JP2001322947A - 遺伝子ファミリーｎｍ２３のポリペプチドまたはこれらをコードする核酸の、皮膚または腸障害の診断または治療のための使用、およびそれらの、薬理学的に活性がある物質の同定のための使用 - Google Patents

遺伝子ファミリーｎｍ２３のポリペプチドまたはこれらをコードする核酸の、皮膚または腸障害の診断または治療のための使用、およびそれらの、薬理学的に活性がある物質の同定のための使用

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JP2001322947A JP2001047946A JP2001047946A JP2001322947A JP 2001322947 A JP2001322947 A JP 2001322947A JP 2001047946 A JP2001047946 A JP 2001047946A JP 2001047946 A JP2001047946 A JP 2001047946A JP 2001322947 A JP2001322947 A JP 2001322947A
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アンドレアス・ゴッペルト
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】皮膚の障害、腸障害、創傷治癒、創傷治癒の障
害の解析、診断、予防、治療、薬理学的に活性がある物
質の同定等に有用なポリペプチドの提供。 【解決手段】遺伝子ファミリーＮＭ２３の配列番号１な
いし１０のポリプペチド、またはその機能する変異体あ
るいはこのポリペプチドをコードする核酸またはその変
異体を上記各症状の解析等に用いる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、遺伝子ファミリーＮＭ２３のポ
リペプチドまたはこれらをコードする核酸の、皮膚また
は腸細胞の障害および創傷治癒、および／または創傷治
癒の障害の診断および／または予防および／または治療
のための使用、並びにそれらの、薬理学的に活性がある
物質の同定のための使用に関する。
【０００２】創傷は、一般的に、療法的介入なしに治癒
する。しかし、創傷治癒が役割を果たす多くの障害があ
り、例えば真性糖尿病、動脈閉塞性疾患、乾癬、クロー
ン病、表皮水疱症、年齢関連皮膚変化または神経支配障
害である。創傷治癒障害は、創傷治癒の遅延または慢性
創傷につながる。これらの障害は、創傷の性質（例え
ば、広範囲の創傷、深くそして物理的に拡大された手術
創傷、やけど、外傷、床ずれ）、患者の薬物での治療
（例えばコルチコイド類での）により引き起こされる可
能性があるが、また、障害の性質自体により引き起こさ
れる可能性もある。例えば、ＩＩ型糖尿病患者の２５％
は、例えば、慢性潰瘍（「糖尿病足（ｄｉａｂｅｔｉｃ
ｆｏｏｔ）」）をしばしば患い、そのうちおよそ半数
は、高価な入院治療を必要とし、そしてにもかかわらず
最終的に不完全にしか治癒しない。糖尿病足は、糖尿病
に関連する他のいかなる合併症よりも、より長い入院を
引き起こす。Ｉ型およびＩＩ型糖尿病のこれらの症例の
数は増加しつつあり、そしてすべての入院の２．５％に
相当する。さらに、創傷は、患者の年齢が上がるにつ
れ、より治癒しにくくなる。天然治癒過程の加速はま
た、例えば細菌感染の危険または患者の静養期間を減少
させるためにも、しばしば望ましい。
【０００３】さらなる障害はまた、創傷閉鎖の成功後に
起こる可能性もある。胎児皮膚創傷は、傷痕形成なしに
治癒するが、生後期間は、損傷後、常に、傷痕の形成が
起こり、これはしばしば大きな整形的問題に相当する。
さらに、広範囲のやけど創傷の患者、特に傷痕のある皮
膚で、付属器、例えば毛包、汗腺および脂腺が失われて
いるような場合、生活の質は、劇的に不利な影響を受け
る可能性がある。特有の遺伝的性質の場合、周囲の皮膚
の内部に増殖する肥大性の傷痕である、ケロイドもまた
起こる可能性がある。
【０００４】皮膚治癒の過程は、調整された方式で進行
する、複雑な作用および多様な細胞種の相互作用を必要
とする。創傷治癒過程において、以下の段階が区別され
る：創傷の領域における血液の凝固、炎症性細胞の補
充、上皮再形成、顆粒形成組織の形成およびマトリック
ス改造。増殖、移動、マトリックス合成および収縮期中
に関与する細胞種の正確な反応パターンは、例えば、増
殖因子、受容体およびマトリックスタンパク質などの遺
伝子の制御と同様、現在までほとんど知られていない。
【０００５】したがって、現在まで、創傷治癒障害に介
入することを可能にするために、数種の満足できる療法
しか開発されてきていない。療法の確立された型は、創
傷治癒の物理的補助（例えば、包帯、圧迫ガーゼ、ゲ
ル）または皮膚組織、培養皮膚細胞および／またはマト
リックスタンパク質の移植に限定される。近年、創傷治
癒の改善のため、増殖因子が試験されてきているが、慣
用的な療法を決定的には改善していない。創傷治癒障害
の診断もまた、現在までに創傷治癒中の遺伝子制御のよ
り深い理解が欠けているため、さほど意味がない、皮膚
の視覚的解析に基づいている。
【０００６】現在まで、皮膚および腸の再生過程の他の
障害に関してもまた、さほど満足できる療法は開発され
てきていない。ここでもまた、診断剤および療法の開発
に、遺伝子制御の知識が好都合である。創傷治癒に関連
する遺伝子はまた、皮膚の再生の障害に基づく皮膚科学
的障害に、および一般的に再生過程に必須の役割も果た
していることが示されてきている（Ｆｉｎｃｈら， １
９９７， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５１：１
６１９−２８； Ｗｅｒｎｅｒら， １９８８， Ｃｙ
ｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．
９：１５３−１６５）。したがって、増殖因子ＫＧＦ
は、創傷治癒中の角化細胞の増殖および分化の制御に必
須の役割を果たすだけでなく、乾癬における角化細胞の
過剰増殖においても、そして（クローン病および潰瘍性
大腸炎（ｃｏｌｉｔｉｓ ｕｌｃｅｒｏｓａ）の）腸の
再生過程においても、重要な因子である。
【０００７】したがって、皮膚または腸細胞の障害およ
び／または創傷治癒および／または創傷治癒の障害の過
程に関与し、そしてその使用が、診断および／または予
防および／または治療、並びにまた、これらの障害と関
連して有効である薬剤および／または診断剤の同定およ
び開発を決定的に改善する、ポリペプチドおよび／また
はこれらをコードする核酸を利用可能にするのが、本発
明の目的である。
【０００８】皮膚または腸の障害、創傷治癒および創傷
治癒の障害は、調節されない組織増殖および分化に関連
する疾患、特に皮膚の癌および腸の癌とは異なると見な
される。後者の種類の疾患では、個々の細胞が形質転換
され、そして調節されない、自立的な方式で、すなわち
他の細胞種との相互作用とは独立に、増殖し始め、こう
した形質転換細胞は、その病理学的変化をその娘細胞に
受け継ぐ。これらの疾患において、相互作用の欠失は、
細胞・細胞接着および典型的な細胞特性の欠失と平行す
る。対照的に、本発明にしたがった疾患は、細胞相互作
用の障害から生じる。本発明にしたがった皮膚疾患の原
因は、多様な要因に応じる。例えば、乾癬の場合、遺伝
的な素因と共に機能不全Ｔ細胞、線維芽細胞および角化
細胞が役割を果たす（Ｎａｉｒら， １９９７； Ｈｕ
ｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ． ６：１３４９−１
３５６； Ｇｏｔｔｌｉｅｂら， １９９５， Ｎａ
ｔ．Ｍｅｄ． １：４４２−４４７； Ｓａｉａｇら，
１９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０：６６９−６
７２； Ｐｉｔｔｅｌｋｏｗ， １９９８， ｉｎＴｏ
ｅｎｉｇｋ １９８８：２２５−２４６）。創傷治癒の
経過はまた、多様な内因性および外因性の要因によって
も調節される可能性がある。真皮および表皮の異なる細
胞種の相互作用と共に、これらの細胞種と、他の組織お
よび器官、例えば血管系、神経系および結合組織との相
互作用の小さな妨害であっても、創傷治癒の重度の障害
に続き、傷痕の形成につながる可能性がある。さらに、
創傷治癒の過程は、感染、加齢、ビタミン欠乏と共に、
糖尿病などの疾患および免疫系の障害により、影響を受
ける可能性がある。皮膚の他の障害、例えば白斑および
アトピー性皮膚炎に関し、類似の複雑な相互作用が記載
されてきている。こうした議論に基づき、本発明にした
がった皮膚疾患は、癌を含む、調節されない組織増殖お
よび分化と関連する疾患とは区別することが可能であ
る。
【０００９】癌性疾患の自律的特性はまた、療法のレベ
ルでも明白である。転移を形成しない腫瘍の場合、疾患
は外科的に治療してもよい。こうした物理的治療は、腫
瘍細胞が隣接細胞または組織と相互作用しないため、可
能である。したがって、患者は腫瘍の切除により治癒す
る可能性がある一方、本発明にしたがった皮膚の障害の
場合、こうした治療は不可能である。細胞・細胞および
組織・組織相互作用の病理学的妨害は、皮膚の罹患部分
の単純な切除により解決することはできない。
【００１０】区別すべき２つの異なる種類の疾患に対す
る２つの異なる治療アプローチを比較することにより、
２つの異なる機構が異なる疾患の根底にあることが明ら
かである。調節されない組織増殖および分化と関連する
疾患、特に癌の場合、療法は、迅速に増殖する細胞を、
例えば細胞分裂抑制剤を用いて殺すことを標的とする。
これらの毒性剤は、活発に増殖している細胞の増殖を妨
げる一方、細胞周期のＧ０期の細胞は影響を受けないま
まである。対照的に、本発明にしたがった皮膚の障害の
治療は、異なる種類の細胞間の細胞相互作用を、例えば
個々の細胞種の移動、増殖および分化に影響を及ぼすこ
とにより、調節することに向けられる。本発明にしたが
った皮膚の障害は、増殖細胞の一般的な不活性化により
治療することが不可能である。
【００１１】本発明にしたがった創傷治癒および／また
は皮膚または腸の障害の過程に関与する、本発明にした
がって用いられる核酸を同定するための方法論的アプロ
ーチは、癌に関与する核酸を同定するのに適したアプロ
ーチとは非常に異なる。後者は、こうした疾患に罹患し
た細胞種において、差別的に発現されている遺伝子を解
析することにより、同定することが可能である。本発明
に用いられるスクリーニングアプローチは、皮膚の障害
および／または創傷治癒および／または創傷治癒の障害
の複雑な過程に関与する遺伝子を、病的なおよび健康な
組織生検の遺伝子発現を比較することにより、同定する
ことを目的とする。こうしたアプローチは、癌性疾患に
関与する遺伝子の同定には適していないであろう。
【００１２】本発明にしたがった皮膚の障害を、調節さ
れない組織増殖および分化と関連する皮膚疾患、特に皮
膚癌と区別するのに提起される議論はまた、本発明にし
たがった腸の障害を、調節されない組織増殖および分化
と関連する腸の疾患、特に腸の癌と区別する、類似の方
法にも適用することが可能である。例えば、結腸潰瘍の
治癒の遅延、例えばクローン病は、皮膚に関して示され
てきているように、細胞相互作用を妨害する、多様な要
因により引き起こされ、そして調節される。こうした要
因には、自己免疫機構、サイトカイン多型、細菌および
感染性病原体が含まれる（ＰｅｒｎｅｒおよびＲａｓｋ
−Ｍａｄｓｅｎ， １９９９， Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． １３：１３５−１４
４）。これらの要因は、腸細胞、例えば小胞（ｃｒｙｐ
ｔ）細胞、絨毛腸細胞または食細胞の間の相互作用を妨
害する（Ｒｕｅｍｍｅｌｅ ｕｎｄ Ｓｅｉｄｍａｎ，
１９９８， Ｃｈｕｎｇ Ｈｕａ Ｍｉｎ Ｋｕｏ
Ｈｓｉａｏ Ｅｒｈ ＫｏＩ Ｈｓｕｅｈ Ｈｕｉ Ｔ
ｓａ Ｃｈｉｈ， ３９：１−８）。したがって、本発
明にしたがったスクリーニングはまた、腸特異的過程の
癌に関与する核酸を同定するのに適しているだけでな
く、腸の疾患に適用した際も、強力である。
【００１３】創傷治癒過程中のものと共に乾癬およびク
ローン病における遺伝子発現の解析において、遺伝子フ
ァミリーＮＭ２３を同定することが可能であった。この
遺伝子ファミリーは現在までにすでに知られており、そ
して報告されている機能は、皮膚または腸障害、例えば
妨害された創傷治癒には関連付けられていなかったが、
本発明によりその制御が創傷治癒過程に必須であり、し
たがって皮膚または腸障害、例えば妨害された創傷治癒
の診断および／または治療と初めて関連付けられた。こ
れらの遺伝子のポリペプチドは、本発明にしたがった皮
膚および／または腸障害および／または創傷治癒の、診
断、例えば徴候、および／または治療、例えば調節に関
し、あるいは本発明から、完全に新規の療法アプローチ
が生じるような、皮膚および／または腸障害および／ま
たは創傷治癒の療法のための薬理学的に活性がある物質
の同定に関し、現在までに知られている標的に属してい
なかった。
【００１４】したがって、本発明の目的は、配列番号１
ないし配列番号１０の１つにしたがった遺伝子ファミリ
ーＮＭ２３の本発明にしたがって用いられるポリペプチ
ド、またはその機能する変異体、あるいはこれらをコー
ドする核酸またはその変異体の、皮膚および／または腸
障害および／または創傷治癒および／または創傷治癒の
障害の診断および／または治療、例えば療法的および／
または予防的治療のための、および／または薬理学的に
活性がある物質の同定のための、使用により達成され
る。
【００１５】遺伝子ファミリーＮＭ２３は、ヌクレオチ
ド二リン酸キナーゼ（ＮＤＫ）活性を有するタンパク質
をコードし（Ｐｏｓｔｅｌ， １９９８， Ｉｎｔ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３
０：１２９１−５）、該タンパク質は、基質非特異的方
式で、ヌクレオシド二リン酸をヌクレオシド三リン酸に
変換する。活性酵素は、非常に相同な（図６を参照され
たい）ポリペプチドＮＭ２３Ａ（ＮＤＫＡとも称され
る、図６を参照されたい）およびＮＭ２３Ｂ（ＮＤＫ
Ｂ）の６つのサブユニットからなり、そして可能性があ
るサブユニットの６つの組み合わせすべてが起こりうる
（Ｇｉｌｌｅｓら， １９９１， Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ２６６：８７８４−９）。遺伝子ＮＭ２３
−Ｈ１（ヒト由来、ＥＭＢＬデータベースエントリー、
Ｘ１７６２０、Ｘ７５５９８、Ｘ７３０６６； Ｒｏｓ
ｅｎｇａｒｄら， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４
２：１７７−１８０）およびＮＭ２３−Ｍ１（マウス由
来、ＥＭＢＬ Ｍ３５９７０、Ｍ６５０３７、Ｕ８５５
１１、ＡＦ０３３３７７； Ｒｏｓｅｎｇａｒｄら、上
記； Ｓｔｅｅｇら， １９８８， Ｊ． Ｎａｔｌ．
Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８０：２００−２０４）
はそれぞれ、ポリペプチドＮＭ２３Ａ／ＮＤＫＡ（ＳＷ
ＩＳＳＰＲＯＴデータベースエントリー、Ｐ１５５３１
およびＰ１５５３２）をコードし、一方、遺伝子ＮＭ２
３−Ｈ２（ＥＭＢＬ Ｘ５８９６５、Ｍ３６９８１、Ｌ
１６７８５； Ｇｉｌｌｅｓら， １９９１， Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６６：８７８４−９； Ｓｔ
ａｈｌら， １９９１， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５
１：４４５−９）およびＮＭ２３−Ｍ２（ＥＭＢＬ Ｘ
６８１９３； Ｕｒａｎｏら， １９９２， ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ． ３０９：３５８−３６２）はＮＭ２３Ｂ
／ＮＫＤＢ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴエントリー、Ｐ２２３
９２およびＱ０１７６８）をコードする。
【００１６】さらに、遺伝子ＮＭ２３−Ｈ４／ＮＤＫＭ
（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴエントリー、Ｏ００７４６； Ｍ
ｉｌｏｎら， ｌ９９７， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．，
９９：５５０−５５７）；ＤＲ−ＮＭ２３／ＮＤＫ３
（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴエントリー、Ｑｌ３２３２； Ｃ
ｕｃｃｏら， ｌ９９５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９２：７４３５
−７４３９）、ＮＭ２３−Ｈ５／ＮＤＫ５（ＳＷＩＳＳ
ＰＲＯＴエントリー、Ｐ５６５９７、Ｍｕｎｉｅｒら，
１９９８， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ４３４：２８
９−２９４）、５型ＮＭ２３（ＥＭＢＬエントリー、Ｕ
９０４４９； Ｎａｋａｍｕｒａら、１９９７、データ
ベースへの直接エントリー）およびＮＤＫ６（ＳＷＩＳ
ＳＰＲＯＴエントリー、Ｏ６０３６１、Ｂｒａｄｓｈａ
ｗおよびＯｚｅｒｓｋｙ、１９９８、データベースへの
直接エントリー）もまた、遺伝子ファミリーＮＭ２３に
属する。遺伝子ファミリーＮＭ２３のポリペプチドは、
アミノ酸配列レベルで、互いに、およそ５５ないし９５
％の同一性を示す。
【００１７】代謝酵素としての機能に加え、遺伝子ファ
ミリーＮＭ２３には、いくつかの他の機能が割り当てら
れてきている。例えば、ＮＭ２３Ｂの遺伝子産物は、細
胞質だけでなく、核にも位置し（Ｋｒａｅｆｔら， １
９９６， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２２７：６
３−９）、そしてＤＮＡ結合と共に、転写活性化機能が
記載された（Ｐｏｓｔｅｌら， １９９３， Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２６１：４７８−８０； Ｐｏｓｔｅｌ， １
