JP2001269172A - 新規なｃＤＮＡサブトラクション法 - Google Patents
新規なｃＤＮＡサブトラクション法Info
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ある生物組織（テスタ）と別の生物組織
（ドライバ）由来のｍＲＮＡを含むＲＮＡにおいて、テ
スタに特異的に存在する遺伝子の部分塩基配列を含む核
酸を単離及び増幅する方法であって、テスタ及びドライ
バの一方に由来するＲＮＡに相同的な一本鎖核酸と、他
方に由来するＲＮＡに相補的な一本鎖核酸との間でのハ
イブリダイゼーションを行うことを特徴とする前記方法
を提供する。 【効果】 本発明により、広範の機能又は形質を示す細
胞組織に特異的に発現する遺伝子や病原体のＲＮＡ由来
の部分配列を有する核酸を単離・増幅することが可能と
なり、さらに、これらをクローニングすることが可能と
なる。
（ドライバ）由来のｍＲＮＡを含むＲＮＡにおいて、テ
スタに特異的に存在する遺伝子の部分塩基配列を含む核
酸を単離及び増幅する方法であって、テスタ及びドライ
バの一方に由来するＲＮＡに相同的な一本鎖核酸と、他
方に由来するＲＮＡに相補的な一本鎖核酸との間でのハ
イブリダイゼーションを行うことを特徴とする前記方法
を提供する。 【効果】 本発明により、広範の機能又は形質を示す細
胞組織に特異的に発現する遺伝子や病原体のＲＮＡ由来
の部分配列を有する核酸を単離・増幅することが可能と
なり、さらに、これらをクローニングすることが可能と
なる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は任意の組織に特異に
存在するＲＮＡの部分配列の単離及び増幅に関する。詳
しくは、任意の生物機能・形質の異なる細胞及び組織間
において、その機能若しくは形質を示す細胞若しくは組
織に特異に存在するＲＮＡ断片の単離及び増幅に関す
る。
存在するＲＮＡの部分配列の単離及び増幅に関する。詳
しくは、任意の生物機能・形質の異なる細胞及び組織間
において、その機能若しくは形質を示す細胞若しくは組
織に特異に存在するＲＮＡ断片の単離及び増幅に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】組織特異的に発現する遺伝子を濃縮して
クローニングする方法として、ｃＤＮＡサブトラクショ
ン法が知られる。多細胞生物は、同一の遺伝情報を持ち
ながら、その発現様式の違いにより、別の機能・形質を
示す細胞へと分化していると考えられている。組織特異
的に発現する遺伝子を単離することは、その機能若しく
は形質発現の機構解明のために重要な第一歩となるばか
りでなく、それらの遺伝子は、その機能・形質を司る重
要な作用を持つ有用な機能タンパク質である可能性があ
り、さまざまな産業上の利用が期待できる。
クローニングする方法として、ｃＤＮＡサブトラクショ
ン法が知られる。多細胞生物は、同一の遺伝情報を持ち
ながら、その発現様式の違いにより、別の機能・形質を
示す細胞へと分化していると考えられている。組織特異
的に発現する遺伝子を単離することは、その機能若しく
は形質発現の機構解明のために重要な第一歩となるばか
りでなく、それらの遺伝子は、その機能・形質を司る重
要な作用を持つ有用な機能タンパク質である可能性があ
り、さまざまな産業上の利用が期待できる。
【０００３】ｃＤＮＡサブトラクション法は、機能・形
質の異なる細胞組織間で発現量の違う遺伝子の部分的な
ｃＤＮＡを濃縮してクローニングする方法であり、該方
法では、まず、ある機能・形質を示す組織（以下「テス
タ(tester)」という。）と、それらを示さない若しくは
それらとは違う組織（以下「ドライバ(driver)」とい
う。）からｍＲＮＡを抽出して、２本鎖ｃＤＮＡの合成
を行う。次いで、テスタ及びドライバ由来のｃＤＮＡを
それぞれ別々の（異なった切断面を生じる）制限酵素で
切断し、両ｃＤＮＡを熱変性等で1本鎖に解離させた後
に、テスタ由来のｃＤＮＡに過剰量のドライバ由来のｃ
ＤＮＡを加えて２本鎖を再形成させる（サブトラクティ
ブハイブリダイゼーション）。このとき、テスタ由来の
ｃＤＮＡ群において、ドライバのそれと共通の配列を有
する、すなわち、テスタとドライバの両組織で発現して
いる遺伝子由来のｃＤＮＡは、過剰量加えたドライバ由
来のｃＤＮＡとハイブリッドを形成するが、テスタでの
み発現している遺伝子由来のｃＤＮＡは、もとの２本鎖
を形成する。その後、テスタ由来のｃＤＮＡと同じ制限
酵素で切断したプラスミドベクターにライゲーションす
ることにより、テスタ由来のｃＤＮＡにおいて、元と同
じ２本鎖を形成したｃＤＮＡだけがクローニングされ
る。
質の異なる細胞組織間で発現量の違う遺伝子の部分的な
ｃＤＮＡを濃縮してクローニングする方法であり、該方
法では、まず、ある機能・形質を示す組織（以下「テス
タ(tester)」という。）と、それらを示さない若しくは
それらとは違う組織（以下「ドライバ(driver)」とい
う。）からｍＲＮＡを抽出して、２本鎖ｃＤＮＡの合成
を行う。次いで、テスタ及びドライバ由来のｃＤＮＡを
それぞれ別々の（異なった切断面を生じる）制限酵素で
切断し、両ｃＤＮＡを熱変性等で1本鎖に解離させた後
に、テスタ由来のｃＤＮＡに過剰量のドライバ由来のｃ
ＤＮＡを加えて２本鎖を再形成させる（サブトラクティ
ブハイブリダイゼーション）。このとき、テスタ由来の
ｃＤＮＡ群において、ドライバのそれと共通の配列を有
する、すなわち、テスタとドライバの両組織で発現して
いる遺伝子由来のｃＤＮＡは、過剰量加えたドライバ由
来のｃＤＮＡとハイブリッドを形成するが、テスタでの
み発現している遺伝子由来のｃＤＮＡは、もとの２本鎖
を形成する。その後、テスタ由来のｃＤＮＡと同じ制限
酵素で切断したプラスミドベクターにライゲーションす
ることにより、テスタ由来のｃＤＮＡにおいて、元と同
じ２本鎖を形成したｃＤＮＡだけがクローニングされ
る。
【０００４】しかし、上記の方法では、テスタとドライ
バの双方において発現する遺伝子由来のｃＤＮＡであっ
ても、その一部はもとの２本鎖を形成し、その結果、両
組織で発現している遺伝子、すなわち、その機能・形質
の発現にはあまり関わりのない遺伝子（以下、「非特異
遺伝子」という。）のｃＤＮＡもクローニングされるこ
とになる。従って、上記の方法では、テスタで特異的に
発現する遺伝子（以下「特異遺伝子」という。）のｃＤ
ＮＡを濃縮することはできるが、単離してクローニング
することはできない。
バの双方において発現する遺伝子由来のｃＤＮＡであっ
ても、その一部はもとの２本鎖を形成し、その結果、両
組織で発現している遺伝子、すなわち、その機能・形質
の発現にはあまり関わりのない遺伝子（以下、「非特異
遺伝子」という。）のｃＤＮＡもクローニングされるこ
とになる。従って、上記の方法では、テスタで特異的に
発現する遺伝子（以下「特異遺伝子」という。）のｃＤ
ＮＡを濃縮することはできるが、単離してクローニング
することはできない。
【０００５】このような非特異遺伝子のｃＤＮＡのクロ
ーニングを回避するために、ドライバ由来のｃＤＮＡを
より過剰に加えることが考えられるが、その場合、特異
遺伝子がもとの2本鎖を形成する可能性を低くすること
となり、特に、少量しか発現していない特異遺伝子の単
離が困難となる。
ーニングを回避するために、ドライバ由来のｃＤＮＡを
より過剰に加えることが考えられるが、その場合、特異
遺伝子がもとの2本鎖を形成する可能性を低くすること
となり、特に、少量しか発現していない特異遺伝子の単
離が困難となる。
【０００６】ところで、特定のＤＮＡ断片を指数関数的
に増幅する方法としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
法がある。このＰＣＲを工程に加えたリプレゼンテーシ
ョナル・ディフェレンス・アナリシス（RDA）法（Lisit
syn, N., Lisitsyn, N. andWigler, M., Science 259
(1993) p.946）が報告され、さらに、その改良法（Gurs
kaya, N.G., Diatchenko, L., Chenchik, A., Siebert,
P.D., Khaspekov, G.L., Lukyanov, K.A., Vagner, L.
L., Ermolaeva, O.D., Lukyanov, S.A. and Sverdlov,
E.D., Analytical Biochemistry 240 (1996) p.90）が
報告された。これは、上記のサブトラクティブハイブリ
ダイゼーションを行い、テスタ由来で元の２本鎖を形成
した分子だけがＰＣＲにより指数関数的に増幅されるこ
とを特徴とする方法で、その利点としては、最初の過程
でｃＤＮＡの合成に用いるｍＲＮＡの量が少なくてすむ
こと、特異遺伝子を増幅して単離することから、少量し
か発現していない特異遺伝子をクローニングできる可能
性が従来法に比べて高まったことが挙げられる。
に増幅する方法としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
法がある。このＰＣＲを工程に加えたリプレゼンテーシ
ョナル・ディフェレンス・アナリシス（RDA）法（Lisit
syn, N., Lisitsyn, N. andWigler, M., Science 259
(1993) p.946）が報告され、さらに、その改良法（Gurs
kaya, N.G., Diatchenko, L., Chenchik, A., Siebert,
P.D., Khaspekov, G.L., Lukyanov, K.A., Vagner, L.
L., Ermolaeva, O.D., Lukyanov, S.A. and Sverdlov,
E.D., Analytical Biochemistry 240 (1996) p.90）が
報告された。これは、上記のサブトラクティブハイブリ
ダイゼーションを行い、テスタ由来で元の２本鎖を形成
した分子だけがＰＣＲにより指数関数的に増幅されるこ
とを特徴とする方法で、その利点としては、最初の過程
でｃＤＮＡの合成に用いるｍＲＮＡの量が少なくてすむ
こと、特異遺伝子を増幅して単離することから、少量し
か発現していない特異遺伝子をクローニングできる可能
性が従来法に比べて高まったことが挙げられる。
【０００７】しかし、サブトラクティブハイブリダイゼ
ーションを２本鎖ＤＮＡで行うために非特異遺伝子の増
幅を回避できず、従って、特異遺伝子と非特異遺伝子を
完全に分離できないという欠点は、従来法と変わらな
い。一方、特定のＲＮＡ断片を指数関数的に増幅する方
法として、Nucleic Acid Sequence-Based Amplificatio
n（NASBA）法が考案された（Davey and Malek, 1989,
欧州特許第0329822号公報）。ＮＡＳＢＡ法は、ＰＣＲ
法と比較して、いくつかの点で違う特徴がある。その特
徴の１つに、ＰＣＲがＤＮＡを鋳型にして２本鎖ＤＮＡ
を増幅するのに対し、ＮＡＳＢＡは、基本的に１本鎖Ｒ
ＮＡを鋳型にそれに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅できる
という点がある。
ーションを２本鎖ＤＮＡで行うために非特異遺伝子の増
幅を回避できず、従って、特異遺伝子と非特異遺伝子を
完全に分離できないという欠点は、従来法と変わらな
い。一方、特定のＲＮＡ断片を指数関数的に増幅する方
法として、Nucleic Acid Sequence-Based Amplificatio
n（NASBA）法が考案された（Davey and Malek, 1989,
欧州特許第0329822号公報）。ＮＡＳＢＡ法は、ＰＣＲ
法と比較して、いくつかの点で違う特徴がある。その特
徴の１つに、ＰＣＲがＤＮＡを鋳型にして２本鎖ＤＮＡ
を増幅するのに対し、ＮＡＳＢＡは、基本的に１本鎖Ｒ
ＮＡを鋳型にそれに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅できる
という点がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ある機能・
形質を示す細胞組織に特異的に発現する遺伝子が低発現
量のものであってもよく、かつ、非特異的なものと完全
に分離することのできる、前記特異的遺伝子の塩基配列
を含む核酸の効果的な単離及び増幅方法を提供すること
を目的とする。
形質を示す細胞組織に特異的に発現する遺伝子が低発現
量のものであってもよく、かつ、非特異的なものと完全
に分離することのできる、前記特異的遺伝子の塩基配列
を含む核酸の効果的な単離及び増幅方法を提供すること
を目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、テスタ及びド
ライバ組織から抽出した少量のＲＮＡから、部分的な一
本鎖の相補ＲＮＡ（テスタ由来）と相同ＲＮＡ（ドライ
バ由来）をＮＡＳＢＡ法により増幅し、テスタの相補Ｒ
ＮＡと過剰量のドライバの相同ＲＮＡ間でハイブリダイ
ゼーションを行うことにより、ドライバの相同ＲＮＡに
相補性をもつテスタの相補ＲＮＡを全て２本鎖のハイブ
リッドとし、その後にドライバの相同ＲＮＡを取り除く
ことにより、テスタに特異的に存在するＲＮＡの相補Ｒ
ＮＡを単離できることを見出し、本発明に至った。
を解決するために鋭意研究を行った結果、テスタ及びド
ライバ組織から抽出した少量のＲＮＡから、部分的な一
本鎖の相補ＲＮＡ（テスタ由来）と相同ＲＮＡ（ドライ
バ由来）をＮＡＳＢＡ法により増幅し、テスタの相補Ｒ
ＮＡと過剰量のドライバの相同ＲＮＡ間でハイブリダイ
ゼーションを行うことにより、ドライバの相同ＲＮＡに
相補性をもつテスタの相補ＲＮＡを全て２本鎖のハイブ
リッドとし、その後にドライバの相同ＲＮＡを取り除く
ことにより、テスタに特異的に存在するＲＮＡの相補Ｒ
ＮＡを単離できることを見出し、本発明に至った。
【００１０】すなわち、本発明は、ある生物組織（テス
タ）と別の生物組織（ドライバ）由来のｍＲＮＡを含む
ＲＮＡにおいて、テスタに特異的に存在する遺伝子の部
分塩基配列を含む核酸を単離及び増幅する方法であっ
て、テスタ及びドライバの一方に由来するＲＮＡに相同
的な一本鎖核酸と、他方に由来するＲＮＡに相補的な一
本鎖核酸との間でのハイブリダイゼーションを行うこと
を特徴とする前記方法を提供する。
タ）と別の生物組織（ドライバ）由来のｍＲＮＡを含む
ＲＮＡにおいて、テスタに特異的に存在する遺伝子の部
分塩基配列を含む核酸を単離及び増幅する方法であっ
て、テスタ及びドライバの一方に由来するＲＮＡに相同
的な一本鎖核酸と、他方に由来するＲＮＡに相補的な一
本鎖核酸との間でのハイブリダイゼーションを行うこと
を特徴とする前記方法を提供する。
【００１１】上記方法は、好ましくは、以下の工程： （Ａ）テスタ及びドライバから抽出したＲＮＡを鋳型と
して、テスタの抽出ＲＮＡに相補若しくは相同な任意の
部分塩基配列を含む１本鎖核酸、及びドライバの抽出Ｒ
ＮＡに相同若しくは相補な任意の部分塩基配列を含む１
本鎖核酸を増幅する工程；
して、テスタの抽出ＲＮＡに相補若しくは相同な任意の
部分塩基配列を含む１本鎖核酸、及びドライバの抽出Ｒ
ＮＡに相同若しくは相補な任意の部分塩基配列を含む１
本鎖核酸を増幅する工程；
【００１２】（Ｂ）テスタ由来の１本鎖核酸と過剰量の
ドライバ由来の１本鎖核酸との間でハイブリダイゼーシ
ョンを行って、２本鎖を形成した核酸を除去する工程；
及び（Ｃ）前記（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼー
ションされなかった１本鎖核酸に相同又は相補な１本鎖
核酸を増幅する工程；を含む。ここで、前記１本鎖核酸
は、好ましくは１本鎖ＲＮＡである。
ドライバ由来の１本鎖核酸との間でハイブリダイゼーシ
ョンを行って、２本鎖を形成した核酸を除去する工程；
及び（Ｃ）前記（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼー
ションされなかった１本鎖核酸に相同又は相補な１本鎖
核酸を増幅する工程；を含む。ここで、前記１本鎖核酸
は、好ましくは１本鎖ＲＮＡである。
【００１３】前記（Ａ）及び（Ｃ）の工程は、好ましく
は、任意の複数の塩基配列からなる混合プライマーのペ
アを用いるＮＡＳＢＡによって１本鎖ＲＮＡを増幅する
ことを含む。前記（Ａ）の工程は、好ましくは、以下の
工程： （ａ）テスタ由来の抽出ＲＮＡ及びドライバ由来の抽出
ＲＮＡをそれぞれ鋳型として、（i）任意の複数の塩基
配列からなる第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'
末端に付加されたＴ７プロモータからなるプライマー、
並びに（ii）任意の複数の塩基配列からなる第２の混合
オリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いてＮＡＳ
ＢＡを行うことにより、それぞれの抽出ＲＮＡに相補的
な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程；
は、任意の複数の塩基配列からなる混合プライマーのペ
アを用いるＮＡＳＢＡによって１本鎖ＲＮＡを増幅する
ことを含む。前記（Ａ）の工程は、好ましくは、以下の
工程： （ａ）テスタ由来の抽出ＲＮＡ及びドライバ由来の抽出
ＲＮＡをそれぞれ鋳型として、（i）任意の複数の塩基
配列からなる第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'
末端に付加されたＴ７プロモータからなるプライマー、
並びに（ii）任意の複数の塩基配列からなる第２の混合
オリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いてＮＡＳ
ＢＡを行うことにより、それぞれの抽出ＲＮＡに相補的
な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程；
【００１４】（ｂ）上記工程（ａ）で得られるテスタ由
来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第１
の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加された
Ｔ７プロモータからなるプライマー、並びに（ii）前記
第２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加さ
れた任意の１種の塩基配列からなる第３のオリゴヌクレ
オチドからなるプライマーを用いてＮＡＳＢＡを行うこ
とにより、前記相補的１本鎖ＲＮＡに相同的な１本鎖Ｒ
ＮＡを増幅する工程；
来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第１
の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加された
Ｔ７プロモータからなるプライマー、並びに（ii）前記
第２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加さ
れた任意の１種の塩基配列からなる第３のオリゴヌクレ
オチドからなるプライマーを用いてＮＡＳＢＡを行うこ
とにより、前記相補的１本鎖ＲＮＡに相同的な１本鎖Ｒ
ＮＡを増幅する工程；
【００１５】（ｃ）上記工程（ａ）で得られるドライバ
由来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第
１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加され
たオリゴｄＴからなるプライマー、並びに（ii）前記第
２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加され
たＴ７プロモータからなるプライマーを用いてＮＡＳＢ
Ａを行うことにより、前記相補的１本鎖ＲＮＡに相補的
な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程；を含む。
由来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第
１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加され
たオリゴｄＴからなるプライマー、並びに（ii）前記第
２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加され
