JP2001083144A - Process for treating blood and composition - Google Patents
Process for treating blood and compositionInfo
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、キレート剤、キレート
能を有しない抗血液凝固剤、および水溶性媒体中で2価
陽イオンを溶出しうる金属塩により血液を処理すること
で、血液細胞を分離することなく、血液細胞反応の決定
を再現性良く行うことができる血液の処理方法及び処理
用組成物を提供するものである。The present invention relates to a method for treating blood cells by treating blood with a chelating agent, an anticoagulant having no chelating ability, and a metal salt capable of eluting divalent cations in an aqueous medium. The present invention provides a blood processing method and a blood processing composition that can determine a blood cell reaction with good reproducibility without separating the blood.
【0002】[0002]
【従来の技術】血液中に含まれる血球として知られてい
るのは、赤血球、好塩基球、好中球、好酸球、リンパ
球、単球などであり、これらの細胞は、生体に必要な酸
素の運搬及び免疫反応や炎症反応などの生体の防御反応
に携わることが良く知られている。2. Description of the Related Art Blood cells contained in blood are known to be erythrocytes, basophils, neutrophils, eosinophils, lymphocytes, monocytes, etc. These cells are necessary for living organisms. It is well known that they are involved in the transport of various oxygen and defense reactions of the living body such as the immune response and the inflammatory response.
【0003】免疫反応や炎症反応は、血球それ自身の貧
食作用に代表される細胞自身による外敵や組織への直接
の細胞反応や血球が保有していたメディエーターを放出
する反応を通じ、そのメディエーターがその他の細胞ま
たは、組織に作用することにより行われることが知られ
ている。これら血液中の細胞(血球)から放出されるメ
ディエーターとして、インターロイキン類、例えば、イ
ンターロイキン1(IL−1)、インターロイキン2
(IL−2)、インターロイキン3(IL−3)、イン
ターロイキン4(IL−4)、インターロイキン5(I
L−5)、インターロイキン6(IL−6)、インター
ロイキン7(IL−7)、インターロイキン8(IL−
8)、インターロイキン9(IL−9)、インターロイ
キン10(IL−10)、インターロイキン13(IL
−13)、インターフェロン−α(IFN−α)、イン
ターフェロン−β(IFN−β)、インターフェロン−
γ(IFN−γ)、腫瘍懐死因子(TNF−α、TNF
−β)を始めとするサイトカイン類や、ヒスタミン、ロ
イコトリエン、platelet activatin
g factor(PAF)、major basic
protein(MBP)、eosinophil
cationic protein(ECP)、eos
inophil peroxidase(EPO)、c
harcot−leyden crystal (CL
C)等が知られている。これらメディエーターの血球か
らの放出は、時として過剰となり、気管支喘息、慢性関
節リウマチ、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、糖
尿病などの症状を引き起こすことが知られている。従っ
てこれらの物質量を決定することは、上記の疾患患者の
病態を調べることや、治療に用いる薬剤の選択、さら
に、疾患の基礎研究の分野において大変重要とされてい
る。[0003] The immune response and the inflammatory response are caused by the cell's own mediated phagocytosis, such as the phagocytosis of the blood cell itself, by the direct cell reaction to an enemy or tissue or the reaction of releasing the mediator held by the blood cell. It is known that it is performed by acting on other cells or tissues. As mediators released from cells (blood cells) in these blood, interleukins such as interleukin 1 (IL-1), interleukin 2
(IL-2), interleukin 3 (IL-3), interleukin 4 (IL-4), interleukin 5 (I
L-5), interleukin 6 (IL-6), interleukin 7 (IL-7), interleukin 8 (IL-
8), interleukin 9 (IL-9), interleukin 10 (IL-10), interleukin 13 (IL
-13), interferon-α (IFN-α), interferon-β (IFN-β), interferon-
γ (IFN-γ), tumor necrosis factor (TNF-α, TNF
-Β) and other cytokines, histamine, leukotriene, platelet activatin
g factor (PAF), major basic
protein (MBP), eosinophil
Caticic protein (ECP), eos
inophil peroxidase (EPO), c
harcot-leyden crystal (CL
C) and the like are known. It is known that the release of these mediators from blood cells is sometimes excessive and causes symptoms such as bronchial asthma, rheumatoid arthritis, allergic rhinitis, atopic dermatitis and diabetes. Therefore, determining the amounts of these substances is very important in the field of examining the pathology of patients with the above-mentioned diseases, selecting drugs to be used for the treatment, and further, basic research on the diseases.
【0004】これら、血液中のメディエーター量を測定
するための従来の問題点として、再現性がないこと、及
び、その操作が簡便でないことが挙げられる。血液中の
メディエーターは、その量が極めて微量であるうえ、血
液中に存在する多量多雑なタンパク、または、血球成分
が測定の精度に悪影響を及ぼすことが知られており、こ
れを回避するためにメディエーターと、その他のタンパ
ク、血球成分を分離して測定する操作を数段階にわたっ
て必要としていた。メディエーターのなかで、ヒスタミ
ン、ロイコトリエンを例として血球からのメディエータ
ーを遊離させる方法を説明すると、血液から白血球を分
離して測定する方法として、特許公開番号特開平6−2
05695が挙げられる。試験管に被検者からEDTA
採血した血液と磁石粒子に固着化した抗好塩基球モノク
ローナル抗体を加え室温で5分間反応を行わせ、好塩基
球を血液から分離する。磁性粒子をアビジン固層化マイ
クロプレートに移し、アレルギーの特異抗原をマイクロ
プレートのウエル内に分注し、好塩基球からヒスタミン
を遊離させる。そのヒスタミンの定量方法として、反応
液にビオチン標識ヒスタミン、酵素標識抗ヒスタミン抗
体を加え、洗浄後、アビジン固層化抗体に結合した、ビ
オチン標識ヒスタミン−酵素標識抗ヒスタミン抗体複合
体の酵素活性を求めヒスタミン量を測定する方法が開示
されている。[0004] These conventional problems for measuring the amount of mediator in the blood include lack of reproducibility and an inconvenient operation. Mediators in blood are extremely small in amount, and it is known that abundant and complex proteins or blood cell components present in blood adversely affect the accuracy of measurement. In several steps, an operation of separating and measuring a mediator, other proteins, and blood cell components was required. Among the mediators, histamine and leukotriene are used as examples to explain the method of releasing a mediator from blood cells. The method for separating and measuring leukocytes from blood is described in Patent Publication No. 6-2.
05695. EDTA from subject to test tube
The collected blood and an antibasophil monoclonal antibody immobilized on magnetic particles are added, and the reaction is carried out at room temperature for 5 minutes to separate basophils from the blood. The magnetic particles are transferred to an avidin-immobilized microplate, and allergic specific antigen is dispensed into the wells of the microplate to release histamine from basophils. As a method for quantifying histamine, biotin-labeled histamine and enzyme-labeled antihistamine antibody were added to the reaction solution, and after washing, the enzyme activity of the biotin-labeled histamine-enzyme-labeled antihistamine antibody complex bound to the avidin-immobilized antibody was determined. A method for measuring the amount of histamine is disclosed.
【0005】また、別な方法としては、血液から白血球
を分離して測定するために、EDTA添加条件で採血を
行い、4%デキストランを加え赤血球を沈殿させ、白血
球浮遊液を分離し、遠心を行い、タイロイド反応液(1
24mM NaCl、4mMKCl、0.64mM N
aH2 PO4、1mM CaCl2、0.6mM MgCl
2、10mM HEPESおよび0.03%ヒト血清アル
ブミン)に浮遊させ、遠心、浮遊を繰り返し行い、白血
球の洗浄を行う。その浮遊液に、アレルギーの特異抗原
液を加え反応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離さ
せる。反応後遠心し、上清を採取し、上清中のヒスタミ
ン遊離量を蛍光法、RIA法、HPLC法にて測定を行
う方法がよく知られている。As another method, in order to separate and measure leukocytes from blood, blood is collected under EDTA-added conditions, red blood cells are precipitated by adding 4% dextran, leukocyte suspension is separated, and centrifugation is performed. Perform tyroid reaction (1
24 mM NaCl, 4 mM KCl, 0.64 mM N
aH 2 PO 4 , 1 mM CaCl 2 , 0.6 mM MgCl
2 , 10 mM HEPES and 0.03% human serum albumin), centrifugation and suspension are repeated, and the leukocytes are washed. An allergic specific antigen solution is added to the suspension to cause a reaction, thereby releasing histamine from basophils. It is well known that after the reaction, centrifugation is performed, the supernatant is collected, and the amount of histamine released in the supernatant is measured by a fluorescence method, an RIA method, or an HPLC method.
【0006】また、別のメディエーターであるロイコト
リエンの測定方法では、血液から白血球を分離し、カル
シウムイオノフォアーを加え反応を行い、好塩基球から
ロイコトリエンを遊離させる。そして、プロスタグラン
ジンを含む氷冷アセトニトリル/メタノール/酢酸液を
加え反応を停止し、−20℃で1時間放置後、遠心を行
い、反応液中のロイコトリエン量をHPLCにて測定す
る方法が知られている。In another method for measuring leukotriene, which is a mediator, leukotriene is separated from blood, and a calcium ionophore is added to carry out a reaction to release leukotriene from basophils. Then, an ice-cooled acetonitrile / methanol / acetic acid solution containing prostaglandin is added to stop the reaction, left at -20 ° C for 1 hour, centrifuged, and the amount of leukotriene in the reaction solution is measured by HPLC. Have been.
【0007】このように、血球から放出されるメディエ
ーターであるロイコトリエンの測定方法において、ロイ
コトリエン自身の吸収特性として、280nm付近の吸
収を持っているにも関わらず、ロイコトリエンの血中濃
度が微量で有り、なおかつ、血中に含まれるタンパクも
280nm付近の吸収を持っているために全血中のロイ
コトリエン量を血液から標的細胞を分離することなく測
定することは不可能である。従って、血球から放出され
るロイコトリエン量を測定するためには、血中からの標
的細胞の分離操作が必要となる。As described above, in the method for measuring leukotriene, which is a mediator released from blood cells, the leukotriene has a very low blood concentration of leukotriene in spite of its absorption characteristic of about 280 nm. Further, since the protein contained in blood also has an absorption around 280 nm, it is impossible to measure the amount of leukotriene in whole blood without separating target cells from blood. Therefore, in order to measure the amount of leukotriene released from blood cells, an operation of separating target cells from blood is required.
