JP2001238555A - アミノ酸組成が改良されたトランスジェニック植物の作出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決課題】 植物の可食部分における遊離アミノ酸、
特にグルタミン酸、アルパラギン、アスパラギン酸、セ
リン、スレオニン、アラニン、およびヒスチジンの少な
くとも一つの遊離アミノ酸を高度に蓄積するトランスジ
ェニック植物およびその作出方法を提供する。 【解決手段】 グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡ
Ｄ）遺伝子をアンチセンス方向に、植物細胞における遺
伝子発現のために適切な制御配列と共に植物に導入し、
ＧＡＤ遺伝子の発現を抑制する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遊離アミノ酸含量
が増強されたトランスジェニックトマトの作製方法、作
製されたトランスジェニックトマトに関する。より具体
的には、本発明は、アスパラギン、アスパラギン酸、セ
リン、スレオニン、アラニン、ヒスチジンおよびグルタ
ミン酸の少なくとも１つを高蓄積するトランスジェニッ
クトマトの作製方法およびその方法により作製されたト
ランスジェニックトマトに関する。

【０００２】

【従来の技術】植物に特定の遺伝子を導入し形質転換さ
せる技術が世界で初めて報告されたのは土壌細菌、Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用
いてタバコに遺伝子を導入した研究であり、その後多く
の有用農業形質を付与した作物が作出され、植物に有用
成分を作らせる試みも行われてきた。このようなトラン
スジェニック植物作成技術を用いた植物育種法は、交配
等による従来の伝統的な育種に代わるものとして有望視
されている。その中で窒素同化に関する植物の特性改良
の研究も進められてきており、特にアミノ酸は窒素代謝
産物の中でも果実、根菜類の根、種子などにおいて重要
な成分であり、また食味にも大きく影響を与えることか
ら盛んに研究が行われてきている。

【０００３】アミノ酸の生合成に関する研究としては、
例えば、大腸菌由来ＤＨＤＰＳ遺伝子をタバコに導入
し、遊離リジンが２００倍上昇したという報告（米国特
許第５２５８３００号、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ Ｒｅｓ．＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ａ
Ｋ遺伝子の導入により遊離リジンが増加したという報告
（ＥＰ４８５９７０，ＷＯ９３１９１９０）、ＡＳ遺伝
子をタバコに導入し、Ａｓｎ含量が１００倍上昇したと
いう報告（ＷＯ ９５０９９１１，Ｕｎｉｖ Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，ＷＯ ９０１５３３， Ｕｎｉｖ Ｒｏｃｋ
ｆｅｌｌｅｒ）、アントラニル酸合成酵素をイネに導入
しトリプトファン含量が９０倍上昇したという報告（Ｗ
Ｏ ９７２６３６６，ＤＥＫＡＬＢ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｃｏｒｐ）がなされている。遺伝子導入の対象となる植
物はタバコ、シロイヌナズナ等のモデル植物に限られ
ず、トマトなどの果実をもつ植物も利用されている。例
えば、トマトについては１９８６年にアグロバクテリウ
ム法を用いて形質転換体が作出され（Ｓ．ＭｃＣｏｒｍ
ｉｃｋ，Ｊ．Ｎｉｅｄｅｒｍｅｙｅｒ，Ｊ．Ｆｒｙ，
Ａ．Ｂａｒｎａｓｏｎ，Ｒ．Ｈｏｒｓｃｈ ａｎｄ
Ｒ．Ｆｒａｌｅｙ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒ
ｔｓ，５，８１−８４（１９８６）；Ｙ．Ｓ．Ｃｈｙ
ｉ，Ｒ．Ａ．Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ，Ｄ．Ｇｏｌｄｓｔｅ
ｒｎ，Ｓ．Ｄ．Ｔａｒｋｓｌｅｙ ａｎｄ Ｆ．Ｌｏａ
ｉｚａ−Ｆｉｇｕｅｒｏｅ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．，２０４，６４−６９（１９８６））、それ以来形
質転換系の改良がなされてきている。また、アミノ酸生
合成、窒素同化に関与する遺伝子は上述の他にも多数知
られており、アスパラギナーゼ、ＧＯＧＡＴ等が含ま
れ、これらの塩基配列も報告されている。

【０００４】ここで、特にα−アミノ酸の一種であるグ
ルタミン酸は、一般にタンパク質中に広く分布し、調味
用途として使用されているトマトのうま味成分や、ダイ
ズではその醸造食品（例えば、醤油、ミソなど）中のう
ま味成分は、いずれもグルタミン酸であることが知られ
ており、高等植物では窒素代謝の最初の段階で合成され
ることが知られている。また、グルタミン酸より生じた
グルタミン、アスパラギンが篩管を経由して各組織に分
配されその他のアミノ酸合成、タンパク質合成に用いら
れることが分かっている。植物においては、スクロース
やアミノ酸などの光合成産物の輸送経路である篩管には
高濃度に存在する例が報告されている（茅野充男ら、植
物栄養・肥料学ｐ１２５（１９９３））が、可食部分に
高濃度に含まれる例としては、トマト果実に０．２５ｇ
／１００ｇｆ．ｗ．程度含まれる例（ときめき２号、日
本食品工業学会誌、第３９巻、ｐ６４−６７（１９９
２））が知られている。しかしながら、グルタミン酸の
場合は、ソース器官での生合成能が向上できたとしても
アミノ基供与の出発物質であり、前述のように種々の生
合成経路で代謝されるため、植物体中でグルタミン酸を
高濃度に蓄積させるのは容易ではない。

【０００５】交配育種、遺伝子操作を問わず、これまで
グルタミン酸の濃度を植物体の可食部分中で飛躍的に高
めるのに成功した例は出願人の知る限り見当たらない。
例えば、ＧＤＨ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝
子を導入したトランスジェニック植物が作製されてお
り、大腸菌由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼＧＤＨ
（ＮＡＤＰ−ＧＤＨ）を除草剤フォスフィノスリシン耐
性付与を目的としてタバコとトウモロコシに導入したと
ころ、根でグルタミン酸含量が１．３〜１．４倍増加し
たことが報告されており（Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔ Ｄａｖ
ｉｄら、ＣＡ２１８０７８６（１９９６）、この報告で
は、タバコの根において、１４．７ｍｇ／１００ｇｆ．
ｗ．であったグルタミン酸含量が２０．６ｍｇ／１００
ｇｆ．ｗ．に、トウモロコシの根において１６．２ｍｇ
／１００ｇｆ．ｗ．であったグルタミン酸含量が１９．
１ｍｇ／１００ｇｆ．ｗ．に増大した。これ以外にも、
ＧＤＨ遺伝子の利用について記載された報告はあるが、
実施例は示されていない（ＷＯ９５０９９１１、クロレ
ラ由来のα、β−サブユニット（ＷＯ９７１２９８
３））。またグルタミン酸族アミノ酸についての分析値
も示されていない。

