JP4260303B2

JP4260303B2 - Blood processing method and composition

Info

Publication number: JP4260303B2
Application number: JP25624599A
Authority: JP
Inventors: 宏幸永井
Original assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Current assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Priority date: 1999-09-09
Filing date: 1999-09-09
Publication date: 2009-04-30
Anticipated expiration: 2019-09-09
Also published as: JP2001083144A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、キレート剤、キレート能を有しない抗血液凝固剤、および水溶性媒体中で２価陽イオンを溶出しうる金属塩により血液を処理することで、血液細胞を分離することなく、血液細胞反応の決定を再現性良く行うことができる血液の処理方法及び処理用組成物を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液中に含まれる血球として知られているのは、赤血球、好塩基球、好中球、好酸球、リンパ球、単球などであり、これらの細胞は、生体に必要な酸素の運搬及び免疫反応や炎症反応などの生体の防御反応に携わることが良く知られている。
【０００３】
免疫反応や炎症反応は、血球それ自身の貧食作用に代表される細胞自身による外敵や組織への直接の細胞反応や血球が保有していたメディエーターを放出する反応を通じ、そのメディエーターがその他の細胞または、組織に作用することにより行われることが知られている。これら血液中の細胞（血球）から放出されるメディエーターとして、インターロイキン類、例えば、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン９（ＩＬ−９）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍懐死因子（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）を始めとするサイトカイン類や、ヒスタミン、ロイコトリエン、ｐｌａｔｅｌｅｔａｃｔｉｖａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ（ＰＡＦ）、ｍａｊｏｒｂａｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ）、ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｃａｔｉｏｎｉｃｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＣＰ）、ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＥＰＯ）、ｃｈａｒｃｏｔ−ｌｅｙｄｅｎｃｒｙｓｔａｌ（ＣＬＣ）等が知られている。これらメディエーターの血球からの放出は、時として過剰となり、気管支喘息、慢性関節リウマチ、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、糖尿病などの症状を引き起こすことが知られている。従ってこれらの物質量を決定することは、上記の疾患患者の病態を調べることや、治療に用いる薬剤の選択、さらに、疾患の基礎研究の分野において大変重要とされている。
【０００４】
これら、血液中のメディエーター量を測定するための従来の問題点として、再現性がないこと、及び、その操作が簡便でないことが挙げられる。血液中のメディエーターは、その量が極めて微量であるうえ、血液中に存在する多量多雑なタンパク、または、血球成分が測定の精度に悪影響を及ぼすことが知られており、これを回避するためにメディエーターと、その他のタンパク、血球成分を分離して測定する操作を数段階にわたって必要としていた。メディエーターのなかで、ヒスタミン、ロイコトリエンを例として血球からのメディエーターを遊離させる方法を説明すると、血液から白血球を分離して測定する方法として、特許公開番号特開平６−２０５６９５が挙げられる。試験管に被検者からＥＤＴＡ採血した血液と磁石粒子に固着化した抗好塩基球モノクローナル抗体を加え室温で５分間反応を行わせ、好塩基球を血液から分離する。磁性粒子をアビジン固層化マイクロプレートに移し、アレルギーの特異抗原をマイクロプレートのウエル内に分注し、好塩基球からヒスタミンを遊離させる。そのヒスタミンの定量方法として、反応液にビオチン標識ヒスタミン、酵素標識抗ヒスタミン抗体を加え、洗浄後、アビジン固層化抗体に結合した、ビオチン標識ヒスタミン−酵素標識抗ヒスタミン抗体複合体の酵素活性を求めヒスタミン量を測定する方法が開示されている。
【０００５】
また、別な方法としては、血液から白血球を分離して測定するために、ＥＤＴＡ添加条件で採血を行い、４％デキストランを加え赤血球を沈殿させ、白血球浮遊液を分離し、遠心を行い、タイロイド反応液（１２４ｍＭＮａＣｌ、４ｍＭＫＣｌ、０．６４ｍＭＮａＨ₂ ＰＯ₄、１ｍＭＣａＣｌ₂、０．６ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＨＥＰＥＳおよび０．０３％ヒト血清アルブミン）に浮遊させ、遠心、浮遊を繰り返し行い、白血球の洗浄を行う。その浮遊液に、アレルギーの特異抗原液を加え反応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離させる。反応後遠心し、上清を採取し、上清中のヒスタミン遊離量を蛍光法、ＲＩＡ法、ＨＰＬＣ法にて測定を行う方法がよく知られている。
【０００６】
また、別のメディエーターであるロイコトリエンの測定方法では、血液から白血球を分離し、カルシウムイオノフォアーを加え反応を行い、好塩基球からロイコトリエンを遊離させる。そして、プロスタグランジンを含む氷冷アセトニトリル／メタノール／酢酸液を加え反応を停止し、−２０℃で１時間放置後、遠心を行い、反応液中のロイコトリエン量をＨＰＬＣにて測定する方法が知られている。
【０００７】
このように、血球から放出されるメディエーターであるロイコトリエンの測定方法において、ロイコトリエン自身の吸収特性として、２８０ｎｍ付近の吸収を持っているにも関わらず、ロイコトリエンの血中濃度が微量で有り、なおかつ、血中に含まれるタンパクも２８０ｎｍ付近の吸収を持っているために全血中のロイコトリエン量を血液から標的細胞を分離することなく測定することは不可能である。従って、血球から放出されるロイコトリエン量を測定するためには、血中からの標的細胞の分離操作が必要となる。
【０００８】
以上の通り、血球から遊離するメディエーターを測定する方法のほとんどは、血液から血漿、血清や標的細胞を分離する操作が必要である。これは、血液中には、アルブミン、グロブリン、抗体などのタンパクや、ナトリウム、カリウムなどの無機物、糖や脂質などの有機物を含んでいるために、測定対象物を定量しようとする際に用いられる検出系である蛍光法や比色法や発光法における、ブランク値上昇の要因や血中の夾雑物によって反応が阻害されることによる反応特異性（感度）の低下が引き起こされる為である。このように、メディエーターの測定において、目的とするメディエーターと他の血液成分を分離するために数段階にわたる分離操作を必要とするのが一般的で、極めて複雑かつ煩雑な方法であった。
【０００９】
また一方、血液と目的とするメディエーターの分離をより簡便化させた方法として、特開平３−１９９４８による全血を用いて血球からヒスタミンを遊離させる方法が知られている。具体的には、ヘパリン採血した血液２５μｌとアレルゲン溶液２５μｌをグラスファイバーを固定化したマイクロプレートに分注し、３７℃で９０分反応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離させる。ヒスタミンが吸着しているマイクロプレートを洗浄後、蛍光法にて測定を行う方法が開示されている。しかしながら、この方法では、血液成分と目的のメディエーターとの分離が不十分であるため、再現性が悪く、診断に必要とする充分な感度が得られていない。
【００１０】
以上の通り、細胞反応の決定を再現性良く行う際には、目的とする物質とそれ以外の成分を分離しなければならず、被検者から採血した際に、採血管１本１本を遠心し血球を沈降させることによる分離操作や、遠心によって得られた血漿及び血清の他容器への分注操作、あるいは、血球特異的抗体を用いた血液から血球の分離作業が必要とされるなど、操作上大変な手間がかかるとともに測定者の作業時間が伸び、それに伴う、コストをあげる要因ともなっていた。
【００１１】
また、例え、血液成分と目的物質との分離操作を簡略化させた方法があったとしても、血液中の成分の影響により、再現性が悪く、データのバラツキから、その結果と患者の病態とは異なる結果が得られることがあるため、これら細胞反応の決定方法として、血液成分と目的物質の分離ステップを簡略化しうる、簡便かつ再現性の良い血液処理方法が望まれていた。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
細胞反応の決定方法として、簡便かつ再現性の良い血液処理方法を樹立できれば、正確な測定値が得られ、結果として、被検者の病態を正しく反映するとともに、異常値に対する再検査の必要も無くなる。また、測定操作の簡便化ができ、検査センターなどの実施者のコストも大幅に改善できる。このように、再現性向上と簡便化は、この分野の検査を進めていくうえでの必然の要求である。従って、本発明の目的は、血液中の細胞反応の決定方法において、再現性が良く、簡便化が可能となる血液の処理方法及びその処理用組成物を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記問題に対して、鋭意研究を行った結果、血液に、キレート剤、キレート能を有しない抗血液凝固剤、及び水溶性媒体中で２価金属イオンを溶出しうる金属塩を添加することで、前記課題を解決しうることを見出し本発明に至った。
【００１４】
即ち、本発明は、血液に、キレート剤、キレート能を有しない抗血液凝固剤、及び水溶性媒体中で２価陽イオンを溶出しうる金属塩を添加することを特徴とする、細胞反応のための血液処理方法、及び処理用組成物を提供する。
本発明で用いられる血液とは、全血を生理的塩類溶液にて１〜１０倍希釈した血液で有ればよいが、好ましくは全血が望ましい。
【００１５】
本発明におけるキレート剤とは、水溶液中の２価金属イオンと結合する能力を持つ物質で、血液中にモル濃度比として、キレート剤１分子に対して２〜１０倍分子のカルシウムが存在する場合に、室温条件下で１時間以内に血液凝固が起こる物質である。例としては、ＥＤＴＡ、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロ三酢酸、などが挙げられるが、好ましくは、市販されている採血管に含まれているＥＤＴＡ−２Ｎａ、ＥＤＴＡ−２Ｋが好ましく、さらに好ましくは、ＥＤＴＡ−２Ｎａが好ましい。その血液細胞反応時の濃度は、１〜５０ｍＭであれば良く、好ましくは１．５〜１４ｍＭ、より好ましくは２〜３．５ｍＭが好ましい。