たＴ７プロモータからなるプライマーを用いてＮＡＳＢ
Ａを行うことにより、前記相補的１本鎖ＲＮＡに相補的
な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程；を含む。
【００１６】この場合において、前記（Ｃ）の工程は、
好ましくは、前記（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼ
ーションされなかった１本鎖ＲＮＡを鋳型として、
（i）前記第３のオリゴヌクレオチド及びその5'末端に
付加されたＴ７プロモータからなるプライマー、並びに
（ii）前記第１の混合オリゴヌクレオチドからなるプラ
イマーを用いてＮＡＳＢＡを行うことにより、前記１本
鎖ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程を含
む。あるいは、前記（Ｃ）の工程は、好ましくは、前記
（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼーションされなか
った１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第３のオリ
ゴヌクレオチドからなるプライマー、並びに（ii）前記
第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加さ
れたＴ７プロモータからなるプライマーを用いてＮＡＳ
ＢＡを行うことにより、前記１本鎖ＲＮＡに相同的な１
本鎖ＲＮＡを増幅する工程を含む。
好ましくは、前記（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼ
ーションされなかった１本鎖ＲＮＡを鋳型として、
（i）前記第３のオリゴヌクレオチド及びその5'末端に
付加されたＴ７プロモータからなるプライマー、並びに
（ii）前記第１の混合オリゴヌクレオチドからなるプラ
イマーを用いてＮＡＳＢＡを行うことにより、前記１本
鎖ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程を含
む。あるいは、前記（Ｃ）の工程は、好ましくは、前記
（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼーションされなか
った１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第３のオリ
ゴヌクレオチドからなるプライマー、並びに（ii）前記
第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加さ
れたＴ７プロモータからなるプライマーを用いてＮＡＳ
ＢＡを行うことにより、前記１本鎖ＲＮＡに相同的な１
本鎖ＲＮＡを増幅する工程を含む。
【００１７】この場合において、前記第１の混合オリゴ
ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２の
混合オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、
前記第３のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番
号７で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドで
ある。
ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２の
混合オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、
前記第３のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番
号７で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドで
ある。
【００１８】あるいは、前記（Ａ）の工程は、好ましく
は、以下の工程： （ａ）テスタ由来の抽出ＲＮＡ及びドライバ由来の抽出
ＲＮＡをそれぞれ鋳型として、（i）任意の複数の塩基
配列からなる第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'
末端に付加されたＴ７プロモータからなるプライマー、
並びに（ii）任意の複数の塩基配列からなる第２の混合
オリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いてＮＡＳ
ＢＡを行うことにより、それぞれの抽出ＲＮＡに相補的
な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程；
は、以下の工程： （ａ）テスタ由来の抽出ＲＮＡ及びドライバ由来の抽出
ＲＮＡをそれぞれ鋳型として、（i）任意の複数の塩基
配列からなる第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'
末端に付加されたＴ７プロモータからなるプライマー、
並びに（ii）任意の複数の塩基配列からなる第２の混合
オリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いてＮＡＳ
ＢＡを行うことにより、それぞれの抽出ＲＮＡに相補的
な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程；
【００１９】（ｂ）上記工程（ａ）で得られるテスタ由
来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第１
の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加された
任意の１種の塩基配列からなる第４のオリゴヌクレオチ
ドからなるプライマー、並びに（ii）前記第２の混合オ
リゴヌクレオチド及びその5'末端に付加されたＴ７プロ
モータからなるプライマーを用いてＮＡＳＢＡを行うこ
とにより、前記相補的１本鎖ＲＮＡに相補的な１本鎖Ｒ
ＮＡを増幅する工程；
来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第１
の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加された
任意の１種の塩基配列からなる第４のオリゴヌクレオチ
ドからなるプライマー、並びに（ii）前記第２の混合オ
リゴヌクレオチド及びその5'末端に付加されたＴ７プロ
モータからなるプライマーを用いてＮＡＳＢＡを行うこ
とにより、前記相補的１本鎖ＲＮＡに相補的な１本鎖Ｒ
ＮＡを増幅する工程；
【００２０】（ｃ）上記工程（ａ）で得られるドライバ
由来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第
１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加され
たＴ７プロモータからなるプライマー、並びに（ii）前
記第２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加
されたオリゴｄＴからなるプライマーを用いてＮＡＳＢ
Ａを行うことにより、前記相補的１本鎖ＲＮＡに相同的
な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程；を含む。
由来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第
１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加され
たＴ７プロモータからなるプライマー、並びに（ii）前
記第２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加
されたオリゴｄＴからなるプライマーを用いてＮＡＳＢ
Ａを行うことにより、前記相補的１本鎖ＲＮＡに相同的
な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程；を含む。
【００２１】この場合において、前記（Ｃ）の工程は、
好ましくは、前記（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼ
ーションされなかった１本鎖ＲＮＡを鋳型として、
（i）前記第４のオリゴヌクレオチド及びその5'末端に
付加されたＴ７プロモータからなるプライマー、並びに
（ii）前記第２の混合オリゴヌクレオチドからなるプラ
イマーを用いてＮＡＳＢＡを行うことにより、前記１本
鎖ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程を含
む。あるいは、前記（Ｃ）の工程は、好ましくは、前記
（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼーションされなか
った１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第４のオリ
ゴヌクレオチドからなるプライマー、並びに（ii）前記
第２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加さ
れたＴ７プロモータからなるプライマーを用いてＮＡＳ
ＢＡを行うことにより、前記１本鎖ＲＮＡに相同的な１
本鎖ＲＮＡを増幅する工程を含む。
好ましくは、前記（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼ
ーションされなかった１本鎖ＲＮＡを鋳型として、
（i）前記第４のオリゴヌクレオチド及びその5'末端に
付加されたＴ７プロモータからなるプライマー、並びに
（ii）前記第２の混合オリゴヌクレオチドからなるプラ
イマーを用いてＮＡＳＢＡを行うことにより、前記１本
鎖ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程を含
む。あるいは、前記（Ｃ）の工程は、好ましくは、前記
（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼーションされなか
った１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第４のオリ
ゴヌクレオチドからなるプライマー、並びに（ii）前記
第２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加さ
れたＴ７プロモータからなるプライマーを用いてＮＡＳ
ＢＡを行うことにより、前記１本鎖ＲＮＡに相同的な１
本鎖ＲＮＡを増幅する工程を含む。
【００２２】この場合において、前記第１の混合オリゴ
ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２の
混合オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、
前記第４のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番
号７で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチドである。
ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２の
混合オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、
前記第４のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番
号７で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチドである。
【００２３】本発明の上記方法は、好ましくは、以下の
工程： （Ｄ）前記（Ｃ）の工程で増幅される１本鎖核酸を鋳型
として、２本鎖ＤＮＡを増幅する工程；をさらに含む。
さらに、本発明は、ある生物組織（テスタ）と別の生物
組織（ドライバ）由来のｍＲＮＡを含むＲＮＡにおい
て、テスタに特異的に存在する遺伝子の部分塩基配列を
含むＤＮＡをクローニングする方法であって、テスタ及
びドライバの一方に由来するＲＮＡに相同的な一本鎖核
酸と、他方に由来するＲＮＡに相補的な一本鎖核酸との
間でのハイブリダイゼーションを行うことを特徴とする
前記方法を提供する。
工程： （Ｄ）前記（Ｃ）の工程で増幅される１本鎖核酸を鋳型
として、２本鎖ＤＮＡを増幅する工程；をさらに含む。
さらに、本発明は、ある生物組織（テスタ）と別の生物
組織（ドライバ）由来のｍＲＮＡを含むＲＮＡにおい
て、テスタに特異的に存在する遺伝子の部分塩基配列を
含むＤＮＡをクローニングする方法であって、テスタ及
びドライバの一方に由来するＲＮＡに相同的な一本鎖核
酸と、他方に由来するＲＮＡに相補的な一本鎖核酸との
間でのハイブリダイゼーションを行うことを特徴とする
前記方法を提供する。
【００２４】上記方法は、好ましくは、以下の工程： （Ａ）テスタ及びドライバから抽出したＲＮＡを鋳型と
して、テスタの抽出ＲＮＡに相補若しくは相同な任意の
部分塩基配列を含む１本鎖核酸、及びドライバの抽出Ｒ
ＮＡに相同若しくは相補な任意の部分塩基配列を含む１
本鎖核酸を増幅する工程； （Ｂ）テスタ由来の１本鎖核酸と過剰量のドライバ由来
の１本鎖核酸との間でハイブリダイゼーションを行っ
て、２本鎖を形成した核酸を除去する工程； （Ｃ）前記（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼーショ
ンされなかった１本鎖核酸に相同又は相補な１本鎖核酸
を増幅する工程；
して、テスタの抽出ＲＮＡに相補若しくは相同な任意の
部分塩基配列を含む１本鎖核酸、及びドライバの抽出Ｒ
ＮＡに相同若しくは相補な任意の部分塩基配列を含む１
本鎖核酸を増幅する工程； （Ｂ）テスタ由来の１本鎖核酸と過剰量のドライバ由来
の１本鎖核酸との間でハイブリダイゼーションを行っ
て、２本鎖を形成した核酸を除去する工程； （Ｃ）前記（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼーショ
ンされなかった１本鎖核酸に相同又は相補な１本鎖核酸
を増幅する工程；
【００２５】（Ｄ）前記（Ｃ）の工程で増幅される１本
鎖核酸を鋳型として、２本鎖ＤＮＡを増幅する工程；及
び （Ｅ）前記（Ｄ）の工程で増幅される２本鎖ＤＮＡをベ
クター中に組み込み、得られる組換えベクターを用いて
宿主を形質転換する工程； を含む。ここで、前記１本鎖核酸は、好ましくは、１本
鎖ＲＮＡである。前記（Ａ）及び（Ｃ）の工程は、好ま
しくは、任意の複数の塩基配列からなる混合プライマー
のペアを用いるＮＡＳＢＡによって１本鎖ＲＮＡを増幅
することを含む。
鎖核酸を鋳型として、２本鎖ＤＮＡを増幅する工程；及
び （Ｅ）前記（Ｄ）の工程で増幅される２本鎖ＤＮＡをベ
クター中に組み込み、得られる組換えベクターを用いて
宿主を形質転換する工程； を含む。ここで、前記１本鎖核酸は、好ましくは、１本
鎖ＲＮＡである。前記（Ａ）及び（Ｃ）の工程は、好ま
しくは、任意の複数の塩基配列からなる混合プライマー
のペアを用いるＮＡＳＢＡによって１本鎖ＲＮＡを増幅
することを含む。
【００２６】前記（Ａ）の工程は、好ましくは、以下の
工程： （ａ）テスタ由来の抽出ＲＮＡ及びドライバ由来の抽出
ＲＮＡをそれぞれ鋳型として、（i）任意の複数の塩基
配列からなる第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'
末端に付加されたＴ７プロモータからなるプライマー、
並びに（ii）任意の複数の塩基配列からなる第２の混合
オリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いてＮＡＳ
ＢＡを行うことにより、それぞれの抽出ＲＮＡに相補的
な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程；
工程： （ａ）テスタ由来の抽出ＲＮＡ及びドライバ由来の抽出
ＲＮＡをそれぞれ鋳型として、（i）任意の複数の塩基
配列からなる第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'
末端に付加されたＴ７プロモータからなるプライマー、
並びに（ii）任意の複数の塩基配列からなる第２の混合
オリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いてＮＡＳ
ＢＡを行うことにより、それぞれの抽出ＲＮＡに相補的
な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程；
【００２７】（ｂ）上記工程（ａ）で得られるテスタ由
来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第１
の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加された
Ｔ７プロモータからなるプライマー、並びに（ii）前記
第２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加さ
れた任意の１種の塩基配列からなる第３のオリゴヌクレ
オチドからなるプライマーを用いてＮＡＳＢＡを行うこ
とにより、前記相補的１本鎖ＲＮＡに相同的な１本鎖Ｒ
ＮＡを増幅する工程；
来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第１
の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加された
Ｔ７プロモータからなるプライマー、並びに（ii）前記
第２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加さ
れた任意の１種の塩基配列からなる第３のオリゴヌクレ
オチドからなるプライマーを用いてＮＡＳＢＡを行うこ
とにより、前記相補的１本鎖ＲＮＡに相同的な１本鎖Ｒ
ＮＡを増幅する工程；
【００２８】（ｃ）上記工程（ａ）で得られるドライバ
由来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第
１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加され
たオリゴｄＴからなるプライマー、並びに（ii）前記第
２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加され
たＴ７プロモータからなるプライマーを用いてＮＡＳＢ
Ａを行うことにより、前記相補的１本鎖ＲＮＡに相補的
な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程；を含む。
由来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第
１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加され
たオリゴｄＴからなるプライマー、並びに（ii）前記第
２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加され
たＴ７プロモータからなるプライマーを用いてＮＡＳＢ
Ａを行うことにより、前記相補的１本鎖ＲＮＡに相補的
な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程；を含む。
【００２９】この場合において、前記（Ｃ）の工程は、
好ましくは、前記（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼ
ーションされなかった１本鎖ＲＮＡを鋳型として、
（i）前記第３のオリゴヌクレオチド及びその5'末端に
付加されたＴ７プロモータからなるプライマー、並びに
（ii）前記第１の混合オリゴヌクレオチドからなるプラ
イマーを用いてＮＡＳＢＡを行うことにより、前記１本
鎖ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程を含
む。あるいは、前記（Ｃ）の工程は、好ましくは、前記
（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼーションされなか
った１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第３のオリ
ゴヌクレオチドからなるプライマー、並びに（ii）前記
第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加さ
れたＴ７プロモータからなるプライマーを用いてＮＡＳ
ＢＡを行うことにより、前記１本鎖ＲＮＡに相同的な１
本鎖ＲＮＡを増幅する工程を含む。
好ましくは、前記（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼ
ーションされなかった１本鎖ＲＮＡを鋳型として、
（i）前記第３のオリゴヌクレオチド及びその5'末端に
付加されたＴ７プロモータからなるプライマー、並びに
（ii）前記第１の混合オリゴヌクレオチドからなるプラ
イマーを用いてＮＡＳＢＡを行うことにより、前記１本
鎖ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程を含
む。あるいは、前記（Ｃ）の工程は、好ましくは、前記
（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼーションされなか
った１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第３のオリ
ゴヌクレオチドからなるプライマー、並びに（ii）前記
第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加さ
れたＴ７プロモータからなるプライマーを用いてＮＡＳ
ＢＡを行うことにより、前記１本鎖ＲＮＡに相同的な１
本鎖ＲＮＡを増幅する工程を含む。
【００３０】この場合において、前記第１の混合オリゴ
ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２の
混合オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、
前記第３のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番
号７で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドで
ある。
ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２の
混合オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、
前記第３のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番
号７で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドで
ある。
【００３１】あるいは、前記（Ａ）の工程は、好ましく
は、以下の工程： （ａ）テスタ由来の抽出ＲＮＡ及びドライバ由来の抽出
ＲＮＡをそれぞれ鋳型として、（i）任意の複数の塩基
配列からなる第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'
末端に付加されたＴ７プロモータからなるプライマー、
並びに（ii）任意の複数の塩基配列からなる第２の混合
オリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いてＮＡＳ
ＢＡを行うことにより、それぞれの抽出ＲＮＡに相補的
な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程；
は、以下の工程： （ａ）テスタ由来の抽出ＲＮＡ及びドライバ由来の抽出
ＲＮＡをそれぞれ鋳型として、（i）任意の複数の塩基
配列からなる第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'
末端に付加されたＴ７プロモータからなるプライマー、
並びに（ii）任意の複数の塩基配列からなる第２の混合
オリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いてＮＡＳ
ＢＡを行うことにより、それぞれの抽出ＲＮＡに相補的
な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程；
【００３２】（ｂ）上記工程（ａ）で得られるテスタ由
来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第１
の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加された
任意の１種の塩基配列からなる第４のオリゴヌクレオチ
ドからなるプライマー、並びに（ii）前記第２の混合オ
リゴヌクレオチド及びその5'末端に付加されたＴ７プロ
モータからなるプライマーを用いてＮＡＳＢＡを行うこ
とにより、前記相補的１本鎖ＲＮＡに相補的な１本鎖Ｒ
ＮＡを増幅する工程；
来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第１
の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加された
任意の１種の塩基配列からなる第４のオリゴヌクレオチ
ドからなるプライマー、並びに（ii）前記第２の混合オ
リゴヌクレオチド及びその5'末端に付加されたＴ７プロ
モータからなるプライマーを用いてＮＡＳＢＡを行うこ
とにより、前記相補的１本鎖ＲＮＡに相補的な１本鎖Ｒ
ＮＡを増幅する工程；
【００３３】（ｃ）上記工程（ａ）で得られるドライバ
由来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第
１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加され
たＴ７プロモータからなるプライマー、並びに（ii）前
記第２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加
されたオリゴｄＴからなるプライマーを用いてＮＡＳＢ
Ａを行うことにより、前記相補的１本鎖ＲＮＡに相同的
な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程；を含む。
由来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第
１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加され
たＴ７プロモータからなるプライマー、並びに（ii）前
記第２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加
されたオリゴｄＴからなるプライマーを用いてＮＡＳＢ
Ａを行うことにより、前記相補的１本鎖ＲＮＡに相同的
な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程；を含む。
【００３４】この場合において、前記（Ｃ）の工程は、
好ましくは、前記（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼ
ーションされなかった１本鎖ＲＮＡを鋳型として、
（i）前記第４のオリゴヌクレオチド及びその5'末端に
付加されたＴ７プロモータからなるプライマー、並びに
（ii）前記第２の混合オリゴヌクレオチドからなるプラ
イマーを用いてＮＡＳＢＡを行うことにより、前記１本
鎖ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程を含
む。あるいは、前記（Ｃ）の工程は、好ましくは、前記
（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼーションされなか
った１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第４のオリ
ゴヌクレオチドからなるプライマー、並びに（ii）前記
第２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加さ
れたＴ７プロモータからなるプライマーを用いてＮＡＳ
ＢＡを行うことにより、前記１本鎖ＲＮＡに相同的な１
本鎖ＲＮＡを増幅する工程を含む。
好ましくは、前記（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼ
ーションされなかった１本鎖ＲＮＡを鋳型として、
（i）前記第４のオリゴヌクレオチド及びその5'末端に
付加されたＴ７プロモータからなるプライマー、並びに
（ii）前記第２の混合オリゴヌクレオチドからなるプラ
イマーを用いてＮＡＳＢＡを行うことにより、前記１本
鎖ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する工程を含
む。あるいは、前記（Ｃ）の工程は、好ましくは、前記
（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼーションされなか
った１本鎖ＲＮＡを鋳型として、（i）前記第４のオリ
ゴヌクレオチドからなるプライマー、並びに（ii）前記
第２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加さ
れたＴ７プロモータからなるプライマーを用いてＮＡＳ
ＢＡを行うことにより、前記１本鎖ＲＮＡに相同的な１
本鎖ＲＮＡを増幅する工程を含む。
【００３５】この場合において、前記第１の混合オリゴ
ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２の
混合オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、
前記第４のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番
号７で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチドである。
ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２の
混合オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、
前記第４のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番
号７で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチドである。
【００３６】さらに、本発明は、以下のプライマーペ
ア： （Ａ）（i）任意の複数の塩基配列からなる第１の混合
オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加されたＴ７プ
ロモータからなるプライマー：並びに（ii）任意の複数
の塩基配列からなる第２の混合オリゴヌクレオチドから
なるプライマー：からなる、テスタ及びドライバから抽
出したＲＮＡを鋳型としてそれぞれの任意の部分に相補
な１本鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマ
ーペア；
ア： （Ａ）（i）任意の複数の塩基配列からなる第１の混合
オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加されたＴ７プ
ロモータからなるプライマー：並びに（ii）任意の複数
の塩基配列からなる第２の混合オリゴヌクレオチドから
なるプライマー：からなる、テスタ及びドライバから抽
出したＲＮＡを鋳型としてそれぞれの任意の部分に相補
な１本鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマ
ーペア；
【００３７】（Ｂ）（i）前記第１の混合オリゴヌクレ
オチド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータから
なるプライマー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌ
クレオチド及びその5'末端に付加された任意の１種の塩
基配列からなる第３のオリゴヌクレオチドからなるプラ
イマー：からなる、テスタ由来の相補的１本鎖ＲＮＡを
鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅する
ためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；
オチド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータから
なるプライマー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌ
クレオチド及びその5'末端に付加された任意の１種の塩
基配列からなる第３のオリゴヌクレオチドからなるプラ
イマー：からなる、テスタ由来の相補的１本鎖ＲＮＡを
鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅する
ためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；
【００３８】（Ｃ）（i）前記第１の混合オリゴヌクレ
オチド及びその5'末端に付加されたオリゴｄＴからなる
プライマー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌクレ
オチド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータから
なるプライマー：からなる、ドライバ由来の相補的１本
鎖ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡ
を増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；
オチド及びその5'末端に付加されたオリゴｄＴからなる
プライマー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌクレ
オチド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータから
なるプライマー：からなる、ドライバ由来の相補的１本
鎖ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡ
を増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；
【００３９】（Ｄ）（i）前記第３のオリゴヌクレオチ
ド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータからなる
プライマー：及び（ii）前記第１の混合オリゴヌクレオ
チドからなるプライマー：からなる、１本鎖ＲＮＡを鋳
型として該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅するた
めのＮＡＳＢＡ用プライマーペア、又は（i）前記第３
のオリゴヌクレオチドからなるプライマー：及び（ii）
前記第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付
加されたＴ７プロモータからなるプライマー：からな
る、１本鎖ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本
鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペ
ア；を含む、テスタとドライバ由来のｍＲＮＡを含むＲ
ＮＡにおいて、テスタに特異的に存在する遺伝子の部分
塩基配列を含む核酸を単離及び増幅するためのプライマ
ーセットを提供する。
ド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータからなる
プライマー：及び（ii）前記第１の混合オリゴヌクレオ
チドからなるプライマー：からなる、１本鎖ＲＮＡを鋳
型として該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅するた
めのＮＡＳＢＡ用プライマーペア、又は（i）前記第３
のオリゴヌクレオチドからなるプライマー：及び（ii）
前記第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付
加されたＴ７プロモータからなるプライマー：からな
る、１本鎖ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本
鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペ
ア；を含む、テスタとドライバ由来のｍＲＮＡを含むＲ
ＮＡにおいて、テスタに特異的に存在する遺伝子の部分
塩基配列を含む核酸を単離及び増幅するためのプライマ
ーセットを提供する。
【００４０】この場合において、前記第１の混合オリゴ
ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２の
混合オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、
前記第３のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番
号７で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドで
ある。
ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２の
混合オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、
前記第３のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番
号７で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドで
ある。
【００４１】さらに、本発明は、以下のプライマーペ
ア： （Ａ）（i）任意の複数の塩基配列からなる第１の混合
オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加されたＴ７プ
ロモータからなるプライマー：並びに（ii）任意の複数
の塩基配列からなる第２の混合オリゴヌクレオチドから
なるプライマー：からなる、テスタ及びドライバから抽
出したＲＮＡを鋳型としてそれぞれの任意の部分に相補
な１本鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマ
ーペア；
ア： （Ａ）（i）任意の複数の塩基配列からなる第１の混合
オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加されたＴ７プ
ロモータからなるプライマー：並びに（ii）任意の複数
の塩基配列からなる第２の混合オリゴヌクレオチドから
なるプライマー：からなる、テスタ及びドライバから抽
出したＲＮＡを鋳型としてそれぞれの任意の部分に相補
な１本鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマ
ーペア；
【００４２】（Ｂ）（i）前記第１の混合オリゴヌクレ
オチド及びその5'末端に付加された任意の１種の塩基配
列からなる第４のオリゴヌクレオチドからなるプライマ
ー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌクレオチド及
びその5'末端に付加されたＴ７プロモータからなるプラ
イマー：からなる、テスタ由来の相補的１本鎖ＲＮＡを
鋳型として該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する
ためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；
オチド及びその5'末端に付加された任意の１種の塩基配
列からなる第４のオリゴヌクレオチドからなるプライマ
ー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌクレオチド及
びその5'末端に付加されたＴ７プロモータからなるプラ
イマー：からなる、テスタ由来の相補的１本鎖ＲＮＡを
