JP2001122797A - 皮膚外用剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】単なる創傷はもとより、上記の褥瘡に代表され
る治りにくい潰瘍を伴う皮膚疾患等に対して効果のある
成分を見い出し、かかる成分を有効成分とする皮膚外用
剤を提供すること。 【解決手段】白血病阻害因子（ＬＩＦ）を有効成分とす
る皮膚外用剤。この皮膚外用剤は、単なる創傷はもとよ
り、褥瘡に代表される治りにくい潰瘍を伴う皮膚疾患等
に対して、優れた予防効果及び治療効果を有することを
見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、皮膚外用剤に関す
る技術分野の発明である。より詳細には、創傷から褥瘡
等の潰瘍を伴う皮膚疾患に対して、予防効果及び治療効
果が認められる皮膚外用剤に関する発明である。

【０００２】

【従来の技術】皮膚の創傷や疾患（以下、皮膚疾患等と
いう）には、様々なものがあり、これらの皮膚疾患等に
対する治療効果を、様々な側面から発揮する皮膚外用剤
が提供されている。

【０００３】皮膚疾患等のうちでも、潰瘍を伴う皮膚疾
患等は、治りにくいものとして知られている。この潰瘍
を伴う治癒しにくい皮膚外傷の代表的なものとして、褥
瘡（いわゆる「床擦れ」）が知られている。

【０００４】褥瘡は、長期臥床中の病人の背中や腰（特
に、仙骨部や腸骨稜部）、さらには足踵のように、長期
間圧迫されている部位に生じる、その境界が鮮明な、乾
燥性壊死塊が付着した、難治性の潰瘍で、圧迫部分の発
赤・腫脹に始まり、水疱・糜爛を経て、潰瘍化し、壊死
部分が深く、筋や腱や骨が露出することも稀ではない。
褥瘡は、一旦生じると難治性のために、寝たきりの老人
等においては、医療上の大きな問題となっている。

【０００５】

【発明が解決すべき課題】本発明が解決すべき課題は、
単なる創傷はもとより、上記の褥瘡に代表される治りに
くい潰瘍を伴う皮膚疾患等に対して効果のある成分を見
い出し、かかる成分を有効成分とする皮膚外用剤を提供
することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、この課題の
解決に向けて、様々な角度から検討を重ねた。その一環
として、治療が困難で、患者が病床にいる期間が非常に
長い、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の患者に、奇妙な
ことに、長期にわたって病床に伏している他の種類の疾
患の患者と比較して、褥瘡になる患者が極端に少ないこ
とに着目した。

【０００７】ＡＬＳは、原因不明の代表的な神経難病の
一つで、その治療法は確立しておらず、病状の進行と共
に、高度の筋萎縮や筋力低下が認められ、最終的に、こ
れらの症状が呼吸筋にまで及び、このため、最終的には
死に至る疾患である。ＡＬＳ患者は、筋萎縮や麻痺によ
る不十分な栄養摂取や、全身のるい痩に加え、末期には
完全な運動麻痺に陥り、本来なら褥瘡が生じやすい条件
が揃っている。それにもかかわらず、死に至るまで、褥
瘡ができにくい、という奇妙な現象が認められた。

【０００８】そこで、ＡＬＳ患者の皮膚の状態につい
て、詳細に解析したところ、驚くべきことに、ＡＬＳ患
者の皮膚表面に、白血病阻害因子(Leukemia inhibiting
factor ：以下、ＬＩＦともいう）が、旺盛に発現して
いることと表皮が増生していること、さらには、in vit
roで、ＬＩＦによる表皮の増殖促進とケラチノサイトに
対する増殖促進効果が認められることを突き止め、かか
るＬＩＦを有効成分とする皮膚外用剤を提供することに
より、上記の課題を解決し得ることを見出して、本発明
を完成した。

【０００９】すなわち、本発明は、ＬＩＦを有効成分と
する皮膚外用剤（以下、本発明皮膚外用剤ともいう）を
提供する発明である。本発明皮膚外用剤は、典型的に
は、褥瘡を治療するための「褥瘡治療剤」及び創傷を治
療するための「創傷治療剤」としての態様を採り得る皮
膚外用剤である。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の態様につい
て説明する。本発明皮膚外用剤の有効成分として配合さ
れるＬＩＦは、Ｄ因子とも呼ばれ、約１８０アミノ酸か
らなる分子量が３８０００〜６２０００の糖蛋白質であ
る。

【００１１】ＬＩＦは、運動神経や知覚神経の生存維
持、交感神経のコリン作動性分化に、免疫系では炎症時
に働くneurotrophic factor であり、筋損傷時の再生促
進作用等を有することが知られている。

