class-switch recombination; CSR). Confirmation of enhancing the activity of the AID gene can be carried out by analyzing the promoter activity of the AID gene using the following construct for assaying substances for promoting the prevention of infection and vaccine effect.
本発明の延命効果物質、および感染防御効果・ワクチン効果促進物質としては、乳酸菌や他の菌類・酵母類、他の動植物由来の成分である蛋白質、糖類、核酸、脂質、ポリフェノール、食物繊維、ミネラル、ビタミン等を挙げることができ、特に菌類やその成分が好ましい。菌類としては、乳酸菌を挙げることができる。 The life-prolonging effect substance of the present invention and the infection-protecting effect / vaccine effect promoting substance include lactic acid bacteria, other fungi / yeasts, proteins and sugars, nucleic acids, lipids, polyphenols, dietary fibers, minerals derived from other animals and plants. Vitamins and the like, and fungi and their components are particularly preferred. Examples of fungi include lactic acid bacteria.
乳酸菌は、腸内細菌にも分類されるものが好ましく、例えば、ラクトバチルス属乳酸菌、ビフィドバクテリウム属乳酸菌、ラクトコッカス属乳酸菌、スタフィロコッカス属乳酸菌などを挙げることができる。 Lactic acid bacteria are preferably classified as enteric bacteria, and examples include Lactobacillus lactic acid bacteria, Bifidobacterium lactic acid bacteria, Lactococcus lactic acid bacteria, Staphylococcus lactic acid bacteria, and the like.
ラクトバチルス属乳酸菌としては、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・アミロボルス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ラクティスなどがある。
ビフィドバクテリウム属乳酸菌としては、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガムなどがある。
ラクトコッカス属乳酸菌としては、ラクトコッカス・ラクティスなどがある。
スタフィロコッカス属乳酸菌としては、スタフィロコッカス・サーモフィルスなどがある。
Lactobacillus lactic acid bacteria include Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylobolus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivaius, Lactobacillus casei, Lactobacillus casei There are John Sony and Lactobacillus lactis.
Examples of lactic acid bacteria belonging to the genus Bifidobacterium include Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium addressenses, Bifidobacterium infantis, and Bifidobacterium longum .
Examples of Lactococcus lactic acid bacteria include Lactococcus lactis.
Staphylococcus lactic acid bacteria include Staphylococcus thermophilus.
これらの乳酸菌のうち、後述の実施例に示すように、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ），ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ），ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ），ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）,ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ），ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）,ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、特にラクトバチルス・アシドフィルスは、サーチュイン遺伝子の活性を増強することが確認されている。 Among these lactic acid bacteria, as shown in Examples described later, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus brevis (Lactobacillus brevis), Lactobacillus p , Lactobacillus gasseri, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus casei (Lactobacillus cacti) Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium infantibitis Lactococcus lactis), in particular Lactobacillus acidophilus, has been confirmed to enhance the activity of the sirtuin gene.
また、これらの実施例のうち、後述の実施例に示すように、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ），ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ），ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ），ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ），スタフィロコッカス・サーモフィルス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ），ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、特にラクトバチルス・アシドフィルスは、ＡＩＤ遺伝子を活性化するものであり、感染防御効果・ワクチン効果促進物質として有用である。 In addition, among these examples, as shown in the examples described later, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovorus (Lactobacillus amylovirus), Lactobacillus brevis), Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus lactis s. Staphylococcus thermophilus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolecentis, Bifidobacterium infactifium infection Longifum (Bifidobacterium longum), particularly Lactobacillus acidophilus, activates the AID gene, and is useful as a substance that promotes infection protection and vaccine effects.
本発明の延命効果物質は、各種の食品、化粧品、医薬品等の成分として利用することができ、特に、延命を実現しうる新たな機能性食品として有用である。
また、本発明の感染防御効果・ワクチン効果促進物質も、各種の食品、化粧品、医薬品等の成分として利用することができ、特に、感染防御を実現する新規機能性食品や新規ワクチンの開発に繋げることができる。
The life-prolonging effect substance of the present invention can be used as a component of various foods, cosmetics, pharmaceuticals, and the like, and is particularly useful as a new functional food that can realize life extension.
In addition, the infection-protective effect / vaccine-effect promoting substance of the present invention can also be used as a component of various foods, cosmetics, pharmaceuticals, etc., and in particular, leads to the development of new functional foods and new vaccines that realize infection protection. be able to.
２．延命効果物質および感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定
本発明においては、延命効果物質の検定用コンストラクトと、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトの２つを提供する。以下、両発明のそれぞれに特徴的な部分について先に説明し、続いて共通する部分について説明する。
2. In the present invention, there are provided two constructs, one for constructing a life-prolonging effect substance and the other for constructing a prophylactic effect / vaccine effect promoting substance. Hereinafter, the characteristic parts of the two inventions will be described first, and then the common parts will be described.
（延命効果物質検定用コンストラクト）
本発明の延命効果物質検定用コンストラクトは、サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備える。サーチュイン遺伝子については既に延命効果物質の欄において述べたとおりである。
(Construct for prolonging life-effect substances)
The life-prolonging effect substance test construct of the present invention comprises a polynucleotide having promoter activity of a sirtuin gene. The sirtuin gene has already been described in the column of life-prolonging effect substances.
ｈＳＩＲＴ１遺伝子のプロモーター活性を有するとは、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドのｈＳＩＲＴ１のプロモーター活性の９０％以上、好ましくは９５％以上の活性を有することを意味し、好ましくは実質的に同等以上の活性を有することを意味する。ｈＳＩＲＴ１のプロモーター活性の確認は、ｈＳＩＲＴ１遺伝子の発現が増強または活性化されるかどうかの確認により行うことができる。 Having hSIRT1 gene promoter activity means having an activity of 90% or more, preferably 95% or more of the hSIRT1 promoter activity of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, preferably It means having substantially the same or higher activity. Confirmation of hSIRT1 promoter activity can be performed by confirming whether the expression of hSIRT1 gene is enhanced or activated.
ｈＳＩＲＴ１遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドとしては、配列表の配列番号１記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、好ましくは、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列表の配列番号１記載の塩基配列は、ヒト正常線維芽細胞株ＴＩＧ−１より調製されるｈＳＩＲＴ１遺伝子の上流−１５９３〜−１塩基部分（＋１がｈＳＩＲＴ１遺伝子の翻訳開始点とする。）の領域である。 Examples of the polynucleotide having the promoter activity of the hSIRT1 gene include a polynucleotide comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, preferably a polynucleotide comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is the upstream 1593 to -1 base portion of the hSIRT1 gene prepared from the normal human fibroblast cell line TIG-1 (+1 is the translation start point of the hSIRT1 gene). It is an area.
また、ｈＳＩＲＴ１遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドであれば、配列表の配列番号１記載の塩基配列に改変を加えた塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。例えば、配列番号１に記載の塩基配列と相同性が８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上であるポリヌクレオチドを挙げることができる。
Moreover, as long as it is a polynucleotide which has the promoter activity of hSIRT1 gene, the polynucleotide which has a base sequence which changed the base sequence of
本発明において、サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、ＰＣＲ等により得ることができる。例えば、ｈＳＩＲＴ１遺伝子の場合、配列番号１に記載の塩基配列を増幅するプライマーセットを用いて、ヒト由来の鋳型ゲノムＤＮＡをＰＣＲ等により増幅することにより、配列表の配列番号１記載の塩基配列を得ることができる。一方、配列番号１に記載の塩基配列に基づき設計したプローブを用いて、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることによっても、配列表の配列番号１記載の塩基配列を得ることができる。 In the present invention, the polynucleotide having the promoter activity of the sirtuin gene can be obtained by PCR or the like. For example, in the case of the hSIRT1 gene, by using a primer set that amplifies the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and amplifying human-derived template genomic DNA by PCR or the like, the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is obtained. Obtainable. On the other hand, by screening a human genomic library using a probe designed based on the base sequence described in SEQ ID NO: 1, the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing can be obtained.
（感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクト）
本発明の感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトは、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを備える。ＡＩＤ遺伝子については既に延命効果物質の欄において述べたとおりである。
(Constructs for testing anti-infection and vaccine effect promoting substances)
The construct for assaying a substance that promotes infection protection and vaccine effect according to the present invention comprises a polynucleotide having the promoter activity of the AID gene. The AID gene has already been described in the column of the life-prolonging effect substance.
ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するとは、配列表の配列番号２記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドのＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性の９０％以上の活性を有することを意味し、好ましくは実質的に同等以上の活性を有することを意味する。ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性の確認は、ＡＩＤ遺伝子の発現が増強または活性化されるかどうかの確認により行うことができる。 Having AID gene promoter activity means having an activity of 90% or more of the promoter activity of the AID gene of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, preferably substantially equivalent or higher It means having activity. Confirmation of the promoter activity of the AID gene can be performed by confirming whether the expression of the AID gene is enhanced or activated.
ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドとしては、配列表の配列番号２記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、好ましくは、配列表の配列番号１記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列表の配列番号２記載の塩基配列は、ヒト正常線維芽細胞株ＴＩＧ−１から得られるヒトＡＩＤ遺伝子の上流−５２０〜−１塩基部分（＋１がＡＩＤ遺伝子の翻訳開始点とする。）の領域である。 Examples of the polynucleotide having the AID gene promoter activity include a polynucleotide comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, preferably a polynucleotide comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is the upstream -520 to -1 base portion of the human AID gene obtained from human normal fibroblast cell line TIG-1 (+1 is the translation start point of the AID gene). It is an area.
また、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドであれば、配列表の配列番号２記載の塩基配列に改変を加えた塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。例えば、配列番号２に記載の塩基配列と相同性が８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上であるポリヌクレオチドを挙げることができる。
Moreover, as long as it is a polynucleotide which has the promoter activity of an AID gene, the polynucleotide which has a base sequence which changed the base sequence of
本発明において、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、ＰＣＲ等により得ることができる。例えば、配列番号２に記載の塩基配列を増幅するプライマーセットを用いて、ヒト由来の鋳型ゲノムＤＮＡをＰＣＲ等により増幅することにより、配列表の配列番号２記載の塩基配列を得ることができる。一方、配列番号２に記載の塩基配列に基づき設計したプローブを用いて、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることによっても、配列表の配列番号２記載の塩基配列を得ることができる。 In the present invention, a polynucleotide having AID gene promoter activity can be obtained by PCR or the like. For example, by using a primer set that amplifies the base sequence described in SEQ ID NO: 2 and amplifying human-derived template genomic DNA by PCR or the like, the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing can be obtained. On the other hand, by screening a human genomic library using a probe designed based on the base sequence described in SEQ ID NO: 2, the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing can be obtained.
本発明の延命効果物質検定用コンストラクトと、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトとは、更にリポーター活性を有するポリヌクレオチドなどを含むものであってもよい。リポーター活性を有するポリヌクレオチドを含むことにより、サーチュイン遺伝子のプロモーター活性やＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性の確認を容易に行うことができる。 The construct for prolonging a life-prolonging effect substance of the present invention and the construct for assaying an infectious protective effect / vaccine effect promoting substance may further contain a polynucleotide having reporter activity. By including a polynucleotide having a reporter activity, the promoter activity of the sirtuin gene and the promoter activity of the AID gene can be easily confirmed.
