JP2001136976A - 高親和性コリントランスポーター - Google Patents

高親和性コリントランスポーター

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 生理的に重要である高親和性コリントランス
ポーター活性を有するタンパク質、それをコードする遺
伝子及びそれらを利用した高親和性コリントランスポー
ター活性促進物質のスクリーニング方法等を提供するこ
と。 【解決手段】 線虫（C. elegans）のゲノム配列から予
測されるＮａ+依存性トランスポーターｃＤＮＡについ
てアフリカツメガエルの卵母細胞発現系で高親和性コリ
ン取り込み活性を調べることにより、線虫高親和性コリ
ントランスポーターのｃＤＮＡ（cho-1）を同定し、こ
のｃＤＮＡとの塩基配列の相同性を指標にラット脊髄か
らラット高親和性コリントランスポーターのｃＤＮＡ
（ＣＨＴ１）をクローニングする。同様に、ヒトゲノム
からヒト高親和性コリントランスポーターのｃＤＮＡを
クローニングする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、高親和性コリント
ランスポーター活性を有するタンパク質、それをコード
する遺伝子及びそれらの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】全身の臓器に分布し、内分泌系と並んで
エネルギー代謝、循環、呼吸及び生殖など生体にとって
最も基本的な機能を調節する神経系である自律神経は、
アドレナリン作動性とコリン作動性に分類される。交感
神経の節後繊維以外のすべての自律神経繊維、運動神経
繊維、交感神経のうち汗腺・血管拡張繊維はコリン作動
性神経であり、運動・自律神経機能に重要である。脳に
も存在するコリン作動性神経は、脳の認知機能に重要で
あり、アルツハイマー病では変性することが知られてい
る。また、コリン作動性神経では、コリン生合成能を欠
いているため、アセチルコリン分解産物のコリンはシナ
プス前部に存在する高親和性コリントランスポーターに
よって細胞内に取り込まれ、アセチルコリン合成に再利
用される。この高親和性コリンの取り込みはアセチルコ
リン合成の律速段階であり、シナプス伝達の効率を調節
すると考えられている（J. Neurochem. 18, 781-798, 1
971、Science 178, 626-628, 1972、Biochem. Biophys.
Acta 291, 564-575, 1973、Mol. Pharmacol. 9, 630-6
39, 1973、J. Pharmacol. Exp. Ther. 192, 86-94,197
5、J. Neurochem. 30, 15-21, 1978、J. Neurochem. 4
4, 11-24, 1985、J.Neurochem. 60, 1191-1201, 1993、
J. Neurochem. 20, 581-593, 1973、Eur. J.Pharmacol.
102, 369-370, 1984）。従来、主要な神経伝達物質ト
ランスポーターのほとんどのｃＤＮＡは単離されている
が、生理的に重要である高親和性コリントランスポータ
ーのｃＤＮＡは同定されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】コリン作動性神経に局
在し、アセチルコリンの前駆体であるコリンを細胞内に
取り込む作用をするタンパク質の存在がこれまでに予想
されており、このタンパク質である高親和性コリントラ
ンスポーターの分子的性質は不明であった。本発明の課
題は、生理的に重要である高親和性コリントランスポー
ター活性を有するタンパク質、それをコードする遺伝子
及びそれらを利用した高親和性コリントランスポーター
活性促進物質のスクリーニング方法等を提供することに
ある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究し、ゲノム・プロジェクトの
情報（Science 282, 2012-2018, 1998）を利用して、線
虫（C. elegans）のゲノム配列から予測されるＮａ+依
存性トランスポーターｃＤＮＡを１つひとつクローニン
グし、そのそれぞれについてアフリカツメガエルの卵母
細胞発現系で高親和性コリン取り込み活性を調べること
により、線虫高親和性コリントランスポーターのｃＤＮ
Ａ（ｃｈｏ−１）を同定し、このｃＤＮＡとの塩基配列
の相同性を指標にラット脊髄から相同分子（ＣＨＴ１）
をクローニングした。このＣＨＴ１は神経伝達物質トラ
ンスポーター（J. Neurochem. 71, 1785-1803, 1998）
との相同性をもたないが、Ｎａ+依存性グルコーストラ
ンスポーターファミリーに属する分子（Nature 330, 37
9-381, 1987）に対して２０−２５％の相同性を有して
いた。
【０００５】ノザン解析の結果、脊髄、前脳基底部、線
条体、脳幹に限局してＣＨＴ１の転写産物が確認され、
ＣＨＴ１はコリン作動性神経で発現していると考えられ
たので、ＣＨＴ１をアフリカツメガエルの卵母細胞で発
現させると、Ｎａ+依存的で、ヘミコリニウム−３で完
全に阻害されるコリン取り込み活性が観察された。これ
らの結果から、ＣＨＴ１が高親和性コリントランスポー
ター活性を有することを見い出した。また、本発明者ら
は、ヒト及びマウス由来のコリントランスポーターｃＤ
ＮＡをクローニングし、その塩基配列を決定し、その発
現産物が高親和性コリン取り込み活性を有することを確
認した。本発明は以上のようにして完成するに至ったも
のである。
【０００６】すなわち本発明は、高親和性コリントラン
スポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（請求項１）や、以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコ
ードする遺伝子(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列
からなるタンパク質(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸
配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高親和
性コリントランスポーター活性を有するタンパク質（請
求項２）や、配列番号１に示される塩基配列又はその相
補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤ
ＮＡ（請求項３）や、請求項３記載の遺伝子を構成する
ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有する
タンパク質をコードする線虫由来のＤＮＡ（請求項４）
や、以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードする遺伝
子(ａ)配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタン
パク質(ｂ)配列番号４に示されるアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつ高親和性コリント
ランスポーター活性を有するタンパク質（請求項５）
や、配列番号３に示される塩基配列又はその相補的配列
並びにこれらの配列の一部または全部を含むＤＮＡ（請
求項６）や、請求項６記載の遺伝子を構成するＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高
親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質
をコードするラット由来のＤＮＡ（請求項７）や、以下
の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードする遺伝子(ａ)配
列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつ高親和性コリントランスポ
ーター活性を有するタンパク質（請求項８）や、配列番
号５に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれ
らの配列の一部または全部を含むＤＮＡ（請求項９）
や、請求項９記載の遺伝子を構成するＤＮＡとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ高親和性コ
リントランスポーター活性を有するタンパク質をコード
するヒト由来のＤＮＡ（請求項１０）や、以下の(ａ)又
は(ｂ)のタンパク質をコードする遺伝子(ａ)配列番号８
に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質(ｂ)配列番
号８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配
列からなり、かつ高親和性コリントランスポーター活性
を有するタンパク質（請求項１１）や、配列番号７に示
される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列
の一部または全部を含むＤＮＡ（請求項１２）や、請求
項１２記載の遺伝子を構成するＤＮＡとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ高親和性コリント
ランスポーター活性を有するタンパク質をコードするマ
ウス由来のＤＮＡ（請求項１３）に関する。
【０００７】また本発明は、高親和性コリントランスポ
ーター活性を有するタンパク質（請求項１４）や、配列
番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請
求項１５）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは
付加されたアミノ酸配列からなり、かつ線虫高親和性コ
リントランスポーター活性を有するタンパク質（請求項
１６）や、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる
タンパク質（請求項１７）や、配列番号４に示されるア
ミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、か
つラット高親和性コリントランスポーター活性を有する
タンパク質（請求項１８）や、配列番号６に示されるア
ミノ酸配列からなるタンパク質（請求項１９）や、配列
番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数
個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸
配列からなり、かつヒト高親和性コリントランスポータ
ー活性を有するタンパク質（請求項２０）や、配列番号
８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項
２１）や、配列番号８に示されるアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつマウス高親和性コ
リントランスポーター活性を有するタンパク質（請求項
２２）に関する。
【０００８】また本発明は、高親和性コリントランスポ
ーター活性を有するタンパク質と、マーカータンパク質
及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質
（請求項２３）や、高親和性コリントランスポーター活
性を有するタンパク質が、請求項１５又は１６記載の線
虫高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパ
ク質であることを特徴とする請求項２３記載の融合タン
パク質（請求項２４）や、高親和性コリントランスポー
ター活性を有するタンパク質が、請求項１７又は１８記
載のラット高親和性コリントランスポーター活性を有す
るタンパク質であることを特徴とする請求項２３記載の
融合タンパク質（請求項２５）や、高親和性コリントラ
ンスポーター活性を有するタンパク質が、請求項１９又
は２０記載のヒト高親和性コリントランスポーター活性
を有するタンパク質であることを特徴とする請求項２３
記載の融合タンパク質（請求項２６）や、高親和性コリ
ントランスポーター活性を有するタンパク質が、請求項
２１又は２２記載のマウス高親和性コリントランスポー
ター活性を有するタンパク質であることを特徴とする請
求項２３記載の融合タンパク質（請求項２７）に関す
る。
【０００９】また本発明は、高親和性コリントランスポ
ーター活性を有するタンパク質に特異的に結合する抗体
（請求項２８）や、高親和性コリントランスポーター活
性を有するタンパク質が、請求項１５又は１６記載の線
虫高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパ
ク質であることを特徴とする請求項２８記載の抗体（請
求項２９）や、高親和性コリントランスポーター活性を
有するタンパク質が、請求項１７又は１８記載のラット
高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク
質であることを特徴とする請求項２８記載の抗体（請求
項３０）や、高親和性コリントランスポーター活性を有
するタンパク質が、請求項１９又は２０記載のヒト高親
和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質で
あることを特徴とする請求項２８記載の抗体（請求項３
１）や、高親和性コリントランスポーター活性を有する
タンパク質が、請求項２１又は２２記載のマウス高親和
性コリントランスポーター活性を有するタンパク質であ
ることを特徴とする請求項２８記載の抗体（請求項３
２）や、抗体がモノクローナル抗体であることを特徴と
する請求項２８〜３２のいずれか記載の抗体（請求項３
３）に関する。
【００１０】また本発明は、高親和性コリントランスポ
ーター活性を有するタンパク質を発現することができる
発現系を含んでなる宿主細胞（請求項３４）や、高親和
性コリントランスポーター活性を有するタンパク質が、
請求項１５又は１６記載の線虫高親和性コリントランス
ポーター活性を有するタンパク質であることを特徴とす
る請求項３４記載の宿主細胞（請求項３５）や、高親和
性コリントランスポーター活性を有するタンパク質が、
請求項１７又は１８記載のラット高親和性コリントラン
スポーター活性を有するタンパク質であることを特徴と
する請求項３４記載の宿主細胞（請求項３６）や、高親
和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質
が、請求項１９又は２０記載のヒト高親和性コリントラ
ンスポーター活性を有するタンパク質であることを特徴
とする請求項３４記載の宿主細胞（請求項３７）や、高
親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質
が、請求項２１又は２２記載のマウス高親和性コリント
ランスポーター活性を有するタンパク質であることを特
徴とする請求項３４記載の宿主細胞（請求項３８）に関
する。
【００１１】また本発明は、高親和性コリントランスポ
ーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能
が染色体上で欠損又は過剰発現することを特徴とする非
ヒト動物（請求項３９）や、高親和性コリントランスポ
ーター活性を有するタンパク質が、請求項１５又は１６
記載の線虫高親和性コリントランスポーター活性を有す
るタンパク質であることを特徴とする請求項３９記載の
非ヒト動物（請求項４０）や、高親和性コリントランス
ポーター活性を有するタンパク質が、請求項１７又は１
８記載のラット高親和性コリントランスポーター活性を
有するタンパク質であることを特徴とする請求項３９記
載の非ヒト動物（請求項４１）や、高親和性コリントラ
ンスポーター活性を有するタンパク質が、請求項１９又
は２０記載のヒト高親和性コリントランスポーター活性
を有するタンパク質であることを特徴とする請求項３９
記載の非ヒト動物（請求項４２）や、高親和性コリント
ランスポーター活性を有するタンパク質が、請求項２１
又は２２記載のマウス高親和性コリントランスポーター
活性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項
３９記載の非ヒト動物（請求項４３）や、非ヒト動物
が、マウス又はラットであることを特徴とする請求項３
９〜４３のいずれか記載の非ヒト動物（請求項４４）に
関する。
【００１２】また本発明は、高親和性コリントランスポ
ーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能
が染色体上で欠損した細胞に、請求項８〜１０のいずれ
か記載の遺伝子又はＤＮＡを導入することを特徴とする
高親和性コリントランスポーター活性を有する細胞の調
製方法（請求項４５）や、高親和性コリントランスポー
ター活性を有する細胞が、請求項８〜１０のいずれか記
載の遺伝子又はＤＮＡが染色体にインテグレイトされ、
ステイブルに高親和性コリントランスポーター活性を示
す細胞であることを特徴とする請求項４５記載の高親和
性コリントランスポーター活性を有する細胞の調製方法
（請求項４６）や、請求項４５又は４６記載の高親和性
コリントランスポーター活性を有する細胞の調製方法に
より得られることを特徴とする高親和性コリントランス
ポーター活性を有する細胞（請求項４７）に関する。
【００１３】また本発明は、被検物質の存在下、請求項
１４〜２２のいずれか記載の高親和性コリントランスポ
ーター活性を有するタンパク質の高親和性コリントラン
スポーター活性を測定・評価することを特徴とする高親
和性コリントランスポーター活性促進又は抑制物質のス
クリーニング方法（請求項４８）や、被検物質の存在
下、高親和性コリントランスポーター活性を有するタン
パク質を発現している細胞膜又は細胞をインビトロで培
養し、該細胞膜又は該細胞における高親和性コリントラ
ンスポーター活性を有するタンパク質の活性及び／又は
発現量を測定・評価することを特徴とする高親和性コリ
ントランスポーター活性促進若しくは抑制物質又は高親
和性コリントランスポーター発現促進若しくは抑制物質
のスクリーニング方法（請求項４９）や、高親和性コリ
ントランスポーター活性を有するタンパク質を発現して
いる細胞膜又は細胞が、請求項３４〜３８のいずれか記
載の高親和性コリントランスポーター活性を有するタン
パク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主
細胞又は請求項４７記載の高親和性コリントランスポー
ター活性を有する細胞であることを特徴とする請求項４
９記載の高親和性コリントランスポーター活性促進若し
くは抑制物質又は高親和性コリントランスポーター発現
促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項５
０）や、高親和性コリントランスポーター活性を有する
タンパク質が、組換えタンパク質であることを特徴とす
る請求項４８〜５０のいずれか記載の高親和性コリント
ランスポーター活性促進若しくは抑制物質又は高親和性
コリントランスポーター発現促進若しくは抑制物質のス
クリーニング方法（請求項５１）や、被検物質の存在
下、請求項３９〜４４のいずれか記載の非ヒト動物から
得られた細胞をインビトロで培養し、該細胞における高
親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質
の活性及び／又は発現量を測定・評価することを特徴と
する高親和性コリントランスポーター活性促進若しくは
抑制物質又は高親和性コリントランスポーター発現促進
若しくは抑制物質のスクリーニング方法（請求項５２）
や、被検物質を非ヒト動物に投与し、高親和性コリント
ランスポーター活性を有するタンパク質の活性及び／又
は発現量を評価することを特徴とする高親和性コリント
ランスポーター活性促進若しくは抑制物質又は高親和性
コリントランスポーター発現促進若しくは抑制物質のス
クリーニング方法（請求項５３）や、高親和性コリント
ランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺
伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現した非ヒト動物
に被検物質を投与し、高親和性コリントランスポーター
活性を有するタンパク質の活性及び／又は発現量を評価
することを特徴とする高親和性コリントランスポーター
活性促進若しくは抑制物質又は高親和性コリントランス
ポーター発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方
法（請求項５４）や、高親和性コリントランスポーター
活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色
体上で欠損又は過剰発現した非ヒト動物に被検物質を投
与し、高親和性コリントランスポーター活性を有するタ
ンパク質の活性及び／又は発現量を野生型非ヒト動物の
場合と比較・評価することを特徴とする高親和性コリン
トランスポーター活性促進若しくは抑制物質又は高親和
性コリントランスポーター発現促進若しくは抑制物質の
スクリーニング方法（請求項５５）や、非ヒト動物が、
マウス又はラットであることを特徴とする請求項５２〜
５５のいずれか記載の高親和性コリントランスポーター
活性促進若しくは抑制物質又は高親和性コリントランス
ポーター発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方
法（請求項５６）に関する。
【００１４】また本発明は、請求項４８〜５６のいずれ
か記載のスクリーニング方法により得られる高親和性コ
リントランスポーター活性を有するタンパク質の活性若
しくは発現を促進する物質（請求項５７）や、請求項４
８〜５６のいずれか記載のスクリーニング方法により得
られる高親和性コリントランスポーター活性を有するタ
ンパク質の活性若しくは発現を抑制する物質（請求項５
８）や、高親和性コリントランスポーターの活性増加又
は発現増強を必要としている患者を治療するのに用いら
れる医薬組成物であって、有効成分として請求項１４〜
２２のいずれか記載のタンパク質及び／又は請求項５７
記載の高親和性コリントランスポーター活性を有するタ
ンパク質の活性若しくは発現を促進する物質を含んでな
る医薬組成物（請求項５９）や、高親和性コリントラン
スポーターの活性又は発現の抑制を必要としている患者
を治療するのに用いられる医薬組成物であって、有効成
分として請求項１４〜２２のいずれか記載のタンパク質
及び／又は請求項５８記載の高親和性コリントランスポ
ーター活性を有するタンパク質の活性若しくは発現を抑
制する物質を含んでなる医薬組成物（請求項６０）に関
する。
【００１５】また本発明は、検体中の高親和性コリント
ランスポーターをコードするＤＮＡ配列を、請求項１９
又は２０記載のタンパク質をコードするＤＮＡ配列と比
較することを特徴とする高親和性コリントランスポータ
ーの発現又は活性と関連する疾病の診断方法（請求項６
１）や、請求項１９又は２０記載のタンパク質をコード
するＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部
からなるアルツハイマー症の診断用プローブ（請求項６
２）や、請求項６２記載の診断用プローブ及び／又は請
求項２８〜３３のいずれか記載の抗体を含有することを
特徴とするアルツハイマー症の診断薬（請求項６３）に
関する。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明の配列番号１に記載される
線虫高親和性コリントランスポーターのｃＤＮＡは、C.