【0008】以上の通り、血球から遊離するメディエー
ターを測定する方法のほとんどは、血液から血漿、血清
や標的細胞を分離する操作が必要である。これは、血液
中には、アルブミン、グロブリン、抗体などのタンパク
や、ナトリウム、カリウムなどの無機物、糖や脂質など
の有機物を含んでいるために、測定対象物を定量しよう
とする際に用いられる検出系である蛍光法や比色法や発
光法における、ブランク値上昇の要因や血中の夾雑物に
よって反応が阻害されることによる反応特異性(感度)
の低下が引き起こされる為である。このように、メディ
エーターの測定において、目的とするメディエーターと
他の血液成分を分離するために数段階にわたる分離操作
を必要とするのが一般的で、極めて複雑かつ煩雑な方法
であった。As described above, most methods for measuring a mediator released from blood cells require an operation for separating plasma, serum and target cells from blood. This is used when trying to quantify the measurement target because blood contains proteins such as albumin, globulin, antibodies, inorganic substances such as sodium and potassium, and organic substances such as sugars and lipids. Reaction specificity (sensitivity) due to factors such as an increase in the blank value and inhibition of the reaction by blood contaminants in the fluorescence, colorimetric, and luminescent methods that are detection systems
Is caused. As described above, in the measurement of a mediator, a separation operation in several steps is generally required to separate a target mediator from other blood components, which is an extremely complicated and complicated method.
【0009】また一方、血液と目的とするメディエータ
ーの分離をより簡便化させた方法として、特開平3−1
9948による全血を用いて血球からヒスタミンを遊離
させる方法が知られている。具体的には、ヘパリン採血
した血液25μlとアレルゲン溶液25μlをグラスフ
ァイバーを固定化したマイクロプレートに分注し、37
℃で90分反応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離
させる。ヒスタミンが吸着しているマイクロプレートを
洗浄後、蛍光法にて測定を行う方法が開示されている。
しかしながら、この方法では、血液成分と目的のメディ
エーターとの分離が不十分であるため、再現性が悪く、
診断に必要とする充分な感度が得られていない。On the other hand, as a method for further simplifying the separation of blood and a desired mediator, Japanese Patent Application Laid-Open No.
A method for releasing histamine from blood cells using whole blood according to 9948 is known. Specifically, 25 μl of heparin-collected blood and 25 μl of the allergen solution were dispensed into a glass plate-immobilized microplate, and
C. for 90 minutes to release histamine from basophils. A method is disclosed in which a microplate on which histamine is adsorbed is washed and then measured by a fluorescence method.
However, in this method, reproducibility is poor due to insufficient separation of blood components from the desired mediator,
Sufficient sensitivity required for diagnosis has not been obtained.
【0010】以上の通り、細胞反応の決定を再現性良く
行う際には、目的とする物質とそれ以外の成分を分離し
なければならず、被検者から採血した際に、採血管1本
1本を遠心し血球を沈降させることによる分離操作や、
遠心によって得られた血漿及び血清の他容器への分注操
作、あるいは、血球特異的抗体を用いた血液から血球の
分離作業が必要とされるなど、操作上大変な手間がかか
るとともに測定者の作業時間が伸び、それに伴う、コス
トをあげる要因ともなっていた。As described above, when a cell reaction is determined with good reproducibility, a target substance and other components must be separated, and when blood is collected from a subject, one blood collection tube is used. Separation operation by centrifuging one and sedimenting blood cells,
Dispensing operations of the plasma and serum obtained by centrifugation into other containers, or the work of separating blood cells from blood using blood cell-specific antibodies are required. The work time was increased, and the cost was increased accordingly.
【0011】また、例え、血液成分と目的物質との分離
操作を簡略化させた方法があったとしても、血液中の成
分の影響により、再現性が悪く、データのバラツキか
ら、その結果と患者の病態とは異なる結果が得られるこ
とがあるため、これら細胞反応の決定方法として、血液
成分と目的物質の分離ステップを簡略化しうる、簡便か
つ再現性の良い血液処理方法が望まれていた。Further, even if there is a method for simplifying the operation of separating a blood component from a target substance, the reproducibility is poor due to the influence of components in blood, and the results and patient Since a result different from the above-mentioned pathological condition may be obtained, a simple and highly reproducible blood processing method capable of simplifying a step of separating a blood component and a target substance has been desired as a method for determining these cell reactions.
【0012】[0012]
【発明が解決しようとする課題】細胞反応の決定方法と
して、簡便かつ再現性の良い血液処理方法を樹立できれ
ば、正確な測定値が得られ、結果として、被検者の病態
を正しく反映するとともに、異常値に対する再検査の必
要も無くなる。また、測定操作の簡便化ができ、検査セ
ンターなどの実施者のコストも大幅に改善できる。この
ように、再現性向上と簡便化は、この分野の検査を進め
ていくうえでの必然の要求である。従って、本発明の目
的は、血液中の細胞反応の決定方法において、再現性が
良く、簡便化が可能となる血液の処理方法及びその処理
用組成物を提供することを目的とする。If a simple and reproducible blood processing method can be established as a method for determining a cell reaction, accurate measurement values can be obtained, and as a result, the pathology of the subject can be accurately reflected. In addition, there is no need to re-examine abnormal values. In addition, the measurement operation can be simplified, and the cost of a practitioner such as an inspection center can be greatly improved. As described above, improvement in reproducibility and simplification are indispensable requirements in proceeding with inspection in this field. Accordingly, an object of the present invention is to provide a blood processing method and a processing composition thereof, which have high reproducibility and can be simplified in a method for determining a cellular reaction in blood.
【0013】[0013]
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記問題に
対して、鋭意研究を行った結果、血液に、キレート剤、
キレート能を有しない抗血液凝固剤、及び水溶性媒体中
で2価金属イオンを溶出しうる金属塩を添加すること
で、前記課題を解決しうることを見出し本発明に至っ
た。Means for Solving the Problems The present inventor has conducted intensive studies on the above problems, and as a result, found that a chelating agent,
The present inventors have found that the above problem can be solved by adding an anticoagulant having no chelating ability and a metal salt capable of eluting a divalent metal ion in an aqueous medium, and have accomplished the present invention.
【0014】即ち、本発明は、血液に、キレート剤、キ
レート能を有しない抗血液凝固剤、及び水溶性媒体中で
2価陽イオンを溶出しうる金属塩を添加することを特徴
とする、細胞反応のための血液処理方法、及び処理用組
成物を提供する。本発明で用いられる血液とは、全血を
生理的塩類溶液にて1〜10倍希釈した血液で有ればよ
いが、好ましくは全血が望ましい。That is, the present invention is characterized in that a chelating agent, an anticoagulant having no chelating ability, and a metal salt capable of eluting a divalent cation in an aqueous medium are added to blood. Provided are a blood treatment method and a treatment composition for a cell reaction. The blood used in the present invention may be blood obtained by diluting whole blood with a physiological salt solution 1 to 10 times, and preferably whole blood.
【0015】本発明におけるキレート剤とは、水溶液中
の2価金属イオンと結合する能力を持つ物質で、血液中
にモル濃度比として、キレート剤1分子に対して2〜1
0倍分子のカルシウムが存在する場合に、室温条件下で
1時間以内に血液凝固が起こる物質である。例として
は、EDTA、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテ
ル、ニトリロ三酢酸、などが挙げられるが、好ましく
は、市販されている採血管に含まれているEDTA−2
Na、EDTA−2Kが好ましく、さらに好ましくは、
EDTA−2Naが好ましい。その血液細胞反応時の濃
度は、1〜50mMであれば良く、好ましくは1.5〜
14mM、より好ましくは2〜3.5mMが好ましい。The chelating agent in the present invention is a substance capable of binding to a divalent metal ion in an aqueous solution, and has a molar concentration ratio of 2 to 1 per molecule of the chelating agent in blood.
It is a substance that causes blood coagulation within 1 hour under room temperature conditions when 0-fold molecular calcium is present. Examples include EDTA, citric acid, oxalic acid, crown ether, nitrilotriacetic acid, and the like, but preferably EDTA-2 contained in a commercially available blood collection tube.
Na and EDTA-2K are preferred, and more preferably,
EDTA-2Na is preferred. The concentration at the time of the blood cell reaction may be 1 to 50 mM, preferably 1.5 to 50 mM.
14 mM, more preferably 2-3.5 mM, is preferred.
【0016】本発明におけるキレート能を有しない抗血
液凝固剤とは、血液中に1〜10mMのカルシウムの存
在下、または非存在下において、血液凝固が起こらない
抗凝固剤のことであり、例えば、2mMのカルシウムの
存在下、室温で1時間以内に血液凝固が起こらない抗血
液凝固剤である。抗血液凝固剤の例としては、ヘパリ
ン、プラスミン、ヒルジン、アンチトロンビンIII、
トロンボモジュリン、プロスタグランジン、Chica
go blue、Germanin、血液凝固因子に対
する抗体、血液凝固因子に対するレセプター等が挙げら
れる。血液凝固因子としては、第VIII因子、第VI
I因子、第IX因子、第X因子、第XI因子、第XII
因子、第XIII因子などが有り、それに対する抗体ま
たはレセプターなら何でも良い。これら抗血液凝固剤と
して、好ましくはヘパリンナトリウム、ヘパリンリチウ
ムなどが挙げられるが、さらに好ましくは、ヘパリンナ
トリウムが挙げられる。その血液細胞反応時の濃度は、
1〜50U/ ml、好ましくは5〜30U/ mlが望ま
しい。ここで、1Uとは、日本薬局方に定められた1単
位と同等量とする。The anticoagulant having no chelating ability in the present invention is an anticoagulant that does not cause blood coagulation in the presence or absence of 1 to 10 mM calcium in blood. An anticoagulant that does not coagulate within 1 hour at room temperature in the presence of 2 mM calcium. Examples of anticoagulants include heparin, plasmin, hirudin, antithrombin III,
Thrombomodulin, prostaglandin, Chica
Go blue, Germanin, antibodies to blood coagulation factors, receptors for blood coagulation factors, and the like. Blood coagulation factors include factor VIII and VI
Factor I, Factor IX, Factor X, Factor XI, XII
There is a factor, factor XIII, etc., and any antibody or receptor against it may be used. These anticoagulants preferably include sodium heparin, lithium heparin and the like, and more preferably sodium heparin. The concentration during the blood cell reaction is
1 to 50 U / ml, preferably 5 to 30 U / ml is desirable. Here, 1U is equivalent to 1 unit defined by the Japanese Pharmacopoeia.