リポーター活性を有するポリヌクレオチドとしては、細胞内において遺伝子発現の指標として使用することのできる公知のリポータータンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。リポータータンパク質としては、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：緑色蛍光タンパク質）をはじめとする各種蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ等を挙げることができる。このうち、本発明においてはＧＦＰが好ましい。 As the polynucleotide having reporter activity, a gene encoding a known reporter protein that can be used as an indicator of gene expression in cells can be used. Examples of the reporter protein include various fluorescent proteins such as GFP (Green Fluorescent Protein), luciferase, alkaline phosphatase and the like. Of these, GFP is preferred in the present invention.
本発明の延命効果物質検定用コンストラクトと、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトの調製は、例えば、ｈＳＩＲＴ１のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを、レポーター活性を有するポリヌクレオチドを含むベクターのレポーターの発現を制御するプロモーターと置換することで行うことができる。このようなベクターとしては、リポータータンパク質がＧＦＰの場合には、ｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクター（ＴａＫａＲａ）を挙げることができる。 Preparation of the life-prolonging effect substance assay construct of the present invention and the construct for assaying an infection protective effect / vaccine effect promoting substance can be carried out, for example, by using a polynucleotide having hSIRT1 promoter activity and a reporter of a vector comprising a polynucleotide having reporter activity Can be performed by substituting a promoter that controls the expression of. An example of such a vector is pEGFP-C3 vector (TaKaRa) when the reporter protein is GFP.
（各コンストラクトを含む細胞）
上記本発明の延命効果物質検定用コンストラクトか、或いは感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトは、細胞に導入して各物質の検索システムとして機能させることができる。
(Cells containing each construct)
The above-mentioned construct for prolonging the life-prolonging effect substance of the present invention or the construct for examining the anti-infection effect / vaccine effect promoting substance can be introduced into cells and function as a search system for each substance.
各コンストラクトの導入先となる宿主細胞としては、ヒトをはじめとする各種生物の細胞を挙げることができ、動物細胞が好ましい。また、細胞の種類には特に限定はない。代表的なものとしては、ヒト子宮頸ガン由来細胞株ＨｅＬａ、ヒト肺ガン由来細胞株Ａ５４９、ヒト大腸ガン由来細胞株ＣａＣｏ−２、ヒト正常線維芽細胞ＴＩＧ−１、ヒトＢ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１、ヒトＢ骨髄腫細胞株Ｕ−２６６、エプスタインバールウイルスにより不死化したヒトＢ細胞株(ＥＢＶ−Ｂ)を挙げることができる。 Examples of host cells into which each construct is introduced include cells of various organisms including humans, and animal cells are preferred. Moreover, there is no limitation in particular in the kind of cell. Representative examples include human cervical cancer-derived cell line HeLa, human lung cancer-derived cell line A549, human colon cancer-derived cell line CaCo-2, human normal fibroblast TIG-1, and human B-cell leukemia cell line BALL. -1, human B myeloma cell line U-266, and human B cell line immortalized with Epstein-Barr virus (EBV-B).
宿主細胞に上記本発明のコンストラクトを取り込ませる方法は、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法などによることができ、市販のトランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）など）やＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｍａｘａ社）等を利用してもよい。 The method of incorporating the construct of the present invention into a host cell can be performed by a lipofection method, an electroporation method, or the like. ) Etc. may be used.
本発明の細胞は、宿主細胞の種類に応じて培地を選択して（例えば、ＨｅＬａの場合にはＤＭＥＭ培地、Ａ５４９の場合にはＥＲＤＦ培地、ＣａＣｏ−２及びＴＩＧ−１の場合にはＭＥＭ培地、ＢＡＬＬ−１及びＵ−２６６の場合にはＲＰＭＩ６４０培地、ＥＢＶ−Ｂの場合にはＥＲＤＦ培地など）、常法により培養することができる。 The cells of the present invention can be selected according to the type of host cell (for example, DMEM medium for HeLa, ERDF medium for A549, MEM medium for CaCo-2 and TIG-1). In the case of BALL-1 and U-266, RPMI640 medium, and in the case of EBV-B, ERDF medium, etc.) can be cultured by a conventional method.
（本発明の検定用キット）
上述の本発明のコンストラクトおよび細胞は、それぞれ、有用物質の検定用キットとして利用することができる。
すなわち、本発明の第１のキットは、延命効果物質の検定用キットであって、上述の延命効果物質検定用コンストラクトまたは該コンストラクトを含む細胞を含むものである。本発明の第２のキットは、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用キットであって、上述の感染防御効果・ワクチン効果促進物質検定用コンストラクトまたは該コンストラクトを含む細胞を含むものである。
各コンストラクト、細胞については、既に述べたとおりである。
(Test kit of the present invention)
The constructs and cells of the present invention described above can be used as kits for assaying useful substances, respectively.
That is, the first kit of the present invention is a kit for assaying a life-prolonging effect substance, and includes the above-described construct for prolonging a proliferative effect substance or a cell containing the construct. A second kit of the present invention is a kit for assaying a substance that promotes infection protection / vaccine effect, and comprises the above-described construct for assaying substance for promoting defense / vaccine effect or a cell containing the construct.
Each construct and cell is as described above.
本発明のキットにおいて、それぞれのコンストラクトを含む場合は、コンストラクトの導入先である宿主細胞や、細胞を導入するための培地、細胞へコンストラクトを取り込ませるための試薬、検体と細胞とを接触させるための培地等を一緒に含めることができる。宿主細胞や培地については既に述べたとおりであり、試薬についても既に述べた細胞の取り込み方法のいずれかの方法において用いる試薬を適宜選択することができる。検体と細胞とを接触させるための培地については、後述する本発明の検出方法の欄において説明するとおりである。
一方、本発明のキットにおいて細胞を含む場合には、検体と細胞とを接触させるための培地を含めることができる。
In the kit of the present invention, when each construct is included, a host cell to which the construct is introduced, a medium for introducing the cell, a reagent for incorporating the construct into the cell, and a specimen and the cell are brought into contact with each other. The medium can be included together. The host cells and culture medium are as described above, and the reagents used in any of the cell uptake methods described above can be selected as appropriate. The medium for contacting the specimen and the cells is as described in the section of the detection method of the present invention described later.
On the other hand, when the kit of the present invention contains cells, a medium for bringing the specimen into contact with the cells can be included.
（本発明の検定方法）
上述の本発明の細胞は、それぞれ、有用物質の検定に用いることができる。
すなわち、本発明の第一の検定方法は、延命効果物質の検定方法であって、延命効果物質検定用コンストラクトを含有する細胞と試料とを接触させ、サーチュイン遺伝子のプロモーター活性を測定することを特徴とする。
本発明の第二の検定方法は、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定方法であって、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定用コンストラクトを含む細胞と試料とを接触させ、ＡＩＤ遺伝子のプロモーター活性を測定することを特徴とする。
(Test method of the present invention)
Each of the above-described cells of the present invention can be used for assay of useful substances.
That is, the first assay method of the present invention is a method for assaying a life-prolonging effect substance, comprising contacting a cell containing a construct for prolonging a pro-life effect substance assay with a sample and measuring the promoter activity of a sirtuin gene. And
A second assay method of the present invention is a method for assaying a substance that promotes infection protection / vaccine effect, comprising contacting a cell containing a construct for assaying a substance for promoting infection protection / vaccine effect with a sample, and The promoter activity is measured.
本発明の２つの検定方法は、細胞と試料とを接触させ、プロモーター活性を測定する点においては共通である。
試料としては、特に限定されるものではないが、例えば、食品成分・生薬成分・医薬品成分・化粧品成分等の天然及び化学合成成分等であれば良く、より具体的には、乳酸菌や他の菌類・酵母類、他の動植物由来の成分である蛋白質、糖類、核酸、脂質、ポリフェノール、食物繊維、ミネラル、ビタミン等を挙げることができ、特に菌類やその成分が好ましい。菌類としては、乳酸菌を挙げることができる。乳酸菌は、腸内細菌にも分類されるものが好ましく、例えば、ラクトバチルス属乳酸菌、ビフィドバクテリウム属乳酸菌、ラクトコッカス属乳酸菌、スタフィロコッカス属乳酸菌などを挙げることができる。各属の乳酸菌の具体例については、上述の延命効果物質および感染防御効果・ワクチン効果促進物質の説明の欄で列挙したとおりである。
The two assay methods of the present invention are common in that the promoter activity is measured by contacting the cell with the sample.
Although it does not specifically limit as a sample, For example, what is necessary is just natural and chemically synthesized components, such as a food ingredient, a crude drug ingredient, a pharmaceutical ingredient, a cosmetic ingredient, etc., More specifically, lactic acid bacteria and other fungi -Proteins, saccharides, nucleic acids, lipids, polyphenols, dietary fibers, minerals, vitamins and the like, which are components derived from yeasts and other animals and plants, can be mentioned, and fungi and their components are particularly preferred. Examples of fungi include lactic acid bacteria. Lactic acid bacteria are preferably classified as enteric bacteria, and examples include Lactobacillus lactic acid bacteria, Bifidobacterium lactic acid bacteria, Lactococcus lactic acid bacteria, Staphylococcus lactic acid bacteria, and the like. Specific examples of the lactic acid bacteria of each genus are as listed in the description of the above-mentioned life-prolonging effect substance and infection protective effect / vaccine effect promoting substance.
試料としての菌類の形態は、生菌体、死菌体、培養上清などが挙げられ、中でも死菌体が好ましい。死菌体は、生菌体を加熱（例えば、６０〜１２０℃で２０分〜１時間程度）、凍結乾燥、アルコール処理等、更には食品用途以外であればホルマリン処理することにより調製され得る。 Examples of the fungal form as a sample include live cells, dead cells, culture supernatant, and the like, and among them dead cells are preferable. Dead cells can be prepared by heating live cells (for example, at 60 to 120 ° C. for about 20 minutes to 1 hour), freeze-drying, alcohol treatment, and the like, and further subjecting to formalin treatment except for food use.
本発明の分析方法においては、まず試料と細胞とを接触させる。試料と細胞との接触は、細胞に対し試料を添加して一定時間静置することにより行うことができる。試料が上記乳酸菌の場合の例を示すと、乳酸菌の加熱死菌体を細胞に対し終濃度０．１〜１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、１２時間〜３日間程度処理を行う。 In the analysis method of the present invention, a sample and cells are first brought into contact with each other. The contact between the sample and the cell can be performed by adding the sample to the cell and allowing to stand for a certain time. In the case where the sample is the above lactic acid bacterium, heat-killed lactic acid bacteria are added to the cells so that the final concentration is 0.1 to 10 μg / ml, and the treatment is performed for about 12 hours to 3 days.
本発明の各検定方法においては、続いてプロモーター活性を測定する。プロモーター活性の測定は、細胞にリポーター活性を有するポリヌクレオチドが含まれている場合には、その発現強度の変化を追跡することにより行うことができる。追跡は、蛍光強度の観察によることができる。蛍光強度は、フローサイトメーターにより測定することができる。 In each assay method of the present invention, the promoter activity is subsequently measured. The measurement of the promoter activity can be performed by tracking the change in the expression intensity when the cell has a polynucleotide having a reporter activity. Tracking can be by observation of fluorescence intensity. The fluorescence intensity can be measured with a flow cytometer.
本発明の第一の検定方法、すなわち、延命効果物質の検定方法により、試料の延命効果を検定することができる。すなわち、試料が延命効果を有するか否かの確認、延命効果の程度の確認などを行うことができるほか、複数ある試料の中から、延命効果を有する物質を選抜することができる。 By the first assay method of the present invention, that is, the assay method of the life-prolonging effect substance, the life-prolonging effect of the sample can be assayed. That is, it is possible to confirm whether or not a sample has a life-prolonging effect, to confirm the degree of the life-prolonging effect, and to select a substance having a life-prolonging effect from a plurality of samples.