【００１２】ここで、まず、ＬＩＦについて簡単に説明
する。ＬＩＦは、活性化されたＴ細胞、単球、マスト細
胞、ニューロン細胞を含む様々な種類の細胞によって発
現される、多面発現性のサイトカインであり(GilettNA,
Lowe D,Lu L et al.,Growth Fact 1993;9:301-305、Li
M.Sendtner M,SmithA,Nature 1995;378:724-727)、分
化、細胞増殖、悪液質及び炎症に関連している。ＬＩＦ
は、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＣＴ−１、ＯＭ及びＩＬ−１
１を含むサイトカインのグループに属している。これら
のグループのサイトカインには、異なる生物学的作用が
認められるが、シグナルは共通の受容体サブユニットgp
130 を介して伝達される(Stahl N,Yancopoulos GD,J Ne
urobiol 1994;25:1454-1466)。ヤーヌスチロシンキナー
ゼであるJAK1とJAK2は、ＬＩＦの刺激によって活性化さ
れ、Stat1 ，Stat3 を順次リン酸化し、リン酸化された
Stat1 ，Stat3 は、核に移行し、Statに応答する遺伝子
の転写を惹起する(Hirano T,Matsuda T,Nakajima K,Ste
m Cells 1994;12:262-277)。ＬＩＦ遺伝子は、第２２染
色体の長腕に局在しており、孤発性(Sporadic)ＡＬＳに
関係するＮＦ−Ｈ遺伝子に近接している(Meyer MA,Pott
er NT,Muscle Nerve 1996;19:1291-1301) 。ＬＩＦは、
損傷した骨格筋の再生時に産生され(Kurek JB,Bower J
J,Romanella M,et al.Muscle Nerve 1996;19.1291-130
1)、in vivo において筋再生を刺激する筋原性の成長因
子(myogenic growth factor)として働く(Kurek JB,Bowe
r JJ,Romanella M,et al.MuscleNerve 1997;20:815-82
2)。また、ＬＩＦは、運動神経と知覚神経において生存
・維持や新生児の脊髄において、神経と星状細胞の前駆
体の分化を促進する(Richards LJ,Kilpatrick TJ,Dutto
n R et al.Eur J Neurosol 1996;8:291-299)。

【００１３】ＬＩＦは、ＡＬＳの発症に関与する興奮性
のアミノ酸、ＢＯＡＡ毒で障害した神経において、顕著
な上昇を示す。ＬＩＦとＬＩＦ受容体は、培養されたヒ
トケラチノサイト（ＫＣ）において、ＲＴ−ＰＣＲ法に
よって検出される。ＬＩＦ蛋白質は、ＫＣ培養液におい
て殆ど検出されないが、ＫＣをＩＬ−１、ＩＬ−８また
はカルシウムで刺激することによって、顕著に増加させ
ることができる(Paglia D,Kondo S,Ng KM,et al.Br J D
ermatol 1996;134:817-823) 。

【００１４】上述したように、ＬＩＦは、ＡＬＳに対す
る有望な治療手段として用いようとする動きも認められ
るが、本発明のように、ＬＩＦを、皮膚外用剤における
有効成分とした例は、全く認められない。

【００１５】本発明皮膚外用剤の有効成分として用いら
れるＬＩＦは、ヒト由来のＬＩＦは勿論、マウス、ラッ
ト、ウサギ等の他の動物（動物種は特に限定されない）
に由来するＬＩＦを用いることができる。ただし、本発
明皮膚外用剤が、主にヒトを対象に使用されることを考
慮すると、ヒト由来のＬＩＦを本発明皮膚外用剤の有効
成分とすることが好ましい（本発明皮膚外用剤を人間以
外の動物に対して使用する場合には、その動物に由来す
るＬＩＦを、有効成分として用いることが、原則として
好ましい）。

【００１６】ＬＩＦ蛋白質をコードする遺伝子配列は、
既に決定されており〔Gough,NM,Gearing DP,King JA et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A .,85(8):2623-2627(1
988)] 、ＬＩＦ遺伝子は、常法により、得ることができ
る。

【００１７】すなわち、所望する遺伝子を有する供給
源、例えば、Ｔ細胞の遺伝子ライブラリーを作成し、こ
の遺伝子ライブラリーから、ＬＩＦ遺伝子を有するクロ
ーンをスクリーニングすることにより、ＬＩＦ遺伝子を
入手することができる。 遺伝子ライブラリーは、通常
公知の方法で調製することができる。例えば、Ｔ細胞を
穏やかな条件下で破壊後、この破壊物にショ糖密度勾配
遠心や塩化セシウム密度勾配遠心を施すことにより、ゲ
ノムＤＮＡを分離し、このゲノムＤＮＡを適当なII型制
限酵素で処理して生じたＤＮＡ断片を、その断片の末端
配列に応じて遺伝子導入用ベクターに組み込み、これを
そのベクターに応じた宿主に導入することにより、遺伝
子ライブラリーを調製することができる。