【０００６】無機窒素を有機体に同化する第一段階は、
上述したように主にグルタミンを生成するためのグルタ
ミン酸へのアンモニアの取り込みであり、これはグルタ
ミンシンテターゼ酵素（ＧＳ）により触媒される。次い
で、このグルタミンは、α−ケトグルタル酸とから、グ
ルタミン酸シンターゼ（ＧＯＧＡＴ）に触媒され、２分
子のグルタミン酸が生成される。このＧＳ／ＧＯＧＡサ
イクルが、植物における窒素同化の主要な経路と考えら
れている（文献：ＭｉｆｌｉｎおよびＬｅａ，１９７
６，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５；８７３−８
８５）。一方、アンモニアの取り込みがＧＳにより触媒
される経路以外の代謝経路により進行する事が知られて
いる（Ｋｎｉｇｈｔ ａｎｄ Ｌａｎｇｓｔｏｎ−Ｕｎ
ｋｅｆｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：９５
１−９５４）。即ち、グルタミン酸を生成するためのα
−ケトグルタル酸へのアンモニアの取り込みであり、こ
れはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）により触
媒される。しかし、植物のＧＤＨは、アンモニアに対し
て高いＫｍ値を有しており、一方、アンモニアは毒性が
あり、細胞内アンモニアは通常低濃度であるため、正常
な生育条件下でのこの窒素同化経路の役割については未
だ充分には明らかにされていないが、ある研究では、細
胞内のアンモニウム濃度が正常レベルを越えて上昇した
時の窒素同化に寄与しているとの報告がある（Ｋｎｉｇ
ｈｔ ａｎｄ Ｌａｎｇｓｔｏｎ−Ｕｎｋｅｆｅｒ、前
掲）。

【０００７】合成されたグルタミン酸は、さらに別のア
ミノ酸、アスパラギンやアラニン、フェニルアラニン、
ロイシン、イソロイシン、グリシン、バリン、セリン、
チロシン、プロリン、γ−アミノ絡酸（ＧＡＢＡ）等の
合成に利用される。特に、トマトの果実やシュガービー
トの根等の貯蔵器官にはＧＡＢＡが多量に蓄積されてい
ることが知られており、グルタミン酸が消費されている
と考えられる。ＧＡＢＡの蓄積は細胞内の酸性や低温、
ヒートショックなどの環境ストレスによって誘導される
ことが知られている（ＳｔｒｅｅｔｅｒおよびＴｈｉｍ
ｐｓｏｎ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９７２，４
９，５７２−５７８：Ｒｅｇｇｉａｎｉら，Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９８８，２９；９８１
−９８７：Ｍｅｎｅｎｇｕｓら、１９８９，Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ，９０；２９−３２：Ｒｏｂｅｒｔｓ
ら、１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ９８；４
８０−４８７：Ｓｈｅｌｐら、１９９５，Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ ９４；２１９−２２８：Ａｕｒｉｓａ
ｎｏら、１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ ３６；１５２５−１５２９：Ｗａｌｌａｃｅら、
１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ７５；１７０
−１７５：Ｍａｙｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ，９４；７９６−８１０）。ＧＡＢＡはグルタミン酸
デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）の触媒によりグルタミン
酸から合成される。ＧＡＤの活性は細胞内のＣａイオン
濃度やカルモジュリンによって調節されており（Ｌｉｎ
ｇら、１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，６；１１３５
−１１４３：Ｓｎｅｄｄｅｎら、１９９５，Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ，１０８；５４３−５４９：Ａｒａｚ
ｉら、１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１０
８；５５１−５６１：Ｓｎｅｄｄｅｎら、１９９６，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７１；４１４８−４１５
３）、様々なストレスによって細胞内のＣａイオン濃度
が誘導的に変化し、その結果ＧＡＤ活性が急速に高めら
れると考えられている。このため、ＧＡＢＡは植物細胞
におけるシグナル伝達物質としての働きも期待されてい
るが、詳細についてはほとんど分かっていない。

【０００８】Ｐｅｔｕｎｉａで初めてＧＡＤをコードす
る遺伝子が単離され（Ｂａｕｍら，１９９５，Ｊ Ｂｉ
ｏｌ Ｃｈｅｍ，２６８；１９６１０−１９６１７）、
その後、トマト（Ｇａｌｌｅｇｏら、１９９５，Ｐｌａ
ｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２７；１１４３−１１５１）
やＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ｚｉｋら、１９９８，Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，３７；９６７−９７５）か
らもＧＡＤ遺伝子が単離された。いずれの場合もＣ末端
に３０−３２アミノ酸からなるカルモジュリン結合サイ
トが共通に存在している。しかし、その遺伝子発現の器
官は植物によって異なっており、Ｐｅｔｕｎｉａでは花
弁と花で、トマトでは果実で、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ではＧＡＤ１遺伝子が根で、ＧＡＤ２遺伝子が植物体全
体で発現していることが報告されている。Ｇｉｄｅｏｎ
ら（ＥＭＢＯ，１５；２９８８−２９９６，１９９６）
は、カルモジュリンによる発現調節機能について研究を
行う目的で、Ｐｅｔｕｎｉａより単離されたＧＡＤ遺伝
子をタバコに導入し形質転換体を作出した。この報告に
よれば、ＧＡＤ遺伝子全長をセンス方向に導入した場合
とカルモジュリン結合サイトを除き、同様にセンス方向
に導入した場合の形質転換体について調査を行った結
果、ＧＡＢＡが増加し、グルタミン酸が減少した。その
増減の程度はカルモジュリン結合サイトを除いた場合の
ほうが著しく、また、植物の背丈が低くなり、形態的差
異も観察されたことが報告されている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、植物
の貯蔵器官の遊離アミノ酸含量、特に根、種子などの植
物の可食部分における遊離アミノ酸、特にグルタミン
酸、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、スレオニ
ン、アラニンおよびヒスチジンの少なくとも１つの蓄積
を増強する方法、および、遊離アミノ酸が高度に蓄積さ
れたトランスジェニック植物を提供することである。