９９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７４：２２
８２１−９）。さらに、Ｒａｓ−ＧＴＰアーゼの制御に
おけるＮＭ２３の役割が記載された（Ｚｈｕら， Ｐｒ
ｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９
６：１４９１１−８）。
【００１８】ＮＭ２３Ａの発現の減少は、ショウジョウ
バエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅ
ｒ）において、転移および細胞異常の形成の腫瘍マーカ
ーとして記載され（Ｒｏｓｅｎｇａｒｄら， １９８
９， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：１７７−ｌ８０）、ここ
で、正常レベルのＮＭ２３発現は、腫瘍細胞が転移を形
成する能力を阻害することが可能である（Ｌｅｅおよび
Ｌｅｅ， １９９９，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒ １
４５：９３−９）。この機能は、酵素活性に関連してい
ないようである。（ＬｅｅおよびＬｅｅ、上記）。一
方、ＮＭ２３の発現は、アンチセンス実験（Ｃｉｐｏｌ
ｌｉｎｉら， １９９７， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃ
ｅｒ ７３：２９７−３０２）および抗体実験（Ｓｏｒ
ｓｃｈｅｒら， １９９３， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９５：３
３６−４５）から仮定されるように、細胞増殖に必須で
ある。にもかかわらず、ヒト初期および転移形成黒色腫
細胞におけるＮＭ２３発現の解析と共に、異なる段階の
黒色腫形成の解析により、ヒトにおけるＮＭ２３発現
は、マウスにおける状況と対照的に、転移の形成と相関
しないことが導かれた（Ｅａｓｔｙら， １９９６，
Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７４（１）：１０９−１
４）。最近、これらの結果が、別のグループによる第二
の研究中、確認された（Ｓｅｒｅｇａｒｄら， １９９
９， Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ６９（６）：６７
１−６７６）。したがって、ＮＭ２３は、黒色腫形成に
おいて信頼できる診断に適していないようであった。調
節されない組織増殖および分化に関連する疾患、特に癌
の治療は、本発明にしたがった疾患と非常に異なるた
め、したがって、ＮＭ２３ポリペプチドおよび／または
その機能する変異体および／またはこれらのポリペプチ
ドをコードする核酸を、本発明にしたがった疾患の診断
または治療に使用する戦略は、調節されない組織増殖お
よび分化に関連する疾患、特に癌の背景における療法の
ため記載されてきているため、期待できない戦略であっ
た（ＷＯ ９８／１１２３２）。さらに、遺伝子ファミ
リーＮＭ２３のポリペプチド、核酸またはこれらのポリ
ペプチドをコードするｃＤＮＡおよび皮膚または腸の障
害または創傷治癒または創傷治癒の障害の間に、いかな
る関連も確立されてきていない。したがって、本発明に
したがった核酸および／またはポリペプチドを使用する
ことが可能であることは意外であった。
【００１９】一般的に、組織において差別的に発現され
る遺伝子の解析は、細胞培養系の解析よりも、明らかに
より多い、偽陽性クローンの形の誤りに悩まされる。こ
れは、限定された細胞培養系の使用により避けることが
不可能である。現存する培養系は、創傷治癒過程の複雑
さを満足にシミュレーションすることが不可能であるた
めである。
【００２０】この問題は、多様な異なる細胞種からなる
皮膚に関し、特に当てはまる。さらに、創傷治癒は、多
様な細胞種の増殖および分化を含む、細胞過程の空間的
および時間的変化を伴う、非常に複雑な過程である。し
たがって、専門家にとって、皮膚の複雑な系だけでな
く、さらに創傷治癒の生理学的過程、そしてさらに差別
的に発現される遺伝子のレベルでの創傷治癒の異なる段
階も解析するのは、期待できない戦略である。これらの
困難に基づき、スクリーニングの成功は、実験パラメー
ターの選択に依存した。適用される方法は標準的である
（例えばサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション）
一方、スクリーニングおよび確認戦略は、洗練されそし
て限定された選択のパラメーターのため、創意がある。
例えば、生検試料を採取する時点の選択が、スクリーニ
ングの成功のため重要である：創傷治癒および皮膚の障
害は、しばしば、細胞増殖および細胞移動の障害により
引き起こされる。これらの過程は創傷の１日後に開始さ
れる。したがって、この時点の分子過程の解析は、正常
の創傷治癒に必須の過程に、それほど多くの洞察を提供
しないであろう。しかし、創傷の１日後以降の時点での
創傷治癒の経過において、創傷における細胞種の組成
は、かなり変化している。その結果、この創傷における
差別的な発現は、必ずしも該遺伝子が細胞において差別
的に発現されることを意味せず、単に異なる細胞種組成
を反映する可能性もある。したがって、生検を採取する
日の選択は、スクリーニングの成功のため重要である。
【００２１】限定されたパラメーターにもかかわらず、
得られた遺伝子中で、創傷治癒中に差別的に発現され、
皮膚の創傷治癒または障害における使用に不適切である
遺伝子の過剰提示（ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔ
ｉｏｎ）が観察された。これらの遺伝子は、例えば、主
要な代謝、例えば解糖、クエン酸回路、糖新生および呼
吸鎖の酵素をコードする遺伝子を含み、また、リボソー
ムタンパク質、例えばＬ４１およびＳ２０をコードする
遺伝子も含む。比較的少数の適切な遺伝子のみを同定す
ることが可能であった。したがって、使用可能なまたは
本発明にしたがった同定遺伝子が創傷治癒に関連するこ
とは驚くべきことであった。
【００２２】さらに、最初に来診した潜在的な患者から
生検を採取した時点では、創傷の状態は非常に多様であ
る。したがって、本発明にしたがって用いられる核酸の
同定のため、動物モデルを用いた。ＢＡＬＢ／ｃマウス
に創傷を与え、そして多様な時点で創傷生検を採取し
た。本過程は、遺伝的背景、創傷の種類、生検を採取し
た時点などの境界条件などを、正確に調節し、そしてし
たがって遺伝子発現の再現可能な解析を可能にするとい
う利点を有する。動物モデルの限定された条件下であっ
てさえ、関連する遺伝子の同定を複雑にする、解析クロ
ーンの過剰および弱く発現される遺伝子の過少提示など
の、さらなる方法論的問題が発生する。
【００２３】本発明にしたがった遺伝子ファミリーＮＭ
２３のポリペプチドの寄託番号およびそのｃＤＮＡが図
５に示される。本発明にしたがい使用可能なポリペプチ
ドＮＭ２３−Ｍ２のｃＤＮＡは、損なわれていない（ｉ
ｎｔａｃｔ）および創傷を受けた皮膚から得たｃＤＮＡ
ライブラリーから単離した。正常治癒対不完全治癒（デ
キサメタゾン治療）創傷のｃＤＮＡライブラリーにおい
て、異なる存在量を示したｃＤＮＡを選択した（実施例
１）。これは、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーシ
ョンにより、行った（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏら， １９
９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ９３：６０２５−６０３０）。選択され
たｃＤＮＡは、正常治癒創傷のｃＤＮＡプールに対し、
デキサメタゾン治療動物のｃＤＮＡプールにおいて、よ
り高い存在量を示した。ＮＭ２３−Ｍ２は、マウス創傷
ｃＤＮＡのサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション
を通じ、同定することが可能であった。ＮＭ２３−Ｍ２
は、損なわれていない皮膚に対する正常治癒１日創傷の
サブトラクションから得られたｃＤＮＡ集団において
も、そして良好治癒創傷に対する不完全治癒創傷（デキ
サメタゾン治療マウス）のサブトラクションから得られ
たｃＤＮＡ集団においても、共に濃縮されていた（実施
例１）。これは、ＮＭ２３が正常創傷治癒中、制御され
るだけでなく、発現の制御が創傷治癒の正常な進行にも
必須であることを示唆した。
【００２４】遺伝子が最初に同定された後、別の方法に
より、創傷治癒特異的発現を確認することが必要であ
る。これは、いわゆる「逆ノーザンブロット」、「ＲＮ
アーゼ保護アッセイ」、「ＲＴ−ＰＣＲアッセイ」、
「ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション」および「Ｔ
ａｑＭａｎ解析」により、行った。これらの方法を用
い、多様な創傷治癒状態で、そして皮膚障害（乾癬）か
ら、そして腸障害（クローン病）から採取した生検にお
けるｍＲＮＡの量を測定した。それにより、皮膚および
腸生検の発現パターンの組織特異的局所変化を決定した
（実施例２−７）。
【００２５】逆ノーザンブロットで、サブトラクション
後のＮＭ２３−Ｍ２ ｃＤＮＡの濃縮を確認することが
可能であった（図１、実施例１）。さらに、マウスの５
日創傷の組織切片のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーシ
ョンは、遺伝子ＮＭ２３−Ｍ１が創傷縁で過剰増殖上皮
において発現されていることを示した。これは、該遺伝
子が角化細胞の増殖および創傷の上皮再形成に必須の役
割を果たしていることを支持する（実施例４）。ＮＭ２
３−Ｍ２の発現が、コントロール動物の正常良好治癒創
傷におけるより、デキサメタゾン治療マウスの不完全治
癒創傷において、およそ５倍強いことはまた、定量的Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ解析によっても、示すことが可能であった
（図２、実施例２）。したがって、サブトラクション実
験により示唆された、創傷治癒過程におけるＮＭ２３の
必須の役割を、確認することが可能であった。
【００２６】さらに、ＮＭ２３の発現は、乾癬と関連付
けることも可能であった。それぞれ、乾癬患者の損傷皮
膚領域の生検または正常な皮膚のコントロール被験者の
生検から得たＲＮＡを用い、「ＲＮアーゼ保護アッセ
イ」を行った。コントロール被験者の皮膚に比較し、患
者の皮膚において、ＮＭ２３−Ｈ１が有意に強く発現さ
れていることを示すことが可能であった（図３、実施例
３）。したがって、乾癬の場合も、ＮＭ２３および疾患
の進行の間に関連がある。
【００２７】炎症性腸障害クローン病の場合、同様の相
関が見出された。患者から、明らかに炎症がある領域お
よびより炎症が少ない領域の腸生検を採取した。健常コ
ントロール被験者の腸生検に比べ、クローン病患者の腸
生検はすべて、ＮＭ２３−Ｈ１発現の有意な増加を示し
た（図４、実施例３）。さらに、ＮＭ２３−Ｈ１発現
と、疾患の重症度の相関を見出すことが可能であった。
腸の、より炎症の少ない領域が、ＮＭ２３−Ｈ１発現の
中程度の増加しか示さなかった一方、明らかに炎症があ
る領域では、発現の強い増加を見出すことが可能であっ
た（図４）。これらの結果は、ＮＭ２３の発現が疾患の
重症度を反映するだけでなく、疾患の進行に必須であ
り、そしてＮＭ２３の発現を、これらの疾患の診断マー
カーとして用いることが可能であることを立証する。
【００２８】本発明にしたがって用いられるポリペプチ
ドは、さらに、これらが合成的に調製されることで特徴
付けることが可能である。したがって、全ポリペプチド
またはその一部を、例えば慣用的な合成（Ｍｅｒｒｉｆ
ｉｅｌｄ技術）の補助で、合成してもよい。本発明にし
たがって用いられるポリペプチドの一部は、抗血清を得
るのに特に適しており、これを用い、適切な遺伝子発現
バンクを検索し、本発明にしたがって用いられるポリペ
プチドのさらなる機能する変異体にたどりついてもよ
い。
【００２９】本発明の意味の範囲内の「機能する変異
体」という用語は、本発明にしたがい使用可能なポリペ
プチドに機能上関連する、すなわち皮膚または腸の再生
過程中に制御されるおよび／または該ポリペプチドの構
造的特徴を有するポリペプチドを意味すると理解され
る。機能する変異体の例は、遺伝子の異なる対立遺伝子
による、生物の多様な個体または多様な器官にコードさ
れるポリペプチドである。
【００３０】他の例には、例えば、非皮膚または非腸特
異的組織、例えば胚性組織から単離されるが、創傷治癒
に関与する細胞において、発現後に、示される機能を有
する、核酸によりコードされるポリペプチドが含まれ
る。
【００３１】さらなる意味において、本用語はまた、配
列番号１ないし配列番号１０の１つにしたがったアミノ
酸配列を有するポリペプチドに、および／またはＤＮＡ
配列の補助で、図５のリストの公的にアクセス可能なデ
ータベースエントリーに、約７０％、好ましくは約８０
％、特に約９０％、特に約９５％の配列相同性、特に配
列同一性を有するポリペプチドを意味するとも理解され
る。
【００３２】機能する変異体はまた、長さ少なくとも６
アミノ酸、優先的には少なくとも８アミノ酸、特に好ま
しくは少なくとも１２アミノ酸を持つ、本発明にしたが
い使用可能なポリペプチドの一部も含む。
【００３３】さらに、これらはまた、約１−６０、好ま
しくは約１−３０、特に約１−１５、特に約１−５アミ
ノ酸の範囲のポリペプチドの、Ｎ−および／またはＣ−
末端および／または内部欠失体（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）ま
たは部分も含む。例えば、最初のアミノ酸、メチオニン
は、ポリペプチドの機能を有意に改変することなく、欠
失させることが可能である。
【００３４】「コードする核酸」という用語は、本発明
にしたがい使用可能な、単離可能ポリペプチドまたは例
えばシグナル配列を含む前駆体をコードするＤＮＡ配列
に関する。ポリペプチドは、全長配列、または特定の、
例えば酵素的、活性を保持する限り、コード配列のいか
なる一部の配列によりコードされていてもよい。
【００３５】本発明にしたがって用いられる核酸の配列
における改変は、例えば、遺伝暗号の縮重のため、存在
してもよく、または活性を有意に改変することなく、核
酸の５’および／または３’端に非翻訳配列が結合して
いてもよく；以下に言及される修飾もまた、核酸に適用
されてもよいことが知られる。本発明はしたがって、ま
た、本発明にしたがって用いられる核酸のいわゆる「変
異体」も含む。
【００３６】「変異体」という用語は、ストリンジェン
トな条件下で基準配列とハイブリダイズし、そして本発
明にしたがって用いられる対応するポリペプチドに対し
全体的に類似の活性を有するＤＮＡ配列に相補的なＤＮ
Ａ配列すべてを示す。
【００３７】「制御」という用語は、ポリペプチドまた
はこれらのポリペプチドをコードする核酸の量の増加ま
たは減少を意味し、こうした変化は例えば転写または翻
訳のレベルで起こると理解される。
【００３８】「ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件」は、例えば、ハイブリダイゼーションが２．
５ ｘ ＳＳＣ緩衝液中、６０℃で行われた後、より低
い緩衝剤濃度中、３７℃で何回かの洗浄段階を行い、そ
して安定なままである条件を意味すると理解される。
【００３９】核酸の変異体はまた、少なくとも８ヌクレ
オチド、優先的には少なくとも１８ヌクレオチド、特に
少なくとも２４ヌクレオチド、特に好ましくは少なくと
も３０ヌクレオチド、特に好ましくは少なくとも４２ヌ
クレオチドの長さを持つ、本発明にしたがい使用可能な
核酸の一部も含む。
【００４０】優先的には、本発明にしたがって用いられ
る核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ、特
に二本鎖ＤＮＡである。核酸の配列は、さらに、少なく
とも１つのイントロンおよび／または１つのポリＡ配列
を有することで特徴付けることが可能である。本発明に
したがって用いられる核酸はまた、そのアンチセンス配
列の形で用いてもよい。
【００４１】本発明にしたがって用いられる遺伝子の発
現には、一般的に二本鎖ＤＮＡが好ましく、ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ領域が特に好ましい。この領域は
コザック配列（Ｋｏｚａｋ， １９８７， Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５： ８１２５−４
８）内にある最初の開始コドン（ＡＴＧ）から始まり、
該ＡＴＧに対し同一読み枠にある次の停止コドン（ＴＡ
Ｇ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）までである。
【００４２】本発明にしたがって用いられる核酸配列の
さらなる使用は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｚ
ｈｅｎｇおよびＫｅｍｅｎｙ， １９９５， Ｃｌｉ
ｎ．Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １００： ３８０−
２； ＮｅｌｌｅｎおよびＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，
１９９３， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃ
ｉ． １８： ４１９−２３； Ｓｔｅｉｎ， １９９
２， Ｌｅｕｋｅｍｉａ ６： ９６７−７４）および
／またはリボザイム（Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉら， １
９９８， Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．
５４： １１７５−２０２； Ｖａｉｓｈら， １９
９８， Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ． ２６：
