JP2001056326A - セロトニン及び５−ヒドロキシインドール酢酸の精製法及び測定方法 - Google Patents
セロトニン及び５−ヒドロキシインドール酢酸の精製法及び測定方法Info
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- JP2001056326A JP2001056326A JP11230330A JP23033099A JP2001056326A JP 2001056326 A JP2001056326 A JP 2001056326A JP 11230330 A JP11230330 A JP 11230330A JP 23033099 A JP23033099 A JP 23033099A JP 2001056326 A JP2001056326 A JP 2001056326A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】不純物の影響を受けにくい５ＨＴ及び５ＨＩＡ
Ａの精製及び測定法を提供する。 【解決手段】セロトニン（５ＨＴ）及び５−ヒドロキシ
インドール酢酸（５ＨＩＡＡ）を含む試料をプレカラム
に吸着・溶出させ、５ＨＴ及び５ＨＩＡＡを回収するこ
とにより、５ＨＴ及び５ＨＩＡＡを精製する際に、プレ
カラムが逆相カラムであり、吸着液がｐＨ５．０以下
で、かつ塩基性物質用イオンペア試薬を含み、溶出液が
吸着液に比べｐＨが１．０以上高い溶液であることを特
徴とする。またそのような方法により精製した５ＨＴ及
び５ＨＩＡＡを分離カラムに導入・分離し、各成分を検
出・測定することにより、５ＨＴ及び５ＨＩＡＡを同時
測定する。
Ａの精製及び測定法を提供する。 【解決手段】セロトニン（５ＨＴ）及び５−ヒドロキシ
インドール酢酸（５ＨＩＡＡ）を含む試料をプレカラム
に吸着・溶出させ、５ＨＴ及び５ＨＩＡＡを回収するこ
とにより、５ＨＴ及び５ＨＩＡＡを精製する際に、プレ
カラムが逆相カラムであり、吸着液がｐＨ５．０以下
で、かつ塩基性物質用イオンペア試薬を含み、溶出液が
吸着液に比べｐＨが１．０以上高い溶液であることを特
徴とする。またそのような方法により精製した５ＨＴ及
び５ＨＩＡＡを分離カラムに導入・分離し、各成分を検
出・測定することにより、５ＨＴ及び５ＨＩＡＡを同時
測定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、組織抽出液、血
清、血漿、尿などの試料中に含まれるセロトニン及び／
又は５−ヒドロキシインドール酢酸の精製及び測定方法
に関する。
清、血漿、尿などの試料中に含まれるセロトニン及び／
又は５−ヒドロキシインドール酢酸の精製及び測定方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】セロトニン（以下５ＨＴ）、及び５−ヒ
ドロキシインドール酢酸（以下５ＨＩＡＡ）の同時測定
方法としては、液体クロマトグラフを用いた方法が知ら
れている。分離カラムとして逆相カラムを用い、分離カ
ラムの試料による汚れを防ぐために、同じ逆相ゲルのプ
レカラムを分離カラムの前に配し、試料分析中にモータ
ーバルブを用いて分析カラム流路からはずし自動洗浄す
る方法（ＭＡＲＬＩＥＳＫＯＥＬら Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒ．，４９５（１９８９） ｐ２６３）がある。
この方法では、５ＨＴ及び５ＨＩＡＡばかりでなく、バ
ニリルマンデル酸、ホモバニリン酸、ドーパミン、トリ
プトファンも同時に測定できる。
ドロキシインドール酢酸（以下５ＨＩＡＡ）の同時測定
方法としては、液体クロマトグラフを用いた方法が知ら
れている。分離カラムとして逆相カラムを用い、分離カ
ラムの試料による汚れを防ぐために、同じ逆相ゲルのプ
レカラムを分離カラムの前に配し、試料分析中にモータ
ーバルブを用いて分析カラム流路からはずし自動洗浄す
る方法（ＭＡＲＬＩＥＳＫＯＥＬら Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒ．，４９５（１９８９） ｐ２６３）がある。
この方法では、５ＨＴ及び５ＨＩＡＡばかりでなく、バ
ニリルマンデル酸、ホモバニリン酸、ドーパミン、トリ
プトファンも同時に測定できる。
【０００３】また、プレカラムおよび分離カラムとして
どちらも逆相カラムを用い、プレカラムに吸着させる吸
着液及び溶出させる溶出液を同じ組成とし、カラムスイ
ッチングによる方法（ＴＯＲＳＴＥＮ Ｊ．ＰＡＮＨＯ
ＬＺＥＲら Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４５（１９９９）
ｐ２６２）がある。この方法では、５ＨＴ及び５ＨＩＡ
Ａばかりでなく、ノルエピネフリン、ジヒドロキシフェ
ニル酢酸、エピネフリン、ノルメタネフリン、ホモバニ
リン酸、メタネフリン、ドーパミンも同時に測定でき
る。
どちらも逆相カラムを用い、プレカラムに吸着させる吸
着液及び溶出させる溶出液を同じ組成とし、カラムスイ
