JP2001321181A - 異種蛋白質の高発現法及び高発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 外来遺伝子から翻訳される異種蛋白質を効率
よく発現、生産する、異種蛋白質の高発現法と高発現ベ
クターを得る。 【解決手段】 異種蛋白質をコードする外来遺伝子を発
現ベクター内に導入した際に、外来遺伝子の転写を開始
するためのプロモーター領域と、前記外来遺伝子の開始
コドンとの間に、予め定められた蛋白質の転写・発現に
必要な遺伝子単位としての第１シストロンを配し、尚且
つ、該第１シストロンの終止コドンの一部の塩基配列と
異種蛋白質をコードする外来遺伝子の開始コドンの一部
の塩基配列とが重複するように配して発現ベクターとす
るもの。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、例えば大腸菌等の
宿主細胞を形質転換して、異種蛋白質を高効率で発現、
生産する、異種蛋白質の高発現法及び高発現ベクターに
関する。

【０００２】

【従来の技術】原核生物あるいは真核生物由来の蛋白質
（この場合、この蛋白質は本来の宿主細胞が発現、生産
しないという意味で異種蛋白質と呼ぶ）を遺伝子組換え
技術を用いて発現、生産させる試みは広く行われてい
る。

【０００３】多くの蛋白質は、遺伝子組換え技術が開発
される以前は、その供給源となる材料が限られることが
多いため、ほとんど純粋な形で得られることは少なく、
ほとんど研究対象となることが無かった。しかし、遺伝
子組換え技術の開発で、例えば大腸菌を用いて、多くの
微生物の酵素や高等生物由来のホルモン蛋白質や酵素の
発現が可能となり、多くの蛋白質が不純物の少ない状態
で大量に得られるようになった。

【０００４】そして、既に多くの蛋白質は、この遺伝子
組換え技術を利用して、大腸菌だけでなく、様々な細菌
細胞或いは真核生物由来の細胞を宿主として生産される
ようになっており、試薬、医薬品或いは工業用酵素とし
て製品化されている。

【０００５】しかしながら、大腸菌を宿主とした異種蛋
白質の生産は、他の細菌細胞や真核生物由来の細胞を宿
主として生産する場合に較べて蛋白質の生産に必要なプ
ロセス（転写、翻訳）の知識が蓄積されており、現在で
も最も広く使用されている宿主である。そして、転写、
翻訳、蛋白質の折りたたみ過程の基本的な知識の最近の
進展は、大腸菌を利用した異種蛋白質の発現、生産をさ
らに有用なものにしている。

【０００６】異種蛋白質を大腸菌を用いて生産する利点
は、宿主である大腸菌の特に生育が早いこと、安価な基
質を含んだ培養液で高い生産性が得られること、更にこ
れまで多くの研究成果が蓄積されており、その結果、そ
の豊富な遺伝学的知識から、たくさんのクローニングベ
クターとそのクローニングベクターを維持、管理する変
異型大腸菌が数多く開発されていることが上げられる。

【０００７】しかし、このような大腸菌とクローニング
ベクターを用いても、転写、翻訳がスムーズに進行し、
菌体内に蓄積される蛋白質が、目的とする分子量を持っ
た蛋白質として得られるかどうかの保証は必ずしもない
のが現状である。このため、現在でも大腸菌を用いて異
種蛋白質を生産する様々な改良がなされているというの
が現状である。

【０００８】ここで大腸菌を宿主として、組換え蛋白質
を生産させるためには、少なくとも以下のような特徴を
有するＤＮＡ配列を持ったプラスミドを用いることが必
要である。大腸菌内で蛋白質として遺伝子組換え技術を
用いて発現、生産させるためには、大腸菌細胞中の転
写、翻訳装置を利用できるようにプラスミドＤＮＡ上に
機能配列を適切な位置関係で配置されることが必要であ
る。

【０００９】その簡単な説明図は、図１１に示した。図
中、プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼが認識する
遺伝子上の構造である。オペレーターは、レプレッサー
が結合する部位であり、一般にリプレッサー蛋白質が結
合しているとこの遺伝子の転写は抑制される。転写開始
点とは、転写の際、ｍＲＮＡの転写の開始点である。SD
は、リボゾームが認識し、翻訳が開始するために必要な
シャイン・ダルガーノ（SD）構造である。 ATGは、蛋白
質を合成される際の最初のメチオニンをコードする開始
コドンを示す。STOPは、蛋白質の翻訳を終了する終止コ
ドンである。

【００１０】即ち、ＤＮＡからｍＲＮＡの転写開始のシ
グナルであるプロモーター配列とそのオペレーター、転
写されて生成したｍＲＮＡが、大腸菌リボゾームＲＮＡ
上で効率良く翻訳が行われるためのシャイン・ダルガー
ノ（SD）配列及びその直後に翻訳の開始コドンであるAT
G を少なくとも有し、ATG 下流に、目的の発現させたい
蛋白質を配置する。

【００１１】ここで言うプロモーターとは、遺伝子の転
写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節す
るＤＮＡ上の領域のことであり、ＲＮＡポリメラーゼが
結合することによって機能する。また、このプロモータ
ーの発現スイッチのオン・オフを行うための転写因子
（大腸菌では、しばしばリプレッサーと呼ばれる蛋白質
が行っている）が結合する領域（オペレーターと呼ばれ
る）は、しばしばその一部がプロモーターと重なってい
る場合が多い。

【００１２】このリプレッサー蛋白質をコントロールす
ること（"誘導剤"を加えるあるいは温度シフトによって
リプレッサー機能を阻害すると一般にプロモーターが稼
動する）によって、プロモーターのスイッチをコントロ
ール可能にする。また、プラスミドを安定に維持するた
めにプラスミド複製開始点とプラスミド損失細胞を選択
するマーカー遺伝子（一般には、抗生物質耐性にかかわ
る遺伝子が多く利用されている）がそのプラスミド上に
必要であり、以上の性質が大腸菌を用いて、簡単に異種
蛋白質を発現させる場合に良く利用される方法である
が、プラスミドではなく、ファージベクターを用いた方
法等もあり、上記、紹介した方法に限定されるものでは
ない。

【００１３】大腸菌を用いて異種蛋白質を効率よく発
現、生産する場合によく試みられる戦略のひとつは、遺
伝子量効果を利用した生産性の改善である。具体的に
は、異種蛋白質遺伝子を組み込む発現クローニングベク
ターの性質として、大腸菌内で多数のコピーとして存在
を許すことであり、その為に大腸菌内でプラスミドコピ
ー数が複数存在できるプラスミドの複製開始点が利用さ
れる。例えば、プラスミドpMB1/ColE1由来の複製開始点
は、細胞内に15〜60コピー、あるいは、pMB1の複製開始
点の変異型であるpUC系の複製開始点は、数100コピー、
さらにp15A由来の複製開始点は、10〜12コピーのプラス
ミドを大腸菌内に存在させることが出来る。

【００１４】このように大腸菌内に複数のコピーを存在
させる複製開始点を持ったベクターは、細胞分裂に伴い
ランダムに分配されても安定に分配されることになり、
結果として安定に維持されることになる。また、このよ
うなプラスミドを安定に維持するために、このプラスミ
ドを培養中に失った細胞のみを殺し、結果的にプラスミ
ドを持った細胞のみを選択するために培養液中にプラス
ミドに導入された耐性遺伝子に対応した抗生物質を培養
液中に添加するという戦略が取られる。