【００１８】ここで用いる遺伝子導入用ベクターは、特
に限定されず、例えば、プラスミドとしては、pBluescr
ipt ，ｐＵＣ１８，ｐＢＲ３２２，ｐＢＧＰ１２０，ｐ
ＰＣφ１，ｐＰＣφ２，ｐＰＣφ３，ｐＭＣ１４０３，
ｐＬＧ２００，ｐＬＧ３００，ｐＬＧ４００等を；λフ
ァージとしては、λｇｔ１０，λＺＡＰII等を挙げるこ
とができる。

【００１９】なお、これらの遺伝子ライブラリーの調製
工程を、市販の遺伝子ライブラリー調製用キットを用い
て行うことも可能である。このようにして調製した、Ｔ
細胞等の遺伝子ライブラリーにおけるクローンを選別し
て、ＬＩＦ遺伝子を有する遺伝子を、ある程度選別する
ことが好ましい。例えば、既知のＬＩＦ遺伝子の塩基配
列に基づくＤＮＡフラグメントを合成し、これに標識を
施した標識プローブを用いて、ＬＩＦ遺伝子を有するク
ローンを選別することが可能である。

【００２０】また、上記ＤＮＡフラグメントをプライマ
ーとして、ヒト神経細胞等のゲノムＤＮＡに、ＰＣＲ等
の遺伝子増幅手段を施し、この増幅産物に標識を施した
ものをプローブとして用いて、ＬＩＦ遺伝子を有するク
ローン群を選別することも可能である。

【００２１】上述のようにして調製した標識プローブ
を、Ｔ細胞等の遺伝子ライブラリーのレプリカにハイブ
リダイズさせて、標識プローブとハイブリダイズするク
ローンを選別し、このクローンをＬＩＦ遺伝子を有する
クローンとすることができる。

【００２２】このようにして調製したクローンにおい
て、ＬＩＦ遺伝子が存在するか否かの確認は、通常公知
の遺伝子配列の決定手段を用いて行うことができる。例
えば、マキサム−ギルバート法(Maxam,A.M.,and Gilber
t.W.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,560(1977))，ゲノ
ミック・シークエンス法(Church,G.M. and Gilbert.W.P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,1991(1984)) ，マルチプ
レックス法(Church,G.M. and Kieffer-Higgins,S.,Scie
nce,240,185(1988))，サイクルシークエンス法(Murray,
V.,Nucleic Acids Res.,17,8889(1989))，ジデオキシ法
(Sanger,F.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,546
3(1977))等の手段を用いて、ＬＩＦ遺伝子が存在するか
否かを確認することができる。

【００２３】また、これらの手段の原理を応用した、塩
基配列自動解析装置を用いて、ＬＩＦ遺伝子が存在する
か否かの確認を行うことも、勿論可能である。このよう
にして得られたＬＩＦ遺伝子を含むクローンから、ＬＩ
Ｆ遺伝子を単離することができる。

【００２４】さらに、既知のＬＩＦ遺伝子の塩基配列を
基にして、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法を、Ｔ細胞
等のＲＮＡに直接施すことにより、より簡便かつ迅速
に、ＬＩＦ遺伝子を入手することが可能である。

【００２５】さらに、ホスファイト−トリエステル法(I
kehara,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,5956
(1984)) 等の通常公知の方法を用いて、ＬＩＦ遺伝子を
化学合成することも可能であり、これらの化学合成法を
応用したＤＮＡシンセサイザーを用いて、ＬＩＦ遺伝子
を合成することもできる。

【００２６】後述するように、このようにして得られる
ＬＩＦ遺伝子を基にして製造されるＬＩＦが、本発明皮
膚外用剤の有効成分として用いられるが、そのアミノ酸
配列を改変（例えば、特定アミノ酸の欠失，変更，付
加）した改変ＬＩＦも、この改変ＬＩＦの生理的な活性
（かかる生理的な活性については後述する）が、本来の
ＬＩＦと実質的に変わらない限り、本発明皮膚外用剤の
有効成分となるＬＩＦの範疇に入るものである。そし
て、かかる改変ＬＩＦを製造する基となる改変ＬＩＦ遺
伝子も、通常公知の方法に従い製造することができる。

【００２７】すなわち、サイト−スペシフィックミュー
タジェネシス(Site-Specific Mutagenesis)(Mark,D.F.,
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,5662(1984))
や、前述の遺伝子の化学合成法等を用いて、改変ＬＩＦ
遺伝子を得ることができる。

【００２８】上述のようにして入手され得るＬＩＦ遺伝
子（以下、特に断わらない限り、改変ＬＩＦ遺伝子を含
む）を用いて、本発明皮膚外用剤の有効成分として用い
得るＬＩＦ（以下、特に断わらない限り、改変ＬＩＦを
含む）を、一般的な遺伝子組換え技術に従って製造する
ことができる。