５２３７−４２； Ｐｅｒｓｉｄｉｓ， １９９７，
Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５： ９２１
−２； ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，
１９９６， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １２：５
１０−５）の構築である。アンチセンスオリゴヌクレオ
チドを用い、本発明にしたがって用いられる核酸の安定
性を減少させてもよく、および／または本発明にしたが
って用いられる核酸の翻訳を阻害してもよい。したがっ
て、例えば、細胞における対応する遺伝子の発現をｉｎ
ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ両方で減少させるこ
とが可能である。したがって、オリゴヌクレオチドまた
はリボザイムは治療剤として適している可能性がある。
本戦略は、例えば、皮膚、上皮および真皮細胞にとって
さえも、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドがリポソ
ームと複合体化されている場合、適している（Ｓｍｙｔ
ｈら， １９９７， Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａ
ｔｏｌ． １０８： ５２３−６； Ｗｈｉｔｅら，
１９９９， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏ
ｌ． １１２： ６９９−７０５； Ｗｈｉｔｅら，
１９９９， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏ
ｌ． １１２： ８８７−９２）。プローブとしてまた
は「アンチセンス」オリゴヌクレオチドとしての使用に
は、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが好ましい。
【００４３】さらに、合成的に調製されている核酸を、
本発明を実施するのに用いてもよい。したがって、本発
明にしたがって用いられる核酸は、例えば図５に記載さ
れるＤＮＡ配列の補助で、および／または遺伝暗号に関
し、これらの図に同様に記載されるタンパク質配列の補
助で、例えばホスホトリエステル法（例えば、Ｕｌｍａ
ｎｎ， Ｅ． ＆ Ｐｅｙｍａｎ， Ａ．（１９９０）
ＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ， ９０， ５４３
−５８４， Ｎｏ． ４を参照されたい）にしたがい、
化学的に合成することが可能である。
【００４４】一般的に、オリゴヌクレオチドは、細胞に
発生しているエンドまたはエキソヌクレアーゼにより、
特にＤＮアーゼおよびＲＮアーゼにより、迅速に分解さ
れる。したがって、高濃度の核酸が、長期間に渡り、細
胞において維持されるように、分解に対し安定化するた
めに、核酸を修飾することが好都合である（Ｂｅｉｇｅ
ｌｍａｎら， １９９５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ． ２３：３９８９−９４； Ｄｕｄｙｃ
ｚ， １９９５， ＷＯ９５１１９１０； Ｍａｃａｄ
ａｍら， １９９８， ＷＯ９８３７２４０； Ｒｅｅ
ｓｅら， １９９７， ＷＯ９７２９１１６）。典型的
には、こうした安定化は、１つまたはそれ以上のヌクレ
オチド間リン基の導入により、あるいは１つまたはそれ
以上の非リンヌクレオチド間基の導入により、得ること
が可能である。
【００４５】適切な修飾ヌクレオチド間基は、Ｕｈｌｍ
ａｎｎおよびＰｅｙｍａｎｎ（１９９０ Ｃｈｅｍ．
Ｒｅｖ． ９０， ５４４）に要約されている（また、
Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら， １９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３： ３９８９−９４； Ｄ
ｕｄｙｃｚ， １９９５， ＷＯ ９５／１１９１０；
Ｍａｄａｄａｍら， １９９８， ＷＯ ９８／３７
２４０； Ｒｅｅｓｅら， １９９７， ＷＯ ９７／
２９１１６も参照されたい）。本発明にしたがった使用
の１つで使用することが可能な、核酸中の修飾ヌクレオ
チド間リン酸遊離基および／または非リン性架橋は、例
えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホス
ホラミデート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル
を含み、一方、非リン性ヌクレオチド間類似体（ａｎａ
ｌｏｇｕｅ）は、例えば、シロキサン架橋、カルボネー
ト架橋、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート
架橋および／またはチオエーテル架橋を含む。また、本
修飾は、本発明にしたがった使用の１つに使用してもよ
い、薬剤組成物の貯蔵寿命も改善するはずであることも
意図される。
【００４６】本発明のさらなる態様において、本発明に
したがって用いられる核酸を、皮膚および／または腸の
障害および／または創傷治癒および／または創傷治癒の
障害の解析および／または診断および／または予防およ
び／または治療に用いようとする、ベクター、好ましく
はシャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベ
クターまたは遺伝子治療活性を有するベクターの形のベ
クターの調製に用いる。さらに、該核酸を用い、ノック
アウト遺伝子構築物または発現カセットを調製してもよ
い。
【００４７】したがって、本発明にしたがって用いられ
る核酸は、ベクター、好ましくは発現ベクターまたは遺
伝子治療に適したベクターに含まれてもよい。好ましく
は、遺伝子治療に適したベクターは、本発明にしたがい
使用可能な核酸と機能上関連する、創傷、腸、または皮
膚特異的制御配列を含む。
【００４８】発現ベクターは、原核または真核発現ベク
ターであってもよい。原核発現ベクターの例は、大腸菌
（Ｅ． ｃｏｌｉ）における発現では、例えばｐＧＥＭ
またはｐＵＣ誘導体であり、真核発現ベクターの例は、
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現では、例え
ばベクターｐ４２６Ｍｅｔ２５またはｐ４２６ＧＡＬ１
であり（Ｍｕｍｂｅｒｇら（１９９４）Ｎｕｃｌ． Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２２， ５７６７−５７６
８）、昆虫細胞における発現では、例えばバキュロウイ
ルスベクター、例えばＥＰ−Ｂ１−０ １２７ ８３９
またはＥＰ−Ｂ１−０ ５４９ ７２１に開示されるも
のであり、そして哺乳動物細胞における発現では、例え
ばベクターＲｃ／ＣＭＶおよびＲｃ／ＲＳＶまたはＳＶ
４０ベクターであり、これらはすべて一般的に入手可能
である。
【００４９】一般的に、発現ベクターはまた、それぞれ
の宿主細胞に適したプロモーターを含んでおり、例え
ば、大腸菌における発現ではｔｒｐプロモーター（例え
ば、ＥＰ−Ｂ１−０ １５４ １３３を参照された
い）、酵母における発現ではＭｅｔ２５、ＧＡＬ １ま
たはＡＤＨ２プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌら（１９８
３）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５８， ２
６７４−２６８２； Ｍｕｍｂｅｒｇ、上記）、昆虫細
胞における発現ではバキュロウイルス・ポリヘドリン
（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーター（例えば、ＥＰ
−Ｂ１−０ １２７ ８３９を参照されたい）である。
哺乳動物細胞における発現では、例えば、適切なプロモ
ーターは、真核細胞において、恒常的、制御可能、組織
特異的、細胞周期特異的または代謝特異的発現を可能に
するものである。本発明にしたがった制御可能要素は、
プロモーター、アクチベーター配列、エンハンサー、サ
イレンサーおよび／またはリプレッサー配列である。
【００５０】真核生物において恒常的発現を可能にする
適切な制御可能要素の例は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ
により認識されるプロモーターまたはウイルスプロモー
ター、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ
４０プロモーターまたはＬＴＲプロモーター、例えばＭ
ＭＴＶ（マウス乳腺腫瘍ウイルス； Ｌｅｅら（１９８
１）Ｎａｔｕｒｅ ２１４， ２２８−２３２）由来の
もの、およびさらなるウイルスプロモーターおよびアク
チベーター配列、例えばＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰ
Ｖ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶまたはＨＩＶ由来のものである。
【００５１】真核生物において制御可能発現を可能にす
る制御可能要素の例は、対応するリプレッサーと組み合
わせたテトラサイクリンオペレーターである（Ｇｏｓｓ
ｅｎＭ．ら（１９９４）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５，５１６−２０）。
【００５２】好ましくは、創傷治癒に関連する遺伝子の
発現は、組織特異的プロモーターの調節下で起こり、創
傷、皮膚または腸特異的プロモーター、例えばヒトＫ１
０プロモーター（Ｂａｉｌｌｅｕｌら， １９９０，
Ｃｅｌｌ ６２： ６９７−７０８）、ヒトＫ１４プロ
モーター（Ｖａｓｓａｒら， １９８９， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：
１５６３−６７）、ウシサイトケラチンＩＶプロモー
ター（Ｆｕｃｈｓら， １９８８； Ｔｈｅｂｉｏｌｏ
ｇｙ ｏｆ ｗｏｏｌ ａｎｄ ｈａｉｒ（Ｇ．Ｅ．
Ｒｏｇｅｒｓら監修）， ｐｐ． ２８７−３０９．
Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，ロンドン／ニュー
ヨーク）またはラット由来の「脂肪酸結合タンパク質」
プロモーターが特に好ましい。
【００５３】真核生物において組織特異的発現を可能に
する制御可能要素のさらなる例は、特定の細胞種のみで
発現されるタンパク質をコードする遺伝子のプロモータ
ーまたはエンハンサー由来のプロモーターまたはアクチ
ベーター配列である。
【００５４】真核生物において細胞周期特異的発現を可
能にする制御可能要素の例は、以下の遺伝子のプロモー
ターである：ｃｄｃ２５、サイクリンＡ、サイクリン
Ｅ、ｃｄｃ２、Ｅ２Ｆ、Ｂ−ｍｙｂまたはＤＨＦＲ（Ｚ
ｗｉｃｋｅｒ Ｊ．およびＭｕｌｌｅｒ Ｒ．（１９９
７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １３， ３−６）。
【００５５】真核生物において代謝特異的発現を可能に
する制御可能要素の例は、低酸素症、グルコース欠乏、
リン酸濃度または熱ショックにより制御されるプロモー
ターである。
【００５６】トランスフェクション、形質転換または感
染による、真核または原核細胞における、本発明にした
がって用いられる核酸の導入、およびしたがってポリペ
プチドの発現を可能にするため、核酸は、プラスミドと
して、ウイルスまたは非ウイルスベクターの一部として
存在してもよい。適切なウイルスベクターは特に：バキ
ュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、
アデノ関連ウイルスおよびヘルペスウイルスである。適
切な非ウイルスベクターは特に：ビロソーム、リポソー
ム、陽イオン性脂質、またはポリ−リジン−結合ＤＮＡ
である。
【００５７】遺伝子治療に適したベクターの例は、ウイ
ルスベクター、例えばアデノウイルスベクターまたはレ
トロウイルスベクターである（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎら，
１９９７， Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ３： ４６６−７
６； Ｓｐｒｉｎｇｅｒら，１９８８， Ｍｏｌ． Ｃ
ｅｌｌ． ２： ５４９−５８）。裸のＤＮＡは局所適
用後、皮膚細胞に入り込むことが可能であるため、真核
発現ベクターは、単離された型で、遺伝子治療に使用す
るのに適している（Ｈｅｎｇｇｅら， １９９６，
Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７： ２９１１
−６； Ｙｕら， １９９９， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ．
Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １１２： ３７０−５）。
【００５８】遺伝子治療に適したベクターはまた、本発
明にしたがって用いられる核酸を、リポソームと複合体
化することにより得ることも可能であり、これはこのよ
うにして、特に皮膚細胞の、非常に高いトランスフェク
ション効率を達成することが可能であるためである（Ａ
ｌｅｘａｎｄｅｒおよびＡｋｈｕｒｓｔ， １９９５，
Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ４： ２２７９
−８５）。リポフェクションの場合、リポソーム懸濁物
の超音波処理により、陽イオン性脂質から小さい単層小
胞を調製する。ＤＮＡはイオン的にリポソームの表面に
結合し、すなわち、陽性正味電荷が残り、そしてプラス
ミドＤＮＡがリポソームにより１００％複合体化される
ような比率で結合する。一方で、Ｆｅｌｇｎｅｒら（１
９８７、上記）に使用された脂質混合物、ＤＯＴＭＡ
（１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−トリメチル
アンモニウムブロミド）およびＤＰＯＥ（ジオレイルホ
スファチジルエタノールアミン）に加え、多くの新規脂
質処方が合成され、そして多様な細胞株のトランスフェ
クションにおけるその効率に関し試験された（Ｂｅｈ
ｒ， Ｊ．Ｐ．ら（１９８９）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６， ６９８
２−６９８６； Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｊ．Ｈ．ら（１９
９４）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， ２５
５０−２５６１；Ｇａｏ， Ｘ． ＆ Ｈｕａｎｇ，
Ｌ．（１９９１）， Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ． Ａｃｔａ １１８９， １９５−２０３）。新規
脂質処方の例は、ＤＯＴＡＰ Ｎ−［１−（２，３−ジ
オレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチ
ルアンモニウムエチル−サルフェートまたはＤＯＧＳ
（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ；ジオクタデシルアミドグリ
シルスペルミン）である。細胞への核酸の輸送を増加さ
せる補助剤は、例えば、細胞核への核酸の輸送を可能に
する、ＤＮＡに結合しているタンパク質またはペプチド
あるいは合成ペプチド−ＤＮＡ分子であってもよい（Ｓ
ｃｈｗａｒｔｚら（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ６， ２８２； Ｂｒａｎｄｅｎら（１９９９）Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １７， ７８４）。補
助剤はまた、細胞の細胞質への核酸の放出を可能にする
分子（Ｐｌａｎｃｋら（１９９４）Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ２６９， １２９１８； Ｋｉｃｈｌｅｒ
ら（１９９７）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ． ８， ２
１３）、または例えば、リポソーム（Ｕｈｌｍａｎｎお
よびＰｅｙｍａｎｎ（１９９０）上記）も含む。遺伝子
治療ベクターの別の特に適切な型は、本発明にしたがい
使用可能な核酸を金粒子に適用し、そしてこれらを、い
わゆる遺伝子銃の補助で、組織、好ましくは皮膚、また
は細胞内に撃ち込むことにより、得ることが可能である
（Ｗａｎｇら， １９９９， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ．
Ｄｅｒｍａｔｏｌ．， １１２： ７７５−８１， Ｔ
ｕｔｉｎｇら， １９９８， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ．
Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １１１：１８３−８）。
【００５９】本発明にしたがい使用可能な遺伝子治療に
適したベクターのさらなる型は、「裸の」発現ベクター
を、生体適合マトリックス、例えばコラーゲンマトリッ
クスに導入することにより、調製してもよい。移入細胞
を発現ベクターでトランスフェクションし、そして本発
明にしたがって用いられるポリペプチドを細胞において
発現させるため、本マトリックスを創傷に導入してもよ
い（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＢａｎａｄｉｏ、ＵＳ
５，９６２，４２７）。
【００６０】本発明にしたがい使用可能な核酸を遺伝子
治療で使用するため、ポリペプチドをコードする核酸の
一部が、好ましくはプロモーターおよびポリペプチドの
開始コドンの間のイントロン配列、および／または特に
遺伝子の３’端のポリＡ配列、特に天然発生ポリＡ配列