elegansゲノム・プロジェクトからＮａ+依存性トラン
スポーターファミリーのメンバーと予測される完全長の
候補ｃＤＮＡから調製したそれぞれのｃＲＮＡを、アフ
リカツメガエル卵母細胞に注入し高親和性コリン取り込
みを調べることにより得ることができる。その際、哺乳
類の脳シナプトソームでは高親和性コリン取り込みは１
μＭのＨＣ３で完全に阻害される（Ｋｉ＝１０−１００
ｎＭ）のに対し、あらゆる細胞に分布している低親和性
コリン取り込みはより高濃度のＨＣ３でのみ阻害される
（Ｋｉ＝５０μＭ）ことから、１μＭのヘミコリニウム
−３（hemicholinium-3；ＨＣ３）に対する感受性を高
親和性コリン取り込みの判断基準とすることができる。
例えば、以下のようにして線虫（C.elegans）の候補ｃ
ＤＮＡから目的とする遺伝子の同定、発現、局在を確か
めることができる。
【００１７】高親和性コリン取り込みにおいて、Ｃ４８
Ｄ１．３と予測された遺伝子に相当するｃＤＮＡは１μ
ＭのＨＣ３で阻害される有意なコリン取り込みを促すこ
とが分かった。図１には、Ｃ４８Ｄ１．３ｃＲＮＡまた
は水を注入したアフリカツメガエル卵母細胞の［3Ｈ］
コリンの取り込み結果が示されている。図１中、黒と白
のカラムは１μＭのＨＣ３の非存在下、存在下でのコリ
ン取り込みをそれぞれ示し、それぞれのカラムは平均±
ＳＥＭ（ｎ＝６〜８卵母細胞) で表示されている。また
図２には、Ｎａ+のコリン取り込みに対する効果が示さ
れ、黒カラムは標準溶液中で測定したコリン取り込みを
示し ([Ｎａ+]＝１００ｍＭ)、白カラムはＮａ+非存在
下でのコリン取り込みを示している（Ｎａ+はＬｉ+に置
き換えられた）。さらに図３にはＨＣ３によるコリン取
り込みの阻害が示されている。かかる図２，３から、こ
の取り込みはＮａ+ 依存性であり、ＨＣ３のＫｉは５０
ｎＭと推定された。このｃＤＮＡクローンはｃｈｏ−１
（high-affinity cholinetransporter-1）と名付けられ
た。
【００１８】ｃＤＮＡとゲノムの塩基配列の比較によ
り、ｃｈｏ−１遺伝子は９つのエクソンからなることが
分かった。ｃｈｏ−１のｃＤＮＡの塩基配列から予想さ
れるタンパク質は５７６アミノ酸残基であり（図４参
照）、この配列番号２に示されるタンパク質は常法によ
り作製することができる。また、入手できるデータベー
スを検索したところｃｈｏ−１のアミノ酸配列はＮａ+
依存性グルコーストランスポーターファミリーのメンバ
ーに対して弱いながら有意な相同性を示した。疎水性分
析と他のトランスポーターとの比較から１２回膜貫通領
域をもつことが示唆される（図７参照）。
【００１９】次に、線虫（C.elegans）の神経系でｃｈ
ｏ−１を発現している細胞を同定するために、ｃｈｏ−
１遺伝子上流５．１ｋｂの領域を融合させたグリーン蛍
光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を線虫に導入し、cho-
1::gfpを発現している神経細胞の分布を調べた。cho-
1::gfpレポーターＤＮＡを染色体外に保持しているＬ１
幼虫の写真を図５として示す（スケールバー；５０μ
ｍ）。図５中、矢頭は神経環を示す。腹部神経索ではＧ
ＦＰはコリン作動性運動神経においてのみ発現している
が、おそらく染色体外のレポーターＤＮＡが欠失したた
めにいくつかのＤＡ、ＤＢ神経細胞はＧＦＰを発現して
いない。これはｃｈｏ−１がコリン作動性神経の高親和
性コリントランスポーターであることを裏付けている。
【００２０】本発明の配列番号３に記載されるラット高
親和性コリントランスポーターのｃＤＮＡは、例えば次
のようにして調製することができる。脊椎動物のｃｈｏ
−１相同分子に注目し、ｃｈｏ−１から予想されるアミ
ノ酸配列でデータベースを検索し、ヒトのgenomic surv
ey sequence（ＧＳＳ）で一つの候補（GenBank accessi
on number：AQ316435）を同定した。このヒトのゲノム
ＤＮＡとｃｈｏ−１の塩基配列の相同性に基づき、縮重
プライマーを用いたＰＣＲでラット脊髄ｃＤＮＡからｃ
ＤＮＡ断片を増幅した。この断片を使ってラット脊髄ｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングし陽性のｃＤＮＡ
クローンを得た。最長の読み枠の塩基配列からｃｈｏ−
１と５１％の同一性および７０％の類似性を示す５８０
アミノ酸残基のタンパク質が予想された（図４参照）。
このラットｃＤＮＡクローンはＣＨＴ１と名付けられ
た。図４には、ラットＣＨＴ１と線虫ＣＨＯ−１のそれ
ぞれのアミノ酸配列が、同一残基は黒囲みで、類似残基
はグレー囲みで表示されている。予想される膜貫通領域
Ｉ−ＸIIは下線が引かれている。この配列番号４で示さ
れるタンパク質は常法により作製することができる。
【００２１】上記ＣＨＴ１のアミノ酸配列はＮａ+依存
性グルコーストランスポーターファミリーのメンバーと
有意な相同性を有する（２０−２５％）。遺伝研究所
（三島、日本）のプログラムCLUSTALWを用いてneighbor
-joining法で作製したＮａ+依存性グルコーストランス
ポーターファミリーの系統樹を図６に示す。図６には、
ラットＣＨＴ１に対してそれぞれのタンパク質が含む同
一のアミノ酸の割合％が右側に示されている。一方、酵
母のコリントランスポーター（J. Biol. Chem. 265, 15
996-16003, 1990）、当初は高親和性コリントランスポ
ーターと報告されていたクレアチントランスポーター
（Biochem. Biophys. Res. Commun. 198, 637-645, 199
4）、及び他の神経伝達物質トランスポーターとは相同
性をもたない。
【００２２】ＣＨＴ１の予想されるトポロジーは線虫Ｃ
ＨＯ−１と本質的に同じであると考えられ、ラットＣＨ
Ｔ１の予想されるトポロジーを図７に示す。図７中、黒
の円は同一残基、グレーの円はよく保存された残基、白
の円は類似していない残基を示す。枝線は予想される糖
鎖付加部位を示す。円中のＰはタンパク質キナーゼＣに
よるリン酸化予想部位を示す。
【００２３】次に、ノザン解析やin situ ハイブリダイ
ゼーションでＣＨＴ１のｍＲＮＡの発現分布を調べた。
ラットのさまざまな組織のノザン解析からおよそ５ｋｂ
の長さの転写産物の発現を確認した。図８には、ラット
組織でのＣＨＴ１のｍＲＮＡ転写産物のノザン解析の結
果が示されている。また、ＲＮＡの標準（０．２４−
９．５ｋｂ；GIBCO BRL)の長さが左に示されている。図
８からわかるように、前脳基底部や脳幹、脊髄で多く、
線条体では少なかった。これらの組織はいずれもコリン
作動性神経を含むことが知られている。一方、脳の他の
領域や非神経系の組織では転写産物は確認されなかっ
た。
【００２４】これらの結果と一致して、in situ ハイブ
リダイゼーションでは線条体、前脳基底部の細胞群、脊
髄前角を含む主要なコリン作動性神経の細胞集団でＣＨ
Ｔ１のｍＲＮＡの発現が確認された。図９及び図１０
（スケールバー；１mm）には、ラット脳及び脊髄におけ
るＣＨＴ１転写産物のin situ ハイブリダイゼーション
解析に関する、ジゴキシゲニンでラベルされたアンチセ
ンスのｃＲＮＡプローブにハイブリダイズされた明視野
での切片の顕微鏡写真が図示されている。図９から、Ｃ
ＨＴ１のｍＲＮＡ転写産物はvertical及びhorizontal l
imbs of the diagonal band (VDB, HDB), medial septa
l nucleus (MS), caudate and putamen (CPu), olfacto
ry tubercle (Tu)で検出されていることが、図１０から
脊髄では前角 (VH)で発現が観察されることがわかる。
また、小胞アセチルコリントランスポーターのプローブ
でハイブリダイズされた隣の切片も本質的に同様な分布
を示した。この発現分布はすでに報告されているコリン
アセチル基転移酵素や小胞アセチルコリントランスポー
ターの分布と本質的に同じである。これらの結果はＣＨ
Ｔ１のｍＲＮＡがコリン作動性神経に限局して発現して
いることを示している。
【００２５】次にＣＨＴ１によるコリン取り込みをアフ
リカツメガエル卵母細胞で調べた。ＣＨＴ１のｃＲＮＡ
を注入した卵母細胞のコリン取り込みは水を注入したコ
ントロールよりも２−４倍高かった。図１１には、ＣＨ
Ｔ１のｃＲＮＡまたは水を注入したアフリカツメガエル
卵母細胞の［3Ｈ］コリンの取り込み結果が示されてい
る。図１１中、黒と白のカラムは１００ｍＭのＮａＣｌ
あるいはＬｉＣｌを含む標準溶液でのコリン取り込みを
それぞれ示し、それぞれのカラムは平均±ＳＥＭ（ｎ＝
６〜８卵母細胞）で表示されている。またコリン濃度の
コリン取り込みに対する効果が図１２に示されている。
図１２においては、水を注入した卵母細胞の取り込みを
ｃＲＮＡのそれから差し引いて、ＣＨＴ１によるコリン
取り込みを算出し、取り込みはミカエリス・メンテンの
曲線に近似させている。図１２に示されるように、ＣＨ
Ｔ１のコリン取り込みはコリン濃度を増加させると飽和
した（Ｋｍ＝２．２±０．２μＭ，ｎ＝３）。
【００２６】次に、ＨＣ３によるコリン取り込みの阻害
の結果を図１３に示す。図１３から、コントロールの内
因性のコリン取り込みのＫｍは１０μＭより高く、ＣＨ
Ｔ１のコリン取り込みは０．１μＭのＨＣ３で完全に阻
害される（Ｋｉ＝２−３ｎＭ）のに対して、コントロー
ルでは１０μＭのＨＣ３でわずかしか阻害されないこと
がわかる。図１４に示されるように、ＣＨＴ１のコリン
取り込みのイオン依存性を調べるとＮａ+だけでなくＣ
ｌ-依存的であることがわかった。黒と白のカラムは水
を注入した卵母細胞のコリン取り込み、ｃＲＮＡを注入
した卵母細胞のコリン取り込みをそれぞれ示す（標準溶
液中の１００ｍＭのＮａＣｌは図で示されているそれぞ
れの１００ｍＭの塩で置換）。これらの結果は脳シナプ
トソームの高親和性コリン取り込みから期待される特性
（コリンに対する高い親和性、ＨＣ３に対する高い感受
性、Ｎａ+−Ｃｌ-依存性）をＣＨＴ１がもつことを示し
ている（J. Neurochem. 27, 93-99, 1976）。
【００２７】また、ＣＨＴ１のｃＤＮＡとベクター（コ
ントロール）をそれぞれ導入したＣＯＳ７細胞から調製
した膜の［3Ｈ］ＨＣ３結合活性を調べた。結果を図１
５に示す。図１５からわかるように、ＣＨＴ１を発現さ
せた細胞の膜ではＮａ+依存的な［3Ｈ］ＨＣ３結合が観
察されたが、コントロールの膜では観察されなかった。
次に、特異的［3Ｈ］ＨＣ３結合の飽和解析を行った。
図１６に示されるように、平衡解離定数（Ｋｄ）は１．
６±０．２μＭ（ｎ＝３）であると推定された。この値
は脳シナプトソームで報告されている数値と類似してい
た（J. Neurochem. 60, 1191-1201, 1993、Life Sci. 3
5, 2335-2343, 1984、Brain Res. 348, 321-330, 198
5）。さらに、ＨＣ３、コリン(Cho)、アセチルコリン(A
ch)による特異的［3Ｈ］ＨＣ３結合の置換について検討
した。アセチルコリンは１μＭフィゾスチグミン存在下
で測定した。結果を図１７に示す。図１７から、
［3Ｈ］ＨＣ３の特異的結合はアセチルコリンよりも約
１０倍以上低い濃度で置換されることがわかる。これら
の結果はＣＨＴ１が高親和性コリントランスポーターで
あるだけでなくＨＣ３結合部位でもあることを示してい
る。
【００２８】本発明の配列番号５に記載されるヒト高親
和性コリントランスポーターのｃＤＮＡは、例えば次の
ようにして調製することができる。線虫（C. elegans）
ＣＨＯ−１のアミノ酸配列でデーターベース検索を行
い、有意な相同性がある特定のヒトゲノムＤＮＡ断片の
配列（human genomic survey sequenceの１クローンで
あるＲ−１０７Ｐ１２；GenBank accession number：AQ
316435）を見い出し、かかるＤＮＡ断片の塩基配列を基
にＰＣＲの遺伝子特異的プライマーを設計した。ヒト全
脳のMarathon-ReadyTM cDNA（クローンテック社製）と
付属のアダプタープライマーを用いて５′−ＲＡＣＥ
（rapid amplification of cDNA ends）及び３′−ＲＡ
ＣＥを行った。この得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ用クロ
ーニングベクターにクローン化し、挿入ＤＮＡの塩基配
列を決定した。また、このＤＮＡ配列から予想されるア
ミノ酸配列は配列番号６で示されている。かかる配列番
号６で示されるヒト高親和性コリントランスポーター活
性を有するタンパク質は、配列番号５に示されるＤＮＡ
配列情報に基づいて常法により作製することができる。
【００２９】本発明の配列番号７に記載されるマウス高
親和性コリントランスポーターのｃＤＮＡは、例えば次
のようにして調製することができる。線虫（C. elegan
s）ＣＨＯ−１のアミノ酸配列でデーターベース検索を
行い、有意な相同性がある特定のヒトゲノムＤＮＡ断片
の配列（human genomic survey sequenceの１クローン
であるＲ−１０７Ｐ１２；GenBank accession number：
AQ316435）を見い出し、かかるＤＮＡ断片の塩基配列を
基にＰＣＲの遺伝子特異的プライマーを設計した。マウ
ス全脳のMarathon-ReadyTM cDNA（クローンテック社
製）と付属のアダプタープライマーを用いて５′−ＲＡ
ＣＥ（rapid amplification of cDNA ends）及び３′−
ＲＡＣＥを行った。この得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ用
クローニングベクターにクローン化し、挿入ＤＮＡの塩
基配列を決定した。また、このＤＮＡ配列から予想され
るアミノ酸配列は配列番号８で示されている。かかる配
列番号８で示されるマウス高親和性コリントランスポー
ター活性を有するタンパク質は、配列番号７に示される
ＤＮＡ配列情報に基づいて常法により作製することがで
きる。
【００３０】本発明の高親和性コリントランスポーター
活性を有するタンパク質としては、天然由来のタンパク
質であっても組換えタンパク質であってもよく、上記具
体的に開示した配列番号２、４、６及び８で示されるも
のの他に、配列番号２、４、６及び８で示されるアミノ
酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高親
和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質も
包含され、これらは公知の方法で調製することができ
る。また、本発明の高親和性コリントランスポーター活
性を有するタンパク質をコードする遺伝子又はＤＮＡと
しては、上記具体的に開示された配列番号１、３、５及
び７で示されるものの他に、配列番号２、４、６及び８
で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列か
らなり、かつ高親和性コリントランスポーター活性を有
するタンパク質をコードする遺伝子又はＤＮＡや、これ
ら遺伝子又はＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつ高親和性コリントランスポーター活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも包含され、
これらは公知の方法で調製することができる。
【００３１】ところで、コリン作動性神経は学習・記憶
に非常に重要な役割を果たしている。この神経の障害と
痴呆の重篤さは相関する。アセチルコリン合成の律速段
階は高親和性コリン取り込みであり、その活性は神経活
動や種々の刺激で制御されている。さらにアルツハイマ
ー病患者の脳では高親和性コリン取り込みやＨＣ３結合
活性が亢進している（Trends Neurosci. 15, 117-122,
1992、Ann. NY Acad.Sci. 777, 197-204, 1996、J. Neu
rochem. 69, 2441-2451, 1997）。上記高親和性コリン
トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする
遺伝子又はＤＮＡや、高親和性コリントランスポーター
活性を有するタンパク質のクローニングはこれらの制御
の分子機構を明らかにしたり、アルツハイマー病の新し
い療法を開発したりするために重要である。
【００３２】本発明の融合タンパク質とは、線虫、ラッ
ト、ヒト、マウス等の高親和性コリントランスポーター
活性を有するタンパク質に、マーカータンパク質及び／
又はペプチドタグとを結合させたものをいい、マーカー
タンパク質としては、従来知られているマーカータンパ
ク質であればどのようなものでもよく、例えば、アルカ
リフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰ
などを具体的に挙げることができ、また本発明における
ペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬ
ＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチド
タグを具体的に例示することができる。かかる融合タン
パク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴ
ＡとＨｉｓタグの親和性を利用した高親和性コリントラ
ンスポーター活性を有するタンパク質の精製や、高親和
性コリントランスポーター活性を有するタンパク質の検
出や、高親和性コリントランスポーター活性を有するタ
ンパク質に対する抗体の定量、アルツハイマー症の診断
用マーカーなどとして、また当該分野の研究用試薬とし
ても有用である。
【００３３】本発明の高親和性コリントランスポーター
活性を有するタンパク質に特異的に結合する抗体として
は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ
抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を
具体的に挙げることができ、これらは上記高親和性コリ
ントランスポーター活性を有するタンパク質を抗原とし
て用いて常法により作製することができるが、その中で
もモノクローナル抗体がその特異性の点でより好まし
い。かかるモノクローナル抗体等の高親和性コリントラ
ンスポーター活性を有するタンパク質に特異的に結合す
る抗体は、例えば、アルツハイマー症の診断や高親和性
コリントランスポーターの制御の分子機構を明らかにす
る上で有用である。
【００３４】高親和性コリントランスポーター活性を有
するタンパク質に対する抗体は、慣用のプロトコールを
用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該高親和性コリ
ントランスポーター活性を有するタンパク質若しくはエ
ピトープを含む断片、又は該タンパク質を膜表面に発現
した細胞を投与することにより産生され、例えばモノク
ローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産
生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 2
56, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイ
ブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥ
ＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND
CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 198
5）など任意の方法を用いることができる。
【００３５】本発明の上記高親和性コリントランスポー
ター活性を有するタンパク質に対する一本鎖抗体をつく
るために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778
号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現
させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳
動物等を利用したり、上記抗体を用いて、その高親和性
コリントランスポーター活性を有するタンパク質を発現
するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロ
マトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもで
きる。高親和性コリントランスポーター活性を有するタ
ンパク質に対する抗体は、とりわけ、アルツハイマー症
等の診断や治療に使用できる可能性がある。
【００３６】本発明はまた、上記高親和性コリントラン
スポーター活性を有するタンパク質を発現することがで
きる発現系を含んでなる宿主細胞に関する。かかる高親
和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質を
コードする遺伝子の宿主細胞への導入は、Davisら（BAS
IC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambroo
kら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd E
d., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室
マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウ
ムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介
トランスフェクション、トランスベクション(transvect
ion)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介
トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質
導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾
丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うこ
とができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、スト
レプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィ
ロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス
等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ
９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、
ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞
（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを
欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９
３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞等の動物細胞や、植
物細胞等を挙げることができる。
【００３７】また、発現系としては、上記高親和性コリ
ントランスポーター活性を有するタンパク質を宿主細胞
内で発現させることができる発現系であればどのような
ものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来
する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラス
ミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニ
アウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬
病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリ
オファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合
せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミ
ドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要
素に由来するものを挙げることができる。この発現系は
発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を
含んでいてもよい。
【００３８】上記発現系を含んでなる宿主細胞やかかる
細胞の細胞膜、またかかる細胞を培養して得られる高親
和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質
は、後述するように本発明のスクリーニング方法に用い
ることができる。例えば、細胞膜を得る方法としては、
F. Pietri-Rouxel（Eur. J. Biochem., 247, 1174-117
9, 1997）らの方法などを用いることができ、また、か
かる高親和性コリントランスポーター活性を有するタン
パク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アン
モニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまた
はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース
クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシ
アパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト
グラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体
クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティ
ークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例え
ば、抗高親和性コリントランスポーター活性を有するタ
ンパク質抗体を結合させたカラムや、上記高親和性コリ
ントランスポーターに通常のペプチドタグを付加した場
合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合した
カラムを用いることにより、高親和性コリントランスポ
ーター活性を有するタンパク質を得ることができる。
【００３９】本発明において、上記高親和性コリントラ
ンスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝
子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、染色体上
の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパ
ク質をコードする遺伝子の一部若しくは全部が破壊・欠
損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、高親和性
コリントランスポーター活性を有するタンパク質を発現
する機能を失なった非ヒト動物をいい、また、高親和性
コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコー
ドする遺伝子機能が染色体上で過剰発現する非ヒト動物
とは、野生型非ヒト動物に比べてかかる高親和性コリン
トランスポーター活性を有するタンパク質を大量に産生
する非ヒト動物をいう。そして、本発明における非ヒト
動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物などの非
ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限
定されるものではない。
【００４０】ところで、メンデルの法則に従い出生して
くるホモ接合体非ヒト動物には、高親和性コリントラン
スポーター活性を有するタンパク質欠損型又は過剰発現
型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非
ヒト動物における欠損型又は過剰発現型とその同腹の野
生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比
較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動
物、すなわち高親和性コリントランスポーター活性を有
するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠
損又は過剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには
同腹の動物を、例えば下記に記載する本発明のスクリー
ニングに際して併用することが好ましい。かかる高親和
性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコ
ードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する
非ヒト動物の作製方法を、高親和性コリントランスポー
ター活性を有するタンパク質のノックアウトマウスやト
ランスジェニックマウスを例にとって以下説明する。
【００４１】例えば、高親和性コリントランスポーター
活性を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色
体上で欠損したマウス、すなわち高親和性コリントラン
スポーター活性を有するタンパク質ノックアウトマウス
は、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法によ
り得られた遺伝子断片を用いて、高親和性コリントラン
スポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
をスクリーニングし、スクリーニングされた高親和性コ
リントランスポーター活性を有するタンパク質をコード
する遺伝子をウイルスベクター等を用いてサブクローン
し、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このクロー
ンの高親和性コリントランスポーター活性を有するタン
パク質をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネ
オ遺伝子カセット等に置換し、３′末端側にジフテリア
トキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘル
ペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝
子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベク
ターを作製する。
【００４２】この作製されたターゲティングベクターを
線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等に
よってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相
同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（Ｇ
ＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥ
Ｓ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目
的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により
確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のク
ローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクション
し、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウス
を作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとイン
タークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることが
でき、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロス
させることによって、本発明の高親和性コリントランス
ポーター活性を有するタンパク質ノックアウトマウスを
作製することができる。また、高親和性コリントランス
ポーター活性を有するタンパク質ノックアウトマウスが
生起しているかどうかを確認する方法としては、例え
ば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離
してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマ
ウスの発現をウエスタンブロット法等により調べる方法
がある。
【００４３】高親和性コリントランスポーター活性を有
するタンパク質のトランスジェニックマウスは、高親和
性コリントランスポーター活性を有するタンパク質をコ
ードするｃＤＮＡにチキンβ−アクチン、マウスニュー
ロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラビ
ットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロン
を融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウ
ス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られ
た卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植
し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから
前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することによりか
かるトランスジェニックマウスを創製することができ
る。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウス
の尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入した高親和性コリ
ントランスポーター活性を有するタンパク質をコードす
る遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーショ
ン法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行
うことができる。
【００４４】また、本発明の高親和性コリントランスポ
ーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子又は
ＤＮＡの全部あるいは一部を用いると、アルツハイマー
症等の遺伝子治療に有効な細胞を調製することができ
る。本発明におけるこれら細胞の調製方法としては、高
親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した細胞に、
上記本発明の遺伝子又はＤＮＡの全部あるいは一部をト
ランスフェクション等により導入し、高親和性コリント
ランスポーター活性を有する細胞を得る方法を挙げるこ
とができ、特に、かかる高親和性コリントランスポータ
ー活性を有する細胞としては、上記遺伝子又はＤＮＡ等
が染色体にインテグレイトされ、ステイブルに高親和性
コリントランスポーター活性を示す細胞を用いることが
好ましい。
【００４５】また、上記高親和性コリントランスポータ
ー活性を有するタンパク質をコードする遺伝子若しくは
ＤＮＡ、高親和性コリントランスポーター活性を有する
タンパク質、高親和性コリントランスポーター活性を有
するタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチ
ドタグとを結合させた融合タンパク質、高親和性コリン
トランスポーター活性を有するタンパク質に対する抗
体、高親和性コリントランスポーター活性を有するタン
パク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主
細胞、高親和性コリントランスポーター活性を有する細
胞等を用いると、アルツハイマー症等のような症状の治
療に有用な薬剤、すなわち高親和性コリントランスポー
ター活性促進若しくは抑制物質又は高親和性コリントラ
ンスポーター発現促進若しくは抑制物質をスクリーニン
グすることができる。
【００４６】本発明におけるスクリーニング方法として
は、被検物質の存在下、上記本発明の高親和性コリント
ランスポーター活性を有するタンパク質の高親和性コリ
ントランスポーター活性を測定・評価する方法や、被検
物質の存在下、本発明の高親和性コリントランスポータ
ー活性を有するタンパク質を発現している細胞膜又は細
胞をインビトロで培養し、該細胞における高親和性コリ
ントランスポーター活性を有するタンパク質の活性及び
／又は発現量を測定・評価する方法や、前記高親和性コ
リントランスポーター活性を有するタンパク質をコード
する遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒ
ト動物及び／又は野生型非ヒト動物に被検物質を投与
し、本発明の高親和性コリントランスポーター活性を有
するタンパク質の活性及び／又は発現量を測定・評価す
る方法等を挙げることができる。上記細胞膜又は細胞と
しては、前記高親和性コリントランスポーター活性を有
するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠
損又は過剰発現する非ヒト動物又は野生型非ヒト動物な
どから得られる初代培養した細胞などの細胞や、本発明
の高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパ
ク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細
胞や、本発明の高親和性コリントランスポーター活性を
有する細胞や、これら細胞の細胞膜などを具体的に例示
することができる。
【００４７】上記被検物質と高親和性コリントランスポ
ーター活性を有するタンパク質とを用いたスクリーニン
グ方法について、以下に具体的に例を挙げて説明する
が、本発明のスクリーニング方法はこれらに限定される
ものではない。高親和性コリントランスポーター活性を
有するタンパク質発現細胞を被検物質の存在下で培養
し、一定時間培養後細胞膜表面に発現された高親和性コ
リントランスポーター活性を有するタンパク質が減少又
は増加したことを、本発明の高親和性コリントランスポ
ーター活性を有するタンパク質に特異的に結合する抗体
を用いて、ＥＬＩＳＡ等による免疫化学的に検出して、
あるいはｍＲＮＡの発現が抑制又は促進したことを指標
として評価することができる。また、かかるｍＲＮＡの
検出法は、ＤＮＡチップ、ノーザンハイブリダイゼーシ
ョン等の方法で行なうことができる他、高親和性コリン
トランスポーターをコードする遺伝子のプロモーターの
下流にルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子をつない
だ遺伝子を導入した細胞を用いると、被検物質による高
親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子の発現抑制又は促進は、前記レポー
ター遺伝子の活性を指標に検出することが可能である。
【００４８】また本発明は、高親和性コリントランスポ
ーター活性を有するタンパク質の活性又は発現の促進を
必要としている患者を治療するのに用いられる医薬組成
物や、高親和性コリントランスポーター活性を有するタ
ンパク質の活性又は発現の抑制を必要としている患者を
治療するのに用いられる医薬組成物であって、有効成分
として高親和性コリントランスポーター活性を有するタ
ンパク質や、高親和性コリントランスポーター活性を有
するタンパク質の活性若しくは発現を促進する物質又は
高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク
質の活性若しくは発現を抑制する物質を含んでなる医薬
組成物に関する。高親和性コリントランスポーター活性
を有するタンパク質は、多くの病理を含めて多数の生物
学的機能に関与していることから、高親和性コリントラ
ンスポーター活性を有するタンパク質を刺激し得る化合
物や、その機能を阻害し得る化合物は医薬としての用途
が期待できる。
【００４９】上記高親和性コリントランスポーター活性
を有するタンパク質の活性若しくは発現を促進又は抑制
する物質としては、高親和性コリントランスポーター活
性を有するタンパク質に結合して、あるいは上流のシグ
ナル伝達分子に作用して、単独で高親和性コリントラン
スポーター活性を有するタンパク質の活性若しくは発現
を促進する物質又はその活性若しくは発現を阻害・拮抗
する物質であればどのようなものでもよく、例えば、抗
体、高親和性コリントランスポーター活性を有するタン
パク質のリガンド、このタンパク質の断片及び断片をコ
ードするオリゴヌクレオチド等を具体的に挙げることが
でき、またこれらはアルツハイマー疾等のような症状の
治療及び予防目的等の医薬として使用することができる
が、これらの用途に限定されるものではない。
【００５０】本発明はまた、検体中の高親和性コリント
ランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡ配列を、本発明の高親和性コリントランスポーター
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列と比較
することからなる、高親和性コリントランスポーター活
性を有するタンパク質の活性又は発現と関連する疾病の
診断方法に関する。高親和性コリントランスポーター活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの変異型の検
出は、遺伝子に変異がある個体をＤＮＡレベルで見い出
すことにより行うことができ、高親和性コリントランス
ポーター活性を有するタンパク質の過少発現、過剰発現
又は変異発現により生ずる疾病の診断に有効である。か
かる検出に用いられる検体としては、被験者の細胞、例
えば血液、尿、唾液、組織等の生検から得ることができ
るゲノムＤＮＡや、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを具体的に挙げ
ることができるがこれらに限定されるものではなく、か
かる検体を使用する場合、ＰＣＲ等により増幅したもの
を用いてもよい。そして、塩基配列の欠失や挿入変異
は、正常な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズ
の変化により検出でき、また点突然変異は増幅ＤＮＡを
標識高親和性コリントランスポーター活性を有するタン
パク質をコードする遺伝子とハイブリダイズさせること
で同定することができる。このように、高親和性コリン
トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする
遺伝子の変異を検出することで、アルツハイマー疾等の
ような症状の診断又は判定をすることができる。
【００５１】本発明はまた、高親和性コリントランスポ
ーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ又は
ＲＮＡのアンチセンス鎖の全部又は一部からなるアルツ
ハイマー症等のような症状の疾患の診断用プローブ、及
び当該プローブ及び／又は本発明の高親和性コリントラ
ンスポーター活性を有するタンパク質に特異的に結合す
る抗体を含有してなるアルツハイマー疾等のような症状
の疾患の診断薬に関する。前記診断用プローブとして
は、高親和性コリントランスポーター活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（ｃ
ＲＮＡ）のアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プロ
ーブとして成立する程度の長さ（少なくとも２０ベース
以上）を有するものであれば特に制限されるものではな
い。かかるプローブ及び／又は本発明の高親和性コリン
トランスポーター活性を有するタンパク質に特異的に結
合する抗体をアルツハイマー症等のような症状の診断薬
の有効成分とするためには、プローブが分解されないよ
うな適当なバッファー類や滅菌水に溶解することが好ま
しい。また、これらの診断薬を用いた、免疫染色法（De
v. Biol. 170, 207-222, 1995、J. Neurobiol. 29,
1-17, 1996）や、In situ ハイブリダイゼーション法
（J. Neurobiol. 29, 1-17, 1996）や、in situ PCR
法等の方法によりアルツハイマー症等のような症状の疾
患を診断することもできる。
【００５２】以下上記の各種実験における実験方法等を
さらに詳細に説明する。 （高親和性コリントランスポーターｃＤＮＡのクローニ
ング）線虫高親和性コリントランスポーターの候補のｃ
ＤＮＡは、種々の発生段階の線虫混合物のpoly(A)+RNA
から逆転写ＰＣＲ及び３′ＲＡＣＥで単離した。プロト
コールに従ってMarathonTM cDNA Amplification Kit
(クローンテック社製)を用いた。ＰＣＲの順方向のプラ
イマーはＣ．ｅｌｅｇａｎｓゲノム・プロジェクトから
入手したＤＮＡ塩基配列に基いて、予測遺伝子の暫定的
な翻訳開始点で設計した。増幅されたＰＣＲ産物を改変
pSPUTKベクター（ストラタジーン社製）のＮｃｏＩ（平
滑化）部位とＮｏｔＩ部位にサブクローニングし、挿入
ＤＮＡの塩基配列を決定した。ラットのＣＨＴ１ｃＤＮ
ＡはGeneTrapper cDNA PositiveSelection System (ギ
ブコバイオラッドラボレトリー：GIBCO BRL)をプロトコ
ール通りに使用してラット脊髄ｃＤＮＡライブラリーか
ら単離した。用いたプライマーは縮重ＰＣＲで得られた
ｃＤＮＡ断片の塩基配列から設計した。得られたｃＤＮ
Ａクローンを解析した結果陽性だったクローンをpSPUTK
ベクター及びpcDNA3.1+ ベクター (インビトロジェン社
製) にサブクローニングした。
【００５３】（アフリカツメガエル卵母細胞での発現）
ｃＲＮＡはキャップアナログ存在下でＳＰ６またはＴ７
ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで合成した。キ
ャップ化ＲＮＡ２０−３０ｎｇをアフリカツメガエル卵
母細胞（ステージＶ−VI）に微量注入した。取り込み測
定は文献（Nature 360, 467-471, 1992）に述べられて
いる方法と本質的に同様に行った。コリン取り込みはＲ
ＮＡ注入の２−３日後に０．７５ｍｌの標準液中（０．
０１−１μＭの［3Ｈ］−コリン、１００ｍＭのＮａＣ
ｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＣ
ａＣｌ2、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＴｒｉｓ：
ｐＨ７．４） の卵母細胞（６−８個）を用いて３０−
６０分間行った。取り込み後の卵母細胞は１０％のＳＤ
Ｓで可溶化して、液体シンチレーションカウンターで［
3Ｈ］量を測定した。
【００５４】（ＧＦＣ発現コンストラクト）cho-1::gfp
の転写融合コンストラクトは文献（Gene 212, 127-135,
1998）で述べられている方法と同様にＰＣＲで作製し
た。核移行シグナル配列（ＮＬＳ）の下流にあるグリー
ン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子をｃｈ
ｏ−１翻訳開始点からアミノ酸３残基分下流の位置に読
み枠が合うように挿入した。ＮＬＳとｇｆｐ遺伝子はpP
D104.53ベクターから増幅した。ｃｈｏ−１翻訳開始点
から５．１ｋｂ上流領域を調製するためにｃｈｏ−１の
最初のアミノ酸３残基分を含むように設計したＰＣＲプ
ライマーを用いた。文献（EMBO J. 10, 3959-3970, 199
1）で述べられている方法と同様にｒｏｌ−６（ｓｕ１
００６）マーカーと作製したＤＮＡを線虫の生殖器官に
同時注入した。
【００５５】（ノザン解析）ラットのさまざまな組織か
ら調製した６μｇのpoly(A)+RNAをホルムアルデヒド−
アガロース電気泳動で分離し、ナイロン膜に転写した。
次にハイブリダイゼーション溶液（最終濃度で５０％の
ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×Denhardt's solutio
n、０．５％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのsalmon sper
m DNAを含む溶液）中で、ランダム・プライム法で［32
Ｐ］ラベルしたＣＨＴ１のｃＤＮＡ断片に対して４２℃
で１６時間ハイブリダイズさせた。ナイロン膜は最終条
件（０．１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ：６５℃）で
洗浄後、エンハンシングスクリーン（enhancing scree
n）と共に７日間オートラジオグラフィーを行った。
【００５６】（in situ ハイブリダイゼーション）ジゴ
キシゲニンでラベルしたアンチセンスの転写産物はin v
itroで合成した。転写産物は平均長２００〜４００塩基
対になるまでアルカリ分解を行った。新鮮凍結組織のク
リオスタット切片（１０〜２０μｍ）を用いた。ハイブ
リダイゼーションは1×Denhardt's 溶液［最終濃度で５
０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５ｍＭ
のＥＤＴＡ、０．３ＭのＮａＣｌ、５０％のホルムアミ
ド、１０％のデキストランサルフェート、１ｍｇ／ｍｌ
の大腸菌（E. coli）のｔＲＮＡを含む溶液］に溶解さ
せたラベル化ｃＲＮＡプローブ（およそ１μｇ／ｍｌ）
で４５℃で２０時間行った。次に切片を２×ＳＳＣ／５
０％のホルムアミド中で２回、１×ＳＳＣ／５０％のホ
ルムアミド中で１回、いずれも４５℃で洗浄した。ハイ
ブリダイズしたプローブを抗ジゴキシゲニンＦａｂ断片
（Boehringer-Mannheim）とＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質を用
いて可視化した。切片は基質溶液中で２４−４８時間反
応させた。
【００５７】（結合実験）［3Ｈ］ヘミコリニウム−３
（ＨＣ３；１２８Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はNEN Life Science
Products から入手した。pcDNA3.1-CHT1あるいはpcDNA
3.1をそれぞれＣＯＳ７細胞に一過性に発現させた。プ
ロトコールに従ってTransFast Reagent（プロメガ社
製）を導入し用いた。膜調製は、細胞を０．３２Ｍスク
ロース中でホモジュナイズし、２００，０００ｇで１時
間遠心後、沈澱物を懸濁させた。結合実験は他で述べら
れている方法と本質的に同様に行った。特異的結合量は
１０μＭのＨＣ３存在下で決定した非特異的結合量を全
体の結合量から差し引いて計算した。飽和結合実験のデ
ータから特異的な［3Ｈ］ＨＣ３結合量を非線形近似で
解析してＫｄ値を算出した。
【００５８】
【発明の効果】本発明によると、生理的に重要である高
親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク
質、それをコードする遺伝子ＤＮＡを提供することがで
きる。また、それらタンパク質や遺伝子ＤＮＡを用いる
ことにより、アルツハイマー症の予防や治療に有用な物
質をスクリーニングすることや、遺伝子治療に有用な細
胞を調製することができる。
【００５９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION <120> High-Affinity Choline Transporter <130> A011P15 <140> <141> <150> JP P1999-240642 <151> 1999-08-27 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1731 <212> DNA <213> Caenorhabditis elegans <220> <221> CDS <222> (1)..(1731) <400> 1 atg gcc gac tta ttg ggt atc gtg gcc att gtg ttc ttc tac gtg ctc 48 Met Ala Asp Leu Leu Gly Ile Val Ala Ile Val Phe Phe Tyr Val Leu 1 5 10 15 att ctt gtc gtt gga ata tgg gcg ggt aga aaa tcg aaa agt tca aaa 96 Ile Leu Val Val Gly Ile Trp Ala Gly Arg Lys Ser Lys Ser Ser Lys 20 25 30 gag ctt gaa tca gaa gcc ggc gcg gcg acg gaa gag gtg atg tta gct 144 Glu Leu Glu Ser Glu Ala Gly Ala Ala Thr Glu Glu Val Met Leu Ala 35 40 45 ggg aga aac atc gga act ctt gtc gga att ttc aca atg act gcc acg 192 Gly Arg Asn Ile Gly Thr Leu Val Gly Ile Phe Thr Met Thr Ala Thr 50 55 60 tgg gtt ggc ggt gct tat atc aat gga acc gcc gag gct ctg tat aat 240 Trp Val Gly Gly Ala Tyr Ile Asn Gly Thr Ala Glu Ala Leu Tyr Asn 65 70 75 80 gga ggt ctc ctt gga tgt cag gct cca gtt gga tat gca att tcc ctt 288 Gly Gly Leu Leu Gly Cys Gln Ala Pro Val Gly Tyr Ala Ile Ser Leu 85 90 95 gtt atg gga gga cta ctt ttc gca aag aaa atg cga gaa gaa gga tat 336 Val Met Gly Gly Leu Leu Phe Ala Lys Lys Met Arg Glu Glu Gly Tyr 100 105 110 att aca atg ctc gat cct ttt cag cac aaa tat ggc caa cga atc ggt 384 Ile Thr Met Leu Asp Pro Phe Gln His Lys Tyr Gly Gln Arg Ile Gly 115 120 125 ggc ttg atg tat gtt cca gca ctt ctt ggt gaa aca ttc tgg aca gca 432 Gly Leu Met Tyr Val Pro Ala Leu Leu Gly Glu Thr Phe Trp Thr Ala 130 135 140 gcc att ctt tcg gca ctt ggt gca aca ctg tcg gta att ctt gga atc 480 Ala Ile Leu Ser Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ser Val Ile Leu Gly Ile 145 150 155 160 gac atg aat gca tca gtg acc ctg tcg gcc tgt att gcc gta ttc tac 528 Asp Met Asn Ala Ser Val Thr Leu Ser Ala Cys Ile Ala Val Phe Tyr 165 170 175 aca ttc acc ggt gga tac tat gca gtc gcg tac act gac gtc gtt caa 576 Thr Phe Thr Gly Gly Tyr Tyr Ala Val Ala Tyr Thr Asp Val Val Gln 180 185 190 cta ttt tgc att ttc gtc ggt ttg tgg gtt tgc gtg ccg gcg gct atg 624 Leu Phe Cys Ile Phe Val Gly Leu Trp Val Cys Val Pro Ala Ala Met 195 200 205 gtg cat gat ggt gcg aag gat att tcc agg aat gca ggc gac tgg att 672 Val His Asp Gly Ala Lys Asp Ile Ser Arg Asn Ala Gly Asp Trp Ile 210 215 220 gga gag att gga gga ttc aaa gaa aca tct ctc tgg att gat tgc atg 720 Gly Glu Ile Gly Gly Phe Lys Glu Thr Ser Leu Trp Ile Asp Cys Met 225 230 235 240 ctt ctc ctt gtc ttt gga gga att cca tgg caa gtg tac ttc caa aga 768 Leu Leu Leu Val Phe Gly Gly Ile Pro Trp Gln Val Tyr Phe Gln Arg 245 250 255 gtt ctc tcc tca aaa act gct cat gga gca cag acg ttg tcg ttt gtg 816 Val Leu Ser Ser Lys Thr Ala His Gly Ala Gln Thr Leu Ser Phe Val 260 265 270 gcg ggc gtc gga tgc att ctc atg gcg att cca cca gcg ttg atc ggt 864 Ala Gly Val Gly Cys Ile Leu Met Ala Ile Pro Pro Ala Leu Ile Gly 275 280 285 gca att gcc agg aac aca gac tgg aga atg act gat tat tcc cca tgg 912 Ala Ile Ala Arg Asn Thr Asp Trp Arg Met Thr Asp Tyr Ser Pro Trp 290 295 300 aac aat gga act aag gtc gaa tcg att cca ccg gat aag aga aac atg 960 Asn Asn Gly Thr Lys Val Glu Ser Ile Pro Pro Asp Lys Arg Asn Met 305 310 315 320 gtg gtc ccg ttg gta ttc cag tat ctt acg cca aga tgg gtc gcc ttt 1008 Val Val Pro Leu Val Phe Gln Tyr Leu Thr Pro Arg Trp Val Ala Phe 325 330 335 att gga ctc ggc gca gtg tcg gct gct gta atg tca tct gca gat tca 1056 Ile Gly Leu Gly Ala Val Ser Ala Ala Val Met Ser Ser Ala Asp Ser 340 345 350 tct gta cta tca gca gca tca atg ttt gct cac aac atc tgg aag ctc 1104 Ser Val Leu Ser Ala Ala Ser Met Phe Ala His Asn Ile Trp Lys Leu 355 360 365 aca att cgc cct cac gcg tct gaa aaa gaa gtg ata att gtg atg aga 1152 Thr Ile Arg Pro His Ala Ser Glu Lys Glu Val Ile Ile Val Met Arg 370 375 380 ata gcc atc atc tgt gtt ggt atc atg gca acc atc atg gca ctt acc 1200 Ile Ala Ile Ile Cys Val Gly Ile Met Ala Thr Ile Met Ala Leu Thr 385 390 395 400 att caa tcc atc tat ggg ctt tgg tat ctt tgt gca gat ttg gtc tac 1248 Ile Gln Ser Ile Tyr Gly Leu Trp Tyr Leu Cys Ala Asp Leu Val Tyr 405 410 415 gtc ata ctc ttc cct caa cta tta tgt gtt gta tat atg cca cgt agc 1296 Val Ile Leu Phe Pro Gln Leu Leu Cys Val Val Tyr Met Pro Arg Ser 420 425 430 aat acg tat ggc tca ttg gct ggc tat gca gtc ggt ctt gtg ctc cgt 1344 Asn Thr Tyr Gly Ser Leu Ala Gly Tyr Ala Val Gly Leu Val Leu Arg 435 440 445 ttg att gga ggc gag cca ctt gta tcg ctg cca gcg ttc ttc cat tat 1392 Leu Ile Gly Gly Glu Pro Leu Val Ser Leu Pro Ala Phe Phe His Tyr 450 455 460 cca atg tat acg gat ggg gta cag tat ttc cca ttc agg aca act gct 1440 Pro Met Tyr Thr Asp Gly Val Gln Tyr Phe Pro Phe Arg Thr Thr Ala 465 470 475 480 atg tta tct tca atg gct act atc tac att gta tca ata caa tcg gag 1488 Met Leu Ser Ser Met Ala Thr Ile Tyr Ile Val Ser Ile Gln Ser Glu 485 490 495 aag ctg ttc aaa tcg gga cgt ttg tct ccg gag tgg gac gta atg ggt 1536 Lys Leu Phe Lys Ser Gly Arg Leu Ser Pro Glu Trp Asp Val Met Gly 500 505 510 tgt gta gtg aat att ccg ata gat cat gta ccc ctt ccg tca gat gta 1584 Cys Val Val Asn Ile Pro Ile Asp His Val Pro Leu Pro Ser Asp Val 515 520 525 tcg ttt gct gtt agt agt gag acc ttg aat atg aag gct cca aac gga 1632 Ser Phe Ala Val Ser Ser Glu Thr Leu Asn Met Lys Ala Pro Asn Gly 530 535 540 aca ccg gct cca gta cat ccg aac caa cag ccg tct gat gaa aat aca 1680 Thr Pro Ala Pro Val His Pro Asn Gln Gln Pro Ser Asp Glu Asn Thr 545 550 555 560 tta tta cat cca tat tcg gac caa agt tat tat tcc aca aat agc aat 1728 Leu Leu His Pro Tyr Ser Asp Gln Ser Tyr Tyr Ser Thr Asn Ser Asn 565 570 575 taa 1731 <210> 2 <211> 576 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegans <400> 2 Met Ala Asp Leu Leu Gly Ile Val Ala Ile Val Phe Phe Tyr Val Leu 1 5 10 15 Ile Leu Val Val Gly Ile Trp Ala Gly Arg Lys Ser Lys Ser Ser Lys 20 25 30 Glu Leu Glu Ser Glu Ala Gly Ala Ala Thr Glu Glu Val Met Leu Ala 35 40 45 Gly Arg Asn Ile Gly Thr Leu Val Gly Ile Phe Thr Met Thr Ala Thr 50 55 60 