【００１５】次に、異種蛋白質を発現させるプロモータ
ーの強さも発現量に関係する重要な因子である。この目
的に利用させる大腸菌のプロモーターとして良く知られ
ているのは、tacあるいはtrcプロモーターである。これ
は、ラクトース資化性オペロンのプロモーター誘導体で
あり、カタボライト抑制のかからないオペレーター変異
をもつlacUV5プロモーターと、トリプトファン生合成系
オペロンのプロモーターである trpプロモーターとのハ
イブリッドプロモーターである。このプロモーターは、
ラクトースの添加によって稼動するが、異種蛋白質を大
腸菌に作らせる目的には、代謝されない合成糖としてイ
ソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（IPTG）を使
うことによって、蛋白質の生産に非常に都合の良い性質
を持っている。

【００１６】そのほか、同じく異種蛋白質を大腸菌で生
産する目的で利用可能であるλファージ由来のPLプロモ
ーターおよび大腸菌のファージであるT7プロモーターを
用いた発現ベクターが開発されており、目的に応じて選
択することが可能で、多くの組換え蛋白質の生産に成功
するようになった。しかし、このような強いプロモータ
ーは、プロモーター下流に配置された目的遺伝子の転写
量の増大には効果があるが、効率のよい翻訳を保証する
ものではなく、実際には組換え蛋白質の生産は試行錯誤
的要素が極めて高いというのが現状である。

【００１７】本発明者らは、これまで好熱性細菌から様
々な酵素を解析することによって、蛋白質の耐熱化のメ
カニズムを明らかしようとしてきた。この研究を推し進
めるために、好熱性細菌から、酵素遺伝子をクローニン
グし、遺伝子組換え技術を利用して、大腸菌を用いて生
産、精製し、その酵素の特性を調べるという研究を行っ
ている。また、酵素の耐熱化のメカニズムが明らかにな
れば、活性が安定な酵素の開発が可能になり、酵素の利
用範囲が著しく広がると予想されている。

【００１８】しかし、好熱性細菌から多くの遺伝子がク
ローニングされているが、大腸菌を宿主とした蛋白質の
発現系を用いても、その多くは、発現しないか、発現し
ても極めて少ないことは周知である。これは、好熱菌の
ゲノムＤＮＡのGC含量が一般に高く（約70％）、大腸菌
の菌体内で転写されたmＲＮＡが安定な2次構造を作りや
すく、そのため翻訳開始反応に必須なSD配列、ATG 開始
コドンを含むメッセンジャーＲＮＡ上の領域で安定な２
次構造を形成し、翻訳の開始反応を阻害しているためと
考えられている。実際に、この２次構造を排除するよう
な変異の導入を行うことによりこの翻訳効率が改善され
ることの報告も幾つかある。

【００１９】このような状況のなかで、本発明者は、好
熱性細菌であるThermus thermophilus HB8から有意にGC
含量の高い3-isopropylmalate dehydrogenase(IPMDH)を
コードしているleuB遺伝子をクローン化し、この遺伝子
産物を大腸菌で効率よく発現する組換えプラスミドであ
るpHB2を得た［Tanaka, T., et al.(1981) J. Bioche
m., 89:677-682］。しかしながら、この発現プラスミド
には、翻訳開始反応に必須なSD配列、ATG 開始コドンを
含むメッセンジャーＲＮＡ上に２次構造を有すると予想
された。

【００２０】また、使用しているプロモーターは、汎用
プラスミドとして有名なｐBR322 の抗生物質テトラサイ
クリン耐性遺伝子のプロモーター、Ptetを用いたもので
あり、さらにlueB遺伝子の上流には、テトラサイクリン
耐性遺伝子のＮ−末端配列がPtetとleuB遺伝子のあいだ
に存在しており、これまで大腸菌に異種生物蛋白質を生
産するとき、頻繁に利用されている強いプロモーターを
使用していないことから、好熱菌由来の遺伝子の発現が
上手く行かない理由として考えられた上記の説明で必ず
しも説明できなかった。

【００２１】そこで、強い転写能力を持つ、tac promot
erのコントロール下で、翻訳開始点付近の２次構造を除
去したが、先の発現プラスミドpHB2の発現効率に及ばな
いことを発見した［Ishida, M., et al. (1994) J. Bac
teriol., 176(9):2767-2770］。これは、強いプロモー
ターの支配下で、転写産物（ｍＲＮＡ）は大量に作られ
るものの、翻訳効率が著しく低く、蛋白質が作られてい
ないと理解される。このことは、大腸菌細胞中での異種
蛋白質の効率的な発現は、強いプロモーターの使用、あ
るいは翻訳開始点付近の２次構造を取らないようにすれ
ば達成させるという単純な問題ではないことが結論され
た。

【００２２】この現象と同じような例は、真核生物の遺
伝子を大腸菌で発現させようとしたとき、しばしば観察
されていた。そのために転写産物が、効率よく翻訳開始
がおこるように転写開始点からSD-ATG周辺領域に工夫を
凝らし、翻訳の改善を試みた多くの報告があり、先に議
論した翻訳開始点付近の安定な２次構造とその２次構造
中に配置されているSD配列とATG 配列の関係を論じてい
る。

【００２３】そこで、目的の蛋白質をｍＲＮＡの翻訳開
始点付近の２次構造を形成できないように、大腸菌を代
表とする原核生物の蛋白合成が転写と翻訳が同時に起こ
ることに着目して、先ず発現させたい目的遺伝子を２番
目のシストロンとなるように配置し、その上流に短いシ
ストロンを配置し、転写−翻訳を起こさせることによっ
て、第２のシストロンの翻訳開始に必要なSD-ATG周辺領
域の２次構造形成を押さえて、結果的に翻訳効率を改善
しようという試みが数多く行われた。

【００２４】この試みの一つとして、Schoner らは、牛
成長ホルモンを効率良く大腸菌に作らせることに成功し
た。これは、Two-cistronシステムと呼ばれるものであ
り［Schoner,B.E., et al. (1984) Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA., 81:5403-5407］、また、この方法を用いたたく
さんの成功例も多数報告されている。その一つの例とし
て、図１２には、SchonerらのTwo-cistron systemの概
念図を示す（Schoner, B.E., et al. Methods Enzymo
l.,185:94-103(1990)）。

【００２５】尚、図中、プロモーターとは、ＲＮＡポリ
メラーゼが認識する遺伝子上の構造である。オペレータ
ーは、レプレッサーが結合する部位であり、一般にリプ
レッサー蛋白質が結合しているとこの遺伝子の転写は抑
制される。転写開始点とは、転写の際、ｍＲＮＡの転写
の開始点である。SDは、リボゾームが認識し、翻訳が開
始するために必要なシャイン・ダルガーノ（SD）構造で
ある。 ATGは、蛋白質を合成される際の最初のメチオニ
ンをコードする開始コドンを示す。STOPは、蛋白質の翻
訳を終了する終止コドンである。

【００２６】ここで、使用するプロモーター下流直ぐの
シストロンを第１シストロン、発現させたい目的遺伝子
をコードする第１シストロン下流のシストロンを第２シ
ストロンと呼ぶ。ここで使用する”シストロンあるいは
cistron ”は、大腸菌遺伝学の相補性検定から生まれた
概念で、二つの突然変異が互いに相補しない場合に、”
同一のシストロン”に属すると定義されているが、ここ
では、遺伝子の最小単位として蛋白質をコードする領域
（オープン・リーディング・フレーム、ＯＲＦ）と同義
に使用する。