ッチングによる方法（ＴＯＲＳＴＥＮ Ｊ．ＰＡＮＨＯ
ＬＺＥＲら Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４５（１９９９）
ｐ２６２）がある。この方法では、５ＨＴ及び５ＨＩＡ
Ａばかりでなく、ノルエピネフリン、ジヒドロキシフェ
ニル酢酸、エピネフリン、ノルメタネフリン、ホモバニ
リン酸、メタネフリン、ドーパミンも同時に測定でき
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】トリプトファン代謝物
の中で、５ＨＴおよび５ＨＩＡＡはさまざまな疾患との
関連で特に重要であり、これら２つの物質を簡便に試料
中の不純物質の影響なく測定出来る方法が望まれてい
る。ここでいう不純物質には、さまざまな疾患の治療の
ために投与された薬物なども含まれる。
の中で、５ＨＴおよび５ＨＩＡＡはさまざまな疾患との
関連で特に重要であり、これら２つの物質を簡便に試料
中の不純物質の影響なく測定出来る方法が望まれてい
る。ここでいう不純物質には、さまざまな疾患の治療の
ために投与された薬物なども含まれる。
【０００５】これまで知られている方法は、５ＨＴおよ
び５ＨＩＡＡを含めて複数の代謝物を同時に測定するも
のである。ＴＯＲＳＴＥＮ Ｊ．ＰＡＮＨＯＬＺＥＲら
の方法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４５（１９９９）ｐ２
６２）は、カラムスイッチングを用いるものの、プレカ
ラムおよび分離カラムどちらも逆相カラムで、プレカラ
ムに吸着させる吸着液及び溶出させる溶出液を同じ組成
としており、プレカラムで除去されない不純物質が、分
離カラムでも不純物質として問題にになる可能性が高
い。
び５ＨＩＡＡを含めて複数の代謝物を同時に測定するも
のである。ＴＯＲＳＴＥＮ Ｊ．ＰＡＮＨＯＬＺＥＲら
の方法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４５（１９９９）ｐ２
６２）は、カラムスイッチングを用いるものの、プレカ
ラムおよび分離カラムどちらも逆相カラムで、プレカラ
ムに吸着させる吸着液及び溶出させる溶出液を同じ組成
としており、プレカラムで除去されない不純物質が、分
離カラムでも不純物質として問題にになる可能性が高
い。
【０００６】また、５ＨＴ、５ＨＩＡＡを含めて多くの
成分を同時に測定するためには、プレカラムにおいて５
ＨＴ、５ＨＩＡＡを含めて多くの成分を吸着した後、溶
出し、分離カラムに導入すればよい。このため、５Ｈ
Ｔ、５ＨＩＡＡの測定に影響を及ぼす不純物質が分離カ
ラムに導入される可能性も高い。
成分を同時に測定するためには、プレカラムにおいて５
ＨＴ、５ＨＩＡＡを含めて多くの成分を吸着した後、溶
出し、分離カラムに導入すればよい。このため、５Ｈ
Ｔ、５ＨＩＡＡの測定に影響を及ぼす不純物質が分離カ
ラムに導入される可能性も高い。
【０００７】このため投与薬物などの不純物質の影響を
受けにくい５ＨＴおよび／又は５ＨＩＡＡの精製及び測
定方法の確立が望まれている。
受けにくい５ＨＴおよび／又は５ＨＩＡＡの精製及び測
定方法の確立が望まれている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述した
課題を解決するために鋭意検討を行った結果、本発明を
完成するに至った。即ち本発明は、セロトニン及び／又
は５−ヒドロキシインドール酢酸を含む試料をプレカラ
ムに吸着させる工程、セロトニン及び５−ヒドロキシイ
ンドール酢酸をプレカラムから溶出させる工程、及び溶
出したセロトニン及び５−ヒドロキシインドール酢酸を
回収する工程からなる、セロトニン及び／又は５−ヒド
ロキシインドール酢酸の精製法において、プレカラムが
逆相カラムであり、吸着工程における吸着液がｐＨ５．
０以下で、かつ塩基性物質用イオンペア試薬を含んだ溶
液であり、また溶出工程における溶出液が前記吸着液に
比べｐＨが１．０以上高い溶液であることを特徴とする
方法である。
課題を解決するために鋭意検討を行った結果、本発明を
完成するに至った。即ち本発明は、セロトニン及び／又
は５−ヒドロキシインドール酢酸を含む試料をプレカラ
ムに吸着させる工程、セロトニン及び５−ヒドロキシイ
ンドール酢酸をプレカラムから溶出させる工程、及び溶
出したセロトニン及び５−ヒドロキシインドール酢酸を
回収する工程からなる、セロトニン及び／又は５−ヒド
ロキシインドール酢酸の精製法において、プレカラムが
逆相カラムであり、吸着工程における吸着液がｐＨ５．
０以下で、かつ塩基性物質用イオンペア試薬を含んだ溶
液であり、また溶出工程における溶出液が前記吸着液に
比べｐＨが１．０以上高い溶液であることを特徴とする
方法である。
【０００９】また本発明は、上述の方法により精製した
セロトニン及び／又は５−ヒドロキシインドール酢酸を
分離カラムに導入し分離する工程、及び分離した各成分
を検出または測定する工程からなることを特徴とする、
セロトニン及び／又は５−ヒドロキシインドール酢酸の