鋳型として該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する
ためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；
【００４３】（Ｃ）（i）前記第１の混合オリゴヌクレ
オチド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータから
なるプライマー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌ
クレオチド及びその5'末端に付加されたオリゴｄＴから
なるプライマー：からなる、ドライバ由来の相補的１本
鎖ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡ
を増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；
オチド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータから
なるプライマー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌ
クレオチド及びその5'末端に付加されたオリゴｄＴから
なるプライマー：からなる、ドライバ由来の相補的１本
鎖ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡ
を増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；
【００４４】（Ｄ）（i）前記第４のオリゴヌクレオチ
ド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータからなる
プライマー：及び（ii）前記第２の混合オリゴヌクレオ
チドからなるプライマー：からなる、１本鎖ＲＮＡを鋳
型として該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅するた
めのＮＡＳＢＡ用プライマーペア、又は（i）前記第４
のオリゴヌクレオチドからなるプライマー：及び（ii）
前記第２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付
加されたＴ７プロモータからなるプライマー：からな
る、１本鎖ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本
鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペ
ア；を含む、テスタとドライバ由来のｍＲＮＡを含むＲ
ＮＡにおいて、テスタに特異的に存在する遺伝子の部分
塩基配列を含む核酸を単離及び増幅するためのプライマ
ーセットを提供する。
ド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータからなる
プライマー：及び（ii）前記第２の混合オリゴヌクレオ
チドからなるプライマー：からなる、１本鎖ＲＮＡを鋳
型として該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅するた
めのＮＡＳＢＡ用プライマーペア、又は（i）前記第４
のオリゴヌクレオチドからなるプライマー：及び（ii）
前記第２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付
加されたＴ７プロモータからなるプライマー：からな
る、１本鎖ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本
鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペ
ア；を含む、テスタとドライバ由来のｍＲＮＡを含むＲ
ＮＡにおいて、テスタに特異的に存在する遺伝子の部分
塩基配列を含む核酸を単離及び増幅するためのプライマ
ーセットを提供する。
【００４５】この場合において、前記第１の混合オリゴ
ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２の
混合オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、
前記第４のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番
号７で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチドである。
ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２の
混合オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、
前記第４のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番
号７で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチドである。
【００４６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 １．本発明の方法 本発明は、ある生物組織（テスタ）と別の生物組織（ド
ライバ）由来のｍＲＮＡを含むＲＮＡにおいて、テスタ
に特異的に存在する遺伝子の部分塩基配列を含む核酸を
単離及び増幅する方法に関し、該方法は、テスタ及びド
ライバの一方に由来するＲＮＡに相同的な一本鎖核酸
と、他方に由来するＲＮＡに相補的な一本鎖核酸との間
でのハイブリダイゼーションを行うことを特徴とする。
さらに、該方法により単離及び増幅された核酸を用い
て、テスタに特異的に存在する遺伝子の部分塩基配列を
含む２本鎖ＤＮＡをクローニングすることができる。
ライバ）由来のｍＲＮＡを含むＲＮＡにおいて、テスタ
に特異的に存在する遺伝子の部分塩基配列を含む核酸を
単離及び増幅する方法に関し、該方法は、テスタ及びド
ライバの一方に由来するＲＮＡに相同的な一本鎖核酸
と、他方に由来するＲＮＡに相補的な一本鎖核酸との間
でのハイブリダイゼーションを行うことを特徴とする。
さらに、該方法により単離及び増幅された核酸を用い
て、テスタに特異的に存在する遺伝子の部分塩基配列を
含む２本鎖ＤＮＡをクローニングすることができる。
【００４７】本発明の方法は、テスタ及びドライバ組織
からのＲＮＡの抽出、各抽出ＲＮＡに対する部分的な１
本鎖核酸の増幅、サブトラクティブ・ハイブリダイゼー
ションによるテスタに特異的な１本鎖核酸の単離、単離
された１本鎖核酸に相同又は相補な１本鎖核酸の増幅の
各工程により行うことが好ましい。以下、これらの工程
を分説する。
からのＲＮＡの抽出、各抽出ＲＮＡに対する部分的な１
本鎖核酸の増幅、サブトラクティブ・ハイブリダイゼー
ションによるテスタに特異的な１本鎖核酸の単離、単離
された１本鎖核酸に相同又は相補な１本鎖核酸の増幅の
各工程により行うことが好ましい。以下、これらの工程
を分説する。
【００４８】（１）テスタ及びドライバ組織からのＲＮ
Ａの抽出 テスタとドライバの両細胞組織からＲＮＡ、好ましくは
全ＲＮＡを抽出する。生物組織からのＲＮＡの抽出は、
当業者に公知の方法を用いて行うことができ、また、市
販のキットを用いて行うこともできる。例えば、生物組
織からの全ＲＮＡの抽出は、液体窒素で凍結後、細胞組
織を磨砕し、グアニジウムチオシアネートやフェノール
・クロロホルム溶液等で全ＲＮＡを抽出してエタノール
沈殿等によりこれを回収することにより行うことができ
る。その具体的な操作方法は、Molecular Cloning（Man
iatisら、A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour
Laboratory Press, 1982)等に記載されている。
Ａの抽出 テスタとドライバの両細胞組織からＲＮＡ、好ましくは
全ＲＮＡを抽出する。生物組織からのＲＮＡの抽出は、
当業者に公知の方法を用いて行うことができ、また、市
販のキットを用いて行うこともできる。例えば、生物組
織からの全ＲＮＡの抽出は、液体窒素で凍結後、細胞組
織を磨砕し、グアニジウムチオシアネートやフェノール
・クロロホルム溶液等で全ＲＮＡを抽出してエタノール
沈殿等によりこれを回収することにより行うことができ
る。その具体的な操作方法は、Molecular Cloning（Man
iatisら、A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour
Laboratory Press, 1982)等に記載されている。
【００４９】（２）各抽出ＲＮＡに対する部分的な１本
鎖核酸の増幅 テスタ及びドライバから抽出したＲＮＡを鋳型として、
テスタの抽出ＲＮＡに相補若しくは相同な任意の部分塩
基配列を含む１本鎖核酸、及びドライバの抽出ＲＮＡに
相同若しくは相補な任意の部分塩基配列を含む１本鎖核
酸を増幅する。ここで、前記１本鎖核酸は、ＤＮＡまた
はＲＮＡのどちらであってもよいが、好ましくはＲＮＡ
である。前記１本鎖核酸がＲＮＡである場合には、上記
増幅は、例えば、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence
Based Amplification）によって行うことができる。
鎖核酸の増幅 テスタ及びドライバから抽出したＲＮＡを鋳型として、
テスタの抽出ＲＮＡに相補若しくは相同な任意の部分塩
基配列を含む１本鎖核酸、及びドライバの抽出ＲＮＡに
相同若しくは相補な任意の部分塩基配列を含む１本鎖核
酸を増幅する。ここで、前記１本鎖核酸は、ＤＮＡまた
はＲＮＡのどちらであってもよいが、好ましくはＲＮＡ
である。前記１本鎖核酸がＲＮＡである場合には、上記
増幅は、例えば、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence
Based Amplification）によって行うことができる。
【００５０】通常のＮＡＳＢＡ法は、特定の塩基配列の
増幅を目的に行われる。その場合、目的とする塩基配列
の両端の配列に相当する２つのオリゴヌクレオチドプラ
イマーの中で、その5'末端側にＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーター配列が付加された相補プライマーと標的ＲＮ
Ａとのアニーリング、逆転写酵素によるｃＤＮＡの合
成、前記反応で生じたＲＮＡ-ＤＮＡのハイブリッドに
おけるＲＮＡのＲＮＡ分解酵素による分解、前記反応で
合成されたｃＤＮＡへの相同プライマーのアニーリング
と逆転写酵素によるＤＮＡ合成、前記反応で生じたＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列の下流に標的配列が
続く２本鎖ＤＮＡを鋳型にしたＲＮＡポリメラーゼによ
る相補ＲＮＡの大量合成、合成された相補ＲＮＡを鋳型
として上記一連の反応が繰り返されることにより前記の
相補ＲＮＡが指数関数的に増幅される。ここで、ＲＮＡ
ポリメラーゼとしては、当業者に公知のものを用いるこ
とができるが、好ましくはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用
いる。逆転写酵素としては、当業者に公知のものを用い
ることができるが、好ましくはＡＭＶ−ＲＴを用いる。
また、ＲＮＡ分解酵素としては、当業者に公知のものを
用いることができるが、好ましくはRNaseHを用いる。そ
の他、各種ヌクレオチド、ＤＴＴ、MgCl2、ＤＭＳＯ、K
Cl溶液、水等、必要となる試薬は、当業者であれば容易
に選択することができる。また、反応温度、反応時間等
の反応条件も、当業者であれば容易に設定することがで
きる。あるいは、ＮＡＳＢＡは、NASBA Amplification
Kit（ORGANON TEKNIKA）等の市販のキットを用い、添付
の説明書に従って行ってもよい。なお、ＮＡＳＢＡの詳
しい原理、具体的な操作方法は、例えばMolecular Meth
ods for Virus Detection（Sooknananら、pp. 261-28
5、Academic Press）に掲載されている。本発明の好ま
しい実施形態では、本工程において、上記（１）で得ら
れる各抽出ＲＮＡから任意の同等の部分的相補ＲＮＡを
増幅するための第１のＮＡＳＢＡ、及び該部分的相補Ｒ
ＮＡから相補又は相同ＲＮＡを増幅するための第２のＮ
ＡＳＢＡを行う。
増幅を目的に行われる。その場合、目的とする塩基配列
の両端の配列に相当する２つのオリゴヌクレオチドプラ
イマーの中で、その5'末端側にＲＮＡポリメラーゼのプ
ロモーター配列が付加された相補プライマーと標的ＲＮ
Ａとのアニーリング、逆転写酵素によるｃＤＮＡの合
成、前記反応で生じたＲＮＡ-ＤＮＡのハイブリッドに
おけるＲＮＡのＲＮＡ分解酵素による分解、前記反応で
合成されたｃＤＮＡへの相同プライマーのアニーリング
と逆転写酵素によるＤＮＡ合成、前記反応で生じたＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列の下流に標的配列が
続く２本鎖ＤＮＡを鋳型にしたＲＮＡポリメラーゼによ
る相補ＲＮＡの大量合成、合成された相補ＲＮＡを鋳型
として上記一連の反応が繰り返されることにより前記の
相補ＲＮＡが指数関数的に増幅される。ここで、ＲＮＡ
ポリメラーゼとしては、当業者に公知のものを用いるこ
とができるが、好ましくはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用
いる。逆転写酵素としては、当業者に公知のものを用い
ることができるが、好ましくはＡＭＶ−ＲＴを用いる。
また、ＲＮＡ分解酵素としては、当業者に公知のものを
用いることができるが、好ましくはRNaseHを用いる。そ
の他、各種ヌクレオチド、ＤＴＴ、MgCl2、ＤＭＳＯ、K
Cl溶液、水等、必要となる試薬は、当業者であれば容易
に選択することができる。また、反応温度、反応時間等
の反応条件も、当業者であれば容易に設定することがで
きる。あるいは、ＮＡＳＢＡは、NASBA Amplification
Kit（ORGANON TEKNIKA）等の市販のキットを用い、添付
の説明書に従って行ってもよい。なお、ＮＡＳＢＡの詳
しい原理、具体的な操作方法は、例えばMolecular Meth
ods for Virus Detection（Sooknananら、pp. 261-28
5、Academic Press）に掲載されている。本発明の好ま
しい実施形態では、本工程において、上記（１）で得ら
れる各抽出ＲＮＡから任意の同等の部分的相補ＲＮＡを
増幅するための第１のＮＡＳＢＡ、及び該部分的相補Ｒ
ＮＡから相補又は相同ＲＮＡを増幅するための第２のＮ
ＡＳＢＡを行う。
【００５１】第１のＮＡＳＢＡは、上記（１）で得られ
る各抽出ＲＮＡから同等の部分的相補ＲＮＡを増幅する
ために、各ＮＡＳＢＡを同一のプライマーペアを用いて
行う。また、各抽出ＲＮＡ、すなわち、鋳型にする抽出
ＲＮＡ集団の多様性をできるだけ保存した相補ＲＮＡが
増幅されるように、プライマーとしては、好ましくは12
8〜256種類の複数の塩基配列からなる混合オリゴヌクレ
オチドを用いる。但し、該混合ヌクレオチドは、若干の
特異性を確保するために3'末端の３塩基は共通の塩基と
することが好ましい。第１のＮＡＳＢＡでは、テスタ由
来の抽出ＲＮＡ及びドライバ由来の抽出ＲＮＡから同等
な部分的相補ＲＮＡが得られればよく、特定の領域を標
的とするものではないため、プライマーの塩基配列はい
かなるものであってもよい。また、プライマーの塩基数
は特に制限されないが、好ましくは１６塩基以上、より
好ましくは２３塩基以上とする。ここで、第１のＮＡＳ
ＢＡにおいて用いられる、抽出ＲＮＡに相補的なプライ
マーとして用いることが意図されるオリゴヌクレオチド
を「第１の混合オリゴヌクレオチド」、相同的なプライ
マーとして用いることが意図されるオリゴヌクレオチド
を「第２の混合オリゴヌクレオチド」という。第１の混
合オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１で
表わされる塩基配列を有するものが挙げられ、第２の混
合オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号４で
表わされる塩基配列を有するものが挙げられる。
る各抽出ＲＮＡから同等の部分的相補ＲＮＡを増幅する
ために、各ＮＡＳＢＡを同一のプライマーペアを用いて
行う。また、各抽出ＲＮＡ、すなわち、鋳型にする抽出
ＲＮＡ集団の多様性をできるだけ保存した相補ＲＮＡが
増幅されるように、プライマーとしては、好ましくは12
8〜256種類の複数の塩基配列からなる混合オリゴヌクレ
オチドを用いる。但し、該混合ヌクレオチドは、若干の
特異性を確保するために3'末端の３塩基は共通の塩基と
することが好ましい。第１のＮＡＳＢＡでは、テスタ由
来の抽出ＲＮＡ及びドライバ由来の抽出ＲＮＡから同等
な部分的相補ＲＮＡが得られればよく、特定の領域を標
的とするものではないため、プライマーの塩基配列はい
かなるものであってもよい。また、プライマーの塩基数
は特に制限されないが、好ましくは１６塩基以上、より
好ましくは２３塩基以上とする。ここで、第１のＮＡＳ
ＢＡにおいて用いられる、抽出ＲＮＡに相補的なプライ
マーとして用いることが意図されるオリゴヌクレオチド
を「第１の混合オリゴヌクレオチド」、相同的なプライ
マーとして用いることが意図されるオリゴヌクレオチド
を「第２の混合オリゴヌクレオチド」という。第１の混
合オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１で
表わされる塩基配列を有するものが挙げられ、第２の混
合オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号４で
表わされる塩基配列を有するものが挙げられる。
【００５２】さらに、ＮＡＳＢＡにおいて使用する相補
プライマーは、その5'末端にＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーターを付加させておく必要がある。このようなプロ
モーターはいずれのＲＮＡポリメラーゼに対するもので
あってもよいが、好ましくはＴ７ＲＮＡポリメラーゼの
プロモーター、すなわちＴ７プロモータである。従っ
て、第１のＮＡＳＢＡで用いる相補プライマーとして
は、例えば、配列番号１で表わされる塩基配列の5'末端
にＴ７プロモータ配列を付加した塩基配列、すなわち、
配列番号２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドが挙げられ、相同プライマーとしては、例えば、
配列番号４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドが挙げられる（図１中の（１）を参照された
い）。
プライマーは、その5'末端にＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーターを付加させておく必要がある。このようなプロ
モーターはいずれのＲＮＡポリメラーゼに対するもので
あってもよいが、好ましくはＴ７ＲＮＡポリメラーゼの
プロモーター、すなわちＴ７プロモータである。従っ
て、第１のＮＡＳＢＡで用いる相補プライマーとして
は、例えば、配列番号１で表わされる塩基配列の5'末端
にＴ７プロモータ配列を付加した塩基配列、すなわち、
配列番号２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドが挙げられ、相同プライマーとしては、例えば、
配列番号４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドが挙げられる（図１中の（１）を参照された
い）。
【００５３】このようにして得られる第１のＮＡＳＢＡ
反応液中には、指数関数的に増幅した相補ＲＮＡの他
に、その転写の鋳型となった２本鎖ＤＮＡと２種類のプ
ライマーが含まれている。これらが次に行う第２のＮＡ
ＳＢＡの反応液に混入すると、再度第１のＮＡＳＢＡ産
物と同一の相補ＲＮＡが増幅する可能性があるので、こ
れらを取り除く必要がある。その方法としては、大腸菌
由来のＤＮＡ分解酵素（例えば、DNase I）で処理し
て、ゲル濾過マイクロスピンカラム等（例えば、MicroS