【００２７】本発明者は、GC-rich で発現効率が非常に
悪い好熱性菌由来の遺伝子を大腸菌に発現させるために
さらに鋭意研究を進めた。その結果、発現プラスミドを
持った大腸菌から発現効率の株をスクリーニングする過
程で、この発現効果の改善されたクローンが結果的に二
つのシストロンからなり、二つのシストロンが４塩基分
重なった発現プラスミドになっていることが判明した。
より詳しく説明すると、GC-richのThermophilus leuBを
大腸菌で高発現系をスクリーニングして探した結果、親
プラスミドよりも４．８倍高い活性を示す菌体を得た。
これを解析した結果、ＯＲＦの長さが短くなった変異で
あることを確認した（Ishida,M., et al. (1997) J.Bio
chem., 121(6):1031-1034）。更に、本発明者は、GC-ri
chのThermophilus leuBの高発現系の構築中に、偶然得
られた高発現ベクター(E.coli leu-株中で、生育が早く
なったものから得られたプラスミド)を回析したとこ
ろ、ATGの重なりが観察され、GC-rich遺伝子を大腸菌で
発現させるときには、(1) 強いプロモータを使用するこ
と、(2) 翻訳効率が高い、短いリーダＯＲＦを導入する
こと、(3) プロモータ下流にリーダーＯＲＦを配置する
こと、(4) シストロンをATGAの４塩基でオーバラップさ
せるとよいことを論じた（Ishida,M., et al. (1997) E
xtremophiles, 1:157-162）。図１３にATGコドンの重な
っている状態を説明する説明図を示す。

【００２８】尚、図中、プロモーターとは、ＲＮＡポリ
メラーゼが認識する遺伝子上の構造である。オペレータ
ーは、レプレッサーが結合する部位であり、一般にリプ
レッサー蛋白質が結合しているとこの遺伝子の転写は抑
制される。転写開始点とは、転写の際、ｍＲＮＡの転写
の開始点である。SDは、リボゾームが認識し、翻訳が開
始するために必要なシャイン・ダルガーノ（SD）構造で
ある。 ATGは、蛋白質を合成される際の最初のメチオニ
ンをコードする開始コドンを示す。STOPは、蛋白質の翻
訳を終了する終止コドンである。

【００２９】現在、急速な勢いで解析が進んでいるゲノ
ム解析計画は、生物の丸ごと全部の遺伝子配列を解析し
ようという目的を持っている。そして、現在判ってきて
いることは、遺伝子配列からこれまで解析されたことの
ない、機能不明の遺伝子が多数存在することである。そ
のため、比較生物学的な観点から、遺伝子機能を推定す
るとか、蛋白質のドメイン構造に注目して、機能を予想
するといった、大量のデータをコンピューターで解析す
ることによって、遺伝子機能を絞込みを行うアプローチ
が取られつつある。

【００３０】しかし、最終的には、蛋白質の機能を調べ
るためには、実際の蛋白質を精製して、その機能を確認
することが最終的に必要になるだろうし、また、実用段
階の研究、あるいは医薬品等にするためには、その蛋白
質を大量に得ることが必要である。しかし、生体から直
接、このような蛋白質を大量に得ることは、不可能に近
く、組換え技術を利用した安定な蛋白質発現のシステム
の開発が望まれている。

【００３１】

【発明が解決しようとする課題】一般に大腸菌による異
種蛋白質を発現、生産するための発現プラスミドの構築
は、発現ベクター上のプロモーター下流に目的蛋白質の
遺伝子を挿入することによって達成される。しかし、実
際に発現するかどうかは、使用するプロモーターと発現
させたい蛋白質をコードした遺伝子のＮ−末端側の配列
に依存することが知られており、しばしば、発現の成功
までには試行錯誤が必要である。特にＧＣ−含量の高い
遺伝子は、発現が困難であることが多い。

【００３２】そこで、本発明は、発現させたい目的遺伝
子（第２シストロン）の上流にリーダー配列（第１シス
トロン）を配し、尚且つ、第１シストロンの終止コドン
と第２シストロンの開始コドンを重なるように配置した
発現プラスミドを得た上で、外来遺伝子から翻訳される
異種蛋白質を効率よく発現、生産する、異種蛋白質の高
発現法と高発現ベクターを得ることを目的とする。

【００３３】

【課題を解決するための手段】請求項１に記載された発
明に係る異種蛋白質の高発現法は、異種蛋白質をコード
する外来遺伝子を発現ベクター内に導入し、この発現ベ
クターを宿主微生物内に導入して該宿主微生物を培養す
ることにより異種蛋白質を発現させる方法において、異
種蛋白質をコードする外来遺伝子を発現ベクター内に導
入した際に、外来遺伝子の転写を開始するためのプロモ
ーター領域と、前記外来遺伝子の開始コドンとの間に、
予め定められた蛋白質の転写・発現に必要な遺伝子単位
としての第１シストロンを配し、尚且つ、該第１シスト
ロンの終止コドンの一部の塩基配列と異種蛋白質をコー
ドする外来遺伝子の開始コドンの一部の塩基配列とが重
複するように配して発現ベクターとするものである。

【００３４】請求項２に記載された発明に係る異種蛋白
質の高発現法は、請求項１に記載された異種蛋白質の発
現法において、前記第１シストロンの終止コドンの一部
の塩基配列と異種蛋白質をコードする外来遺伝子の開始
コドンの一部の塩基配列との重複する塩基配列を含む構
造を、「ＡＴＧＡ」又は「ＴＧＡＴＧ」とするものであ
る。

【００３５】請求項３に記載された発明に係る異種蛋白
質の高発現法は、請求項１又は２に記載された異種蛋白
質の高発現法において、前記プロモーター領域として、
以下に示す何れかのプロモータ領域を備えているもので
ある。 ・テトラサイクリン耐性遺伝子プロモーター（Ptet） ・ラクトース資化性オペロンプロモーター（Plac) ・ラクトース資化性オペロンプロモーター誘導体（Plac
UV5, Ptac, Ptrc) ・トリプトファン生合成系オペロンプロモーター(Ptrp) ・ファージT7ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター(P
T7) ・ファージT3ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター
（PT3） ・ファージSP6ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター
(PSP6) ・低温感受性プロモーター(PcspA) ・ファージλPLプロモーター(PλPL) ・アルカリフォスファターゼ遺伝子プロモーター(Ppho
A) ・アラビノースプロモーター（ParaBAD)

【００３６】請求項４に記載された発明に係る異種蛋白
質の高発現法は、請求項１〜３の何れかに記載された異
種蛋白質の高発現法において、 前記異種蛋白質をコードする外来遺伝子として、遺伝子
中に「ＡＴ」塩基対よりも「ＧＣ」塩基対が圧倒的に多
く存在するＧＣ-rich の遺伝子を用いるものである。

【００３７】請求項５に記載された発明に係る異種蛋白
質の高発現ベクターは、外来遺伝子の転写を開始するた
めのプロモーター領域と、 該プロモータ領域の下流に配された、予め定められた蛋
白質の転写・発現に必要な遺伝子単位としての第１シス
トロンと、 該第１シストロンの終止コドンの一部の塩基配列と異種
蛋白質をコードする外来遺伝子の開始コドンの一部の塩
基配列とが重複するように配された、異種蛋白質の転写
・発現に必要な遺伝子単位をコードする第２シストロン
と、 宿主細胞での複製開始点を含むオリジン(ori) 領域とを
備えた発現ベクターであって、 異種蛋白質をコードする外来遺伝子を導入するための制
限酵素認識部位を第１シストロンの終止コドンの一部又
は第２シストロンの開始コドンの下流の領域に備えたも
のである。

【００３８】請求項６に記載された発明に係る異種蛋白
質の高発現ベクターは、請求項５に記載された異種蛋白
質の高発現ベクターにおいて、 前記第１シストロンの終止コドンの一部の塩基配列と異
種蛋白質をコードする外来遺伝子の開始コドンの一部の
塩基配列との重複する塩基配列を含む構造が、「ＡＴＧ
Ａ」又は「ＴＧＡＴＧ」であるものである。