例えば、延命効果物質としての各種乳酸菌または乳酸菌由来成分の探索に用いることができる。具体的には、後述の実施例に示すように、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ），ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ），ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ），ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）,ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ），ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）,ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）を延命効果物質として選抜することができ、特にラクトバチルス・アシドフィルスを優れた延命効果物質として選抜することができる。 For example, it can be used for searching for various lactic acid bacteria or components derived from lactic acid bacteria as life-prolonging substances. Specifically, as shown in the examples below, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus critus L Lactobacillus gasseri, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus casei (Lactobacillus bifilcium) Bifidobacterium bifidoum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium lactifacticus L. ) Can be selected as a life-prolonging effect substance, and in particular, Lactobacillus acidophilus can be selected as an excellent life-prolonging effect substance.
本発明の延命効果物質の検定方法によれば、乳酸菌が直接接触をする可能性のある腸管系の細胞株を宿主細胞として用いることで、腸管細胞でのＳＩＲＴ１発現増強と延命実現に対するＳＩＲＴ１の新たな関連が明らかになるとともに、乳酸菌による腸管細胞の機能修飾を通じた延命実現の可能性についても解析を行うことが可能である。 According to the method for assaying a life-prolonging effect substance of the present invention, by using an intestinal cell line that can be directly contacted by lactic acid bacteria as a host cell, a new SIRT1 for realizing increased SIRT1 expression and prolonging life in intestinal cells. As a result, it is possible to analyze the possibility of prolonging life through functional modification of intestinal cells by lactic acid bacteria.
本発明の第二の検定方法、すなわち、感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定方法により、試料の感染防御効果・ワクチン効果（いずれかの効果、または両方の効果）を検定することができる。すなわち、試料が感染防御効果・ワクチン効果を有するか否かの確認、感染防御効果・ワクチン効果の程度の確認などを行うことができるほか、複数ある試料の中から、感染防御効果・ワクチン効果を有する物質を選抜することができる。 According to the second assay method of the present invention, that is, the assay method of the substance that promotes the infection protection effect / vaccine effect, the infection protection effect / vaccine effect (either effect or both effects) of the sample can be assayed. In other words, it is possible to confirm whether or not a sample has an infection protective effect / vaccine effect, to confirm the degree of infection protective effect / vaccine effect, etc. It is possible to select substances that have it.
例えば、感染防御効果・ワクチン効果促進物質としての各種乳酸菌または乳酸菌由来成分の探索に用いることができる。具体的には、後述の実施例に示すように、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ），ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ），ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ），ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ），スタフィロコッカス・サーモフィルス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ），ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ），ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）を感染防御効果・ワクチン効果促進物質として選抜することができ、特にラクトバチルス・アシドフィルスを優れた感染防御効果・ワクチン効果促進物質として選抜することができる。 For example, it can be used for searching for various lactic acid bacteria or components derived from lactic acid bacteria as infection-protecting and vaccine-effect promoting substances. Specifically, as shown in the examples below, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus bile, and Lactobacillus b. Lactobacillus gasseri; Lactobacillus johnsonii; Lactobacillus lactis; Staphylococcus thermophilus, Bifidobacterium bifidum (Bifidobacterium bifidum), Bifidobacterium adolescentis (Bifidobacterium bifidobium) Bifidobacterium longum) can be selected as an infection-protecting effect / vaccine effect promoting substance, and in particular, Lactobacillus acidophilus can be selected as an excellent infection-protecting effect / vaccine effect promoting substance.
本発明の感染防御効果・ワクチン効果促進物質の検定方法によれば、試料の感染防御効果・ワクチン効果促進物質を検定することができる。すなわち、抗体産生応答だけでなくＢ細胞のＣＳＲ過程の活性化及びＢ細胞の親和性成熟過程の活性化が可能であり、非タンパク質性抗原に対しては親和性と持続性に優れた中和抗体を誘導することができる物質、特に乳酸菌を選抜することが可能であり、ワクチンへの応用が可能である。 According to the method for assaying an infection protective effect / vaccine effect promoting substance of the present invention, an infection protective effect / vaccine effect promoting substance of a sample can be assayed. That is, it is possible to activate not only antibody production responses but also B cell CSR processes and B cell affinity maturation processes, and neutralize with excellent affinity and persistence for non-protein antigens. Substances capable of inducing antibodies, particularly lactic acid bacteria, can be selected, and can be applied to vaccines.
実施例１〔ｈＳＩＲＴ１プロモーター転写活性化乳酸菌の同定〕
（１）ｈＳＩＲＴ１プロモーター（ｈＳＩＲＴ１ｐ）の取得
ｈＳＩＲＴ１ｐとして、ＡＴＧ翻訳開始点より−１５９３ｂｐ〜−１ｂｐ（＋１は翻訳開始点を示すものとする。）を、ヒト正常線維芽細胞株ＴＩＧ−１より調製したゲノムＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲにより取得した。ＰＣＲ反応には、宝酒造のＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用い、指定のプロトコールに従って反応を進めた。ＰＣＲの反応液組成は、以下に示すとおりである。ＰＣＲ反応条件は９４℃にて２分間変性を行ったあと、９８℃；２０秒、６８℃；１分を３５サイクルとした。なお、非特異的反応を抑えるために、全ての操作は氷上にて速やかに行った。
Example 1 [Identification of hSIRT1 Promoter Transcription-Activated Lactic Acid Bacteria]
(1) Acquisition of hSIRT1 promoter (hSIRT1p) As hSIRT1p, −1593 bp to −1 bp (+1 indicates the translation start point) from the ATG translation start point was prepared from a human normal fibroblast cell line TIG-1. It was obtained by PCR using genomic DNA as a template. For the PCR reaction, TaKaRa LA Taq (TaKaRa, Shiga, Japan) manufactured by Takara Shuzo was used, and the reaction proceeded according to the designated protocol. The composition of the reaction solution for PCR is as shown below. PCR reaction conditions were denaturation at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 35 cycles of 98 ° C .; 20 seconds, 68 ° C .; 1 minute. In order to suppress non-specific reactions, all operations were performed quickly on ice.
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌水 ２５．９μｌ
１０ｘＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ８μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ ｐｒｉｍｅｒ（５'） １μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ ｐｒｉｍｅｒ（３'） １μｌ
ＴＩＧ−１ゲノムＤＮＡ ３．６μｌ
ＬＡ−Ｔａｑ １μｌ
合 計 ５０μｌ
(PCR reaction solution composition)
Sterile water 25.9 μl
10 × PCR Buffer 5 μl
25 mM MgCl 2 5 μl
2.5
10 μmol / μl primer (5 ′) 1 μl
10 μmol / μl primer (3 ′) 1 μl
3.6 μl of TIG-1 genomic DNA
LA-
50μl total
ＰＣＲに使用したプライマーｈＳＩＲＴｐ−ＡｓｅＩ（Ｆ）およびｈＳＩＲＴｐ−ＮｈｅＩ（Ｒ）のそれぞれの配列は、配列表の配列番号３および４、並びに表１に示した。尚、表１に示す配列中、大文字はｈＳＩＲＴ１プロモーター内の配列を示し、小文字はＰＣＲにより付加するそれぞれの制限酵素認識配列を示し、表２以降に示すプライマー配列においても同じである。ＧＦＰ発現ベクターの構築にはｈＳＩＲＴｐ−ＡｓｅＩ（Ｆ）およびｈＳＩＲＴｐ−ＮｈｅＩ（Ｒ）をそれぞれ用いた。また、すべてのオリゴ合成はニッポンＥＧＴ社（Ｔｏｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）に依頼した。 The sequences of the primers hSIRTp-AseI (F) and hSIRTp-NheI (R) used for PCR are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 and Table 1, respectively. In the sequences shown in Table 1, uppercase letters indicate the sequences in the hSIRT1 promoter, lowercase letters indicate the respective restriction enzyme recognition sequences added by PCR, and the same applies to the primer sequences shown in Table 2 and later. For the construction of the GFP expression vector, hSIRTp-AseI (F) and hSIRTp-NheI (R) were used, respectively. All oligo synthesis was requested from Nippon EGT (Toyama, Japan).
それぞれ反応終了後、１．５％アガロースゲルにて電気泳動を行い、目的のバンドを切り出した後、ゲル抽出を行った。ゲル抽出はプロメガ社のＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ＵＰ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、製品のプロトコールに従って行った。
次に、これらのＰＣＲ産物をＴＡクローニング用のベクターであるｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）へサブクローニングした（ｐＧＥＭ−ｈＳＩＲＴ１ｐ）。
After completion of each reaction, electrophoresis was performed on a 1.5% agarose gel, and the target band was cut out, followed by gel extraction. Gel extraction was performed using Promega's Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System (Promega, Madison, Wis.) According to the product protocol.
Next, these PCR products were subcloned into pGEM-T Easy vector (Promega), a vector for TA cloning (pGEM-hSIRT1p).
（２）点変異の導入
得られたヒトＳＩＲＴ１プロモーター（ｈＳＩＲＴ１ｐ）全長のシークエンスを確認した。その結果３カ所に点変異が確認されたため、部位特異的変異導入法により点変異の修正を行った。
すなわち、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用い、製品付属のプロトコールに従いＰＣＲ法にて修正を行った。ＰＣＲの反応条件は９５℃；３０秒のあと、９５℃；３０秒、５５℃；１分を１２サイクルとした。修正に使用したプライマーｑｕｉｃｈｃｈａｎｇｅ−１４３６、ｑｕｉｃｈｃｈａｎｇｅ−１４０１、ｑｕｉｃｈｃｈａｎｇｅ−１６０のそれぞれの配列は、配列表の配列番号５、６および７、並びに表２に示す。
(2) Introduction of point mutation The sequence of the obtained human SIRT1 promoter (hSIRT1p) was confirmed. As a result, point mutations were confirmed at three locations, and point mutations were corrected by site-directed mutagenesis.
That is, correction was performed by the PCR method using QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, Calif.) According to the protocol attached to the product. PCR reaction conditions were 95 ° C; 30 seconds, then 95 ° C; 30 seconds, 55 ° C; 1 minute was 12 cycles. The sequences of the primers change-1436, change-1401, and change-160 used for the correction are shown in SEQ ID NOs: 5, 6 and 7, and Table 2, respectively.
このＰＣＲ産物に制限酵素ＤｐｎＩを加えて３７℃で１時間処理し、鋳型ＤＮＡの消化を行った。上記サンプル１μｌにつきＳｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ ＸＬ−１−ｂｌｕｅを１００μｌ加えて、氷上にて３０分静置し、４２℃で４５秒間熱処理を行った後、さらに氷上にて２分間静置した。その後、ＳＯＣ培地を４００μｌ加え、２００〜２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。その後、遠心して得られた菌体ペレットをＬＢ（Ａｍｐ+）プレートに播種し、３７℃にて一晩培養した。翌日、適当なコロニーをピックアップし、それぞれシークエンスを確認した。 The restriction enzyme DpnI was added to this PCR product and treated at 37 ° C. for 1 hour to digest the template DNA. 100 μl of Supercompetent cell XL-1-blue was added to 1 μl of the sample, left on ice for 30 minutes, heat-treated at 42 ° C. for 45 seconds, and then left on ice for 2 minutes. Thereafter, 400 μl of SOC medium was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour with shaking at 200 to 250 rpm. Thereafter, the cell pellet obtained by centrifugation was seeded on an LB (Amp + ) plate and cultured at 37 ° C. overnight. On the next day, appropriate colonies were picked up and their respective sequences were confirmed.