測定方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
セロトニン及び／又は５−ヒドロキシインドール酢酸を
分離カラムに導入し分離する工程、及び分離した各成分
を検出または測定する工程からなることを特徴とする、
セロトニン及び／又は５−ヒドロキシインドール酢酸の
測定方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】プレカラムとして用いられる逆相カラム
は、シリカ系またはポリマー系のゲルに疎水基として、
エーテル基、オクタデシル基、オクチル基、フェニル基
などを導入したゲルを充填したカラムが挙げられる。ま
た、ゲル自体が疎水性を有する場合については、疎水基
を導入しなくともよい。
は、シリカ系またはポリマー系のゲルに疎水基として、
エーテル基、オクタデシル基、オクチル基、フェニル基
などを導入したゲルを充填したカラムが挙げられる。ま
た、ゲル自体が疎水性を有する場合については、疎水基
を導入しなくともよい。
【００１１】プレカラムに５ＨＴおよび５ＨＩＡＡを吸
着させる吸着液については、ｐＨ５．０以下、好ましく
はｐＨ２．０から４．０である。さらに、設定したｐＨ
に緩衝能のあるクエン酸、グリシン、酢酸など物質を加
えることが望ましい。その濃度は５．０から５０ｍＭ程
度がよい。
着させる吸着液については、ｐＨ５．０以下、好ましく
はｐＨ２．０から４．０である。さらに、設定したｐＨ
に緩衝能のあるクエン酸、グリシン、酢酸など物質を加
えることが望ましい。その濃度は５．０から５０ｍＭ程
度がよい。
【００１２】そして、加える塩基性物質用イオンペア試
薬としては、５ＨＴなどの塩基性物質と逆相カラムであ
るプレカラム中のゲルの疎水表面との相互作用を強める
性質を有する試薬であれば特に限定されない。通常、そ
の物質はマイナスチャージを有する分子構造と疎水性を
有する分子構造とがつながった分子構造を取る。例え
ば、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸溶液、１−プ
ロパンスルホン酸ナトリウム、１−ブタンスルホン酸ナ
トリウム、１−ペンタンスルホン酸ナトリウム、１−ヘ
キサンスルホン酸ナトリウム、１−ヘプタンスルホン酸
ナトリウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウム、１−
ノナンスルホン酸ナトリウム、１−デカンスルホン酸ナ
トリウム、１−ウンデカンスルホン酸ナトリウム、１−
ドデカンスルホン酸ナトリウム、１−トリデカンスルホ
ン酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、２−
ナフタレンスルホン酸ナトリウムなどがあげられる。
薬としては、５ＨＴなどの塩基性物質と逆相カラムであ
るプレカラム中のゲルの疎水表面との相互作用を強める
性質を有する試薬であれば特に限定されない。通常、そ
の物質はマイナスチャージを有する分子構造と疎水性を
有する分子構造とがつながった分子構造を取る。例え
ば、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸溶液、１−プ
ロパンスルホン酸ナトリウム、１−ブタンスルホン酸ナ
トリウム、１−ペンタンスルホン酸ナトリウム、１−ヘ
キサンスルホン酸ナトリウム、１−ヘプタンスルホン酸
ナトリウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウム、１−
ノナンスルホン酸ナトリウム、１−デカンスルホン酸ナ
トリウム、１−ウンデカンスルホン酸ナトリウム、１−
ドデカンスルホン酸ナトリウム、１−トリデカンスルホ
ン酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、２−
ナフタレンスルホン酸ナトリウムなどがあげられる。
【００１３】実際に溶液中で塩基性物質用イオンペア試
薬の性質を有する分子は、それぞれ、過塩素酸イオン、
トリクロロ酢酸イオン、１−プロパンスルホン酸イオ
ン、１−ブタンスルホン酸イオン、１−ペンタンスルホ
ン酸イオン、１−ヘキサンスルホン酸イオン、１−ヘプ
タンスルホン酸イオン、１−オクタンスルホン酸イオ
ン、１−ノナンスルホン酸イオン、１−デカンスルホン
酸イオン、１−ウンデカンスルホン酸イオン、１−ドデ
カンスルホン酸イオン、１−トリデカンスルホン酸イオ
ン、ドデシルスルホン酸イオン、２−ナフタレンスルホ
ン酸イオンであるので、これらのイオンを含む試薬であ
れば良い。例えば、過塩素酸イオンを含む試薬として
は、過塩素酸ナトリウム以外に過塩素酸溶液があげられ
る。
薬の性質を有する分子は、それぞれ、過塩素酸イオン、
トリクロロ酢酸イオン、１−プロパンスルホン酸イオ
ン、１−ブタンスルホン酸イオン、１−ペンタンスルホ
ン酸イオン、１−ヘキサンスルホン酸イオン、１−ヘプ
タンスルホン酸イオン、１−オクタンスルホン酸イオ
ン、１−ノナンスルホン酸イオン、１−デカンスルホン