【００２９】より具体的には、ＬＩＦ遺伝子が、発現可
能な形態の遺伝子発現用ベクターに、ＬＩＦ遺伝子を組
み込み、この遺伝子発現用ベクターの性質に対応する宿
主に、この組換えベクターを導入して、形質転換し、か
かる形質転換体を培養等することにより、所望するＬＩ
Ｆを製造することができる。

【００３０】ここで用いる遺伝子発現用ベクターは、通
常、発現しようとする遺伝子の上流域に、プロモータ
ー，エンハンサー等を、同下流域に転写終了配列等を保
有するのが好適である。

【００３１】また、ＬＩＦ遺伝子の発現は、直接発現系
に限らず、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子，グル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子や、チオレド
キシン遺伝子を利用した融合タンパク質発現系とするこ
とも可能である。

【００３２】遺伝子発現用ベクターとしては、例えば、
宿主を大腸菌とするべきものとして、ｐＱＥ，ｐＧＥ
Ｘ，ｐＴ７−７，ｐＭＡＬ，ｐＴｒｘＦｕｓ，ｐＥＴ，
ｐＮＴ２６ＣII等を例示することができる。また、宿主
を枯草菌とするべきものとしては、ｐＰＬ６０８，ｐＮ
Ｃ３，ｐＳＭ２３，ｐＫＨ８０等を例示することができ
る。

【００３３】また、宿主を酵母とするべきものとして
は、ｐＧＴ５，ｐＤＢ２４８Ｘ，ｐＡＲＴ１，ｐＲＥＰ
１，ＹＥｐ１３，ＹＲｐ７，ＹＣｐ５０等を例示するこ
とができる。

【００３４】また、宿主を哺乳動物細胞又は昆虫細胞と
するべきものとしては、ｐ９１０２３，ｐＣＤＭ８，ｐ
ｃＤＬ−ＳＲα２９６，ｐＢＣＭＧＳＮｅｏ，ｐＳＶ２
ｄｈｆｒ，ｐＳＶｄｈｆｒ，ｐＡｃ３７３，ｐＡＣＹＭ
１，ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐＲＥＰ４，ｐｃＤＮＡ１等を例
示することができる。

【００３５】なお、これらの既存の遺伝子発現用ベクタ
ーの他、目的に応じて適宜作出した遺伝子発現用ベクタ
ーを用いることも、勿論可能である。ＬＩＦ遺伝子を組
み込んだ遺伝子発現用ベクターの宿主細胞への導入及び
このベクターによる宿主の形質転換法としては、一般的
な方法、例えば、宿主細胞が大腸菌や枯草菌である場合
には、塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等
を；宿主細胞が哺乳動物細胞又は昆虫細胞である場合
は、リン酸カルシウム法，エレクトロポレーション法若
しくはリポソーム法等を選択することができる。

【００３６】このようにして得られる形質転換体を、常
法に従い培養することにより、ＬＩＦが培養系に蓄積さ
れる。かかる培養において用いられる培地は、選択した
宿主の種類に応じて適宜選択することが可能である。例
えば、宿主が大腸菌である場合には、ＬＢ培地やＴＢ培
地等が、宿主が哺乳動物細胞の場合には、ＲＰＭＩ１６
４０培地等が適宜選択され得る。

【００３７】上述のような形質転換体の培養によって得
られる、培養物からのＬＩＦの単離及び精製は、常法に
従って行うことが可能であり、例えば、培養物を、ＬＩ
Ｆの物理的性質及び／又は化学的性質を利用した、各種
の処理操作を用いて行うことができる。

【００３８】具体的には、例えば、タンパク質沈澱剤に
よる処理，限外濾過，ゲル濾過，高速液体クロマトグラ
フィー，遠心分離，電気泳動，特異抗体を用いたアフィ
ニティクロマトグラフィー，透析法等を、単独又は組み
合わせて、ＬＩＦの単離及び精製を行うことができる。

【００３９】このようにして得られた、ＬＩＦを、本発
明皮膚外用剤の有効成分として配合することができる。
なお、本発明皮膚外用剤の有効成分として配合され得る
ＬＩＦは、必ずしも完全なものとして認識されているＬ
ＩＦ分子全体を意味するものではなく、ＬＩＦの生理的
な活性を実質的に維持し得る限りにおいて、完全なＬＩ
Ｆ分子の断片も用いることができる。

【００４０】本発明皮膚外用剤におけるＬＩＦの配合量
は、本発明皮膚外用剤のより具体的な用途や剤型に応じ
て適宜選択されるべきものであり、特に限定されるべき
ものではないが、概ね皮膚外用剤全体に対して０．１〜
１．０重量％が好ましい。

【００４１】このようにして、ＬＩＦを、本発明皮膚外
用剤の有効成分として配合することにより、単なる創傷
はもとより、上記の褥瘡に代表される治りにくい、潰瘍
を伴う皮膚疾患等に対して、著しい治療効果を有する皮
膚外用剤が提供される。