Trp Val Gly Gly Ala Tyr Ile Asn Gly Thr Ala Glu Ala Leu Tyr Asn 65 70 75 80 Gly Gly Leu Leu Gly Cys Gln Ala Pro Val Gly Tyr Ala Ile Ser Leu 85 90 95 Val Met Gly Gly Leu Leu Phe Ala Lys Lys Met Arg Glu Glu Gly Tyr 100 105 110 Ile Thr Met Leu Asp Pro Phe Gln His Lys Tyr Gly Gln Arg Ile Gly 115 120 125 Gly Leu Met Tyr Val Pro Ala Leu Leu Gly Glu Thr Phe Trp Thr Ala 130 135 140 Ala Ile Leu Ser Ala Leu Gly Ala Thr Leu Ser Val Ile Leu Gly Ile 145 150 155 160 Asp Met Asn Ala Ser Val Thr Leu Ser Ala Cys Ile Ala Val Phe Tyr 165 170 175 Thr Phe Thr Gly Gly Tyr Tyr Ala Val Ala Tyr Thr Asp Val Val Gln 180 185 190 Leu Phe Cys Ile Phe Val Gly Leu Trp Val Cys Val Pro Ala Ala Met 195 200 205 Val His Asp Gly Ala Lys Asp Ile Ser Arg Asn Ala Gly Asp Trp Ile 210 215 220 Gly Glu Ile Gly Gly Phe Lys Glu Thr Ser Leu Trp Ile Asp Cys Met 225 230 235 240 Leu Leu Leu Val Phe Gly Gly Ile Pro Trp Gln Val Tyr Phe Gln Arg 245 250 255 Val Leu Ser Ser Lys Thr Ala His Gly Ala Gln Thr Leu Ser Phe Val 260 265 270 Ala Gly Val Gly Cys Ile Leu Met Ala Ile Pro Pro Ala Leu Ile Gly 275 280 285 Ala Ile Ala Arg Asn Thr Asp Trp Arg Met Thr Asp Tyr Ser Pro Trp 290 295 300 Asn Asn Gly Thr Lys Val Glu Ser Ile Pro Pro Asp Lys Arg Asn Met 305 310 315 320 Val Val Pro Leu Val Phe Gln Tyr Leu Thr Pro Arg Trp Val Ala Phe 325 330 335 Ile Gly Leu Gly Ala Val Ser Ala Ala Val Met Ser Ser Ala Asp Ser 340 345 350 Ser Val Leu Ser Ala Ala Ser Met Phe Ala His Asn Ile Trp Lys Leu 355 360 365 Thr Ile Arg Pro His Ala Ser Glu Lys Glu Val Ile Ile Val Met Arg 370 375 380 Ile Ala Ile Ile Cys Val Gly Ile Met Ala Thr Ile Met Ala Leu Thr 385 390 395 400 Ile Gln Ser Ile Tyr Gly Leu Trp Tyr Leu Cys Ala Asp Leu Val Tyr 405 410 415 Val Ile Leu Phe Pro Gln Leu Leu Cys Val Val Tyr Met Pro Arg Ser 420 425 430 Asn Thr Tyr Gly Ser Leu Ala Gly Tyr Ala Val Gly Leu Val Leu Arg 435 440 445 Leu Ile Gly Gly Glu Pro Leu Val Ser Leu Pro Ala Phe Phe His Tyr 450 455 460 Pro Met Tyr Thr Asp Gly Val Gln Tyr Phe Pro Phe Arg Thr Thr Ala 465 470 475 480 Met Leu Ser Ser Met Ala Thr Ile Tyr Ile Val Ser Ile Gln Ser Glu 485 490 495 Lys Leu Phe Lys Ser Gly Arg Leu Ser Pro Glu Trp Asp Val Met Gly 500 505 510 Cys Val Val Asn Ile Pro Ile Asp His Val Pro Leu Pro Ser Asp Val 515 520 525 Ser Phe Ala Val Ser Ser Glu Thr Leu Asn Met Lys Ala Pro Asn Gly 530 535 540 Thr Pro Ala Pro Val His Pro Asn Gln Gln Pro Ser Asp Glu Asn Thr 545 550 555 560 Leu Leu His Pro Tyr Ser Asp Gln Ser Tyr Tyr Ser Thr Asn Ser Asn 565 570 575 <210> 3 <211> 1743 <212> DNA <213> Rat <220> <221> CDS <222> (1)..(1743) <400> 3 atg cct ttc cat gta gaa gga cta gta gcg att atc ctg ttc tac ctt 48 Met Pro Phe His Val Glu Gly Leu Val Ala Ile Ile Leu Phe Tyr Leu 1 5 10 15 ctt ata ttt ctg gtt gga ata tgg gct gca tgg aaa acc aaa aac agc 96 Leu Ile Phe Leu Val Gly Ile Trp Ala Ala Trp Lys Thr Lys Asn Ser 20 25 30 ggt aat gca gaa gaa cgc agc gaa gcc atc ata gtt ggg ggc cga gac 144 Gly Asn Ala Glu Glu Arg Ser Glu Ala Ile Ile Val Gly Gly Arg Asp 35 40 45 att ggt ttg ttg gtt ggt ggt ttt acc atg aca gcc acc tgg gtt gga 192 Ile Gly Leu Leu Val Gly Gly Phe Thr Met Thr Ala Thr Trp Val Gly 50 55 60 gga ggt tac atc aac ggg aca gct gaa gca gtt tat ggg cca ggt tgt 240 Gly Gly Tyr Ile Asn Gly Thr Ala Glu Ala Val Tyr Gly Pro Gly Cys 65 70 75 80 ggt cta gct tgg gct cag gca ccc att gga tat tct ctg agt ctg att 288 Gly Leu Ala Trp Ala Gln Ala Pro Ile Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Ile 85 90 95 tta ggt ggc ctg ttt ttt gca aaa cct atg cgt tcc aag gga tat gtg 336 Leu Gly Gly Leu Phe Phe Ala Lys Pro Met Arg Ser Lys Gly Tyr Val 100 105 110 act atg tta gac ccg ttt caa cag atc tat gga aag cgc atg ggt ggg 384 Thr Met Leu Asp Pro Phe Gln Gln Ile Tyr Gly Lys Arg Met Gly Gly 115 120 125 ctg ctg ttc atc cct gca ctg atg gga gag atg ttc tgg gct gca gca 432 Leu Leu Phe Ile Pro Ala Leu Met Gly Glu Met Phe Trp Ala Ala Ala 130 135 140 att ttc tct gca tta ggg gct acc atc agc gta atc att gat gtg gat 480 Ile Phe Ser Ala Leu Gly Ala Thr Ile Ser Val Ile Ile Asp Val Asp 145 150 155 160 gtg aac ata tcg gtc att gtc tcc gca ctc att gcc att ctt tat acc 528 Val Asn Ile Ser Val Ile Val Ser Ala Leu Ile Ala Ile Leu Tyr Thr 165 170 175 ctc gtg gga ggg ctc tac tct gtg gca tat act gat gtt gta cag cta 576 Leu Val Gly Gly Leu Tyr Ser Val Ala Tyr Thr Asp Val Val Gln Leu 180 185 190 ttc tgc att ttt ata gga ttg tgg atc agt gtc cca ttt gcc ctg tca 624 Phe Cys Ile Phe Ile Gly Leu Trp Ile Ser Val Pro Phe Ala Leu Ser 195 200 205 cat cct gca gtc acc gac att gga ttc act gct gtg cat gct aaa tac 672 His Pro Ala Val Thr Asp Ile Gly Phe Thr Ala Val His Ala Lys Tyr 210 215 220 cag agt ccc tgg ctg gga acc att gaa tca gtt gaa gtc tac acc tgg 720 Gln Ser Pro Trp Leu Gly Thr Ile Glu Ser Val Glu Val Tyr Thr Trp 225 230 235 240 ctt gat aat ttt ctg ttg ttg atg ctg ggt gga ata cca tgg caa gcc 768 Leu Asp Asn Phe Leu Leu Leu Met Leu Gly Gly Ile Pro Trp Gln Ala 245 250 255 tac ttc cag agg gtc ctc tct tca tcg tca gcg acc tat gct cag gtg 816 Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ser Ser Ser Ser Ala Thr Tyr Ala Gln Val 260 265 270 ctg tcc ttc ctg gca gct ttt ggg tgc ctg gtg atg gct cta cca gcc 864 Leu Ser Phe Leu Ala Ala Phe Gly Cys Leu Val Met Ala Leu Pro Ala 275 280 285 att tgc att ggg gcc att gga gcc tcc aca gac tgg aac caa act gca 912 Ile Cys Ile Gly Ala Ile Gly Ala Ser Thr Asp Trp Asn Gln Thr Ala 290 295 300 tat ggg ttt cca gat ccc aag acc aag gag gaa gca gac atg att ctc 960 Tyr Gly Phe Pro Asp Pro Lys Thr Lys Glu Glu Ala Asp Met Ile Leu 305 310 315 320 ccg att gtt cta cag tac ctc tgc cct gtg tac att tcc ttc ttt ggg 1008 Pro Ile Val Leu Gln Tyr Leu Cys Pro Val Tyr Ile Ser Phe Phe Gly 325 330 335 ctt ggt gct gtt tct gct gct gtc atg tcc tcg gct gac tca tcc atc 1056 Leu Gly Ala Val Ser Ala Ala Val Met Ser Ser Ala Asp Ser Ser Ile 340 345 350 cta tca gca agt tcc atg ttt gct cgg aat atc tac cag ctt tcc ttc 1104 Leu Ser Ala Ser Ser Met Phe Ala Arg Asn Ile Tyr Gln Leu Ser Phe 355 360 365 aga caa aat gca tca gac aag gaa att gtg tgg gtc atg agg atc act 1152 Arg Gln Asn Ala Ser Asp Lys Glu Ile Val Trp Val Met Arg Ile Thr 370 375 380 gtg ttt gtg ttt gga gca tct gca aca gcc atg gcc ttg ctc acg aag 1200 Val Phe Val Phe Gly Ala Ser Ala Thr Ala Met Ala Leu Leu Thr Lys 385 390 395 400 act gtg tat ggg ctc tgg tac ctg agc tct gac ctt gtc tac atc atc 1248 Thr Val Tyr Gly Leu Trp Tyr Leu Ser Ser Asp Leu Val Tyr Ile Ile 405 410 415 atc ttc cca cag ctg ctc tgt gta ctc ttc atc aaa gga acc aac act 1296 Ile Phe Pro Gln Leu Leu Cys Val Leu Phe Ile Lys Gly Thr Asn Thr 420 425 430 tat ggg gca gtt gct ggt tat att ttt gga ctt ttc ctg aga att acc 1344 Tyr Gly Ala Val Ala Gly Tyr Ile Phe Gly Leu Phe Leu Arg Ile Thr 435 440 445 gga gga gag cca tat cta tac ttg cag ccc tta atc ttc tac cct ggt 1392 Gly Gly Glu Pro Tyr Leu Tyr Leu Gln Pro Leu Ile Phe Tyr Pro Gly 450 455 460 tat tac cct gac aag aat ggt ata tac aat cag agg ttc cca ttt aaa 1440 Tyr Tyr Pro Asp Lys Asn Gly Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Pro Phe Lys 465 470 475 480 act ctc tcc atg gtt acc tca ttc ttt acc aac att tgt gtt tcc tat 1488 Thr Leu Ser Met Val Thr Ser Phe Phe Thr Asn Ile Cys Val Ser Tyr 485 490 495 cta gcc aag tat cta ttt gaa agt gga acc ttg cct cca aaa tta gat 1536 Leu Ala Lys Tyr Leu Phe Glu Ser Gly Thr Leu Pro Pro Lys Leu Asp 500 505 510 ata ttt gat gct gtt gtc tca agg cac agt gaa gag aac atg gac aag 1584 Ile Phe Asp Ala Val Val Ser Arg His Ser Glu Glu Asn Met Asp Lys 515 520 525 acc att cta gtc aga aat gaa aac atc aaa tta aat gaa ctt gca cct 1632 Thr Ile Leu Val Arg Asn Glu Asn Ile Lys Leu Asn Glu Leu Ala Pro 530 535 540 gta aag cct cga cag agc cta acc ctc agt tca act ttc acc aat aaa 1680 Val Lys Pro Arg Gln Ser Leu Thr Leu Ser Ser Thr Phe Thr Asn Lys 545 550 555 560 gag gct ctc ctt gat gtt gat tcc agt cca gag gga tct ggg act gaa 1728 Glu Ala Leu Leu Asp Val Asp Ser Ser Pro Glu Gly Ser Gly Thr Glu 565 570 575 gat aac tta caa tga 1743 Asp Asn Leu Gln 580 <210> 4 <211> 580 <212> PRT <213> Rat <400> 4 Met Pro Phe His Val Glu Gly Leu Val Ala Ile Ile Leu Phe Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Ile Phe Leu Val Gly Ile Trp Ala Ala Trp Lys Thr Lys Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Ala Glu Glu Arg Ser Glu Ala Ile Ile Val Gly Gly Arg Asp 35 40 45 Ile Gly Leu Leu Val Gly Gly Phe Thr Met Thr Ala Thr Trp Val Gly 50 55 60 Gly Gly Tyr Ile Asn Gly Thr Ala Glu Ala Val Tyr Gly Pro Gly Cys 65 70 75 80 Gly Leu Ala Trp Ala Gln Ala Pro Ile Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Ile 85 90 95 Leu Gly Gly Leu Phe Phe Ala Lys Pro Met Arg Ser Lys Gly Tyr Val 100 105 110 Thr Met Leu Asp Pro Phe Gln Gln Ile Tyr Gly Lys Arg Met Gly Gly 115 120 125 Leu Leu Phe Ile Pro Ala Leu Met Gly Glu Met Phe Trp Ala Ala Ala 130 135 140 Ile Phe Ser Ala Leu Gly Ala Thr Ile Ser Val Ile Ile Asp Val Asp 145 150 155 160 Val Asn Ile Ser Val Ile Val Ser Ala Leu Ile Ala Ile Leu Tyr Thr 165 170 175 Leu Val Gly Gly Leu Tyr Ser Val Ala Tyr Thr Asp Val Val Gln Leu 180 185 190 Phe Cys Ile Phe Ile Gly Leu Trp Ile Ser Val Pro Phe Ala Leu Ser 195 200 205 His Pro Ala Val Thr Asp Ile Gly Phe Thr Ala Val His Ala Lys Tyr 210 215 220 Gln Ser Pro Trp Leu Gly Thr Ile Glu Ser Val Glu Val Tyr Thr Trp 225 230 235 240 Leu Asp Asn Phe Leu Leu Leu Met Leu Gly Gly Ile Pro Trp Gln Ala 245 250 255 Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ser Ser Ser Ser Ala Thr Tyr Ala Gln Val 260 265 270 Leu Ser Phe Leu Ala Ala Phe Gly Cys Leu Val Met Ala Leu Pro Ala 275 280 285 Ile Cys Ile Gly Ala Ile Gly Ala Ser Thr Asp Trp Asn Gln Thr Ala 290 295 300 Tyr Gly Phe Pro Asp Pro Lys Thr Lys Glu Glu Ala Asp Met Ile Leu 305 310 315 320 Pro Ile Val Leu Gln Tyr Leu Cys Pro Val Tyr Ile Ser Phe Phe Gly 325 330 335 Leu Gly Ala Val Ser Ala Ala Val Met Ser Ser Ala Asp Ser Ser Ile 340 345 350 Leu Ser Ala Ser Ser Met Phe Ala Arg Asn Ile Tyr Gln Leu Ser Phe 355 360 365 Arg Gln Asn Ala Ser Asp Lys Glu Ile Val Trp Val Met Arg Ile Thr 370 375 380 Val Phe