【００１６】
本発明におけるキレート能を有しない抗血液凝固剤とは、血液中に１〜１０ｍＭのカルシウムの存在下、または非存在下において、血液凝固が起こらない抗凝固剤のことであり、例えば、２ｍＭのカルシウムの存在下、室温で１時間以内に血液凝固が起こらない抗血液凝固剤である。抗血液凝固剤の例としては、ヘパリン、プラスミン、ヒルジン、アンチトロンビンＩＩＩ、トロンボモジュリン、プロスタグランジン、Ｃｈｉｃａｇｏｂｌｕｅ、Ｇｅｒｍａｎｉｎ、血液凝固因子に対する抗体、血液凝固因子に対するレセプター等が挙げられる。血液凝固因子としては、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子などが有り、それに対する抗体またはレセプターなら何でも良い。これら抗血液凝固剤として、好ましくはヘパリンナトリウム、ヘパリンリチウムなどが挙げられるが、さらに好ましくは、ヘパリンナトリウムが挙げられる。その血液細胞反応時の濃度は、１〜５０Ｕ/ ｍｌ、好ましくは５〜３０Ｕ/ ｍｌが望ましい。ここで、１Ｕとは、日本薬局方に定められた１単位と同等量とする。
【００１７】
また、本発明における２価陽イオンとは、カルシウムイオン（Ｃａ²⁺）、マグネシウムイオン（Ｍｇ²⁺）、マンガンイオン（Ｍｎ²⁺）、亜鉛イオン（Ｚｎ²⁺）、カドミウムイオン（Ｃｄ²⁺）、及び銅イオン（Ｃｕ²⁺）等が挙げられるが、好ましくはカルシウムイオン、あるいは、マグネシウムイオンが好ましい。
水溶液中で２価陽イオンを生じさせうる金属塩としては、塩化物、硫酸塩、炭酸塩、硝酸塩、リン酸塩等が挙げられる。例えば、ＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂、ＭｎＣｌ₂、ＺｎＣｌ₂、ＣｄＣｌ₂、ＣｕＣｌ₂、ＣａＳＯ₄ 、ＭｇＳＯ₄、ＭｎＳＯ₄、ＺｎＳＯ₄、ＣｄＳＯ₄、ＣｕＳＯ₄、Ｃａ（ＮＯ₃）₂、Ｍｇ（ＮＯ₃）₂、Ｍｎ（ＮＯ₃）₂、Ｚｎ（ＮＯ₃）₂、Ｃｄ（ＮＯ₃）₂、Ｃｕ（ＮＯ₃）₂、ＣａＣＯ₃ 、ＭｎＣＯ₃、ＣｄＣＯ₃ 、ＣａＨＰＯ₄、ＭｇＨＰＯ₄、Ｚｎ₃（ＰＯ₄）₂等が挙げられるが、好ましくは、ＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂が望ましい。その血液細胞反応時の濃度は、１〜２００ｍＭが望ましく、キレート剤とのモル濃度比は、キレート剤１分子に対して金属塩が１〜２００倍が良く、好ましくはキレート剤１分子に対して１〜５０倍が望ましい。
【００１８】
本発明で用いられる細胞反応とは、細胞上のタンパク発現反応、細胞からのタンパク等の有機化合物放出反応であり、細胞に何らかの刺激を与えた時、または、何ら刺激を与えていない状態で、細胞の代謝の中で放出されたものであっても構わない。ここで言う細胞の刺激とは、外部から物質を添加し、細胞上の物質との結合、あるいは細胞内への浸透により、細胞内の情報伝達系を活性化することである。情報伝達系としては、タンパク質のリン酸化やプロテアーゼ活性化、または、イノシトール３リン酸による細胞内カルシウム濃度上昇作用があげられる。細胞に何らかの刺激を与えた時の例としては、好塩基球からのヒスタミンやロイコトリエンの放出において、好塩基球上のＦｃεＲＩレセプターに結合したアレルギー特異的ＩｇＥ抗体の２分子とアレルゲンが結合し、アレルギー特異的ＩｇＥ抗体を架橋することにより、細胞内の情報伝達系であるリン酸化酵素が活性化され、細胞内へのカルシウム流入を引き起こし、ヒスタミンなどのメディエーターが放出される例が挙げられる。
【００１９】
また、刺激されていない状態で放出される例としては、好塩基球からのインターロイキン４、インターロイキン８の放出が挙げられる。そして、放出される有機化合物としては、血液細胞から放出されたメディエーターが挙げられる。メディエーターとしては、好塩基球からのヒスタミン、ロイコトリエン、インターロイキン類、ｐｌａｔｅｌｅｔａｃｔｉｖａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ（ＰＡＦ）、好酸球からのＭａｊｏｒｂａｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ）、Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｅｃａｔｉｏｎｉｃｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＣＰ）、Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ｄｅｒｉｖｅｒｅｄｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ（ＥＤＮ），Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＥＰＯ）、Ｃｈａｒｃｏｔ−ｂｅｙｄｅｎｃｒｙｓｔａｌ（ＣＬＣ）、トロンボキサンなどが挙げられるが、好ましくは、好塩基球から遊離されるヒスタミン、ロイコトリエン、ＰＡＦ、インターロイキンが望ましい。
【００２０】
血液の処理方法としては、３つの組成物すなわち、キレート剤、キレート能を有しない抗血液凝固剤、水溶性媒体中で２価陽イオンを溶出しうる金属塩を添加する順序は問わず、いずれの順序で添加しても、再現性良く細胞反応を決定することを可能にするものである。
例えば、採血時にキレート剤のみを添加しておき、細胞反応時にキレート能を有しない抗血液凝固剤、及び水溶性媒体中で２価陽イオンを溶出しうる金属塩を加えても良いし、採血時にキレート能を有しない抗血液凝固剤を添加しておき、細胞反応時にキレート剤、及び水溶性媒体中で２価陽イオンを溶出しうる金属塩を加えても良い。また、採血時にキレート剤、キレート能を有しない抗血液凝固剤、水溶性媒体中で２価陽イオンを溶出しうる金属塩のすべてを添加し、これを用いて細胞反応を行っても良い。
【００２１】
この時のキレート剤、キレート能を有しない抗血液凝固剤、水溶性媒体中で２価陽イオンを溶出しうる金属塩の添加方法としては、粉末であっても、適当な緩衝液中に溶解されていても良い。適当な緩衝液とは、Ｐｉｐｅｓ緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、Ｇｏｏｄ緩衝液などで、細胞の安定化のための至適なｐＨに調整されていることが好ましく、その範囲は５〜１０、好ましくは６〜９に調整されることが望ましい。また、必要に応じて塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、酢酸カリウムの塩や防腐剤としてアジ化ナトリウムを加えても良い。
【００２２】
添加する際の容器の材質に関しては、ポリスチレン、ポリプロピレン、テフロン、ポリエチレン、メチルベンテン樹脂（ＴＰＸ）、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、塩化ビニル樹脂等のプラスティック、ステンレス、チタン等の金属、ガラス及びゴム等何でも用いることができる。容器の色に関しては、透明、半透明、褐色等何でも用いることができる。
【００２３】
具体的な方法として、抗血液凝固剤としてヘパリンを添加した血液に、キレート剤であるＥＤＴＡ及び金属塩として塩化カルシウムを添加し、この組成液に被験者において疑われるアレルゲンを添加し、血液細胞からヒスタミン等のメディエーターを放出させる。そして、その放出されたヒスタミン等を既知の測定法にて直接測定するだけで良い。
【００２４】
ここで言う、アレルゲンとは、アレルギー反応を引き起こす原因物質であり、特異的ＩｇＥ抗体量測定試薬として市販されているアレルゲンやアレルゲン抽出物として市販されているものなど通常検査で用いられているアレルゲンであれば何でも良い。例えば、スギ、カモガヤなどの花粉や、牛乳、卵白などの食物、菌類などが挙げられる。
【００２５】
別の使用例においては、キレート剤であるＥＤＴＡを用い、ＥＤＴＡ採血された血液に、抗凝固剤であるヘパリン及び、金属塩として２価の重金属を添加する。そして、この組成液に上述のごとく、アレルゲンを添加し、血液細胞からメディエーターを放出させ、これを既知の測定法で測定すれば良い。さらに、別の例では、被検者から採血し、その血液にキレート剤であるＥＤＴＡ、抗凝固剤であるヘパリン及び、金属塩として２価の重金属を添加し、この組成液に上述のごとく、アレルゲンを添加し、血液細胞からメディエーターを放出させ、これを既知の測定法で測定すれば良い。
【００２６】
決定方法とは、細胞反応によって放出された有機化合物の量を定量する方法や目視などにより確認する方法である。有機化合物量を定量する方法には、支持体に固着させた担体に目的とする有機化合物を補足させ、検出系により測定する方法や有機化合物をカラムにより分離した後に検出系によって測定する方法が挙げられる。目視により確認する方法とは、細胞反応後の血球の状態を目視により確認する方法である。決定方法として好ましくは、有機化合物を定量する方法が望ましく、より好ましくは、支持体に固着させた担体に有機化合物を補足させる方法が望ましく、さらに好ましくは、有機化合物に特異的な吸着体を用いて測定する方法が望ましい。
【００２７】
ここで言う支持体とは、血球からメディエーターを遊離させる反応を行う容器であり、マイクロプレート、試験管、磁性ビーズなどが挙げられる。支持体の材質に関しては、ポリスチレン、ポリプロピレン、テフロン、ポリエチレン、メチルベンテン樹脂（ＴＰＸ）、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、塩化ビニル樹脂等のプラスティック、ステンレス、チタン等の金属、ガラス及びゴム等何でも用いることができ、また、支持体の色に関しては、褐色、透明、半透明など何でも良い。
【００２８】
また、固着させた担体とは、有機化合物に対して特異的に吸着する物質のことであり、有機化合物に対する抗体やレセプター、グラスファイバーなどが挙げられる。
検出系とは、有機化合物量を測定する方法であり、比色法、蛍光法、発光法、放射活性法などが挙げられ、ＥＩＡ法やＲＩＡ法及び特異的に吸着する担体を用いて測定する方法である。
【００２９】
ここで言うＥＩＡ法とは、メディエータに対する抗体を支持体に固定化し、標識酵素の活性によりメディエーター量を測定する酵素免疫測定方法である。例えば、ＥＩＡ法を用いた細胞反応によって放出された有機化合物の決定方法として、好塩基球から放出されるヒスタミンの測定では、市販されているキットの方法によって測定できる。例えば次のように行う。被検者からヘパリン採血した血液とアレルギー特異的抗原溶液と反応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離させる。遊離したヒスタミンとアシル化試薬を反応させ、ヒスタミンをアシル化する。次に、ヒスタミンの定量方法として、抗アシル化ヒスタミン抗体を固層化したマイクロプレートにアシル化したヒスタミンと酵素標識したヒスタミンを添加し反応を行い、標識酵素活性を測定することによって抗アシル化ヒスタミン抗体に結合した酵素標識ヒスタミン量を求め、そこから、アシル化ヒスタミン量を求める方法である。
【００３０】