酸イオン、１−ウンデカンスルホン酸イオン、１−ドデ
カンスルホン酸イオン、１−トリデカンスルホン酸イオ
ン、ドデシルスルホン酸イオン、２−ナフタレンスルホ
ン酸イオンであるので、これらのイオンを含む試薬であ
れば良い。例えば、過塩素酸イオンを含む試薬として
は、過塩素酸ナトリウム以外に過塩素酸溶液があげられ
る。
【００１４】イオンペア試薬の濃度は、イオンペア試薬
により異なるが、例えば過塩素酸ナトリウム、トリクロ
ロ酢酸であれば１０から１００ｍＭ、望ましくは３０〜
７０ｍＭ程度がよい。また、試料中の５ＨＴおよび５Ｈ
ＩＡＡの酸化防止を目的として、エチレンジアミン４酢
酸などの金属キレート剤を、防腐剤としてアジ化ナトリ
ウムなどを加えてもよい。
により異なるが、例えば過塩素酸ナトリウム、トリクロ
ロ酢酸であれば１０から１００ｍＭ、望ましくは３０〜
７０ｍＭ程度がよい。また、試料中の５ＨＴおよび５Ｈ
ＩＡＡの酸化防止を目的として、エチレンジアミン４酢
酸などの金属キレート剤を、防腐剤としてアジ化ナトリ
ウムなどを加えてもよい。
【００１５】プレカラムから５ＨＴおよび５ＨＩＡＡを
溶出するための溶出液としては、少なくとも吸着液に比
べｐＨを１．０以上高くする必要があるが、好ましくは
ｐＨ５．０から７．０である。設定したｐＨに緩衝能の
あるクエン酸、酢酸、リン酸などの物質を加えることが
望ましい。その濃度は５．０から５０ｍＭ程度がよい。
また５ＨＴを速やかに溶出するために、溶出液には塩基
性物質用イオンペアを含まない方が好ましく、更にエタ
ノール、メタノール、アセトニトリルなどの有機溶媒を
加えることが望ましい。加える有機溶媒濃度は、その種
類により異なるがアセトニトリルであれば１．０から１
０％加えるとよい。また、試料中の５ＨＴおよび５ＨＩ
ＡＡの酸化防止を目的として、エチレンジアミン４酢酸
などの金属キレート剤を、防腐剤としてアジ化ナトリウ
ムなどを加えてもよい。
溶出するための溶出液としては、少なくとも吸着液に比
べｐＨを１．０以上高くする必要があるが、好ましくは
ｐＨ５．０から７．０である。設定したｐＨに緩衝能の
あるクエン酸、酢酸、リン酸などの物質を加えることが
望ましい。その濃度は５．０から５０ｍＭ程度がよい。
また５ＨＴを速やかに溶出するために、溶出液には塩基
性物質用イオンペアを含まない方が好ましく、更にエタ
ノール、メタノール、アセトニトリルなどの有機溶媒を
加えることが望ましい。加える有機溶媒濃度は、その種
類により異なるがアセトニトリルであれば１．０から１
０％加えるとよい。また、試料中の５ＨＴおよび５ＨＩ
ＡＡの酸化防止を目的として、エチレンジアミン４酢酸
などの金属キレート剤を、防腐剤としてアジ化ナトリウ
ムなどを加えてもよい。
【００１６】５ＨＴは塩基性物質であり、疎水性は弱
い。一方５ＨＩＡＡは、ｐＨが上昇すると共に酸性の電
荷を増し疎水性が弱くなり、ｐＨが低下すると共に酸性
の電荷が低下し疎水性が強くなる。これらの性質を利用
し、プレカラムとして逆相カラムを用い、吸着液の組成
を、５ＨＩＡＡを吸着させるためにｐＨ５．０以下と
し、かつ５ＨＴを吸着させるために塩基性物質用イオン
ペア試薬を加えた組成とし、更にプレカラムに吸着され
た疎水性の高い不純物を溶出せずに、５ＨＩＡＡを速や
かに溶出するために、溶出液のｐＨが吸着液のｐＨと比
較して１．０以上高い溶液とすることにより、プレカラ
ムから５ＨＴおよび５ＨＩＡＡを含み、それ以外の成分
を最小限とした分画を回収することができる。
い。一方５ＨＩＡＡは、ｐＨが上昇すると共に酸性の電
荷を増し疎水性が弱くなり、ｐＨが低下すると共に酸性
の電荷が低下し疎水性が強くなる。これらの性質を利用
し、プレカラムとして逆相カラムを用い、吸着液の組成
を、５ＨＩＡＡを吸着させるためにｐＨ５．０以下と
し、かつ５ＨＴを吸着させるために塩基性物質用イオン
ペア試薬を加えた組成とし、更にプレカラムに吸着され
た疎水性の高い不純物を溶出せずに、５ＨＩＡＡを速や
かに溶出するために、溶出液のｐＨが吸着液のｐＨと比
較して１．０以上高い溶液とすることにより、プレカラ
ムから５ＨＴおよび５ＨＩＡＡを含み、それ以外の成分
を最小限とした分画を回収することができる。
【００１７】以上のようにして精製された５ＨＴおよび
５ＨＩＡＡを含む溶液を、分離カラムに導入・分離し、
分離した成分を検出又は測定することにより、５ＨＴお
よび５ＨＩＡＡの測定を行うことができる。
５ＨＩＡＡを含む溶液を、分離カラムに導入・分離し、
分離した成分を検出又は測定することにより、５ＨＴお
よび５ＨＩＡＡの測定を行うことができる。
【００１８】分離カラムとしては、５ＨＴ及び５ＨＩＡ
Ａについて保持できるカラムであれば良い。例えば、弱
い疎水性の性質を有した陽イオン交換カラムや、逆相カ
ラムを用いることができる。分離カラムとして用いられ
る逆相カラムは、シリカ系またはポリマー系のゲルに疎
水基として、エーテル基、オクタデシル基、オクチル
基、フェニル基などを導入したゲルを充填したカラムが
挙げられる。また、ゲル自体が疎水性を有する場合につ
いては、疎水基を導入しなくともよい。