【００４２】本発明皮膚外用剤の用法・用量は、本発明
皮膚外用剤の具体的な用途や、使用者の症状等に応じて
適宜選択することが可能であり、特に限定されるべきも
のではない。

【００４３】本発明皮膚外用剤には、必須成分であるＬ
ＩＦの他に、本発明の所期の効果を妨げない限り、他の
薬効成分等を、その薬効成分において一般的に知られて
いる薬効を本発明皮膚外用剤に発揮させるべく、必要に
応じて配合することができる。

【００４４】例えば、ソルコセリル，ジルダザック，イ
サロパン，スクロース等の肉芽形成促進剤；ゲンタマイ
シン，エリスロマイシン，テラマイシン，アクロマイシ
ン，フラジオマイシン，ポピドンヨード等の抗菌剤等を
本発明皮膚外用剤に配合することができる。

【００４５】本発明皮膚外用剤は、単なる創傷を治療す
ることを目的とする、創傷治療剤としての態様を採り得
ることは勿論のこと、特に治りにくい褥瘡を治療するた
めの、褥瘡治療剤としての形態を採り得る。

【００４６】本発明皮膚外用剤が、創傷治療剤としての
形態を採る場合には、従来の創傷治療剤に配合されてい
る有効成分、典型的には、上記した肉芽形成促進剤や抗
菌剤、その他、創傷を治療するために有効であると考え
られる全ての成分、例えば、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＩＧ
Ｆ−１等を、必要に応じて、本発明皮膚外用剤における
効果を損なわない限度内で、ＬＩＦと組み合わせて配合
することができる。

【００４７】本発明皮膚外用剤が、褥瘡治療剤としての
形態を採る場合には、従来の褥瘡治療剤に配合されてい
る有効成分、例えば、抗菌剤（上記した）、肉芽形成促
進剤（上記した）、蛋白分解酵素剤、その他、褥瘡を治
療するために有効であると考えられる全ての成分、例え
ば、上述したＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＩＧＦ−１等を、必
要に応じて、本発明皮膚外用剤における効果を損なわな
い限度内で、ＬＩＦと組み合わせて配合することができ
る。

【００４８】本発明皮膚外用剤の剤型は、特に限定され
ず、例えば、液剤，軟膏剤，クリーム剤，貼付剤等の剤
型を採り得る。かかる剤型に応じて、本発明皮膚外用剤
には、通常公知の基剤成分等、例えば、油分，界面活性
剤，高級アルコール，防腐剤，保湿剤，増粘剤，キレー
ト剤，色素，香料等を配合することができる。

【００４９】本発明皮膚外用剤の具体的な剤型は、後述
する実施例において記載する。

【００５０】

【実施例】以下、本発明の実施例を記載するが、この実
施例により、本発明の技術的範囲が限定されるものでは
ない。また、特に断わらない限り、配合量は、配合され
る対象全体に対する重量％で表す。

【００５１】〔参考例〕 （１）ＬＩＦの調製 ＬＩＦのｃＤＮＡを、常法に従って調製して、大腸菌の
発現ベクター（ｐＧＥＸ−２Ｔ：Pharmacia 社製）に組
み込んだ後、これを大腸菌（ＪＭ１０９：TOYOBO社製）
に導入して、ＩＰＴＧ（isopropy-beta-D-thiogalactop
yranoside)で誘導することによりＬＩＦ蛋白質〔ＧＳＴ
（glutathioneS-transferase）との融合蛋白質〕を発現
させた。このＧＳＴ融合ＬＩＦ蛋白質を、glutathione-
sepharose カラム（Pharmacia 社製）を用いて一段階で
精製し、次いで、得られた精製ＧＳＴ融合ＬＩＦ蛋白質
を、thrombinで処理し、ＧＳＴ部分とＬＩＦ部分とを切
断した後、Benzamide Sepharose 6B (Pharmacia Biotec
h 社）カラムでthrombinを除去した。このthrombinによ
る処理物を、再びglutathione-sepharose カラムに通
し、カラムに結合せずに通過した画分を集めて、純品の
ＬＩＦ蛋白質（以下、特に断わらない限り、このように
して得られたＬＩＦ蛋白質を、「ＬＩＦ」という。ま
た、特に断わらない限り、以下の実施例においては、Ｌ
ＩＦとして、この参考例で製造したＬＩＦを、本発明皮
膚外用剤の有効成分として用いた。）を得た。

【００５２】（２）ＬＩＦに対する抗体の調製 上記のようにして得たＬＩＦを、フロインドのアジュバ
ンドと共に、ウサギに注射して、この免疫操作を繰り返
した後、ウサギから血清を採取して、常法により、ポリ
クローナール抗体を精製した。このポリクローナル抗体
の特異性は、上記のようにして得たＬＩＦ、及びＬＩＦ
が盛んに発現されているＴ細胞と、得られた抗体とのウ
エスタンブロットにより確認した。