（３）ｐＥＧＦＰ−Ｃ３への組換え
上記により点変異を修正したｐＧＥＭ−ｈＳＩＲＴ１ｐから、ＡｓｅＩ／ＮｈｅＩ消化にてプロモーター断片を切り出し、ＡｓｅＩ／ＮｈｅＩ消化によりＣＭＶプロモーターを除去したｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクター（ＴａＫａＲａ）に挿入し、ＧＦＰ発現コンストラクトを構築した（ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ）。ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰのベクターマップを、図１に示した。
(3) Recombination into pEGFP-C3 A pEGFP-C3 vector (TaKaRa) in which a promoter fragment was excised from pGEM-hSIRT1p whose point mutation was corrected as described above by AseI / NheI digestion and the CMV promoter was removed by AsII / NheI digestion And a GFP expression construct was constructed (phSIRT1p-GFP). A vector map of phSIRT1p-GFP is shown in FIG.
（４）ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ安定発現動物細胞の樹立
ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ安定発現動物細胞株の作製には、ヒト子宮頸ガン由来細胞株ＨｅＬａ、ヒト肺ガン由来細胞株Ａ５４９、ヒト大腸ガン由来細胞株ＣａＣｏ−２を用いた。
また、生体の正常組織におけるＳＩＲＴ１制御に対する乳酸菌の効果を検証可能とするために、ヒト正常線維芽細胞（ＴＩＧ−１）を用いた。
各細胞の培養には、ＨｅＬａの場合にはＤＭＥＭ培地、Ａ５４９の場合にはＥＲＤＦ培地、ＣａＣｏ−２及びＴＩＧ−１の場合にはＭＥＭ培地を用いた。
(4) Establishment of animal cells that stably express phSIRT1p-GFP A human cervical cancer-derived cell line HeLa, a human lung cancer-derived cell line A549, a human colon cancer-derived cell line CaCo- 2 was used.
Moreover, in order to be able to verify the effect of lactic acid bacteria on SIRT1 control in normal tissues of the living body, human normal fibroblasts (TIG-1) were used.
For culturing each cell, DMEM medium was used for HeLa, ERDF medium was used for A549, and MEM medium was used for CaCo-2 and TIG-1.
（５）遺伝子導入
上記ｈＳＩＲＴ１ｐ駆動のＧＦＰリポーターベクター（ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ）を、ヒト子宮頸ガン細胞株（ＨｅＬａ）、ヒト肺ガン細胞株（Ａ５４９）及びヒト大腸がん細胞株（Ｃａｃｏ−２）にリポフェクション法により導入した。
すなわち、上記接着系動物細胞へのｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ導入に当たっては、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いた。トランスフェクションの前日に細胞を１ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／１０ｍｌ ｄｉｓｈの細胞密度で準備した。翌日、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰ遺伝子を１０μｇ分(液量８５μｌ)とＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬１５μｌをＯｐｉｔ−ＭＥＭ培地１．４ｍｌで希釈し、室温にて１５分間インキュベートした。この間に、細胞の培養培地を、血清を含まない新鮮なＥＲＤＦ培地（５ｍｌ／１０ｍｌ ｄｉｓｈ）と交換し、混合液を添加した。その後、遺伝子導入から３時間後に血清を含む新鮮な通常培地に培地交換を行い、また同時にＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）による遺伝子導入細胞の薬剤選択を開始した。
このようにして、ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを安定に発現するＨｅＬａ，Ａ５４９及びＣａｃｏ−２細胞株を樹立した。
(5) Gene transfer The above-described hSIRT1p-driven GFP reporter vector (phSIRT1p-GFP) is transferred to human cervical cancer cell line (HeLa), human lung cancer cell line (A549), and human colon cancer cell line (Caco-2). It was introduced by the lipofection method.
That is, LipofectAMINE (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Was used to introduce phSIRT1p-GFP into the above-mentioned adherent animal cells. The day before transfection, cells were prepared at a cell density of 1 × 10 6 cells / 10 ml dish. On the next day, 10 μg of the phSIRT1p-GFP gene (fluid volume: 85 μl) and 15 μl of LipofectAMINE reagent were diluted with 1.4 ml of Opti-MEM medium and incubated at room temperature for 15 minutes. During this time, the cell culture medium was replaced with fresh ERDF medium (5 ml / 10 ml dish) without serum and the mixture was added. Thereafter, 3 hours after the gene transfer, the medium was replaced with a fresh normal medium containing serum, and at the same time, drug selection of the gene-transferred cells by G418 (1 mg / ml) was started.
In this way, HeLa, A549 and Caco-2 cell lines that stably express phSIRT1p-GFP were established.
一方、ＴＩＧ−１細胞に対して、他の細胞と同様ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰを導入することを試みたが、従来のリポフェクション法では遺伝子導入効率が低く、安定株を作ることは困難であった。そこで、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ（Ａｍａｘａ社）及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｍａｘａ社）を用いたエレクトロポレーション法による遺伝子導入を試みた。ところがＴＩＧ−１用として特化された遺伝子導入条件及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎはなかったので、様々な条件でエレクトロポレーションを行い、ＴＩＧ−１細胞に対する遺伝子導入の最適条件を決定し、実際にはＲ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬を用い、Ｕ−２３プログラムを用いて遺伝子導入を行った。詳細はＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットに付属のプロトコールに従い行った。 On the other hand, it was attempted to introduce phSIRT1p-GFP into TIG-1 cells in the same manner as other cells. However, the conventional lipofection method had low gene transfer efficiency and it was difficult to produce a stable strain. Then, gene introduction by an electroporation method using Nucleofector Device (Amaxa) and Nucleofector Solution (Amaxa) was tried. However, since there were no gene transfer conditions and Nucleofector Solution specialized for TIG-1, electroporation was performed under various conditions to determine the optimal conditions for gene transfer into TIG-1 cells. In fact, R Solution Using the reagent, gene transfer was performed using the U-23 program. Details were performed according to the protocol attached to the Nucleofector kit.
（６）乳酸菌
乳酸菌としては、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｌ１，３，４），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）（Ｌ５．６），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（Ｌ７），ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）（Ｌ８），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）（Ｌ１０），ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）（Ｌ２２），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（Ｌ３４），ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）（Ｂ１，２），ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）（Ｂ５），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）（Ｂ８），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）（Ｂ１１），ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＳＫ３０３），ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）（Ｌ２５）を用いた。
(6) Lactic acid bacteria Lactobacillus acidophilus (L1, 3, 4), Lactobacillus amylovorus (L5.6), Lactobacillus brevis (Lactobacillus brevis (Lactobacillus brevis) (Lactobacillus brevis) Lactobacillus crispatus (L8), Lactobacillus gasseri (L10), Lactobacillus reuteri (L22), Lactobacillus L Bacteria bifi Bifidobacterium bifidum (B1, 2), Bifidobacterium breve (B5), Bifidobacterium adolescentis (B8), Bifidobacterium infantitis (B8) Bifidobacterium infantis (B11), Lactococcus lactis (SK303), Lactobacillus casei (L25) were used.
（７）乳酸菌処理
１００℃で３０分間処理後凍結乾燥した乳酸菌の凍結乾燥加熱死菌体をサンプルとして用いた。凍結乾燥死菌体は、上記遺伝子導入動物細胞に終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、２日間培養を行った。
ポジティブコントロールは、カロリー制限をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系で模倣し、ＳＩＲＴ１発現増強効果があるとされている血清及び糖抜き培地での１６時間培養処理（ＣＲ処理）とした。
(7) Lactic acid bacteria treatment Lyophilized and heat-killed cells of lactic acid bacteria that had been treated at 100 ° C for 30 minutes and then freeze-dried were used as samples. Lyophilized dead cells were added to the transgenic animal cells so as to have a final concentration of 10 μg / ml and cultured for 2 days.
As a positive control, caloric restriction was imitated in an in vitro culture system, and a 16-hour culture treatment (CR treatment) was performed in serum and sugar-free medium, which is considered to have an effect of enhancing SIRT1 expression.
（８）フローサイトメーター解析
フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を用いてＧＦＰの発現強度の変化を追跡した。この蛍光強度の変化がｈＳＩＲＴ１プロモーター活性の変化として捉えることができる。蛍光強度をヒストグラムとして展開し、未処理区においてピークの頻度値を示す蛍光強度よりも強い蛍光強度を示す細胞数の割合を数値化し、グラフに示した。ＨｅＬａ、Ａ５４９及びＣａｃｏ−２の各細胞株における結果を、それぞれ図２、図３、図４に示した。また、ＴＩＧ−１細胞における結果を、図５に示した。
(8) Flow cytometer analysis Changes in the expression intensity of GFP were followed using a flow cytometer (Beckman Coulter, Miami, FL). This change in fluorescence intensity can be regarded as a change in hSIRT1 promoter activity. The fluorescence intensity was developed as a histogram, and the ratio of the number of cells showing fluorescence intensity stronger than the fluorescence intensity showing the peak frequency value in the untreated section was digitized and shown in the graph. The results of the HeLa, A549, and Caco-2 cell lines are shown in FIGS. 2, 3, and 4, respectively. Moreover, the result in TIG-1 cell was shown in FIG.
図２〜４から明らかなように、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ１，３，４）は、全ての細胞株で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ（Ｌ５．６）はＡ５４９及びＣａｃｏ−２細胞で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ（Ｌ７）は全ての細胞株で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ（Ｌ８）はＡ５４９及びＣａｃｏ−２細胞で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌ１０）はＨｅＬａ及びＡ５４９細胞で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ（Ｌ２２）はＡ５４９細胞で、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ（Ｂ１，２）はＡ５４９細胞で、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ（Ｂ５）はＡ５４９細胞で、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（Ｂ８）はＡ５４９細胞で、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ（Ｂ１１）はＡ５４９細胞で、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ（ＳＫ３０３）はＡ５４９細胞でそれぞれ再現性良く強い活性が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（Ｌ３４）はＨｅＬａ及びＡ５４９で再現性良く弱めの活性が観察された。 As is apparent from FIGS. 2 to 4, Lactobacillus acidophilus (L1,3,4) is all cell lines, Lactobacillus amylovorus (L5.6) is A549 and Caco-2 cells, and Lactobacillus brevis (L7) is all. Lactobacillus crisis (L8) is A549 and Caco-2 cells, Lactobacillus gasseri (L10) is HeLa and A549 cells, Lactobacillus reuteri (L22) is A549 cells, Bifidobacterium breve (B5) is an A549 cell and Bifidob Actinodium adolescentis (B8) is A549 cells, Bifidobacterium infantis (B11) is A549 cells, and Lactococcus lactis (SK303) is A549 cells with good reproducibility and Lactobacillus salivaryL Weaker activity was observed.
また図５から明らかなように、ＴＩＧ−１細胞では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ（Ｌ６）及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ（Ｌ７）で高い活性が観察された。 Further, as is clear from FIG. 5, in TIG-1 cells, high activity was observed in Lactobacillus acidophilus (L4), Lactobacillus amylovorus (L6) and Lactobacillus brevis (L7).