pin S-400 HR Columns、アマシャムファルマシア社）
で、増幅した相補ＲＮＡと分離して低分子化したＤＮＡ
を取り除くことができる。
反応液中には、指数関数的に増幅した相補ＲＮＡの他
に、その転写の鋳型となった２本鎖ＤＮＡと２種類のプ
ライマーが含まれている。これらが次に行う第２のＮＡ
ＳＢＡの反応液に混入すると、再度第１のＮＡＳＢＡ産
物と同一の相補ＲＮＡが増幅する可能性があるので、こ
れらを取り除く必要がある。その方法としては、大腸菌
由来のＤＮＡ分解酵素（例えば、DNase I）で処理し
て、ゲル濾過マイクロスピンカラム等（例えば、MicroS
pin S-400 HR Columns、アマシャムファルマシア社）
で、増幅した相補ＲＮＡと分離して低分子化したＤＮＡ
を取り除くことができる。
【００５４】次いで、上記のようにしてテスタ及びドラ
イバの両組織から増幅した相補ＲＮＡを鋳型として、さ
らに、それぞれ別々のプライマーを用いた第２のＮＡＳ
ＢＡを行う。第２のＮＡＳＢＡでは、テスタからの相補
ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡ及びドライバからの相補
ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅するか（本発明の
第１の実施形態）、あるいは、テスタからの相補ＲＮＡ
に相補的な１本鎖ＲＮＡ及びドライバからの相補ＲＮＡ
に相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅する（本発明の第２の実
施形態）。いずれの場合においても、プライマーとして
は、第１の混合オリゴヌクレオチドを有するプライマー
及び第２の混合オリゴヌクレオチドを有するプライマー
を用いる。
イバの両組織から増幅した相補ＲＮＡを鋳型として、さ
らに、それぞれ別々のプライマーを用いた第２のＮＡＳ
ＢＡを行う。第２のＮＡＳＢＡでは、テスタからの相補
ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡ及びドライバからの相補
ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅するか（本発明の
第１の実施形態）、あるいは、テスタからの相補ＲＮＡ
に相補的な１本鎖ＲＮＡ及びドライバからの相補ＲＮＡ
に相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅する（本発明の第２の実
施形態）。いずれの場合においても、プライマーとして
は、第１の混合オリゴヌクレオチドを有するプライマー
及び第２の混合オリゴヌクレオチドを有するプライマー
を用いる。
【００５５】本発明の第１の実施形態では、テスタから
の相補ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡ及びドライバから
の相補ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する。この
場合において、前者の増幅のためのＮＡＳＢＡでは、前
記第１の混合オリゴヌクレオチドの5'末端にＲＮＡポリ
メラーゼのプロモーターを付加させ、後者の増幅のため
のＮＡＳＢＡでは、前記第２の混合オリゴヌクレオチド
の5'末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加さ
せる。また、前者の増幅のためのＮＡＳＢＡでは、後で
行うサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション後にテ
スタ由来のＲＮＡだけが増幅可能となるように、前記第
２の混合オリゴヌクレオチドの5'末端に任意の１種の
（共通の）オリゴヌクレオチドを付加させる。該オリゴ
ヌクレオチドはいかなる配列を含んでいてもよいが、そ
の塩基数はそれ自体が単独でプライマーとして機能し得
る程度とし、好ましくは１６塩基〜２５塩基、より好ま
しくは約２０塩基とする。ここで用いる該オリゴヌクレ
オチドを「第３のオリゴヌクレオチド」という。第３の
オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号７で表
わされる塩基配列を有するものが挙げられる。一方、後
者の増幅のためのＮＡＳＢＡでは、後で行うサブトラク
ティブ・ハイブリダイゼーション後に、ドライバ由来の
ＲＮＡを取り除くために、前記第１の混合オリゴヌクレ
オチドの5'末端にオリゴｄＴを付加させる。該オリゴｄ
Ｔの塩基数は、特に制限されないが、好ましくは２０塩
基〜５０塩基、より好ましくは２５塩基〜３０塩基とす
る。
の相補ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡ及びドライバから
の相補ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する。この
場合において、前者の増幅のためのＮＡＳＢＡでは、前
記第１の混合オリゴヌクレオチドの5'末端にＲＮＡポリ
メラーゼのプロモーターを付加させ、後者の増幅のため
のＮＡＳＢＡでは、前記第２の混合オリゴヌクレオチド
の5'末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加さ
せる。また、前者の増幅のためのＮＡＳＢＡでは、後で
行うサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション後にテ
スタ由来のＲＮＡだけが増幅可能となるように、前記第
２の混合オリゴヌクレオチドの5'末端に任意の１種の
（共通の）オリゴヌクレオチドを付加させる。該オリゴ
ヌクレオチドはいかなる配列を含んでいてもよいが、そ
の塩基数はそれ自体が単独でプライマーとして機能し得
る程度とし、好ましくは１６塩基〜２５塩基、より好ま
しくは約２０塩基とする。ここで用いる該オリゴヌクレ
オチドを「第３のオリゴヌクレオチド」という。第３の
オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号７で表
わされる塩基配列を有するものが挙げられる。一方、後
者の増幅のためのＮＡＳＢＡでは、後で行うサブトラク
ティブ・ハイブリダイゼーション後に、ドライバ由来の
ＲＮＡを取り除くために、前記第１の混合オリゴヌクレ
オチドの5'末端にオリゴｄＴを付加させる。該オリゴｄ
Ｔの塩基数は、特に制限されないが、好ましくは２０塩
基〜５０塩基、より好ましくは２５塩基〜３０塩基とす
る。
【００５６】従って、上記の場合には、テスタからの相
補ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅するための第２
のＮＡＳＢＡでは、例えば、配列番号２で表わされる塩
基配列を有する混合オリゴヌクレオチド及び配列番号６
で表わされる塩基配列を有する混合オリゴヌクレオチド
をプライマーとして用いる。また、ドライバからの相補
ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅するための第２の
ＮＡＳＢＡでは、例えば、配列番号３で表わされる塩基
配列を有する混合オリゴヌクレオチド及び配列番号５で
表わされる塩基配列を有する混合オリゴヌクレオチドを
プライマーとして用いる（図１中の（２）を参照された
い）。
補ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅するための第２
のＮＡＳＢＡでは、例えば、配列番号２で表わされる塩
基配列を有する混合オリゴヌクレオチド及び配列番号６
で表わされる塩基配列を有する混合オリゴヌクレオチド
をプライマーとして用いる。また、ドライバからの相補
ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅するための第２の
ＮＡＳＢＡでは、例えば、配列番号３で表わされる塩基
配列を有する混合オリゴヌクレオチド及び配列番号５で
表わされる塩基配列を有する混合オリゴヌクレオチドを
プライマーとして用いる（図１中の（２）を参照された
い）。
【００５７】本発明の第２の実施形態では、テスタから
の相補ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡ及びドライバから
の相補ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅する。この
場合において、前者の増幅のためのＮＡＳＢＡでは、前
記第２の混合オリゴヌクレオチドの5'末端にＲＮＡポリ
メラーゼのプロモーターを付加させ、後者の増幅のため
のＮＡＳＢＡでは、前記第１の混合オリゴヌクレオチド
の5'末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加さ
せる。また、前者の増幅のためのＮＡＳＢＡでは、後で
行うサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション後にテ
スタ由来のＲＮＡだけが増幅可能となるように、前記第
１の混合オリゴヌクレオチドの5'末端に任意の１種の
（共通の）オリゴヌクレオチドを付加させる。該オリゴ
ヌクレオチドはいかなる配列を含んでいてもよいが、そ
の塩基数はそれ自体が単独でプライマーとして機能し得
る程度とし、好ましくは１６塩基〜２５塩基、より好ま
しくは約２０塩基とする。ここで用いる該オリゴヌクレ
オチドを「第４のオリゴヌクレオチド」という。第４の
オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号７で表
わされる塩基配列に相補的な塩基配列を有するものが挙
げられる。一方、後者の増幅のためのＮＡＳＢＡでは、
後で行うサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション後
に、ドライバ由来のＲＮＡを取り除くために、前記第２
の混合オリゴヌクレオチドの5'末端に上記オリゴｄＴを
付加させる。
の相補ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡ及びドライバから
の相補ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅する。この
場合において、前者の増幅のためのＮＡＳＢＡでは、前
記第２の混合オリゴヌクレオチドの5'末端にＲＮＡポリ
メラーゼのプロモーターを付加させ、後者の増幅のため
のＮＡＳＢＡでは、前記第１の混合オリゴヌクレオチド
の5'末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加さ
せる。また、前者の増幅のためのＮＡＳＢＡでは、後で
行うサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション後にテ
スタ由来のＲＮＡだけが増幅可能となるように、前記第
１の混合オリゴヌクレオチドの5'末端に任意の１種の
（共通の）オリゴヌクレオチドを付加させる。該オリゴ
ヌクレオチドはいかなる配列を含んでいてもよいが、そ
の塩基数はそれ自体が単独でプライマーとして機能し得
る程度とし、好ましくは１６塩基〜２５塩基、より好ま
しくは約２０塩基とする。ここで用いる該オリゴヌクレ
オチドを「第４のオリゴヌクレオチド」という。第４の
オリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号７で表
わされる塩基配列に相補的な塩基配列を有するものが挙
げられる。一方、後者の増幅のためのＮＡＳＢＡでは、
後で行うサブトラクティブ・ハイブリダイゼーション後
に、ドライバ由来のＲＮＡを取り除くために、前記第２
の混合オリゴヌクレオチドの5'末端に上記オリゴｄＴを
付加させる。
【００５８】このようにして得られる第２のＮＡＳＢＡ
反応液中には、指数関数的に増幅した１本鎖ＲＮＡの他
に、その転写の鋳型となった２本鎖ＤＮＡと２種類のプ
ライマーが含まれている。これらが後に行うＮＡＳＢＡ
の反応液に混入すると、再度上記第２のＮＡＳＢＡ産物
と同一の１本鎖ＲＮＡが増幅する可能性があるので、こ
れらを取り除く必要がある。その方法としては、大腸菌
由来のＤＮＡ分解酵素（例えば、DNase I）で処理し
て、ゲル濾過マイクロスピンカラム等（例えば、MicroS
pin S-400 HR Columns、アマシャムファルマシア社）
で、増幅した相補ＲＮＡと分離して低分子化したＤＮＡ
を取り除くことができる。
反応液中には、指数関数的に増幅した１本鎖ＲＮＡの他
に、その転写の鋳型となった２本鎖ＤＮＡと２種類のプ
ライマーが含まれている。これらが後に行うＮＡＳＢＡ
の反応液に混入すると、再度上記第２のＮＡＳＢＡ産物
と同一の１本鎖ＲＮＡが増幅する可能性があるので、こ
れらを取り除く必要がある。その方法としては、大腸菌
由来のＤＮＡ分解酵素（例えば、DNase I）で処理し
て、ゲル濾過マイクロスピンカラム等（例えば、MicroS
pin S-400 HR Columns、アマシャムファルマシア社）
で、増幅した相補ＲＮＡと分離して低分子化したＤＮＡ
を取り除くことができる。
【００５９】（３）サブトラクティブ・ハイブリダイゼ
ーションによるテスタに特異的な１本鎖核酸の単離 上記（２）で増幅したテスタ由来の１本鎖核酸とドライ
バ由来の１本鎖核酸との間で、サブトラクティブハイブ
リダイゼーションを行う。ここで、前記１本鎖核酸は、
ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらであってもよいが、好まし
くはＲＮＡである。
ーションによるテスタに特異的な１本鎖核酸の単離 上記（２）で増幅したテスタ由来の１本鎖核酸とドライ
バ由来の１本鎖核酸との間で、サブトラクティブハイブ
リダイゼーションを行う。ここで、前記１本鎖核酸は、
ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらであってもよいが、好まし
くはＲＮＡである。
【００６０】両１本鎖核酸を熱変性後、急冷して高次構
造を解いて解離した１本鎖核酸の状態にする。0.5M程度
のナトリウム塩を含む適当な緩衝液、例えば、HEPES緩
衝液中で、テスタ由来の１本鎖核酸とその10倍量のドラ
イバ由来の１本鎖核酸を加えて、一晩ハイブリダイゼー
ションを行う。ここで、ハイブリダイゼーション後の溶
液に、さらに、10倍量のドライバ由来の相同ＲＮＡを加
えてもう一晩ハイブリダイゼーションしてもよく、これ
により、より強いストリンジェンシーで特異遺伝子の単
離ができる。
造を解いて解離した１本鎖核酸の状態にする。0.5M程度
のナトリウム塩を含む適当な緩衝液、例えば、HEPES緩
衝液中で、テスタ由来の１本鎖核酸とその10倍量のドラ
イバ由来の１本鎖核酸を加えて、一晩ハイブリダイゼー
ションを行う。ここで、ハイブリダイゼーション後の溶
液に、さらに、10倍量のドライバ由来の相同ＲＮＡを加
えてもう一晩ハイブリダイゼーションしてもよく、これ
により、より強いストリンジェンシーで特異遺伝子の単
離ができる。
【００６１】次いで、前記ハイブリダイゼーション溶液
において、ドライバ由来の１本鎖核酸を取り除く。これ
により、ハイブリッドを形成したテスタ由来の１本鎖核
酸をも取り除くことができる。ドライバ由来の１本鎖核
酸は、上記（２）で述べたようにアデニンの連続配列
（ポリＡ鎖）が付加されている場合には、オリゴdTカラ
ムやオリゴdTビーズ、オリゴdTラテックス等で簡便に取
り除くことができる。このような操作は、当業者であれ
ば容易に行うことができる（図２中の（３）を参照され
たい）。
において、ドライバ由来の１本鎖核酸を取り除く。これ
により、ハイブリッドを形成したテスタ由来の１本鎖核
酸をも取り除くことができる。ドライバ由来の１本鎖核
酸は、上記（２）で述べたようにアデニンの連続配列
（ポリＡ鎖）が付加されている場合には、オリゴdTカラ
ムやオリゴdTビーズ、オリゴdTラテックス等で簡便に取
り除くことができる。このような操作は、当業者であれ
ば容易に行うことができる（図２中の（３）を参照され
たい）。
【００６２】（４）単離された１本鎖核酸に相同又は相
補な１本鎖核酸の増幅 上記（３）で得られるテスタ由来の一本鎖核酸だけを増
幅する。ここで、前記１本鎖核酸は、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａのどちらであってもよいが、好ましくはＲＮＡであ
る。前記１本鎖核酸がＲＮＡである場合には、該増幅
は、ＮＡＳＢＡ法により行うことができる。
補な１本鎖核酸の増幅 上記（３）で得られるテスタ由来の一本鎖核酸だけを増
幅する。ここで、前記１本鎖核酸は、ＤＮＡまたはＲＮ
Ａのどちらであってもよいが、好ましくはＲＮＡであ
る。前記１本鎖核酸がＲＮＡである場合には、該増幅
は、ＮＡＳＢＡ法により行うことができる。
【００６３】上記（２）において本発明の第１の実施形
態に従った場合には、上記（３）で得られる１本鎖核酸
は、3'末端に第３のオリゴヌクレオチドの相補鎖が付加
した１本鎖ＲＮＡである。従って、この場合には、第１
の混合オリゴヌクレオチド及び第３のオリゴヌクレオチ
ドをプライマーを用いるＮＡＳＢＡを行う。ここで、該
１本鎖ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する場合に
は、前記第３のオリゴヌクレオチドの5'末端にＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーターを付加させる。また、該１本
鎖ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅する場合には、
前記第１の混合オリゴヌクレオチドの5'末端にＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーターを付加させる（図２中の
（４）を参照されたい）。
態に従った場合には、上記（３）で得られる１本鎖核酸
は、3'末端に第３のオリゴヌクレオチドの相補鎖が付加
した１本鎖ＲＮＡである。従って、この場合には、第１
の混合オリゴヌクレオチド及び第３のオリゴヌクレオチ
ドをプライマーを用いるＮＡＳＢＡを行う。ここで、該
１本鎖ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する場合に
は、前記第３のオリゴヌクレオチドの5'末端にＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーターを付加させる。また、該１本
鎖ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅する場合には、
前記第１の混合オリゴヌクレオチドの5'末端にＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーターを付加させる（図２中の
（４）を参照されたい）。
【００６４】上記（２）において本発明の第２の実施形
態に従った場合には、上記（３）で得られる１本鎖核酸
は、3'末端に第４のオリゴヌクレオチドの相補鎖が付加
した１本鎖ＲＮＡである。従って、この場合には、第２
の混合オリゴヌクレオチド及び第４のオリゴヌクレオチ
ドをプライマーを用いるＮＡＳＢＡを行う。ここで、該
１本鎖ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する場合に
は、前記第４のオリゴヌクレオチドの5'末端にＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーターを付加させる。また、該１本
鎖ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅する場合には、
前記第２の混合オリゴヌクレオチドの5'末端にＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーターを付加させる。
態に従った場合には、上記（３）で得られる１本鎖核酸
は、3'末端に第４のオリゴヌクレオチドの相補鎖が付加
した１本鎖ＲＮＡである。従って、この場合には、第２
の混合オリゴヌクレオチド及び第４のオリゴヌクレオチ
ドをプライマーを用いるＮＡＳＢＡを行う。ここで、該
１本鎖ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する場合に