【００５３】〔試験例〕ＬＩＦの本発明皮膚外用剤の有
効成分としての有用性の検討ケラチノサイト及び皮膚組織での検討 ケラチノサイト培地の調製 ３人の提供者からの、健常な表皮のケラチノサイト（ク
ラボウ社）は、ＫＧＭ培地（Keratinocyte growth medi
um）〔0.1 mM phosphoethanolamin ，10μg/mLtransfer
rin，5 μg/mL insulin, 10ng/mL ＥＧＦ，0.5 μg/mL
hydrocortisone,50U/mL penicillin ，100 μg/mL stre
ptomycin ，0.4 ％v/v bovine hypothalamic extract
（ＢＰＥ：クラボウ社）が添加されたＭＣＤＢ１５３培
地（シグマ社）〕で、３７℃・５％ＣＯ₂ の条件で培養
した。培地は、２〜３日毎に交換した。ケラチノサイト
がコンフルエントな状態になったら、0.25％トリプシン
／0.02％ＥＤＴＡでサブカルチャーを行った。３〜６世
代のケラチノサイトを試験に用いた。

【００５４】 ケラチノサイトの増生の計測 ケラチノサイトの増生は、ＭＴＴ法(Mosmann T.J.Immun
l Med 1993;65:55-63)で計測した。ケラチノサイトは、
９６ウエルプレートにおいて、insulin ，ＥＧＦ，hydr
ocortisone，ＢＰＥを除いたＫＧＭ培地を用いて、２４
時間培養した。それから、ＬＩＦを添加（0.01〜100 ng
/mL)した、このＫＧＭ培地を、各々のウエルに加え、７
２時間インキュベートを行った。インキュベーション終
了後、１０μL の、3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-
diphenyl tetrazolium bromide（ＭＴＴ,2.5mg/L) （シ
グマ社）を各々のウエルに添加後、４時間インキュベー
トを行った。開裂したＭＴＴを、０．０４Ｎのhydrogen
chloride （２−プロパノール中）で抽出した。その抽
出物の５６０nmにおける吸光度を計測した。

【００５５】 皮膚の組織培養 全厚の皮膚は、手術を行った胸部の癌の患者から得た。
大きさが揃えられた（２×３mm）皮膚から余分な脂肪組
織が除去され、皮膚の片側を、２０ng/mL の組換えヒト
ＬＩＦ含有又は非含有の、0.25％ bovine albumin 、１
％ antibiotic/antimycotic 、１％ＦＢＳを添加したＩ
ＭＥＭ(Iscove's modified Dulbecco'smedium) に浸し
て、３７℃・５％ＣＯ₂ で７日間インキュベートを行っ
た。その後、その皮膚組織を１０％ホルマリンで固定
し、アルコール槽で脱水して、パラフィンで包埋した。
７個のメイクロメーターに適した厚さの切片が切り出さ
れ、ポリリジンで前処理されたスライドにマウントし
た。これらのスライドを、ウサギ抗サイトケラチン抗体
（Progen Biotechnik 社）（１００倍）と一緒に、１時
間、室温でインキュベートして、ＡＢＣキット（前出）
で染色した。

【００５６】 〜の結果 第１図に示すように、ＬＩＦの処方により、用量依存的
なケラチノサイトの増殖が認められた。細胞増殖は、３
ng/ml という低用量においてさえも、顕著に認められ
た。

【００５７】また、皮膚の組織培養においても、第２図
（Ａ：ＬＩＦ非含有培地を用いた染色像、Ｂ：ＬＩＦ含
有培地を用いた染色像）に示すように、ＬＩＦを投与す
ることにより、ＬＩＦ非含有培地との比較において、表
皮の増生が認められた。

【００５８】このように、ケラチノサイトを増殖させる
こと、すなわち、創傷や褥瘡に対して治療効果を発揮す
ることが可能なＬＩＦを、皮膚外用剤の有効成分として
配合することにより、所望する本発明皮膚外用剤（創傷
治療剤，褥瘡治療剤）が提供されることが明らかになっ
た。