【0017】また、本発明における2価陽イオンとは、
カルシウムイオン(Ca2+)、マグネシウムイオン(M
g2+)、マンガンイオン(Mn2+)、亜鉛イオン(Zn
2+)、カドミウムイオン(Cd2+)、及び銅イオン(C
u2+)等が挙げられるが、好ましくはカルシウムイオ
ン、あるいは、マグネシウムイオンが好ましい。水溶液
中で2価陽イオンを生じさせうる金属塩としては、塩化
物、硫酸塩、炭酸塩、硝酸塩、リン酸塩等が挙げられ
る。例えば、CaCl2、MgCl2、MnCl2、Zn
Cl2、CdCl2、CuCl2、CaSO4 、MgS
O4、MnSO4、ZnSO4、CdSO4、CuSO4、
Ca(NO3)2、Mg(NO3)2、Mn(NO3)2、Z
n(NO3)2、Cd(NO3)2、Cu(NO3)2、Ca
CO3 、MnCO3、CdCO3 、CaHPO4、MgH
PO4、Zn3(PO4)2等が挙げられるが、好ましく
は、CaCl2、MgCl2が望ましい。その血液細胞反
応時の濃度は、1〜200mMが望ましく、キレート剤
とのモル濃度比は、キレート剤1分子に対して金属塩が
1〜200倍が良く、好ましくはキレート剤1分子に対
して1〜50倍が望ましい。In the present invention, the divalent cation is:
Calcium ion (Ca 2+ ), magnesium ion (M
g 2+ ), manganese ion (Mn 2+ ), zinc ion (Zn
2+ ), cadmium ion (Cd 2+ ), and copper ion (C
u 2+ ) and the like, and preferably a calcium ion or a magnesium ion. Examples of metal salts capable of generating divalent cations in an aqueous solution include chlorides, sulfates, carbonates, nitrates, and phosphates. For example, CaCl 2 , MgCl 2 , MnCl 2 , Zn
Cl 2 , CdCl 2 , CuCl 2 , CaSO 4 , MgS
O 4 , MnSO 4 , ZnSO 4 , CdSO 4 , CuSO 4 ,
Ca (NO 3 ) 2 , Mg (NO 3 ) 2 , Mn (NO 3 ) 2 , Z
n (NO 3 ) 2 , Cd (NO 3 ) 2 , Cu (NO 3 ) 2 , Ca
CO 3 , MnCO 3 , CdCO 3 , CaHPO 4 , MgH
PO 4 , Zn 3 (PO 4 ) 2 and the like can be mentioned, but CaCl 2 and MgCl 2 are preferable. The concentration at the time of the blood cell reaction is desirably 1 to 200 mM, and the molar concentration ratio with the chelating agent is 1 to 200 times the ratio of the metal salt to 1 molecule of the chelating agent, preferably 1 molecule of the chelating agent. 1 to 50 times is desirable.
【0018】本発明で用いられる細胞反応とは、細胞上
のタンパク発現反応、細胞からのタンパク等の有機化合
物放出反応であり、細胞に何らかの刺激を与えた時、ま
たは、何ら刺激を与えていない状態で、細胞の代謝の中
で放出されたものであっても構わない。ここで言う細胞
の刺激とは、外部から物質を添加し、細胞上の物質との
結合、あるいは細胞内への浸透により、細胞内の情報伝
達系を活性化することである。情報伝達系としては、タ
ンパク質のリン酸化やプロテアーゼ活性化、または、イ
ノシトール3リン酸による細胞内カルシウム濃度上昇作
用があげられる。細胞に何らかの刺激を与えた時の例と
しては、好塩基球からのヒスタミンやロイコトリエンの
放出において、好塩基球上のFcεRIレセプターに結
合したアレルギー特異的IgE抗体の2分子とアレルゲ
ンが結合し、アレルギー特異的IgE抗体を架橋するこ
とにより、細胞内の情報伝達系であるリン酸化酵素が活
性化され、細胞内へのカルシウム流入を引き起こし、ヒ
スタミンなどのメディエーターが放出される例が挙げら
れる。The cell reaction used in the present invention is a reaction for expressing a protein on a cell or a reaction for releasing an organic compound such as a protein from a cell, and is given when a cell is stimulated or when it is not stimulated at all. In the state, it may be released in the metabolism of the cell. The term "stimulation of a cell" as used herein means to activate a signal transduction system in a cell by adding a substance from the outside and binding to a substance on the cell or penetrating into the cell. Examples of the signal transduction system include protein phosphorylation and protease activation, and the action of increasing the intracellular calcium concentration by inositol triphosphate. As an example of the case where some stimulus is given to cells, in the release of histamine and leukotriene from basophils, allergen binds to two molecules of allergy-specific IgE antibody bound to FcεRI receptor on basophils, Cross-linking of a specific IgE antibody activates a phosphorylase, which is an intracellular signal transduction system, causing calcium influx into cells and releasing mediators such as histamine.
【0019】また、刺激されていない状態で放出される
例としては、好塩基球からのインターロイキン4、イン
ターロイキン8の放出が挙げられる。そして、放出され
る有機化合物としては、血液細胞から放出されたメディ
エーターが挙げられる。メディエーターとしては、好塩
基球からのヒスタミン、ロイコトリエン、インターロイ
キン類、platelet activating f
actor(PAF)、好酸球からのMajor ba
sic protein(MBP)、Eosinoph
ile cationic protein(EC
P)、Eosinophil−derivered n
eurotoxin(EDN),Eosinophil
peroxidase(EPO)、Charcot−
beydencrystal(CLC)、トロンボキサ
ンなどが挙げられるが、好ましくは、好塩基球から遊離
されるヒスタミン、ロイコトリエン、PAF、インター
ロイキンが望ましい。An example of release in a non-stimulated state is release of interleukin 4 and interleukin 8 from basophils. And the released organic compound includes a mediator released from blood cells. Mediators include histamine, leukotriene, interleukins, and platelet activating f from basophils.
actor (PAF), Major ba from eosinophils
sic protein (MBP), Eosinoph
ile caticic protein (EC
P), Eosinophil-derived n
eurotoxin (EDN), Eosinophil
peroxidase (EPO), Charcot-
beydencrystal (CLC), thromboxane, etc., and histamine, leukotriene, PAF, and interleukin, which are preferably released from basophils, are preferred.
【0020】血液の処理方法としては、3つの組成物す
なわち、キレート剤、キレート能を有しない抗血液凝固
剤、水溶性媒体中で2価陽イオンを溶出しうる金属塩を
添加する順序は問わず、いずれの順序で添加しても、再
現性良く細胞反応を決定することを可能にするものであ
る。例えば、採血時にキレート剤のみを添加しておき、
細胞反応時にキレート能を有しない抗血液凝固剤、及び
水溶性媒体中で2価陽イオンを溶出しうる金属塩を加え
ても良いし、採血時にキレート能を有しない抗血液凝固
剤を添加しておき、細胞反応時にキレート剤、及び水溶
性媒体中で2価陽イオンを溶出しうる金属塩を加えても
良い。また、採血時にキレート剤、キレート能を有しな
い抗血液凝固剤、水溶性媒体中で2価陽イオンを溶出し
うる金属塩のすべてを添加し、これを用いて細胞反応を
行っても良い。Regarding the method for treating blood, the order of adding the three compositions, namely, a chelating agent, an anticoagulant having no chelating ability, and a metal salt capable of eluting a divalent cation in an aqueous medium is not limited. In any case, the cell reaction can be determined with good reproducibility regardless of the order of addition. For example, at the time of blood collection, only the chelating agent is added,
An anticoagulant having no chelating ability at the time of cell reaction and a metal salt capable of eluting divalent cations in an aqueous medium may be added, or an anticoagulant having no chelating ability at the time of blood collection may be added. In addition, a chelating agent and a metal salt capable of eluting a divalent cation in a water-soluble medium during a cell reaction may be added. In addition, a chelating agent, an anticoagulant having no chelating ability, and a metal salt capable of eluting a divalent cation in an aqueous medium may be added at the time of blood collection, and a cell reaction may be performed using the metal salt.
【0021】この時のキレート剤、キレート能を有しな
い抗血液凝固剤、水溶性媒体中で2価陽イオンを溶出し
うる金属塩の添加方法としては、粉末であっても、適当
な緩衝液中に溶解されていても良い。適当な緩衝液と
は、Pipes緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、G
ood緩衝液などで、細胞の安定化のための至適なpH
に調整されていることが好ましく、その範囲は5〜1
0、好ましくは6〜9に調整されることが望ましい。ま
た、必要に応じて塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩
化カリウム、酢酸カリウムの塩や防腐剤としてアジ化ナ
トリウムを加えても良い。At this time, the method of adding the chelating agent, the anticoagulant having no chelating ability, and the metal salt capable of eluting divalent cations in an aqueous medium may be either a powder or an appropriate buffer. It may be dissolved therein. Suitable buffers include Pipes buffer, phosphate buffer, acetate buffer, G
Optimum pH for cell stabilization with wood buffer etc.
Is preferably adjusted to a range of 5-1.
It is desirably adjusted to 0, preferably 6 to 9. If necessary, sodium chloride, sodium acetate, potassium chloride, potassium acetate and sodium azide as a preservative may be added.
【0022】添加する際の容器の材質に関しては、ポリ
スチレン、ポリプロピレン、テフロン、ポリエチレン、
メチルベンテン樹脂(TPX)、フッ素樹脂、アクリル
樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、塩化ビニル樹
脂等のプラスティック、ステンレス、チタン等の金属、
ガラス及びゴム等何でも用いることができる。容器の色
に関しては、透明、半透明、褐色等何でも用いることが
できる。With respect to the material of the container at the time of addition, polystyrene, polypropylene, Teflon, polyethylene,
Plastics such as methylbenthene resin (TPX), fluororesin, acrylic resin, polycarbonate, polyurethane, and vinyl chloride resin; metals such as stainless steel and titanium;
Anything such as glass and rubber can be used. Regarding the color of the container, any material such as transparent, translucent, and brown can be used.
【0023】具体的な方法として、抗血液凝固剤として
ヘパリンを添加した血液に、キレート剤であるEDTA
及び金属塩として塩化カルシウムを添加し、この組成液
に被験者において疑われるアレルゲンを添加し、血液細
胞からヒスタミン等のメディエーターを放出させる。そ
して、その放出されたヒスタミン等を既知の測定法にて
直接測定するだけで良い。As a specific method, a chelating agent EDTA is added to blood to which heparin is added as an anticoagulant.
Then, calcium chloride is added as a metal salt, and a suspected allergen in the subject is added to the composition to release a mediator such as histamine from blood cells. Then, the released histamine and the like need only be directly measured by a known measuring method.
【0024】ここで言う、アレルゲンとは、アレルギー
反応を引き起こす原因物質であり、特異的IgE抗体量
測定試薬として市販されているアレルゲンやアレルゲン
抽出物として市販されているものなど通常検査で用いら
れているアレルゲンであれば何でも良い。例えば、ス
ギ、カモガヤなどの花粉や、牛乳、卵白などの食物、菌
類などが挙げられる。The allergen referred to herein is a substance that causes an allergic reaction, and is used in ordinary tests such as an allergen that is commercially available as a reagent for measuring the amount of specific IgE antibody and an allergen that is commercially available as an allergen extract. Any allergens are acceptable. For example, pollen such as cedar and duckweed, food such as milk and egg white, fungi and the like can be mentioned.