は、前記第４のオリゴヌクレオチドの5'末端にＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーターを付加させる。また、該１本
鎖ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅する場合には、
前記第２の混合オリゴヌクレオチドの5'末端にＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーターを付加させる。
【００６５】但し、上記のいずれのＮＡＳＢＡにおいて
も、最初の熱変性過程を除いて行うことが好ましい。こ
れにより、たとえ前記溶液中にドライバ由来の１本鎖Ｒ
ＮＡやそれとハイブリッドを形成しているテスタ由来の
１本鎖ＲＮＡが残っていても、これらは増幅されない。
なぜなら、ドライバ由来の１本鎖ＲＮＡに上記第３又は
第４のオリゴヌクレオチドがアニーリングしないこと
と、２本鎖ＲＮＡはＮＡＳＢＡ反応の鋳型にならないか
らである。
も、最初の熱変性過程を除いて行うことが好ましい。こ
れにより、たとえ前記溶液中にドライバ由来の１本鎖Ｒ
ＮＡやそれとハイブリッドを形成しているテスタ由来の
１本鎖ＲＮＡが残っていても、これらは増幅されない。
なぜなら、ドライバ由来の１本鎖ＲＮＡに上記第３又は
第４のオリゴヌクレオチドがアニーリングしないこと
と、２本鎖ＲＮＡはＮＡＳＢＡ反応の鋳型にならないか
らである。
【００６６】以上のようにして選択的に増幅したＲＮＡ
は、そのまま標識することにより、ｃＤＮＡライブラリ
ーやESTライブラリーから特異遺伝子を選抜するための
プローブとして用いることができる。例えば、テスタの
ｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーをＤＮＡチ
ップ上に並べ、前記の増幅ＲＮＡを標識してプローブと
してハイブリダイゼーションを行うことにより、その機
能又は形質発現に関与する遺伝子を選抜することができ
る。また、このような選抜をゲノミックライブラリーに
ついて行うことにより、特異遺伝子のプロモーターを選
抜することができる。
は、そのまま標識することにより、ｃＤＮＡライブラリ
ーやESTライブラリーから特異遺伝子を選抜するための
プローブとして用いることができる。例えば、テスタの
ｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーをＤＮＡチ
ップ上に並べ、前記の増幅ＲＮＡを標識してプローブと
してハイブリダイゼーションを行うことにより、その機
能又は形質発現に関与する遺伝子を選抜することができ
る。また、このような選抜をゲノミックライブラリーに
ついて行うことにより、特異遺伝子のプロモーターを選
抜することができる。
【００６７】また、本工程により得られる反応溶液には
増幅したＲＮＡの転写の鋳型となる２本鎖ＤＮＡも含ま
れていることから、そのまま15サイクル程度のＰＣＲに
より単離した特異配列のｃＤＮＡを合成し、適当なベク
ター、例えばプラスミドベクターにつなぎ、該ベクター
を用いて大腸菌を形質転換することにより、テスタに特
異的な遺伝子をクローニングすることができる。このよ
うなクローニングを簡便に行うために、本発明の方法に
おいて使用するプライマーに制限酵素認識部位を含ませ
てもよい。さらに、クローニングしたＤＮＡの塩基配列
を調べて特異的プライマーを設計し、3'及び5'RACE法に
より特異的遺伝子の全長ｃＤＮＡを得ることができ、ま
た、TAIL-PCRによりそのプロモーター配列を得ることが
できる。
増幅したＲＮＡの転写の鋳型となる２本鎖ＤＮＡも含ま
れていることから、そのまま15サイクル程度のＰＣＲに
より単離した特異配列のｃＤＮＡを合成し、適当なベク
ター、例えばプラスミドベクターにつなぎ、該ベクター
を用いて大腸菌を形質転換することにより、テスタに特
異的な遺伝子をクローニングすることができる。このよ
うなクローニングを簡便に行うために、本発明の方法に
おいて使用するプライマーに制限酵素認識部位を含ませ
てもよい。さらに、クローニングしたＤＮＡの塩基配列
を調べて特異的プライマーを設計し、3'及び5'RACE法に
より特異的遺伝子の全長ｃＤＮＡを得ることができ、ま
た、TAIL-PCRによりそのプロモーター配列を得ることが
できる。
【００６８】上記の一連の工程で使用したオリゴヌクレ
オチドのセットと同様の効果が期待できる別の塩基配列
のオリゴヌクレオチドセット数種を用いて、上記の工程
を行うことにより、プライマーの配列による選択性を排
除して、特異遺伝子を完全にプロファイルできるであろ
う。本発明の方法の利用方法についてより詳細に説明す
ると、以下のとおりである。
オチドのセットと同様の効果が期待できる別の塩基配列
のオリゴヌクレオチドセット数種を用いて、上記の工程
を行うことにより、プライマーの配列による選択性を排
除して、特異遺伝子を完全にプロファイルできるであろ
う。本発明の方法の利用方法についてより詳細に説明す
ると、以下のとおりである。
【００６９】（イ）本発明の方法により増幅した組織特
異的なｃＤＮＡの塩基配列からプライマーを設計し、テ
スタ由来のｍＲＮＡを鋳型にした3'及び5'RACE法により
組織特異的な遺伝子の全長ｃＤＮＡが得られる。 （ロ）組織特異的な増幅ＲＮＡ又はｃＤＮＡをプローブ
として、テスタ由来のｍＲＮＡを鋳型にしたｃＤＮＡ若
しくはESTライブラリーとハイブリダイゼーションを行
い遺伝子を選抜する。例えば、ＤＮＡチップ（アレイ）
において、抽出したｍＲＮＡに代わって、上記の増幅Ｒ
ＮＡ又はｃＤＮＡをプローブとすると、ｍＲＮＡのポピ
ュレーションに比べてハウスキーピング遺伝子の部分配
列は除かれていることと、組織特異的に発現はしていて
も微量しか発現していない遺伝子のそれは、逆にＮＡＳ
ＢＡにより指数関数的に増幅していることから、組織特
異的な発現遺伝子を強調して選抜できると思われる。
異的なｃＤＮＡの塩基配列からプライマーを設計し、テ
スタ由来のｍＲＮＡを鋳型にした3'及び5'RACE法により
組織特異的な遺伝子の全長ｃＤＮＡが得られる。 （ロ）組織特異的な増幅ＲＮＡ又はｃＤＮＡをプローブ
として、テスタ由来のｍＲＮＡを鋳型にしたｃＤＮＡ若
しくはESTライブラリーとハイブリダイゼーションを行
い遺伝子を選抜する。例えば、ＤＮＡチップ（アレイ）
において、抽出したｍＲＮＡに代わって、上記の増幅Ｒ
ＮＡ又はｃＤＮＡをプローブとすると、ｍＲＮＡのポピ
ュレーションに比べてハウスキーピング遺伝子の部分配
列は除かれていることと、組織特異的に発現はしていて
も微量しか発現していない遺伝子のそれは、逆にＮＡＳ
ＢＡにより指数関数的に増幅していることから、組織特
異的な発現遺伝子を強調して選抜できると思われる。
【００７０】（ハ）ある機能・形質を示す組織において
特異的に働くプロモーターを組織特異的な増幅ｃＤＮＡ
の塩基配列からプライマーを設計し、TAIL-PCRを行う
か、それらをプローブとしてゲノミックライブラリーと
のハイブリダイゼーションから選抜できる。 （ニ）未知病原体を検出できる可能性がある。詳しく
は、組織特異的な増幅ｃＤＮＡをクローニングし、サブ
トラクティブｃＤＮＡライブラリーとする。健全組織か
ら抽出したゲノムＤＮＡと罹病組織から抽出したｍＲＮ
Ａ群をプローブとしてハイブリダイゼーションを行い、
罹病組織のｍＲＮＡ群にのみに反応したｃＤＮＡが未知
病原体由来である可能性がある。
特異的に働くプロモーターを組織特異的な増幅ｃＤＮＡ
の塩基配列からプライマーを設計し、TAIL-PCRを行う
か、それらをプローブとしてゲノミックライブラリーと
のハイブリダイゼーションから選抜できる。 （ニ）未知病原体を検出できる可能性がある。詳しく
は、組織特異的な増幅ｃＤＮＡをクローニングし、サブ
トラクティブｃＤＮＡライブラリーとする。健全組織か
ら抽出したゲノムＤＮＡと罹病組織から抽出したｍＲＮ
Ａ群をプローブとしてハイブリダイゼーションを行い、
罹病組織のｍＲＮＡ群にのみに反応したｃＤＮＡが未知
病原体由来である可能性がある。
【００７１】上記の特異遺伝子をin vitroで発現するこ
とにより有用な生物機能・形質に関わるタンパク質の生
産により医薬や農薬等の物質生産への利用、また、最近
の遺伝子導入技術を用いてそれらの遺伝子を導入した形
質転換動植物の育成による分子育種や遺伝子治療への利
用、生物機能・形質発現機構の解明、未知病原体の同定
により医療、農業や環境保全に貢献できる。
とにより有用な生物機能・形質に関わるタンパク質の生
産により医薬や農薬等の物質生産への利用、また、最近
の遺伝子導入技術を用いてそれらの遺伝子を導入した形
質転換動植物の育成による分子育種や遺伝子治療への利
用、生物機能・形質発現機構の解明、未知病原体の同定
により医療、農業や環境保全に貢献できる。
【００７２】２．本発明のプライマーセット 本発明は、上記本発明の方法を実施するために使用する
プライマーセットに関する。上記第１節（２）における
本発明の第１の実施形態に用いる場合には、本発明のプ
ライマーセットは、以下のプライマーペア：
プライマーセットに関する。上記第１節（２）における
本発明の第１の実施形態に用いる場合には、本発明のプ
ライマーセットは、以下のプライマーペア：
【００７３】（Ａ）（i）任意の複数の塩基配列からな
る第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加
されたＴ７プロモータからなるプライマー：並びに（i
i）任意の複数の塩基配列からなる第２の混合オリゴヌ
クレオチドからなるプライマー：からなる、テスタ及び
ドライバから抽出したＲＮＡを鋳型としてそれぞれの任
意の部分に相補な１本鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳ
ＢＡ用プライマーペア；
る第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加
されたＴ７プロモータからなるプライマー：並びに（i
i）任意の複数の塩基配列からなる第２の混合オリゴヌ
クレオチドからなるプライマー：からなる、テスタ及び
ドライバから抽出したＲＮＡを鋳型としてそれぞれの任
意の部分に相補な１本鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳ
ＢＡ用プライマーペア；
【００７４】（Ｂ）（i）前記第１の混合オリゴヌクレ
オチド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータから
なるプライマー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌ
クレオチド及びその5'末端に付加された任意の１種の塩
基配列からなる第３のオリゴヌクレオチドからなるプラ
イマー：からなる、テスタ由来の相補的１本鎖ＲＮＡを
鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅する
ためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；
オチド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータから
なるプライマー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌ
クレオチド及びその5'末端に付加された任意の１種の塩
基配列からなる第３のオリゴヌクレオチドからなるプラ
イマー：からなる、テスタ由来の相補的１本鎖ＲＮＡを
鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅する
ためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；
【００７５】（Ｃ）（i）前記第１の混合オリゴヌクレ
オチド及びその5'末端に付加されたオリゴｄＴからなる
プライマー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌクレ
オチド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータから
なるプライマー：からなる、ドライバ由来の相補的１本
鎖ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡ
を増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；
オチド及びその5'末端に付加されたオリゴｄＴからなる
プライマー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌクレ
オチド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータから
なるプライマー：からなる、ドライバ由来の相補的１本
鎖ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡ
を増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；
【００７６】（Ｄ）（i）前記第３のオリゴヌクレオチ
ド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータからなる
プライマー：及び（ii）前記第１の混合オリゴヌクレオ
チドからなるプライマー：からなる、１本鎖ＲＮＡを鋳
型として該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅するた
めのＮＡＳＢＡ用プライマーペア、又は（i）前記第３
のオリゴヌクレオチドからなるプライマー：及び（ii）
前記第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付
加されたＴ７プロモータからなるプライマー：からな
る、１本鎖ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本
鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペ
ア；を含む。この場合において、前記第１の混合オリゴ
ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２の
混合オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、
前記第３のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番
号７で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドで
ある。上記第１節（２）における本発明の第２の実施形
態に用いる場合には、本発明のプライマーセットは、以
下のプライマーペア：
ド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータからなる
プライマー：及び（ii）前記第１の混合オリゴヌクレオ
チドからなるプライマー：からなる、１本鎖ＲＮＡを鋳
型として該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅するた
めのＮＡＳＢＡ用プライマーペア、又は（i）前記第３
のオリゴヌクレオチドからなるプライマー：及び（ii）
前記第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付
加されたＴ７プロモータからなるプライマー：からな
る、１本鎖ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本
鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペ
ア；を含む。この場合において、前記第１の混合オリゴ
ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２の
混合オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、
前記第３のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番
号７で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドで
ある。上記第１節（２）における本発明の第２の実施形
態に用いる場合には、本発明のプライマーセットは、以
下のプライマーペア：
【００７７】（Ａ）（i）任意の複数の塩基配列からな
る第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加
されたＴ７プロモータからなるプライマー：並びに（i
i）任意の複数の塩基配列からなる第２の混合オリゴヌ
クレオチドからなるプライマー：からなる、テスタ及び
ドライバから抽出したＲＮＡを鋳型としてそれぞれの任
意の部分に相補な１本鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳ
ＢＡ用プライマーペア；
る第１の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加
されたＴ７プロモータからなるプライマー：並びに（i
i）任意の複数の塩基配列からなる第２の混合オリゴヌ
クレオチドからなるプライマー：からなる、テスタ及び
ドライバから抽出したＲＮＡを鋳型としてそれぞれの任
意の部分に相補な１本鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳ
ＢＡ用プライマーペア；
【００７８】（Ｂ）（i）前記第１の混合オリゴヌクレ
オチド及びその5'末端に付加された任意の１種の塩基配
列からなる第４のオリゴヌクレオチドからなるプライマ
ー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌクレオチド及
びその5'末端に付加されたＴ７プロモータからなるプラ
イマー：からなる、テスタ由来の相補的１本鎖ＲＮＡを
鋳型として該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する
ためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；
オチド及びその5'末端に付加された任意の１種の塩基配
列からなる第４のオリゴヌクレオチドからなるプライマ
ー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌクレオチド及
びその5'末端に付加されたＴ７プロモータからなるプラ
イマー：からなる、テスタ由来の相補的１本鎖ＲＮＡを
鋳型として該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅する
ためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；
【００７９】（Ｃ）（i）前記第１の混合オリゴヌクレ
オチド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータから
なるプライマー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌ
クレオチド及びその5'末端に付加されたオリゴｄＴから
なるプライマー：からなる、ドライバ由来の相補的１本
鎖ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡ
を増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；
オチド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータから
なるプライマー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌ
クレオチド及びその5'末端に付加されたオリゴｄＴから
なるプライマー：からなる、ドライバ由来の相補的１本
鎖ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡ
を増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；
【００８０】（Ｄ）（i）前記第４のオリゴヌクレオチ
ド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータからなる
プライマー：及び（ii）前記第２の混合オリゴヌクレオ
チドからなるプライマー：からなる、１本鎖ＲＮＡを鋳
型として該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅するた
めのＮＡＳＢＡ用プライマーペア、又は（i）前記第４
のオリゴヌクレオチドからなるプライマー：及び（ii）
前記第２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付
加されたＴ７プロモータからなるプライマー：からな
る、１本鎖ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本
鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペ
ア；を含む。この場合において、前記第１の混合オリゴ
ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２の
混合オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、
前記第４のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番
号７で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチドである。
ド及びその5'末端に付加されたＴ７プロモータからなる
プライマー：及び（ii）前記第２の混合オリゴヌクレオ
チドからなるプライマー：からなる、１本鎖ＲＮＡを鋳
型として該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅するた
めのＮＡＳＢＡ用プライマーペア、又は（i）前記第４
のオリゴヌクレオチドからなるプライマー：及び（ii）
前記第２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付
加されたＴ７プロモータからなるプライマー：からな
る、１本鎖ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本
鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペ
ア；を含む。この場合において、前記第１の混合オリゴ
ヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２の
混合オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、
前記第４のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番
号７で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチドである。
【００８１】さらに、上記のプライマー以外の試薬類を
本発明のプライマーセットに加えて、本発明の方法を実
施するためのキットとすることもできる。このような試
薬類としては、ＲＮＡ抽出用試薬、NASBA用試薬、電気
泳動用試薬などが挙げられるが、これらに限定されな
い。前記ＲＮＡ抽出用試薬としては、例えば、粉砕用緩
衝液、グアニジウムチオシアン酸塩、フェノール、クロ
ロホルム、ＳＤＳ、β−メルカプトエタノール等が挙げ
られる。前記NASBA用試薬としては、例えば、AMV-RT、R
NaseH、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、BSA（ウシ血清アルブ
ミン）、ヌクレオチド混合物、DTT、MgCl2、72％DMSO、
2M KCl、水等が挙げられる。前記電気泳動用試薬として
は、例えば、アガロース又はポリアクリルアミドゲル、
ローディング緩衝液、臭化エチジウム染色用試薬等が挙
げられる。
本発明のプライマーセットに加えて、本発明の方法を実
施するためのキットとすることもできる。このような試
薬類としては、ＲＮＡ抽出用試薬、NASBA用試薬、電気
泳動用試薬などが挙げられるが、これらに限定されな
い。前記ＲＮＡ抽出用試薬としては、例えば、粉砕用緩
衝液、グアニジウムチオシアン酸塩、フェノール、クロ
ロホルム、ＳＤＳ、β−メルカプトエタノール等が挙げ
られる。前記NASBA用試薬としては、例えば、AMV-RT、R
NaseH、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、BSA（ウシ血清アルブ
ミン）、ヌクレオチド混合物、DTT、MgCl2、72％DMSO、
2M KCl、水等が挙げられる。前記電気泳動用試薬として
は、例えば、アガロース又はポリアクリルアミドゲル、
ローディング緩衝液、臭化エチジウム染色用試薬等が挙
げられる。
【００８２】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的
に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのも
のであり、本発明の技術的範囲を制限するものではな
い。 〔実施例１〕キュウリモザイクウイルスＹ株（CMV-Y）
に感染したトマト葉と、CMV-Yに感染していない健全ト
マト葉に対して、本発明のｃＤＮＡサブトラクション法
を行った。なお、以下の実験において、ＮＡＳＢＡはＮ
ＡＳＢＡ増幅キット（オルガノテクニカ）を用い、添付
の説明書に従って行った。
に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのも
のであり、本発明の技術的範囲を制限するものではな
い。 〔実施例１〕キュウリモザイクウイルスＹ株（CMV-Y）
に感染したトマト葉と、CMV-Yに感染していない健全ト
マト葉に対して、本発明のｃＤＮＡサブトラクション法
を行った。なお、以下の実験において、ＮＡＳＢＡはＮ
ＡＳＢＡ増幅キット（オルガノテクニカ）を用い、添付
の説明書に従って行った。
【００８３】（１）トマト葉からのＲＮＡの抽出 接種３週間後のキュウリモザイクウイルス（CMV-Y）感
染トマトと、同様に育てた健全トマトの葉をそれぞれ10
0mgずつ採取し、これを液体窒素で凍結し、ＲＮＡ抽出
キットであるRNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）に
より全ＲＮＡを抽出した。
染トマトと、同様に育てた健全トマトの葉をそれぞれ10
0mgずつ採取し、これを液体窒素で凍結し、ＲＮＡ抽出
キットであるRNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社）に
より全ＲＮＡを抽出した。
【００８４】（２）ＮＡＳＢＡ法による１本鎖ＲＮＡの
増幅 上記（１）で得られた各抽出ＲＮＡ約300ngを鋳型と
し、以下の配列を有するT7DP1及びDP2Ecoをプライマー
として用いるＮＡＳＢＡを行った。ＮＡＳＢＡの温度条
件は、65℃で５分間、酵素溶液を加えて30℃で２分間、
さらに41℃で９０分間とした。 T7DP1：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGAGTCGACAGCRTKTGHA
WCDKCCA（配列番号２） DP2Eco：AGGCGTGAGWGHCTTVMGKRTGA（配列番号４）
増幅 上記（１）で得られた各抽出ＲＮＡ約300ngを鋳型と
し、以下の配列を有するT7DP1及びDP2Ecoをプライマー
として用いるＮＡＳＢＡを行った。ＮＡＳＢＡの温度条
件は、65℃で５分間、酵素溶液を加えて30℃で２分間、
さらに41℃で９０分間とした。 T7DP1：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGAGTCGACAGCRTKTGHA
WCDKCCA（配列番号２） DP2Eco：AGGCGTGAGWGHCTTVMGKRTGA（配列番号４）
【００８５】DNase I（RNase free、TaKaRa）溶液１μl
を加え、37℃で1時間保温してフェノール・クロロホル
ム抽出後、エタノール沈殿により核酸を回収した。滅菌
蒸留水100μlに溶解させ、ゲル濾過マイクロスピンカラ
ム（MicroSpin Columns S-400、アマシャムファルマシ
ア）により、添付の説明書に従って、低分子化したＤＮ
Ａを取り除き、増幅した相補ＲＮＡを分画した。
を加え、37℃で1時間保温してフェノール・クロロホル
ム抽出後、エタノール沈殿により核酸を回収した。滅菌
蒸留水100μlに溶解させ、ゲル濾過マイクロスピンカラ
ム（MicroSpin Columns S-400、アマシャムファルマシ
ア）により、添付の説明書に従って、低分子化したＤＮ
Ａを取り除き、増幅した相補ＲＮＡを分画した。
【００８６】上記のように得られたCMV感染トマト由来
の相補ＲＮＡ（１μl/100μl）を鋳型とし、上記T7DP1
と以下の配列を有するDP32をプライマーとして用いるＮ
ＡＳＢＡにより、3'末端にDP3の配列を付加した相補Ｒ
ＮＡを４１℃で増幅した。 DP32:AGAAGGCTGCAGCTGATCTGTAAGGCGTGAGWGHCTTVMGKRTGA
（配列番号６） DP3: AGAAGGCTGCAGCTGATCTGTA（配列番号７）
の相補ＲＮＡ（１μl/100μl）を鋳型とし、上記T7DP1
と以下の配列を有するDP32をプライマーとして用いるＮ
ＡＳＢＡにより、3'末端にDP3の配列を付加した相補Ｒ
ＮＡを４１℃で増幅した。 DP32:AGAAGGCTGCAGCTGATCTGTAAGGCGTGAGWGHCTTVMGKRTGA
（配列番号６） DP3: AGAAGGCTGCAGCTGATCTGTA（配列番号７）
【００８７】同様にして、上記のように得られた健全ト
マト由来の相補ＲＮＡ（１μl/100μl）を鋳型とし、以
下の配列を有するTTTDP1とT7DP2Ecoをプライマーとして
用いるＮＡＳＢＡにより、抽出ＲＮＡに対する相同ＲＮ
Ａを増幅した。 TTTDP1: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCGACAGCRTKTGH
AWCDKCCA（配列番号３） T7DP2Eco: GGAATTATAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCGTGAGW
GHCTTVMGKRTGA（配列番号５）
マト由来の相補ＲＮＡ（１μl/100μl）を鋳型とし、以
下の配列を有するTTTDP1とT7DP2Ecoをプライマーとして
用いるＮＡＳＢＡにより、抽出ＲＮＡに対する相同ＲＮ
Ａを増幅した。 TTTDP1: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCGACAGCRTKTGH
AWCDKCCA（配列番号３） T7DP2Eco: GGAATTATAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCGTGAGW
GHCTTVMGKRTGA（配列番号５）
【００８８】DNase I（RNase free、TaKaRa）溶液１μl
を加え、37℃で1時間保温してフェノール・クロロホル
ム抽出後、エタノール沈殿により核酸を回収した。滅菌
蒸留水100μlに溶解させ、ゲル濾過マイクロスピンカラ
ム（MicroSpin Columns S-400、アマシャムファルマシ
ア）により、添付の説明書に従って、低分子化したＤＮ
Ａを取り除き、増幅したＲＮＡを分画した。
を加え、37℃で1時間保温してフェノール・クロロホル
ム抽出後、エタノール沈殿により核酸を回収した。滅菌
蒸留水100μlに溶解させ、ゲル濾過マイクロスピンカラ
ム（MicroSpin Columns S-400、アマシャムファルマシ
ア）により、添付の説明書に従って、低分子化したＤＮ
Ａを取り除き、増幅したＲＮＡを分画した。
【００８９】（３）サブトラクティブ・ハイブリダイゼ
ーション HEPES緩衝液（100mM HEPES、1M NaCl、0.04mM EDTA）10
μlと１μl（/100μl）のCMV感染トマト由来の相補ＲＮ
Ａ、９μl（/100μl）の健全トマト由来の相同ＲＮＡを
混合し、98℃で1.5分間変性後、68℃で一晩ハイブリダ
イゼーションを行った。98℃で1.5分間変性した健全ト
マト由来の相同ＲＮＡ10μlとHEPES緩衝液10μlを前記
のハイブリダイゼーション溶液に加え、さらに一晩ハイ
ブリダイゼーションを行った。
ーション HEPES緩衝液（100mM HEPES、1M NaCl、0.04mM EDTA）10
μlと１μl（/100μl）のCMV感染トマト由来の相補ＲＮ
Ａ、９μl（/100μl）の健全トマト由来の相同ＲＮＡを
混合し、98℃で1.5分間変性後、68℃で一晩ハイブリダ
イゼーションを行った。98℃で1.5分間変性した健全ト
マト由来の相同ＲＮＡ10μlとHEPES緩衝液10μlを前記
のハイブリダイゼーション溶液に加え、さらに一晩ハイ
ブリダイゼーションを行った。
【００９０】前記のハイブリダイゼーション溶液２μl
とHEPES緩衝液８μl、オリゴdTラテックス懸濁溶液（ol
igotex-dT30、TaKaRa）10μlを混合し、65℃で５分間、
37℃で10分間保温した。15,000 rpmで３分間遠心分離し
て上清を採取した。こうして、健全トマト由来のアデニ
ン基の連続配列が付加された相同ＲＮＡと、これとハイ
ブリッドを形成したCMV感染トマト由来の相補ＲＮＡを
取り除き、CMV感染トマトにおける特異ＲＮＡ由来のＲ
ＮＡ断片を単離した。
とHEPES緩衝液８μl、オリゴdTラテックス懸濁溶液（ol
igotex-dT30、TaKaRa）10μlを混合し、65℃で５分間、
37℃で10分間保温した。15,000 rpmで３分間遠心分離し
て上清を採取した。こうして、健全トマト由来のアデニ
ン基の連続配列が付加された相同ＲＮＡと、これとハイ
ブリッドを形成したCMV感染トマト由来の相補ＲＮＡを
取り除き、CMV感染トマトにおける特異ＲＮＡ由来のＲ
ＮＡ断片を単離した。
【００９１】（４）単離した塩基配列のＮＡＳＢＡ及び
ＰＣＲによる増幅 上記（３）で得られた遠心分離後の上清１μlを鋳型と
し、オリゴヌクレオチドT7DP3及びDP1Salをプライマー
として用いるＮＡＳＢＡにより、単離した相補ＲＮＡか
ら相同ＲＮＡを増幅した。温度条件は、65°Cで５分
間、酵素混合液を加えて41°Cで３０分間とし、その
後、この反応液を氷上に置いて反応を停止した。特異遺
伝子から増幅した部分的相同ＲＮＡを５％未変性アクリ
ルアミドゲルで電気泳動して銀染色した結果を図３に示
す。
ＰＣＲによる増幅 上記（３）で得られた遠心分離後の上清１μlを鋳型と
し、オリゴヌクレオチドT7DP3及びDP1Salをプライマー
として用いるＮＡＳＢＡにより、単離した相補ＲＮＡか
ら相同ＲＮＡを増幅した。温度条件は、65°Cで５分
間、酵素混合液を加えて41°Cで３０分間とし、その
後、この反応液を氷上に置いて反応を停止した。特異遺
伝子から増幅した部分的相同ＲＮＡを５％未変性アクリ
ルアミドゲルで電気泳動して銀染色した結果を図３に示
す。
【００９２】図３において、レーンC/Hhは、サブトラク
ティブハイブリダイゼーションとその後の操作により単
離したＲＮＡ断片からの増幅産物を示し、レーンCは、C
MV感染トマト由来の相補ＲＮＡからサブトラクションを
経ずに増幅した産物を示す。レーンHとH/Hhは、陰性の
対照として健全トマトからの抽出ＲＮＡから同様に単離
した増幅産物を示す。すなわち、レーンH/Hhは、健全ト
マトからの抽出ＲＮＡから相補ＲＮＡを増幅し、同じ健
全トマトからの抽出ＲＮＡから増幅した相同ＲＮＡとの
間でサブトラクティブハイブリダイゼーションを行って
単離した増幅産物を示し、レーンHは、健全トマト由来
の相補ＲＮＡからサブトラクションを経ずに増幅した産
物を示す。レーンMは、1本鎖ＲＮＡのサイズマーカーを
示す。
ティブハイブリダイゼーションとその後の操作により単
離したＲＮＡ断片からの増幅産物を示し、レーンCは、C
MV感染トマト由来の相補ＲＮＡからサブトラクションを
経ずに増幅した産物を示す。レーンHとH/Hhは、陰性の
対照として健全トマトからの抽出ＲＮＡから同様に単離
した増幅産物を示す。すなわち、レーンH/Hhは、健全ト
マトからの抽出ＲＮＡから相補ＲＮＡを増幅し、同じ健
全トマトからの抽出ＲＮＡから増幅した相同ＲＮＡとの
間でサブトラクティブハイブリダイゼーションを行って
単離した増幅産物を示し、レーンHは、健全トマト由来
の相補ＲＮＡからサブトラクションを経ずに増幅した産
物を示す。レーンMは、1本鎖ＲＮＡのサイズマーカーを
示す。
【００９３】レーンC/Hhでは、レーンCと比較して、い
くつかのバンドが選択的に増幅されている。同じ抽出Ｒ
ＮＡ由来の相補ＲＮＡと相同ＲＮＡの間でサブトラクテ
ィブハイブリダイゼーションしたレーンH/Hhは、予測さ
れたとおり全てのバンドが取り除かれ、ほとんど増幅断
片が見られなかった。また、レーンCとレーンHの間で同
じ位置に検出されたバンドの中には、共通に発現してい
る遺伝子由来のＲＮＡ断片が含まれていると考えられ、
もし、そのバンド中の全ての断片が共通に発現している
遺伝子由来であれば、サブトラクションにより取り除か
れるはずである。実際に、それらのバンドのいくつか
は、サブトラクションを経たレーンC/Hhにおいて消失
し、感染と健全の両トマトで発現している遺伝子由来の
ＲＮＡは取り除かれていると考えられた。
くつかのバンドが選択的に増幅されている。同じ抽出Ｒ
ＮＡ由来の相補ＲＮＡと相同ＲＮＡの間でサブトラクテ
ィブハイブリダイゼーションしたレーンH/Hhは、予測さ
れたとおり全てのバンドが取り除かれ、ほとんど増幅断
片が見られなかった。また、レーンCとレーンHの間で同
じ位置に検出されたバンドの中には、共通に発現してい
る遺伝子由来のＲＮＡ断片が含まれていると考えられ、
もし、そのバンド中の全ての断片が共通に発現している
遺伝子由来であれば、サブトラクションにより取り除か
れるはずである。実際に、それらのバンドのいくつか
は、サブトラクションを経たレーンC/Hhにおいて消失
し、感染と健全の両トマトで発現している遺伝子由来の
ＲＮＡは取り除かれていると考えられた。
【００９４】次いで、上記のようにして単離した相補Ｒ
ＮＡからの増幅産物（１μl/20μl）を鋳型としてＰＣ
Ｒを行った。該ＰＣＲは、増幅集団の各分子種の比率を
保つために定量的ＰＣＲ（18サイクル）とし、DP3（T7D
P3においてプロモーター配列を除いたもの）とDP1Salを
プライマーとして用いた。 DP3: AGAAGGCTGCAGCTGATCTGTA（配列番号７） DP1Sal: GAGTCGACAGCRTKTGHAWCDKCCA（配列番号１） なお、上記ＰＣＲは、ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼ：Ｅ
ｘ−Ｔａｑ（TaKaRa社製）を用い、添付の説明書に従っ
て行った。温度条件は、９４℃で２分間に続いて、９４
℃で１分間−６０℃で１分間−７２℃で２分間を１８サ
イクル、その後に、７２℃で８分間とした。増幅産物を
アガロースゲルで電気泳動した結果を図４に示す。
ＮＡからの増幅産物（１μl/20μl）を鋳型としてＰＣ
Ｒを行った。該ＰＣＲは、増幅集団の各分子種の比率を
保つために定量的ＰＣＲ（18サイクル）とし、DP3（T7D
P3においてプロモーター配列を除いたもの）とDP1Salを
プライマーとして用いた。 DP3: AGAAGGCTGCAGCTGATCTGTA（配列番号７） DP1Sal: GAGTCGACAGCRTKTGHAWCDKCCA（配列番号１） なお、上記ＰＣＲは、ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼ：Ｅ
ｘ−Ｔａｑ（TaKaRa社製）を用い、添付の説明書に従っ
て行った。温度条件は、９４℃で２分間に続いて、９４
℃で１分間−６０℃で１分間−７２℃で２分間を１８サ
イクル、その後に、７２℃で８分間とした。増幅産物を
アガロースゲルで電気泳動した結果を図４に示す。
【００９５】図４において、レーンC及びC/Hhは、それ
ぞれ、図３における同じ名称のレーンの増幅産物から増
幅したＤＮＡ断片を示す。レーンC/2Hhは、一晩サブト
ラクティブハイブリダイゼーションをした後、さらに健
全トマト由来の相同ＲＮＡを加えてもう一晩ハイブリダ
イゼーションした結果で、レーンC//Hhは、オリゴdTラ