また、他のヒスタミン測定方法では、特開平６−２０５６９５によると、血液１０ｍｌにＨＡ−ＨＥＰＥＳ緩衝液４０ｍｌを加え、血液を希釈した後、試験管に５００μｌずつ分注し、これに、好塩基球と反応するモノクローナル抗体を固着させた磁性粒子５０μｌを加え、室温で５分間反応を行い、モノクローナル抗体と好塩基球の結合反応を行う。続いて磁石でビーズを集め上清を除いた後、緩衝液にて１回洗浄を行う。そして、磁性粒子をアビジン固層化マイクロプレートに移し、アレルギー特異的抗原溶液と反応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離させる。その時に、反応液にビオチン標識ヒスタミン、酵素標識抗ヒスタミン抗体を同時に加えておく。洗浄後、アビジン固層化抗体に結合したビオチン標識ヒスタミン−酵素標識抗ヒスタミン抗体複合体の酵素活性を求めヒスタミン量を測定する方法が開示されている。
【００３１】
また、他の有機化合物であるロイコトリエンは、市販されているキットの方法による抗ロイコトリエン抗体を用いたＥＩＡ法によって測定可能である。また、他の血球から放出される有機化合物であるインターロイキン３は、市販されているキットの方法によって測定できる。例えば、次のように行う。抗インターロイキン３抗体を固層化したマイクロプレートに血漿又は血清を添加し反応を行い、固層化抗体とインターロイキン３を結合させる。反応液を洗浄後、酵素標識抗インターロイキン３抗体を加え、反応を行い、インターロイキン３と酵素標識抗インターロイキン３を結合させる。そして標識抗体の酵素活性を測定することによってインターロイキン３の量を測定する方法である。また、他のインターロイキンであるインターロイキン６では、特開平１−２７１８６２よれば、抗−インターロイキン６モノクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに血清を加え、室温で２〜３時間放置し、固層化抗体とインターロイキン６を結合させる。反応液を除去後、洗浄を行った後、ビオチン化抗インターロイキン６ポリクロナル抗体を加え３７℃１時間反応を行い、インターロイキン６とビオチン化抗体を結合させる。次に、酵素標識ストレプトアビジンを加え、３７℃３０分放置し、ビオチン化抗体と酵素標識ストレプトアビジンを結合させ、反応液を除去後、３回以上洗浄を行った後、定量系として、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを加え、遊離した４−メチルウンベリフェロンの蛍光強度を測定する方法が開示されている。
【００３２】
ここで言うＲＩＡ法とは、放射性標識体を用いた免疫測定法である。例えば、ＲＩＡ法を用いた細胞反応によって放出された有機化合物の決定方法として、好塩基球から放出されるヒスタミンの測定では（臨床検査 vol.26 no.2 1982/2) 、例えば、次のように行う。ＥＤＴＡ添加条件にて採血後、遠心によって血漿を分離する。アシル化試薬チューブに血漿又は標準ヒスタミンとアシル化緩衝液を加え、血漿中のヒスタミンをアシル化する。次に¹²⁵Ｉ標識ヒスタミンを加え抗ヒスタミン抗体固層化チューブ内で反応させる。反応後、反応液を除去し、抗ヒスタミン抗体チューブに結合した放射能を測定することにより血漿中のヒスタミン量を求める方法が報告されている。
【００３３】
他の有機化合物であるロイコトリエンの測定においては、試料または標準の非標識ロイコトリエン、抗ロイコトリエン抗体、³Ｈ標識ロイコトリエンを４℃、５〜２４時間反応させた後、デキストランチャーコールと氷中１０分間反応させる。遠心後、上清を分取し、放射活性を測定することによりロイコトリエンの量を求める。
【００３４】
また、他の有機化合物であるＰＡＦの測定は、試料または標準の非標識ＰＡＦ、抗ＰＡＦ抗体、¹²⁵Ｉ標識ＰＡＦと２次抗体を室温で、５〜２４時間反応させた後、遠心分離で得られた沈殿物の放射活性を測定することによりＰＡＦの量を求める。
好酸球から遊離する有機化合物であるＥＣＰの測定方法については、市販されているキットでは次のように行われる。抗凝固剤存在下で採血を行い、遠心によって血漿又は血清に分離し、標準ＥＣＰ及び検体を５０μｌずつ試験管にとり、¹²⁵Ｉ標識ヒトＥＣＰとウサギ抗ヒトＥＣＰ抗体を５０μｌずつ加え、室温で１晩インキュベートする。これにヒツジ抗ウサギＩｇＧ抗体２ｍｌを加え室温で３０分インキュベート後、遠心にて上清を除去し、沈殿物のγカウンターを測定することによりＥＣＰ量を測定する方法が知られている。
【００３５】
ここで言う、有機化合物をカラムにより分離した後に検出系によって測定する方法とは、イオン性、疎水性、親和性などのメディエーターの物性を利用し、樹脂を充填したカラムにより、メディエーターを分離する方法であり、ＨＰＬＣ法が挙げられる。
ＨＰＬＣ法を用いた有機化合物の決定方法として、例えば、特開平６−２０５６９５によるヒスタミンの測定法があげられる。例えば、次のように行う、陽イオン交換樹脂を充填したカラムに試料を通じ、ヒスタミンを分離した後に、０．１％オルトフタルアルデヒドとＮａＯＨを加え、ヒスタミン−オルトフタルアルデヒド結合反応を行いヒスタミンを蛍光体として、ＨＣｌを加え、反応を停止し、蛍光強度を測定することによってヒスタミン遊離量を測定する方法が報告されている。また、他の有機化合物であるロイコトリエンの測定においては、血液から白血球を分離し、カルシウムイオノフォアーを加え好塩基球からロイコトリエンを放出させ、プロスタグランジンを含む氷冷アセトニトリル／メタノール／酢酸液で反応を停止し、−２０℃で１時間放置後、遠心、逆層クロマトグラフィでロイコトリエンの分離を行って、ロイコトリエンの吸収特性である２８０ｎｍの吸収を測定し、ロイコトリエン量を測定する方法である。
【００３６】
ここで言う有機化合物を特異的に吸着する担体とは、グラスファイバー、抗体、酵素、レセプター、レクチンなどが挙げられる。
有機化合物を特異的に吸着する担体を用いて測定する方法としては特開平３−１９９４８が挙げられ、血球から遊離されるヒスタミンの測定において、ヘパリン採血した血液とアレルゲンをグラスファイバーを固定化したマイクロプレートに分注し、好塩基球からヒスタミンを放出させ、グラスファイバーに結合したヒスタミン量を蛍光法にて測定する方法が開示されている。
【００３７】
【発明の実施の形態】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００３８】
【実施例１】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対し、ＥＤＴＡナトリウム濃度がヒスタミン遊離反応時に１ｍＭになるようにＥＤＴＡナトリウム（同人化学社製）を添加した血液２５μｌとヒスタミン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム（和光純薬工業社製）、７０ｍＭ酢酸ナトリウム（和光純薬工業社製）、２．５ｍＭ酢酸カリウム（和光純薬工業社製）、１０Ｕ／ｍｌヘパリンナトリウム（ヘキスト・マリオン・ルセル社）及び、０．００５％アジ化ナトリウム（和光純薬工業社製）を含むＰｉｐｅｓ緩衝液（同人化学社製）（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ抗体溶液（ＤＡＫＯ社製）２５μｌをグラスファイバーを固定化したマイクロプレートに分注し、３７℃９０分間反応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離させた。反応後、マイクロプレートを洗浄し、界面活性剤を２００μｌ添加し３７℃６０分反応させ、グラスファイバーに付着した血液中の夾雑物を洗浄する。その後、水酸化ナトリウム（和光純薬工業社製）で調整した０．０５％オルトフタルアルデヒド溶液（和光純薬工業社製）を７５μｌ分注し、蛍光体を形成した後、０．６％過塩素酸（和光純薬工業社製）７５μｌを分注して反応を停止し、蛍光強度を測定しヒスタミン標準液よりヒスタミン量を求めた。試験は５回行い、標準偏差を平均値で割った値を１００倍し、ＣｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆＶａｒｉａｔｉｏｎ（ＣＶ）（％）を求めた。その結果ＣＶ値は７．８％であった。
【００３９】
【実施例２】
ＥＤＴＡナトリウム濃度が、ヒスタミン遊離反応時に１、２５、５０ｍＭである以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は９％、８．５％、９．７％、であった。
【００４０】
【比較例１】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対し、ヘパリンナトリウム濃度がヒスタミン遊離反応時に１０Ｕ／ｍｌになるようにヘパリンナトリウムを添加した血液２５μｌとヒスタミン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ抗体溶液２５μｌを用いて実施例１と同様の方法にてヒスタミンの測定を行った。その結果、ＣＶ値は１２３％であり、ＥＤＴＡナトリウム濃度１〜５０ｍＭの範囲では、実施例１の結果と合わせ、ＣＶ値が７．８〜９％と低下した。ばらつきの程度を表すＣＶ値が有意に低下する結果から明らかなように、ＥＤＴＡナトリウム濃度１〜５０ｍＭの添加によって、細胞反応の再現性が向上した。
【００４１】
【実施例３】
塩化カルシウム濃度が、ヒスタミン遊離反応時に１、１００、２００ｍＭである以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は８．５％、８．５％、８．３％であった。
【００４２】
【比較例２】
塩化カルシウム濃度が、ヒスタミン遊離反応時に０ｍＭである以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、１５０％であり、カルシウム濃度１〜２００ｍＭの範囲では、実施例１の結果と合わせ、ＣＶ値が７．８〜８．５％へと低下した。この結果から明らかなように、カルシウム濃度１〜２００ｍＭの範囲内において、細胞反応の再現性が向上した。
【００４３】
【実施例４】
ヘパリンナトリウム濃度が、ヒスタミン遊離反応時に１、２０、５０Ｕ／ｍｌである以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、８．３％、８．０％、８．４％であった。
【００４４】
【比較例３】
ヘパリンナトリウム濃度が、ヒスタミン遊離反応時に０ｍＭである以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、１４３％であり、ヘパリンナトリウム濃度１〜５０Ｕ／ｍｌの範囲では、実施例１の結果と合わせ、ＣＶ値が７．８〜８．４％へと低下した。この結果から明らかなように、ヘパリン濃度１〜５０Ｕ／ｍｌの範囲内において、細胞反応の再現性が向上した。
【００４５】
【実施例５】
ＥＤＴＡナトリウムが、クエン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）である以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、８．２％であった。
【００４６】
【実施例６】
ＥＤＴＡナトリウムが、シュウ酸ナトリウム（和光純薬工業社製）である以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、８．１％であった。実施例１、実施例５、実施例６、比較例１の結果から、キレート剤が、ＥＤＴＡナトリウム、クエン酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウムであっても、ＣＶ値が７．８〜８．２％と低下し、細胞反応の再現性が向上した。
【００４７】
【実施例７】
ヘパリンナトリウムが、プラスミン（和光純薬工業社製）である以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、８．９％であった。