【0025】別の使用例においては、キレート剤である
EDTAを用い、EDTA採血された血液に、抗凝固剤
であるヘパリン及び、金属塩として2価の重金属を添加
する。そして、この組成液に上述のごとく、アレルゲン
を添加し、血液細胞からメディエーターを放出させ、こ
れを既知の測定法で測定すれば良い。さらに、別の例で
は、被検者から採血し、その血液にキレート剤であるE
DTA、抗凝固剤であるヘパリン及び、金属塩として2
価の重金属を添加し、この組成液に上述のごとく、アレ
ルゲンを添加し、血液細胞からメディエーターを放出さ
せ、これを既知の測定法で測定すれば良い。In another usage example, EDTA as a chelating agent is used, and heparin as an anticoagulant and a divalent heavy metal as a metal salt are added to blood collected from EDTA. Then, as described above, the allergen may be added to this composition solution to release the mediator from the blood cells, which may be measured by a known measuring method. Further, in another example, blood is collected from a subject and the blood contains the chelating agent E.
DTA, heparin as an anticoagulant, and 2 as a metal salt
As described above, an allergen may be added to this composition solution, a mediator may be released from blood cells, and this may be measured by a known measurement method.
【0026】決定方法とは、細胞反応によって放出され
た有機化合物の量を定量する方法や目視などにより確認
する方法である。有機化合物量を定量する方法には、支
持体に固着させた担体に目的とする有機化合物を補足さ
せ、検出系により測定する方法や有機化合物をカラムに
より分離した後に検出系によって測定する方法が挙げら
れる。目視により確認する方法とは、細胞反応後の血球
の状態を目視により確認する方法である。決定方法とし
て好ましくは、有機化合物を定量する方法が望ましく、
より好ましくは、支持体に固着させた担体に有機化合物
を補足させる方法が望ましく、さらに好ましくは、有機
化合物に特異的な吸着体を用いて測定する方法が望まし
い。The determination method is a method for quantifying the amount of the organic compound released by the cell reaction, or a method for confirming the amount visually. Methods for quantifying the amount of an organic compound include a method in which a target organic compound is captured on a carrier fixed to a support and measured by a detection system, and a method in which an organic compound is separated by a column and then measured by a detection system. Can be The method of visually confirming is a method of visually confirming the state of blood cells after a cell reaction. Preferably, the determination method is a method of quantifying an organic compound,
More preferably, a method of trapping an organic compound on a carrier fixed to a support is desirable, and more preferably, a method of measuring using an adsorbent specific to the organic compound is desirable.
【0027】ここで言う支持体とは、血球からメディエ
ーターを遊離させる反応を行う容器であり、マイクロプ
レート、試験管、磁性ビーズなどが挙げられる。支持体
の材質に関しては、ポリスチレン、ポリプロピレン、テ
フロン、ポリエチレン、メチルベンテン樹脂(TP
X)、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、
ポリウレタン、塩化ビニル樹脂等のプラスティック、ス
テンレス、チタン等の金属、ガラス及びゴム等何でも用
いることができ、また、支持体の色に関しては、褐色、
透明、半透明など何でも良い。The term "support" as used herein refers to a container for performing a reaction for releasing a mediator from blood cells, and examples thereof include a microplate, a test tube, and magnetic beads. Regarding the material of the support, polystyrene, polypropylene, Teflon, polyethylene, methylbenthene resin (TP
X), fluorine resin, acrylic resin, polycarbonate,
Polyurethane, plastics such as vinyl chloride resin, metals such as stainless steel and titanium, glass and rubber can be used, and the color of the support is brown,
Anything such as transparent or translucent is acceptable.
【0028】また、固着させた担体とは、有機化合物に
対して特異的に吸着する物質のことであり、有機化合物
に対する抗体やレセプター、グラスファイバーなどが挙
げられる。検出系とは、有機化合物量を測定する方法で
あり、比色法、蛍光法、発光法、放射活性法などが挙げ
られ、EIA法やRIA法及び特異的に吸着する担体を
用いて測定する方法である。Further, the fixed carrier is a substance that specifically adsorbs to an organic compound, and examples thereof include an antibody against the organic compound, a receptor, and glass fiber. The detection system is a method for measuring the amount of an organic compound, which includes a colorimetric method, a fluorescent method, a luminescent method, a radioactive method, and the like, and is measured using an EIA method, an RIA method, and a specifically adsorbing carrier. Is the way.
【0029】ここで言うEIA法とは、メディエータに
対する抗体を支持体に固定化し、標識酵素の活性により
メディエーター量を測定する酵素免疫測定方法である。
例えば、EIA法を用いた細胞反応によって放出された
有機化合物の決定方法として、好塩基球から放出される
ヒスタミンの測定では、市販されているキットの方法に
よって測定できる。例えば次のように行う。被検者から
ヘパリン採血した血液とアレルギー特異的抗原溶液と反
応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離させる。遊離
したヒスタミンとアシル化試薬を反応させ、ヒスタミン
をアシル化する。次に、ヒスタミンの定量方法として、
抗アシル化ヒスタミン抗体を固層化したマイクロプレー
トにアシル化したヒスタミンと酵素標識したヒスタミン
を添加し反応を行い、標識酵素活性を測定することによ
って抗アシル化ヒスタミン抗体に結合した酵素標識ヒス
タミン量を求め、そこから、アシル化ヒスタミン量を求
める方法である。The EIA method referred to herein is an enzyme immunoassay in which an antibody against a mediator is immobilized on a support and the amount of the mediator is measured by the activity of a labeling enzyme.
For example, as a method for determining an organic compound released by a cell reaction using the EIA method, histamine released from basophils can be measured by a commercially available kit. For example, the following is performed. Heparin-collected blood from the subject is reacted with an allergy-specific antigen solution to release histamine from basophils. The released histamine is reacted with an acylating reagent to acylate histamine. Next, as a method for quantifying histamine,
The amount of enzyme-labeled histamine bound to the anti-acylated histamine antibody was measured by adding acylated histamine and enzyme-labeled histamine to a microplate on which anti-acylated histamine antibody was immobilized, and measuring the labeled enzyme activity. This is a method of obtaining the amount of acylated histamine from the obtained amount.
【0030】また、他のヒスタミン測定方法では、特開
平6−205695によると、血液10mlにHA−H
EPES緩衝液40mlを加え、血液を希釈した後、試
験管に500μlずつ分注し、これに、好塩基球と反応
するモノクローナル抗体を固着させた磁性粒子50μl
を加え、室温で5分間反応を行い、モノクローナル抗体
と好塩基球の結合反応を行う。続いて磁石でビーズを集
め上清を除いた後、緩衝液にて1回洗浄を行う。そし
て、磁性粒子をアビジン固層化マイクロプレートに移
し、アレルギー特異的抗原溶液と反応を行い、好塩基球
からヒスタミンを遊離させる。その時に、反応液にビオ
チン標識ヒスタミン、酵素標識抗ヒスタミン抗体を同時
に加えておく。洗浄後、アビジン固層化抗体に結合した
ビオチン標識ヒスタミン−酵素標識抗ヒスタミン抗体複
合体の酵素活性を求めヒスタミン量を測定する方法が開
示されている。In another method for measuring histamine, according to Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-205695, 10 ml of blood contains HA-H
After adding 40 ml of EPES buffer and diluting the blood, 500 μl was dispensed into a test tube, and 50 μl of magnetic particles on which a monoclonal antibody reacting with basophils was fixed.
And a reaction is carried out at room temperature for 5 minutes to carry out a binding reaction between the monoclonal antibody and basophils. Subsequently, after collecting the beads with a magnet and removing the supernatant, the beads are washed once with a buffer solution. Then, the magnetic particles are transferred to an avidin-immobilized microplate, and reacted with an allergy-specific antigen solution to release histamine from basophils. At that time, a biotin-labeled histamine and an enzyme-labeled antihistamine antibody are simultaneously added to the reaction solution. A method is disclosed in which after washing, the enzyme activity of a biotin-labeled histamine-enzyme-labeled antihistamine antibody complex bound to an avidin-immobilized antibody is determined and the amount of histamine is measured.
【0031】また、他の有機化合物であるロイコトリエ
ンは、市販されているキットの方法による抗ロイコトリ
エン抗体を用いたEIA法によって測定可能である。ま
た、他の血球から放出される有機化合物であるインター
ロイキン3は、市販されているキットの方法によって測
定できる。例えば、次のように行う。抗インターロイキ
ン3抗体を固層化したマイクロプレートに血漿又は血清
を添加し反応を行い、固層化抗体とインターロイキン3
を結合させる。反応液を洗浄後、酵素標識抗インターロ
イキン3抗体を加え、反応を行い、インターロイキン3
と酵素標識抗インターロイキン3を結合させる。そして
標識抗体の酵素活性を測定することによってインターロ
イキン3の量を測定する方法である。また、他のインタ
ーロイキンであるインターロイキン6では、特開平1−
271862よれば、抗−インターロイキン6モノクロ
ーナル抗体を固定化したマイクロプレートに血清を加
え、室温で2〜3時間放置し、固層化抗体とインターロ
イキン6を結合させる。反応液を除去後、洗浄を行った
後、ビオチン化抗インターロイキン6ポリクロナル抗体
を加え37℃1時間反応を行い、インターロイキン6と
ビオチン化抗体を結合させる。次に、酵素標識ストレプ
トアビジンを加え、37℃30分放置し、ビオチン化抗
体と酵素標識ストレプトアビジンを結合させ、反応液を
除去後、3回以上洗浄を行った後、定量系として、4−
メチルウンベリフェリル−β−D−ガラクトシドを加
え、遊離した4−メチルウンベリフェロンの蛍光強度を
測定する方法が開示されている。Leukotriene, which is another organic compound, can be measured by an EIA method using an anti-leukotriene antibody by a commercially available kit. Interleukin 3, an organic compound released from other blood cells, can be measured by a commercially available kit. For example, the following is performed. Plasma or serum is added to a microplate on which anti-interleukin 3 antibody is immobilized, and a reaction is performed.
To combine. After washing the reaction solution, an enzyme-labeled anti-interleukin-3 antibody was added and the reaction was performed.
And enzyme-labeled anti-interleukin-3. This is a method of measuring the amount of interleukin 3 by measuring the enzyme activity of the labeled antibody. Further, another interleukin, interleukin 6, is disclosed in
According to 271862, serum is added to the microplate on which the anti-interleukin 6 monoclonal antibody is immobilized, and left at room temperature for 2 to 3 hours to allow the immobilized antibody and interleukin 6 to bind. After removing the reaction solution and washing, a biotinylated anti-interleukin-6 polyclonal antibody is added and reacted at 37 ° C. for 1 hour to bind the interleukin-6 and the biotinylated antibody. Next, enzyme-labeled streptavidin was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes to bind the biotinylated antibody and enzyme-labeled streptavidin. After removing the reaction solution, washing was performed three times or more.
There is disclosed a method of adding methylumbelliferyl-β-D-galactoside and measuring the fluorescence intensity of released 4-methylumbelliferone.