Ａについて保持できるカラムであれば良い。例えば、弱
い疎水性の性質を有した陽イオン交換カラムや、逆相カ
ラムを用いることができる。分離カラムとして用いられ
る逆相カラムは、シリカ系またはポリマー系のゲルに疎
水基として、エーテル基、オクタデシル基、オクチル
基、フェニル基などを導入したゲルを充填したカラムが
挙げられる。また、ゲル自体が疎水性を有する場合につ
いては、疎水基を導入しなくともよい。
【００１９】分離カラムからの分離に使用される溶離液
には特に限定はない。しかし、弱い疎水性の性質を有し
た陽イオン交換カラムを用いる場合は、ｐＨ５．０以下
の溶離液を用いるとよい。それは５ＨＴは塩基性物質で
あり、一方５ＨＩＡＡはｐＨ５．０以下の溶離液を用い
れば強い疎水性を有するからである。また逆相カラムを
用いる場合は、溶離液のｐＨに特に限定はなくｐＨ５．
０以上でも使用可能である。それは、５ＨＴは弱い疎水
性の性質を有し、一方５ＨＩＡＡはｐＨ５．０以上であ
っても弱い疎水性の性質を有するからである。
には特に限定はない。しかし、弱い疎水性の性質を有し
た陽イオン交換カラムを用いる場合は、ｐＨ５．０以下
の溶離液を用いるとよい。それは５ＨＴは塩基性物質で
あり、一方５ＨＩＡＡはｐＨ５．０以下の溶離液を用い
れば強い疎水性を有するからである。また逆相カラムを
用いる場合は、溶離液のｐＨに特に限定はなくｐＨ５．
０以上でも使用可能である。それは、５ＨＴは弱い疎水
性の性質を有し、一方５ＨＩＡＡはｐＨ５．０以上であ
っても弱い疎水性の性質を有するからである。
【００２０】さらに逆相カラムを用いる場合は、プレカ
ラムからの溶出液と分離カラムからの溶離液に同じ液を
使用することができるため、好ましいものである。その
場合には、５ＨＴ及び５ＨＩＡＡの分離をより良好にす
るために、塩基性物質用イオンペア試薬を加えてもよい
が、加える濃度については、プレカラムから５ＨＴを速
やかに溶出させるために、吸着液に加えた物と同じ種類
の塩基性物質用イオンペア試薬を用いる場合には、吸着
液に加えた濃度の半分以下、異なる種類の塩基性物質用
イオンペア試薬を用いる場合には、必要最小限の濃度と
することが好ましい。これにより、分離カラムから回収
される不純物を最少量とすることができる。
ラムからの溶出液と分離カラムからの溶離液に同じ液を
使用することができるため、好ましいものである。その
場合には、５ＨＴ及び５ＨＩＡＡの分離をより良好にす
るために、塩基性物質用イオンペア試薬を加えてもよい
が、加える濃度については、プレカラムから５ＨＴを速
やかに溶出させるために、吸着液に加えた物と同じ種類
の塩基性物質用イオンペア試薬を用いる場合には、吸着
液に加えた濃度の半分以下、異なる種類の塩基性物質用
イオンペア試薬を用いる場合には、必要最小限の濃度と
することが好ましい。これにより、分離カラムから回収
される不純物を最少量とすることができる。
【００２１】分離カラムにより分離された各成分は、検
出又は測定されるが、例えば検出系としては、電気化学
検出器、蛍光検出器などが挙げられる。蛍光検出器を用
いる場合には、例えば５ＨＴおよび５ＨＩＡＡ自身の自
然蛍光を用いる方法、ジフェニルエチレンジアミン、ベ
ンジルアミンなどの試薬と反応後、生成された蛍光物質
を測定する方法がある。
出又は測定されるが、例えば検出系としては、電気化学
検出器、蛍光検出器などが挙げられる。蛍光検出器を用
いる場合には、例えば５ＨＴおよび５ＨＩＡＡ自身の自
然蛍光を用いる方法、ジフェニルエチレンジアミン、ベ
ンジルアミンなどの試薬と反応後、生成された蛍光物質
を測定する方法がある。
【００２２】本発明においては、試料をプレカラムに導
入し試料中の特定の成分を吸着し、溶出し、分離カラム
に導入し分離し、検出・測定するわけであるが、このよ
うなカラムスイッチング操作は、通常、コンピューター
制御により自動的に指定した時間に流路が切り替えられ
る流路切り替えバルブにより行うことができる。本発明
を実施するための装置としては、一般的に、カラムスイ
ッチングのための流路切り替えバルブ、溶離液を流すポ
ンプ、流す溶離液の種類を切り替えるための流路切り替
えバルブ、オートサンプラー、溶離液中に溶存する気体
成分を除去するデガッサーなどを有し、それらをコンピ
ューターにより自動制御出来るものが用いられる。カラ
ムスイッチングのための流路切り替えバルブとしては、
通常６方モーターバルブが用いられる。
入し試料中の特定の成分を吸着し、溶出し、分離カラム
に導入し分離し、検出・測定するわけであるが、このよ
うなカラムスイッチング操作は、通常、コンピューター
制御により自動的に指定した時間に流路が切り替えられ
る流路切り替えバルブにより行うことができる。本発明
を実施するための装置としては、一般的に、カラムスイ
ッチングのための流路切り替えバルブ、溶離液を流すポ
ンプ、流す溶離液の種類を切り替えるための流路切り替
えバルブ、オートサンプラー、溶離液中に溶存する気体
成分を除去するデガッサーなどを有し、それらをコンピ
ューターにより自動制御出来るものが用いられる。カラ