またはＳＶ４０ウイルスポリＡ配列を含む、１つまたは
それ以上の非コード配列を含む場合もまた、好都合であ
る。これはそれによりｍＲＮＡの安定化を達成すること
が可能であるためである（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．
（１９９３）Ｃｅｌｌ ７４， ９−１４およびＰａｌ
ｍｉｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８， ４７
８−４８２）。
【００６１】ノックアウト遺伝子構築物は、例えば米国
特許５，６２５，１２２；米国特許５，６９８，７６
５；米国特許５，５８３，２７８および米国特許５，７
５０，８２５から当業者に知られる。
【００６２】本発明はさらに、皮膚および／または腸の
障害および／または創傷治癒および／または創傷治癒の
障害の解析および／または診断および／または予防およ
び／または治療に用いるための、本発明にしたがい使用
可能なベクターまたはノックアウト遺伝子構築物を用い
形質転換されている、宿主細胞、特に皮膚または腸細胞
の使用に関する。宿主細胞は、原核または真核細胞いず
れでもよく、原核宿主細胞の例は大腸菌であり、そして
真核細胞の例はサッカロミセス・セレビシエまたは昆虫
細胞である。
【００６３】本発明にしたがい使用可能な、特に好まし
い形質転換宿主細胞は、トランスジェニック胚性非ヒト
幹細胞であり、該細胞は、本発明にしたがい使用可能な
ノックアウト遺伝子構築物または本発明にしたがい使用
可能な発現カセットを含むことで特徴付けられる。宿主
細胞および／または幹細胞の形質転換のための方法は、
当業者に周知であり、そして、例えばエレクトロポレー
ションまたはマイクロインジェクションを含む。
【００６４】本発明はさらに、皮膚および／または腸の
障害および／または創傷治癒および／または創傷治癒の
障害の解析および／または診断に用いるための、本発明
にしたがい使用可能なノックアウト遺伝子構築物または
本発明にしたがい使用可能な発現カセットをゲノムに含
む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。トラ
ンスジェニック動物は、使用されるプロモーターに応
じ、組織特異的で、一般的には増加した、核酸および／
またはポリペプチドの発現を示し、そして創傷治癒障害
の解析に用いることが可能である。したがって例えば、
アクチビンＡトランスジェニックマウスは、創傷治癒の
改善を示し（Ｍｕｎｚら， １９９９，ＥＭＢＯ Ｊ．
１８： ５２０５−１５）、一方、優性ネガティブＫ
ＧＦ受容体を有するトランスジェニックマウスは、創傷
治癒の遅延を示す（Ｗｅｒｎｅｒら， １９９４， Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２６６： ８１９−２２）。さらに、ト
ランスジェニック動物は、加速された創傷治癒能力を備
える可能性がある。
【００６５】特にマウスの、トランスジェニック動物を
調製するための方法は、同様に、ＤＥ １９６ ２５
０４９およびＵＳ ４，７３６，８６６； ＵＳ ５，
６２５，１２２； ＵＳ ５，６９８，７６５； ＵＳ
５，５８３，２７８およびＵＳ ５，７５０，８２５
から、当業者に知られ、そして例えば胚または精母細胞
への発現ベクターの直接注入（上記を参照されたい）に
より、あるいは胚性幹細胞への発現ベクターのトランス
フェクションにより、産生することが可能なトランスジ
ェニック動物が含まれる（ＰｏｌｉｔｅｓおよびＰｉｎ
ｋｅｒｔ： ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏ
ｄｕｃｔｉｏｎ， １５から６８ページ， Ｐｉｎｋｅ
ｒｔ，１９９４： Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａ
ｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｈａｎｄｂｏｏｋ，中， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，英国ロンドン； Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ， １９９
７， ＨａｒｗｏｏｄＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｅｒｓ ，オランダ・アムステルダム；Ｄｏｅｔｓｃ
ｈｍａｎ： Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｅｍ
ｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， １１５から
１４６ページ， Ｐｉｎｋｅｒｔ，１９９４，上記，
中； Ｗｏｏｄ： Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａ
ｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， １４７から１
７６ページ， Ｐｉｎｋｅｒｔ， １９９４，上記，
中； Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ： Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎ
ｓｆｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； Ａｌｔｅｒｎａｔ
ｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ， １７７から２２０ページ， Ｐｉｎｋ
ｅｒｔ， １９９４，上記，中）。
【００６６】本発明にしたがって用いられる核酸が、い
わゆるターゲッティングベクター（Ｐｉｎｋｅｒｔ、１
９９４、上記）に組み込まれている場合、胚性幹細胞の
トランスフェクションおよび相同組換え後、例えば、一
般的にはヘテロ接合体マウスとして、核酸発現の減少を
示し、一方、ホモ接合体マウスはもはや核酸発現を示さ
ない、ノックアウトマウスを生成することが可能であ
る。こうして産生された動物はまた、創傷治癒障害の解
析に用いることも可能である。したがって、例えばｅＮ
ＯＳ（Ｌｅｅら， １９９９， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ． ２７７：Ｈ１６００−１６０８）、Ｎｆ−
１（Ａｔｉｔら， １９９９， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ．
Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １１２： ８３５−４２）およ
びオステオポンチン（Ｌｉａｗら， １９９８， Ｊ．
Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０１： ９６７−７
１）ノックアウトマウスは、損なわれた創傷治癒を示
す。ここでもまた、創傷治癒関連遺伝子の発現の、組織
特異的減少、例えばＣｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いた皮膚特
異的細胞における発現減少（ｓｔａｔ３ノックアウト、
Ｓａｎｏら， ＥＭＢＯ Ｊ． １９９９ １８： ４
６５７−６８）が特に好ましい。この方法で産生された
トランスジェニックおよびノックアウト細胞または動物
はまた、薬理学的に活性がある物質または遺伝子治療に
適したベクターの、それぞれ、スクリーニングおよび同
定に用いてもよい。
【００６７】本発明はさらに、皮膚および／または腸の
障害および／または創傷治癒および／または創傷治癒の
障害の解析および／または診断および／または予防およ
び／または治療のための、および／または適切な宿主細
胞における薬理学的に活性がある物質の同定のための、
本発明にしたがい使用可能な少なくとも１つのポリペプ
チドおよび／または上述のポリペプチドをコードする少
なくとも１つの核酸の使用に関する。
【００６８】ポリペプチドは、例えば、本発明にしたが
って用いられる核酸を、すでに上述されたような適切な
発現系で、当業者に一般的に知られる方法にしたがって
用い、発現させることにより、調製する。適切な宿主細
胞は、例えば、大腸菌株、ＤＨＳ、ＨＢ１０１またはＢ
Ｌ２１、酵母株サッカロミセス・セレビシエ、鱗肢目
（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）昆虫細胞株、例えばスポド
プテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕ
ｇｉｐｅｒｄａ）由来のもの、または動物細胞、ＣＯ
Ｓ、Ｖｅｒｏ、２９３、ＨａＣａＴ、およびＨｅＬａで
あり、これらはすべて一般的に入手可能である。
【００６９】本発明はさらに、適切な宿主細胞における
本発明にしたがった核酸の発現により産生される融合タ
ンパク質の、皮膚および／または腸の障害および／また
は創傷治癒および／または創傷治癒の障害の解析および
／または診断および／または予防および／または治療の
ための、あるいは適切な宿主細胞における薬理学的に活
性がある物質の同定のための、使用に関する。融合タン
パク質は、本発明にしたがって用いられるポリペプチド
の機能をすでに有するか、または融合部分の切断後の
み、機能的に活性であるかいずれかである。本明細書に
特に含まれるのは、約１−２００、好ましくは約１−１
５０、特に約１−１００、特に約１−５０の異質の（ｆ
ｏｒｅｉｇｎ）アミノ酸を有する融合タンパク質であ
る。こうしたペプチド配列の例は、例えば、大腸菌のガ
ラクトシダーゼに由来してもよい、原核ペプチド配列で
ある。さらに、こうして当業者に知られるファージディ
スプレー法のための融合タンパク質を産生するため、例
えばバクテリオファージＭ１３の、ウイルスペプチド配
列もまた、用いてもよい。
【００７０】融合タンパク質に用いるべきペプチド配列
のさらなる好ましい例は、融合タンパク質の検出を容易
にするペプチド、例えば「緑色蛍光タンパク質」（ＷＯ
９５／０７４６３）またはその機能する変異体であ
る。
【００７１】本発明にしたがったタンパク質の精製のた
め、単数または複数のさらなるポリペプチド（タグ）を
結合させてもよい。本発明にしたがったタンパク質タグ
は、例えば、マトリックスへの高親和性吸収、複合体を
溶出させることのない、感知可能な度合いまでの適切な
緩衝液でのストリンジェントな洗浄およびそれに続く吸
収複合体の選択的溶出を可能にする。当業者に知られる
タンパク質タグの例は、（Ｈｉｓ）6タグ、Ｍｙｃタ
グ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＳｔｒｅｐタグＩ
Ｉ、赤血球凝集素タグ、グルタチオントランスフェラー
ゼ（ＧＳＴ）タグ、インテイン含有親和性キチン結合タ
グまたはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグであ
る。これらのタンパク質タグは、Ｎ−またはＣ−末端に
および／または内部に位置してもよい。
【００７２】本発明はさらに、皮膚および／または腸の
障害および／または創傷治癒および／または創傷治癒の
障害の解析および／または診断および／または予防およ
び／または治療のための、および／または薬理学的に活
性がある物質の同定のための、抗体、好ましくは、ポリ
クローナルまたはモノクローナル抗体の使用に関する。
【００７３】このように、例えば、ＴＧＦベータ１に対
するモノクローナル抗体の局所注射は、動物モデルにお
いて、創傷治癒を改善する可能性がある（Ｅｒｎｓｔ
ら，１９９６， Ｇｕｔ ３９： １７２−５）。
【００７４】抗体を産生するため、本発明にしたがって
用いられるポリペプチドまたはその機能する変異体また
は少なくとも６アミノ酸、優先的には少なくとも８アミ
ノ酸、特に好ましくは少なくとも１２アミノ酸を持つ、
その一部を用いる。
【００７５】該方法は、当業に一般的に知られる方法に
したがい、哺乳動物、例えばウサギを、適切な場合、例
えばフロイントのアジュバントおよび／または水酸化ア
ルミニウムゲルの存在下で、本発明にしたがって用いら
れるポリペプチドまたはその言及された一部を用い免疫
することにより実行する（例えば、Ｄｉａｍｏｎｄ，
Ｂ．Ａ．ら（１９８１） Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １３
４４−１３４９を参照されたい）。免疫学的反応の結果
として動物で作成されたポリクローナル抗体は、その
後、一般的に知られる方法にしたがい、容易に血液から
単離し、そして例えばカラムクロマトグラフィーによ
り、精製することが可能である。モノクローナル抗体
は、例えばＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの既知
の方法（Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，
Ｃ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ， ３４９， ２９３
−２９９）にしたがい、産生することが可能である。
【００７６】古典的な抗体の代替物として、リポカリン
（ｌｉｐｏｃａｌｉｎｅ）に基づく、いわゆる「アンチ
カリン」を利用することも可能である（Ｂｅｓｔｅら，
１９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６：１８９８−１９０３）。リ
ポカリン、例えばレチノール結合タンパク質またはビリ
ン（ｂｉｌｉｎｅ）結合タンパク質の天然リガンド結合
部位は、例えば、選択されたハプテンが、例えば本発明
にしたがって用いられるポリペプチドに結合するような
方式で、「コンビナトリアル・タンパク質設計アプロー
チ」により、修飾してもよい（Ｓｋｅｒｒａ， ２００
０， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ
１４８２：３３７−３５０）。抗体の代替物として用
いてもよい、さらなる既知の「骨格（ｓｃａｆｆｏｌ
ｄ）」が記載されてきている（Ｓｋｅｒｒａ， Ｊ．
Ｍｏｌ． Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．， ２０００， １３：
１６７−１８７）。
【００７７】本発明にしたがって用いられる抗体は、本
発明にしたがって用いられるポリペプチドに対して向け
られ、そして本発明にしたがって用いられるポリペプチ
ドと特異的に反応する。ここで上述のポリペプチドの部
分は、それ自体免疫原性であるか、あるいは適切なキャ
リアー、例えばウシ血清アルブミンとカップリングさせ
ることにより、免疫原性を与えられても、またはその免
疫原性を増加させてもよい。本抗体は、ポリクローナル
またはモノクローナルいずれかであり、好ましくはモノ
クローナル抗体である。抗体という用語は、本発明にし
たがい、複数の抗体、または遺伝子操作により調製さ
れ、そして所望により修飾されるその抗原結合部分、例
えばキメラ抗体、ヒト化抗体、多機能抗体、二または少
特異的抗体、一本鎖抗体、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ）
2断片も意味すると理解される（例えば、ＥＰ−Ｂ１−
０ ３６８ ６８４、ＵＳ ４，８１６，５６７、ＵＳ
４，８１６，３９７、ＷＯ ８８／０１６４９、ＷＯ
９３／０６２１３、ＷＯ９８／２４８８４を参照され
たい）。
【００７８】本発明はさらに、適切な場合、適切な添加
剤および／または補助剤と組み合わされた、本発明にし
たがって用いられる少なくとも１つの核酸、本発明にし
たがって用いられる少なくとも１つのポリペプチドまた
は本発明にしたがって用いられる少なくとも１つの抗体
を含む、皮膚および／または腸の障害および／または創
傷治癒および／または創傷治癒の障害の解析および／ま
たは診断および／または予防および／または治療に用い
るための医薬品の使用に関する。
【００７９】障害、特に皮膚または腸障害および／また
は創傷治癒および／または創傷治癒の障害の療法は、慣
用的な方式で、例えば、本発明にしたがい使用可能な医
薬品を含む、包帯剤、硬膏剤、圧迫ガーゼまたはゲルに
より、行ってもよい。したがって、例えば、生理学的生
理食塩水、脱イオン水、安定化剤、プロテイナーゼ阻害
剤などの適切な添加剤または補助剤、例えば、白色ワセ
リン、高流動パラフィンおよび／または黄ろうなどのゲ
ル処方などを含む薬剤を、創傷治癒を直ちにそして直接
達成するため、局所的に投与することが可能である。本
発明にしたがって用いられる医薬品の投与はまた、さら
に、適切な場合、リポソーム複合体または金粒子複合体
の形で、創傷の領域に局所的に行ってもよい。さらに、
治療は、本発明にしたがい使用可能な医薬品の、時間的
に調節された放出を可能にする、経皮療法系（ＴＴＳ）
により行ってもよい。しかし、本発明にしたがい使用可
能な医薬品による治療はまた、経口投薬型、例えば錠剤
またはカプセルにより、粘膜、例えば鼻腔または口腔に
より、あるいは皮膚下に移植された貯蔵物（ｄｉｓｐｏ
ｓｉｔｏｒｉｅｓ）の形で、行ってもよい。ＴＴＳは、
例えば、ＥＰ ０９４４ ３９８ Ａ１、ＥＰ ０ ９
１６ ３３６ Ａ１、ＥＰ ０ ８８９７２３ Ａ１ま
たはＥＰ ０ ８５２ ４９３ Ａ１から知られる。
【００８０】ヒトにおける遺伝子治療使用のため、裸の
形の、あるいは上述の遺伝子治療に適したベクターの１
つの形の、あるいはリポソームまたは金粒子と複合体化
した形の、本発明にしたがって用いられる核酸を含む医
薬品が、特に適している。薬剤ビヒクルは、例えば、好
ましくは、約６．０−８．０の、特に約６．８−７．８
の、特に約７．４のｐＨおよび／または約２００−４０
０ミリオスモル／リットル、特に約２９０−３１０ミリ
オスモル／リットルの浸透圧モル濃度を有する生理学的
緩衝溶液である。さらに、薬剤ビヒクルは、適切な安定
化剤、例えば、ヌクレアーゼ阻害剤、好ましくは、ＥＤ
ＴＡなどの複合体化剤および／または当業者に知られる
他の補助剤を含んでもよい。
【００８１】適切な場合、より詳細に上述される、ウイ
ルスベクターの形の、あるいはリポソーム複合体または
金粒子複合体としての、本発明にしたがって用いられる