【0032】ここで言うRIA法とは、放射性標識体を
用いた免疫測定法である。例えば、RIA法を用いた細
胞反応によって放出された有機化合物の決定方法とし
て、好塩基球から放出されるヒスタミンの測定では(臨
床検査 vol.26 no.2 1982/2)、例えば、次のように行
う。EDTA添加条件にて採血後、遠心によって血漿を
分離する。アシル化試薬チューブに血漿又は標準ヒスタ
ミンとアシル化緩衝液を加え、血漿中のヒスタミンをア
シル化する。次に125I標識ヒスタミンを加え抗ヒスタ
ミン抗体固層化チューブ内で反応させる。反応後、反応
液を除去し、抗ヒスタミン抗体チューブに結合した放射
能を測定することにより血漿中のヒスタミン量を求める
方法が報告されている。The RIA method referred to herein is an immunoassay using a radiolabel. For example, as a method for determining an organic compound released by a cell reaction using the RIA method, in the measurement of histamine released from basophils (clinical test vol. 26 no. 2 1982/2), for example, To do. After blood collection under the conditions of EDTA addition, plasma is separated by centrifugation. Plasma or standard histamine and an acylation buffer are added to an acylating reagent tube to acylate histamine in plasma. Next, 125 I-labeled histamine is added and reacted in an antihistamine antibody-fixed tube. A method has been reported in which the reaction solution is removed after the reaction, and the amount of histamine in plasma is determined by measuring the radioactivity bound to the antihistamine antibody tube.
【0033】他の有機化合物であるロイコトリエンの測
定においては、試料または標準の非標識ロイコトリエ
ン、抗ロイコトリエン抗体、3H標識ロイコトリエンを
4℃、5〜24時間反応させた後、デキストランチャー
コールと氷中10分間反応させる。遠心後、上清を分取
し、放射活性を測定することによりロイコトリエンの量
を求める。In the measurement of leukotriene, which is another organic compound, a sample or a standard unlabeled leukotriene, an anti-leukotriene antibody, and 3 H-labeled leukotriene are reacted at 4 ° C. for 5 to 24 hours, and then dextran charcoal and ice. Incubate for 10 minutes. After centrifugation, the supernatant is collected and the amount of leukotriene is determined by measuring radioactivity.
【0034】また、他の有機化合物であるPAFの測定
は、試料または標準の非標識PAF、抗PAF抗体、
125I標識PAFと2次抗体を室温で、5〜24時間反
応させた後、遠心分離で得られた沈殿物の放射活性を測
定することによりPAFの量を求める。好酸球から遊離
する有機化合物であるECPの測定方法については、市
販されているキットでは次のように行われる。抗凝固剤
存在下で採血を行い、遠心によって血漿又は血清に分離
し、標準ECP及び検体を50μlずつ試験管にとり、
125I標識ヒトECPとウサギ抗ヒトECP抗体を50
μlずつ加え、室温で1晩インキュベートする。これに
ヒツジ抗ウサギIgG抗体2mlを加え室温で30分イ
ンキュベート後、遠心にて上清を除去し、沈殿物のγカ
ウンターを測定することによりECP量を測定する方法
が知られている。Measurement of PAF which is another organic compound
Is a sample or standard unlabeled PAF, anti-PAF antibody,
125Reaction of I-labeled PAF and secondary antibody at room temperature for 5 to 24 hours
After the reaction, the radioactivity of the precipitate obtained by centrifugation is measured.
To determine the amount of PAF. Free from eosinophils
For information on how to measure ECP,
The kits on sale are as follows. Anticoagulant
Blood is collected in the presence and separated into plasma or serum by centrifugation
Take 50 μl each of the standard ECP and the sample into a test tube,
12550 I-labeled human ECP and rabbit anti-human ECP antibody
Add in aliquots and incubate at room temperature overnight. to this
Add 2 ml of sheep anti-rabbit IgG antibody and add at room temperature for 30 minutes.
After incubation, remove the supernatant by centrifugation, and
Method of measuring ECP amount by measuring Unter
It has been known.
【0035】ここで言う、有機化合物をカラムにより分
離した後に検出系によって測定する方法とは、イオン
性、疎水性、親和性などのメディエーターの物性を利用
し、樹脂を充填したカラムにより、メディエーターを分
離する方法であり、HPLC法が挙げられる。HPLC
法を用いた有機化合物の決定方法として、例えば、特開
平6−205695によるヒスタミンの測定法があげら
れる。例えば、次のように行う、陽イオン交換樹脂を充
填したカラムに試料を通じ、ヒスタミンを分離した後
に、0.1%オルトフタルアルデヒドとNaOHを加
え、ヒスタミン−オルトフタルアルデヒド結合反応を行
いヒスタミンを蛍光体として、HClを加え、反応を停
止し、蛍光強度を測定することによってヒスタミン遊離
量を測定する方法が報告されている。また、他の有機化
合物であるロイコトリエンの測定においては、血液から
白血球を分離し、カルシウムイオノフォアーを加え好塩
基球からロイコトリエンを放出させ、プロスタグランジ
ンを含む氷冷アセトニトリル/メタノール/酢酸液で反
応を停止し、−20℃で1時間放置後、遠心、逆層クロ
マトグラフィでロイコトリエンの分離を行って、ロイコ
トリエンの吸収特性である280nmの吸収を測定し、
ロイコトリエン量を測定する方法である。The method of measuring an organic compound by a detection system after separating the organic compound by a column is to utilize the physical properties of the mediator, such as ionicity, hydrophobicity, affinity, etc., and to carry out the mediator by a resin-filled column. This is a separation method, and examples include an HPLC method. HPLC
As a method for determining an organic compound using the method, there is, for example, a method for measuring histamine according to JP-A-6-205695. For example, after histamine is separated by passing a sample through a column filled with a cation exchange resin and histamine is added thereto, 0.1% orthophthalaldehyde and NaOH are added, and a histamine-orthophthalaldehyde binding reaction is performed as described below, and histamine is fluoresced. A method has been reported in which HCl is added as a body, the reaction is stopped, and the amount of histamine released is measured by measuring the fluorescence intensity. In the measurement of leukotriene, another organic compound, leukocytes are separated from blood, calcium ionophore is added to release leukotriene from basophils, and the reaction is performed with an ice-cold acetonitrile / methanol / acetic acid solution containing prostaglandin. Was stopped and left at −20 ° C. for 1 hour, followed by centrifugation and separation of leukotriene by reverse layer chromatography to measure the absorption at 280 nm, which is the absorption characteristic of leukotriene.
This is a method for measuring the amount of leukotriene.
【0036】ここで言う有機化合物を特異的に吸着する
担体とは、グラスファイバー、抗体、酵素、レセプタ
ー、レクチンなどが挙げられる。有機化合物を特異的に
吸着する担体を用いて測定する方法としては特開平3−
19948が挙げられ、血球から遊離されるヒスタミン
の測定において、ヘパリン採血した血液とアレルゲンを
グラスファイバーを固定化したマイクロプレートに分注
し、好塩基球からヒスタミンを放出させ、グラスファイ
バーに結合したヒスタミン量を蛍光法にて測定する方法
が開示されている。The carrier specifically adsorbing the organic compound mentioned here includes glass fiber, antibody, enzyme, receptor, lectin and the like. As a method for measuring using a carrier that specifically adsorbs an organic compound, Japanese Patent Application Laid-Open No.
In the measurement of histamine released from blood cells, heparin-collected blood and allergen are dispensed into a microplate on which glass fibers are immobilized, histamine is released from basophils, and histamine bound to glass fibers. A method for measuring the amount by a fluorescence method is disclosed.
【0037】[0037]
【発明の実施の形態】以下、実施例を挙げて本発明をさ
らに詳細に説明するが本発明は何らこれに限定されるも
のではない。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited thereto.
【0038】[0038]
【実施例1】健常人ボランティア血液1例を用いて、血
球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に
血液5mlに対し、EDTAナトリウム濃度がヒスタミ
ン遊離反応時に1mMになるようにEDTAナトリウム
(同人化学社製)を添加した血液25μlとヒスタミン
遊離反応時の濃度として、50mM塩化カルシウム(和
光純薬工業社製)、70mM酢酸ナトリウム(和光純薬
工業社製)、2.5mM酢酸カリウム(和光純薬工業社
製)、10U/mlヘパリンナトリウム(ヘキスト・マ
リオン・ルセル社)及び、0.005%アジ化ナトリウ
ム(和光純薬工業社製)を含むPipes緩衝液(同人
化学社製)(pH7.4)にて調整したヒト抗IgE抗
体溶液(DAKO社製)25μlをグラスファイバーを
固定化したマイクロプレートに分注し、37℃90分間
反応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離させた。反
応後、マイクロプレートを洗浄し、界面活性剤を200
μl添加し37℃60分反応させ、グラスファイバーに
付着した血液中の夾雑物を洗浄する。その後、水酸化ナ
トリウム(和光純薬工業社製)で調整した0.05%オ
ルトフタルアルデヒド溶液(和光純薬工業社製)を75
μl分注し、蛍光体を形成した後、0.6%過塩素酸
(和光純薬工業社製)75μlを分注して反応を停止
し、蛍光強度を測定しヒスタミン標準液よりヒスタミン
量を求めた。試験は5回行い、標準偏差を平均値で割っ
た値を100倍し、Coefficient of V
ariation(CV)(%)を求めた。その結果C
V値は7.8%であった。Example 1 Histamine released from blood cells was measured using one healthy volunteer blood sample. At the time of blood collection, 25 μl of blood to which 5 mL of blood was added with sodium EDTA (manufactured by Dojindo Chemical Co., Ltd.) so that the EDTA sodium concentration was 1 mM during the histamine release reaction, and 50 mM calcium chloride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ), 70 mM sodium acetate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 2.5 mM potassium acetate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 10 U / ml sodium heparin (Hoechst Marion Roussel) and 0.005% A microplate in which 25 μl of a human anti-IgE antibody solution (manufactured by DAKO) prepared with Pipes buffer (manufactured by Dojindo) (pH 7.4) containing sodium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) is immobilized on a glass fiber. And histamine was released from basophils. After the reaction, the microplate was washed, and a surfactant was added for 200 hours.
Add μl and react at 37 ° C. for 60 minutes to wash out impurities in blood attached to the glass fiber. Thereafter, a 0.05% orthophthalaldehyde solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) prepared with sodium hydroxide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used for 75 times.
After dispensing μl to form a phosphor, the reaction was stopped by dispensing 75 μl of 0.6% perchloric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), the fluorescence intensity was measured, and the amount of histamine was determined from the histamine standard solution. I asked. The test was performed 5 times, and the value obtained by dividing the standard deviation by the average value was multiplied by 100 to obtain the Coefficient of V.
Arrangement (CV) (%) was determined. As a result C
The V value was 7.8%.
【0039】[0039]
【実施例2】EDTAナトリウム濃度が、ヒスタミン遊
離反応時に1、25、50mMである以外は実施例1と
同様の方法にて試験を行った。その結果CV値は9%、
8.5%、9.7%、であった。Example 2 A test was performed in the same manner as in Example 1 except that the sodium EDTA concentration was 1, 25, and 50 mM during the histamine release reaction. As a result, the CV value is 9%,
8.5% and 9.7%.