【００４８】
【実施例８】
ヘパリンナトリウムが、トロンビン（和光純薬工業社製）である以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、８．６％であった。実施例１、実施例７、実施例８、比較例２の結果から、キレート能を有しない抗血液凝固剤が、ヘパリンナトリウム、プラスミン、トロンビンであっても、ＣＶ値が７．８〜８．９％と低下し、細胞反応の再現性が向上した。
【００４９】
【実施例９】
塩化カルシウムが、塩化マグネシウム（和光純薬工業社製）である以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、９．７％であった。
【００５０】
【実施例１０】
塩化カルシウムが、塩化マンガン（和光純薬工業社製）である以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、９．９％であった。実施例１、実施例９、実施例１０、比較例３の結果から、２価陽イオンがカルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオンであっても、ＣＶ値が７．８〜９．９％と低下し、細胞反応の再現性が向上した。
【００５１】
【実施例１１】
塩化カルシウムが、硫酸カルシウム（和光純薬工業社製）である以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、９．３％であった。
【００５２】
【実施例１２】
塩化カルシウムが、炭酸カルシウム（和光純薬工業社製）である以外は実施例１と同様の方法にて試験を行った。その結果ＣＶ値は、９．５％であった。実施例１、実施例１１、実施例１２、比較例３の結果から、金属塩が塩化物、硫酸塩、炭酸塩であっても、ＣＶ値が７．８〜９．５％と低下し、細胞反応の再現性が向上した。
【００５３】
【実施例１３】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対し、ヒスタミン遊離反応時にＥＤＴＡナトリウム濃度が１ｍＭ、ヘパリンナトリウム濃度が１０Ｕ／ｍｌになるように、ＥＤＴＡナトリウムとヘパリンナトリウムを添加した血液２５μｌとヒスタミン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ抗体溶液２５μｌを用いて実施例１と同様の方法にてヒスタミンの測定を行った。その結果、ＣＶ値が８．０％であり、実施例１のＣＶ値７．８％と同等の結果が得られた。この結果から明らかなように、キレート剤、キレート能を有さない抗血液凝固剤を血液に同時に添加しても、細胞反応の再現性が向上した。
【００５４】
【実施例１４】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対し、ヒスタミン遊離反応時にヘパリンナトリウム濃度が１０Ｕ／ｍｌになるようにヘパリンナトリウムを添加した血液２５μｌとヒスタミン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭＥＤＴＡナトリウム及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ抗体溶液２５μｌを用いて実施例１と同様の方法にてヒスタミンの測定を行った。その結果、ＣＶ（％）が８．０％であり、実施例１のＣＶ値７．８％と同等の結果が得られた。この結果から明らかなように、血液にキレート能を有さない抗血液凝固剤を添加し、緩衝液にキレート剤と金属塩を添加しても、細胞反応の再現性が向上した。
【００５５】
【実施例１５】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対しＥＤＴＡナトリウム濃度がヒスタミン遊離反応時に１、２５、５０ｍＭになるようにＥＤＴＡナトリウムを添加した血液５０μｌとヒスタミン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、１０Ｕ／ｍｌヘパリンナトリウム及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ溶液５０μｌをプラスチックチューブに分注し、３７℃９０分間反応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離させる。その後、遠心を行い、血球を除去した後、遊離したヒスタミンとアシル化試薬を反応させ、ヒスタミンをアシル化する。抗アシル化ヒスタミン抗体を固層化したマイクロプレートにアシル化したヒスタミンと酵素標識ヒスタミン２００μｌを添加し５度で１８時間反応を行い、洗浄後、酵素基質２００μｌを加え２５度で反応を行い、３０分後、反応停止液５０μｌを加え、４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ＣＶ値は９．２％、８．８％、９．５％であった。
【００５６】
【比較例４】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対し、ヘパリンナトリウム濃度がヒスタミン遊離反応時に１０Ｕ／ｍｌになるようにヘパリンナトリウムを添加した血液５０μｌとヒスタミン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ抗体溶液５０μｌを用いて実施例１５と同様の方法にてヒスタミンの測定を行った。その結果、ＣＶ値は１４０％であり、ＥＤＴＡナトリウム濃度１〜５０ｍＭの範囲では、ＣＶ値が８．８〜９．５％と低下した。この結果から明らかなように、ＥＤＴＡナトリウム濃度１〜５０ｍＭの範囲内において、細胞反応の再現性が向上した。
【００５７】
【実施例１６】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対しＥＤＴＡナトリウム濃度がヒスタミン遊離反応時に１、２５、５０ｍＭになるようにＥＤＴＡナトリウムを添加した３種類の血液それぞれ５０μｌとヒスタミン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、１０Ｕ／ｍｌヘパリンナトリウム及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ溶液２５μｌをチューブに分注し、３７℃、９０分間反応を行い、好塩基球からヒスタミンを遊離させる。その後、遠心を行い、血球を除去した後、アシル化試薬チューブに遊離したヒスタミン５００μｌと標準ヒスタミンμｌとアシル化緩衝液５０μｌを加え、遊離したヒスタミンをアシル化する。次に¹²⁵Ｉ標識ヒスタミン１ｍｌを加え抗ヒスタミン抗体固層化チューブ内で４度、１６時間反応させる。反応後、反応液を除去し、抗ヒスタミン抗体チューブに結合した放射能を測定した。その結果、ＣＶ値は、９．３％、９．０％、９．５％であった。
【００５８】
【比較例５】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるヒスタミンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対し、ヘパリンナトリウム濃度がヒスタミン遊離反応時に１０Ｕ／ｍｌになるようにヘパリンナトリウムを添加した血液２５μｌとヒスタミン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ抗体溶液２５μｌを用いて実施例１６と同様の方法にてヒスタミンの測定を行った。その結果、ＣＶ値は１４０％であり、ＥＤＴＡナトリウム濃度１〜５０ｍＭの範囲では、ＣＶ値が９〜９．５％と低下した。この結果から明らかなように、ＥＤＴＡナトリウム濃度１〜５０ｍＭの範囲内において、細胞反応の再現性が向上した。
【００５９】
【実施例１７】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるロイコトリエンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対しＥＤＴＡナトリウム濃度がロイコトリエン遊離反応時に１、２５、５０ｍＭになるようにＥＤＴＡナトリウムを添加した３種類の血液それぞれ２５μｌとロイコトリエン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、１０Ｕ／ｍｌヘパリン及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ溶液２５μｌをチューブに分注し、３７℃、９０分間反応を行い、好塩基球からロイコトリエンを遊離させる。その後、遠心を行い、血球を除去した後、プロスタグランジンを含む氷冷アセトニトリル／メタノール／酢酸液で反応を停止し、−２０℃で１時間放置後、遠心、逆層クロマトグラフィでロイコトリエンの分離を行って、ロイコトリエンの吸収特性である２８０ｎｍの吸収を測定し、ロイコトリエン量の測定を行った。その結果、ＣＶ値は、それぞれ、８．１％、８．８％、９．３％であった。
【００６０】
【比較例６】
健常人ボランティア血液１例を用いて、血球から遊離されるロイコトリエンの測定を行った。採血時に血液５ｍｌに対し、ヘパリンナトリウム濃度がヒスタミン遊離反応時に１０Ｕ／ｍｌになるようにヘパリンナトリウムを添加した血液２５μｌとロイコトリエン遊離反応時の濃度として、５０ｍＭ塩化カルシウム、７０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸カリウム、及び、０．００５％アジ化ナトリウムを含むＰｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）にて調整したヒト抗ＩｇＥ抗体溶液２５μｌを用いて実施例１７と同様の方法にてロイコトリエンの測定を行った。その結果、ＣＶ値は１２０％であり、ＥＤＴＡナトリウム濃度１〜５０ｍＭの範囲では、実施例１７の結果と合わせ、ＣＶ値が８．１〜９．３％と低下した。この結果から明らかなように、ＥＤＴＡナトリウム濃度１〜５０ｍＭの範囲内において、細胞反応の再現性が向上した。
【００６１】
【発明の効果】
本発明は、血液細胞反応の決定方法において、血液、キレート剤、キレート能を有しない抗血液凝固剤、及び水溶性媒体中で２価陽イオンを溶出しうる金属塩からなる群より組み合わせた組成物を用いた血液処理により、血液を分離することなく細胞機能を再現性よく測定できることを示したものである。従って本発明の効果は、細胞機能検査の再現性を高めることができる効果、操作の簡便化による作業者の作業時間軽減及びそれに伴うコストを低下させる効果が期待される。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention treats blood with a chelating agent, an anti-blood coagulant that does not have chelating ability, and a metal salt that can elute divalent cations in an aqueous medium without separating blood cells. The present invention provides a blood processing method and a processing composition capable of determining a cell reaction with high reproducibility.