（９）ルシフェラーゼアッセイ
先に構築したｐＧＥＭ−ｈＳＩＲＴ１ｐよりＮｏｔＩ消化によりｈＳＩＲＴ１ｐを切り出し、ＮｏｔＩ消化したＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに挿入した。さらにＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ消化によりｈＳＩＲＴ１ｐを切り出し、ＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩ消化したｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入し、ルシフェラーゼ活性を指標としてｈＳＩＲＴ１ｐ活性を測定するレポーターベクターを作製した（ｐＧＬ３−ｈＳＩＲＴ１ｐ）。ＨｅＬａ，Ａ５４９，Ｃａｃｏ−２，ＴＩＧ−１細胞に対しｐＧＬ３−ｈＳＩＲＴ１ｐ及び遺伝子導入効率を推定するためのコントロールプラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ）をＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ試薬により導入し、３時間後に培地交換を行った。
(9) Luciferase assay hSIRT1p was excised from the previously constructed pGEM-hSIRT1p by NotI digestion and inserted into NotI digested BluescriptII. Furthermore, hSIRT1p was excised by digestion with SacI / BamHI and inserted into pGL3-Basic (Promega) digested with SacI / BglII to prepare a reporter vector for measuring hSIRT1p activity using luciferase activity as an index (pGL3-hSIRT1p). To HeLa, A549, Caco-2, and TIG-1 cells, pGL3-hSIRT1p and a control plasmid (pRL-TK) for estimating gene transfer efficiency were introduced with Lipofectamine reagent, and the medium was changed after 3 hours.
通常はここからｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰのときと同様４８時間に渡り１０μｇ／ｍｌの濃度で乳酸菌の加熱死菌体を添加・培養し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙキットのプロトコールに則って、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性の測定を行う。ところがこの条件では、サンプル間のデータのばらつきが大きかった。そこで細胞毎に、乳酸菌加熱死菌体処理及び培養時間の至適化を行った。その結果、ＨｅＬａでは遺伝子導入後３時間後に培地交換、さらに２１時間後に培地交換とともに乳酸菌添加（１０μｇ／ｍｌ）し、２４時間後にプロモーターアッセイを行うことにより、再現性良く、サンプル間のデータのばらつきの少ないデータを得ることができた。また、Ａ５４９では遺伝子導入後３時間後に培地交換とともに乳酸菌を添加して、さらに３日間培養後プロモーターアッセイを行うことにより、再現性良く、サンプル間のデータのばらつきの少ないデータを得ることができた。この為、以後、この条件で乳酸菌加熱死菌体のｈＳＩＲＴ１ｐ活性に与える影響を検証した。ＨｅＬａおよびＡ５４９の各細胞株における結果を、それぞれ図６および図７に示す。
Usually, heat-killed cells of lactic acid bacteria are added and cultured at a concentration of 10 μg / ml over 48 hours as in the case of phSIRT1p-GFP, and luciferase is used using a luminometer according to the protocol of the Dual-Luciferase assay kit. Measure activity. However, under this condition, data variation between samples was large. Then, the lactic acid bacteria heat dead cell processing and the culture | cultivation time optimization were performed for every cell. As a result, in HeLa, medium was exchanged 3 hours after gene introduction, lactic acid bacteria were added (10 μg / ml) together with medium exchange 21 hours later, and promoter assay was performed 24 hours later. We were able to obtain data with little. In addition, in A549, lactic acid bacteria were added together with the
その結果、図６からわかるように、ＨｅＬａ細胞では、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（Ｂ８）以外の乳酸菌で高いＳＩＲＴ１ｐの転写活性化を観察することができた。また、図７からわかるように、Ａ５４９細胞では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ４）以外の乳酸菌で高いＳＩＲＴ１ｐの転写活性化を観察することができた。 As a result, as can be seen from FIG. 6, high transcriptional activation of SIRT1p could be observed in lactic acid bacteria other than Bifidobacterium adolescentis (B8) in HeLa cells. Further, as can be seen from FIG. 7, in A549 cells, high transcriptional activation of SIRT1p could be observed in lactic acid bacteria other than Lactobacillus acidophilus (L4).
（１０）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲによる遺伝子発現の解析
ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰ及びｐＧＬ３−ｈＳＩＲＴ１を用いた解析から再現性良く、ｈＳＩＲＴ１ｐを活性化しうる乳酸菌を選抜し、それら乳酸菌存在下で培養したＨｅＬａ，Ａ５４９，ＴＩＧ−１，Ｃａｃｏ−２における内在性ｈＳＩＲＴ１遺伝子の発現量の変化をＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により追跡した。この際、各細胞における乳酸菌の処理条件は、前記実験と同様に至適化を行ってから決定するものとした。内在性ｈＳＩＲＴ１遺伝子の発現を測定するためのＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ用のプライマーは、以下のものを用いた。
ＨＡ０４４２６３−Ｆ：ＧＣＣＴＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＣＴＡＧＴＧＡＣ（配列番号１０）
ＨＡ０４４２６３−Ｒ：ＴＴＣＧＡＧＧＡＴＣＴＧＴＧＣＣＡＡＴＣＡＴＡＡ（配列番号１１）
(10) Analysis of gene expression by Quantitative Realtime PCR From the analysis using phSIRT1-GFP and pGL3-hSIRT1, lactic acid bacteria capable of activating hSIRT1p were selected with good reproducibility, and HeLa, A549, TIG- cultured in the presence of these lactic acid bacteria The change in the expression level of the endogenous hSIRT1 gene in 1, Caco-2 was followed by the Quantitative real-time PCR method. At this time, the treatment conditions for lactic acid bacteria in each cell were determined after optimization as in the above experiment. The following primers were used for Real-time PCR for measuring the expression of the endogenous hSIRT1 gene.
HA044423-F: GCCTCACATGCAAGCTCTAGTGAC (SEQ ID NO: 10)
HA044423-R: TTCGAGGATCTGTGCCAATCATAA (SEQ ID NO: 11)
また内部コントロールとしてはヒトβアクチンあるいはヒトグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。その際のプライマーは、以下のものを用いた。 As an internal control, human β-actin or human glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene was used. The following primers were used at that time.
βアクチンの場合：
ＨＡ０６７８０３−Ｆ：ＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＡＡ（配列番号１２）
ＨＡ０６７８０３−Ｒ：ＣＴＡＡＧＴＣＡＴＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣＡ（配列番号１３）
For β-actin:
HA067803-F: TGGCACCCCAGCACAATGAA (SEQ ID NO: 12)
HA067803-R: CTAAGGTCATAGCCGCCCTAGAAGCA (SEQ ID NO: 13)
ＧＡＰＤＨの場合：
ＨＡ０３１５７８−Ｆ：ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ（配列番号１４）
ＨＡ０３１５７８−Ｒ：ＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴ（配列番号１５）
For GAPDH:
HA031578-F: GCACCGTCAAGGCTGGAAC (SEQ ID NO: 14)
HA031578-R: ATGGTGGTGAAGACGCCAGT (SEQ ID NO: 15)
ｃＤＮＡ合成は、Ｍ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅ Ｈ Ｍｉｎｕｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い常法に基づき行った。ＰＣＲ反応はＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を用い、ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて行った。 cDNA synthesis was performed based on a conventional method using M-MLV Reverse Transscriptase RNase H Minus (Promega). PCR reaction was performed using SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa) and thermal Cycler Dice (TaKaRa).
実施例２〔ヒトＡＩＤプロモーター転写活性化乳酸菌の同定〕
（１）ヒトＡＩＤプロモーター（ｈＡＩＤｐ）の取得
ｈＡＩＤプロモーターとして、ＡＴＧ翻訳開始点より−５２０ｂｐ〜−１ｂｐ（＋１は翻訳開始点を示すものとする。）を、ヒト正常線維芽細胞株ＴＩＧ−１より調製したゲノムＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲ法により取得した。ＰＣＲ反応には、宝酒造のＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用い、指定のプロトコールに従って反応を進めた。ＰＣＲの反応液組成は、以下に示すとおりである。ＰＣＲ反応条件は９４℃にて２分間変性を行ったあと、９８℃；２０秒、６８℃；１分を３５サイクルとした。なお、非特異的反応を抑えるために、全ての操作は氷上にて速やかに行った。
Example 2 [Identification of lactic acid bacteria activated by human AID promoter transcription]
(1) Acquisition of human AID promoter (hAIDp) As the hAID promoter, -520 bp to -1 bp (+1 indicates the translation start point) from the ATG translation start point, from human normal fibroblast cell line TIG-1. It was obtained by a PCR method using the prepared genomic DNA as a template. For the PCR reaction, TaKaRa LA Taq (TaKaRa, Shiga, Japan) manufactured by Takara Shuzo was used, and the reaction proceeded according to the designated protocol. The composition of the reaction solution for PCR is as shown below. PCR reaction conditions were denaturation at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 35 cycles of 98 ° C .; 20 seconds, 68 ° C .; 1 minute. In order to suppress non-specific reactions, all operations were performed quickly on ice.
（ＰＣＲ反応液組成）
滅菌水 ２５．９μｌ
１０ｘ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ８μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ ｐｒｉｍｅｒ（５'） １μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ ｐｒｉｍｅｒ（３'） １μｌ
ＴＩＧ−１ ゲノムＤＮＡ ３．６μｌ
ＬＡ−Ｔａｑ １μl
合 計 ５０μｌ
(PCR reaction solution composition)
Sterile water 25.9 μl
10x PCR Buffer 5 μl
25 mM MgCl 2 5 μl
2.5
10 μmol / μl primer (5 ′) 1 μl
10 μmol / μl primer (3 ′) 1 μl
TIG-1 genomic DNA 3.6 μl
LA-Taq 1μl
50μl total
ＰＣＲに使用したプライマーの配列は表３に示した。ＧＦＰ発現ベクターの構築にはｈＡＩＤｐ−ＮｄｅＩ（Ｆ）およびｈＡＩＤｐ−ＸｂａＩ（Ｒ）をそれぞれ用いた。また、すべての合成はニッポンＥＧＴ社（Ｔｏｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）に依頼した。 The primer sequences used for PCR are shown in Table 3. For the construction of the GFP expression vector, hAIDp-NdeI (F) and hAIDp-XbaI (R) were used, respectively. All syntheses were requested from Nippon EGT (Toyama, Japan).
それぞれ反応終了後、１．５％アガロースゲルにて電気泳動を行い、目的のバンドを切り出した後、ゲル抽出を行った。ゲル抽出はプロメガ社のＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ＵＰ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、製品のプロトコールに従って行った。
次に、このＰＣＲ産物はＴＡクローニング用のベクターであるｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）へサブクローニングした（ｐＧＥＭ−ｈＡＩＤｐ）。
After completion of each reaction, electrophoresis was performed on a 1.5% agarose gel, and the target band was cut out, followed by gel extraction. Gel extraction was performed using Promega's Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System (Promega, Madison, Wis.) According to the product protocol.
Next, this PCR product was subcloned into pGEM-T Easy vector (Promega), a vector for TA cloning (pGEM-hAIDp).
（２）ｐＥＧＦＰ−Ｃ３への組換え
シークエンスを確認したあとのｐＧＥＭ−ｈＡＩＤｐから、ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ消化にてプロモーター断片を切り出し、ＡｓｅＩ及びＮｈｅＩ消化によりＣＭＶプロモーターを除去したｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクター（ＴａＫａＲａ）に挿入し、ＧＦＰ発現コンストラクトを構築した（ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ）。ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰのベクターマップを、図８に示した。
(2) Recombination into pEGFP-C3 From pGEM-hAIDp after confirming the sequence, a promoter fragment was excised by digestion with NdeI and XbaI, and pCMP-C3 vector (TaKaRa) from which the CMV promoter was removed by digestion with AseI and NheI. Inserted to construct a GFP expression construct (phAIDp-GFP). A vector map of phAIDp-GFP is shown in FIG.