【0040】[0040]
【比較例1】健常人ボランティア血液1例を用いて、血
球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に
血液5mlに対し、ヘパリンナトリウム濃度がヒスタミ
ン遊離反応時に10U/mlになるようにヘパリンナト
リウムを添加した血液25μlとヒスタミン遊離反応時
の濃度として、50mM塩化カルシウム、70mM酢酸
ナトリウム、2.5mM酢酸カリウム、及び、0.00
5%アジ化ナトリウムを含むPipes緩衝液(pH
7.4)にて調整したヒト抗IgE抗体溶液25μlを
用いて実施例1と同様の方法にてヒスタミンの測定を行
った。その結果、CV値は123%であり、EDTAナ
トリウム濃度1〜50mMの範囲では、実施例1の結果
と合わせ、CV値が7.8〜9%と低下した。ばらつき
の程度を表すCV値が有意に低下する結果から明らかな
ように、EDTAナトリウム濃度1〜50mMの添加に
よって、細胞反応の再現性が向上した。Comparative Example 1 Using one healthy volunteer blood, histamine released from blood cells was measured. For 5 ml of blood at the time of blood collection, 25 μl of blood to which heparin sodium was added so that the concentration of heparin sodium was 10 U / ml during the histamine release reaction, and 50 mM calcium chloride, 70 mM sodium acetate, 2.5 mM acetate Potassium and 0.00
Pipes buffer containing 5% sodium azide (pH
Histamine was measured in the same manner as in Example 1 using 25 μl of the human anti-IgE antibody solution prepared in 7.4). As a result, the CV value was 123%. When the sodium EDTA concentration was in the range of 1 to 50 mM, the CV value was reduced to 7.8 to 9% in combination with the result of Example 1. As is apparent from the result that the CV value indicating the degree of the variation significantly decreased, the reproducibility of the cell reaction was improved by the addition of the sodium EDTA concentration of 1 to 50 mM.
【0041】[0041]
【実施例3】塩化カルシウム濃度が、ヒスタミン遊離反
応時に1、100、200mMである以外は実施例1と
同様の方法にて試験を行った。その結果CV値は8.5
%、8.5%、8.3%であった。Example 3 A test was conducted in the same manner as in Example 1 except that the calcium chloride concentration was 1, 100, and 200 mM during the histamine release reaction. As a result, the CV value was 8.5.
%, 8.5% and 8.3%.
【0042】[0042]
【比較例2】塩化カルシウム濃度が、ヒスタミン遊離反
応時に0mMである以外は実施例1と同様の方法にて試
験を行った。 その結果CV値は、150%であり、カ
ルシウム濃度1〜200mMの範囲では、実施例1の結
果と合わせ、CV値が7.8〜8.5%へと低下した。
この結果から明らかなように、カルシウム濃度1〜20
0mMの範囲内において、細胞反応の再現性が向上し
た。Comparative Example 2 A test was performed in the same manner as in Example 1 except that the calcium chloride concentration was 0 mM during the histamine release reaction. As a result, the CV value was 150%. When the calcium concentration was in the range of 1 to 200 mM, the CV value was reduced to 7.8 to 8.5% in combination with the result of Example 1.
As is clear from the results, the calcium concentration was 1 to 20.
Within the range of 0 mM, the reproducibility of the cell reaction was improved.
【0043】[0043]
【実施例4】ヘパリンナトリウム濃度が、ヒスタミン遊
離反応時に1、20、50U/mlである以外は実施例
1と同様の方法にて試験を行った。その結果CV値は、
8.3%、8.0%、8.4%であった。Example 4 A test was conducted in the same manner as in Example 1, except that the sodium heparin concentration was 1, 20, and 50 U / ml during the histamine release reaction. As a result, the CV value is
8.3%, 8.0% and 8.4%.
【0044】[0044]
【比較例3】ヘパリンナトリウム濃度が、ヒスタミン遊
離反応時に0mMである以外は実施例1と同様の方法に
て試験を行った。その結果CV値は、143%であり、
ヘパリンナトリウム濃度1〜50U/mlの範囲では、
実施例1の結果と合わせ、CV値が7.8〜8.4%へ
と低下した。この結果から明らかなように、ヘパリン濃
度1〜50U/mlの範囲内において、細胞反応の再現
性が向上した。Comparative Example 3 A test was conducted in the same manner as in Example 1, except that the concentration of heparin sodium was 0 mM during the histamine release reaction. As a result, the CV value is 143%,
In the range of heparin sodium concentration of 1 to 50 U / ml,
Together with the results of Example 1, the CV value was reduced to 7.8 to 8.4%. As is clear from the results, the reproducibility of the cell reaction was improved in the range of the heparin concentration of 1 to 50 U / ml.
【0045】[0045]
【実施例5】EDTAナトリウムが、クエン酸ナトリウ
ム(和光純薬工業社製)である以外は実施例1と同様の
方法にて試験を行った。その結果CV値は、8.2%で
あった。Example 5 A test was performed in the same manner as in Example 1 except that sodium EDTA was sodium citrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the CV value was 8.2%.
【0046】[0046]
【実施例6】EDTAナトリウムが、シュウ酸ナトリウ
ム(和光純薬工業社製)である以外は実施例1と同様の
方法にて試験を行った。その結果CV値は、8.1%で
あった。実施例1、実施例5、実施例6、比較例1の結
果から、キレート剤が、EDTAナトリウム、クエン酸
ナトリウム、シュウ酸ナトリウムであっても、CV値が
7.8〜8.2%と低下し、細胞反応の再現性が向上し
た。Example 6 A test was conducted in the same manner as in Example 1 except that sodium EDTA was sodium oxalate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the CV value was 8.1%. From the results of Example 1, Example 5, Example 6, and Comparative Example 1, even when the chelating agent was sodium EDTA, sodium citrate, or sodium oxalate, the CV value was 7.8 to 8.2%. And the reproducibility of the cell response was improved.
【0047】[0047]
【実施例7】ヘパリンナトリウムが、プラスミン(和光
純薬工業社製)である以外は実施例1と同様の方法にて
試験を行った。その結果CV値は、8.9%であった。Example 7 A test was performed in the same manner as in Example 1 except that sodium heparin was plasmin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the CV value was 8.9%.
【0048】[0048]
【実施例8】ヘパリンナトリウムが、トロンビン(和光
純薬工業社製)である以外は実施例1と同様の方法にて
試験を行った。その結果CV値は、8.6%であった。
実施例1、実施例7、実施例8、比較例2の結果から、
キレート能を有しない抗血液凝固剤が、ヘパリンナトリ
ウム、プラスミン、トロンビンであっても、CV値が
7.8〜8.9%と低下し、細胞反応の再現性が向上し
た。Example 8 A test was performed in the same manner as in Example 1 except that the heparin sodium was thrombin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the CV value was 8.6%.
From the results of Example 1, Example 7, Example 8, and Comparative Example 2,
Even if the anticoagulant having no chelating ability was heparin sodium, plasmin, or thrombin, the CV value was reduced to 7.8 to 8.9%, and the reproducibility of the cell reaction was improved.
【0049】[0049]
【実施例9】塩化カルシウムが、塩化マグネシウム(和
光純薬工業社製)である以外は実施例1と同様の方法に
て試験を行った。その結果CV値は、9.7%であっ
た。Example 9 A test was performed in the same manner as in Example 1 except that calcium chloride was magnesium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the CV value was 9.7%.
【0050】[0050]
【実施例10】塩化カルシウムが、塩化マンガン(和光
純薬工業社製)である以外は実施例1と同様の方法にて
試験を行った。その結果CV値は、9.9%であった。
実施例1、実施例9、実施例10、比較例3の結果か
ら、2価陽イオンがカルシウムイオン、マグネシウムイ
オン、マンガンイオンであっても、CV値が7.8〜
9.9%と低下し、細胞反応の再現性が向上した。Example 10 A test was conducted in the same manner as in Example 1 except that calcium chloride was manganese chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the CV value was 9.9%.
From the results of Example 1, Example 9, Example 10, and Comparative Example 3, even when the divalent cation is a calcium ion, a magnesium ion, or a manganese ion, the CV value is 7.8 or more.
This decreased to 9.9%, and the reproducibility of the cell reaction was improved.
【0051】[0051]
【実施例11】塩化カルシウムが、硫酸カルシウム(和
光純薬工業社製)である以外は実施例1と同様の方法に
て試験を行った。その結果CV値は、9.3%であっ
た。Example 11 A test was performed in the same manner as in Example 1 except that calcium chloride was calcium sulfate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the CV value was 9.3%.
【0052】[0052]
【実施例12】塩化カルシウムが、炭酸カルシウム(和
光純薬工業社製)である以外は実施例1と同様の方法に
て試験を行った。その結果CV値は、9.5%であっ
た。実施例1、実施例11、実施例12、比較例3の結
果から、金属塩が塩化物、硫酸塩、炭酸塩であっても、
CV値が7.8〜9.5%と低下し、細胞反応の再現性
が向上した。Example 12 A test was performed in the same manner as in Example 1 except that calcium chloride was calcium carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the CV value was 9.5%. From the results of Example 1, Example 11, Example 12, and Comparative Example 3, even if the metal salt is chloride, sulfate, or carbonate,
The CV value was reduced to 7.8 to 9.5%, and the reproducibility of the cell reaction was improved.
【0053】[0053]
【実施例13】健常人ボランティア血液1例を用いて、
血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時
に血液5mlに対し、ヒスタミン遊離反応時にEDTA
ナトリウム濃度が1mM、ヘパリンナトリウム濃度が1
0U/mlになるように、EDTAナトリウムとヘパリ
ンナトリウムを添加した血液25μlとヒスタミン遊離
反応時の濃度として、50mM塩化カルシウム、70m
M酢酸ナトリウム、2.5mM酢酸カリウム、及び、
0.005%アジ化ナトリウムを含むPipes緩衝液
(pH7.4)にて調整したヒト抗IgE抗体溶液25
μlを用いて実施例1と同様の方法にてヒスタミンの測
定を行った。その結果、CV値が8.0%であり、実施
例1のCV値7.8%と同等の結果が得られた。この結
果から明らかなように、キレート剤、キレート能を有さ
ない抗血液凝固剤を血液に同時に添加しても、細胞反応
の再現性が向上した。Example 13 Using one healthy volunteer blood sample,
Histamine released from blood cells was measured. 5 ml of blood at the time of blood collection and EDTA at the time of histamine release reaction
Sodium concentration 1 mM, heparin sodium concentration 1
The concentration at the time of histamine release reaction with 25 μl of blood added with sodium EDTA and sodium heparin so as to be 0 U / ml was 50 mM calcium chloride, 70 mM
M sodium acetate, 2.5 mM potassium acetate, and
Human anti-IgE antibody solution 25 prepared with Pipes buffer (pH 7.4) containing 0.005% sodium azide
Histamine was measured in the same manner as in Example 1 using μl. As a result, the CV value was 8.0%, and a result equivalent to the CV value of Example 1 of 7.8% was obtained. As is clear from these results, the reproducibility of the cell reaction was improved even when a chelating agent and an anticoagulant having no chelating ability were simultaneously added to blood.