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、窒素の
同化および利用に関わる主要な酵素の発現レベルおよび
／または細胞特異的な発現バランスを変化させた植物お
よびその作製方法を提供することによって達成される。
このような植物は、窒素同化または利用酵素をコードす
る１以上の遺伝子を適切な制御配列と共に導入し、これ
を過剰発現または発現抑制することによって作製され
る。特に、本発明により、グルタミン酸デカルボキシラ
ーゼ（ＧＡＤ）遺伝子をアンチセンス方向に植物に導入
し、その発現を変えることによって遊離アミノ酸を高度
に蓄積するトランスジェニック植物、特にグルタミン
酸、アスパラギン、アスパラギン酸、セリン、スレオニ
ン、アラニンおよびヒスチジンの少なくとも１つを高度
に蓄積する植物が得られる。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明は、植物における窒素代謝
の遺伝子操作に関する。特に、本発明は、果実、根菜類
の根、種子など有用植物の可食部分の遊離アミノ酸、特
にうま味成分であるグルタミン酸の高蓄積を図るために
窒素同化および利用に関与する酵素の発現量を変化させ
ることに関する。これらの酵素はその発現が増強され、
あるいは修飾され、あるいは抑制され、所望の性質を有
する植物が作製される。本発明において使用される標的
遺伝子の一つのグループは、グルタミン酸のＧＡＢＡへ
の代謝に関係する酵素をコードする遺伝子群である。標
的遺伝子としては例えば、グルタミン酸デカルボキシラ
ーゼ（ＧＡＤ）が挙げられる。操作は植物を本明細書に
記載された核酸構築物で形質転換することにより行うこ
とができる。形質転換された植物またはそれらの子孫は
所望の改変された酵素を発現し、相当するｍＲＮＡの発
現変化、窒素同化または利用能の変化、および／または
植物の遊離アミノ酸含量増加についてスクリーニングさ
れる。

【００１１】簡単には本発明の方法は以下の手順を含
み、また本発明のトランスジェニック植物はこのような
方法によって作製されたトランスジェニック植物であ
る： ａ）目的とする遺伝子をクローニングするステップ； ｂ）得られた遺伝子を必要により適切なベクターへ適切
な方向に挿入し、再クローニングするステップ； ｃ）植物細胞へ上記ベクターを導入し、形質転換体を得
るステップ； ｄ）得られた形質転換体を植物体へ再生させ栽培するス
テップ；

【００１２】本発明の実施態様の一つにおいては、窒素
同化または利用酵素をコードする１個または数個の遺伝
子配列またはそのアンチセンス配列が強力な構成的プロ
モーター制御下に置かれ、植物体中で過剰発現される。
本発明の別の実施態様においては、窒素同化または利用
酵素の発現パターンが改変される。このような発現パタ
ーンの改変は、例えば、 ａ）酵素をコードする遺伝子配列またはそのアンチセン
ス配列が所望の発現パターンを有するプロモーター（例
えば、器官特異的または生育ステージ特異的発現パター
ンを示すプロモーター）に機能し得る状態で結合されて
いるトランスジーン、 ｂ）酵素をコードする遺伝子配列またはそのアンチセン
スｍＲＮＡの好ましいパターンでの発現を活性化する修
飾調節遺伝子、 ｃ）好ましいパターンで発現するように修飾された調節
領域を有する、１コピーの天然遺伝子のアンチセンス配
列、の少なくとも１つを用いて植物を遺伝子操作するこ
とによって達成され得る。

【００１３】本発明のさらに別の実施態様においては、
窒素同化または利用経路において改変された酵素または
異なる型の酵素が発現される。この型の実施態様には、
宿主植物の窒素同化または利用酵素の触媒作用とは異な
る触媒作用を有する対応酵素をコードする、植物細胞中
で発現可能な遺伝子構築物を作製し、これにより植物を
遺伝子操作することが含まれる。このような手段をとる
ことにより、増強された遊離アミノ酸を含有する植物が
得られる。このような植物を育成するために伝統的な作
物育種法では大きな分離集団のスクリーニングを必要と
し、多大の時間を要するところ、本発明によれば、こう
した労力を回避し時間を節約することができる。

【００１４】以下は本明細書において使用される用語お
よび略語の定義である。 ３５Ｓ ＝ カリフラワーモザイクウイルスプロモーター ＧＡＤ ＝ グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ） ＧＤＨ ＝ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ 遺伝子融合体＝ 異種遺伝子が連結されたプロモーターを含む遺伝子構築物 （前記プロモーターは異種遺伝子の転写を調節する） 異種遺伝子 ＝ 遺伝子構築において、異種遺伝子はその遺伝子が自然に連結さ れていないプロモーターに連結されていることを意味する。異種遺伝子は、前記 プロモーターを寄与する生物からのものであってもよく、またそうでなくてもよ い。 ＰＣＲ ＝ポリメラーゼ連鎖反応

【００１５】本発明に使用できる窒素同化または利用酵
素遺伝子には既に述べたような種々の遺伝子が含まれる
が、グルタミン酸を蓄積させるために利用できる好まし
い遺伝子の例のひとつとして、グルタミン酸デカルボキ
シラーゼ（ＧＡＤ）遺伝子が挙げられる。ＧＡＤ遺伝子
が使用される場合は、アンチセンス方向で発現される。
本発明の好ましい実施態様の一つにおいては、トマト由
来ＧＡＤ遺伝子をコードする配列をアンチセンス方向に
連結された強力な構成植物プロモーターであるカリフラ
ワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター
をコードする組換え構築物を用いて、トマト植物を遺伝
子工学的に操作される。ＧＡＤ遺伝子の発現が抑制され
た系統は、対照の非形質転換トマトよりも遊離アミノ酸
含量の増加、特にグルタミン酸含量の増加（２倍）が見
られた。

【００１６】本発明に使用し得る核酸構築物は当業者に
公知の方法を使用して作成し得る。構築物を単離し、特
性決定する方法、あるいは、その操作および構築物それ
自体を作るのに使用しうる組換えＤＮＡ法については、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉ
ｎｇ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓのような出典を参考にし得る。所
望の成分の塩基配列が知られているような場合には生物
起源からそれを単離するのではなく合成することが有利
なこともある。また、塩基配列全体、あるいは部分的に
知られている場合には、所望の核酸断片を増幅すること
もできる。この様な場合当業者はＣａｒｕｔｈｅｒｓ
ら、１９８０，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．Ｓｙｍ
ｐ．Ｓｅｒ．７：２１５−２３３及びＣｈｏｗ及びＫｅ
ｍｐｅ，１９８１，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．９：
２８０７−２８１７のような文献を参考にすることがで
きる。その他の場合、所望の成分はポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）増幅により有利に生産しうる。ＰＣＲ法に
ついては、当業者は、Ｇｅｌｆ ａｎｄ，１９８９，Ｐ
ＣＲ技術、ＤＮＡ増幅に関する原理及び応用、Ｈ．Ａ．
Ｅｒｌｉｃｈ編集、ストックトンプレス，Ｎ．Ｙ．、分
子生物学における現行のプロトコル、２巻、１５章、Ａ
ｕｓｕｂｅｌら編集、ジョンウイリイ＆サンズ，１９８
８を参考にし得る。