（３）ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ安定発現動物細胞株の樹立及び遺伝子導入
ｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ安定発現動物細胞株の作製には、ヒト子宮頸ガン由来細胞株ＨｅＬａ、ヒト肺ガン細胞株（Ａ５４９）、ヒトＢ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１、ヒトＢ骨髄腫細胞株Ｕ−２６６、エプスタインバールウイルスにより不死化したヒトＢ細胞株(ＥＢＶ−Ｂ)を用いた。
各細胞の培養には、ＨｅＬａの場合にはＤＭＥＭ培地、Ａ５４９の場合にはＥＲＤＦ培地、ＢＡＬＬ−１及びＵ−２６６の場合にはＲＰＭＩ６４０培地、ＥＢＶ−Ｂの場合にはＥＲＤＦ培地を用いた。
(3) Establishment of phAIDp-GFP stable expression animal cell line and gene transfer For production of hAIDp-GFP stable expression animal cell line, human cervical cancer-derived cell line HeLa, human lung cancer cell line (A549), human B cell Leukemia cell line BALL-1, human B myeloma cell line U-266, and human B cell line immortalized with Epstein-Barr virus (EBV-B) were used.
For the culture of each cell, DMEM medium was used for HeLa, ERDF medium was used for A549, RPMI640 medium was used for BALL-1 and U-266, and ERDF medium was used for EBV-B.
上記ｈＡＩＤｐ駆動のＧＦＰリポーターベクター（ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ）を、リポフェクション法により、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてヒト子宮頸ガン細胞株（ＨｅＬａ）及びヒト肺ガン細胞株（Ａ５４９）に導入した。 The hAIDp-driven GFP reporter vector (phAIDp-GFP) was introduced into human cervical cancer cell line (HeLa) and human lung cancer cell line (A549) using LipofectAMINE (Invitrogen, Carlsbad, CA) by the lipofection method. .
トランスフェクションの前日に細胞を１ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／１０ｍｌ ｄｉｓｈの細胞密度で準備しておいた。翌日、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ遺伝子を１０μｇ分(液量８５μｌ)とＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬１５μｌをＯｐｉｔ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地１．４ｍｌで希釈し、室温にて１５分間インキュベートした。この間に、細胞の培養培地を、血清を含まない新鮮なＥＲＤＦ培地（５ｍｌ／１０ｍｌ ｄｉｓｈ)と交換し、混合液を添加した。遺伝子導入から３時間後に血清を含む新鮮な通常培地に培地交換を行い、また同時にＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）によるセレクションを開始した。
このようにして、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰを安定に発現するＨｅＬａ及びＡ５４９細胞株を樹立した。
The day before transfection, cells were prepared at a cell density of 1 × 10 6 cells / 10 ml dish. On the next day, 10 μg of the phAIDp-GFP gene (fluid volume 85 μl) and 15 μl of LipofectAMINE reagent were diluted with 1.4 ml of Opti-MEM (Invitrogen) medium and incubated at room temperature for 15 minutes. During this time, the cell culture medium was replaced with fresh serum-free ERDF medium (5 ml / 10 ml dish) and the mixture was added. Three hours after the gene transfer, the medium was replaced with a fresh normal medium containing serum, and at the same time, selection with G418 (1 mg / ml) was started.
In this manner, HeLa and A549 cell lines that stably express phAIDp-GFP were established.
一方、ＢＡＬＬ−１，Ｕ−２６６，ＥＢＶ−Ｂはいずれも浮遊細胞で、ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ遺伝子導入が困難な細胞であった。そのため様々な遺伝子導入方法及び条件を検討し、接着系細胞で高い遺伝子導入効率が観察されていたＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ社）を試したが、満足できるものではなかった。そこでさらにＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ（Ａｍａｘａ社）及びＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｍａｘａ社）を用いたエレクトロポレーション法による遺伝子導入を試みた。その際、至適試薬及びプログラムは、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍａｘａ社）を用い決定した。ＢＡＬＬ−１，Ｕ−２６６，ＥＢＶ−ＢともにＶ ｓｏｌｕｔｉｏｎ試薬を用い、Ｔ−１６プログラムにより遺伝子導入を行った。詳細はＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットに付属のプロトコールに従い行った。 On the other hand, BALL-1, U-266, and EBV-B were all floating cells and were difficult to introduce the phAIDp-GFP gene. Therefore, various gene transfer methods and conditions were examined, and FuGENE (Roche), which had been observed to have high gene transfer efficiency in adherent cells, was not satisfactory. Therefore, further gene introduction was attempted by electroporation using Nucleofector Device (Amaxa) and Nucleofector Solution (Amaxa). At that time, the optimum reagent and program were determined using Cell Line Nucleofector Optimization Kit (Amaxa). For BALL-1, U-266, and EBV-B, gene introduction was performed using the T solution using the V solution reagent. Details were performed according to the protocol attached to the Nucleofector kit.
（４）乳酸菌
乳酸菌としては、以下の菌株を用いた。
ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）（Ｌ２５）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｌ１〜４），ラクトバチルス・アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）（Ｌ５，６），ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（Ｌ７，８），ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）（Ｌ９〜１２，１５，３３），ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）（Ｌ１６，１７），ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（Ｌ２８），ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（Ｌ３４），スタフィロコッカス・サーモフィルス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｌ２６），ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）（Ｂ２），ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）（Ｂ８），ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）（Ｂ１２），ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）（Ｂ１３）を用いた。
(4) Lactic acid bacteria The following strains were used as lactic acid bacteria.
Lactobacillus casei (L25), Lactobacillus acidophilus (L1-4), Lactobacillus amylovorus (L5, bL), Lactobacillus amylovus (L5, b) 8), Lactobacillus gasseri (L9-12, 15, 33), Lactobacillus johnsonii (L16, 17), Lactobacillus lactis (L28) Bacillus salivarius (Lactobacil) us salivarius (L34), Staphylococcus thermophilus (L26), Bifidobacterium bifidum (B2), Bifidobacterium addressium (B2), Bifidobacterium addressium (B2) Bifidobacterium infantis (B12) and Bifidobacterium longum (B13) were used.
（５）乳酸菌処理
１００℃で３０分処理後凍結乾燥した乳酸菌の凍結乾燥加熱死菌体をサンプルとして用いた。凍結乾燥加熱死菌体は、上記ｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ安定発現細胞株に終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、２日間処理を行った。
(5) Lactic acid bacteria treatment Freeze-dried and heat-killed cells of lactic acid bacteria treated at 100 ° C. for 30 minutes and then lyophilized were used as samples. Lyophilized heat-killed cells were added to the hAIDp-GFP stable expression cell line so as to have a final concentration of 10 μg / ml and treated for 2 days.
（６）フローサイトメーター解析
フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を用いてＧＦＰの発光強度の変化を追跡した。この蛍光強度の変化がｈＡＩＤプロモーター活性の変化として捉えることができる。無処理のものをコントロール（ｃｔｒｌ）とした。蛍光強度をヒストグラムとして展開し、未処理区においてピークの頻度値を示す蛍光強度よりも強い蛍光強度を示す細胞数の割合を数値化し、グラフに示した。ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＢＡＬＬ、Ｕ２６６の各細胞株の結果を、それぞれ図９、図１０、図１１、図１２にそれぞれ示した。
(6) Flow cytometer analysis Changes in the luminescence intensity of GFP were followed using a flow cytometer (Beckman Coulter, Miami, FL). This change in fluorescence intensity can be regarded as a change in hAID promoter activity. The untreated sample was used as a control (ctrl). The fluorescence intensity was developed as a histogram, and the ratio of the number of cells showing fluorescence intensity stronger than the fluorescence intensity showing the peak frequency value in the untreated section was digitized and shown in the graph. The results of the cell lines HeLa, A549, BALL, and U266 are shown in FIGS. 9, 10, 11, and 12, respectively.
その結果、図９から明らかなように、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ１〜４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ（Ｌ５，６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ（Ｌ７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌ１０）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ（Ｂ２）で強いｈＡＩＤｐ転写活性化能が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌ１１，１２，１５，３３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（Ｌ１６，１７）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｌ２８）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（Ｌ３４）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ２６）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（Ｂ８）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ（Ｂ１２）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ（Ｂ１３）は中程度のＡＩＤｐ転写活性化能が、それ以外の菌には弱いＡＩＤｐ転写活性化能が認められた。 As a result, as is apparent from FIG. 9, Lactobacillus acidophilus (L1 to 4), Lactobacillus amylovorus (L5, 6), Lactobacillus brevis (L7), Lactobacillus gasseri (L10), and BifidoBidh activation Lactobacillus gasseri (L11, 12, 15, 33), Lactobacillus johnsonii (L16, 17), Lactobacillus lactis (L28), Lactobacillus salivarius (L34), Staphylococ 26 obacterium adolescentis (B8), Bifidobacterium infantis (B12), the Bifidobacterium longum (B13) AIDp transcriptional activation ability of moderate, was observed weak AIDP transcriptional activation ability in the other bacteria.
図１０の結果から、Ａ５４９細胞においては、いずれの乳酸菌においても強いｈＡＩＤｐ転写活性化能が認められた。 From the results shown in FIG. 10, A549 cells showed a strong hAIDp transcription activation ability in any lactic acid bacterium.
図１１の結果から、ＢＡＬＬ−１細胞においては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ（Ｌ６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌ３３），Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ（Ｌ３４），Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ２６），Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（Ｂ８），Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ（Ｂ１２）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ（Ｂ１３）以外の乳酸菌に強いｈＡＩＤｐ転写活性化能が認められた。 From the results of FIG. 11, in BALL-1 cells, Lactobacillus amylovorus (L6), Lactobacillus gasseri (L33), Lactobacillus salivarius (L34), Staphylococcus thermophilus (L26), Bifidobacterium adolescentis (B8), Bifidobacterium infantis (B12), Bifidobacterium Strong hAIDp transcription activation ability was observed in lactic acid bacteria other than longum (B13).
図１２の結果から、Ｕ−２６６細胞においては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ２６）で弱いｈＡＩＤｐ転写活性化能が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ（Ｌ２５）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｌ１〜４）で中程度のｈＡＩＤｐ転写活性化能が、それ以外の乳酸菌で強いｈＡＩＤｐ転写活性化能が認められた。 From the results of FIG. 12, in U-266 cells, staphylococcus thermophilus (L26) has weak hAIDp transcription activation ability, and Lactobacillus casei (L25) and Lactobacillus acidophilus (L1-4) have moderate hAIDp transcription activation ability. In other lactic acid bacteria, strong hAIDp transcription activation ability was observed.