ムスイッチングのための流路切り替えバルブとしては、
通常６方モーターバルブが用いられる。
【００２３】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳細な説明をす
るが、本発明は実施例に限定するものではない。
るが、本発明は実施例に限定するものではない。
【００２４】実施例１ 図１に装置の構成を示した。装置はＨＬＣ−７２５ＣＡ
ＩＩ東ソー（株）製の配管系を変更し用いた。６方モー
ターバルブは１個用いた。プレカラム（Ｃ１）、分離カ
ラム（Ｃ２）は、それぞれＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−８０Ｔ
ｓ（サイズ３．２ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｍｍ）、ＴＳＫｇ
ｅｌＯＤＳ−８０Ｔｓ（サイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１
２０ｍｍ）どちらも東ソー（株）製を用いた。ポンプは
すべてレシプロ型ポンプで、流速はポンプ１，２，３，
４（Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４）それぞれ１．０ｍｌ／ｍ
ｉｎ，０．７ｍｌ／ｍｉｎ，０．２５ｍｌ／ｍｉｎ，
０．２５ｍｌ／ｍｉｎとした。デガッサ（Ｄ）は、オン
ライン真空脱気式を用い、吸着液（Ｅ１），洗浄液（Ｅ
２），溶出・溶離液（Ｅ３）、反応液１，２（Ｒ１，Ｒ
２）のすべてをポンプの前に脱気するようにした。オー
トサンプラー（ＡＳ）は、ループを５００μＬとした。
リアクター（ＲＥ）はテフロン配管０．４ｍｍＩ．Ｄ．
×２０ｍとし、設定温度は９０℃とした。蛍光検出器
（ＦＳ）は、光源にキセノンランプを用い、励起波長３
４０から３６０ｎｍ、蛍光波長４７０ｎｍ以上とした。
ＩＩ東ソー（株）製の配管系を変更し用いた。６方モー
ターバルブは１個用いた。プレカラム（Ｃ１）、分離カ
ラム（Ｃ２）は、それぞれＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−８０Ｔ
ｓ（サイズ３．２ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｍｍ）、ＴＳＫｇ
ｅｌＯＤＳ−８０Ｔｓ（サイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１
２０ｍｍ）どちらも東ソー（株）製を用いた。ポンプは
すべてレシプロ型ポンプで、流速はポンプ１，２，３，
４（Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３，Ｐ４）それぞれ１．０ｍｌ／ｍ
ｉｎ，０．７ｍｌ／ｍｉｎ，０．２５ｍｌ／ｍｉｎ，
０．２５ｍｌ／ｍｉｎとした。デガッサ（Ｄ）は、オン
ライン真空脱気式を用い、吸着液（Ｅ１），洗浄液（Ｅ
２），溶出・溶離液（Ｅ３）、反応液１，２（Ｒ１，Ｒ
２）のすべてをポンプの前に脱気するようにした。オー
トサンプラー（ＡＳ）は、ループを５００μＬとした。
リアクター（ＲＥ）はテフロン配管０．４ｍｍＩ．Ｄ．
×２０ｍとし、設定温度は９０℃とした。蛍光検出器
（ＦＳ）は、光源にキセノンランプを用い、励起波長３
４０から３６０ｎｍ、蛍光波長４７０ｎｍ以上とした。
【００２５】吸着液（Ｅ１）の組成は１０ｍＭグリシ
ン、５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム ｐＨ３．０とし、洗
浄液（Ｅ２）はカテコールアミン測定用試薬溶離液ＢＩ
Ｉ（東ソー株式会社製）を、溶出液及び溶離液としては
いずれも溶出・溶離液（Ｅ３）を用い、その組成は１０
ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ硝酸アンモニウム、２
％アセトニトリルｐＨ５．５とした。また５ＨＴ及び５
ＨＩＡＡの検出のために用いられる反応液１（Ｒ１）は
５０％アセトニトリル、４０ｍＭベンジルアミンとし、
反応液２（Ｒ２）は、５０％アセトニトリル、５ｍＭ四
ほう酸ナトリウム、６ｍＭフェリシアン化カリウム ｐ
Ｈ１０．０とした。測定中の６方モーターバルブ、３方
電磁弁の切り替えタイミングは、６方モーターバルブ１
（Ｍ１）：ＯＮ１．９ｍｉｎ−ＯＦＦ１２．０ｍｉｎ、
３方電磁弁１（Ｓ１）：ＯＮ１２．０ｍｉｎ−ＯＦＦ１
７．０ｍｉｎ、３方電磁弁２（Ｓ２）：ＯＮ２９．０ｍ
ｉｎ−ＯＦＦ３０．５ｍｉｎ、とし、測定サイクルは３
５．５ｍｉｎとした。
ン、５０ｍＭ過塩素酸ナトリウム ｐＨ３．０とし、洗
浄液（Ｅ２）はカテコールアミン測定用試薬溶離液ＢＩ
Ｉ（東ソー株式会社製）を、溶出液及び溶離液としては
いずれも溶出・溶離液（Ｅ３）を用い、その組成は１０
ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ硝酸アンモニウム、２
％アセトニトリルｐＨ５．５とした。また５ＨＴ及び５
ＨＩＡＡの検出のために用いられる反応液１（Ｒ１）は