【００１７】本発明に使用される遺伝子構築物は、一般
に、目的遺伝子の他に植物細胞内で機能する適切なプロ
モーター、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターのよ
うな適切なターミネーター、その他の発現制御に有用な
エレメント、および、形質転換体を選抜するための適切
なマーカー遺伝子、例えばカナマイシン耐性、Ｇ４１８
耐性、ハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子を含
んでいる。この構築物に含まれるプロモーターは構成的
プロモーターであっても器官特異的若しくは生育ステー
ジ特異的であってもよく、使用する宿主、遺伝子、必要
とする発現量、発現させるべき器官、生育ステージ等に
応じて選択することができる。本発明によれば、窒素同
化または利用酵素をコードする遺伝子のアンチセンスｍ
ＲＮＡの過剰発現を示す植物は、所望の酵素をコードす
る配列のアンチセンス配列に連結された植物プロモータ
ーを含む遺伝子構築物で植物細胞を形質転換することに
より作製することができる。本発明の好ましい実施態様
において、関連プロモーターは強力かつ非器官特異的ま
たは非生育ステージ特異的プロモーター（例えば、多く
または全ての組織中で強く発現するプロモーター）であ
る。この様な強力な構成的プロモーターの例として、Ｃ
ａＭＶ３５Ｓプロモーターが挙げられる。

【００１８】本発明の別の実施態様において、器官特異
的または生育ステージ特異的プロモーターを所望の酵素
をコードする配列に結合させた遺伝子構築物で植物を操
作するのが有利なことがある。例えば、光合成組織及び
器官中の発現が所望される場合は、リブロースビスフォ
スフェートカルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）遺伝子
又は葉緑体ａ／ｂ結合蛋白質（ＣＡＢ）遺伝子のプロモ
ーターが使用しうる。種子中の発現が所望される場合
は、種々の種子貯蔵蛋白質遺伝子のプロモーターを使用
することができ、果実中での発現が所望される場合は、
果実特異的プロモーター（例えばトマトの２Ａ１１）を
使用することができ、塊茎中での発現が所望される場合
は、塊茎貯蔵蛋白質遺伝子のプロモーター（例えばポテ
トのパタチン）を使用することができる。

【００１９】本発明の更に別の実施態様において、誘導
プロモーターを所望の酵素をコードする配列に結合させ
た遺伝子構築物で植物を形質転換する事が有利であり得
る。この様なプロモーターの例は多岐にわたる。例え
ば、熱ショック遺伝子、防御応答遺伝子（例：フェニル
アラニンアンモニアリアーゼ遺伝子）、傷害応答遺伝子
（例：ヒドロキシプロリンに富む細胞壁蛋白質遺伝
子）、化学誘導遺伝子（例：ニトレート還元酵素遺伝
子、キチナーゼ遺伝子）、暗所誘導遺伝子（例：アスパ
ラギンシンテターゼ遺伝子（ＣｏｒｕｚｚｉおよびＴｓ
ａｉ、ＵＳ５，２５６，５５８）が挙げられるがこれら
に限定されない。

【００２０】本発明の組換え核酸構築物は、その構築物
の伝達追跡のための選択可能なマーカーを含んでもよ
い。例えば、細菌中で伝達される構築物は抗生物質耐性
遺伝子、例えばカナマイシン、テトラサイクリン、スト
レプトマイシン、またはクロラムフェニコール対する耐
性を与える遺伝子を含むことが好ましい。構築物を伝達
するのに適したベクターとして、プラスミド、コスミ
ド、バクテリオファージまたはウイルスが挙げられる。
加えて、組換え構築物は、これらの構築物により形質転
換された植物細胞の単離、同定または追跡のための植物
で発現し得る選択可能なマーカー遺伝子又はスクリーニ
ング可能なマーカー遺伝子を含んでも良い。選択可能な
マーカーとして、抗生物質耐性（例えば、カナマイシン
またはハイグロマイシンに対する耐性）、または除草剤
耐性（例えば、スルフォニル尿素、フォスフィノスリシ
ン、またはグリフォゼートに対する耐性）を与える遺伝
子が挙げられるが、これらに限定されない。スクリーニ
ング可能なマーカーとして、β−グルクロニダーゼをコ
ードする遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，１９８７，Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ ５：３８７−４０
５）、ルシフェラーゼをコードする遺伝子（Ｏｗら、１
９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：８５６−８５９）、
アントシアニン色素産生を調節するＢ及びＣ１遺伝子産
物（Ｇｏｆｆら、１９９０，ＥＭＢＯ Ｊ，９：２５１
７−２５２２）が挙げられるがこれらに限定はされな
い。

【００２１】本発明に使用できる遺伝子導入法は特に限
定されず、植物細胞あるいは植物体への遺伝子導入法と
して当業者に知られるいずれの方法を使用してもよい。
例えば、本発明の実施態様の一つにおいて、アグロバク
テリウムが遺伝子構築物を植物に導入するのに用いられ
る。この様な形質転換は２成分アグロバクテリウムＴ−
ＤＮＡベクター（Ｂｅｖａｎ，１９８４，Ｎｕｃ．ａｃ
ｉｄ Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１）、および同
時培養操作（Ｈｏｒｓｃｈら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２２７：１２２９−１２３１）を使用することが望
ましい。一般に、アグロバクテリウム形質転換系が双子
葉植物を操作するのに使用される（Ｂｅｖａｎｓら、１
９８２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１６：３５７
−３８４；Ｒｏｇｅｒｓら、１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１８：６２７−６４１）。アグ
ロバクテリウム形質転換系はまた単子葉植物および植物
細胞を形質転換するのに使用することもできる（Ｈｅｒ
ｎａｌｓｔｅｅｎら、１９８４， ＥＭＢＯ Ｊ．，
３：３０３９−３０４１；Ｈｏｙｋａｓｓ−ＶａｎＳｌ
ｏｇｔｅｒｅｎら、１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１１：
７６３−７６４；Ｇｒｉｍｓｌｅｙら、９８７，Ｎａｔ
ｕｒｅ，３２５：１６７−１６７９；Ｂｏｕｌｔｏｎ
ら、１９８９，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１
２：３１−４０；Ｇｏｕｌｄら、１９９１，Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９５：４２６−４３４）。植物を
形質転換するためにアグロバクテリウム系を利用する場
合は、組換えＤＮＡ構築物は植物細胞に導入すべきＤＮ
Ａ配列に隣接する位置に、Ｔ−ＤＮＡ領域の少なくとも
右ボーダー配列を更に含む。好ましい実施態様において
は、移入される配列は左右のＴ−ＤＮＡボーダー配列の
間に挿入される。この様なＴ−ＤＮＡをベースとする形
質転換ベクターの適切な設計及び構築は当業者に公知で
ある。