[0002]
[Prior art]
Known blood cells in the blood are erythrocytes, basophils, neutrophils, eosinophils, lymphocytes, monocytes, etc., and these cells transport oxygen necessary for the body and It is well known to be involved in biological defense reactions such as immune reactions and inflammatory reactions.
[0003]
Immune and inflammatory reactions are caused by the cell itself, which is represented by the phagocytosis of the blood cell itself, by direct cell reaction to external enemies and tissues and by the release of the mediator that the blood cell possessed. Alternatively, it is known to be performed by acting on a tissue. As mediators released from these blood cells (blood cells), interleukins such as interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 3 (IL-3), interleukin 4 (IL-4), interleukin 5 (IL-5), interleukin 6 (IL-6), interleukin 7 (IL-7), interleukin 8 (IL-8), interleukin 9 (IL-9) ), Interleukin 10 (IL-10), interleukin 13 (IL-13), interferon-α (IFN-α), interferon-β (IFN-β), interferon-γ (IFN-γ), tumor necrosis Cytokines including factors (TNF-α, TNF-β), histamine, leukotrienes, platelets ctivating factor (PAF), major basic protein (MBP), eosinophil cationic protein (ECP), eosinophil peroxidase (EPO), charcot-leyden crystal (CLC) and the like are known. Release of these mediators from blood cells is sometimes excessive and is known to cause symptoms such as bronchial asthma, rheumatoid arthritis, allergic rhinitis, atopic dermatitis and diabetes. Therefore, it is very important to determine the amount of these substances in the fields of investigating the pathology of the above-mentioned disease patients, selection of drugs used for treatment, and basic research of diseases.
[0004]
These conventional problems for measuring the amount of mediator in the blood include the lack of reproducibility and the inconvenient operation. In order to avoid mediators in blood, it is known that the amount of mediators in blood is extremely small, and that a large amount of complex proteins or blood cell components present in blood adversely affect measurement accuracy. In addition, it required several steps to separate and measure the mediator, other proteins, and blood cell components. Among the mediators, histamine and leukotriene are used as an example to explain a method for releasing mediators from blood cells. As a method for separating and measuring leukocytes from blood, Japanese Patent Publication No. 6-205695 can be cited. Blood collected from EDTA from a subject and anti-basophil monoclonal antibody immobilized on magnet particles are added to a test tube and allowed to react at room temperature for 5 minutes to separate basophils from blood. The magnetic particles are transferred to an avidin-layered microplate, the allergic specific antigen is dispensed into the wells of the microplate, and histamine is released from basophils. As a quantification method for the histamine, biotin-labeled histamine and enzyme-labeled antihistamine antibody were added to the reaction solution, washed, and then the enzyme activity of the biotin-labeled histamine-enzyme-labeled antihistamine antibody complex bound to the avidin-immobilized antibody was determined. A method for measuring the amount of histamine is disclosed.
[0005]
As another method, in order to separate and measure leukocytes from blood, blood is collected under the conditions of adding EDTA, 4% dextran is added to precipitate red blood cells, leukocyte suspension is separated, centrifuged, and tyroid. Reaction solution (124 mM NaCl, 4 mM KCl, 0.64 mM NaH ₂ PO _Four 1 mM CaCl ₂ 0.6 mM MgCl ₂ 10 mM HEPES and 0.03% human serum albumin), and centrifugation and suspension are repeated to wash leukocytes. The allergic specific antigen solution is added to the suspension and reacted to release histamine from basophils. A well-known method is to centrifuge after the reaction, collect the supernatant, and measure the amount of histamine released in the supernatant by the fluorescence method, RIA method, or HPLC method.
[0006]
In another method for measuring leukotriene, which is a mediator, leukocytes are separated from blood, reacted with calcium ionophore, and released from basophils. Then, an ice-cold acetonitrile / methanol / acetic acid solution containing prostaglandin is added to stop the reaction, and the mixture is allowed to stand at −20 ° C. for 1 hour and then centrifuged, and the amount of leukotriene in the reaction solution is measured by HPLC. It has been.
[0007]
Thus, in the method for measuring leukotriene, which is a mediator released from blood cells, the leukotriene itself has an absorption characteristic in the vicinity of 280 nm, but the leukotriene has a very low blood concentration, and Since proteins contained in blood also have absorption around 280 nm, it is impossible to measure the amount of leukotriene in whole blood without separating target cells from blood. Therefore, in order to measure the amount of leukotriene released from blood cells, it is necessary to separate target cells from blood.
[0008]
As described above, most methods for measuring mediators released from blood cells require an operation for separating plasma, serum and target cells from blood. This is used when quantifying a measurement object because blood contains proteins such as albumin, globulin, and antibodies, inorganic substances such as sodium and potassium, and organic substances such as sugars and lipids. This is because, in the fluorescence method, the colorimetric method, and the luminescence method which are detection systems, the reaction specificity (sensitivity) is lowered due to the cause of an increase in the blank value and the reaction being inhibited by contaminants in the blood. As described above, in the measurement of mediators, it is a general and extremely complicated and complicated method that requires several steps of separation operations to separate the target mediator from other blood components.
[0009]
On the other hand, as a method for further simplifying the separation of blood and the desired mediator, a method for releasing histamine from blood cells using whole blood according to JP-A-3-19948 is known. Specifically, 25 μl of heparin collected blood and 25 μl of allergen solution are dispensed on a microplate on which glass fibers are immobilized, and reacted at 37 ° C. for 90 minutes to release histamine from basophils. A method is disclosed in which measurement is performed by a fluorescence method after washing a microplate on which histamine is adsorbed. However, in this method, since the separation between the blood component and the target mediator is insufficient, reproducibility is poor and sufficient sensitivity required for diagnosis is not obtained.
[0010]
As described above, when determining the cell reaction with high reproducibility, it is necessary to separate the target substance from the other components. Separation operation by centrifugation and sedimentation of blood cells, dispensing operation of plasma and serum obtained by centrifugation into other containers, or separation of blood cells from blood using blood cell specific antibodies, etc. are required As a result, it takes a lot of time and effort for the operator, and the work time of the measurer is increased, which has been a factor in raising costs.
[0011]
In addition, even if there is a method that simplifies the separation operation of blood components and target substances, the reproducibility is poor due to the influence of blood components, and the results and patient pathology Since different results may be obtained, a simple and reproducible blood treatment method capable of simplifying the separation step of the blood component and the target substance has been desired as a method for determining these cellular reactions.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
If a simple and highly reproducible blood treatment method can be established as a method for determining the cellular response, accurate measurement values can be obtained.As a result, the patient's pathology is correctly reflected, and reexamination for abnormal values is also necessary. Disappear. In addition, the measurement operation can be simplified, and the cost of a practitioner such as an inspection center can be greatly improved. Thus, improvement of reproducibility and simplification are inevitable requirements for proceeding with inspections in this field. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a blood processing method and a composition for the processing which can be easily reproducible and simplified in a method for determining a cellular reaction in blood.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
As a result of earnest research on the above problems, the present inventor has found that a chelating agent, an anti-blood coagulant having no chelating ability, and a metal salt capable of eluting divalent metal ions in an aqueous medium. The inventors have found that the above-mentioned problems can be solved by the addition of No. 1, and have reached the present invention.
[0014]
That is, the present invention provides a cell reaction characterized by adding a chelating agent, an anticoagulant having no chelating ability, and a metal salt capable of eluting divalent cations in an aqueous medium to blood. A blood treatment method and a treatment composition are provided.
The blood used in the present invention may be blood obtained by diluting whole blood with a physiological salt solution 1 to 10 times, preferably whole blood.
[0015]
The chelating agent in the present invention is a substance having the ability to bind to a divalent metal ion in an aqueous solution, and when 2 to 10 times the molecule of calcium is present in the blood as a molar concentration ratio to one molecule of the chelating agent. Furthermore, it is a substance that causes blood coagulation within 1 hour under room temperature conditions. Examples include EDTA, citric acid, oxalic acid, crown ether, nitrilotriacetic acid, etc., preferably EDTA-2Na and EDTA-2K contained in commercially available blood collection tubes are preferred. EDTA-2Na is preferable. The concentration at the time of the blood cell reaction may be 1 to 50 mM, preferably 1.5 to 14 mM, more preferably 2 to 3.5 mM.
[0016]
The anticoagulant having no chelating ability in the present invention is an anticoagulant that does not cause blood coagulation in the presence or absence of 1 to 10 mM calcium in the blood. It is an anticoagulant that does not cause blood clotting within 1 hour at room temperature in the presence of calcium. Examples of anticoagulants include heparin, plasmin, hirudin, antithrombin III, thrombomodulin, prostaglandins, Chicago blue, Germanin, antibodies against blood coagulation factors, receptors for blood coagulation factors, and the like. Examples of blood coagulation factors include Factor VIII, Factor VII, Factor IX, Factor X, Factor XI, Factor XII, Factor XIII, etc. Any antibody or receptor may be used. As these anticoagulants, heparin sodium, heparin lithium and the like are preferable, and heparin sodium is more preferable. The concentration during the blood cell reaction is 1 to 50 U / ml, preferably 5 to 30 U / ml. Here, 1U is an amount equivalent to 1 unit determined by the Japanese Pharmacopoeia.
[0017]
The divalent cation in the present invention is a calcium ion (Ca ²⁺ ), Magnesium ion (Mg ²⁺ ), Manganese ions (Mn ²⁺ ), Zinc ion (Zn ²⁺ ), Cadmium ion (Cd ²⁺ ), And copper ions (Cu ²⁺ ) And the like, preferably calcium ions or magnesium ions.