Val Phe Gly Ala Ser Ala Thr Ala Met Ala Leu Leu Thr Lys 385 390 395 400 Thr Val Tyr Gly Leu Trp Tyr Leu Ser Ser Asp Leu Val Tyr Ile Ile 405 410 415 Ile Phe Pro Gln Leu Leu Cys Val Leu Phe Ile Lys Gly Thr Asn Thr 420 425 430 Tyr Gly Ala Val Ala Gly Tyr Ile Phe Gly Leu Phe Leu Arg Ile Thr 435 440 445 Gly Gly Glu Pro Tyr Leu Tyr Leu Gln Pro Leu Ile Phe Tyr Pro Gly 450 455 460 Tyr Tyr Pro Asp Lys Asn Gly Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Pro Phe Lys 465 470 475 480 Thr Leu Ser Met Val Thr Ser Phe Phe Thr Asn Ile Cys Val Ser Tyr 485 490 495 Leu Ala Lys Tyr Leu Phe Glu Ser Gly Thr Leu Pro Pro Lys Leu Asp 500 505 510 Ile Phe Asp Ala Val Val Ser Arg His Ser Glu Glu Asn Met Asp Lys 515 520 525 Thr Ile Leu Val Arg Asn Glu Asn Ile Lys Leu Asn Glu Leu Ala Pro 530 535 540 Val Lys Pro Arg Gln Ser Leu Thr Leu Ser Ser Thr Phe Thr Asn Lys 545 550 555 560 Glu Ala Leu Leu Asp Val Asp Ser Ser Pro Glu Gly Ser Gly Thr Glu 565 570 575 Asp Asn Leu Gln 580 <210> 5 <211> 1743 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1743) <400> 5 atg gct ttc cat gtg gaa gga ctg ata gct atc atc gtg ttc tac ctt 48 Met Ala Phe His Val Glu Gly Leu Ile Ala Ile Ile Val Phe Tyr Leu 1 5 10 15 cta att ttg ctg gtt gga ata tgg gct gcc tgg aga acc aaa aac agt 96 Leu Ile Leu Leu Val Gly Ile Trp Ala Ala Trp Arg Thr Lys Asn Ser 20 25 30 ggc agc gca gaa gag cgc agc gaa gcc atc ata gtt ggt ggc cga gat 144 Gly Ser Ala Glu Glu Arg Ser Glu Ala Ile Ile Val Gly Gly Arg Asp 35 40 45 att ggt tta ttg gtt ggt gga ttt acc atg aca gct acc tgg gtc gga 192 Ile Gly Leu Leu Val Gly Gly Phe Thr Met Thr Ala Thr Trp Val Gly 50 55 60 gga ggg tat atc aat ggc aca gct gaa gca gtt tat gta cca ggt tat 240 Gly Gly Tyr Ile Asn Gly Thr Ala Glu Ala Val Tyr Val Pro Gly Tyr 65 70 75 80 ggc cta gct tgg gct cag gca cca att gga tat tct ctt agt ctg att 288 Gly Leu Ala Trp Ala Gln Ala Pro Ile Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Ile 85 90 95 tta ggt ggc ctg ttc ttt gca aaa cct atg cgt tca aag ggg tat gtg 336 Leu Gly Gly Leu Phe Phe Ala Lys Pro Met Arg Ser Lys Gly Tyr Val 100 105 110 acc atg tta gac ccg ttt cag caa atc tat gga aaa cgc atg ggc gga 384 Thr Met Leu Asp Pro Phe Gln Gln Ile Tyr Gly Lys Arg Met Gly Gly 115 120 125 ctc ctg ttt att cct gca ctg atg gga gaa atg ttc tgg gct gca gca 432 Leu Leu Phe Ile Pro Ala Leu Met Gly Glu Met Phe Trp Ala Ala Ala 130 135 140 att ttc tct gct ttg gga gcc acc atc agc gtg atc atc gat gtg gat 480 Ile Phe Ser Ala Leu Gly Ala Thr Ile Ser Val Ile Ile Asp Val Asp 145 150 155 160 atg cac att tct gtc atc atc tct gca ctc att gcc act ctg tac aca 528 Met His Ile Ser Val Ile Ile Ser Ala Leu Ile Ala Thr Leu Tyr Thr 165 170 175 ctg gtg gga ggg ctc tat tct gtg gcc tac act gat gtc gtt cag ctc 576 Leu Val Gly Gly Leu Tyr Ser Val Ala Tyr Thr Asp Val Val Gln Leu 180 185 190 ttt tgc att ttt gta ggg ctg tgg atc agc gtc ccc ttt gca ttg tca 624 Phe Cys Ile Phe Val Gly Leu Trp Ile Ser Val Pro Phe Ala Leu Ser 195 200 205 cat cct gca gtc gca gac atc ggg ttc act gct gtg cat gcc aaa tac 672 His Pro Ala Val Ala Asp Ile Gly Phe Thr Ala Val His Ala Lys Tyr 210 215 220 caa aag ccg tgg ctg gga act gtt gac tca tct gaa gtc tac tct tgg 720 Gln Lys Pro Trp Leu Gly Thr Val Asp Ser Ser Glu Val Tyr Ser Trp 225 230 235 240 ctt gat agt ttt ctg ttg ttg atg ctg ggt gga atc cca tgg caa gca 768 Leu Asp Ser Phe Leu Leu Leu Met Leu Gly Gly Ile Pro Trp Gln Ala 245 250 255 tac ttt cag agg gtt ctc tct tct tcc tca gcc acc tat gct caa gtg 816 Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ser Ser Ser Ser Ala Thr Tyr Ala Gln Val 260 265 270 ctg tcc ttc ctg gca gct ttc ggg tgc ctg gtg atg gcc atc cca gcc 864 Leu Ser Phe Leu Ala Ala Phe Gly Cys Leu Val Met Ala Ile Pro Ala 275 280 285 ata ctc att ggg gcc att gga gca tca aca gac tgg aac cag act gca 912 Ile Leu Ile Gly Ala Ile Gly Ala Ser Thr Asp Trp Asn Gln Thr Ala 290 295 300 tat ggg ctt cca gat ccc aag act aca gaa gag gca gac atg att tta 960 Tyr Gly Leu Pro Asp Pro Lys Thr Thr Glu Glu Ala Asp Met Ile Leu 305 310 315 320 cca att gtt ctg cag tat ctc tgc cct gtg tat att tct ttc ttt ggt 1008 Pro Ile Val Leu Gln Tyr Leu Cys Pro Val Tyr Ile Ser Phe Phe Gly 325 330 335 ctt ggt gca gtt tct gct gct gtt atg tca tca gca gat tct tcc atc 1056 Leu Gly Ala Val Ser Ala Ala Val Met Ser Ser Ala Asp Ser Ser Ile 340 345 350 ttg tca gca agt tcc atg ttt gca cgg aac atc tac cag ctt tcc ttc 1104 Leu Ser Ala Ser Ser Met Phe Ala Arg Asn Ile Tyr Gln Leu Ser Phe 355 360 365 aga caa aat gct tcg gac aaa gaa atc gtt tgg gtt atg cga atc aca 1152 Arg Gln Asn Ala Ser Asp Lys Glu Ile Val Trp Val Met Arg Ile Thr 370 375 380 gtg ttt gtg ttt gga gca tct gca aca gcc atg gcc ttg ctg acg aaa 1200 Val Phe Val Phe Gly Ala Ser Ala Thr Ala Met Ala Leu Leu Thr Lys 385 390 395 400 act gtg tat ggg ctc tgg tac ctc agt tct gac ctt gtt tac atc gtt 1248 Thr Val Tyr Gly Leu Trp Tyr Leu Ser Ser Asp Leu Val Tyr Ile Val 405 410 415 atc ttc ccc cag ctg ctt tgt gta ctc ttt gtt aag gga acc aac acc 1296 Ile Phe Pro Gln Leu Leu Cys Val Leu Phe Val Lys Gly Thr Asn Thr 420 425 430 tat ggg gcc gtg gca ggt tat gtt tct ggc ctc ttc ctg aga ata act 1344 Tyr Gly Ala Val Ala Gly Tyr Val Ser Gly Leu Phe Leu Arg Ile Thr 435 440 445 gga ggg gag cca tat ctg tat ctt cag ccc ttg atc ttc tac cct ggc 1392 Gly Gly Glu Pro Tyr Leu Tyr Leu Gln Pro Leu Ile Phe Tyr Pro Gly 450 455 460 tat tac cct gat gat aat ggt ata tat aat cag aaa ttt cca ttt aaa 1440 Tyr Tyr Pro Asp Asp Asn Gly Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Pro Phe Lys 465 470 475 480 aca ctt gcc atg gtt aca tca ttc tta acc aac att tgc atc tcc tat 1488 Thr Leu Ala Met Val Thr Ser Phe Leu Thr Asn Ile Cys Ile Ser Tyr 485 490 495 cta gcc aag tat cta ttt gaa agt gga acc ttg cca cct aaa tta gat 1536 Leu Ala Lys Tyr Leu Phe Glu Ser Gly Thr Leu Pro Pro Lys Leu Asp 500 505 510 gta ttt gat gct gtt gtt gca aga cac agt gaa gaa aac atg gat aag 1584 Val Phe Asp Ala Val Val Ala Arg His Ser Glu Glu Asn Met Asp Lys 515 520 525 aca att ctt gtc aaa aat gaa aat att aaa tta gat gaa ctt gca ctt 1632 Thr Ile Leu Val Lys Asn Glu Asn Ile Lys Leu Asp Glu Leu Ala Leu 530 535 540 gtg aag cca cga cag agc atg acc ctc agc tca act ttc acc aat aaa 1680 Val Lys Pro Arg Gln Ser Met Thr Leu Ser Ser Thr Phe Thr Asn Lys 545 550 555 560 gag gcc ttc ctt gat gtt gat tcc agt cca gaa ggg tct ggg act gaa 1728 Glu Ala Phe Leu Asp Val Asp Ser Ser Pro Glu Gly Ser Gly Thr Glu 565 570 575 gat aat tta cag tga 1743 Asp Asn Leu Gln 580 <210> 6 <211> 580 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Phe His Val Glu Gly Leu Ile Ala Ile Ile Val Phe Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Ile Leu Leu Val Gly Ile Trp Ala Ala Trp Arg Thr Lys Asn Ser 20 25 30 Gly Ser Ala Glu Glu Arg Ser Glu Ala Ile Ile Val Gly Gly Arg Asp 35 40 45 Ile Gly Leu Leu Val Gly Gly Phe Thr Met Thr Ala Thr Trp Val Gly 50 55 60 Gly Gly Tyr Ile Asn Gly Thr Ala Glu Ala Val Tyr Val Pro Gly Tyr 65 70 75 80 Gly Leu Ala Trp Ala Gln Ala Pro Ile Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Ile 85 90 95 Leu Gly Gly Leu Phe Phe Ala Lys Pro Met Arg Ser Lys Gly Tyr Val 100 105 110 Thr Met Leu Asp Pro Phe Gln Gln Ile Tyr Gly Lys Arg Met Gly Gly 115 120 125 Leu Leu Phe Ile Pro Ala Leu Met Gly Glu Met Phe Trp Ala Ala Ala 130 135 140 Ile Phe Ser Ala Leu Gly Ala Thr Ile Ser Val Ile Ile Asp Val Asp 145 150 155 160 Met His Ile Ser Val Ile Ile Ser Ala Leu Ile Ala Thr Leu Tyr Thr 165 170 175 Leu Val Gly Gly Leu Tyr Ser Val Ala Tyr Thr Asp Val Val Gln Leu 180 185 190 Phe Cys Ile Phe Val Gly Leu Trp Ile Ser Val Pro Phe Ala Leu Ser 195 200 205 His Pro Ala Val Ala Asp Ile Gly Phe Thr Ala Val His Ala Lys Tyr 210 215 220 Gln Lys Pro Trp Leu Gly Thr Val Asp Ser Ser Glu Val Tyr Ser Trp 225 230 235 240 Leu Asp Ser Phe Leu Leu Leu Met Leu Gly Gly Ile Pro Trp Gln Ala 245 250 255 Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ser Ser Ser Ser Ala Thr Tyr Ala Gln Val 260 265 270 Leu Ser Phe Leu Ala Ala Phe Gly Cys Leu Val Met Ala Ile Pro Ala 275 280 285 Ile Leu Ile Gly Ala Ile Gly Ala Ser Thr Asp Trp Asn Gln Thr Ala 290 295 300 Tyr Gly Leu Pro Asp Pro Lys Thr Thr Glu Glu Ala Asp Met Ile Leu 305 310 315 320 Pro Ile Val Leu Gln Tyr Leu Cys Pro Val Tyr Ile Ser Phe Phe Gly 325 330 335 Leu Gly Ala Val Ser Ala Ala Val Met Ser Ser Ala Asp Ser Ser Ile 340 345 350 Leu Ser Ala Ser Ser Met Phe Ala Arg Asn Ile Tyr Gln Leu Ser Phe 355 360 365 Arg Gln Asn Ala Ser Asp Lys Glu Ile Val Trp Val Met Arg Ile Thr 370 375 380 Val Phe Val Phe Gly Ala Ser Ala Thr Ala Met Ala Leu Leu Thr Lys 385 390 395 400 Thr Val Tyr Gly Leu Trp Tyr Leu Ser Ser Asp Leu Val Tyr Ile Val 405 410 415 Ile Phe Pro Gln Leu Leu Cys Val Leu Phe Val Lys Gly Thr Asn Thr 420 425 430 Tyr Gly Ala Val Ala Gly Tyr Val Ser Gly Leu Phe Leu Arg Ile Thr 435 440 445 Gly Gly Glu Pro Tyr Leu Tyr Leu Gln Pro Leu Ile Phe Tyr Pro Gly 450 455 460 Tyr Tyr Pro Asp Asp Asn Gly Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Pro Phe Lys 465 470 475 480 Thr Leu Ala Met Val Thr Ser Phe Leu Thr Asn Ile Cys Ile Ser Tyr 485 490 495 Leu Ala Lys Tyr Leu Phe Glu Ser Gly Thr Leu Pro Pro Lys Leu Asp 500 505 510 Val Phe Asp Ala Val Val Ala Arg His Ser Glu Glu Asn Met Asp Lys 515 520 525 Thr Ile Leu Val Lys Asn Glu Asn Ile Lys Leu Asp Glu Leu Ala Leu 530 535 540 Val Lys Pro Arg Gln Ser Met Thr Leu Ser Ser Thr Phe Thr Asn Lys 545 550 555 560 Glu Ala Phe Leu Asp Val Asp Ser Ser Pro Glu Gly Ser Gly Thr Glu 565 570 575 Asp Asn Leu Gln 580 <210> 7 <211> 1743 <212> DNA <213> Mouse <220> <221> CDS <222> (1)..