（７）ルシフェラーゼアッセイ
先に構築したｐＧＥＭ−ｈＡＩＤｐよりＥｃｏＲＩ処理によりｈＡＩＤｐを切り出し、ＥｃｏＲＩ処理をしたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩに挿入した。さらにＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化によりｈＡＩＤｐを切り出し、ＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃに挿入し、ルシフェラーゼ活性を指標としてｈＡＩＤｐ活性を測定するレポーターベクターを作製した（ｐＧＬ３−ｈＡＩＤｐ）。ＢＡＬＬ−１，Ｕ２６６，ＥＢＶ−Ｂ各細胞に対しｐＧＬ３−ｈＡＩＤｐ及び遺伝子導入効率を推定するためのコントロールプラスミド（ｐＲＫ−ＴＫ）をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ試薬により導入し、３時間後に培地交換を行った。ｐｈＳＩＲＴ１ｐ−ＧＦＰのときと同様４８時間に渡り１０μｇ／ｍｌの濃度で乳酸菌の加熱死菌体を添加・培養し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙキットのプロトコールに則って、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼ活性の測定を行った。
(7) Luciferase assay hAIDp was excised from the previously constructed pGEM-hAIDp by EcoRI treatment and inserted into Bluescript II that had been EcoRI treated. Furthermore, hAIDp was excised by SacI / HindIII digestion, inserted into pGL3-Basic digested with SacI / HindIII, and a reporter vector for measuring hAIDp activity using luciferase activity as an index was prepared (pGL3-hAIDp). PGL3-hAIDp and a control plasmid (pRK-TK) for estimating gene transfer efficiency were introduced into each cell of BALL-1, U266, EBV-B with Nucleofector reagent, and the medium was changed after 3 hours. As in the case of phSIRT1p-GFP, heat-killed cells of lactic acid bacteria were added and cultured at a concentration of 10 μg / ml for 48 hours, and luciferase activity was measured using a luminometer according to the protocol of the Dual-Luciferase assay kit. went.
（８）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲによる遺伝子発現の解析
ｐｈＡＩＤｐ−ＧＦＰ及びｐＧＬ３−ｈＡＩＤｐを用いた解析から再現性良く、ｈＡＩＤｐを活性化しうる乳酸菌を選抜し、それら乳酸菌存在下で培養したＨｅＬａ，Ａ５４９，ＢＡＬＬ−１，Ｕ２６６，ＥＢＶ−Ｂにおける内在性ｈＡＩＤ遺伝子の発現量の変化をＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により追跡した。
(8) Analysis of gene expression by Quantitative Realtime PCR From lactic acid bacteria capable of activating hAIDp with good reproducibility from analysis using phAIDp-GFP and pGL3-hAIDp, HeLa, A549, BALL- cultured in the presence of these lactic acid bacteria Changes in the expression level of the endogenous hAID gene in 1, U266, EBV-B were followed by a quantitative real-time PCR method.
内在性ｈＡＩＤ遺伝子の発現を測定するためのＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ用のプライマーは、以下のものを用いた。
ＨＡ０５０７９７−Ｆ：ＣＡＣＣＣＴＡＡＴＡＡＴＧＧＧＴＴＧＡＴＧＴＣＴＧ（配列番号１６）
ＨＡ０５０７９７−Ｒ：ＣＴＧＡＴＴＧＧＣＡＴＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＡＧ（配列番号１７）
The following primers were used for Real-time PCR for measuring the expression of the endogenous hAID gene.
HA050797-F: CACCCTATAATAGGGGTTGATGTCTG (SEQ ID NO: 16)
HA0505077-R: CTGATTGGCATTTCTGAGATGAA (SEQ ID NO: 17)
また内部コントロールは上記実施例１と同様ヒトβアクチンあるいはヒトグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ反応も上記と同様に行った。 In addition, as in Example 1, human β-actin or human glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene was used as an internal control. cDNA synthesis and PCR reaction were also performed in the same manner as described above.
実施例３（遺伝子発現を誘導するＴＬＲの同定）
微生物を認識するレセプターとして機能しうる各種ＴＬＲの発現を、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰおよびｐｈＡＩＤ−ＧＦＰのそれぞれを導入したＨｅＬａ，Ａ５４９，ＴＩＧ−１，Ｃａｃｏ−２，ＢＡＬＬ−１，Ｕ２６６，ＥＢＶ−Ｂにおいて検証した。
Example 3 (Identification of TLRs that induce gene expression)
Expression of various TLRs that can function as receptors recognizing microorganisms was verified in HeLa, A549, TIG-1, Caco-2, BALL-1, U266, EBV-B into which phSIRT1-GFP and phAID-GFP were introduced, respectively. did.
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ法用のプライマーとしては、以下の組み合わせを用い、方法は上記実施例１および実施例２の方法にならって行った。 As primers for the Quantitative Realtime PCR method, the following combinations were used, and the method was performed according to the method of Example 1 and Example 2 above.
ＴＬＲ１：
ＨＡ０３７８４１−Ｆ：ＣＡＧＡＧＴＧＡＡＴＧＧＴＧＣＣＡＴＴＡＴＧＡＡＣ（配列番号１８）
ＨＡ０３７８４１−Ｒ：ＣＣＴＴＧＧＧＣＣＡＴＴＣＣＡＡＡＴＡＡＧＴＣ（配列番号１９）
TLR1:
HA037841-F: CAGAGTGAATGGTGCCCATTAGAAC (SEQ ID NO: 18)
HA037841-R: CCTTGGGGCATTCCAAATAAGTC (SEQ ID NO: 19)
ＴＬＲ２：
ＨＡ０３７８４２−Ｆ：ＡＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＣＡＴＧＴＧＣＴＧ（配列番号２０）
ＨＡ０３７８４２−Ｒ：ＡＧＴＡＧＧＣＡＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＴＡＡ（配列番号２１）
TLR2:
HA037842-F: ACTGGTGTCTGGCATGTGCTG (SEQ ID NO: 20)
HA037842-R: AGTAGGGCATCCCGCTCACTGTAA (SEQ ID NO: 21)
ＴＬＲ３：
ＣＨ０００２５５−Ｆ：ＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＴＣＡＡＧＣＣＡＣＴＡ（配列番号２２）
ＣＨ０００２５５−Ｒ：ＧＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＴＴＧＣＡＡＧＡＴＧ（配列番号２３）
TLR3:
CH000255-F: CCCTGAGCTGTCAAGCCACTA (SEQ ID NO: 22)
CH000255-R: GGGCACTGTTCTTGCAAGATG (SEQ ID NO: 23)
ＴＬＲ４：
ＣＨ０００２５６−Ｆ：ＣＴＧＧＧＴＧＴＧＴＴＴＣＣＡＴＧＴＣＴＣＡ（配列番号２４）
ＣＨ０００２５６−Ｒ：ＣＡＴＧＣＧＧＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＴＴＴＣ（配列番号２５）
TLR4:
CH000256-F: CTGGGTGTGTTCCATGTCTCA (SEQ ID NO: 24)
CH000256-R: CATGCGGACACACACACTTTC (SEQ ID NO: 25)
ＴＬＲ５：
ＨＡ０３７８４９−Ｆ：ＣＡＧＴＡＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＧＡＧＧＡ（配列番号２６）
ＨＡ０３７８４９−Ｒ：ＧＴＴＧＣＴＡＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＣＧＧＡＡＴＧ（配列番号２７）
TLR5:
HA037849-F: CAGTATTTGAGGTGGCCTGAGGA (SEQ ID NO: 26)
HA037849-R: GTTGCTACAGTTGCAACGGAATG (SEQ ID NO: 27)
ＴＬＲ９：
ＨＡ０４８１３８−Ｆ：ＡＧＴＣＣＴＣＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＧＡＡ（配列番号２８）
ＨＡ０４８１３８−Ｒ：ＧＣＧＴＴＧＧＣＧＣＴＡＡＧＧＴＴＧＡ（配列番号２９）
TLR9:
HA048138-F: AGTCCTCGACCTGGCAGGAA (SEQ ID NO: 28)
HA048138-R: GCGTTGGCGCTAAGGTTTGA (SEQ ID NO: 29)
各種ＴＬＲリガンド（Ｈｕｍａｎ ＴＬＲ１−９ Ａｇｏｎｉｓｔ Ｋｉｔ，ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を購入し、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ，Ａ５４９，Ｃａｃｏ−２，ＴＩＧ−１細胞及びｐｈＡＩＤ−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ，Ａ５４９，ＢＡＬＬ−１，Ｕ２６６と共培養することで、それぞれの細胞内でのＧＦＰ強度が増強するＴＬＲを同定した。ＧＦＰ発現強度は、フローサイトメーターにより追跡した。 Various TLR ligands (Human TLR1-9 Agonist Kit, InvivoGen) were purchased and HeLa, A549, Caco-2, TIG-1 cells introduced with phSIRT1-GFP and HeLa, A549, BALL-1, introduced with phAID-GFP, By co-culturing with U266, TLRs that enhance the GFP intensity in each cell were identified. GFP expression intensity was followed by a flow cytometer.
ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞における結果を図１３−１〜図１３−１２に示す。また、ｐｈＳＩＲＴ１−ＧＦＰを導入したＡ５４９細胞における結果を図１４−１〜図１４−１２に示す。図１３−１及び図１４−１３のｃｏｎは、ネガティブコントロールを示す。図１３−１１および図１４−１１のＬ１、図１４−１２のＬ５、および図１３−１２のＬ７は、ポジティブコントロールを示す。点線が反応時のデータを示し、このデータが動いているものが反応を示したＴＬＲとなる、具体的には、ＨｅＬａでは、ＴＬＲ１（図１３−２）、ＴＬＲ２（図１３−３）、ＴＬＲ３（図１３−４）、ＴＬＲ９（図１３−１０）が反応を示し、Ａ５４９では、ほぼ全てのＴＬＲに反応性を示していた（図１４−２〜図１４−１０）。これらのことより、乳酸菌のＳＩＲＴ１への反応の少なくとも一部は、ＴＬＲを介して生じていることが示された。 The results in HeLa cells into which phSIRT1-GFP has been introduced are shown in FIGS. 13-1 to 13-12. Moreover, the result in A549 cell which introduce | transduced phSIRT1-GFP is shown to FIGS. 14-1 to 14-12. The con in FIGS. 13-1 and 14-13 indicates a negative control. L1 in FIGS. 13-11 and 14-11, L5 in FIGS. 14-12, and L7 in FIGS. 13-12 represent positive controls. The dotted line shows the data at the time of reaction, and the moving data becomes the TLR indicating the reaction. Specifically, in HeLa, TLR1 (FIG. 13-2), TLR2 (FIG. 13-3), TLR3 (FIG. 13-4), TLR9 (FIG. 13-10) showed a reaction, and A549 showed reactivity to almost all TLRs (FIGS. 14-2 to 14-10). From these facts, it was shown that at least a part of the reaction of lactic acid bacteria to SIRT1 occurs via TLR.
実施例４（ＧＦＰｍｕｔを用いたＳＨＭ増強乳酸菌のスクリーニング）
ＡＩＤ遺伝子は抗体のクラススイッチに加え、体細胞高頻度突然変異（Ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｐｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ：ＳＨＭ）誘導能を有していることが知られている。そこでＧＦＰ遺伝子のコード領域内のＡＩＤによるＳＨＭのターゲットとなるような領域に停止コドンを人為的に導入したＧＦＰｍｕｔというコンストラクトを作製した。ＧＦＰｍｕｔはｈＡＩＤ非存在下では無蛍光、ｈＡＩＤ活性に応じて緑色蛍光を発する。このコンストラクトを安定に発現する細胞株を樹立することができれば、ＡＩＤのＳＨＭ活性を増強しうる乳酸菌の探索に応用できるものと期待される。
Example 4 (Screening of SHM-enhanced lactic acid bacteria using GFPmut)
It is known that the AID gene has the ability to induce somatic hypermutation (SHM) in addition to antibody class switching. Therefore, a construct called GFPmut was prepared in which a stop codon was artificially introduced into a region targeted for SHM by AID in the coding region of the GFP gene. GFPmut emits no fluorescence in the absence of hAID, and emits green fluorescence in response to hAID activity. If a cell line that stably expresses this construct can be established, it is expected to be applicable to the search for lactic acid bacteria that can enhance the SHM activity of AID.