【００２２】別の実施態様において、組換え核酸構築物
を植物および植物細胞に導入する為の種々の別法を使用
することができる。別の遺伝子導入法および形質転換方
法として、裸のＤＮＡの、カルシウム、ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）またはエレクトロポレーション介在
性取り込みによるプロトプラスト形質転換（Ｐａｓｚｋ
ｏｗｓｋｉら、１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．，３：２７１
７−２７２２；Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５，Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１６９−１７７；
Ｆｒｏｍｍら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：５８２４−５８２８；Ｓｈ
ｉｍａｍｏｔｏら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３３８：
２７４−２７６）が挙げられる。本発明によれば、多種
の植物及び植物細胞系が本発明の核酸構築物および上記
の形質転換方法を使用して本明細書に記載された所望の
生理学的特性につき操作しうる。これらの方法は、標的
が単子葉植物または植物細胞である場合に特に有益であ
る。好ましい実施態様において、操作のための標的植物
および植物細胞として、トマト、ポテト、ビート、ダイ
ズ、アラビドプシス、トウモロコシ、小麦、イネ、サト
ウキビ等が挙げられるが、これらに限定されない。特に
好ましいのはトマトである。

【００２３】本発明によれば、本明細書に開示されたよ
うな遺伝子構築物を、プロトプラスト、組織培養細胞、
組織及び器官外殖体、花粉、胚ならびに植物全体を含む
がこれらに限定されない種々の植物細胞型に導入および
操作することにより所望の植物が得られる。本発明の実
施態様において、操作された植物体は下記のアプローチ
および方法に従って形質転換体につき選択又はスクリー
ニングされる。次に単離された形質転換体を植物個体に
再生させてもよい。植物細胞、組織または器官から植物
個体に再生するための方法は、多くの植物種において当
業者に公知である。

【００２４】形質転換された植物細胞、カルス、組織ま
たは植物は、形質転換に用いた遺伝子構築物に存在する
マーカー遺伝子によりコードされた形質につき選択又は
スクリーニングする事により同定され、単離することが
できる。例えば、形質転換遺伝子構築物が耐性を与える
ような抑制量の抗生物質または除草剤を含む培地で操作
された植物体を生育させることにより、選択を行うこと
ができる。更に形質転換された植物細胞および植物は、
本発明の組換え核酸構築物に存在しうる可視のマーカー
遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ遺伝子、ルシフ
ェラーゼ遺伝子、Ｂ遺伝子またはＣ１遺伝子）の活性に
つきスクリーニングする事により同定しうる。この様な
選択方法およびスクリーニング方法は当業者に公知であ
る。

【００２５】また、本発明の遺伝子構築物を含む植物ま
たは植物細胞形質転換体を同定するために物理的方法お
よび生化学的方法が使用しうる。そのような方法とし
て、 １）組換えＤＮＡインサートの構造を検出および測定す
るためのサザン分析またはＰＣＲ増幅； ２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写産物を検出および測定す
るためのノーザンブロット、Ｓ１ ＲＮａｓｅ保護、プ
ライマー伸長ＰＣＲ増幅または逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ
−ＰＣＲ）増幅； ３）遺伝子構築産物が蛋白質である場合は、蛋白質ゲル
電気泳動、ウエスタンブロット、免疫沈殿、またはエン
ザイムイムノアッセイが挙げられるが、これらに限定さ
れない。これらのアッセイ方法は全て当業者に公知であ
る。

【００２６】本発明によれば、改良された成分特性を有
する植物を得るため、形質転換された植物を所望の生理
学的変化に関してスクリーニングしてよい。例えば、Ｇ
ＡＤ酵素の発現抑制に関して操作した場合、形質転換さ
れた植物は、所望の組織および生育段階でＧＡＤ酵素の
発現が所望のレベルに低下した植物について試験される
であろう。次に、所望の生理学的変化、例えば、ＧＡＤ
の発現低下を示す植物を、所望の成分変化について引き
続きスクリーニングすることができる。本発明によれ
ば、窒素同化プロセスまたは利用プロセスの変化で操作
された植物は、改良された成分特性、すなわち、遊離ア
ミノ酸、特に、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラ
ギン酸、セリン、スレオニン、アラニン、ヒスチジン高
含有、とりわけうま味成分であるグルタミン酸高含有を
示しうる。この様な改良された特性を有する操作された
植物および植物系統は、植物の遊離アミノ酸含量を測定
する事により同定しうる。この分析のための操作および
方法は当業者に公知である。本発明によって得られる植
物は、遊離アミノ酸含量において対照植物（非形質転換
植物）に対して増加した植物である。好ましい実施態様
において、所望の植物は、その果実、根、種子等の可食
部分での遊離アミノ酸含量、とりわけうま味成分である
グルタミン酸含量が２倍以上の増加を示し、全遊離アミ
ノ酸含量も最大約３倍程度まで増加する。グルタミン酸
以外のアミノ酸に関しては、特に、アスパラギン酸、ア
スパラギン、アラニン、セリン、スレオニンおよびヒス
チジンの増加が著しい。本発明によってアミノ酸組成が
改良され得る植物種は特に限定されないが、グルタミン
酸を主要なうま味成分とするトマトが特に好ましい。