(1743) <400> 7 atg tct ttc cac gta gaa gga ctg gta gct att atc ctc ttc tac ctc 48 Met Ser Phe His Val Glu Gly Leu Val Ala Ile Ile Leu Phe Tyr Leu 1 5 10 15 ctt ata ttt ctg gtt gga ata tgg gct gca tgg aaa acc aaa aac agc 96 Leu Ile Phe Leu Val Gly Ile Trp Ala Ala Trp Lys Thr Lys Asn Ser 20 25 30 ggc aac cca gaa gag cac agt gaa gcc atc ata gtc ggg ggc cgt gac 144 Gly Asn Pro Glu Glu His Ser Glu Ala Ile Ile Val Gly Gly Arg Asp 35 40 45 att ggt ttg ttg gtt ggt ggt ttt acc atg aca gcc acc tgg gtt gga 192 Ile Gly Leu Leu Val Gly Gly Phe Thr Met Thr Ala Thr Trp Val Gly 50 55 60 gga ggc tac atc aat ggg aca gca gaa gca gtg tat ggg cca ggt tgt 240 Gly Gly Tyr Ile Asn Gly Thr Ala Glu Ala Val Tyr Gly Pro Gly Cys 65 70 75 80 ggt cta gct tgg gct cag gca ccc att gga tat tct ctg agt cta att 288 Gly Leu Ala Trp Ala Gln Ala Pro Ile Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Ile 85 90 95 tta ggt ggt ctg ttt ttt gcg aaa cct atg cgt tcc aag gga tat gtg 336 Leu Gly Gly Leu Phe Phe Ala Lys Pro Met Arg Ser Lys Gly Tyr Val 100 105 110 act atg tta gac cca ttt caa cag atc tat gga aag cgc atg ggt ggg 384 Thr Met Leu Asp Pro Phe Gln Gln Ile Tyr Gly Lys Arg Met Gly Gly 115 120 125 ctg ctc ttc atc cct gca ctg atg gga gag atg ttc tgg gct gca gca 432 Leu Leu Phe Ile Pro Ala Leu Met Gly Glu Met Phe Trp Ala Ala Ala 130 135 140 att ttc tct gca tta ggg gcc acc atc agc gtg atc att gat gtg gat 480 Ile Phe Ser Ala Leu Gly Ala Thr Ile Ser Val Ile Ile Asp Val Asp 145 150 155 160 gtg aac ata tcg gtc att gtc tct gca ctc att gcc att ctt tat acc 528 Val Asn Ile Ser Val Ile Val Ser Ala Leu Ile Ala Ile Leu Tyr Thr 165 170 175 cta gtg ggt ggg ctc tac tct gtg gca tat act gat gtt gtc cag cta 576 Leu Val Gly Gly Leu Tyr Ser Val Ala Tyr Thr Asp Val Val Gln Leu 180 185 190 ttc tgc att ttt ata gga ctg tgg atc agt gtc cct ttt gcc ctg tca 624 Phe Cys Ile Phe Ile Gly Leu Trp Ile Ser Val Pro Phe Ala Leu Ser 195 200 205 cat cct gca gtc acc gac atc gga ttc aca gct gtg cat gct aaa tac 672 His Pro Ala Val Thr Asp Ile Gly Phe Thr Ala Val His Ala Lys Tyr 210 215 220 cag agt ccc tgg ctg gga acc att gaa tca gtt gaa gtc tac acc tgg 720 Gln Ser Pro Trp Leu Gly Thr Ile Glu Ser Val Glu Val Tyr Thr Trp 225 230 235 240 ctt gat aat ttt ctg tta ttg atg ctg ggt gga atc cca tgg caa gcc 768 Leu Asp Asn Phe Leu Leu Leu Met Leu Gly Gly Ile Pro Trp Gln Ala 245 250 255 tac ttc cag agg gtc ctc tct tca tcc tca gcc acc tat gct cag gta 816 Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ser Ser Ser Ser Ala Thr Tyr Ala Gln Val 260 265 270 ctg tcc ttc ctg gca gct ttt ggg tgc ctg gtg atg gct cta ccc gcc 864 Leu Ser Phe Leu Ala Ala Phe Gly Cys Leu Val Met Ala Leu Pro Ala 275 280 285 ata tgc ata gga gct att gga gct tcc aca gac tgg aac cag act gcc 912 Ile Cys Ile Gly Ala Ile Gly Ala Ser Thr Asp Trp Asn Gln Thr Ala 290 295 300 tac ggg tat cca gat ccc aag act aag gag gaa gca gac atg att ctc 960 Tyr Gly Tyr Pro Asp Pro Lys Thr Lys Glu Glu Ala Asp Met Ile Leu 305 310 315 320 ccg atc gtt ctg cag tac ctc tgc cct gtg tac atc tcc ttc ttt ggg 1008 Pro Ile Val Leu Gln Tyr Leu Cys Pro Val Tyr Ile Ser Phe Phe Gly 325 330 335 ctt ggt gct gtt tca gct gct gtc atg tcc tca gct gac tcg tcc atc 1056 Leu Gly Ala Val Ser Ala Ala Val Met Ser Ser Ala Asp Ser Ser Ile 340 345 350 ctg tcg gcg agt tct atg ttt gct cgg aat atc tac cag ctt tcc ttc 1104 Leu Ser Ala Ser Ser Met Phe Ala Arg Asn Ile Tyr Gln Leu Ser Phe 355 360 365 aga caa aat gca tca gac aag gaa att gtg tgg gtc atg agg atc act 1152 Arg Gln Asn Ala Ser Asp Lys Glu Ile Val Trp Val Met Arg Ile Thr 370 375 380 gtg ctt gtg ttc gga gca tct gca aca gcc atg gct ttg ctg acg aag 1200 Val Leu Val Phe Gly Ala Ser Ala Thr Ala Met Ala Leu Leu Thr Lys 385 390 395 400 act gtg tat ggg ctc tgg tac ctg agc tct gac ctt gtc tac atc atc 1248 Thr Val Tyr Gly Leu Trp Tyr Leu Ser Ser Asp Leu Val Tyr Ile Ile 405 410 415 atc ttc cca cag ctg ctc tgt gta ctc ttc atc aaa gga acc aac act 1296 Ile Phe Pro Gln Leu Leu Cys Val Leu Phe Ile Lys Gly Thr Asn Thr 420 425 430 tat ggg gca gtt gct ggt tat att ttt gga cta ttc ctg aga att act 1344 Tyr Gly Ala Val Ala Gly Tyr Ile Phe Gly Leu Phe Leu Arg Ile Thr 435 440 445 gga gga gag cca tat cta tac ttg cag ccc tta atc ttc tac cct ggt 1392 Gly Gly Glu Pro Tyr Leu Tyr Leu Gln Pro Leu Ile Phe Tyr Pro Gly 450 455 460 tat tac tct gac aag aat ggt ata tac aat cag agg ttc cca ttt aaa 1440 Tyr Tyr Ser Asp Lys Asn Gly Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Pro Phe Lys 465 470 475 480 act ctc tcc atg gtt acc tca ttc ttt acc aac att tgt gtt tct tat 1488 Thr Leu Ser Met Val Thr Ser Phe Phe Thr Asn Ile Cys Val Ser Tyr 485 490 495 cta gcc aag tat cta ttt gaa agt gga acc ttg cct cca aaa tta gat 1536 Leu Ala Lys Tyr Leu Phe Glu Ser Gly Thr Leu Pro Pro Lys Leu Asp 500 505 510 gta ttt gat gct gtt gtc gca agg cac agt gaa gag aac atg gac aag 1584 Val Phe Asp Ala Val Val Ala Arg His Ser Glu Glu Asn Met Asp Lys 515 520 525 acc att cta gtc aga aat gaa aat atc aaa tta aat gaa ctt gca cct 1632 Thr Ile Leu Val Arg Asn Glu Asn Ile Lys Leu Asn Glu Leu Ala Pro 530 535 540 gtg aaa cct cgg cag agc cta acc ctc agt tca act ttc acc aat aag 1680 Val Lys Pro Arg Gln Ser Leu Thr Leu Ser Ser Thr Phe Thr Asn Lys 545 550 555 560 gag gcc ctc ctt gat gtt gat tcc agt ccg gag ggg tct ggg act gaa 1728 Glu Ala Leu Leu Asp Val Asp Ser Ser Pro Glu Gly Ser Gly Thr Glu 565 570 575 gat aac tta caa tga 1743 Asp Asn Leu Gln 580 <210> 8 <211> 580 <212> PRT <213> Mouse <400> 8 Met Ser Phe His Val Glu Gly Leu Val Ala Ile Ile Leu Phe Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Ile Phe Leu Val Gly Ile Trp Ala Ala Trp Lys Thr Lys Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Pro Glu Glu His Ser Glu Ala Ile Ile Val Gly Gly Arg Asp 35 40 45 Ile Gly Leu Leu Val Gly Gly Phe Thr Met Thr Ala Thr Trp Val Gly 50 55 60 Gly Gly Tyr Ile Asn Gly Thr Ala Glu Ala Val Tyr Gly Pro Gly Cys 65 70 75 80 Gly Leu Ala Trp Ala Gln Ala Pro Ile Gly Tyr Ser Leu Ser Leu Ile 85 90 95 Leu Gly Gly Leu Phe Phe Ala Lys Pro Met Arg Ser Lys Gly Tyr Val 100 105 110 Thr Met Leu Asp Pro Phe Gln Gln Ile Tyr Gly Lys Arg Met Gly Gly 115 120 125 Leu Leu Phe Ile Pro Ala Leu Met Gly Glu Met Phe Trp Ala Ala Ala 130 135 140 Ile Phe Ser Ala Leu Gly Ala Thr Ile Ser Val Ile Ile Asp Val Asp 145 150 155 160 Val Asn Ile Ser Val Ile Val Ser Ala Leu Ile Ala Ile Leu Tyr Thr 165 170 175 Leu Val Gly Gly Leu Tyr Ser Val Ala Tyr Thr Asp Val Val Gln Leu 180 185 190 Phe Cys Ile Phe Ile Gly Leu Trp Ile Ser Val Pro Phe Ala Leu Ser 195 200 205 His Pro Ala Val Thr Asp Ile Gly Phe Thr Ala Val His Ala Lys Tyr 210 215 220 Gln Ser Pro Trp Leu Gly Thr Ile Glu Ser Val Glu Val Tyr Thr Trp 225 230 235 240 Leu Asp Asn Phe Leu Leu Leu Met Leu Gly Gly Ile Pro Trp Gln Ala 245 250 255 Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ser Ser Ser Ser Ala Thr Tyr Ala Gln Val 260 265 270 Leu Ser Phe Leu Ala Ala Phe Gly Cys Leu Val Met Ala Leu Pro Ala 275 280 285 Ile Cys Ile Gly Ala Ile Gly Ala Ser Thr Asp Trp Asn Gln Thr Ala 290 295 300 Tyr Gly Tyr Pro Asp Pro Lys Thr Lys Glu Glu Ala Asp Met Ile Leu 305 310 315 320 Pro Ile Val Leu Gln Tyr Leu Cys Pro Val Tyr Ile Ser Phe Phe Gly 325 330 335 Leu Gly Ala Val Ser Ala Ala Val Met Ser Ser Ala Asp Ser Ser Ile 340 345 350 Leu Ser Ala Ser Ser Met Phe Ala Arg Asn Ile Tyr Gln Leu Ser Phe 355 360 365 Arg Gln Asn Ala Ser Asp Lys Glu Ile Val Trp Val Met Arg Ile Thr 370 375 380 Val Leu Val Phe Gly Ala Ser Ala Thr Ala Met Ala Leu Leu Thr Lys 385 390 395 400 Thr Val Tyr Gly Leu Trp Tyr Leu Ser Ser Asp Leu Val Tyr Ile Ile 405 410 415 Ile Phe Pro Gln Leu Leu Cys Val Leu Phe Ile Lys Gly Thr Asn Thr 420 425 430 Tyr Gly Ala Val Ala Gly Tyr Ile Phe Gly Leu Phe Leu Arg Ile Thr 435 440 445 Gly Gly Glu Pro Tyr Leu Tyr Leu Gln Pro Leu Ile Phe Tyr Pro Gly 450 455 460 Tyr Tyr Ser Asp Lys Asn Gly Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Pro Phe Lys 465 470 475 480 Thr Leu Ser Met Val Thr Ser Phe Phe Thr Asn Ile Cys Val Ser Tyr 485 490 495 Leu Ala Lys Tyr Leu Phe Glu Ser Gly Thr Leu Pro Pro Lys Leu Asp 500 505 510 Val Phe Asp Ala Val Val Ala Arg His Ser Glu Glu Asn Met Asp Lys 515 520 525 Thr Ile Leu Val Arg Asn Glu Asn Ile Lys Leu Asn Glu Leu Ala Pro 530 535 540 Val Lys Pro Arg Gln Ser Leu Thr Leu Ser Ser Thr Phe Thr Asn Lys 545 550 555 560 Glu Ala Leu Leu Asp Val Asp Ser Ser Pro Glu Gly Ser Gly Thr Glu 565 570 575 Asp Asn Leu Gln 580
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の線虫ｃｈｏ−１（C48D1.3 cRNA）また
は水を注入したアフリカツメガエル卵母細胞の［3Ｈ］
コリンの取り込み結果を示す図である。
【図２】本発明の線虫ｃｈｏ−１（C48D1.3 cRNA）また
は水を注入したアフリカツメガエル卵母細胞のＮａ+の
依存性によるコリン取り込みに対する効果の結果を示す
図である。
【図３】本発明の線虫ｃｈｏ−１（C48D1.3 cRNA）また
は水を注入したアフリカツメガエル卵母細胞のＨＣ３に
よるコリン取り込みの阻害の結果を示す図である。
【図４】本発明のラットＣＨＴ１及び線虫ＣＨＯ−１の
それぞれのアミノ酸配列を示す図である。
【図５】線虫の神経系で本発明のcho-1::gfpを発現して
いる神経細胞の分布を示す図である。
【図６】Ｎａ+依存性グルコーストランスポーターファ
ミリーの系統樹を示す図である。
【図７】本発明のラットＣＨＴ１の予想されるトポロジ
ーを示す図である。
【図８】本発明のラット組織でのＣＨＴ１ｍＲＮＡ転写
産物のノザン解析の結果を示す図である。
【図９】本発明のラット脳におけるＣＨＴ１転写産物の
in situ ハイブリダイゼーション解析の結果を示す図で
ある。
【図１０】本発明の脊髄におけるＣＨＴ１転写産物のin
situ ハイブリダイゼーション解析の結果を示す図であ
る。
【図１１】本発明のＣＨＴ１ｃＲＮＡまたは水を注入し
たアフリカツメガエル卵母細胞の［3Ｈ］コリンの取り
込みの結果を示す図である。
【図１２】本発明のＣＨＴ１のコリン濃度によるコリン
取り込みに対する効果を示す図である。
【図１３】本発明のＣＨＴ１のＨＣ３によるコリン取り
込みの阻害の結果を示す図である。
【図１４】本発明のＣＨＴ１のＮａ+及びＣｌ-依存性に
よるコリン取り込みの結果を示す図である。
【図１５】本発明のＣＨＴ１ｃＤＮＡあるいはベクター
ｐｃＤＮＡ３．１をそれぞれ導入したＣＯＳ７細胞から
調製した膜への［3Ｈ］ＨＣ３結合結果を示す図であ
る。
【図１６】本発明のＣＨＴ１ｃＤＮＡあるいはベクター
ｐｃＤＮＡ３．１をそれぞれ導入したＣＯＳ７細胞から
調製した膜への特異的［3Ｈ］ＨＣ３結合の飽和解析の
結果を示す図である。
【図１７】本発明のＨＣ３、コリン（Ｃｈｏ）、アセチ
ルコリン（Ａｃｈ）による特異的［3Ｈ］ＨＣ３結合の
置換の結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA10 AA11 BA53 BA80 CA04 CA07 CA09 CA11 DA02 EA04 FA10 GA11 GA12 GA14 GA18 HA01 HA12 HA17 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ08 QQ22 QQ44 QQ53 QQ79 QR02 QR32 QR41 QR55 QR77 QR80 QS24 QS33 QS34 QX07 4B064 AG01 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA19X AA26X AA49X AA50X AA53X AA90X AA90Y AB01 AB04 AC14 BA02 BA25 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA07 AA17 BA01 BA22 BA44 DC50 ZA242 ZB212 ZC412 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA50 DA75 DA76 EA21 EA50 FA72 FA73 FA74 HA06

Claims (63)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 高親和性コリントランスポーター活性を
    有するタンパク質をコードする遺伝子。
  2. 【請求項２】 以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコー
    ドする遺伝子。 (ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
    ク質 (ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若
    しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
    アミノ酸配列からなり、かつ高親和性コリントランスポ