Examples of the metal salt capable of generating a divalent cation in an aqueous solution include chloride, sulfate, carbonate, nitrate, phosphate and the like. For example, CaCl ₂ MgCl ₂ , MnCl ₂ ZnCl ₂ , CdCl ₂ , CuCl ₂ , CaSO _Four , MgSO _Four , MnSO _Four ZnSO _Four , CdSO _Four , CuSO _Four , Ca (NO _Three ) ₂ , Mg (NO _Three ) ₂ , Mn (NO _Three ) ₂ , Zn (NO _Three ) ₂ , Cd (NO _Three ) ₂ , Cu (NO _Three ) ₂ , CaCO _Three , MnCO _Three , CdCO _Three , CaHPO _Four , MgHPO _Four , Zn _Three (PO _Four ) ₂ Etc., preferably CaCl ₂ MgCl ₂ Is desirable. The concentration at the time of the blood cell reaction is desirably 1 to 200 mM, and the molar concentration ratio with the chelating agent is preferably 1 to 200 times the metal salt to one molecule of the chelating agent, preferably to one molecule of the chelating agent. 1 to 50 times is desirable.
[0018]
The cell reaction used in the present invention is a protein expression reaction on a cell, an organic compound release reaction such as a protein from the cell, and when a stimulus is given to the cell or in a state where no stimulus is given, It may be released during cell metabolism. Cell stimulation here refers to activating an information transmission system in a cell by adding a substance from outside and binding to the substance on the cell or penetrating into the cell. Examples of the information transmission system include protein phosphorylation and protease activation, or an action of increasing intracellular calcium concentration by inositol triphosphate. For example, when cells are given some kind of stimulation, in the release of histamine or leukotriene from basophils, allergen-specific IgE antibody bound to FcεRI receptor on basophils binds to the allergen. Examples include cross-linking specific IgE antibodies, which activates phosphorylase, which is an intracellular signal transduction system, causes calcium influx into cells and releases mediators such as histamine.
[0019]
Examples of the release in an unstimulated state include the release of interleukin 4 and interleukin 8 from basophils. And as a discharge | released organic compound, the mediator released | released from the blood cell is mentioned. Mediators include histamine from basophils, leukotrienes, interleukins, platelet activating factor (PAF), major basic protein (MBP) from eosinophils, Eosinophilic protein (ECP), , Eosinophil peroxidase (EPO), Charcot-beydencrystal (CLC), thromboxane, and the like, preferably histamine, leukotriene, PAF, and interleukin released from basophils.
[0020]
The blood treatment method includes three compositions, ie, a chelating agent, an anti-blood coagulant having no chelating ability, and a metal salt capable of eluting divalent cations in an aqueous medium, regardless of the order of addition. Even in this order, the cell reaction can be determined with good reproducibility.
For example, only a chelating agent may be added at the time of blood collection, an anticoagulant that does not have chelating ability at the time of cell reaction, and a metal salt that can elute divalent cations in an aqueous medium may be added. Sometimes an anti-coagulant having no chelating ability is added, and a chelating agent and a metal salt capable of eluting divalent cations in an aqueous medium may be added during cell reaction. Further, a chelating agent, an anti-blood coagulant having no chelating ability, and a metal salt capable of eluting divalent cations in an aqueous medium may be added at the time of blood collection, and a cell reaction may be performed using this.
[0021]
At this time, as a method of adding a chelating agent, an anti-blood coagulant having no chelating ability, or a metal salt capable of eluting divalent cations in an aqueous medium, even if it is a powder, it can be dissolved in an appropriate buffer. May be. Suitable buffers are Pipes buffer, phosphate buffer, acetate buffer, Good buffer, etc., and the pH is preferably adjusted to an optimum pH for cell stabilization. It is desirable to adjust to -10, preferably 6-9. If necessary, sodium azide may be added as a salt of sodium chloride, sodium acetate, potassium chloride, potassium acetate or a preservative.
[0022]
Regarding the material of the container at the time of addition, polystyrene, polypropylene, Teflon, polyethylene, methylbenten resin (TPX), fluororesin, acrylic resin, polycarbonate, polyurethane, vinyl chloride resin and other metals, metals such as stainless steel and titanium, glass Anything such as rubber can be used. Any color such as transparent, translucent or brown can be used for the color of the container.
[0023]
As a specific method, EDTA which is a chelating agent and calcium chloride as a metal salt are added to blood to which heparin is added as an anticoagulant, and an allergen suspected in a subject is added to this composition solution, and histamine is extracted from blood cells. Release mediators. Then, it is only necessary to directly measure the released histamine or the like by a known measurement method.
[0024]
The allergen mentioned here is a causative substance that causes an allergic reaction, and is an allergen that is used in normal tests such as an allergen that is commercially available as a reagent for measuring the amount of specific IgE antibody or an allergen extract. Anything is fine. Examples thereof include pollen such as cedar and camogaya, food such as milk and egg white, and fungi.
[0025]
In another example of use, EDTA that is a chelating agent is used, and heparin that is an anticoagulant and a divalent heavy metal as a metal salt are added to blood collected by EDTA. Then, as described above, an allergen is added to this composition solution to release the mediator from blood cells, and this may be measured by a known measurement method. Furthermore, in another example, blood is collected from a subject, EDTA as a chelating agent, heparin as an anticoagulant, and a divalent heavy metal as a metal salt are added to the blood, and as described above, What is necessary is just to add an allergen, to release a mediator from a blood cell, and to measure this by a known measuring method.
[0026]
The determination method is a method of quantifying the amount of an organic compound released by a cell reaction or a method of confirming by visual observation. Examples of the method for quantifying the amount of the organic compound include a method in which a carrier fixed to a support is supplemented with a target organic compound and the measurement is performed by a detection system, and a method in which the organic compound is separated by a column and then measured by a detection system. It is done. The method of visually confirming is a method of visually confirming the state of blood cells after cell reaction. The determination method is preferably a method of quantifying the organic compound, more preferably a method of capturing the organic compound on a carrier fixed to the support, and more preferably using an adsorbent specific to the organic compound. The measurement method is desirable.
[0027]
The term “support” as used herein refers to a container that performs a reaction for releasing a mediator from blood cells, and examples thereof include a microplate, a test tube, and a magnetic bead. Regarding the material of the support, polystyrene, polypropylene, Teflon, polyethylene, methylbenten resin (TPX), fluororesin, acrylic resin, polycarbonate, polyurethane, vinyl chloride resin and other metals, stainless steel, titanium and other metals, glass and rubber, etc. Anything can be used, and any color such as brown, transparent or translucent may be used as the color of the support.
[0028]
Further, the fixed carrier is a substance that specifically adsorbs to an organic compound, and examples thereof include antibodies, receptors, and glass fibers for the organic compound.
The detection system is a method for measuring the amount of an organic compound, and includes a colorimetric method, a fluorescence method, a luminescence method, a radioactive method, and the like, and measures using an EIA method, an RIA method, and a specifically adsorbing carrier. Is the method.
[0029]
The EIA method referred to here is an enzyme immunoassay method in which an antibody against a mediator is immobilized on a support and the amount of mediator is measured by the activity of a labeling enzyme. For example, as a method for determining an organic compound released by a cell reaction using the EIA method, histamine released from basophils can be measured by a commercially available kit method. For example, this is performed as follows. Heparinized blood from the subject reacts with the allergy-specific antigen solution to release histamine from basophils. The released histamine is reacted with an acylating reagent to acylate histamine. Next, as a method for quantifying histamine, an acylated histamine and an enzyme-labeled histamine are added to a microplate on which an anti-acylated histamine antibody is solidified and reacted, and the labeled enzyme activity is measured to measure the anti-acylated histamine. In this method, the amount of enzyme-labeled histamine bound to the antibody is determined, and the amount of acylated histamine is determined therefrom.
[0030]
According to another method for measuring histamine, according to JP-A-6-205695, 40 ml of HA-HEPES buffer is added to 10 ml of blood, and after diluting the blood, 500 μl is dispensed into a test tube. 50 μl of magnetic particles to which a monoclonal antibody that reacts with is fixed is added and reacted at room temperature for 5 minutes to carry out a binding reaction between the monoclonal antibody and basophils. Subsequently, the beads are collected with a magnet to remove the supernatant, and then washed once with a buffer solution. Then, the magnetic particles are transferred to an avidin solidified microplate and reacted with an allergy-specific antigen solution to release histamine from basophils. At that time, biotin-labeled histamine and enzyme-labeled antihistamine antibody are simultaneously added to the reaction solution. A method is disclosed in which after washing, the enzyme activity of a biotin-labeled histamine-enzyme-labeled anti-histamine antibody complex bound to an avidin-immobilized antibody is determined and the amount of histamine is measured.
[0031]
Moreover, leukotriene which is another organic compound can be measured by EIA method using an anti-leukotriene antibody by a commercially available kit method. Further, interleukin 3, which is an organic compound released from other blood cells, can be measured by a commercially available kit method. For example, this is performed as follows. Plasma or serum is added to the microplate on which the anti-interleukin 3 antibody is solidified, and the reaction is carried out to bind the solidified antibody and interleukin 3. After washing the reaction solution, an enzyme-labeled anti-interleukin 3 antibody is added and the reaction is carried out to bind interleukin 3 and enzyme-labeled anti-interleukin 3. And it is the method of measuring the quantity of interleukin 3 by measuring the enzyme activity of a labeled antibody. In addition, interleukin 6, which is another interleukin, according to Japanese Patent Laid-Open No. 1-271862, serum is added to a microplate on which anti-interleukin 6 monoclonal antibody is immobilized, and left at room temperature for 2 to 3 hours. Conjugated antibody and interleukin 6 are bound. After removing the reaction solution and washing, biotinylated anti-interleukin 6 polyclonal antibody is added and reacted at 37 ° C. for 1 hour to bind interleukin 6 and biotinylated antibody. Next, enzyme-labeled streptavidin was added and left at 37 ° C. for 30 minutes to bind the biotinylated antibody and enzyme-labeled streptavidin, and after removing the reaction solution and washing three or more times, 4- A method for measuring the fluorescence intensity of liberated 4-methylumbelliferone by adding methylumbelliferyl-β-D-galactoside is disclosed.