テックス粒子による非特異断片の除去を２回行ったもの
である。レーンC及びC/Hhは、それぞれ、図３の結果を
反映した結果となった。また、レーンC/2Hhにおいて、
増幅バンドの選択の強度が増していること思われた。
ぞれ、図３における同じ名称のレーンの増幅産物から増
幅したＤＮＡ断片を示す。レーンC/2Hhは、一晩サブト
ラクティブハイブリダイゼーションをした後、さらに健
全トマト由来の相同ＲＮＡを加えてもう一晩ハイブリダ
イゼーションした結果で、レーンC//Hhは、オリゴdTラ
テックス粒子による非特異断片の除去を２回行ったもの
である。レーンC及びC/Hhは、それぞれ、図３の結果を
反映した結果となった。また、レーンC/2Hhにおいて、
増幅バンドの選択の強度が増していること思われた。
【００９６】レーンC/2HhのｃＤＮＡを、プラスミドベ
クターpGEM-T（プロメガ）に組み込んでクローニングし
た。40のクローンについて塩基配列を調べた結果、５ク
ローンはCMVの分節ゲノム３における一部分の配列であ
ることがわかった。CMVゲノムは、当然のことながら、
感染トマトにのみ存在するのであるから、上記のサブト
ラクティブハイブリダイゼーション法により感染トマト
に特異的なＲＮＡを選択できることがわかった。他のク
ローンについては、約１０種類ほどに分けられ、DDBJ
（DNA Data Bank of Japan、http://www.ddbj.nig.ac.j
p/）により相同性探索を行った結果、両組織に存在する
リボゾームＲＮＡやトランスファーＲＮＡ由来と思われ
るｃＤＮＡ断片はなく、またORFと思われるフレームが
存在することから何らかの遺伝子をコードするｍＲＮＡ
の一部配列であることが考えられた。その中の1クロー
ンはムギの機能不明のタンパク質をコードする遺伝子と
約８０％の相同性があった。
クターpGEM-T（プロメガ）に組み込んでクローニングし
た。40のクローンについて塩基配列を調べた結果、５ク
ローンはCMVの分節ゲノム３における一部分の配列であ
ることがわかった。CMVゲノムは、当然のことながら、
感染トマトにのみ存在するのであるから、上記のサブト
ラクティブハイブリダイゼーション法により感染トマト
に特異的なＲＮＡを選択できることがわかった。他のク
ローンについては、約１０種類ほどに分けられ、DDBJ
（DNA Data Bank of Japan、http://www.ddbj.nig.ac.j
p/）により相同性探索を行った結果、両組織に存在する
リボゾームＲＮＡやトランスファーＲＮＡ由来と思われ
るｃＤＮＡ断片はなく、またORFと思われるフレームが
存在することから何らかの遺伝子をコードするｍＲＮＡ
の一部配列であることが考えられた。その中の1クロー
ンはムギの機能不明のタンパク質をコードする遺伝子と
約８０％の相同性があった。
【００９７】
【発明の効果】本発明により、広範の機能又は形質を示
す細胞組織に特異的に発現する遺伝子や病原体のＲＮＡ
由来の部分配列を有する核酸を単離・増幅することが可
能となり、さらに、これらをクローニングすることが可
能となる。
す細胞組織に特異的に発現する遺伝子や病原体のＲＮＡ
由来の部分配列を有する核酸を単離・増幅することが可
能となり、さらに、これらをクローニングすることが可
能となる。
【００９８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director-General of National Institute of Fruit Tree Science, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries <120> Novel cDNA Subtraction Method <130> P00-0049 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized oligonucleotide <400> 1 gagtcgacag crtktghawc dkcca 25 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized oligonucleotide <400> 2 aattctaata cgactcacta taggggagtc gacagcrtkt ghawcdkcca 50 <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized oligonucleotide <400> 3 tttttttttt tttttttttt tttttttgtc gacagcrtkt ghawcdkcca 50 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized oligonucleotide <400> 4 aggcgtgagw ghcttvmgkr tga 23 <210> 5 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized oligonucleotide <400> 5 ggaattataa tacgactcac tatagggaga aggcgtgagw ghcttvmgkr tga 53 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized oligonucleotide <400> 6 agaaggctgc agctgatctg taaggcgtga gwghcttvmg krtga 45 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized oligonucleotide <400> 7 agaaggctgc agctgatctg ta 22 <210> 8 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized oligonucleotide <400> 8 ggaattctaa tacgactcac tatagggaga aggctgcagc tgacatgta 49
【００９９】
【配列表フリーテキスト】配列番号１〜８：合成オリゴ
ヌクレオチド
ヌクレオチド
【図１】本発明の具体的な実施形態を示す図である。
【図２】本発明の具体的な実施形態を示す図である。
【図３】ＮＡＳＢＡを用いる本発明の方法により、ＣＭ
Ｖ感染トマト及び健全トマトから増幅されたＲＮＡ断片
の電気泳動写真である。
Ｖ感染トマト及び健全トマトから増幅されたＲＮＡ断片
の電気泳動写真である。
【図４】ＮＡＳＢＡを用いる本発明の方法により、ＣＭ
Ｖ感染トマト及び健全トマトから増幅されたＲＮＡ断片
のｃＤＮＡの電気泳動写真である。
Ｖ感染トマト及び健全トマトから増幅されたＲＮＡ断片
のｃＤＮＡの電気泳動写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA01 CA03 DA01 DA06 EA04 FA02 HA14 HA19 4B063 QA01 QQ04 QQ52 QR36 QR62 QS25 4B065 AA89X AA95Y AB01 BA02 CA24 CA46 CA60
Claims (13)
- 【請求項１】 ある生物組織（テスタ）と別の生物組織
（ドライバ）由来のｍＲＮＡを含むＲＮＡにおいて、テ
スタに特異的に存在する遺伝子の部分塩基配列を含む核
酸を単離及び増幅する方法であって、テスタ及びドライ
バの一方に由来するＲＮＡに相同的な一本鎖核酸と、他
方に由来するＲＮＡに相補的な一本鎖核酸との間でのハ
イブリダイゼーションを行うことを特徴とする前記方
法。 - 【請求項２】 以下の工程： （Ａ）テスタ及びドライバから抽出したＲＮＡを鋳型と
して、テスタの抽出ＲＮＡに相補若しくは相同な任意の
部分塩基配列を含む１本鎖核酸、及びドライバの抽出Ｒ
ＮＡに相同若しくは相補な任意の部分塩基配列を含む１
本鎖核酸を増幅する工程； （Ｂ）テスタ由来の１本鎖核酸と過剰量のドライバ由来
の１本鎖核酸との間でハイブリダイゼーションを行っ
て、２本鎖を形成した核酸を除去する工程；及び （Ｃ）前記（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼーショ
ンされなかった１本鎖核酸に相同又は相補な１本鎖核酸
を増幅する工程；を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記１本鎖核酸が１本鎖ＲＮＡである請
求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 前記（Ａ）及び（Ｃ）の工程が、任意の
複数の塩基配列からなる混合プライマーのペアを用いる
ＮＡＳＢＡによって１本鎖ＲＮＡを増幅することを含む
請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 以下の工程： （Ｄ）前記（Ｃ）の工程で増幅される１本鎖核酸を鋳型
として、２本鎖ＤＮＡを増幅する工程； をさらに含む請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 ある生物組織（テスタ）と別の生物組織
（ドライバ）由来のｍＲＮＡを含むＲＮＡにおいて、テ
スタに特異的に存在する遺伝子の部分塩基配列を含むＤ
ＮＡをクローニングする方法であって、テスタ及びドラ
イバの一方に由来するＲＮＡに相同的な一本鎖核酸と、
他方に由来するＲＮＡに相補的な一本鎖核酸との間での
ハイブリダイゼーションを行うことを特徴とする前記方
法。 - 【請求項７】 以下の工程： （Ａ）テスタ及びドライバから抽出したＲＮＡを鋳型と
して、テスタの抽出ＲＮＡに相補若しくは相同な任意の
部分塩基配列を含む１本鎖核酸、及びドライバの抽出Ｒ
ＮＡに相同若しくは相補な任意の部分塩基配列を含む１
本鎖核酸を増幅する工程； （Ｂ）テスタ由来の１本鎖核酸と過剰量のドライバ由来
の１本鎖核酸との間でハイブリダイゼーションを行っ
て、２本鎖を形成した核酸を除去する工程； （Ｃ）前記（Ｂ）の工程においてハイブリダイゼーショ
ンされなかった１本鎖核酸に相同又は相補な１本鎖核酸
を増幅する工程； （Ｄ）前記（Ｃ）の工程で増幅される１本鎖核酸を鋳型
として、２本鎖ＤＮＡを増幅する工程；及び （Ｅ）前記（Ｄ）の工程で増幅される２本鎖ＤＮＡをベ
クター中に組み込み、得られる組換えベクターを用いて
宿主を形質転換する工程； を含む請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 前記１本鎖核酸が１本鎖ＲＮＡである請
求項６又は７記載の方法。 - 【請求項９】 前記（Ａ）及び（Ｃ）の工程が、任意の
複数の塩基配列からなる混合プライマーのペアを用いる
ＮＡＳＢＡによって１本鎖ＲＮＡを増幅することを含む
請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 以下のプライマーペア： （Ａ）（i）任意の複数の塩基配列からなる第１の混合
オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加されたＴ７プ
ロモータからなるプライマー：並びに（ii）任意の複数
の塩基配列からなる第２の混合オリゴヌクレオチドから
なるプライマー：からなる、テスタ及びドライバから抽
出したＲＮＡを鋳型としてそれぞれの任意の部分に相補
な１本鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマ
ーペア； （Ｂ）（i）前記第１の混合オリゴヌクレオチド及びそ
の5'末端に付加されたＴ７プロモータからなるプライマ
ー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌクレオチド及
びその5'末端に付加された任意の１種の塩基配列からな
る第３のオリゴヌクレオチドからなるプライマー：から
なる、テスタ由来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として該
ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳ
ＢＡ用プライマーペア； （Ｃ）（i）前記第１の混合オリゴヌクレオチド及びそ
の5'末端に付加されたオリゴｄＴからなるプライマー：
並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌクレオチド及びそ
の5'末端に付加されたＴ７プロモータからなるプライマ
ー：からなる、ドライバ由来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳
型として該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅するた
めのＮＡＳＢＡ用プライマーペア； （Ｄ）（i）前記第３のオリゴヌクレオチド及びその5'
末端に付加されたＴ７プロモータからなるプライマー：
及び（ii）前記第１の混合オリゴヌクレオチドからなる
プライマー：からなる、１本鎖ＲＮＡを鋳型として該Ｒ
ＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳＢ
Ａ用プライマーペア、又は（i）前記第３のオリゴヌク
レオチドからなるプライマー：及び（ii）前記第１の混
合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加されたＴ７
プロモータからなるプライマー：からなる、１本鎖ＲＮ
Ａを鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅
するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；を含む、テス
タとドライバ由来のｍＲＮＡを含むＲＮＡにおいて、テ
スタに特異的に存在する遺伝子の部分塩基配列を含む核
酸を単離及び増幅するためのプライマーセット。 - 【請求項１１】 前記第１の混合オリゴヌクレオチドが
配列番号１で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チドであり、前記第２の混合オリゴヌクレオチドが配列
番号４で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
であり、前記第３のオリゴヌクレオチドが配列番号７で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである請
求項１０記載のプライマーセット。 - 【請求項１２】 以下のプライマーペア： （Ａ）（i）任意の複数の塩基配列からなる第１の混合
オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加されたＴ７プ
ロモータからなるプライマー：並びに（ii）任意の複数
の塩基配列からなる第２の混合オリゴヌクレオチドから
なるプライマー：からなる、テスタ及びドライバから抽
出したＲＮＡを鋳型としてそれぞれの任意の部分に相補
な１本鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳＢＡ用プライマ
ーペア； （Ｂ）（i）前記第１の混合オリゴヌクレオチド及びそ
の5'末端に付加された任意の１種の塩基配列からなる第
４のオリゴヌクレオチドからなるプライマー：並びに
（ii）前記第２の混合オリゴヌクレオチド及びその5'末
端に付加されたＴ７プロモータからなるプライマー：か
らなる、テスタ由来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳型として
該ＲＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡ
ＳＢＡ用プライマーペア； （Ｃ）（i）前記第１の混合オリゴヌクレオチド及びそ
の5'末端に付加されたＴ７プロモータからなるプライマ
ー：並びに（ii）前記第２の混合オリゴヌクレオチド及
びその5'末端に付加されたオリゴｄＴからなるプライマ
ー：からなる、ドライバ由来の相補的１本鎖ＲＮＡを鋳
型として該ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅するた
めのＮＡＳＢＡ用プライマーペア； （Ｄ）（i）前記第４のオリゴヌクレオチド及びその5'
末端に付加されたＴ７プロモータからなるプライマー：
及び（ii）前記第２の混合オリゴヌクレオチドからなる
プライマー：からなる、１本鎖ＲＮＡを鋳型として該Ｒ
ＮＡに相補的な１本鎖ＲＮＡを増幅するためのＮＡＳＢ
Ａ用プライマーペア、又は（i）前記第４のオリゴヌク
レオチドからなるプライマー：及び（ii）前記第２の混
合オリゴヌクレオチド及びその5'末端に付加されたＴ７
プロモータからなるプライマー：からなる、１本鎖ＲＮ
Ａを鋳型として該ＲＮＡに相同的な１本鎖ＲＮＡを増幅
するためのＮＡＳＢＡ用プライマーペア；を含む、テス
タとドライバ由来のｍＲＮＡを含むＲＮＡにおいて、テ
スタに特異的に存在する遺伝子の部分塩基配列を含む核
酸を単離及び増幅するためのプライマーセット。 - 【請求項１３】 前記第１の混合オリゴヌクレオチドが
配列番号１で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チドであり、前記第２の混合オリゴヌクレオチドが配列
番号４で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
であり、前記第４のオリゴヌクレオチドが配列番号７で
表わされる塩基配列に相補的な塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチドである請求項１２記載のプライマーセット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000084213A JP3459977B2 (ja) | 2000-03-24 | 2000-03-24 | 新規なｃＤＮＡサブトラクション法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000084213A JP3459977B2 (ja) | 2000-03-24 | 2000-03-24 | 新規なｃＤＮＡサブトラクション法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001269172A true JP2001269172A (ja) | 2001-10-02 |
| JP3459977B2 JP3459977B2 (ja) | 2003-10-27 |
Family
ID=18600721
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000084213A Expired - Lifetime JP3459977B2 (ja) | 2000-03-24 | 2000-03-24 | 新規なｃＤＮＡサブトラクション法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3459977B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7749707B2 (en) | 2005-03-01 | 2010-07-06 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Method for obtaining subtraction polynucleotide |
-
2000
- 2000-03-24 JP JP2000084213A patent/JP3459977B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7749707B2 (en) | 2005-03-01 | 2010-07-06 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Method for obtaining subtraction polynucleotide |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3459977B2 (ja) | 2003-10-27 |
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