【0054】[0054]
【実施例14】健常人ボランティア血液1例を用いて、
血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時
に血液5mlに対し、ヒスタミン遊離反応時にヘパリン
ナトリウム濃度が10U/mlになるようにヘパリンナ
トリウムを添加した血液25μlとヒスタミン遊離反応
時の濃度として、50mM塩化カルシウム、70mM酢
酸ナトリウム、2.5mM酢酸カリウム、1mM ED
TAナトリウム及び、0.005%アジ化ナトリウムを
含むPipes緩衝液(pH7.4)にて調整したヒト
抗IgE抗体溶液25μlを用いて実施例1と同様の方
法にてヒスタミンの測定を行った。その結果、CV
(%)が8.0%であり、実施例1のCV値7.8%と
同等の結果が得られた。この結果から明らかなように、
血液にキレート能を有さない抗血液凝固剤を添加し、緩
衝液にキレート剤と金属塩を添加しても、細胞反応の再
現性が向上した。Example 14 Using one healthy volunteer blood sample,
Histamine released from blood cells was measured. For blood 5 ml at the time of blood collection, 25 μl of blood to which heparin sodium was added so that the concentration of heparin sodium became 10 U / ml at the time of histamine release reaction, and 50 mM calcium chloride, 70 mM sodium acetate, 2.5 mM acetate Potassium, 1 mM ED
Histamine was measured in the same manner as in Example 1 using 25 μl of a human anti-IgE antibody solution adjusted with Pipes buffer (pH 7.4) containing sodium TA and 0.005% sodium azide. As a result, CV
(%) Was 8.0%, and a result equivalent to the CV value of Example 1 of 7.8% was obtained. As evident from this result,
Even when an anticoagulant having no chelating ability was added to blood and a chelating agent and a metal salt were added to the buffer, the reproducibility of the cell reaction was improved.
【0055】[0055]
【実施例15】健常人ボランティア血液1例を用いて、
血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時
に血液5mlに対しEDTAナトリウム濃度がヒスタミ
ン遊離反応時に1、25、50mMになるようにEDT
Aナトリウムを添加した血液50μlとヒスタミン遊離
反応時の濃度として、50mM塩化カルシウム、70m
M酢酸ナトリウム、2.5mM酢酸カリウム、10U/
mlヘパリンナトリウム及び、0.005%アジ化ナト
リウムを含むPipes緩衝液(pH7.4)にて調整
したヒト抗IgE溶液50μlをプラスチックチューブ
に分注し、37℃90分間反応を行い、好塩基球からヒ
スタミンを遊離させる。その後、遠心を行い、血球を除
去した後、遊離したヒスタミンとアシル化試薬を反応さ
せ、ヒスタミンをアシル化する。抗アシル化ヒスタミン
抗体を固層化したマイクロプレートにアシル化したヒス
タミンと酵素標識ヒスタミン200μlを添加し5度で
18時間反応を行い、洗浄後、酵素基質200μlを加
え25度で反応を行い、30分後、反応停止液50μl
を加え、405nmの吸光度を測定した。その結果、C
V値は9.2%、8.8%、9.5%であった。Example 15 Using one example of healthy volunteer blood,
Histamine released from blood cells was measured. At the time of blood collection, EDT was adjusted so that the EDTA sodium concentration was 1, 25, and 50 mM during the histamine release reaction for 5 ml of blood.
A concentration of 50 mM calcium chloride, 70 mM
M sodium acetate, 2.5 mM potassium acetate, 10 U /
50 μl of a human anti-IgE solution adjusted with a Pipes buffer (pH 7.4) containing 0.1 ml of sodium heparin and 0.005% sodium azide was dispensed into a plastic tube, reacted at 37 ° C. for 90 minutes, and subjected to basophils. To release histamine. Thereafter, centrifugation is performed to remove hemocytes, and then the released histamine is reacted with an acylating reagent to acylate histamine. 200 μl of acylated histamine and enzyme-labeled histamine were added to a microplate on which an anti-acylated histamine antibody was immobilized, and reacted at 5 ° C. for 18 hours. After washing, 200 μl of enzyme substrate was added and reacted at 25 ° C. After one minute, stop reaction liquid 50 μl
Was added, and the absorbance at 405 nm was measured. As a result, C
The V values were 9.2%, 8.8%, and 9.5%.
【0056】[0056]
【比較例4】健常人ボランティア血液1例を用いて、血
球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に
血液5mlに対し、ヘパリンナトリウム濃度がヒスタミ
ン遊離反応時に10U/mlになるようにヘパリンナト
リウムを添加した血液50μlとヒスタミン遊離反応時
の濃度として、50mM塩化カルシウム、70mM酢酸
ナトリウム、2.5mM酢酸カリウム、及び、0.00
5%アジ化ナトリウムを含むPipes緩衝液(pH
7.4)にて調整したヒト抗IgE抗体溶液50μlを
用いて実施例15と同様の方法にてヒスタミンの測定を
行った。その結果、CV値は140%であり、EDTA
ナトリウム濃度1〜50mMの範囲では、CV値が8.
8〜9.5%と低下した。この結果から明らかなよう
に、EDTAナトリウム濃度1〜50mMの範囲内にお
いて、細胞反応の再現性が向上した。Comparative Example 4 Using one healthy volunteer blood, histamine released from blood cells was measured. At the time of blood collection, 50 ml of blood to which 5 ml of blood was added with heparin sodium so that the concentration of sodium heparin became 10 U / ml during the histamine release reaction was 50 mM calcium chloride, 70 mM sodium acetate, and 2.5 mM acetate. Potassium and 0.00
Pipes buffer containing 5% sodium azide (pH
Histamine was measured in the same manner as in Example 15 using 50 μl of the human anti-IgE antibody solution prepared in 7.4). As a result, the CV value was 140%, and the EDTA
When the sodium concentration is in the range of 1 to 50 mM, the CV value is 8.
It decreased to 8 to 9.5%. As is apparent from the results, the reproducibility of the cell reaction was improved in the range of the sodium EDTA concentration of 1 to 50 mM.
【0057】[0057]
【実施例16】健常人ボランティア血液1例を用いて、
血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時
に血液5mlに対しEDTAナトリウム濃度がヒスタミ
ン遊離反応時に1、25、50mMになるようにEDT
Aナトリウムを添加した3種類の血液それぞれ50μl
とヒスタミン遊離反応時の濃度として、50mM塩化カ
ルシウム、70mM酢酸ナトリウム、2.5mM酢酸カ
リウム、10U/mlヘパリンナトリウム及び、0.0
05%アジ化ナトリウムを含むPipes緩衝液(pH
7.4)にて調整したヒト抗IgE溶液25μlをチュ
ーブに分注し、37℃、90分間反応を行い、好塩基球
からヒスタミンを遊離させる。その後、遠心を行い、血
球を除去した後、アシル化試薬チューブに遊離したヒス
タミン500μlと標準ヒスタミンμlとアシル化緩衝
液50μlを加え、遊離したヒスタミンをアシル化す
る。次に125I標識ヒスタミン1mlを加え抗ヒスタミ
ン抗体固層化チューブ内で4度、16時間反応させる。
反応後、反応液を除去し、抗ヒスタミン抗体チューブに
結合した放射能を測定した。その結果、CV値は、9.
3%、9.0%、9.5%であった。Example 16 Using one example of healthy volunteer blood,
Histamine released from blood cells was measured. At the time of blood collection, EDT was adjusted so that the EDTA sodium concentration was 1, 25, and 50 mM during the histamine release reaction for 5 ml of blood.
50 μl of each of three types of blood to which sodium A was added
And 50 mM calcium chloride, 70 mM sodium acetate, 2.5 mM potassium acetate, 10 U / ml sodium heparin, and 0.0
Pipes buffer containing 0.05% sodium azide (pH
25 μl of the human anti-IgE solution prepared in 7.4) is dispensed into a tube and reacted at 37 ° C. for 90 minutes to release histamine from basophils. Thereafter, centrifugation is performed to remove blood cells, and then 500 μl of released histamine, μl of standard histamine, and 50 μl of acylation buffer are added to the acylating reagent tube to acylate the released histamine. Next, 1 ml of 125 I-labeled histamine is added and reacted four times in an antihistamine antibody-fixed tube for 16 hours.
After the reaction, the reaction solution was removed, and the radioactivity bound to the antihistamine antibody tube was measured. As a result, the CV value becomes 9.
3%, 9.0%, and 9.5%.
【0058】[0058]
【比較例5】健常人ボランティア血液1例を用いて、血
球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に
血液5mlに対し、ヘパリンナトリウム濃度がヒスタミ
ン遊離反応時に10U/mlになるようにヘパリンナト
リウムを添加した血液25μlとヒスタミン遊離反応時
の濃度として、50mM塩化カルシウム、70mM酢酸
ナトリウム、2.5mM酢酸カリウム、及び、0.00
5%アジ化ナトリウムを含むPipes緩衝液(pH
7.4)にて調整したヒト抗IgE抗体溶液25μlを
用いて実施例16と同様の方法にてヒスタミンの測定を
行った。その結果、CV値は140%であり、EDTA
ナトリウム濃度1〜50mMの範囲では、CV値が9〜
9.5%と低下した。この結果から明らかなように、E
DTAナトリウム濃度1〜50mMの範囲内において、
細胞反応の再現性が向上した。Comparative Example 5 Histamine released from blood cells was measured using one healthy volunteer blood sample. For 5 ml of blood at the time of blood collection, 25 μl of blood to which heparin sodium was added so that the concentration of heparin sodium was 10 U / ml during the histamine release reaction, and 50 mM calcium chloride, 70 mM sodium acetate, 2.5 mM acetate Potassium and 0.00
Pipes buffer containing 5% sodium azide (pH
Histamine was measured in the same manner as in Example 16 using 25 μl of the human anti-IgE antibody solution prepared in 7.4). As a result, the CV value was 140%, and the EDTA
When the sodium concentration is in the range of 1 to 50 mM, the CV value is 9 to
It decreased to 9.5%. As is apparent from this result, E
In the range of sodium DTA concentration of 1 to 50 mM,
The reproducibility of the cell reaction was improved.
【0059】[0059]
【実施例17】健常人ボランティア血液1例を用いて、
血球から遊離されるロイコトリエンの測定を行った。採
血時に血液5mlに対しEDTAナトリウム濃度がロイ
コトリエン遊離反応時に1、25、50mMになるよう
にEDTAナトリウムを添加した3種類の血液それぞれ
25μlとロイコトリエン遊離反応時の濃度として、5
0mM塩化カルシウム、70mM酢酸ナトリウム、2.
5mM酢酸カリウム、10U/mlヘパリン及び、0.