[0032]
The RIA method referred to here is an immunoassay method using a radioactive label. For example, as a method for determining an organic compound released by a cellular reaction using the RIA method, in the measurement of histamine released from basophils (clinical examination vol.26 no.2 1982/2), for example, To do. After blood collection under EDTA addition conditions, plasma is separated by centrifugation. Plasma or standard histamine and acylation buffer are added to the acylating reagent tube to acylate histamine in plasma. next ¹²⁵ I-labeled histamine is added and allowed to react in the anti-histamine antibody solidified tube. After the reaction, a method for determining the amount of histamine in plasma by removing the reaction solution and measuring the radioactivity bound to the antihistamine antibody tube has been reported.
[0033]
In measuring leukotriene, which is another organic compound, sample or standard unlabeled leukotriene, anti-leukotriene antibody, ^Three H-labeled leukotriene is reacted at 4 ° C. for 5 to 24 hours, and then reacted with dextran charcoal in ice for 10 minutes. After centrifugation, the supernatant is collected and the amount of leukotriene is determined by measuring the radioactivity.
[0034]
In addition, measurement of PAF, which is another organic compound, can be performed by measuring sample or standard unlabeled PAF, anti-PAF antibody, ¹²⁵ After the I-labeled PAF and the secondary antibody are reacted at room temperature for 5 to 24 hours, the amount of PAF is determined by measuring the radioactivity of the precipitate obtained by centrifugation.
A method for measuring ECP, which is an organic compound released from eosinophils, is carried out as follows in a commercially available kit. Blood is collected in the presence of an anticoagulant, separated into plasma or serum by centrifugation, 50 μl of standard ECP and specimen are taken into a test tube, ¹²⁵ Add 50 μl each of I-labeled human ECP and rabbit anti-human ECP antibody and incubate overnight at room temperature. A method is known in which 2 ml of sheep anti-rabbit IgG antibody is added thereto, incubated at room temperature for 30 minutes, the supernatant is removed by centrifugation, and the amount of ECP is measured by measuring the γ counter of the precipitate.
[0035]
The method of measuring the organic compound by the detection system after separating the organic compound by the column is a method of separating the mediator by using a column filled with a resin by utilizing the physical properties of the mediator such as ionicity, hydrophobicity, and affinity. The HPLC method is mentioned.
An example of a method for determining an organic compound using the HPLC method is a method for measuring histamine according to JP-A-6-205695. For example, after the sample is passed through a column filled with a cation exchange resin, histamine is separated as follows, 0.1% orthophthalaldehyde and NaOH are added, and histamine-orthophthalaldehyde binding reaction is performed to fluorinate histamine. A method for measuring histamine release by adding HCl as a body, stopping the reaction, and measuring fluorescence intensity has been reported. In measuring leukotriene, another organic compound, leukocytes were separated from blood, leukotriene was released from basophils by adding calcium ionophore, and reacted with ice-cold acetonitrile / methanol / acetic acid solution containing prostaglandins. Is stopped at -20 ° C. for 1 hour, and then leukotriene is separated by centrifugation and reverse layer chromatography to measure the absorption at 280 nm, which is the absorption characteristic of leukotriene, to measure the amount of leukotriene.
[0036]
Examples of the carrier that specifically adsorbs an organic compound include glass fiber, antibody, enzyme, receptor, lectin and the like.
As a method for measuring using a carrier that specifically adsorbs an organic compound, JP-A-3-19948 can be mentioned. In measurement of histamine released from blood cells, heparin-collected blood and allergen are immobilized with glass fibers. A method is disclosed in which histamine is dispensed onto a plate, histamine is released from basophils, and the amount of histamine bound to glass fiber is measured by a fluorescence method.
[0037]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to this at all.
[0038]
[Example 1]
Using a healthy volunteer blood sample, histamine released from blood cells was measured. The concentration of EDTA sodium (manufactured by Doujin Chemical Co., Ltd.) added to 5 ml of blood at the time of blood collection to give 1 mM of EDTA sodium concentration at the time of histamine release reaction and 50 mM calcium chloride (Wako Pure Chemical Industries) ), 70 mM sodium acetate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 2.5 mM potassium acetate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 10 U / ml sodium heparin (Hoechst Marion Lucer), and 0.005% Microplate on which glass fiber is immobilized with 25 μl of human anti-IgE antibody solution (manufactured by DAKO) adjusted with Pipes buffer (manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.) (pH 7.4) containing sodium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) The reaction was carried out at 37 ° C. for 90 minutes to release histamine from basophils. After the reaction, the microplate is washed, and 200 μl of a surfactant is added and reacted at 37 ° C. for 60 minutes to wash impurities in the blood adhering to the glass fiber. Thereafter, 75 μl of 0.05% orthophthalaldehyde solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) adjusted with sodium hydroxide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dispensed to form a phosphor. The reaction was stopped by dispensing 75 μl of chloric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), the fluorescence intensity was measured, and the amount of histamine was determined from the histamine standard solution. The test was performed 5 times, and the value obtained by dividing the standard deviation by the average value was multiplied by 100 to obtain the Coefficient of Variation (CV) (%). As a result, the CV value was 7.8%.
[0039]
[Example 2]
The test was conducted in the same manner as in Example 1 except that the sodium EDTA concentration was 1, 25, and 50 mM during the histamine release reaction. As a result, the CV values were 9%, 8.5%, and 9.7%.
[0040]
[Comparative Example 1]
Using a healthy volunteer blood sample, histamine released from blood cells was measured. At the time of blood collection, 25 μl of blood to which heparin sodium is added so that the concentration of heparin sodium is 10 U / ml at the time of histamine release reaction and the concentration at the time of histamine release reaction are 50 mM calcium chloride, 70 mM sodium acetate, 2.5 mM acetic acid Histamine was measured in the same manner as in Example 1 using 25 μl of human anti-IgE antibody solution adjusted with Pipes buffer (pH 7.4) containing potassium and 0.005% sodium azide. As a result, the CV value was 123%, and in the range of 1-50 mM EDTA sodium concentration, the CV value decreased to 7.8-9% together with the result of Example 1. As is clear from the result that the CV value representing the degree of variation is significantly decreased, the reproducibility of the cell reaction was improved by the addition of a sodium EDTA concentration of 1 to 50 mM.
[0041]
[Example 3]
The test was performed in the same manner as in Example 1 except that the calcium chloride concentration was 1, 100, 200 mM at the time of histamine release reaction. As a result, the CV values were 8.5%, 8.5%, and 8.3%.
[0042]
[Comparative Example 2]
The test was conducted in the same manner as in Example 1 except that the calcium chloride concentration was 0 mM during the histamine release reaction. As a result, the CV value was 150%. When the calcium concentration was in the range of 1 to 200 mM, the CV value was lowered to 7.8 to 8.5% in combination with the result of Example 1. As is clear from this result, the reproducibility of the cell reaction was improved within a calcium concentration range of 1 to 200 mM.
[0043]
[Example 4]
The test was conducted in the same manner as in Example 1 except that the sodium heparin concentration was 1, 20, and 50 U / ml during the histamine release reaction. As a result, the CV values were 8.3%, 8.0%, and 8.4%.
[0044]
[Comparative Example 3]
The test was conducted in the same manner as in Example 1 except that the sodium heparin concentration was 0 mM during the histamine release reaction. As a result, the CV value was 143%. When the heparin sodium concentration was in the range of 1 to 50 U / ml, the CV value was reduced to 7.8 to 8.4% in combination with the result of Example 1. As is clear from this result, the reproducibility of the cell reaction was improved within the heparin concentration range of 1 to 50 U / ml.
[0045]
[Example 5]
The test was performed in the same manner as in Example 1 except that sodium EDTA was sodium citrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the CV value was 8.2%.
[0046]
[Example 6]
The test was performed in the same manner as in Example 1 except that sodium EDTA was sodium oxalate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the CV value was 8.1%. From the results of Example 1, Example 5, Example 6, and Comparative Example 1, even if the chelating agent is EDTA sodium, sodium citrate, or sodium oxalate, the CV value is 7.8 to 8.2%. Decreased, and the reproducibility of the cell reaction was improved.
[0047]
[Example 7]
The test was conducted in the same manner as in Example 1 except that sodium heparin was plasmin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the CV value was 8.9%.
[0048]
[Example 8]
The test was conducted in the same manner as in Example 1 except that sodium heparin was thrombin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the CV value was 8.6%. From the results of Example 1, Example 7, Example 8, and Comparative Example 2, even if the anticoagulant having no chelating ability is heparin sodium, plasmin, and thrombin, the CV value is 7.8-8. The reproducibility of the cell reaction was improved by 9%.
[0049]
[Example 9]
The test was performed in the same manner as in Example 1 except that the calcium chloride was magnesium chloride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the CV value was 9.7%.
[0050]
[Example 10]
The test was performed in the same manner as in Example 1 except that the calcium chloride was manganese chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the CV value was 9.9%. From the results of Example 1, Example 9, Example 10, and Comparative Example 3, even if the divalent cation is calcium ion, magnesium ion, or manganese ion, the CV value decreases to 7.8 to 9.9%. In addition, the reproducibility of the cell reaction was improved.
[0051]
Example 11
The test was performed in the same manner as in Example 1 except that the calcium chloride was calcium sulfate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the CV value was 9.3%.
[0052]
Example 12
The test was performed in the same manner as in Example 1 except that the calcium chloride was calcium carbonate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the CV value was 9.5%. From the results of Example 1, Example 11, Example 12, and Comparative Example 3, even when the metal salt is chloride, sulfate, carbonate, the CV value is reduced to 7.8 to 9.5%, Improved reproducibility of cell reaction.