【００２７】

【実施例】本発明は、トマト由来ＧＡＤ遺伝子をコード
する配列をアンチセンス方向に連結された強力な構成植
物プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルス
（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターをコードする組換え構
築物を用いて、トマト植物を遺伝子工学的に操作した以
下の実施例により具体的かつ詳細に説明される。実施例
１．トマト由来ＧＡＤ遺伝子の単離 ７０％エタノール（３０秒）、２％次亜塩素酸ナトリウ
ム（１５分）を用いて表面殺菌したトマト種子を、植物
ホルモンを含まないＭＳ寒天培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ
およびＳｋｏｏｇ，１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａ
ｎｔ．，１５：４７３−４７９）に植え、１６時間日
長、２５℃で１週間培養し、無菌植物を得た。得られた
幼植物の根よりＴｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。

【００２８】Ｔｏｔａｌ ＲＮＡはＰｏｌｙ（Ａ）Ｑｕ
ｉｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてｍＲＮＡを精製した後、
Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｈｅｃｈ社）を用いてＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａ
ｎｄ ｃＤＮＡを作成した。作成したＦｉｒｓｔ−Ｓｔ
ｒａｎｄ ｃＤＮＡをテンプレートに用いてＰＣＲ反応
を行ったＰＣＲ反応条件は９４℃−３分；９４℃−４５
秒、５９℃−３０秒、７２℃−９０秒、３５サイクル；
７２℃−１０分とし、パーキンエルマー社のＰＣＲ ｓ
ｙｓｔｅｍ ２４００を用いて行った。用いたプライマ
ーを表−１に示した。得られたＰＣＲ産物はＴＡ−Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い
てクローニングした。目的サイズの遺伝子がクローニン
グできた６種のプラスミッドについてシークエンサー
（ＡＢＩ社３７７Ａ）を用いて塩基配列を決定し、既知
のＧＡＤ遺伝子（Ｇａｌｌｅｇｏら、１９９５，Ｐｌａ
ｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２７；１１４３−１１５１）
との相同性について調査した。得られたクローンのう
ち、Ｔ−ｇａｄ−１９遺伝子の塩基配列を配列番号１に
示した。

【００２９】

【表１】 ＜配列表フリーテキスト＞ 配列番号２および３：ＧＡＤ特異的プライマー 配列番号４および５：Ｎｏｓ−ＰｒｏｍｏｔｅｒからＮ
ＰＴＩＩ間を増幅するためのＰＣＲプライマー

【００３０】その結果、既知のトマトＧＡＤ遺伝子の塩
基配列（Ｇａｌｌｅｇｏら，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌ Ｂｉｏｌ，２７；１１４３−１１５１）と完全に
一致するものは無かったが、調査したクローンの中でＴ
−ｇａｄ−１９遺伝子（配列番号１）が最も相同性が高
く８５％の相同性を有していた。アンチセンス法の機能
として果たし得る可能性があると判断し、Ｔ−ｇａｄ−
１９遺伝子を用いることとした。

【００３１】実施例２．トマトＧＡＤ遺伝子（Ｔ−ｇａ
ｄ−１９）のＴｉプラスミッド（ｐＭＡＴ０３７）への
サブクローニング ＰＣＲ２．１ベクターにクローニングしたトマト由来Ｔ
−ｇａｄ−１９遺伝子は，植物形質転換用ベクターであ
る、Ｔｉプラスミッド（ｐＭＡＴ０３７）（Ｍａｔｓｕ
ｏｋａおよびＮａｋａｍｕｒａ，１９９１，Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８８：８３４−
８３８）にサブクローニングした、始めにＰＣＲ２．１
ベクター中の制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを
用いて切り出し、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイ
ト上ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に置換した。さ
らに制限酵素ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切り出
し、ｐＭＡＴ０３７のＣａＭＶ３５Ｓプロモーター後の
マルチクローニングサイト中の制限酵素ＫｐｎＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩサイトに導入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５
αにトランスフォーメーションした。ａｎｔｉ−Ｔ−ｇ
ａｄ−１９遺伝子を導入したＴｉプラスミッドは、アグ
ロバクテリウム、ＥＨＡ１０１株に形質転換し（図
１）、トマトに感染させるために用いた。

【００３２】実施例３．トマトの子葉へのアグロバクテ
リウム感染による形質転換体の作製 トマト（栽培品種，ミニトマト）の種子を７０％エタノ
ール（３０秒）、２％次亜塩素酸ナトリウム（１５分）
を用いて表面殺菌した後、植物ホルモンを含まないＭＳ
寒天培地に置床し、１６時間日長、２５℃で１週間培養
した。得られた無菌幼植物より子葉を切り取り、２ｍｇ
／ｌゼアチンと０．１ｍｇ／ｌインドール酢酸を加えた
ＭＳ寒天培地（再分化培地、９ｃｍシャーレ使用）に置
床し２日間同条件で培養した。ａｎｔｉ−Ｔ−ｇａｄ−
１９遺伝子を含むアグロバクテリウム（ＥＨＡ１０１）
はＹＥＰ培地（表−２）で一晩培養したものを感染に用
いた。２日間培養した子葉を滅菌シャーレに集め、アグ
ロバクテリウム液を加え感染させた。滅菌したろ紙を用
いて余分なアグロバクテリウム液を子葉から取り除き、
アグロバクテリウムの急激な増殖を防ぐため、先に用い
たシャーレ培地に滅菌ろ紙を敷き，その上に感染させた
子葉を乗せ、２４時間共存培養させた。その後、子葉は
５０ｍｇ／ｌカナマイシン、５００ｍｇ／ｌクラフォラ
ンを含むＭＳ再分化培地（選抜培地）に移し、形質転換
体の選抜を行った。再分化したｓｈｏｏｔは、新しい選
抜培地に移し再選抜を行った。緑色で旺盛に生育したｓ
ｈｏｏｔは茎の部分で切り取り、植物ホルモンを含まな
いＭＳ培地（発根培地、試験管）に移した。発根した再
分化植物は順次土壌に馴化させた。