【００３９】請求項７に記載された発明に係る異種蛋白
質の高発現ベクターｐＬＥＡＤ４は、請求項５又は６に
記載された異種蛋白質の高発現ベクターにおいて、 前記プロモーター領域として、ｔａｃプロモータ領域を
備え、 前記第１シストロンの終止コドンの一部の塩基配列と異
種蛋白質をコードする外来遺伝子の開始コドンの一部の
塩基配列との重複する塩基配列を含む構造が、「ＡＴＧ
Ａ」であるものである。

【００４０】請求項８に記載された発明に係る異種蛋白
質の高発現ベクターｐＬＥＡＤ５は、請求項５又は６に
記載された異種蛋白質の高発現ベクターにおいて、 前記プロモーター領域として、ｔａｃプロモータ領域を
備え、 前記第１シストロンの終止コドンの一部の塩基配列と異
種蛋白質をコードする外来遺伝子の開始コドンの一部の
塩基配列との重複する塩基配列を含む構造が、「ＴＧＡ
ＴＧ」であるものである。

【００４１】請求項９に記載された発明に係る形質転換
微生物は、請求項５〜８の何れかに記載された異種蛋白
質の高発現ベクターを宿主微生物中に保持させて形質転
換したものである。

【００４２】請求項１０に記載された発明に係る形質転
換大腸菌は、請求項９の形質転換微生物において、 前記微生物が大腸菌であって、 前記オリジン（ori） 領域が、以下に示された何れかの
オリジン領域を含むものである。 ・ｐMB１由来の複製オリジン ・p15A由来の複製オリジン ・pSC101由来の複製オリジン ・λファージ由来の複製オリジン

【００４３】

【発明の実施の形態】本発明者らは、蛋白質の耐熱化機
構を研究のために多数の好熱菌由来の遺伝子をスクリー
ニングし、遺伝子産物の生産を行っている。しかし、そ
の発現は、非常に難しく、鋭意研究を重ねた結果、蛋白
質発現の翻訳効率を高める発現ベクターの開発に成功し
た。

【００４４】本発明による異種蛋白質の高発現法は、異
種蛋白質をコードする外来遺伝子を発現ベクター内に導
入した際に、外来遺伝子の転写を開始するためのプロモ
ーター領域と前記外来遺伝子の開始コドンとの間に、予
め定められた蛋白質の転写・発現に必要な遺伝子単位と
しての第１シストロンを配し、尚且つ、該第１シストロ
ンの終止コドンの一部の塩基配列と異種蛋白質をコード
する外来遺伝子の開始コドンの一部の塩基配列とが重複
するように配して発現ベクターとするものであり、これ
を宿主微生物中で培養することにより、外来遺伝子から
翻訳される異種蛋白質を効率よく生産することができ
る。また、本発明の方法によれば、GC-rich で発現効率
が非常に悪い好熱性菌由来の遺伝子を大腸菌に発現させ
ることも可能となる。

【００４５】第１シストロンの終止コドンの一部の塩基
配列と異種蛋白質をコードする外来遺伝子の開始コドン
の一部の塩基配列との重複する塩基配列を含む構造とし
ては、４塩基が重なる「ＡＴＧＡ」又は中央の「Ａ」が
重なる「ＴＧＡＴＧ」の何れでも良い。後述する実施例
に示す通り、「ＡＴＧＡ」の方が「ＴＧＡＴＧ」よりも
若干発現効率が高いが、「ＴＧＡＴＧ」でも実用上は、
全く問題ない。

【００４６】重なりが「ＡＴＧＡ」の場合には、発現効
率が高いものの、発現させたい遺伝子の第２コドンの最
初の塩基がＡに限定されるため、もともとの蛋白質の第
２コドンの最初の塩基がＡのものか、あるいは、この部
位をＡに変え、結果的に第２アミノ酸が変化してもその
蛋白質の活性や、生物活性に影響ないものが利用でき
る。ここで、このベクターを使用する場合は、第２コド
ンの最初の塩基がＡとなるため、第２アミノ酸は、Ile,
Met, Thr, Asn, Lys, Arg, およびSer のいずれかに限
定される。

【００４７】本発明における発現ベクターとしては、外
来遺伝子の転写を開始するためのプロモーター領域と前
記外来遺伝子の開始コドンとの間に、予め定められた蛋
白質の転写・発現に必要な遺伝子単位としての第１シス
トロンを配することが重要であり、宿主微生物や外来遺
伝子の転写を開始するためのプロモーター領域は、ある
程度自由に選択可能である。

【００４８】例えば、プロモーター領域は、外来遺伝子
の転写を行うのであれば、テトラサイクリン耐性遺伝子
プロモーター（Ptet）、ラクトース資化性オペロンプロ
モーター（Plac)、ラクトース資化性オペロンプロモー
ター誘導体（PlacUV5, Ptac,Ptrc)、トリプトファン生
合成系オペロンプロモーター(Ptrp)、ファージT7ＲＮＡ
ポリメラーゼ特異的プロモーター(PT7)、ファージT3Ｒ
ＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター（PT3）、ファー
ジSP6ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター(PSP6)、
低温感受性プロモーター(PcspA)、ファージλPLプロモ
ーター(PλPL)、アルカリフォスファターゼ遺伝子プロ
モーター(PphoA)、アラビノースプロモーター（ParaBA
D)等のプロモータから選択可能であるが、好ましくは、
ｔａｃプロモータ等のより高発現のプロモータが選択さ
れる。

【００４９】本発明による発現ベクターは、外来遺伝子
の転写を開始するためのプロモーター領域と、該プロモ
ータ領域の下流に配された予め定められた蛋白質の転写
・発現に必要な遺伝子単位としての第１シストロンと、
該第１シストロンの終止コドンの一部の塩基配列と異種
蛋白質をコードする外来遺伝子の開始コドンの一部の塩
基配列とが重複するように配された異種蛋白質の転写・
発現に必要な遺伝子単位をコードする第２シストロン
と、宿主細胞での複製開始点を含むオリジン(ori) 領域
とを備え、特に、異種蛋白質をコードする外来遺伝子を
導入するための制限酵素認識部位を第１シストロンの終
止コドンの一部又は第２シストロンの開始コドンの下流
の領域に備えている。

【００５０】ここで、第１シストロンの終止コドンの一
部の塩基配列と異種蛋白質をコードする外来遺伝子の開
始コドンの一部の塩基配列とが重複する塩基配列として
は、４塩基が重なる「ＡＴＧＡ」又は中央の「Ａ」が重
なる「ＴＧＡＴＧ」の何れでも良い。

【００５１】本発明によれば、宿主微生物は、発現ベク
ターによって形質転換されるものであれば、いかなる微
生物をも採りうる。しかし、先行技術の蓄積等を考慮す
ると、大腸菌が最適である。従って、発現ベクターに
は、オリジン(ori)領域が、ｐMB１由来の複製オリジ
ン、p15A由来の複製オリジン、pSC101由来の複製オリジ
ン、λファージ由来の複製オリジンの何れかの領域を含
むものがあげられる。

【００５２】本発明に係る具体的な高発現ベクターとし
て、２種のベクター即ち、ｐＬＥＡＤ４及びｐＬＥＡＤ
５が既に作製され、これを導入した大腸菌は、生物工学
研究所に、各々FERM P-17840(Escherichia coli JM109
(pLEAD4)）及びFERM P-17841(Escherichia coli JM109
(pLEAD5))として、平成１２年４月２８日付けで寄託済
みである。