核酸の投与は、通常、創傷の領域で局所的に行われる。
例えば生理学的生理食塩水溶液、脱イオン水、安定化
剤、プロテイナーゼ阻害剤などの適切な添加剤または補
助剤、例えば白色ワセリン、高流動パラフィンおよび／
または黄ろうなどのゲル処方などを含むポリペプチド自
体を、創傷治癒を直ちにそして直接達成するため、投与
することもまた可能である。
【００８２】本発明はさらに、皮膚の障害および／また
は腸障害および／または創傷治癒および／または創傷治
癒における障害の診断のための診断剤の使用であって、
本発明にしたがい使用可能な、少なくとも１つの核酸、
少なくとも１つのポリペプチドまたは少なくとも１つの
抗体を、適切な場合、適切な添加剤および補助剤と共に
含む、前記診断剤の使用に関する。
【００８３】例えば、本発明にしたがい使用可能な診断
剤を、ポリメラーゼ連鎖反応（実施例２、例えばＥＰ
０ ２００ ３６２にしたがう、ＰＣＲ診断剤）または
実施例３に詳細に示されるようなＲＮアーゼ保護アッセ
イに基づき、本発明にしたがって用いられる核酸の補助
で調製することが可能である。これらの試験は、本発明
にしたがい使用可能な核酸と、通常対応するｍＲＮＡで
ある相補的対鎖の特異的なハイブリダイゼーションに基
づく。本発明にしたがって用いられる核酸はまた、この
場合、例えばＥＰ ０ ０６３ ８７９に記載されるよ
うに、修飾されていてもよい。好ましくは、本発明にし
たがって用いられるＤＮＡ断片は、一般的に知られる方
法にしたがい、適切な試薬により、例えば放射能的にα
−32Ｐ−ｄＣＴＰで、または非放射能的にビオチンまた
はジゴキシゲニンで標識し、そして、好ましくは、例え
ばセルロースまたはナイロンなどの適切な膜にあらかじ
め結合させてある、単離ＲＮＡとインキュベーションす
る。このように、各組織試料由来の等量の調べるＲＮＡ
を用い、プローブにより特異的に標識されたｍＲＮＡの
量を測定することが可能である。あるいは、ｍＲＮＡの
測定はまた、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションの補
助で、組織切片において、行うことも可能である（実施
例４およびＷｅｒｎｅｒら， １９９２， Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：
６８９６−６９００を参照されたい）。
【００８４】このように、本発明にしたがい使用可能な
診断剤の補助で、ありうる創傷治癒障害、腸障害または
皮膚科学的障害を安全に診断するため、対応する遺伝子
の発現強度に関し、組織試料をｉｎ ｖｉｔｒｏで特異
的に測定することもまた可能である（実施例１ないし
３、５、６）。こうした方法は、例えば障害の初期予後
に特に適している。
【００８５】本発明にしたがい使用可能なさらなる診断
剤は、本発明にしたがって用いられるポリペプチドまた
はより詳細に上述されるその免疫原性部分を含む。好ま
しくは、例えばニトロセルロースまたはナイロンの固相
に結合させてあるポリペプチドまたはその部分は、例え
ば自己免疫抗体とこのように反応することを可能にする
ため、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば調べようとする体
液、例えば創傷分泌物と、接触させてもよい。抗体・ペ
プチド複合体をその後、例えば標識抗ヒトＩｇＧまたは
抗ヒトＩｇＭ抗体の補助で、検出してもよい。標識化
は、例えば呈色反応を触媒するペルオキシダーゼなどの
酵素を伴う。このように、存在する自己免疫抗体の存在
および量を、呈色反応により、容易にそして迅速に検出
することが可能である。
【００８６】別の診断剤は、本発明にしたがって用いら
れる抗体自体を含む。これらの抗体の補助で、例えば、
それにより、ありうる創傷治癒障害の徴候を得るため、
関係するポリペプチドが増加した量で存在するかどうか
に関し、組織試料を容易にそして迅速に調べることが可
能である。この場合、本発明にしたがって用いられる抗
体は、例えばすでに上述されたような酵素で標識され
る。それにより、特異的抗体・ペプチド複合体は、酵素
呈色反応により、容易にそしてまた迅速に検出すること
が可能である。
【００８７】本発明にしたがい使用可能なさらなる診断
剤は、プローブ、好ましくはＤＮＡプローブおよび／ま
たはプライマーを含む。これは、適切なプローブの補助
で、例えば、適切な遺伝子バンク、例えば創傷特異的遺
伝子バンクからの単離により、本発明にしたがって用い
られる核酸を得るさらなる可能性を開く（例えば、Ｊ．
Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク州コ
ールドスプリングハーバー，第８章， ８．１から８．
８１ページ，第９章， ９．４７から９．５８ページお
よび第１０章， １０．１から１０．６７ページを参照
されたい）。
【００８８】適切なプローブは、例えば、約１００−１
０００ヌクレオチドの長さを有する、好ましくは約２０
０−５００ヌクレオチドの長さを有する、特に約３００
−４００ヌクレオチドの長さを有するＤＮＡまたはＲＮ
Ａ断片であり、その配列は、配列プロトコルの、および
／または図５に示されるデータベースエントリーのｃＤ
ＮＡ配列の補助で、配列番号１ないし配列番号１０にし
たがって用いられるポリペプチドに由来していてもよい
（実施例３、５、６もまた参照されたい）。
【００８９】あるいは、得られた核酸配列の補助で、ポ
リメラーゼ連鎖反応のプライマーとして適しているオリ
ゴヌクレオチドを合成することが可能である。これを用
い、本発明にしたがって用いられる核酸またはこの部分
を、ｃＤＮＡ、例えば創傷特異的ｃＤＮＡから増幅し、
そして単離してもよい（実施例２、５、６）。適切なプ
ライマーは、例えば、約１０−１００ヌクレオチドの長
さを有する、好ましくは約１５ないし５０ヌクレオチド
の長さを有する、特に約２０−３０ヌクレオチドの長さ
を有するＤＮＡ断片であり、その配列は、配列プロトコ
ルの配列番号１ないし配列番号１０にしたがって用いら
れるポリペプチドに由来していてもよく、および／また
は図５に示されるデータベースエントリーのｃＤＮＡ配
列の補助であってもよい（実施例２、５、６）。
【００９０】本発明はさらに、皮膚の障害または腸障害
および／または創傷治癒の治療および／または創傷治癒
の障害と関連する機能上の相互作用因子の同定のため
の、本発明にしたがい使用可能な試験であって、本発明
にしたがって用いられる、少なくとも１つの核酸、少な
くとも１つのポリペプチドまたは少なくとも１つの抗体
を、適切な場合、適切な添加剤および補助剤と共に含
む、前記試験に関する。
【００９１】本発明の意味における「機能上の相互作用
因子」という用語は、適切な場合、適切な添加剤および
／または補助剤を伴う、本発明にしたがって用いられる
核酸、ポリペプチドまたは抗体と、適切な条件下で相互
作用することが可能な、すべての分子、化合物および／
または組成物および物質混合物を意味すると理解され
る。ありうる相互作用因子は、単純な化学有機または無
機分子または化合物であるが、核酸、ペプチド、タンパ
ク質またはそれらの複合体もまた、含む可能性もある。
これらの相互作用のため、機能上の相互作用因子は、ｉ
ｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、核酸、ポリペ
プチドまたは抗体の機能に影響を与え、あるいは単に本
発明にしたがって用いられる核酸、ポリペプチドまたは
抗体に結合し、またはそれらと共有または非共有方式の
他の相互作用を始める可能性がある。
【００９２】本発明にしたがい使用可能な適切な試験系
は、例えば、適切なマーカー遺伝子および本発明にした
がって用いられる核酸を含む発現ベクターでの、表皮ま
たは皮膚細胞の安定トランスフェクションにより、産生
することが可能である。本方法において、本発明にした
がって用いられる核酸の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏの病理
学的に妨害された発現に対応するように、細胞において
改変される。本発明にしたがって用いられる核酸を含む
アンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、本目的のため
使用してもよい。したがって、これらの系には、本出願
に開示されるように、妨害された再生過程における遺伝
子発現の振る舞いを知ることが特に好都合である。しば
しば、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞の病理学的振る舞いは、
このように、模倣することが可能であり、そして細胞の
正常の振る舞いを再現し、そして療法的可能性を有する
物質を探すことが可能である。
【００９３】本発明にしたがい使用可能なこれらの試験
系に適した細胞は、例えば、一般的に入手可能なＨａＣ
ａＴ細胞、および発現ベクターｐＣＭＶ４である（Ａｎ
ｄｅｒｓｏｎら， １９８９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃ
ｈｅｍ． ２６４： ８２２２−９）。本発明にしたが
って用いられる核酸は、この場合、細胞において、対応
する遺伝子のｍＲＮＡの機能上の濃度が増加する、また
はアンチセンスＲＮＡとのハイブリダイゼーションによ
り減少するように、センスおよびアンチセンス方向両方
で、発現ベクターに組み込まれていてもよい。トランス
フェクションおよび安定形質転換体の選択後、培養中の
細胞は、一般的に、コントロール細胞と比較して、増
殖、移動および／または分化の振る舞いの改変を示す。
ｉｎ ｖｉｔｒｏのこの振る舞いは、しばしば、体の再
生過程における、対応する遺伝子の機能と相関し（Ｙｕ
ら， １９９７， Ａｒｃｈ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ．
Ｒｅｓ． ２８９： ３５２−９； Ｍｉｌｓら， １
９９７， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１４： １５５５５−６
１； Ｃｈａｒｖａｔら， １９９８， Ｅｘｐ Ｄｅ
ｒｍａｔｏｌ ７： １８４−９０； Ｍｙｔｈｉｌｙ
ら， １９９９， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ８
０： １７０７−１３； Ｗｅｒｎｅｒ， １９９８，
Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒ
ｅｖ． ９：１５３−６５）、そしてそれに基づく薬理
学的に活性がある物質の試験系を構築することが可能で
あるような、実行が簡単でそして迅速な試験を用い、検
出することが可能である。したがって、細胞の増殖の振
る舞いは、例えば細胞のＤＮＡへの標識ヌクレオチドの
取り込みにより（例えば、ＦｒｉｅｓおよびＭｉｔｓｕ
ｈａｓｈｉ， １９９５， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｌａ
ｂ． Ａｎａｌ． ９：８９−９５； Ｐｅｒｒｏｓお
よびＷｅｉｇｈｔｍａｎ， １９９１， Ｃｅｌｌ Ｐ
ｒｏｌｉｆ． ２４： ５１７−２３； Ｓａｖｉｎｏ
およびＤａｒｄｅｎｎｅ， １９８５， Ｊ． Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８５： ２２１−６を参
照されたい）、特異的な染色剤での細胞の染色により
（Ｓｃｈｕｌｚら， １９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １６７： １−１３）、または
免疫学的方法により（Ｆｒａｈｍら， １９９８，
Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１１：
４３−５０）、非常に迅速に検出することが可能であ
る。移動は、移動指標試験（Ｃｈａｒｖａｔら、上記）
および匹敵する試験系（Ｂｅｎｅｓｔａｄら， １９８
７， Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｎｅｔ． ２０：
１０９−１９， Ｊｕｎｇｅｒら， １９９３，Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １６０： ７３
−９）により、簡単に検出することが可能である。適切
な分化マーカーは、例えばケラチン６、１０および１４
およびまたロリクリン（ｌｏｒｉｃｒｉｎ）およびイン
ボルクリン（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）であり（Ｒｏｓｅ
ｎｔｈａｌら， １９９２， Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄ
ｅｒｍａｔｏｌ． ９８： ３４３−５０）、これらの
発現は、例えば一般的に入手可能な抗体により、容易に
検出することが可能である。
【００９４】別の適切な試験系は、いわゆるツーハイブ
リッド系を用いた機能上の相互作用の同定に基づく（Ｆ
ｉｅｌｄｓおよびＳｔｅｒｎｇｌａｎｚ， １９９４，
Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １０，
２８６−２９２； ＣｏｌａｓおよびＢｒｅｎｔ， １
９９８， ＴＩＢＴＥＣＨ， １６， ３５５−３６
３）。本試験では、本発明にしたがって用いられるポリ
ペプチドおよびＧａｌ４またはＬｅｘＡなどの転写因子
のＤＮＡ結合ドメイン由来の融合タンパク質を発現する
発現ベクターを用い、細胞を形質転換する。形質転換細
胞は、さらに、そのプロモーターが対応するＤＮＡ結合
ドメインに対する結合部位を含む、レポーター遺伝子を
含む。活性化ドメイン、例えばＧａｌ４またはヘルペス
ウイルスＶＰ１６を有する、既知のまたは未知のポリペ
プチド由来の第二の融合タンパク質を発現するさらなる
発現ベクターの形質転換により、第二の融合タンパク質
が本発明にしたがって用いられるポリペプチドと機能
上、相互作用する場合には、レポーター遺伝子の発現は
非常に増加する可能性がある。例えば、第二の融合タン
パク質の構築のために再生組織由来のｃＤＮＡライブラ
リーを調製することにより、新規相互作用因子を同定す
るため、発現におけるこの増加を利用してもよい。さら
に、本発明にしたがって用いられるポリペプチドおよび
機能上の相互作用因子の間の相互作用を阻害する物質の
スクリーニングのため、本試験系を利用してもよい。こ
うした物質は、本発明にしたがって用いられるポリペプ
チドおよび相互作用因子の融合タンパク質を発現する細
胞において、レポーター遺伝子の発現を減少させる（Ｖ
ｉｄａｌおよびＥｎｄｏｈ， １９９９， Ｔｒｅｎｄ
ｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； １７： ３７
４−８１）。このように、再生過程の障害の療法に使用
することが可能な新規活性化合物を、迅速に同定するこ
とが可能である。
【００９５】本発明にしたがって用いられるポリペプチ
ドの機能上の相互作用因子はまた、選択法、例えばＳＥ
ＬＥＸ（Ｊａｙａｓｅｎａ， １９９９， Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｅｍ． ４５： １６２８−５０； Ｋｌｕｇお
よびＦａｍｕｌｏｋ， １９９４， Ｍ． Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ． ２０： ９７−１０７； Ｔｏ
ｏｌｅら， １９９６， ＵＳ ５５８２９８１）によ
り、単離される核酸であってもよい。ＳＥＬＥＸ法で
は、典型的には、異なる一本鎖ＲＮＡ分子の大きなプー
ルから、増幅および選択の反復により、高い親和性でポ
リペプチドに結合する分子（アプタマー）を単離する。
アプタマーはまた、鏡像型、例えばＬ−リボヌクレオチ
ドとして合成し、そして選択してもよい（Ｎｏｌｔｅ
ら， １９９６， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１４： １１１６−９； Ｋｌｕｓｓｍａｎｎら，
１９９６， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １
４： １１１２−５）。こうして単離された型は、天然
発生リボヌクレアーゼにより分解されず、そしてしたが
ってより大きい安定性を有するという利点を有する。
【００９６】本発明はさらに、本発明にしたがい使用可
能な少なくとも１つの核酸および／または少なくとも１
つのポリペプチドおよび／または少なくとも１つの抗体
を含むことで特徴付けられる、皮膚または腸の障害およ
び／または創傷治癒および／または創傷治癒の障害と関
連する解析のための、支持物質上に固定されたアレイの
使用に関する。
【００９７】こうしたアレイを調製するための方法は、
例えばＷＯ ８９／１０９０７７、ＷＯ ９０／１５０
７０、ＷＯ ９５／３５５０５およびＵＳ ５，７４
４，３０５から知られ、スポッティング、固相化学合成
および光不安定性保護基による。
【００９８】本発明はさらに、障害、特に皮膚または腸
障害および／または創傷治癒および／または創傷治癒の
障害に関連する解析のための、ＤＮＡチップおよび／ま
たはタンパク質チップの使用であって、本発明にしたが
って用いられる、少なくとも１つの核酸および／または
少なくとも１つのポリペプチドおよび／または少なくと
も１つの抗体を含む、前記チップの使用を含む。ＤＮＡ
チップは、例えば、ＵＳ ５，８３７，８３２から知ら
れる。
【００９９】本発明はここで、図および実施例の補助
で、それらに制限されることなく、以下にさらに例示さ
れるであろう。配列番号１ないし配列番号１０は、ヒト
またはマウス由来の、本発明にしたがって用いられるポ
リペプチドを示す。
【０１００】配列番号１１ないし配列番号１４および配
列番号１７ないし配列番号２６は、本発明の実験に用い
られたオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を示す。配列番
号１５ないし配列番号１６は、ＲＮアーゼ保護アッセイ
およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための
プローブの調製に用いられたＮＭ２３のＤＮＡ配列を示
す。
【０１０１】