５０％アセトニトリル、４０ｍＭベンジルアミンとし、
反応液２（Ｒ２）は、５０％アセトニトリル、５ｍＭ四
ほう酸ナトリウム、６ｍＭフェリシアン化カリウム ｐ
Ｈ１０．０とした。測定中の６方モーターバルブ、３方
電磁弁の切り替えタイミングは、６方モーターバルブ１
（Ｍ１）：ＯＮ１．９ｍｉｎ−ＯＦＦ１２．０ｍｉｎ、
３方電磁弁１（Ｓ１）：ＯＮ１２．０ｍｉｎ−ＯＦＦ１
７．０ｍｉｎ、３方電磁弁２（Ｓ２）：ＯＮ２９．０ｍ
ｉｎ−ＯＦＦ３０．５ｍｉｎ、とし、測定サイクルは３
５．５ｍｉｎとした。
【００２６】標準試料は、イオン交換水１Ｌに０．１９
ｇアスコルビン酸、０．３８ｇエチレンジアミン４酢酸
２ナトリウム、３４ｍＬ ６０％過塩素酸溶液を加えて
均一にした希釈液を用い、５ＨＴ（シグマ製）、５ＨＩ
ＡＡ（シグマ製）それぞれ１０ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度に
なるよう調製した。血漿は、同じ希釈液で２０倍に希釈
し、遠心分離後の上清を試料として用いた。尿は、同じ
希釈液で５００倍希釈し、そのまま試料として用いた。
試料注入量は５００μＬとした。
ｇアスコルビン酸、０．３８ｇエチレンジアミン４酢酸
２ナトリウム、３４ｍＬ ６０％過塩素酸溶液を加えて
均一にした希釈液を用い、５ＨＴ（シグマ製）、５ＨＩ
ＡＡ（シグマ製）それぞれ１０ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度に
なるよう調製した。血漿は、同じ希釈液で２０倍に希釈
し、遠心分離後の上清を試料として用いた。尿は、同じ
希釈液で５００倍希釈し、そのまま試料として用いた。
試料注入量は５００μＬとした。
【００２７】血漿は、患者血漿４検体、健常人血漿１検
体を用いた。尿は患者尿２検体、健常人尿１検体を用い
た。
体を用いた。尿は患者尿２検体、健常人尿１検体を用い
た。
【００２８】測定結果を、図２から１０に示した。図２
は標準試料の測定結果であり、５ＨＴと５ＨＩＡＡのピ
ークが確認された。図３〜６はそれぞれ患者血漿１〜
４、図７は健常人血漿の測定結果である。血漿試料で
は、５ＨＴと５ＨＩＡＡのピークが確認された。図８，
９はそれぞれ患者尿１，２、図１０は健常人尿の測定結
果である。尿試料では、５ＨＩＡＡのみが確認され、５
ＨＴは感度以下であった。以上のように、すべての試料
において良好な測定結果が得られた。
は標準試料の測定結果であり、５ＨＴと５ＨＩＡＡのピ
ークが確認された。図３〜６はそれぞれ患者血漿１〜
４、図７は健常人血漿の測定結果である。血漿試料で
は、５ＨＴと５ＨＩＡＡのピークが確認された。図８，
９はそれぞれ患者尿１，２、図１０は健常人尿の測定結
果である。尿試料では、５ＨＩＡＡのみが確認され、５
ＨＴは感度以下であった。以上のように、すべての試料
において良好な測定結果が得られた。
【００２９】
【発明の効果】本発明により、試料中の不純物質の影響
を受けにくいセロトニン及び／又は５−ヒドロキシイン
ドール酢酸の精製及び測定を行うことができる。
を受けにくいセロトニン及び／又は５−ヒドロキシイン
ドール酢酸の精製及び測定を行うことができる。
【図１】実施例１で使用した測定装置の概要図である。
【図２】実施例１の標準試料の測定結果を示す図であ
る。
る。
【図３】実施例１の患者血漿１の測定結果を示す図であ
る。
る。
【図４】実施例１の患者血漿２の測定結果を示す図であ
る。
る。
【図５】実施例１の患者血漿３の測定結果を示す図であ
る。
る。
【図６】実施例１の患者血漿４の測定結果を示す図であ
る。
る。
【図７】実施例１の健常人血漿の測定結果を示す図であ
る。
る。
【図８】実施例１の患者尿１の測定結果を示す図であ
る。
る。
【図９】実施例１の患者尿２の測定結果を示す図であ
る。
る。
【図１０】実施例１の健常人尿の測定結果を示す図であ
る。
る。
Ｅ１ 吸着液 Ｅ２ 洗浄液 Ｅ３ 溶出・溶離液 Ｒ１ 反応液１ Ｒ２ 反応液２ Ｄ デガッサー Ｓ１ ３方電磁弁１ Ｓ２ ３方電磁弁２ Ｐ１ ポンプ１ Ｐ２ ポンプ２ Ｐ３ ポンプ３ Ｐ４ ポンプ４ ＲＥ リアクター ＦＳ 蛍光検出器 ＡＳ オートサンプラー Ｃ１ プレカラム Ｃ２ 分離カラム Ｍ１ ６方モーターバルブ
Claims (6)
- 【請求項１】セロトニン及び／又は５−ヒドロキシイン
ドール酢酸を含む試料をプレカラムに吸着させる工程、
セロトニン及び５−ヒドロキシインドール酢酸をプレカ
ラムから溶出させる工程、及び溶出したセロトニン及び
５−ヒドロキシインドール酢酸を回収する工程からな
る、セロトニン及び／又は５−ヒドロキシインドール酢
酸の精製法において、プレカラムが逆相カラムであり、
吸着工程における吸着液がｐＨ５．０以下で、かつ塩基
性物質用イオンペア試薬を含んだ溶液であり、また溶出
工程における溶出液が前記吸着液に比べｐＨが１．０以
上高い溶液であることを特徴とする方法。 - 【請求項２】請求項１に記載の精製法において、プレカ
ラムからセロトニンおよび５−ヒドロキシインドール酢
酸を溶出する溶出液に、塩基性物質用イオンペア試薬が