【００５９】２．褥瘡の治療効果に対する検討（ＡＬＳ
患者の皮膚におけるＬＩＦの高発現の検討）免疫染色 １０名のＡＬＳ患者（男性７名，女性３名：４１〜６９
歳）と１２名の他の神経原性疾患又は筋肉原性疾患患者
〔男性８名，女性４名、３８〜７１歳：polymyositis
(2),mitochondrial encephalomyopathy(1),sarcoidosis
(1),myotonic dystrophy(1),chronic inflamentory dem
yelonating polyradiculoneuropathy(1),multiple scle
osis(1),Parkinson's disease(1),progressive supranu
clear pathy(1), paraneoplastic cerebellar degemera
tion(1),spinocerebellar degeneration(1) 〕の生検皮
膚を即座にホルマリン固定した後、パラフィン包埋を行
って、皮膚標本を作成した。次いで、これらの皮膚標本
を、キシレン、含水エタノール及びリン酸緩衝食塩水
（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）で、脱パラフィン処理を行い、
０．３％過酸化水素／無水メタノールで３０分間処理し
た。トリプシン処理を行った後、切片を１．５％ウサギ
血清で３０分間インキュベートし、抗体の非特異的な結
合をブロックした。切片を、ＬＩＦのＮ末端ペプチド
〔Ｎ−１８，サンタクルーズ(Santa Cruz)，ＣＡ〕に対
するヤギポリクローナル抗体（１μg/mL）で１２時間反
応させた。その後、切片を、１μg/mLのビオチン化抗ヤ
ギＩｇＧ抗体〔affinity purified ，ベクターラボラト
リーズ(Vevtor Laboratories) 製，ＣＡ〕で１時間イン
キュベートして、アビジン−ビオチン・パラオキシダー
ゼ複合体（ＡＢＣ）法により、ＡＢＣ染色キット〔ＡＢ
Ｃ kit，ベクターラボラトリーズ(Vevtor Laboratorie
s) 製，ＣＡ〕の説明書きに従って、免疫染色を行っ
た。

【００６０】コントロールを得るために、上記の抗ＬＩ
Ｆ抗体を過剰（モル比で１０倍）の組換えヒトＬＩＦ抗
体で、１時間室温でインキュベートした。この飽和した
抗体を、免疫染色における一次抗体として用いた。

【００６１】吸光度の検討 約５０切片を選択して、これらの各々について検討を行
った。これらの切片のイメージは、Scan Jet 4c(ヒュー
レット・パッカード社）を用いてスキャンし、Adobe Ph
otoshop software version 4.0J.A densitomeric analy
sis を、KS100イメージソフトウエアversion 2.0 を用
いて行った。ＬＩＦの総量は、各々の切片におけるＬＩ
Ｆの免疫染色の陽性領域の範囲を定め、灰色レベルの領
域を特定し、これらの領域を解析用に区分して求めた。
その後、陽性領域は、イメージ分析プログラムにより、
計測され、算出された。統合された吸光度（ＩＯＤ）
が、用いられたパラメーターである。各々の患者におけ
るＬＩＦ量は、全ての異なる計測値の総和により評価し
た。全ての切片は、皮膚検体を提供した患者の病歴と状
態についての情報を知らない、２人の別々の病理学者が
解析した。

【００６２】 の結果 ＬＩＦの免疫染色の結果については、第３図に示し、そ
の量的なデータは第４図に示した。

【００６３】ＬＩＦの発現は、疾病コントロールでは極
めて弱いが、ＡＬＳ患者では著しく高くなっていた（第
３図−１ Ａ：ＡＬＳ患者，Ｂ：疾病コントロール）。
また、ＬＩＦの免疫染色には、細胞質が反応し、主に、
表皮と毛包がよく染まったが、真皮は染まらなかった。
表皮の下部層は、上部層と比べると、染色は弱かった
（第３図−１ Ａ）。なお、特異的な染色は、一次抗体
がＬＩＦで吸収した抗体に置換されると認められなかっ
た（データに示さず）。対照的に、褥瘡が認められるＡ
ＬＳ患者における、皮膚のＬＩＦの免疫染色は、とても
弱いものであった。これは、他のＡＬＳ患者とは全く異
なる反面、コントロールと近似していた（第３図−２
Ｃ）。

【００６４】ＡＬＳにおける免疫染色度は、疾病コント
ロールと比べると、顕著に高かった（第４図Ａ）。さら
に、ＡＬＳにおけるＬＩＦの免疫染色を示すＩＯＤは、
病気が進展するにつれて、連続的に増加した。正の相関
は、極めて顕著であった。その反面、疾病コントロール
は、そのような相関は認められなかった（第４図Ｂ）。
ＬＩＦの発現量と、ＡＬＳやその他の疾病の進展とは関
係は認められなかった。

【００６５】表皮の厚さの計測 ヘマトキシン・エオシン染色によるパラフィン切片は、
サンプルの背景については知らない、２名の別々の病理
学者により解析された。各々の切片における３０箇所の
ランダムに選択された位置の、皮膚表層から表皮層の基
底膜までの最短距離が、Zeiss MOPIIIデジタルアナライ
ザーにより計測された。