【実施例】実施例１：サブトラクティブ・ハイブリダイ
ゼーションによる創傷関連ｃＤＮＡの濃縮および創傷関
連遺伝子としてのＮＭ２３−Ｍ１の同定 ＢＡＬＢ／ｃマウスの損なわれていない皮膚および創傷
組織（はさみの切断により組織試料採取の１日前に背中
に創傷を与えたもの）から、標準法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎ
ｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ， １９８７， Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２： １５６−１５９、Ｃｈ
ｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＭａｃｋｅｙ， １９９５，
Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２５： １６３−
１６４）により、総ＲＮＡを単離した。不完全に治癒し
た創傷を持つマウス組織を得るため、創傷を与える前
に、ＢＡＬＢ／ｃマウスをデキサメタゾンで処置した
（体重キログラム当たり、等張生理食塩水溶液中の０．
５ ｍｇのデキサメタゾン注射を１日２回５日間）。そ
の後、逆転写酵素の補助で、ＲＮＡをｃＤＮＡに転写し
た。ｃＤＮＡ合成は、対応するマニュアルの指示にした
がい、ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｇ
ｍｂＨ、ハイデルベルグの「ＳＭＡＲＴ ＰＣＲ ｃＤ
ＮＡ合成キット」を用いて行った。
【０１０２】ｃＤＮＡプール中で異なる頻度で発生する
ｃＤＮＡを同定するため、サブトラクティブ・ハイブリ
ダイゼーション（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏら， １９９
６，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９３： ６０２５−３０）を行った。これは、
対応するマニュアルの指示にしたがい、Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ、ハイデルベ
ルグの「ＰＣＲ選択ｃＤＮＡサブトラクションキット」
を用いて達成し、ｃＤＮＡ合成後の過剰なオリゴヌクレ
オチドの除去は、アガロースゲル電気泳動により行っ
た。創傷関連遺伝子に関し濃縮された４つのｃＤＮＡプ
ールを準備し、ここで１つのプールは、損なわれていな
い皮膚に比較し、創傷組織においてより強く発現される
ｃＤＮＡ断片に関し濃縮され（「創傷特異的ｃＤＮＡプ
ール」）、１つのプールは、創傷組織に比較し、損なわ
れていない皮膚においてより強く発現されるｃＤＮＡ断
片が濃縮され（「皮膚特異的ｃＤＮＡプール」）、１つ
のプールは、不完全治癒創傷に比較し、正常治癒創傷に
おいてより強く発現されるｃＤＮＡ断片が濃縮され
（「正常治癒ｃＤＮＡプール」）、そして１つのプール
は、正常治癒創傷に比較し、不完全治癒創傷においてよ
り強く発現されるｃＤＮＡ断片が濃縮されていた（「不
完全治癒ｃＤＮＡプール」）。
【０１０３】創傷治癒に関連するｃＤＮＡプールに含ま
れる遺伝子を同定するため、プール中の対応するｃＤＮ
Ａの存在を「逆ノーザンブロット」により解析した。こ
こでは、ｃＤＮＡ断片を、多くの異なるｃＤＮＡのアレ
イの形で膜上に固定し、そして放射標識ｃＤＮＡの複合
混合物とハイブリダイズさせる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，
１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハ
ーバー，第９章９．４７から９．５８ページおよび第１
０章１０．３８から１０．５０ページ；Ａｎｄｅｒｓｏ
ｎおよびＹｏｕｎｇ： Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｆ
ｉｌｔｅｒ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ； Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，
Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， １９８
５， ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ監修， ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．；オックスフォード，中，第４
章， ７３から１１２ページ）。
【０１０４】適切なハイブリダイゼーションプローブの
調製のため、サブトラクションされたｃＤＮＡプール
を、制限エンドヌクレアーゼＲｓａＩで処理し、そして
ｃＤＮＡ合成および増幅プライマーを分離するため（マ
ニュアル「ＰＣＲ選択ｃＤＮＡサブトラクションキッ
ト」、Ｃｌｏｎｔｅｃｈを参照されたい）、アガロース
ゲル電気泳動により精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上
記、第６章、６．１から６．３５ページ）。その後、ハ
イブリダイゼーションプローブを調製するため、「ラン
ダム六量体プライム化」法を用い、ｃＤＮＡを放射標識
した（ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，
１９８３， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３
２： ６−１３）。
【０１０５】２５ ｍｌのハイブリダイゼーション溶液
中で、膜を６５℃で３０分間プレインキュベーションし
た（２５ ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．５、１
２５ｍＭ ＮａＣｌ、７％ ＳＤＳ）。ハイブリダイゼ
ーションプローブを１００℃で１０分間変性させ、その
後氷上で冷却し、約１００ ＣＰＭ／ｍｌをハイブリダ
イゼーション溶液に添加し、そしてハイブリダイゼーシ
ョンオーブン中で、６５℃で１６時間、ハイブリダイゼ
ーションを行った。その後、プローブを含まないハイブ
リダイゼーション溶液で、膜を２回、６５℃で１０分
間、洗浄した。その後、流しだされる洗浄溶液中にいか
なる活性も検出されなくなるまで、洗浄溶液（２．５
ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．５、１２．５ ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、０．７％ ＳＤＳ）で、何回か、６５℃
で１０分間、洗浄した。放射能シグナルは、ｐｈｏｓｐ
ｈｏｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、Ｑｕａｎｔｉｔｙ
Ｏｎｅ（登録商標））を用い解析した（図１）。その
後、多様なプローブで異なるシグナル強度を生じるｃＤ
ＮＡを選択した。これは、膜上のＮＭ２３−Ｍ２の位置
で生じ、皮膚特異的ｃＤＮＡプールに比較し、創傷特異
的ｃＤＮＡプールのハイブリダイゼーションプローブ
で、わずかに強いシグナル強度であり、そして正常治癒
ｃＤＮＡプールに比較し、不完全治癒ｃＤＮＡプールの
ハイブリダイゼーションプローブで明らかにより強いシ
グナル強度であった。
【０１０６】実施例２：「リアルタイム定量的ＲＴ−Ｐ
ＣＲ」による、ＮＭ２３−Ｍ２の発現パターンの確認 本発明にしたがって用いられる核酸の差別的発現の確認
は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出系（ＰＥ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中のリアルタ
イムＲＴ−ＰＣＲにより、行った。該装置は、ＡＢＩ
Ｐｒｉｓｍ ７２００／７７００ ＳＤＳソフトウェア
・バージョン１．６．３（１９８８）を備えていた。Ｐ
ＣＲ産物の検出は、染色剤ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １の
補助で、ｃＤＮＡの増幅中に行った。該染色剤の蛍光
は、二本鎖ＤＮＡに対する結合により、非常に増加する
（Ｋａｒｌｓｅｎら， １９９５， Ｊ． Ｖｉｒｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ． ５５： １５３−６； Ｗｉｔ
ｔｗｅｒら， １９９７，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
２２： １３０−８； Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，１９９
８， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４： ９５４−
６２）。定量化の基本は、蛍光シグナルが定義された閾
値を超える際に達するＰＣＲ周期（閾値周期、ＣT値）
である。解析は、ΔＣT法により、行われる（Ｕｓｅｒ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２， Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕ
ａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎ， ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ， １９９７）。ｃＤＮＡの存在量は、内因性
基準（ＧＡＰＤＨ）に比較し、決定した。結果を図２に
示す。
【０１０７】各々１６匹の動物由来の皮膚および創傷組
織由来の総ＲＮＡプールを、上述のように得て、そして
１μｇの総ＲＮＡを、製造者の推奨（ＳＹＢＲ Ｇｒｅ
ｅｎＰＣＲ ａｎｄ ＲＴ−ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔｓ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌ， ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９８）にしたがい、ＴａｑＭａ
ｎ逆転写試薬キット（ＰＥ）を用い、サーモサイクラー
（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣ
Ｒ系９７００、ＰＥ）中で、逆転写に供した。ＮＭ２３
−Ｍ２ ｃＤＮＡ（ＮＭ２３−プライマー１： ＴＴＣ
ＡＡＡＡＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＣＣ（配列番号１
１）、ＮＭ２３−プライマー２： ＡＣＴＣＴＣＣＡＣ
ＴＧＡＡＴＣＡＣＴＧＣＣＡ（配列番号１２））および
基準（ＧＡＰＤＨプライマー１： ＡＴＣＡＡＣＧＧＧ
ＡＡＧＣＣＣＡＴＣＡ（配列番号１３）、ＧＡＰＤＨプ
ライマー２： ＧＡＣＡＴＡＣＴＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣ
ＣＴ（配列番号１４））の増幅のためのプライマーは、
本発明にしたがって用いられる核酸およびＧＡＰＤＨの
既知の配列に基づき、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソ
フトウェアＭａｃｉｎｔｏｓｈ ＰＣ用バージョン１．
０（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，
Ｐ／Ｎ ４０２０８９， １９９８）の補助で選択し
た。ＰＣＲには、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｃｏ
ｒｅ試薬キット（４３０４８８６、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＰＣＲ中のプラ
イマーの濃度は、まず、５０ ｎＭないし６００ ｎＭ
の範囲で最適化し、そしてＰＣＲの特異性は、アガロー
スゲル電気泳動による増幅産物の長さの解析により、立
証した。その後、ＰＣＲ系の効率を、連続希釈により測
定した（Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２， Ｒｅｌ
ａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ
ｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ＰＥ Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， １９９７）。どちらのｃ
ＤＮＡにとっても、増幅効率は１００％であり、すなわ
ちｃＤＮＡの１：２希釈では各々、蛍光閾値を越えるた
めに、もう１回の周期が必要であった。
【０１０８】定量化には、ｃＤＮＡの各バッチを、総体
積２５μｌ中の１０ ｎｇの逆転写総ＲＮＡから増幅し
た。ＰＣＲの実行条件は、製造者の詳細な記述（ＰＥ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ１（登録商標）ＰＣＲ ａｎｄ ＲＴ−ＰＣ
Ｒ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ， １９９
８）に一致した。ＣT値を解析し、そしてＧＡＰＤＨに
比較し、ＮＭ２３−Ｍ２の存在量を計算した。正常治癒
創傷においてＮＭ２３−Ｍ２のわずかな誘導を、そして
デキサメタゾン処置動物の不完全治癒創傷において強い
誘導を確認することが可能であった（図２）。
【０１０９】実施例３：「ＲＮアーゼ保護アッセイ」に
よるＮＭ２３−Ｈ１の発現パターンの立証 ＮＭ２３−Ｈ１の発現は、「ＲＮアーゼ保護アッセイ」
の補助で立証した。該試験は文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、上記、第７章、７．７１ないし７．７８ページ；
Ｗｅｒｎｅｒら，１９９２； Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔ
ｏｒｓ ａｎｄＲｅｃｅｐｔｏｒｓ： Ａ Ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ １７５−１９７、 Ｗｅ
ｒｎｅｒ， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ６８９６−６９０
０）に記載されるように行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏで転
写し、そして放射標識した逆鎖ＲＮＡを、ハイブリダイ
ゼーションプローブとして用いた。２６６ ｂｐ長のＮ
Ｍ２３−Ｈ１断片（配列番号１５）は、ベクターｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）のＥｃｏＲＶ制限部位内に、平滑末端を介し、クロ
ーン化した。プラスミドは、転写前にＸｂａＩで直線化
した（ベクター配列を含まない転写物の長さ：２９９塩
基対、プローブの配列は配列番号１５）。製造者の詳細
な記述にしたがい、32Ｐ−ＵＴＰ（３５μＣｉ／バッ
チ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ブラウンシュワイク）の存在
下で、Ｔ３ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃｓ、マンハイム）を用い、転写を行った。プロー
ブはゲル電気泳動および溶出により、精製した（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、上記、第６章、６．３６から６．４８ペ
ージ）。ハイブリダイゼーション反応には、約１０5
ＣＰＭの各標識転写物を使用した。このために、標準法
（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ，１９８
７， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２： １５
６−１５９、 ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＭａｃｋ
ｅｙ， １９９５， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．
２２５： １６３−１６４）を用い、皮膚または腸生検
いずれかから単離した、１０μｇの総ＲＮＡを、転写物
と共に沈殿させ、１０μｌのハイブリダイゼーション緩
衝液（８０％ 脱イオン化ホルムアミド、４００ ｍＭ
ＮａＣｌ、４０ ｍＭ Ｐｉｐｅｓ ｐＨ ４．６、
１ ｍＭ ＥＤＴＡ）中に取り、そして４２℃で一晩ハ
イブリダイズさせた。その後、ＲＮアーゼＡ／Ｔ１消化
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、ＲＮアーゼＡ：０．８μｇ／
バッチ、ＲＮアーゼＴ１：２０ Ｕ／バッチ）を行っ
た。プロテイナーゼＫ消化（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、３
０μｇ／バッチ）およびフェノール抽出によるＲＮアー
ゼの不活性化後、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）
にしたがい、試料をエタノール沈殿した。その後、試料
を、変性５％アクリルアミドゲル（７ Ｍ 尿素）上の
ゲル電気泳動により、分離した。ゲルを乾燥させ、そし
てオートラジオグラフィーにより、放射能シグナルを解
析した（図３および４）。
【０１１０】３人の異なる乾癬および４人の異なるコン
トロール患者の生検から単離したＲＮＡを用いたＲＮア
ーゼ保護アッセイにおいて、コントロール皮膚試料に比
較し、すべての乾癬患者由来の皮膚試料において、ＮＭ
２３−Ｈ１の発現増加を観察することが可能であった
（図３）。クローン病の５人由来の組織試料由来のＲＮ
Ａを用いたＲＮアーゼ保護アッセイは、コントロール被
験者に比較し、腸の炎症切片において、ＮＭ２３−Ｈ１
の発現増加を示した（図４）。