含まれないことを特徴とする方法。 - 【請求項３】請求項１又は２に記載の精製法において、
プレカラムからセロトニンおよび５−ヒドロキシインド
ール酢酸を溶出する溶出液に、有機溶媒が含まれること
を特徴とする方法。 - 【請求項４】請求項１〜３いずれかに記載の方法により
精製したセロトニン及び／又は５−ヒドロキシインドー
ル酢酸を分離カラムに導入し分離する工程、及び分離し
た各成分を検出または測定する工程からなることを特徴
とする、セロトニン及び／又は５−ヒドロキシインドー
ル酢酸の測定方法。 - 【請求項５】請求項４に記載の測定方法において、分離
カラムとして逆相カラムを用いることを特徴とする方
法。 - 【請求項６】請求項４または５に記載の測定方法におい
て、プレカラムからの溶出液と分離カラムからの溶離液
とが同じ組成であることを特徴とする方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23033099A JP4258072B2 (ja) | 1999-08-17 | 1999-08-17 | セロトニン及び５−ヒドロキシインドール酢酸の精製法及び測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23033099A JP4258072B2 (ja) | 1999-08-17 | 1999-08-17 | セロトニン及び５−ヒドロキシインドール酢酸の精製法及び測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001056326A true JP2001056326A (ja) | 2001-02-27 |
| JP4258072B2 JP4258072B2 (ja) | 2009-04-30 |
Family
ID=16906157
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23033099A Expired - Fee Related JP4258072B2 (ja) | 1999-08-17 | 1999-08-17 | セロトニン及び５−ヒドロキシインドール酢酸の精製法及び測定方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4258072B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006105944A (ja) * | 2003-10-27 | 2006-04-20 | Tosoh Corp | ニコチン依存度の判定方法 |
| JP2011089854A (ja) * | 2009-10-21 | 2011-05-06 | Tosoh Corp | セロトニンの測定方法 |
| KR20210150672A (ko) * | 2020-06-04 | 2021-12-13 | 한국과학기술연구원 | 유도체화를 이용한 신경전달물질 및 그의 대사체의 동시분석법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012113371A1 (de) * | 2011-02-21 | 2012-08-30 | Thanares GmbH | Nachweis von dimeren catecholaminmetaboliten als indikatoren für neurodegenerative erkrankungen |
-
1999
- 1999-08-17 JP JP23033099A patent/JP4258072B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| JP2006105944A (ja) * | 2003-10-27 | 2006-04-20 | Tosoh Corp | ニコチン依存度の判定方法 |
| JP4569255B2 (ja) * | 2003-10-27 | 2010-10-27 | 東ソー株式会社 | ニコチン依存度の判定方法 |
| JP2011089854A (ja) * | 2009-10-21 | 2011-05-06 | Tosoh Corp | セロトニンの測定方法 |
| KR20210150672A (ko) * | 2020-06-04 | 2021-12-13 | 한국과학기술연구원 | 유도체화를 이용한 신경전달물질 및 그의 대사체의 동시분석법 |
| KR102340107B1 (ko) | 2020-06-04 | 2021-12-17 | 한국과학기술연구원 | 유도체화를 이용한 신경전달물질 및 그의 대사체의 동시분석법 |
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|---|---|
| JP4258072B2 (ja) | 2009-04-30 |
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