【００５３】ｐＬＥＡＤ４ベクター(後述する図７を参
照)は、第１シストロンの終止コドンと第２シストロン
の開始コドンの重なりが４塩基(ATGA)となるような発現
ベクターを構築可能である。これは、重なりのなかで最
も発現効率が高い発現ベクターである。但し、発現させ
たい遺伝子の第２コドンの最初の塩基がＡに限定される
ため、もともとの蛋白質の第２コドンの最初の塩基がＡ
のものか、あるいは、この部位をＡに変え、結果的に第
２アミノ酸が変化してもその蛋白質の活性や、生物活性
に影響ないものを利用する必要がある。ここで、このベ
クターを使用する場合は、第２コドンの最初の塩基がＡ
となるため、第２アミノ酸は、Ile, Met,Thr, Asn, Ly
s, Arg, およびSer のいずれかに限定されることにな
る。

【００５４】ｐＬＥＡＤ４ベクターは、以上のような制
限が存在するが、第２アミノ酸の変化を許さない場合の
発現ベクターとして、第１シストロンの終止コドンと第
２シストロンの開始コドンの重なりが１塩基(TGATG) と
なるような発現ベクターが、ｐＬＥＡＤ５ベクター（後
述する図８を参照）である。この場合は、発現させたい
遺伝子の配列を原則として変更する必要がないので、野
生型蛋白質と同じ蛋白質を作ることが出来る利点があ
る。しかし、これまでの結果から、４塩基の重なりの場
合に較べると若干、発現量が劣るものの、実用上は、全
く問題ない。

【００５５】遺伝子組換え技術分野では、ＰＣＲを用い
た遺伝子クローニングは汎用的な技術になりつつあり、
その操作性がよく、極めて迅速に遺伝子をクローニング
可能であるが、以上のように、本発明の発現法を用いる
ことにより、例えば、大腸菌を用いて蛋白質を発現させ
る際に簡単に発現プラスミドの構築が可能である。

【００５６】現在、急速な勢いで解析が進んでいるゲノ
ム解析計画は、生物の丸ごと全部の遺伝子配列を解析し
ようという目的を持っている。そして、現在判ってきて
いることは、遺伝子配列からこれまで解析されたことの
ない、機能不明の遺伝子が多数存在することである。そ
のため、比較生物学的な観点から、遺伝子機能を推定す
るとか、蛋白質のドメイン構造に注目して、機能を予想
するといった、大量のデータをコンピューターで解析す
ることによって、遺伝子機能の絞込みを行うアプローチ
が採用されつつある。しかしながら、一方で、最終的に
蛋白質の機能を調べるためには、実際に蛋白質を生成
し、その機能を確認することが必要である。このこと
は、今後、益々、機能不明な遺伝子が発見されると予想
されるが、その一つ一つについて、蛋白質の機能の確認
のみならず、実用段階の研究或いは医薬品等への応用に
際して、その蛋白質を大量に得ることが必要であること
を意味する。

【００５７】本発明は、"大量の遺伝子を少量生産でき
れば良い"という基礎研究の目的のみならず、ある遺伝
子産物を大量に生産するという実用的なニーズにも充分
答えられる蛋白質発現の手法を提供するものである。

【００５８】本発明は、産業上、価値がある蛋白質の生
産に利用できるのは勿論であるが、これまで発現が難し
かった遺伝子の発現を容易にするため、蛋白質に変異導
入による改変や機能付加と言った基礎研究分野にも利用
可能である。したがって、本発明は酵素を用いる産業上
の分野で非常に有用であり、例えば、医薬品開発、診断
用酵素開発、酵素試薬及び工業用酵素の生産に特に有用
である。

【００５９】

【実施例】［実施例１］第１シストロンと第２シストロ
ンとの重なりの効果 第１シストロンの終止コドンと第２シストロンの開始コ
ドンとが重なっている遺伝子発現の例は多数存在する。
ここでこれまでの変異体からの解析から、ATGAという４
塩基の重なりがあると第２シストロンの発現量が増大す
ることが示唆された。したがって、この配列の効果を検
討した。また、Yanofskyらの報告［Yanofsky,C., et a
l. (1981) Nucleic Acids Res., 9: 6647-6668］では、
大腸菌のtrp operon中には、TGATGという別な重なりの
例が報告されている。したがって、これらの配列の効果
をGC含量が高いＤＮＡポリメラーゼ遺伝子(polA)の発現
にどのような効果があるか検討した。

【００６０】Thermus thermophilus由来のＤＮＡポリメ
ラーゼの発現プラスミドであるｐＬＥＤ−ＮＳとプラス
ミドｐＵＣ１８とを用いて、以下の実験を行った。

【００６１】図１はプラスミドｐＴＴＰ−ＵＣの構築を
説明した工程図である。図１に示す通り、先ず、ｐＬＥ
Ｄ−ＮＳのpolA遺伝子（Tth ＤＮＡポリメラーゼをコー
ドする遺伝子）の24塩基対よりなる翻訳開始領域を除去
した。

【００６２】その後の実験のプラスミドのスクリーニン
グを容易にするために、制限酵素EcoRI(5'-GAATTC-
3')、NcoI(5'-CCATGG-3')、及び Csp45I(5'-TTGCAA-3')
サイトを導入するＰＣＲ用プライマーTPOL-C3(5'-AAGAA
TTCCCATGGTTTCGAACCCAAAGGCCGGGTCC-3'、配列番号１)
と、polA遺伝子の開始コドンから 995塩基下流にあるEc
o52Iを含む領域を挟むＰＣＲ用プライマーTPOL-C5(5'-G
CCAAGACGGCGAGGTCCTT-3'、配列番号２）とを用いて、プ
ラスミドｐＬＥＤ−ＮＳを鋳型としてＰＣＲを行なっ
た。尚、ＰＣＲ用プライマーTPOL-C3及びTPOL-C5は、後
述する配列表の配列番号１及び配列番号２として記載し
た。

【００６３】ＰＣＲはザイモリアクターII model 820
(アトー株式会社)を用いて、94℃-45秒、59℃-45秒、72
℃-90秒を１サイクルとして、30サイクル反応を行なっ
た。このＰＣＲ反応物を制限酵素EcoRI及びEco52Iで消
化した。この反応物は、予めEcoRI及びEco52Iで消化し
たｐＬＥＤ−ＮＳのpolA遺伝子のN-末端部と置き換え
た。

【００６４】このプラスミドは結果としてpolA遺伝子の
翻訳開始領域を欠損しており、このpolA遺伝子を制限酵
素EcoRIとXbaIで反応し、切り出し、予めEcoRI及びXbaI
で反応したプラスミドｐＵＣ１８にクローニングし、ｐ
ＴＴＰ−ＵＣを作製した。結果としてこのプラスミド
は、Ｎ−末端８残基欠損したpolA蛋白質を含み、その直
前にEcoRI-NcoI-Csp45Iの制限酵素サイトが存在する。
また、 EcoRIサイトはｐＵＣ１８のβガラクトシダーゼ
のαペプチドの開始コドン下流に存在する。

【００６５】図２に示す通り、このプラスミドｐＴＴＰ
−ＵＣを制限酵素 EcoRI及びCsp45Iで処理し、このサイ
トに合成オリゴヌクレオチドを導入することによって、
polA遺伝子上流の配列である第１シストロンの終止コド
ンと第２シストロンの開始コドンの重なりと遺伝子発現
の関係を調べた。

【００６６】表１には、今回、合成したオリゴヌクレオ
チドの配列を示し、このオリゴカセットは、ｐＴＴＰ−
ＵＣプラスミドを制限酵素 EcoRI及びCsp45Iで消化した
後、挿入した。尚、表１に示した合成オリゴヌクレオチ
ドの配列は、後述する配列表の配列番号３〜配列番号１
６として記載した。