【００３３】

【表２】

【００３４】実施例４．導入遺伝子の確認 ａｎｔｉ−Ｔ−ｇａｄ−１９遺伝子を含むアグロバクテ
リウムを感染させて得られた選抜個体４個体と、目的遺
伝子を含まないＴｉプラスミッドのみのアグロバクテリ
ウムを感染させて得られた植物３個体、さらにアグロバ
クテリウムで処理しないで、子葉より直接再分化させた
植物体２個体からそれぞれＴｏｔａｌＤＮＡを本田らの
方法に従い抽出した（ＨｏｎｄａおよびＨｉｒａｉ，１
９９０，Ｊｐｎ Ｊ Ｂｒｅｅｄ ４０，３３９−３４
８）。抽出したＤＮＡは、ＲＡａｓｅ処理、フェノール
／クロロホルム処理、さらにＰＥＧ沈殿させ精製した。
０．０１μｇ／μｌになるように希釈し、ＰＣＲ用のテ
ンプレートとした。ＰＣＲはＴｉプラスミッドのＴ−Ｄ
ＮＡ上のＮＰＴＩＩ遺伝子からＮｏｓ−Ｐｒｏｍｏｔｅ
ｒ中の配列を元に約１．０ｋｂｐの増幅産物が得られる
ようなプライマー（表−１．ｂ）を用いてＰＣＲ反応を
行った。反応条件は，９４℃−１分、５５℃−１分、７
２℃−２分、３５サイクルで行った。ＰＣＲ産物は１％
アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマ
イドで染色した。ａｎｔｉ−Ｔ−ｇａｄ−１９遺伝子を
含むアグロバクテリウムを感染させた個体、およびプラ
スミッド遺伝子を含むアグロバクテリウムを感染させた
個体において、予想されるバンドサイズである約１．０
ｋｂｐのバンドが確認され、非形質転換体には検出され
なかった（図２）。これらの結果より、得られた形質転
換植物に各々の遺伝子が導入されていることが示唆され
た。

【００３５】実施例５．遊離アミノ酸の抽出と定量 実施例４で得られた形質転換植物の開花後６週目の果実
を収穫し、−８０℃に保存した。果実は約１／６にカッ
トし、重さを測定した後、乳鉢に入れ液体窒素で凍らせ
すりつぶした。さらに３ｍｌの８０％エタノールを加
え、丁寧にすりつぶした後、遠心チューブに移し、８０
℃で２０分間インキュベートした。１０，０００ｒｐｍ
で２０分間遠心し、上澄を新しいチューブに移し、残っ
たペレットに２ｍｌの８０％エタノールを加え、再度乳
鉢ですりつぶし、８０℃で２０分間インキュベートし
た。遠心後、澄をチューブに移し、先の上澄と併せ、８
０％エタノールを用いて総量を５ｍｌに調製した。良く
混合した後、２０μｌ取り乾燥させた後、０．０２Ｎ塩
酸に溶解した。０．４５μｍのフィルターでろ過し、分
析用サンプルとした。アミノ酸分析は日立高速アミノ酸
分析計（Ｌ−８８００）を用いて行った。ＧＡＤアンチ
センス遺伝子を導入した形質転換トマトのアミノ酸分析
結果を非形質転換トマトおよびＴｉプラスミッドのみ導
入したトマトのアミノ酸分析結果とともに表３に示し
た。

【００３６】

【表３】

【００３７】

【表４】

【００３８】調査した形質転換体４株のうち、アミノ酸
含量、特にグルタミン酸含量がコントロールに比べて２
倍以上増加した株はＧＡＤ−１およびＧＡＤ−２であっ
た。また、それらの系統は他のアミノ酸含量、特にアス
パラギン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、アラ
ニンおよびヒスチジンも増加していた（表３）。ＧＡＤ
−１およびＧＡＤ−２のグルタミン酸含量はコントロー
ルに比べてそれぞれ２．０２倍および２．０６倍であっ
た。また、グルタミン含量も６．９５倍、３．１０倍で
あり、γ−アミノ酪酸含量が６．４２倍２．２９倍とか
なり増加していた（図３）。

【００３９】実施例６．ａｎｔｉ−Ｔ−ｇａｄ−１９遺
伝子導入トマトの後代分析 １）ノーザン分析 形質転換当代（Ｔ_０）植物の腋芽の葉組織よりＴｏｌａ
ｌＲＮＡをフェノール／ＳＤＳ法により抽出した。２０
μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡをホルムアルデヒド−アガロ
ースゲル（１．０％）を用いて電気泳動後、ナイロンメ
ンブランにトランスファーした。ＤＩＧ−Ｌａｂｅｌｉ
ｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈ
ｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
を用いて、ノーザンハイブリダイゼーションを行った。
プローブとしてＴ−ｇａｄ−１９遺伝子を用いた。その
結果、ａｎｔｉ−Ｔ−ｇａｄ−１９遺伝子導入系統Ｎ
ｏ．１，２系統にハイブリダイズしたバンドのシグナル
は非形質転換体にハイブリダイズしたバンドのシグナル
より弱いため、形質転換体では内在性のＧＡＤ遺伝子の
発現が減少していることが示唆された（図４）。しか
し、Ｎｏ．１系統由来の種子は発芽しなかったため、後
代の分析ができなかった。

【００４０】２）Ｔ_１世代の選抜 アグロバクテリウム法により遺伝子導入を行ったトマト
形質転換植物（Ｔ_０世代）より得られた種子を、８０％
エタノールで３０秒，２％次亜塩素酸ナトリウムで１５
分間表面殺菌した後、カナマイシン３５０ｍｇ／ｌを加
えたＭＳ寒天培地に無菌播種した。１ヵ月後、生育の良
い植物の選抜を行った結果、ａｎｔｉ−Ｔ−ｇａｄ−１
９遺伝子導入系統Ｎｏ．２より耐性個体ＧＡＤ２−２−
１，ＧＡＤ２−２−２，ＧＡＤ２−２−３，ＧＡＤ２−
３−１が選抜できた。株当たりの果実数を増加させるた
め、屋外の閉鎖系温室で栽培を行った。栄養条件を同じ
にするため、馴化時に１ｋｇの培養土（パワーソイル，
サカタのタネ）に移植した後は、追肥を行わなかった。

【００４１】３）果実中のアミノ酸含量の測定 第一果房の開花後６週目の果実３個を分析に用いた。
果実に８０℃に熱した８０％エタノールを重量の３倍量
加え、乳鉢ですりつぶした後、再度８０℃で２０分間加
熱した。７，０００ｒｐｍで遠心して、上清を回収した
後、再度８０％エタノールを加え、８０℃に加温した。
エタノールによる抽出を３回行い、総量を８０％エタノ
ールで１００ｍｌに合わせた。良く混合した後、抽出液
２００μｌをエッペンドルフチューブに取り、乾燥さ
せ、２００μｌの滅菌水に溶かした。エチルエーテル２
００μｌ加え混合後、１２，０００ｒｐｍで遠心し、エ
ーテル層を取り除いた。水層を再度乾燥させた後、２０
０μｌの０．０２ＮＨＣｌに溶解し、０．４５μｍのろ
過フィルターを用いてろ過したろ液をサンプルとし、日
立高速アミノ酸計測器（Ｌ−８８００）を用いて分析を
行った。結果は３個の果実の平均値を示した。ａｎｔｉ
−Ｔ−ｇａｄ−１９遺伝子導入系統Ｎｏ．２の後代ＧＡ
Ｄ２−２−１，ＧＡＤ２−２−２，ＧＡＤ２−２−３，
ＧＡＤ２−３−１のグルタミン酸含量が非形質転換体に
比べて、それぞれ、１．３倍、１．８倍，３．０倍、
１．８倍増加していた（表４、図５）。グルタミン酸以
外のアミノ酸では、アラニンの増加が顕著であり、アス
パラギン酸、アスパラギン含量が増加した系統も見られ
た。全遊離アミノ酸含量も非形質転換体と比較して最大
３．２倍増加した。