    ーター活性を有するタンパク質
  3. 【請求項３】 配列番号１に示される塩基配列又はその
    相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含む
    ＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 請求項３記載の遺伝子を構成するＤＮＡ
    とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ
    高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク
    質をコードする線虫由来のＤＮＡ。
  5. 【請求項５】 以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコー
    ドする遺伝子。 (ａ)配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
    ク質 (ｂ)配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若
    しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
    アミノ酸配列からなり、かつ高親和性コリントランスポ
    ーター活性を有するタンパク質
  6. 【請求項６】 配列番号３に示される塩基配列又はその
    相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含む
    ＤＮＡ。
  7. 【請求項７】 請求項６記載の遺伝子を構成するＤＮＡ
    とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ
    高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク
    質をコードするラット由来のＤＮＡ。
  8. 【請求項８】 以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコー
    ドする遺伝子。 (ａ)配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
    ク質 (ｂ)配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若
    しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
    アミノ酸配列からなり、かつ高親和性コリントランスポ
    ーター活性を有するタンパク質
  9. 【請求項９】 配列番号５に示される塩基配列又はその
    相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含む
    ＤＮＡ。
  10. 【請求項１０】 請求項９記載の遺伝子を構成するＤＮ
    Ａとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
    つ高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパ
    ク質をコードするヒト由来のＤＮＡ。
  11. 【請求項１１】 以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコ
    ードする遺伝子。 (ａ)配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
    ク質 (ｂ)配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１若
    しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
    アミノ酸配列からなり、かつ高親和性コリントランスポ
    ーター活性を有するタンパク質
  12. 【請求項１２】 配列番号７に示される塩基配列又はそ
    の相補的配列並びにこれらの配列の一部または全部を含
    むＤＮＡ。
  13. 【請求項１３】 請求項１２記載の遺伝子を構成するＤ
    ＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
    かつ高親和性コリントランスポーター活性を有するタン
    パク質をコードするマウス由来のＤＮＡ。
  14. 【請求項１４】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質。
  15. 【請求項１５】 配列番号２に示されるアミノ酸配列か
    らなるタンパク質。
  16. 【請求項１６】 配列番号２に示されるアミノ酸配列に
    おいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しく
    は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ線虫高親和性
    コリントランスポーター活性を有するタンパク質。
  17. 【請求項１７】 配列番号４に示されるアミノ酸配列か
    らなるタンパク質。
  18. 【請求項１８】 配列番号４に示されるアミノ酸配列に
    おいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しく
    は付加されたアミノ酸配列からなり、かつラット高親和
    性コリントランスポーター活性を有するタンパク質。
  19. 【請求項１９】 配列番号６に示されるアミノ酸配列か
    らなるタンパク質。
  20. 【請求項２０】 配列番号６に示されるアミノ酸配列に
    おいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しく
    は付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒト高親和性
    コリントランスポーター活性を有するタンパク質。
  21. 【請求項２１】 配列番号８に示されるアミノ酸配列か
    らなるタンパク質。
  22. 【請求項２２】 配列番号８に示されるアミノ酸配列に
    おいて、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しく
    は付加されたアミノ酸配列からなり、かつマウス高親和
    性コリントランスポーター活性を有するタンパク質。
  23. 【請求項２３】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質と、マーカータンパク質及び／又は
    ペプチドタグとを結合させた融合タンパク質。
  24. 【請求項２４】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質が、請求項１５又は１６記載の線虫
    高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク
    質であることを特徴とする請求項２３記載の融合タンパ
    ク質。
  25. 【請求項２５】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質が、請求項１７又は１８記載のラッ
    ト高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパ
    ク質であることを特徴とする請求項２３記載の融合タン
    パク質。
  26. 【請求項２６】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質が、請求項１９又は２０記載のヒト
    高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク
    質であることを特徴とする請求項２３記載の融合タンパ
    ク質。
  27. 【請求項２７】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質が、請求項２１又は２２記載のマウ
    ス高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパ
    ク質であることを特徴とする請求項２３記載の融合タン
    パク質。
  28. 【請求項２８】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質に特異的に結合する抗体。
  29. 【請求項２９】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質が、請求項１５又は１６記載の線虫
    高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク
    質であることを特徴とする請求項２８記載の抗体。
  30. 【請求項３０】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質が、請求項１７又は１８記載のラッ
    ト高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパ
    ク質であることを特徴とする請求項２８記載の抗体。
  31. 【請求項３１】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質が、請求項１９又は２０記載のヒト
    高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク
    質であることを特徴とする請求項２８記載の抗体。
  32. 【請求項３２】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質が、請求項２１又は２２記載のマウ
    ス高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパ
    ク質であることを特徴とする請求項２８記載の抗体。
  33. 【請求項３３】 抗体がモノクローナル抗体であること
    を特徴とする請求項２８〜３２のいずれか記載の抗体。
  34. 【請求項３４】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質を発現することができる発現系を含
    んでなる宿主細胞。
  35. 【請求項３５】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質が、請求項１５又は１６記載の線虫
    高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク
    質であることを特徴とする請求項３４記載の宿主細胞。
  36. 【請求項３６】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質が、請求項１７又は１８記載のラッ
    ト高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパ
    ク質であることを特徴とする請求項３４記載の宿主細
    胞。
  37. 【請求項３７】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質が、請求項１９又は２０記載のヒト
    高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク
    質であることを特徴とする請求項３４記載の宿主細胞。
  38. 【請求項３８】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質が、請求項２１又は２２記載のマウ
    ス高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパ
    ク質であることを特徴とする請求項３４記載の宿主細
    胞。
  39. 【請求項３９】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上
    で欠損又は過剰発現することを特徴とする非ヒト動物。
  40. 【請求項４０】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質が、請求項１５又は１６記載の線虫
    高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク
    質であることを特徴とする請求項３９記載の非ヒト動
    物。
  41. 【請求項４１】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質が、請求項１７又は１８記載のラッ
    ト高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパ
    ク質であることを特徴とする請求項３９記載の非ヒト動
    物。
  42. 【請求項４２】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質が、請求項１９又は２０記載のヒト
    高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパク
    質であることを特徴とする請求項３９記載の非ヒト動
    物。
  43. 【請求項４３】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質が、請求項２１又は２２記載のマウ
    ス高親和性コリントランスポーター活性を有するタンパ
    ク質であることを特徴とする請求項３９記載の非ヒト動
    物。
  44. 【請求項４４】 非ヒト動物が、マウス又はラットであ
    ることを特徴とする請求項３９〜４３のいずれか記載の
    非ヒト動物。
  45. 【請求項４５】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上
    で欠損した細胞に、請求項８〜１０のいずれか記載の遺
    伝子又はＤＮＡを導入することを特徴とする高親和性コ
    リントランスポーター活性を有する細胞の調製方法。
  46. 【請求項４６】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有する細胞が、請求項８〜１０のいずれか記載の遺伝
    子又はＤＮＡが染色体にインテグレイトされ、ステイブ
    ルに高親和性コリントランスポーター活性を示す細胞で
    あることを特徴とする請求項４５記載の高親和性コリン
    トランスポーター活性を有する細胞の調製方法。
  47. 【請求項４７】 請求項４５又は４６記載の高親和性コ
    リントランスポーター活性を有する細胞の調製方法によ
    り得られることを特徴とする高親和性コリントランスポ
    ーター活性を有する細胞。
  48. 【請求項４８】 被検物質の存在下、請求項１４〜２２
    のいずれか記載の高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質の高親和性コリントランスポーター
    活性を測定・評価することを特徴とする高親和性コリン
    トランスポーター活性促進又は抑制物質のスクリーニン
    グ方法。
  49. 【請求項４９】 被検物質の存在下、高親和性コリント
    ランスポーター活性を有するタンパク質を発現している
    細胞膜又は細胞をインビトロで培養し、該細胞膜又は該
    細胞における高親和性コリントランスポーター活性を有
    するタンパク質の活性及び／又は発現量を測定・評価す
    ることを特徴とする高親和性コリントランスポーター活
    性促進若しくは抑制物質又は高親和性コリントランスポ
    ーター発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方
    法。
  50. 【請求項５０】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質を発現している細胞膜又は細胞が、
    請求項３４〜３８のいずれか記載の高親和性コリントラ
    ンスポーター活性を有するタンパク質を発現することが
    できる発現系を含んでなる宿主細胞又は請求項４７記載
    の高親和性コリントランスポーター活性を有する細胞で
    あることを特徴とする請求項４９記載の高親和性コリン
    トランスポーター活性促進若しくは抑制物質又は高親和
    性コリントランスポーター発現促進若しくは抑制物質の
    スクリーニング方法。
  51. 【請求項５１】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質が、組換えタンパク質であることを
    特徴とする請求項４８〜５０のいずれか記載の高親和性
    コリントランスポーター活性促進若しくは抑制物質又は
    高親和性コリントランスポーター発現促進若しくは抑制
    物質のスクリーニング方法。
  52. 【請求項５２】 被検物質の存在下、請求項３９〜４４
    のいずれか記載の非ヒト動物から得られた細胞をインビ
    トロで培養し、該細胞における高親和性コリントランス
    ポーター活性を有するタンパク質の活性及び／又は発現
    量を測定・評価することを特徴とする高親和性コリント
    ランスポーター活性促進若しくは抑制物質又は高親和性
    コリントランスポーター発現促進若しくは抑制物質のス
    クリーニング方法。
  53. 【請求項５３】 被検物質を非ヒト動物に投与し、高親
    和性コリントランスポーター活性を有するタンパク質の
    活性及び／又は発現量を評価することを特徴とする高親
    和性コリントランスポーター活性促進若しくは抑制物質
    又は高親和性コリントランスポーター発現促進若しくは
    抑制物質のスクリーニング方法。
  54. 【請求項５４】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上
    で欠損又は過剰発現した非ヒト動物に被検物質を投与
    し、高親和性コリントランスポーター活性を有するタン
    パク質の活性及び／又は発現量を評価することを特徴と
    する高親和性コリントランスポーター活性促進若しくは
    抑制物質又は高親和性コリントランスポーター発現促進
    若しくは抑制物質のスクリーニング方法。
  55. 【請求項５５】 高親和性コリントランスポーター活性
    を有するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上
    で欠損又は過剰発現した非ヒト動物に被検物質を投与
    し、高親和性コリントランスポーター活性を有するタン
    パク質の活性及び／又は発現量を野生型非ヒト動物の場
    合と比較・評価することを特徴とする高親和性コリント
    ランスポーター活性促進若しくは抑制物質又は高親和性
    コリントランスポーター発現促進若しくは抑制物質のス
    クリーニング方法。
  56. 【請求項５６】 非ヒト動物が、マウス又はラットであ
    ることを特徴とする請求項５２〜５５のいずれか記載の
    高親和性コリントランスポーター活性促進若しくは抑制
    物質又は高親和性コリントランスポーター発現促進若し
    くは抑制物質のスクリーニング方法。
  57. 【請求項５７】 請求項４８〜５６のいずれか記載のス
    クリーニング方法により得られる高親和性コリントラン
    スポーター活性を有するタンパク質の活性若しくは発現
    を促進する物質。
  58. 【請求項５８】 請求項４８〜５６のいずれか記載のス
    クリーニング方法により得られる高親和性コリントラン
    スポーター活性を有するタンパク質の活性若しくは発現
    を抑制する物質。
  59. 【請求項５９】 高親和性コリントランスポーターの活
    性増加又は発現増強を必要としている患者を治療するの
    に用いられる医薬組成物であって、有効成分として請求
    項１４〜２２のいずれか記載のタンパク質及び／又は請
    求項５７記載の高親和性コリントランスポーター活性を
    有するタンパク質の活性若しくは発現を促進する物質を
    含んでなる医薬組成物。
  60. 【請求項６０】 高親和性コリントランスポーターの活
    性又は発現の抑制を必要としている患者を治療するのに
    用いられる医薬組成物であって、有効成分として請求項
    １４〜２２のいずれか記載のタンパク質及び／又は請求
    項５８記載の高親和性コリントランスポーター活性を有
    するタンパク質の活性若しくは発現を抑制する物質を含
    んでなる医薬組成物。
  61. 【請求項６１】 検体中の高親和性コリントランスポー
    ターをコードするＤＮＡ配列を、請求項１９又は２０記
    載のタンパク質をコードするＤＮＡ配列と比較すること
    を特徴とする高親和性コリントランスポーターの発現又
    は活性と関連する疾病の診断方法。
  62. 【請求項６２】 請求項１９又は２０記載のタンパク質
    をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのアンチセンス鎖の全部
    又は一部からなるアルツハイマー症の診断用プローブ。
  63. 【請求項６３】 請求項６２記載の診断用プローブ及び
    ／又は請求項２８〜３３のいずれか記載の抗体を含有す
    ることを特徴とするアルツハイマー症の診断薬。
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