【００６７】具体的には、図２に示す通り、このプラス
ミドｐＴＴＰ−ＵＣを制限酵素 EcoRIとCsp45Iで消化
し、表１に示したオリゴカセットである10D, 2D, 5M, 1
0DT, 2DT, 5MT, 4MTをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで
各オリゴヌクレオチドの5'-末端をリン酸化して導入
し、ｐＵＣ１８由来のβガラクトシダーゼのＮ−末端か
ら続く第１シストロンの終止コドンと第２シストロンで
ある polA遺伝子のＮ−末端のアミノ酸8残基とリボゾ
ーム結合配列であるSD配列を補給し、完全なpolA遺伝子
とした。

【００６８】

【表１】

【００６９】この場合、オリゴカセット10D、2D、5Mを
導入したプラスミドから発現する polA蛋白質は、第１
シストロンの終止コドンと第２シストロンの開始コドン
との重なりが１塩基（重なり１）を検討したものであ
り、野生型と同じアミノ酸配列を持つ。しかし、オリゴ
カセット 10DT、2DT、5MT、4MTを導入したプラスミド
は、第１シストロンの終止コドンと第２シストロンの開
始コドンの重なりが４塩基（重なり４、ATGA）を検討し
たものであり、その結果polA蛋白質の第２コドンの最初
の塩基がＡとなるため、polA蛋白質の２番目のアミノ酸
がスレオニンに変化するため、このオリゴカセットを導
入したすべてpolA蛋白質の２番目のアミノ酸をスレオニ
ンになるように設計した。

【００７０】このようにして作製したプラスミドを大腸
菌 JM109株に導入し、プラスミドを精製した後、導入し
たオリゴカセットが正しく導入されているかどうかは、
サンガー法によりその塩基配列を確認した。そして、各
プラスミドを導入した JM109株を抗生物質アンピシリン
(最終濃度100μg/ml)と1.25mM IPTGを含んだYT培地(1%
Bacto trypton, 0.5% Bacto yeast extract, 0.5% NaC
l) にて37℃で、20時間培養することによって、プラス
ミド上のpolA蛋白質を発現させた。培養終了後、各大腸
菌菌体を遠心分離により集め、生理食塩水(0.8%)にて大
腸菌菌体を洗浄し、50mMリン酸カリウム溶液(pH 7.5)に
懸濁し、超音波破砕機により大腸菌菌体を破壊した。

【００７１】この遠心上清を70℃、30分間処理し、12,0
00 ×gで15分間、遠心操作を行ない、その遠心上清を得
た。この遠心上清のＤＮＡポリメラーゼ活性を、デゴキ
シゲニン及びビオチンラベルdUTPの取りこみから測定す
るＥＬＩＳＡキット（RocheDiagnostics, Cat No.1 669
885）を用いて、37℃で100μlの反応体積で測定し、大
腸菌重量当たりのポリメラーゼ活性を求めた。この場合
のＤＮＡポリメラーゼの１単位は、37℃、30分間に1 pm
olのデゴキシゲニンラベルdUTPを取り込む活性と定義し
た。

【００７２】図３はpolA遺伝子の上流の配列と各プラス
ミドから発現されたＤＮＡポリメラーゼの活性を示し
た。図３に示す通り、pTP-5M とpTP-5MTとは、第１シス
トロンの終止コドンと第２シストロンの開始コドンの重
なりが１塩基（重なり１）となった。この場合、pTP-5M
上のpolA遺伝子の第２アミノ酸は、野生型polAと同じグ
ルタミン酸(E, Glu)である。pTP-5MT 上のpolA遺伝子の
第２コドンの最初の塩基は「Ａ」となるため、polAの第
２アミノ酸はグルタミン酸(E, Glu)からスレオニン(T,
Thr)に変化している。

【００７３】図３のpTP-4MT は、第１シストロンの終止
コドンと第２シストロンの開始コドンの重なりが４塩基
（重なり４）となった。この場合、４塩基重なることに
より、polAの第２コドンの最初の塩基は「Ａ」となるた
め、polAの２番目のアミノ酸は、グルタミン酸(E,Glu)
からスレオニン(T,Thr)に変化した。しかしながら、図
３のＤＮＡポリメラーゼ活性から判断すると、このアミ
ノ酸の変化は、polA産物の活性に全く影響しなかった。
また、図３のＤＮＡポリメラーゼ活性から判断すると、
いずれもシストロンを重ねると発現量が増大することが
判った。また、重なり４は、重なり１よりも若干ではあ
るが発現量（ポリメラーゼの活性）が多い傾向があるこ
とも確認された。

【００７４】［実施例２］ tacプロモーター支配下のシ
ストロン重なり効果 実施例１で示した発現ベクターは、ｐＵＣ１８由来のla
cUV5プロモーターによりpolA遺伝子の発現をコントロー
ルした。しかし、このプロモーターは、大腸菌プロモー
ターの中では強い部類であるがさらに転写活性の強い t
acプロモーターを用いてシストロン重なり効果を調べ
た。

【００７５】polA蛋白質発現プラスミドｐＬＥＤ−ＮＳ
のpolA遺伝子上流に36塩基対の第１シストロンを以下の
ように導入した。シストロン重なり１とするために、Ｐ
ＣＲ用プライマー LOR-PO5 (5'-AAGAATTCAGGAGGATTATCA
TATGACCATGATTACTGATATCAGGAGGATCACGTGATGGAGGCGATGCT
TCCGC-3'、配列番号１７)と、TPOL-C5 (配列は実施例１
に記載）とを用いた。

【００７６】また、シストロン重なり４とする為には、
polA遺伝子の第２コドンのGAGをACCに変更する必要があ
り、そのためのＰＣＲ用プライマーLOR-PO4 (5'-AAGAAT
TCAGGAGGATTGTCATATGACCATGATTGATATCAGGAGGATTTACGTAT
GACCGCGATGCTTCCGCTCTTTGA-3'、配列番号１８)とTPOL-C
5とを用いた。各々、プラスミドｐＬＥＤ−ＮＳを鋳型
として、(94℃-45秒、57℃-30秒、72℃-90秒)を1サイク
ルとし、３０サイクルのＰＣＲを行ない、各増幅したＰ
ＣＲ産物をEcoRI、Eco52Iで消化した。尚、ＰＣＲ用プ
ライマーLOR-PO5及びLOR-PO4は、後述する配列表の配列
番号１７及び配列番号１８として記載した。

【００７７】このＰＣＲ断片を含めEcoRI、Eco52Iで消
化したｐＬＥＤ−ＮＳのpolA遺伝子のＮ−末端を含む、
EcoRI-Eco52I断片と置き換え、結果的にプラスミドpPO5
36とpPO45を得た（図５及び図６参照）。また、これら
配列は、シークエンスを行ない確認した。

【００７８】このプラスミドを用いて、実施例１に記載
されている方法と同様に、大腸菌JM109株に導入し、熱
処理上清のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。その結
果と各プラスミドの第１シストロンと第２シストロンが
重なる領域の塩基配列の構造を図４に示した。それによ
ると、実施例１で示したpUC由来のlacUV5プロモーター
よりも転写活性が強いことが知られているｔａｃプロモ
ーターを使用するとＤＮＡポリメラーゼの活性が増大
し、明らかに強いプロモーターを使用する効果が確認で
きた。さらに第１シストロンの終止コドンと第２シスト
ロン（この場合、polA遺伝子に相当）の重なりが４塩基
の場合が１塩基の重なりよりも、蛋白質生産性に関して
効果があることが判明した。

【００７９】［実施例３］発現ベクターｐＬＥＡＤ４お
よびｐＬＥＡＤ５の構築 転写活性の高いtacプロモーターを用いて、two-cistron
システムを用いたシストロンの重複が蛋白質発現に効果
があることが判明したので、様々な蛋白質の発現をこの
システムで試すことを容易にする新規な発現ベクターで
あるｐＬＥＡＤ４およびｐＬＥＡＤ５を以下のように構
築した。