【００６６】表皮の細胞密度の計測 ケラチノサイト数を求めるために、各々の被検者に由来
する５つのヘマトキシリン・エオシン染色された６μm
の厚さの切片について検討を行った。表皮の内部のケラ
チノサイトは、標品のバックグラウンドについては知ら
ない２人の病理学者によって、接眼マイクロメーターで
１００倍に拡大してカウントされた。表皮の領域は、Ze
iss MOPIIIデジタルアナライザーにより計測された。表
皮におけるケラチノサイトの細胞密度は、表皮１mm四方
毎の全ケラチノサイト数で表した。

【００６７】 の結果 疾病コントロールとの比較において、顕著な表皮の増生
が、ＡＬＳ患者の皮膚において認められた（第５図−１
Ａ：ＡＬＳ患者，Ｂ：疾病コントロール）。しかしな
がら、このような表皮の増生は、褥瘡が認められるＡＬ
Ｓ患者には認められなかった（第５図−２ Ｃ：褥瘡が
認められるＡＬＳ患者）。

【００６８】ＡＬＳ患者の表皮の厚さも細胞密度も、疾
病コントロールよりも大きかった（第６図ＡＢ：ＡＬＳ
患者と疾病コントロールとの比較）。また、ＡＬＳ患者
と疾病コントロールのこれらの差異は顕著なものであっ
た。ＡＬＳが進展するに伴って、表皮の増生が連続的に
増加した（第６図ＣＤ：病歴の進展度に係わる比較）。
ＡＬＳの罹患期間と表皮の増生との正の相関、さらには
同じく細胞密度との正の相関は、非常に顕著であった。
このような相関は、疾病コントロールには認められなか
った。

【００６９】また、表皮の増生とＬＩＦの発現の間の正
の相関は顕著であった。第７図に示すように、表皮の厚
さがＡＬＳ患者におけるＬＩＦの免疫反応性の増加と高
度に相関していた。一方、このような相関は、疾病コン
トロールには認められなかった。

【００７０】これらの結果により、ＬＩＦが、褥瘡に対
して有効であり、本発明皮膚外用剤を、特に、褥瘡治療
剤として用いることの有用性が明らかになった。 〔製剤例〕 ＬＩＦ配合マクロゴール軟膏の調製 マクロゴール１０００及びマクロゴール４００を、各５
００g ，全量１０００g をとり、水浴上６５℃に加温し
て溶かした後、固まるまでよくかき混ぜて、基剤とし
た。これとは別に、ＬＩＦ１g を１０mlの滅菌水に溶か
し、前記の基剤と練り合わせて、所望する軟膏を得た。

【００７１】

【発明の効果】本発明により、外傷から褥瘡等の潰瘍を
伴う皮膚疾患に対して治療効果が認められる皮膚外用剤
が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＬＩＦにおける用量依存的なケラチノサイトの
増殖促進効果について検討した結果を示す図面である。

【図２】ＬＩＦの皮膚の器官培養に対する影響を示す、
ケラチンの免疫染色像（２００倍）を示した図面であ
る。

【図３】ＡＬＳ患者等の皮膚におけるＬＩＦの免疫染色
像（８５倍）を示した図面の一部である。

【図４】ＡＬＳ患者等の皮膚におけるＬＩＦの免疫染色
像（８５倍）を示した図面の一部である。

【図５】ＡＬＳ患者等の皮膚におけるＬＩＦの免疫染色
における吸光度とＡＬＳ等の病歴との関係を示した図面
である。

【図６】ＡＬＳ患者等の皮膚切片のヘマトキシリン・エ
オシン染色像（１２５倍）を示した図面の一部である。

【図７】ＡＬＳ患者等の皮膚切片のヘマトキシリン・エ
オシン染色像（１２５倍）を示した図面の一部である。

【図８】ＡＬＳ患者における表皮の厚さ、ケラチノサイ
トの密度及びそれらのＡＬＳ等の病歴との相関関係を検
討した結果を示す図面である。

【図９】ＡＬＳ患者におけるＬＩＦ免疫染色（吸光度）
と表皮の厚さの相関関係を検討した結果を示す図面であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 片山 博幸 埼玉県川越市的場1361−１ 株式会社ビ ー・エム・エル総合研究所内 (72)発明者 会津 善紀 埼玉県川越市的場1361−１ 株式会社ビ ー・エム・エル総合研究所内 (72)発明者 中川 八郎 埼玉県川越市的場1361−１ 株式会社ビ ー・エム・エル総合研究所内 (72)発明者 増田 香奈子 富山県富山市本郷町５区158−３ Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA03 AA17 BA50 CA56 CA59 DA01 DA27 MA63 NA14 ZA891 4H045 AA30 CA42 DA01 EA20 FA74 GA10 GA21 GA30 HA05

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】白血病阻害因子を有効成分とする皮膚外用
   剤。
2. 【請求項２】皮膚外用剤が褥瘡治療剤である、請求項１
   又は２記載の皮膚外用剤。
3. 【請求項３】皮膚外用剤が創傷治療剤である、請求項１
   又は２記載の皮膚外用剤。