【０１１１】実施例４：マウス創傷の組織切断における
ＮＭ２３−Ｈ１発現の解析 創傷におけるＮＭ２３−Ｍ１発現を、ｉｎ ｓｉｔｕハ
イブリダイゼーションにより解析した。該試験は、文献
（Ｗｅｒｎｅｒら, １９９２； Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａ
ｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ： Ａ Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ １７５−１９７、
Ｗｅｒｎｅｒら, １９９８, Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６８９６−６
９００）に記載されるように行った。２５６ ｂｐ長の
ＮＭ２３−Ｍ１断片（配列番号１６）を、ベクターｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）のＥｃｏＲＶ制限部位内に、平滑末端を介し、クロ
ーン化した。本ベクターを用い、記載されるように（Ｗ
ｅｒｎｅｒら、上記）、ハイブリダイゼーションプロー
ブとしての放射標識逆鎖ＲＮＡを産生し、そして用い
た。本プローブを用い、マウスの第５日創傷の凍結組織
切片上でハイブリダイゼーションを行った。ＮＭ２３−
Ｍ１遺伝子は、創傷縁の過剰増殖上皮において、増加し
て発現されることが明らかになった。対照的に、皮膚の
健康な部分では、染色はかすかに検出され、ないしまっ
たく検出されなかった。
【０１１２】実施例５：「ＴａｑＭａｎ解析」による、
ＮＭ２３−Ｍ１およびＮＭ２３−Ｍ２ ｍＲＮＡ発現の
ネズミパターンの解析 成獣ネズミの正常創傷治癒中のＮＭ−２３ ｍＲＮＡ、
ＮＭ２３−Ｍ１およびＮＭ２３−Ｍ２発現の制御の動力
学を、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＧｅｎ
ｅＡｍｐ５７００中の「ＴａｑＭａｎ解析」を用いて解
析した。正常治癒創傷および損なわれていない皮膚は、
上述のように、はさみの切断を用い、１０週齢のＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスから採取した。
【０１１３】ＲＮＡを単離するため、分散装置（ｄｉｓ
ｐｅｒｓｅｒ）を用い、１／１００体積分の２−メルカ
プト−エタノールを補った、ＲＮＡｃｌｅａｎ緩衝液
（ＡＧＳ、ハイデルベルグ）の存在下で、生検をホモジ
ナイズした。続いて、１−ブロモ−３−クロロ−プロパ
ンの存在下で、水飽和酸性フェノールを用い、フェノー
ル処理を２回繰り返すことにより、ＲＮＡを抽出した。
その後、イソプロパノールおよびエタノール沈殿を用
い、ＲＮＡを沈殿させ、そして７５％エタノールを用
い、ＲＮＡを洗浄した。その後、ＲＮＡをＤＮアーゼＩ
で処理した。２０μｇのＲＮＡ（５０μｌのＤＥＰＣ処
理水を加えたもの）に、５．７μｌの転写緩衝液（Ｒｏ
ｃｈｅ）、１μｌのＲＮアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ；４
０ Ｕ／μｌ）および１μｌのＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈ
ｅ；１０ Ｕ／μｌ）を補い、そして３７℃で２０分間
インキュベーションした。その後、さらに１μｌのＤＮ
アーゼＩを添加し、そして試料を３７℃でさらに２０分
間インキュベーションした。続いて、ＲＮＡをフェノー
ル処理し、エタノール沈殿させ、そして洗浄した。上述
の段階はすべて、反応性アミノ基を含まない限り、ＤＥ
ＰＣ（ジエチルピロカーボネート）処理溶液および液体
を用いて行った。続いて、抽出ＲＮＡからｃＤＮＡを合
成した。２０μｌのＲＮＡ（５０ ｎｇ／μｌ）に、１
ｘ ＴａｑＭａｎＲＴ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ
ｅｒ）、５．５ ｍＭ ＭｇＣｌ2（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ）、各々５００μＭのｄＮＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ）、２．５μＭ ランダム六量体（Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、１．２５μｌのＭｕｌｔｉｓｃ
ｒｉｂｅ逆転写酵素（５０ Ｕ／μｌ、Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ）、０．４μｌ ＲＮアーゼ阻害剤（２０
Ｕ／μｌ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）およびＤＥＰＣ
処理水（１００μｌ体積を添加する）を補った。
【０１１４】ＲＮＡの添加に際し、そして混合中、溶液
を２つの０．２ ｍｌチューブ（各々５０μｌ）に分割
し、そしてサーモサイクラー中で逆転写反応を行った
（２５℃で１０分間；４８℃で３０分間および９５℃で
５分間）。続くｃＤＮＡの定量化は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅ
ｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘｅｓ（Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いた定量的ＰＣＲにより行い、こ
こで定量化しようとする各ＮＭ２３ ｃＤＮＡ種に関
し、３つ組測定（各場合、標的プライマーおよびＧＡＰ
ＤＨプライマーを含む）を行った。各３つ組のストック
溶液は、総体積５７μｌに、３７．５μｌの２ ｘ Ｓ
ＹＢＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、０．７５μｌのＡｍ
ｐ． Ｅｒａｓｅ ＵＮＧ（１ Ｕ／μｌ）および１
８．７５μｌのＤＥＰＣ処理水を含んだ。各３つ組測定
に関し、５７μｌのストック溶液に、先に最適化したよ
うな濃度比で、１．５μｌの順方向および逆方向プライ
マー各々を補った。各６０μｌのストック溶液／プライ
マー混合物を、１５μｌのｃＤＮＡ溶液（２ ｎｇ／μ
ｌ）と混合し、そして３つのウェルに分割した。同時
に、基準として、ＧＡＰＤＨの測定のためのプライマー
（配列番号１３および配列番号１４）を含むストック溶
液を、さらなる１５μｌの同一のｃＤＮＡ溶液と混合
し、そして３つのウェルに分配した。ＧＡＰＤＨの標準
グラフを得るため、異なるｃＤＮＡ溶液の連続希釈を作
成した（４ ｎｇ／μｌ；２ ｎｇ／μｌ；１ ｎｇ／
μｌ；０．５ ｎｇ／μｌおよび０．２５ ｎｇ／μ
ｌ）。ＧＡＰＤＨの測定のため、連続希釈の各々１５μ
ｌのｃＤＮＡ溶液を、６０μｌのストック溶液／プライ
マー混合物と混合し、そして３つのウェルに分配した。
解析しようとするＮＭ２３相同体のＰＣＲ各々の標準グ
ラフを得て、ここでＧＡＰＤＨ標準グラフに関し、同じ
希釈を用いた。コントロールとして、ｃＤＮＡを含まな
いＰＣＲを用いた。各標的およびＧＡＰＤＨのストック
溶液／プライマー混合物に１５μｌのＤＥＰＣ水を補
い、混合し、そして３つのウェルに分配した。増幅は、
Ｇｅｎｅ Ａｍｐ． ５７００を用い、行った（５０℃
で２分間；９５℃で１０分間の後、９６℃で１５秒間お
よび６０℃で２分間の３サイクル；その後、９５℃で１
５秒間および６０℃で１分間の３７サイクル）。解析
は、ＧＡＰＤＨ基準に比較し、各ＮＭ２３遺伝子の存在
量を測定することにより、行った。標準曲線は、まず、
連続希釈のＣT値を、ｃＤＮＡおよびＰＣＲ（転写ＲＮ
Ａのｎｇ）の量の対数に対し、プロットすることによ
り、決定し、そしてグラフの傾きを測定した。ＰＣＲの
効率（Ｅ）は、以下のように計算することが可能であ
る：Ｅ＝１０-1 /s−１。ＧＡＰＤＨに対する、調べてい
るＮＭ２３ ｃＤＮＡ種（Ｙ）の相対存在量（Ｘ）は：
Ｘ＝（１＋ＥGAPDH）C T (GAPDH)／（１＋ＥY）C T (Y)であ
る。続いて、成獣１０週齢ＢＡＬＢ／ｃコントロール動
物の損なわれていない皮膚におけるｃＤＮＡの量を１と
等しくすることにより、値を標準化した。成獣マウスの
創傷後の異なる時点での、ＮＭ２３−Ｍ１およびＮＭ２
３−Ｍ２それぞれの相対発現変化を、図７に示す。
【０１１５】ＮＭ２３−Ｍ１（ＮＭ２３−プライマー
３：ＴＣＣ ＴＧＧ ＣＡＣ ＡＧＴＣＡＧ ＡＣＡ
ＡＣＡ（配列番号１７）；ＮＭ２３−プライマー４：Ｔ
ＴＣＡＣＡ ＡＣＣ ＴＣＡ ＣＡＣ ＡＴＣ ＣＴＣ
Ｃ（配列番号１８））およびＮＭ２３−Ｍ２（ＮＭ２
３−プライマー１：（配列番号１１）およびＮＭ２３−
プライマー２（配列番号１２））を検出する適切なプラ
イマーを用い、両相同体の発現は、成獣マウスの創傷治
癒中、減少することを示すことが可能であった（図
７）。
【０１１６】創傷治癒の過程において、ＮＭ２３−Ｍ１
発現は、全体として、損なわれていない皮膚で観察され
る量の約５０％に、一定して減少した。ＮＭ２３−Ｍ２
発現で、同様のパターンが検出され、創傷後１時間およ
び７日の間の創傷治癒中、損なわれていない皮膚に比較
し、発現はかなり減少した。創傷１４日後に初めて、発
現レベルは、おおむね元来のレベルにはね返った。要す
るに、両相同体は、創傷治癒の長い期間にわたり、比較
的減少した発現レベルを示した。この結果は、正常治癒
創傷におけるＮＭ２３発現量の弱い増加を観察すること
が可能であった実施例１および２と矛盾するようであ
る。しかし、実施例４において、創傷組織切片におい
て、ＮＭ２３発現の全体的な増加はないことが立証され
た。染色の増加は、過剰増殖上皮で観察されたが、組織
の他の層では有意な発現は検出されなかった。この結果
は、「リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ」の場合より、ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの場合、ｍＲＮＡを検
出する感度が低いため、発現の空間的パターンの複雑な
変化中、ｍＲＮＡ量の創傷治癒依存変化は、不十分にし
か解析されないことを暗示する：ＮＭ２３発現の空間的
パターンの複雑な変化のため、生検採取中のわずかな可
変性が、「ＴａｑＭａｎ解析」（実施例５）による測定
とは対照的に、「リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ」（実施例
２）およびサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション
（実施例１）により測定されるＮＭ２３ｍＲＮＡ量の創
傷治癒依存変化に関する、異なる結果につながる可能性
がある。困難な条件にも関わらず、ＮＭ２３遺伝子ファ
ミリーの遺伝子を同定することが可能であったことは、
驚くべきことであった。
【０１１７】実施例６：ヒト創傷におけるＮＭ２３−Ｈ
１およびＮＭ２３−Ｈ２の差別的発現 実施例３で、乾癬およびクローン病におけるＮＭ２３−
Ｈ１の差別的制御を解析した。正常治癒創傷を用い、実
施例５に示されるＮＭ２３−Ｍ１およびＮＭ２３−Ｍ２
発現の差別的制御がまた、ヒトにおいても観察されるか
どうか、調べた。それぞれ４ ｍｍまたは６ ｍｍのパ
ンチ皮膚試料を単離することにより、健常被験者の未処
理の損なわれていない皮膚、第１日創傷または第５日創
傷から皮膚試料を採取した。各群（損なわれていない皮
膚、第１日創傷、第５日創傷）に関し、各々１４の被験
者の生検をプールした。生検を震蘯粉砕機（ｓｗｉｎｇ
ｍｉｌｌ）中で分離し、そして実施例５に記載されるよ
うに、ＲＮＡを単離し、その後ＤＮアーゼＩで消化し、
そしてｃＤＮＡに逆転写した。創傷治癒関連ｃＤＮＡの
定量化は、実施例５に記載されるように行った。実験結
果を図８に示す。ＮＭ２３相同体の解析には、ヒトＧＡ
ＰＤＨ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ１７８５１）並びにヒトＮ
Ｍ２３−Ｈ１およびＮＭ２３−Ｈ２（ＥＭＢＬ：Ｘ１７
６２０およびＥＭＢＬ：Ｘ５８９６５）の既知の配列に
基づき、増幅のためのプライマー（ｈＧＡＰＤＨ−プラ
イマー１：ＣＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＴＧＡＧＡ
ＡＧ（配列番号２５）；ｈＧＡＰＤＨ−プライマー２：
ＧＣＴＡＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡ（配列番号
２６）；ＮＭ２３−Ｈ１プライマー１：ＧＡＡＡＴＴＣ
ＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＧＡ（配列番号１９）；ＮＭ
２３−Ｈ１プライマー２：ＣＡＧＧＴＣＡＡＣＧＴＡＧ
ＴＧＴＴＣＣＴＴＧＡＧ（配列番号２０）；ＮＭ２３−
Ｈ２プライマー１：ＣＴＧＧＴＴＧＡＣＴＡＣＡＡＧＴ
ＣＴＴＧＴＧＣＴＣ（配列番号２１）；ＮＭ２３−Ｈ２
プライマー２：ＴＣＣＡＣＣＴＣＴＴＡＴＴＣＡＴＡＧ
ＡＣＣＣＡＧＴ（配列番号２２））を選択した。１０
ｎｇの総ＲＮＡの逆転写から生じたｃＤＮＡを、定量化
のため、総体積２５μｌ中で増幅した。ＰＣＲは、製造
者の指示にしたがい、行った（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣ
Ｒ ａｎｄ ＲＴ−ＰＣＲｒｅａｇｅｎｔｓ ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌ， １９８８）。ＣT値を測定し、そしてＧＡ
ＰＤＨ−ｍＲＮＡに比較し、ＮＭ２３ ｍＲＮＡの存在
量を計算した。実験結果を図８に示す。創傷組織が、発
現のわずかな減少を示すことが観察された。実施例５の
ネズミ生検の解析と対照的に、２つの異なる時点を選択
した。ヒト組織を用い、マウスおよびヒトの創傷治癒の
動力学に関し、結果の有意な一致が観察された（実施例
５）：最初の値と比較し、創傷１日後の生検におけるＮ
Ｍ２３−Ｍ１およびＮＭ２３−Ｈ１発現レベルは、７０
％減少し、そしてｍＲＮＡレベルはどちらも、創傷５日
後、それぞれ最初の値の６６％または７０％にわずかに
増加した。第５日創傷のＮＭ２３−Ｍ２およびＮＭ２３
−Ｈ２の発現レベルがより弱かったのもまた、類似であ
る（最初の値の４８％対６０％）。
【０１１８】したがって、両遺伝子が創傷治癒の制御に
必須の役割を果たし、そして少なくとも１つの相同体、
優先的には両方の相同体の量の調節を、皮膚細胞の障害
の予防および／または診断および／または治療に用いて
もよいことを確認することが可能であった。
【０１１９】実施例７：ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼ
ーションによる、損なわれていない皮膚、正常治癒創
傷、潰瘍と共に、非損傷および損傷乾癬皮膚の生検にお
けるＮＭ２３−Ｈ２の位置決定 実験のため、健康な皮膚と共に正常治癒第５日創傷の生
検を、実施例６に記載されるように、健常被験者から採
取した。さらに、各々１０人の乾癬患者の非損傷および
損傷皮膚、並びに潰瘍患者（Ｕｌｃｕｓ ｃｒｕｒｉｓ
ｖｅｎｏｓｕｍ）の損なわれていない皮膚および創傷
由来の生検を、上述のように採取した。組織切片を４％
パラホルムアルデヒド中で固定し、プロテイナーゼＫ
（１μｇ／ｍｌ等張生理食塩水）で３７℃で１０分間処
理し、そして続いてパラホルムアルデヒドで処理し、そ
してその後、無水酢酸（ａｃｅｔａｎｈｙｄｒｉｄｅ）
（０．１ Ｍ トリエタノールアミン、ｐＨ ８．０中
の０．５ ｍｌ）で処理した。
【０１２０】ヒトＮＭ２３−Ｈ２のｍＲＮＡは、放射性
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、位置決
定した。パラホルムアルデヒド固定切片をパラフィンに
包埋した。ハイブリダイゼーションプローブの合成は、
α−35Ｓ−ＵＴＰの存在下での部分的ＮＭ２３−Ｈ２
ｃＤＮＡ断片のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に基づいた。ＰＣ
Ｒ産物を得るため、センスおよびアンチセンス方向の転
写のためのプロモーター配列を、プライマーに添加した
（Ｔ３−ＮＭ２３−Ｈ２−プライマー：ＡＡＴＴＡＡＣ
ＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡ
ＣＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣ（Ｔ３−プロモーターを含む
センスコントロールプライマー；配列番号２３）、Ｓｐ
６−ＮＭ２３−プライマー：ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡ
ＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＡＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧ
ＧＡＧＡＣＴＧＣ（Ｓｐ６−プロモーターを含むアンチ
センスプライマー；配列番号２４））。ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ転写のため、６０μＣｉの35Ｓ−ＵＴＰおよび各々５
ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰと共に、２５Ｕの
Ｔ３またはＴ７−ＲＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）い
ずれか、１μｇのＰＣＲ産物、１０ ｍＭのジチオスレ
イトール、４０ＵのＲＮアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）お
よび１ ｘ ＴＢ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。
【０１２１】ヒト組織切片（上記を参照されたい）をス
ライドに乗せ、プロテイナーゼＫで処理し、パラホルム
アルデヒドで固定し、そして続いてアセチル化した。５
０％ホルムアミド／４ ｘ ＳＳＣに浸したＷｈａｔｍ
ａｎティッシュペーパーを含む、加湿チャンバーに切片
を移した。切片を３０μｌのハイブリダイゼーション溶
液で覆い、そして６０℃で２．５時間インキュベーショ