【００４２】

【表５】

【００４３】

【表６】

【００４４】

【表７】

【００４５】

【発明の効果】本発明により、遊離アミノ酸を高濃度に
含有する植物が得られ、付加価値の高い原料作物および
食品素材、特に付加価値の高いトマトが提供される。本
発明により全遊離アミノ酸含量が最大３倍程度まで増加
し、特にグルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン
酸、セリン、スレオニン、アラニンおよびヒスチジンの
少なくとも１つの含量の高い作物が提供され、これらの
アミノ酸の後添加の必要のない付加価値の高い原料作物
が提供される。また、本発明により、高濃度にグルタミ
ン酸を蓄積したもの、すなわち、うま味の優れた食品素
材が提供される。さらに、本発明により、そのような遊
離アミノ酸を高度に蓄積する植物を育種するための期間
が大幅に短縮される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｔ−ｇａｄ−１９遺伝子のＴｉプラスミッド
（ｐＭＡＴ０３７）へのアンチセンス方向クローニン
グ。 ３５ＳＰｒｏ：ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、Ｔｅｒ
ｍ：ターミネーター

【図２】トマト由来ＧＡＤアンチ配列、ａｎｔｉ−Ｔ−
ｇａｄ−１９遺伝子を導入した形質転換体のＰＣＲによ
る解析結果を示したものである（ＮＰＴＩＩ特異的プラ
イマー使用、９４℃−１分間、５５℃−１分間、７２℃
−２分間、３５サイクル）。各サンプルの表記は表３と
対応する：非形質転換トマト（Ｃｏｎｔ−１、Ｃｏｎｔ
−２）；プラスミッドｐＭＡＴ０３７を導入した形質転
換トマト；アンチセンスＧＡＤ遺伝子を導入した形質転
換トマト（ＧＡＤ−１、ＧＡＤ−２、ＧＡＤ−６−２、
ＧＡＤ−１１）。

【図３】ａｎｔｉ−Ｔ−ｇａｄ−１９遺伝子を導入した
形質転換体（ＧＡＤ−１，ＧＡＤ−２，ＧＡＤ−６−
２）のアミノ酸含量の比較をグラフに示したものである
（グルタミン酸−Ｇｌｕ、グルタミン−Ｇｌｎ、γ−ア
ミノ酪酸−ＧＡＢＡ、リジン−Ｌｙｓ）。

【図４】ａｎｔｉ−Ｔ−ｇａｄ−１９遺伝子を導入した
形質転換体のノーザン分析の結果を示したものである。
それぞれ、２０μｇの全ＲＮＡを使用した。 レーン１：非トランスジェニックトマト、レーン２、
３：それぞれａｎｔｉ−Ｔ−ｇａｄ−１９ ｎｏ．１，
ｎｏ．２。

【図５】ａｎｔｉ−Ｔ−ｇａｄ−１９遺伝子を導入した
形質転換トマトの後代（Ｔ_１）における果実中のアミノ
酸含量を比較したグラフである。ＧＡＤ２−２−１、Ｇ
ＡＤ２−２−２、ＧＡＤ２−２−３、ＧＡＤ２−３−１
は、それぞれアンチセンスＧＡＤ遺伝子を導入した形質
転換トマトである。測定個体数はそれぞれ３個体とした
（ｎ＝３）。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 同条件で栽培した天然の同種の植物と比
   べて、可食部分の１以上の遊離アミノ酸をより多く蓄積
   するトランスジェニック植物を作出する方法であって、
   グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）をコードす
   る遺伝子配列のアンチセンス配列および前記アンチセン
   ス配列を発現させ得る制御配列を含む遺伝子構築物で植
   物を形質転換し、該遺伝子構築物に連結されたマーカー
   遺伝子により付与された形質に基づいて前記形質転換植
   物を選択または同定し、１以上の遊離アミノ酸をより多
   く蓄積する前記形質転換植物をスクリーニングし、１以
   上の遊離アミノ酸をより多く蓄積する前記形質転換植物
   を選別することを含む、前記方法。
2. 【請求項２】 遺伝子構築物が、植物の構成的プロモー
   ターに機能しうる状態で連結されたアンチセンスＧＡＤ
   遺伝子配列を含むものである、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 遺伝子構築物がトマト由来のＧＡＤから
   なるａｎｔｉ−Ｔ−ｇａｄ−１９とＣａＭＶ ３５Ｓと
   のアンチセンスＧＡＤ遺伝子融合体である、請求項２に
   記載の方法。
4. 【請求項４】 遊離アミノ酸が、アスパラギン、アスパ
   ラギン酸、セリン、スレオニン、アラニン、ヒスチジン
   およびグルタミン酸からなる群より選ばれる、請求項１
   〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】 遊離アミノ酸の一つが遊離グルタミン酸
   である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
6. 【請求項６】 トランスジェニック植物がトランスジェ
   ニックトマトであり、可食部分が果実である、請求項１
   〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項に記載の方
   法により作出されたトランスジェニック植物およびその
   子孫植物。
8. 【請求項８】 請求項１〜６のいずれか１項に記載の方
   法により作出された、果実中の全遊離アミノ酸含量が天
   然の同種植物の２倍以上に増加したトランスジェニック
   植物およびその子孫植物。
9. 【請求項９】 請求項１〜６のいずれか１項に記載の方
   法により作出された、果実中の遊離グルタミン酸含量が
   天然の同種植物の２倍以上に増加したトランスジェニッ
   ク植物およびその子孫植物。
10. 【請求項１０】 請求項７〜９のいずれか１項に記載の
    トランスジェニック植物またはその子孫植物の種子であ
    って、アンチセンスＧＡＤ配列を含有する前記種子。