【００８０】図５は発現ベクターｐＬＥＡＤ４の構築を
説明した工程図である。図６は発現ベクターｐＬＥＡＤ
５の構築を説明した工程図である。図７は発現ベクター
ｐＬＥＡＤ４の特徴を示した説明図である。図８は発現
ベクターｐＬＥＡＤ５の特徴を示した説明図である。図
９は発現ベクターｐＬＥＡＤ４の要部の説明図である。
図１０は発現ベクターｐＬＥＡＤ５の要部の説明図であ
る。

【００８１】図７及び図９に示す通り、第１シストロン
と第２シストロンの重なりが４塩基となるように遺伝子
導入する発現ベクターｐＬＥＡＤ４は、プラスミドpPO4
5をEco105IとHindIIIで消化し、polA遺伝子を含む断片
とオリゴカセット LEAD4に置き換えることにより作製し
た。また、図８及び図１０に示す通り、第１シストロン
と第２シストロンの重なりが１塩基となるように遺伝子
を導入する発現ベクター ｐＬＥＡＤ５は、プラスミドp
PO536を BbrPIとHindIIIで消化し、polA遺伝子を含む断
片とオリゴカセット LEAD5と置き換えることにより作製
した。尚、オリゴカセットLEAD4及びLEAD5は表２に示し
た。又、表２に示した合成オリゴヌクレオチドの配列
は、後述する配列表の配列番号１９〜配列番号２２とし
て記載した。

【００８２】

【表２】

【００８３】［実施例４］発現ベクターｐＬＥＡＤ４お
よびｐＬＥＡＤ５の使用方法発現ベクターｐＬＥＡＤ４
及びｐＬＥＡＤ５の詳細な構造は図７、図８、図９及び
図１０に示した。ｐＬＥＡＤ４は、第１シストロンと第
２シストロンの重なりが４塩基対になるように設計して
あり、発現できる蛋白質の第２コドンの最初の塩基が
「Ａ」である蛋白質もしくは第２コドンの最初の塩基
が、「Ｃ、ＧあるいはＴ」の場合、「Ａ」に変化させ
て、結果的にアミノ酸が変化してもその活性に変化がな
い蛋白質を発現させる場合に使用する。ｐＬＥＡＤ５
は、発現蛋白質のアミノ酸の変化が許容できないときに
使用する。

【００８４】各プラスミドの構造上の特徴は以下の通り
である。 １）プロモーターとしては、 tacを用いており、強い転
写活性を持つ。従って、 lacリプレッサーを持つ大腸菌
宿主を使用する。これにより、IPTG添加により、プロモ
ーターを稼動させることが出来る。 ２）導入する遺伝子は、ＰＣＲにより簡単に準備するこ
とが出来る。遺伝子の5'末端側のクローニング部位とし
て、ｐＬＥＡＤ４はEco105I、ｐＬＥＡＤ５はBbrPIを使
用する。 ３）導入する遺伝子の3'-末端側は、SacI, KpnI, StuI,
BamHI及びHindIIIを利用する。 ４）プライマーの設計 発現させたい遺伝子（異種蛋白質をコードする外来遺伝
子）のＮ−末端側のプライマーは、その 3'-末端側にコ
ーディング領域である ATGから下流の領域にアニーリン
グするように設計する。ｐＬＥＡＤ４の場合は、第２コ
ドンの最初の塩基を「Ａ」とするため、アミノ酸の変化
が伴う場合があるので注意する。このコドンの最初の塩
基を「Ａ」に規定すると、アミノ酸は、Ile, Met, Thr,
Asn,Lys, Arg, 及びSer の何れかを選択することがで
きる。また、開始コドン ATGの直前に制限酵素Eco105I
の認識配列を付加し、その先のプライマーの5'-末端
は、プライマーの二次構造を避け、且つＰＣＲ後に制限
酵素で切断することを考慮して、数塩基対付加してお
く。C-末端側プライマーは、コーディング領域の終止コ
ドン上流とアニーリングする配列とし、プライマーの
5'-末端は、クローニングを容易にするため、制限酵素
の認識配列を付加して設計する。

【００８５】実際の実験の流れは以下の通りである。 １）発現させたい遺伝子（異種蛋白質をコードする外来
遺伝子）を、ｐＬＥＡＤ４あるいはｐＬＥＡＤ５にクロ
ーニングする為のＰＣＲプライマーを設計する。 ２）ＰＣＲを行う。 ３）プライマーの構造、使用する発現ベクターに応じた
制限酵素を用いてＰＣＲ産物を消化する。 ４）必要に応じてＤＮＡを精製する。 ５）ｐＬＥＡＤ４あるいはｐＬＥＡＤ５にクローニング
する。 ６）必要に応じてプラスミドＤＮＡを抽出して、構造を
確認する。 ７）大腸菌を培養し、IPTGを添加し、蛋白質を誘導す
る。その後、大腸菌細胞中から発現した蛋白質を適宜、
精製して解析、使用する。

【００８６】

【発明の効果】本発明は以上説明した通り、発現させた
い目的遺伝子（第２シストロン）の上流にリーダー配列
（第１シストロン）を配し、尚且つ、第１シストロンの
終止コドンと第２シストロンの開始コドンを重なるよう
に配置した発現プラスミドを得た上で、外来遺伝子から
翻訳される異種蛋白質を効率よく発現、生産する、異種
蛋白質の高発現法と高発現ベクターを得ることができる
という効果がある。

【００８７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> NIPPON GENE CO.,LTD. <120> 異種蛋白質の高発現法及び高発現ベクター <130> PJ23683 <160> 22

【００８８】 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 aagaattccc atggtttcga acccaaaggc cgggtcc 37

【００８９】 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 gccaagacgg cgaggtcct t 21

【００９０】 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 aattctacta ggaggttatg aggaggttat tatggaggcg atgcttccgc tctt 54

【００９１】 <210> 4 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 cgaagagcgg aagcatcgcc tccataataa cctcctcata acctcctagt ag 52

【００９２】 <210> 5 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 aattctactt taaggaggtg attatggagg cgatgcttcc gctctt 46

【００９３】 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 cgaagagcgg aagcatcgcc tccataatca cctccttaaa gtag 44

【００９４】 <210> 7 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 aattctacta ggaggttatg atggaggcga tgcttccgct ctt 43

【００９５】 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 cgaagagcgg aagcatcgcc tccatcataa cctcctagta g 41

【００９６】 <210> 9 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 aattctacta ggaggttatg aggaggttat tatgaccgcg atgcttccgc tctt 54

【００９７】 <210> 10 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 cgaagagcgg aagcatcgcg gtcataataa cctcctcata acctcctagt ag 52

【００９８】 <210> 11 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 aattctactt taaggaggtt atgattatga ccgcgatgct tccgctctt 49

【００９９】 <210> 12 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 cgaagagcgg aagcatcgcg gtcataatca cctccttaaa gtag 44

【０１００】 <210> 13 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 aattctacta ggaggttatg atgaccgcga tgcttccgct ctt 43

【０１０１】 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 cgaagagcgg aagcatcgcg gtcatcataa cctcctagta g 41

【０１０２】 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 aattctagga ggactttatg tccgcgatgc ttccgctctt 40

【０１０３】 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 cgaagagcgg aagcgtcgcg gtcataaagt cctcctag 38

【０１０４】 <210> 17 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 aagaattcag gaggattatc atatgaccat gattactgat atcaggagg atcacgtgat 60 ggaggcgatg cttccgc 77

【０１０５】 <210> 18 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 aagaattcag gaggattgtc atatgaccat gattgatatc aggaggatt tacgtatgac 60 cgcgatgctt ccgctctttg a 81