ンした。その後、０．７ ｘ １０6 ＣＰＭの放射標
識リボプローブを含む３０μｌのハイブリダイゼーショ
ン溶液と切片を、６０℃で１６時間インキュベーション
した。その後、ストリンジェントな条件下で切片を洗浄
し、ＲＮアーゼＡとインキュベーションし、そしてエタ
ノールで脱水した。製造者の指示にしたがい、その後、
光および酸素の非存在下で、切片を写真乳剤（Ｋｏｄａ
ｋ ＩＢＯ １４３３）で、４０℃で２−６週間、覆
い、そして続いて写真現像剤および定着液（Ｋｏｄａｋ
ＩＢＯ １４３３）を用い、現像した。
【０１２２】健常被験者および潰瘍患者の損なわれてい
ない皮膚と共に、乾癬患者の非損傷皮膚において、まっ
たくシグナルが観察されないかまたは非常に弱くしか観
察されなかった。対照的に、正常治癒第５日創傷の組織
切片は、過剰増殖上皮の基底細胞層において、シグナル
を示した。これは、ＮＭ２３−Ｈ２発現の誘導が、増殖
および移動により、創傷を閉鎖するのに責任がある細胞
層で特に必須であることを示す。これは、有意な標識
が、創傷縁および非または不完全治癒潰瘍創傷の創傷基
底部（ｗｏｕｎｄ ｇｒｏｕｎｄ）で検出されないとい
う観察と一致する。したがって、ＮＭ２３−Ｈ２発現の
創傷特異的制御は、創傷治癒の正常過程に必須である。
健常被験者の損なわれていない皮膚または乾癬患者の非
損傷皮膚に比較し、損傷乾癬皮膚生検はまた、過剰増殖
上皮の基底細胞層において、標識強度の有意な増加を示
した。これは、ＮＭ２３−Ｈ１の量が乾癬皮膚で増加し
ていることが示された、実施例３の実験結果と一致す
る。
【０１２３】本実験は、ＮＭ２３発現制御が、損なわれ
ていない健康な皮膚と共に、創傷治癒の正常過程に必須
であり、そしてうまく機能しない発現制御は、皮膚細胞
の障害、例えば創傷治癒の遅延または乾癬につながる可
能性があることを説明し、そしてＮＭ２３、優先的には
両方の相同体を、皮膚細胞の障害の予防および／または
診断および／または治療に用いることが可能であること
を示す。不完全治癒創傷は、減少した量のＮＭ２３と関
連する一方、角化細胞が病理学的増殖により特徴付けら
れる乾癬患者においては、ＮＭ２３発現レベルの増加を
示す。
【０１２４】皮膚細胞の治療のため、ＮＭ２３の発現ま
たは活性を、優先的には、創傷治癒の障害の場合、ＮＭ
２３の発現または活性を活性化することにより、調節す
べきである。ＮＭ２３の活性または発現は、優先的に
は、皮膚細胞の過剰増殖障害の場合、特に乾癬の場合、
優先的に阻害されるべきである。
【０１２５】当業者には、本発明の組成物および方法に
対し、多様な修飾を作成してもよいことが明らかであろ
う。したがって、付随する請求項およびその同等物の範
囲内にある限り、本発明はこうした修飾および変動を含
むことが意図される。
【０１２６】本明細書に引用されるすべての刊行物は、
完全に本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ４つの異なるプローブを用いた、適用ｃＤＮ
Ａ断片の同一のパターンを含む膜（マウスＡＴＬＡＳア
レイ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のハイブリダイゼーションの
オートラジオグラム。ｃＤＮＡ断片は、すべて、損なわ
れていない皮膚と比較し、より強く創傷組織で発現され
るｃＤＮＡに関し濃縮された、創傷特異的サブトラクテ
ィブｃＤＮＡライブラリーに由来した。すべてのプロー
ブは、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションから
派生するｃＤＮＡから調製した。Ａ：創傷特異的プロー
ブ（損なわれていない皮膚に対する創傷のサブトラクシ
ョン）、Ｂ：皮膚特異的プローブ（創傷に対する損なわ
れていない皮膚のサブトラクション）、Ｃ：不完全治癒
創傷に特異的なプローブ（創傷コントロール動物に対す
る創傷デキサメタゾン処置動物のサブトラクション）、
Ｄ：正常治癒創傷に特異的なプローブ（創傷デキサメタ
ゾン処置動物に対する創傷コントロール動物のサブトラ
クション）。ＮＭ２３−Ｍ２ ｃＤＮＡの位置（それぞ
れ２回装填）は、矢印で示される。
【図２】 マウスにおける創傷治癒の異なる段階でのＮ
Ｍ２３−Ｍ２の定量的「リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ」の
結果。ＧＡＰＤＨに比較した存在量の計算のための式が
示される。誘導は、損なわれていない皮膚における存在
量での存在量の規準化から生じる。
【図３】 乾癬患者およびコントロールのヒトの皮膚試
料でのＮＭ２３−Ｈ１のＲＮアーゼ保護アッセイの結
果。ＲＮアーゼ処理を伴わない放射性ハイブリダイゼー
ションプローブ（レーン１および５）と共に、各々、プ
ローブとハイブリダイゼーションさせ、そしてＲＮアー
ゼ処理した後の、陰性コントロール（ｔＲＮＡ、レーン
２および６）、４人の異なるコントロールのヒトの皮膚
生検由来のＲＮＡ（レーン３、７、８および９）、およ
び３人の異なる乾癬患者の皮膚生検由来のＲＮＡ（レー
ン４、１０および１１）を装填した。矢印は、ＮＭ２３
−Ｈ１ ｍＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーション
後、ＲＮアーゼ分解に対し保護されたプローブのＲＮＡ
断片の位置を示す。
【図４】 クローン病患者およびコントロールのヒトの
腸試料でのＮＭ２３−Ｈ１のＲＮアーゼ保護アッセイの
結果。ＲＮアーゼ処理を伴わない放射性ハイブリダイゼ
ーションプローブ（レーン１）と共に、各々、プローブ
とハイブリダイゼーションさせ、そしてＲＮアーゼ処理
した後の、陰性コントロール（ｔＲＮＡ、レーン２）、
コントロール患者の腸生検由来のＲＮＡ（レーン３）、
より炎症の少ない領域（レーン４および６）および顕著
な炎症がある領域（レーン５、７および８）の、クロー
ン病患者の腸生検由来のＲＮＡを装填した。レーン４、
５および６と共にレーン７および８で用いたＲＮＡは、
それぞれ、同一の患者に由来する。矢印は、ＮＭ２３−
Ｈ１ ｍＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーション
後、ＲＮアーゼ分解に対し保護されたプローブのＲＮＡ
断片の位置を示す。
【図５】 創傷治癒過程中、遺伝子発現の解析において
同定された遺伝子ファミリーＮＭ２３のポリペプチド配
列およびそのｃＤＮＡおよび寄託番号の調査表。
【図６】 ヒトおよびマウス由来のＮＭ２３Ａ（ＮＤＫ
Ａ＿ヒト、ＮＤＫＡ＿マウス）およびＮＭ２３Ｂ（ＮＤ
ＫＢ＿ヒト、ＮＤＫＢ＿マウス）の同定されたタンパク
質のポリペプチド配列の比較。ＮＭ２３Ａのヒト配列に
対する相違が示される。
【図７】 「ＴａｑＭａｎアッセイ」により測定され
る、損なわれていない皮膚のｃＤＮＡの量に比較した、
成獣マウスの創傷後の異なる時点での、創傷関連ＮＭ２
３−Ｍ１およびＮＭ２３−Ｍ２ ｃＤＮＡの量の調査
表。
【図８】 「ＴａｑＭａｎアッセイ」により測定され
る、第１日および第５日の創傷におけるヒト創傷関連ｍ
ＲＮＡの量の調査表。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年６月１１日（２００１．６．１
１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２２
【補正方法】変更
【補正内容】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/12 Ａ６１Ｋ 35/64 35/64 35/72 35/72 35/74 35/74 35/76 35/76 39/395 Ｄ 39/395 Ｎ 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 1/00 Ａ６１Ｐ 1/00 17/00 17/00 17/02 17/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｎ 5/10 33/50 Ｑ 15/09 Ｔ ＺＮＡ Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/566 37/00 １０２ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/566 15/00 Ｆ 37/00 １０２ ＺＮＡＡ (72)発明者 サビーネ・ヴェルナー スイス国8032 チューリッヒ，ティトフィ スシュトラーセ 37 (72)発明者 スザンネ・ブラオン スイス国8050 チューリッヒ，ザルヴァト ールシュトラーセ 30 (72)発明者 イェルン−ペーター・ハレ ドイツ連邦共和国82377 ペンツベルク, ノンネンヴァルトシュトラーセ ８ツェ− (72)発明者 アンドレアス・ゴッペルト ドイツ連邦共和国80636 ミュンヒェン, ブルテンブルクシュトラーセ 30 (72)発明者 ヨハネス・レーゲンボーゲン ドイツ連邦共和国82152 マルティンスリ ート，プラネッガーシュトラーセ １

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 遺伝子ファミリーＮＭ２３の配列番号
    １ないし配列番号１０の１つにしたがった、少なくとも
    １つのポリペプチドまたはその機能する変異体、あるい
    は前記ポリペプチドの１つをコードする、少なくとも１
    つの核酸またはその変異体の、皮膚の障害および／また
    は腸障害の解析および／または診断および／または予防
    および／または治療のため、および／または創傷治癒お
    よび／または創傷治癒の障害の治療のための使用。
  2. 【請求項２】 遺伝子ファミリーＮＭ２３の配列番号
    １ないし配列番号１０の１つにしたがった、少なくとも
    １つのポリペプチドまたはその機能する変異体、あるい
    は前記ポリペプチドの１つをコードする、少なくとも１
    つの核酸またはその変異体の、皮膚の障害および／また
    は腸障害に、および／または創傷治癒および／または創
    傷治癒の障害の治療に関連する、少なくとも１つの薬理
    学的に活性がある物質の同定のための使用。
  3. 【請求項３】 薬理学的に活性がある物質が、例えば
    ＤＮＡ結合ドメイン、プロモーターまたはエンハンサ
    ー、リプレッサーの形の核酸、あるいは活性化剤または
    阻害剤の形のポリペプチドより選択されることで特徴付
    けられる、請求項２の使用。
  4. 【請求項４】 核酸がＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましく
    はＤＮＡであり、特に二本鎖ＤＮＡであることで特徴付
    けられる、請求項１ないし３の１つの、核酸の使用。
  5. 【請求項５】 核酸配列が、少なくとも１つのイント
    ロンおよび／またはポリＡ配列を有することで特徴付け
    られる、請求項１ないし４の１つの、核酸の使用。
  6. 【請求項６】 アンチセンス配列の形の、請求項１な
    いし５の１つの、核酸の使用。
  7. 【請求項７】 核酸が合成的に調製されていることで
    特徴付けられる、請求項１ないし６の１つの、核酸の使
    用。
  8. 【請求項８】 ポリペプチドが合成的に調製されてい
    ることで特徴付けられる、請求項１ないし３の１つの、
    ポリペプチドの使用。
  9. 【請求項９】 ポリペプチドが融合タンパク質である
    ことで特徴付けられる、請求項１ないし３または８の１
    つの、ポリペプチドの使用。
  10. 【請求項１０】 遺伝子ファミリーＮＭ２３の配列番
    号１ないし配列番号１０のポリペプチドまたはその変異
    体をコードする、少なくとも１つの核酸を含む、優先的
    にはプラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コ
    スミドの形のベクターの、皮膚の障害および／または腸
    障害および／または創傷治癒および／または創傷治癒の
    障害の解析および／または診断および／または予防およ
    び／または治療のための使用。
  11. 【請求項１１】 ベクターが発現ベクターであること
    で特徴付けられる、請求項１０の使用。
  12. 【請求項１２】 ベクターがノックアウト遺伝子構築
    物であることで特徴付けられる、請求項１０の使用。
  13. 【請求項１３】 ベクターが遺伝子治療に適している
    ベクターであることで特徴付けられる、請求項１０ない
    し１２の１つの使用。
  14. 【請求項１４】 遺伝子ファミリーＮＭ２３の配列番
    号１ないし配列番号１０の１つのポリペプチドまたはそ
    の変異体をコードする、少なくとも１つの核酸を含む、
    宿主細胞の、皮膚の障害および／または腸障害および／
    または創傷治癒および／または創傷治癒の障害の、解析
    および／または診断および／または予防および／または
    治療のための使用。
  15. 【請求項１５】 核酸が、請求項１０ないし１３の１
    つのベクターの形で宿主細胞に挿入されていることで特
    徴付けられる、請求項１４の宿主細胞の使用。
  16. 【請求項１６】 皮膚または腸細胞であることで特徴
    付けられる、請求項１４または１５の宿主細胞の使用。
  17. 【請求項１７】 トランスジェニック胚性非ヒト幹細
    胞であることで特徴付けられる、請求項１４または１５
    の宿主細胞の使用。
  18. 【請求項１８】 請求項１７のトランスジェニック胚
    性非ヒト幹細胞を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳
    動物の使用であって、トランスジェニック非ヒト哺乳動
    物が、皮膚の障害および／または腸障害および／または
    創傷治癒および／または創傷治癒の障害の、解析および
    ／または診断のために用いられることで特徴付けられ
    る、前記使用。
  19. 【請求項１９】 そのゲノムが、請求項１１または１
    ２の発現カセットまたはノックアウト遺伝子構築物を含
    むことで特徴付けられる、請求項１８のトランスジェニ
    ック非ヒト哺乳動物の使用。
  20. 【請求項２０】 皮膚の障害および／または腸障害お
    よび／または創傷治癒および／または創傷治癒の障害の
    解析および／または診断および／または予防、および／
    または薬理学的に活性がある物質の同定のための抗体の
    使用であって、前記抗体が、ＮＭ２３遺伝子ファミリー
    の配列番号１ないし配列番号１０の１つのポリペプチド
    に対して、またはその機能する変異体に対して向けられ
    る、前記使用。
  21. 【請求項２１】 皮膚の障害または腸障害および／ま
    たは創傷治癒および／または創傷治癒の障害の診断のた
    めの診断剤の使用であって、該診断剤が、ＮＭ２３遺伝
    子ファミリーの配列番号１ないし配列番号１０の１つに
    したがった、少なくとも１つのポリペプチドまたはその
    機能する変異体、あるいはこれらをコードする少なくと
    も１つの核酸、またはその変異体、あるいは請求項２０
    の少なくとも１つの抗体を、適切な場合、適切な添加剤
    および／または補助剤と共に含むことで特徴付けられ
    る、前記使用。
  22. 【請求項２２】 診断剤がプローブ、優先的にはＤＮ
    Ａプローブを含むことで特徴付けられる、請求項２１の
    方法。
  23. 【請求項２３】 適切な場合、適切な添加剤および／
    または補助剤を伴う、ＮＭ２３遺伝子ファミリーの配列
    番号１ないし配列番号１０の１つにしたがった、少なく
    とも１つのポリペプチドまたはその機能する変異体、あ
    るいは前記ポリペプチドをコードする少なくとも１つの
    核酸、またはその変異体、あるいは請求項２０の少なく
    とも１つの抗体の、医薬品（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）の
    調製のための使用であって、該医薬品が、皮膚の障害お
    よび／または腸障害および／または創傷治癒および／ま
    たは創傷治癒の障害の治療に用いられる、前記使用。
  24. 【請求項２４】 皮膚の障害および／または腸障害お
    よび／または創傷治癒および／または創傷治癒の障害と
    関連する、機能上の相互作用因子の同定のための試験の
    使用であって、該試験が、ＮＭ２３遺伝子ファミリーの
    配列番号１ないし配列番号１０の１つにしたがった、少
    なくとも１つのポリペプチドまたはその機能する変異
    体、あるいはこれらをコードする少なくとも１つの核
    酸、またはその変異体、あるいは請求項２０の少なくと
    も１つの抗体を、適切な場合、適切な添加剤および／ま
    たは補助剤と共に含むことで特徴付けられる、前記使
    用。
  25. 【請求項２５】 皮膚および／または腸障害および／
    または創傷治癒および／または創傷治癒の障害と関連す
    る解析のための、支持物質上に固定されたアレイの使用
    であって、該アレイが、ＮＭ２３遺伝子ファミリーの配
    列番号１ないし配列番号１０の１つにしたがった、少な
    くとも１つのポリペプチドまたはその機能する変異体、
    あるいは前記ポリペプチドをコードする少なくとも１つ
    の核酸、またはその変異体、あるいは請求項２０の少な
    くとも１つの抗体を含むことで特徴付けられる、前記使
    用。
  26. 【請求項２６】 アレイがＤＮＡチップおよび／また
    はタンパク質チップであることで特徴付けられる、請求
    項２５の使用。
JP2001047946A 2000-02-23 2001-02-23 遺伝子ファミリーｎｍ２３のポリペプチドまたはこれらをコードする核酸の、皮膚または腸障害の診断または治療のための使用、およびそれらの、薬理学的に活性がある物質の同定のための使用 Withdrawn JP2001322947A (ja)

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