[0053]
Example 13
Using a healthy volunteer blood sample, histamine released from blood cells was measured. For 5 ml of blood at the time of blood sampling, 25 μl of blood to which EDTA sodium and heparin sodium were added so that the EDTA sodium concentration was 1 mM and the heparin sodium concentration was 10 U / ml at the time of histamine release reaction, and the concentration at the time of histamine release reaction was 50 mM chloride. Similar to Example 1 using 25 μl of human anti-IgE antibody solution adjusted with Pipes buffer (pH 7.4) containing calcium, 70 mM sodium acetate, 2.5 mM potassium acetate and 0.005% sodium azide The histamine was measured by the method. As a result, the CV value was 8.0%, and a result equivalent to the CV value of Example 7.8% was obtained. As is clear from this result, the reproducibility of the cell reaction was improved even when a chelating agent or an anti-blood coagulant having no chelating ability was added simultaneously to the blood.
[0054]
Example 14
Using a healthy volunteer blood sample, histamine released from blood cells was measured. For blood 5 ml at the time of blood collection, 25 μl of blood to which heparin sodium was added so that the concentration of heparin sodium was 10 U / ml at the time of histamine release reaction and the concentration at the time of histamine release reaction were 50 mM calcium chloride, 70 mM sodium acetate, 2.5 mM acetic acid Histamine was measured in the same manner as in Example 1 using 25 μl of human anti-IgE antibody solution adjusted with Pipes buffer (pH 7.4) containing potassium, 1 mM EDTA and 0.005% sodium azide. went. As a result, CV (%) was 8.0%, and a result equivalent to the CV value of Example 7.8% was obtained. As is clear from this result, the reproducibility of the cell reaction was improved even when an anticoagulant having no chelating ability was added to the blood and a chelating agent and a metal salt were added to the buffer solution.
[0055]
Example 15
Using a healthy volunteer blood sample, histamine released from blood cells was measured. 50 μl of blood added with sodium EDTA so that the EDTA sodium concentration becomes 1, 25, 50 mM at the time of histamine release reaction with respect to 5 ml of blood at the time of blood collection and the concentration at the time of histamine release reaction are 50 mM calcium chloride, 70 mM sodium acetate, 2.5 mM Dispense 50 μl of human anti-IgE solution adjusted with Pipes buffer (pH 7.4) containing potassium acetate, 10 U / ml sodium heparin and 0.005% sodium azide into a plastic tube, and react at 37 ° C. for 90 minutes. To release histamine from basophils. Thereafter, centrifugation is performed to remove blood cells, and then the released histamine is reacted with an acylating reagent to acylate histamine. Add 200 μl of acylated histamine and enzyme-labeled histamine to a microplate on which anti-acylated histamine antibody is solidified, react at 5 degrees for 18 hours, wash, add 200 μl of enzyme substrate and react at 25 degrees, 30 After 50 minutes, 50 μl of the reaction stop solution was added, and the absorbance at 405 nm was measured. As a result, the CV values were 9.2%, 8.8%, and 9.5%.
[0056]
[Comparative Example 4]
Using a healthy volunteer blood sample, histamine released from blood cells was measured. 50 μl of blood to which heparin sodium is added so that the concentration of heparin sodium is 10 U / ml at the time of histamine release reaction and the concentration at the time of histamine release reaction are 50 mM calcium chloride, 70 mM sodium acetate, 2.5 mM acetic acid Histamine was measured in the same manner as in Example 15 using 50 μl of human anti-IgE antibody solution adjusted with Pipes buffer (pH 7.4) containing potassium and 0.005% sodium azide. As a result, the CV value was 140%, and the CV value decreased to 8.8 to 9.5% in the range of 1 to 50 mM EDTA sodium concentration. As is clear from this result, the reproducibility of the cell reaction was improved in the range of EDTA sodium concentration of 1 to 50 mM.
[0057]
Example 16
Using a healthy volunteer blood sample, histamine released from blood cells was measured. 50 μl of each of three types of blood added with EDTA sodium so that the EDTA sodium concentration becomes 1, 25, and 50 mM at the time of histamine release reaction with respect to 5 ml of blood at the time of blood collection, and 50 mM calcium chloride and 70 mM sodium acetate as the concentrations at the time of histamine release reaction 25 μl of human anti-IgE solution adjusted with Pipes buffer (pH 7.4) containing 2.5 mM potassium acetate, 10 U / ml sodium heparin and 0.005% sodium azide, Reaction is performed for 90 minutes to release histamine from basophils. Thereafter, centrifugation is carried out to remove blood cells, and then 500 μl of released histamine, μl of standard histamine and 50 μl of acylation buffer are added to the acylating reagent tube to acylate the released histamine. next ¹²⁵ 1 ml of I-labeled histamine is added and allowed to react 4 times for 16 hours in an antihistamine antibody solidified tube. After the reaction, the reaction solution was removed, and the radioactivity bound to the antihistamine antibody tube was measured. As a result, the CV values were 9.3%, 9.0%, and 9.5%.
[0058]
[Comparative Example 5]
Using a healthy volunteer blood sample, histamine released from blood cells was measured. At the time of blood collection, 25 μl of blood to which heparin sodium is added so that the concentration of heparin sodium is 10 U / ml at the time of histamine release reaction and the concentration at the time of histamine release reaction are 50 mM calcium chloride, 70 mM sodium acetate, 2.5 mM acetic acid Histamine was measured in the same manner as in Example 16 using 25 μl of human anti-IgE antibody solution adjusted with Pipes buffer (pH 7.4) containing potassium and 0.005% sodium azide. As a result, the CV value was 140%, and the CV value decreased to 9 to 9.5% in the range of 1 to 50 mM EDTA sodium concentration. As is clear from this result, the reproducibility of the cell reaction was improved in the range of EDTA sodium concentration of 1 to 50 mM.
[0059]
[Example 17]
Using 1 example of healthy volunteer blood, leukotriene released from blood cells was measured. 25 μl each of 3 types of blood to which EDTA sodium was added so that the EDTA sodium concentration would be 1, 25, 50 mM at the time of leukotriene release reaction with respect to 5 ml of blood at the time of blood collection and 50 mM calcium chloride, 70 mM sodium acetate as the concentrations at the time of leukotriene release reaction 25 μl of human anti-IgE solution adjusted with Pipes buffer (pH 7.4) containing 2.5 mM potassium acetate, 10 U / ml heparin and 0.005% sodium azide, Reaction is performed for a minute to release leukotriene from basophils. After centrifugation, the blood cells were removed, the reaction was stopped with ice-cold acetonitrile / methanol / acetic acid solution containing prostaglandin, left at -20 ° C. for 1 hour, and then leukotriene was separated by centrifugation and reverse layer chromatography. Then, the absorption at 280 nm, which is the absorption characteristic of leukotriene, was measured, and the amount of leukotriene was measured. As a result, the CV values were 8.1%, 8.8%, and 9.3%, respectively.
[0060]
[Comparative Example 6]
Using 1 example of healthy volunteer blood, leukotriene released from blood cells was measured. 25 μl of blood to which heparin sodium is added so that the concentration of sodium heparin is 10 U / ml at the time of histamine release reaction with respect to 5 ml of blood at the time of blood collection and the concentration at the time of leukotriene release reaction are 50 mM calcium chloride, 70 mM sodium acetate, 2.5 mM acetic acid Leukotriene was measured in the same manner as in Example 17 using 25 μl of human anti-IgE antibody solution adjusted with Pipes buffer (pH 7.4) containing potassium and 0.005% sodium azide. As a result, the CV value was 120%, and the CV value decreased to 8.1 to 9.3% in combination with the result of Example 17 in the range of the EDTA sodium concentration of 1 to 50 mM. As is clear from this result, the reproducibility of the cell reaction was improved in the range of EDTA sodium concentration of 1 to 50 mM.
[0061]
【The invention's effect】
The present invention relates to a method for determining a blood cell reaction, wherein the composition is a combination of blood, a chelating agent, an anti-coagulant having no chelating ability, and a metal salt capable of eluting divalent cations in an aqueous medium. It shows that the cell function can be measured with good reproducibility without separating the blood by blood treatment using the product. Therefore, the effects of the present invention are expected to be an effect that can improve the reproducibility of the cell function test, an operator can reduce the working time by simplifying the operation, and an associated cost.

Claims

A method for treating blood to be subjected to a mediator release reaction from blood cells , characterized by adding the following (1) to (3) :
(1) Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) and / or citric acid
(2) 1-50 U / ml heparin
(3) A metal salt capable of eluting one or more divalent cations selected from calcium, magnesium and manganese in an aqueous medium, and having a molar concentration ratio of 2 to 1 to 200 times that of (1) Metal salt that can elute valent cations .

The processing method according to claim 1 , wherein the metal salt includes one or more selected from the group consisting of chloride, sulfate, carbonate, nitrate, and phosphate.

The processing method according to claim 1 or 2 , wherein the mediator is histamine, leukotriene, platelet activating factor (PAF) or cytokine.

The processing method according to any one of claims 1 to 3 , wherein the concentration of EDTA and / or citric acid is 1 to 50 mM at the time of mediator release reaction .

The processing method of any one of Claims 1-4 whose density | concentration of the metal salt which can elute a bivalent cation is 1-200 mM at the time of mediator release reaction .

A composition for treating blood to be subjected to a mediator release reaction from blood cells, comprising the following (1) to (3) ;
(1) Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) and / or citric acid
(2) 1-50 U / ml heparin
(3) A metal salt capable of eluting one or more divalent cations selected from calcium, magnesium and manganese in an aqueous medium, and having a molar concentration ratio of 2 to 1 to 200 times that of (1) Metal salt that can elute valent cations.

The composition according to claim 6 , wherein the metal salt comprises one or more selected from the group consisting of chloride, sulfate, carbonate, nitrate, and phosphate.

The composition according to claim 6 or 7 , wherein the mediator is histamine, leukotriene, platelet activating factor (PAF), or cytokine.

The composition according to any one of claims 6 to 8, wherein the concentration of EDTA and / or citric acid is 1 to 50 mM during the mediator release reaction .

The composition according to any one of claims 6 to 9 , wherein the concentration of the metal salt containing a divalent cation is 1 to 200 mM during the mediator release reaction .