【０１０６】 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 gtatgcattg agctcggtac ctaggcctgg atcca 35

【０１０７】 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 agcttggatc caggcctagg taccgagctc aatgcatac 39

【０１０８】 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 21 gtgatgcatg agctcggtac ctaggcctgg atcca 35

【０１０９】 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 22 agcttggatc caggcctagg taccgagctc atgcatcac 39

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＴＴＰ−ＵＣの構築を説明した工
程図である。

【図２】シストロンの重なりと蛋白質発現の関係を調べ
る発現プラスミドの説明図である。

【図３】LacUV5プロモーターを用いた第１シストロンと
第２シストロンの位置関係の説明と発現効率である。

【図４】Tacプロモーターを用いた第１シストロンと第
２シストロンの位置関係の説明と発現効率である。

【図５】発現ベクターｐＬＥＡＤ４の構築を説明した工
程図である。

【図６】発現ベクターｐＬＥＡＤ５の構築を説明した工
程図である。

【図７】発現ベクターｐＬＥＡＤ４の特徴を示した説明
図である。

【図８】発現ベクターｐＬＥＡＤ５の特徴を示した説明
図である。

【図９】発現ベクターｐＬＥＡＤ４の要部の説明図であ
る。

【図１０】発現ベクターｐＬＥＡＤ５の要部の説明図で
ある。

【図１１】大腸菌細胞中で蛋白質の発現に必要な一般的
な遺伝子上の説明図である。

【図１２】two-cistronシステムを示した説明図であ
る。

【図１３】ATGコドンの重なっている状態を説明する説
明図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【書類名】 受託番号変更届

【提出日】 平成１３年０５月１１日

【旧寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術
研究所

【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１７８４０

【新寄託機関の名称】 独立行政法人産業技術総合研
究所 特許生命寄託セン ター

【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−７５７６

【書類名】 受託番号変更届

【旧寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術
研究所

【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１７８４１

【新寄託機関の名称】 独立行政法人産業技術総合研
究所 特許生命寄託セン ター

【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−７５７７

【提出物件の目録】

【物件名】 受託証（写し） １

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA10 BA80 CA02 CA20 DA06 EA04 FA03 FA04 FA05 FA10 HA01 HA14 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 CE02 DA20 4B065 AA01Y AA26X AB01 AC14 BA02 CA24 CA29 CA60

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 異種蛋白質をコードする外来遺伝子を発
   現ベクター内に導入し、この発現ベクターを宿主微生物
   内に導入して該宿主微生物を培養することにより異種蛋
   白質を発現させる方法において、 異種蛋白質をコードする外来遺伝子を発現ベクター内に
   導入した際に、外来遺伝子の転写を開始するためのプロ
   モーター領域と、前記外来遺伝子の開始コドンとの間
   に、予め定められた蛋白質の転写・発現に必要な遺伝子
   単位としての第１シストロンを配し、尚且つ、該第１シ
   ストロンの終止コドンの一部の塩基配列と異種蛋白質を
   コードする外来遺伝子の開始コドンの一部の塩基配列と
   が重複するように配して発現ベクターとすることを特徴
   とする異種蛋白質の高発現法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載された異種蛋白質の発現
   法において、 前記第１シストロンの終止コドンの一部の塩基配列と異
   種蛋白質をコードする外来遺伝子の開始コドンの一部の
   塩基配列との重複する塩基配列を含む構造を、「ＡＴＧ
   Ａ」又は「ＴＧＡＴＧ」とすることを特徴とする異種蛋
   白質の高発現法。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載された異種蛋白質
   の高発現法において、 前記プロモーター領域として、以下に示す何れかのプロ
   モータ領域を備えていることを特徴とする異種蛋白質の
   高発現法。 ・テトラサイクリン耐性遺伝子プロモーター（Ptet） ・ラクトース資化性オペロンプロモーター（Plac) ・ラクトース資化性オペロンプロモーター誘導体（Plac
   UV5, Ptac, Ptrc) ・トリプトファン生合成系オペロンプロモーター(Ptrp) ・ファージT7ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター(P
   T7) ・ファージT3ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター
   （PT3） ・ファージSP6ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター
   (PSP6) ・低温感受性プロモーター(PcspA) ・ファージλPLプロモーター(PλPL) ・アルカリフォスファターゼ遺伝子プロモーター(Ppho
   A) ・アラビノースプロモーター（ParaBAD)
4. 【請求項４】 請求項１〜３の何れかに記載された異種
   蛋白質の高発現法において、 前記異種蛋白質をコードする外来遺伝子として、遺伝子
   中に「ＡＴ」塩基対よりも「ＧＣ」塩基対が圧倒的に多
   く存在するＧＣ-rich の遺伝子を用いることを特徴とす
   る異種蛋白質の高発現法。
5. 【請求項５】 外来遺伝子の転写を開始するためのプロ
   モーター領域と、該プロモータ領域の下流に配された、
   予め定められた蛋白質の転写・発現に必要な遺伝子単位
   としての第１シストロンと、 該第１シストロンの終止コドンの一部の塩基配列と異種
   蛋白質をコードする外来遺伝子の開始コドンの一部の塩
   基配列とが重複するように配された、異種蛋白質の転写
   ・発現に必要な遺伝子単位をコードする第２シストロン
   と、 宿主細胞での複製開始点を含むオリジン(ori) 領域とを
   備えた発現ベクターであって、 異種蛋白質をコードする外来遺伝子を導入するための制
   限酵素認識部位を第１シストロンの終止コドンの一部又
   は第２シストロンの開始コドンの下流の領域に備えたこ
   とを特徴とする異種蛋白質の高発現ベクター。
6. 【請求項６】 請求項５に記載された異種蛋白質の高発
   現ベクターにおいて、 前記第１シストロンの終止コドンの一部の塩基配列と異
   種蛋白質をコードする外来遺伝子の開始コドンの一部の
   塩基配列との重複する塩基配列を含む構造が、「ＡＴＧ
   Ａ」又は「ＴＧＡＴＧ」であることを特徴とする異種蛋
   白質の高発現ベクター。
7. 【請求項７】 請求項５又は６に記載された異種蛋白質
   の高発現ベクターにおいて、 前記プロモーター領域として、ｔａｃプロモータ領域を
   備え、 前記第１シストロンの終止コドンの一部の塩基配列と異
   種蛋白質をコードする外来遺伝子の開始コドンの一部の
   塩基配列との重複する塩基配列を含む構造が、「ＡＴＧ
   Ａ」であることを特徴とする異種蛋白質の高発現ベクタ
   ーｐＬＥＡＤ４。
8. 【請求項８】 請求項５又は６に記載された異種蛋白質
   の高発現ベクターにおいて、 前記プロモーター領域として、ｔａｃプロモータ領域を
   備え、 前記第１シストロンの終止コドンの一部の塩基配列と異
   種蛋白質をコードする外来遺伝子の開始コドンの一部の
   塩基配列との重複する塩基配列を含む構造が、「ＴＧＡ
   ＴＧ」であることを特徴とする異種蛋白質の高発現ベク
   ターｐＬＥＡＤ５。
9. 【請求項９】 請求項５〜８の何れかに記載された異種
   蛋白質の高発現ベクターを宿主微生物中に保持させて形
   質転換した形質転換微生物。
10. 【請求項１０】 請求項９の形質転換微生物において、 前記微生物が大腸菌であって、 前記オリジン（ori） 領域が、以下に示された何れかの
    オリジン領域を含むことを特徴とする形質転換大腸菌。 ・ｐMB１由来の複製オリジン ・p15A由来の複製オリジン ・pSC101由来の複製オリジン ・λファージ由来の複製オリジン