005%アジ化ナトリウムを含むPipes緩衝液(p
H7.4)にて調整したヒト抗IgE溶液25μlをチ
ューブに分注し、37℃、90分間反応を行い、好塩基
球からロイコトリエンを遊離させる。その後、遠心を行
い、血球を除去した後、プロスタグランジンを含む氷冷
アセトニトリル/メタノール/酢酸液で反応を停止し、
−20℃で1時間放置後、遠心、逆層クロマトグラフィ
でロイコトリエンの分離を行って、ロイコトリエンの吸
収特性である280nmの吸収を測定し、ロイコトリエ
ン量の測定を行った。その結果、CV値は、それぞれ、
8.1%、8.8%、9.3%であった。Example 17 Using one example of healthy volunteer blood,
Leukotriene released from blood cells was measured. At the time of blood collection, 5 μl of blood was added to each of 25 μl of three kinds of blood to which sodium EDTA was added so that the concentration of sodium EDTA became 1, 25, and 50 mM at the time of leukotriene release reaction.
1. 0 mM calcium chloride, 70 mM sodium acetate,
5 mM potassium acetate, 10 U / ml heparin and 0.
Pipes buffer containing 005% sodium azide (p
25 μl of the human anti-IgE solution prepared in H7.4) was dispensed into a tube, and reacted at 37 ° C. for 90 minutes to release leukotriene from basophils. Then, after centrifugation to remove blood cells, the reaction was stopped with an ice-cold acetonitrile / methanol / acetic acid solution containing prostaglandin,
After standing at -20 ° C for 1 hour, leukotriene was separated by centrifugation and reverse-layer chromatography, and the absorption at 280 nm, which is the absorption characteristic of leukotriene, was measured to measure the amount of leukotriene. As a result, the CV values are:
They were 8.1%, 8.8% and 9.3%.
【0060】[0060]
【比較例6】健常人ボランティア血液1例を用いて、血
球から遊離されるロイコトリエンの測定を行った。採血
時に血液5mlに対し、ヘパリンナトリウム濃度がヒス
タミン遊離反応時に10U/mlになるようにヘパリン
ナトリウムを添加した血液25μlとロイコトリエン遊
離反応時の濃度として、50mM塩化カルシウム、70
mM酢酸ナトリウム、2.5mM酢酸カリウム、及び、
0.005%アジ化ナトリウムを含むPipes緩衝液
(pH7.4)にて調整したヒト抗IgE抗体溶液25
μlを用いて実施例17と同様の方法にてロイコトリエ
ンの測定を行った。その結果、CV値は120%であ
り、EDTAナトリウム濃度1〜50mMの範囲では、
実施例17の結果と合わせ、CV値が8.1〜9.3%
と低下した。この結果から明らかなように、EDTAナ
トリウム濃度1〜50mMの範囲内において、細胞反応
の再現性が向上した。Comparative Example 6 Leukotriene released from blood cells was measured using one healthy volunteer blood sample. For blood 5 ml at the time of blood collection, 25 μl of blood to which heparin sodium was added so that the heparin sodium concentration was 10 U / ml at the time of histamine release reaction, and 50 mM calcium chloride, 70 μm as a concentration at the time of leukotriene release reaction.
mM sodium acetate, 2.5 mM potassium acetate, and
Human anti-IgE antibody solution 25 prepared with Pipes buffer (pH 7.4) containing 0.005% sodium azide
Leukotriene was measured in the same manner as in Example 17 using μl. As a result, the CV value was 120%, and in the range of sodium EDTA concentration of 1 to 50 mM,
Together with the results of Example 17, the CV value was 8.1 to 9.3%.
And declined. As is apparent from the results, the reproducibility of the cell reaction was improved in the range of the sodium EDTA concentration of 1 to 50 mM.
【0061】[0061]
【発明の効果】本発明は、血液細胞反応の決定方法にお
いて、血液、キレート剤、キレート能を有しない抗血液
凝固剤、及び水溶性媒体中で2価陽イオンを溶出しうる
金属塩からなる群より組み合わせた組成物を用いた血液
処理により、血液を分離することなく細胞機能を再現性
よく測定できることを示したものである。従って本発明
の効果は、細胞機能検査の再現性を高めることができる
効果、操作の簡便化による作業者の作業時間軽減及びそ
れに伴うコストを低下させる効果が期待される。The present invention relates to a method for determining a blood cell reaction, comprising a blood, a chelating agent, an anticoagulant having no chelating ability, and a metal salt capable of eluting a divalent cation in an aqueous medium. This shows that cell function can be measured with good reproducibility without blood separation by blood treatment using the composition combined from the group. Therefore, the effects of the present invention are expected to be able to enhance the reproducibility of the cell function test, to reduce the work time of the operator by simplifying the operation, and to reduce the cost associated therewith.
Claims (20)
液凝固剤、及び水溶性媒体中で2価陽イオンを溶出しう
る金属塩を添加することを特徴とする、細胞反応に供す
る血液の処理方法。1. A treatment of blood subjected to a cell reaction, comprising adding a chelating agent, an anticoagulant having no chelating ability, and a metal salt capable of eluting a divalent cation in an aqueous medium. Method.
遊離反応である請求項1記載の処理方法。2. The treatment method according to claim 1, wherein the cell reaction is a mediator release reaction from blood cells.
ine tetraacetic acid(EDT
A)、クエン酸、及びシュウ酸よりなる群から選ばれる
1種以上を含む請求項1ないし2記載の処理方法。3. The method according to claim 1, wherein the chelating agent is Ethylendiam.
ine tetraacetic acid (EDT
The processing method according to claim 1, comprising one or more selected from the group consisting of A), citric acid, and oxalic acid.
ヘパリン、プラスミン、蛋白分解酵素、アゾ色素、ヒル
ジン、ジクマロール、トロンボモジュリン、血液凝固因
子に対する抗体、及び血液凝固因子に結合するレセプタ
ーよりなる群から選ばれる1種以上を含む請求項1〜3
記載の処理方法。4. An anticoagulant having no chelating ability,
4. A composition comprising at least one member selected from the group consisting of heparin, plasmin, protease, azo dye, hirudin, dicoumarol, thrombomodulin, an antibody against a blood coagulation factor, and a receptor that binds to a blood coagulation factor.
The processing method described.
ウム、マンガン、亜鉛、カドミウム、及び銅よりなる群
から選ばれる1種以上を含む請求項1〜4記載の処理方
法。5. The treatment method according to claim 1, wherein the divalent cation includes at least one selected from the group consisting of calcium, magnesium, manganese, zinc, cadmium, and copper.
酸塩、及びリン酸塩よりなる群から選ばれる1種以上を
含む請求項1〜5記載の処理方法。6. The treatment method according to claim 1, wherein the metal salt contains at least one selected from the group consisting of chlorides, sulfates, carbonates, nitrates, and phosphates.
トリエン、platelet activating
factor(PAF)あるいは、サイトカインである
請求項2〜6記載の処理方法。7. The mediator may be histamine, leukotriene, platelet activating.
The method according to claim 2, wherein the treatment method is a factor (PAF) or a cytokine.
50mMであり、金属塩とのモル濃度比がキレート剤1
に対して金属塩が1〜200である請求項1〜7記載の
処理方法。8. The concentration of the chelating agent may be 1 to 3 during the cell reaction.
50 mM, and the molar concentration ratio with the metal salt is 1
The processing method according to any one of claims 1 to 7, wherein the metal salt is 1 to 200 with respect to the amount of the metal salt.
が、細胞反応時に1〜50U/mlである請求項1〜8
記載の処理方法。9. The anticoagulant having no chelating ability has a concentration of 1 to 50 U / ml during a cell reaction.
The processing method described.
度が、細胞反応時に1〜200mMである請求項1〜9
記載の処理方法。10. The concentration of a metal salt capable of eluting a divalent cation is 1 to 200 mM during a cell reaction.
The processing method described.
血液凝固剤、及び水溶性媒体中で2価陽イオンを溶出し
うる金属塩よりなる、細胞反応に供する血液の処理用組
成物。11. A composition for treating blood to be subjected to a cell reaction, comprising a chelating agent, an anticoagulant having no chelating ability, and a metal salt capable of eluting a divalent cation in an aqueous medium.
ー遊離反応である請求項11記載の組成物。12. The composition according to claim 11, wherein the cellular reaction is a mediator release reaction from blood cells.
mine tetra acetic acid(ED
TA)、クエン酸、及びシュウ酸より選ばれる1種以上
を含む請求項11ないし12記載の組成物。13. The chelating agent may be Ethylendia.
mine tetra acidic acid (ED
The composition according to claim 11, comprising at least one selected from TA), citric acid, and oxalic acid.
が、ヘパリン、プラスミン、蛋白分解酵素、アゾ色素、
ヒルジン、ジクマロール、トロンボモジュリン、血液凝
固因子に対する抗体、及び血液凝固因子に結合するレセ
プターよりなる群から選ばれる1種以上を含む請求項1
1〜13記載の組成物。14. An anticoagulant having no chelating ability includes heparin, plasmin, protease, azo dye,
2. The composition according to claim 1, which comprises at least one member selected from the group consisting of hirudin, dicoumarol, thrombomodulin, an antibody against a blood coagulation factor, and a receptor that binds to a blood coagulation factor.
14. The composition according to 1 to 13.
シウム、マンガン、亜鉛、カドミウム、及び銅よりなる
群から選ばれる1種以上を含む請求項11〜14記載の
組成物。15. The composition according to claim 11, wherein the divalent cation includes at least one selected from the group consisting of calcium, magnesium, manganese, zinc, cadmium, and copper.
硝酸塩、及びリン酸塩よりなる群から選ばれる1種以上
を含む請求項11〜15記載の組成物。16. The metal salt is chloride, sulfate, carbonate,
The composition according to any one of claims 11 to 15, comprising at least one member selected from the group consisting of nitrates and phosphates.
コトリエン、platelet activating
factor(PAF)、あるいは、サイトカインで
ある請求項12〜16記載の組成物。17. The mediator may be histamine, leukotriene, platelet activating.
17. The composition according to claim 12, which is a factor (PAF) or a cytokine.
〜50mMで、金属塩とのモル濃度比がキレート剤1に
対して金属塩が1〜200である請求項11〜17記載
の組成物。18. The concentration of the chelating agent may be 1 during cell reaction.
The composition according to any one of claims 11 to 17, wherein the metal salt is 1 to 200 at a molar concentration ratio to the metal salt of 1 to 200 mM.
度が、細胞反応時に1〜50U/mlである請求項11
〜18記載の組成物。19. The concentration of an anticoagulant having no chelating ability is 1 to 50 U / ml during a cell reaction.
The composition of any one of claims 18 to 18.
細胞反応時に1〜200mMである請求項11〜19記
載の組成物。20. The concentration of a metal salt containing a divalent cation is:
20. The composition according to claims 11 to 19, which is 1 to 200 mM during a cell reaction.
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