Claims (22)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007034115A JP2008195673A (en) | 2007-02-14 | 2007-02-14 | Life prolongation-effective substance, and infection-protecting effect and vaccine effect-promoting substance, construct for assaying the above substances, and application of the above substances |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007034115A JP2008195673A (en) | 2007-02-14 | 2007-02-14 | Life prolongation-effective substance, and infection-protecting effect and vaccine effect-promoting substance, construct for assaying the above substances, and application of the above substances |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008195673A true JP2008195673A (en) | 2008-08-28 |
Family
ID=39754955
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007034115A Pending JP2008195673A (en) | 2007-02-14 | 2007-02-14 | Life prolongation-effective substance, and infection-protecting effect and vaccine effect-promoting substance, construct for assaying the above substances, and application of the above substances |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2008195673A (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2370580A2 (en) * | 2008-12-04 | 2011-10-05 | Opko Curna, LLC | Treatment of sirtuin 1 (sirt1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirtuin 1 |
| EP2403946A2 (en) * | 2009-03-04 | 2012-01-11 | Opko Curna, LLC | Treatment of sirtuin 1 (sirt1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirt 1 |
| EP2467481A2 (en) * | 2009-07-24 | 2012-06-27 | Opko Curna, LLC | Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt) |
| CN107227269A (en) * | 2017-05-28 | 2017-10-03 | 广州弘宝元生物科技有限公司 | Lactobacillus acidophilus and its application with cephalo resistance and high expression Sir2 albumen |
| WO2018218694A1 (en) * | 2017-05-28 | 2018-12-06 | 广州弘宝元生物科技有限公司 | Bifidobacterium longum having cephalosporin resistance and high expression of sir2 protein, and application thereof |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61109729A (en) * | 1984-11-05 | 1986-05-28 | Advance Res & Dev Co Ltd | Cholesterol lowering agent |
| JPS62145026A (en) * | 1985-12-19 | 1987-06-29 | Advance:Kk | Anticarcinogenic agent |
| JPH1084909A (en) * | 1996-09-13 | 1998-04-07 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | Intestinal butyric acid concentration increase accelerating agent |
| JP2001258549A (en) * | 2000-02-19 | 2001-09-25 | Korea Yakult Co Ltd | Lactobacillus acidophilus hy2177 and lactobacillus casei hy2743 having antibacterial activity against helicobacter pylori, lactic acid bacterium preparation and fermented milk using the same |
| JP2001270830A (en) * | 2000-03-24 | 2001-10-02 | Yakult Honsha Co Ltd | Urinary tract infection preventive treatment agent |
| JP2001346581A (en) * | 2000-06-06 | 2001-12-18 | Taisho Pharmaceut Co Ltd | Promoter gene and method for assaying promoter activity |
| JP2005225841A (en) * | 2004-02-16 | 2005-08-25 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | Agent for protecting infection with pathogen |
| WO2006093313A1 (en) * | 2005-03-04 | 2006-09-08 | Calpis Co., Ltd. | T cell apoptosis inducer |
| JP2006273852A (en) * | 2005-03-03 | 2006-10-12 | Meiji Milk Prod Co Ltd | Preventive and/or therapeutic substance comprising bacillus bifidus as active component for allergy |
| JP2006291146A (en) * | 2005-04-14 | 2006-10-26 | Taiyo Corp | Antioxidant |
-
2007
- 2007-02-14 JP JP2007034115A patent/JP2008195673A/en active Pending
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61109729A (en) * | 1984-11-05 | 1986-05-28 | Advance Res & Dev Co Ltd | Cholesterol lowering agent |
| JPS62145026A (en) * | 1985-12-19 | 1987-06-29 | Advance:Kk | Anticarcinogenic agent |
| JPH1084909A (en) * | 1996-09-13 | 1998-04-07 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | Intestinal butyric acid concentration increase accelerating agent |
| JP2001258549A (en) * | 2000-02-19 | 2001-09-25 | Korea Yakult Co Ltd | Lactobacillus acidophilus hy2177 and lactobacillus casei hy2743 having antibacterial activity against helicobacter pylori, lactic acid bacterium preparation and fermented milk using the same |
| JP2001270830A (en) * | 2000-03-24 | 2001-10-02 | Yakult Honsha Co Ltd | Urinary tract infection preventive treatment agent |
| JP2001346581A (en) * | 2000-06-06 | 2001-12-18 | Taisho Pharmaceut Co Ltd | Promoter gene and method for assaying promoter activity |
| JP2005225841A (en) * | 2004-02-16 | 2005-08-25 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | Agent for protecting infection with pathogen |
| JP2006273852A (en) * | 2005-03-03 | 2006-10-12 | Meiji Milk Prod Co Ltd | Preventive and/or therapeutic substance comprising bacillus bifidus as active component for allergy |
| WO2006093313A1 (en) * | 2005-03-04 | 2006-09-08 | Calpis Co., Ltd. | T cell apoptosis inducer |
| JP2006291146A (en) * | 2005-04-14 | 2006-10-26 | Taiyo Corp | Antioxidant |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| JPN6012004951; 饗場浩文: '"赤ワインを飲んで長生きを！"' 化学と生物 Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．２, 20040225, Ｐ．１１４-１１５ * |
| JPN6012026338; 藤木司 外５名: '"飢餓応答としての延命の分子機構に関する解析"' 日本農芸化学会大会講演要旨集 Ｖｏｌ．２００６, 20060305, Ｐ．２８８ * |
| JPN6012061803; Ｈａｉｇｉｓ，Ｍ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．: 'Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｉｒｔｕｉｎｓ - ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ａｇｉｎｇ， ａｎｄ ｃａｌｏｒｉｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ' Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２１, 20061101, Ｐ．２９１３-２９２１ * |
| JPN6012061804; 手島珠紀 外５名: '『Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＳＢＴ２０５５株のプロバイオティクス機能の検証 -加齢に伴う生体機能変化と長期経口投' 日本農芸化学会大会講演要旨集 Ｖｏｌ．２００２, 20020305, Ｐ．１０６ * |
| JPN6012061805; 田中博 外５名: '『Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＳＢＴ２９２８株のプロバイオティクス機能の検証（その２）加齢に伴う生体機能変化と長' 日本農芸化学会大会講演要旨集 Ｖｏｌ．２００２, 20020305, Ｐ．１０６ * |
| JPN6012061806; 鈴木豊 外３名: '『ヨーグルトおよびビフィズス発酵乳がマウスの生存率と血清成分値に及ぼす影響』' 日本栄養・食糧学会誌 Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．３, 1991, Ｐ．１７７-１８２ * |
| JPN6012061808; 荒井幸一郎 外４名: '報文 『殺菌発酵乳投与のマウスの寿命、腸内菌叢におよぼす影響について（予報）』' 栄養と食糧 Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．４, 1980, Ｐ．２１９-２２３ * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2370580A2 (en) * | 2008-12-04 | 2011-10-05 | Opko Curna, LLC | Treatment of sirtuin 1 (sirt1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirtuin 1 |
| EP2370580A4 (en) * | 2008-12-04 | 2012-11-14 | Treatment of sirtuin 1 (sirt1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirtuin 1 | |
| EP2403946A2 (en) * | 2009-03-04 | 2012-01-11 | Opko Curna, LLC | Treatment of sirtuin 1 (sirt1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirt 1 |
| JP2012519488A (en) * | 2009-03-04 | 2012-08-30 | オーピーケーオー・クルナ・エルエルシー | Treatment of SIRT1-related diseases by suppression of natural antisense transcripts against sirtuin 1 (SIRT1) |
| EP2403946A4 (en) * | 2009-03-04 | 2012-11-14 | Treatment of sirtuin 1 (sirt1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirt 1 | |
| EP2467481A2 (en) * | 2009-07-24 | 2012-06-27 | Opko Curna, LLC | Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt) |
| EP2467481A4 (en) * | 2009-07-24 | 2013-01-16 | Curna Inc | Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt) |
| CN107227269A (en) * | 2017-05-28 | 2017-10-03 | 广州弘宝元生物科技有限公司 | Lactobacillus acidophilus and its application with cephalo resistance and high expression Sir2 albumen |
| WO2018218693A1 (en) * | 2017-05-28 | 2018-12-06 | 广州弘宝元生物科技有限公司 | Lactobacillus acidophilus having cephalosporin resistance and high expression of sir2 protein, and application thereof |
| WO2018218694A1 (en) * | 2017-05-28 | 2018-12-06 | 广州弘宝元生物科技有限公司 | Bifidobacterium longum having cephalosporin resistance and high expression of sir2 protein, and application thereof |
| CN107227269B (en) * | 2017-05-28 | 2021-05-18 | 广州弘宝元生物科技有限公司 | Lactobacillus acidophilus with cephalosporin resistance and high Sir2 protein expression and application thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109477089B (en) | Novel gene recombinant vaccinia virus | |
| US20230272346A1 (en) | Compositions and methods for increasing the culture density of a cellular biomass within a cultivation infrastructure | |
| KR20200097760A (en) | CPF1-related method and composition for gene editing | |
| CN109844103A (en) | Method and composition for modifier group DNA | |
| CN105960413A (en) | Artificial dna-binding proteins and uses thereof | |
| KR20230170151A (en) | Novel crispr enzymes and systems | |
| CN102666575A (en) | Mycobacterial vaccines | |
| CN104769112A (en) | Methods and products for expressing proteins in cells | |
| TWI327067B (en) | Antifungal protein and usage thereof | |
| CN107709565A (en) | Polyisoprenoids, carrier, the manufacture method of genetically modified plants, the manufacture method of pneumatic tire and the manufacture method of rubber | |
| KR20230111189A (en) | Reprogrammable ISCB nuclease and uses thereof | |
| CN107556387A (en) | Resisting GPC 3 and the double targeting antibodies of CD3 specificity, the minicircle dna containing this pair of targeting antibodies expression cassette and application | |
| CN109913422A (en) | A kind of immunocyte comprising tumour antigen identification receptor and its application | |
| CN109750054A (en) | A kind of Mycoplasma bovis protein gene MbovGdpP and its application | |
| JP2008195673A (en) | Life prolongation-effective substance, and infection-protecting effect and vaccine effect-promoting substance, construct for assaying the above substances, and application of the above substances | |
| CN110248957A (en) | Through manned SC function control system | |
| CN108064158A (en) | Lactobillus as probiotics and for assessing the haemocyte group to the immune response of reagent such as probiotics | |
| CN110302368A (en) | The composition for preventing and treating mycoplasm hyopneumoniae infection | |
| CN111410695B (en) | Chimeric molecule based on autophagy mechanism mediated Tau protein degradation and application thereof | |
| Lee et al. | CG sequence-and phosphorothioate backbone modification-dependent activation of the NF-κB-responsive gene expression by CpG-oligodeoxynucleotides in human RPMI 8226 B cells | |
| CN114981423A (en) | I-B type CRISPR-associated transposase system | |
| CN108471732A (en) | With the relevant composition of tumor analysis and method | |
| CN109468319A (en) | For inhibiting HSV-1 to replicate and/or CRISPR/Cas9 system, method, kit and its application of target sequence expression | |
| CN110092839A (en) | The fusion protein of porcine pseudorabies virus, preparation method, using and comprising porcine pseudorabies virus fusion protein vaccine | |
| CN109735477B (en) | Preparation and application of three-gene deletion attenuated mutant strain of Listeria monocytogenes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20091116 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120207 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120403 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120529 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120726 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120904 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121025 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121127 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130125 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130219 |