JP2001037486A - 腎疾患治療薬およびそのスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な作用機序を有する腎疾患治療薬もしく
は予防薬、そのスクリーニング方法および同定方法を提
供する。また、前記方法などに有用な新規細胞株を提供
する。 【解決手段】 脂肪酸結合蛋白質の発現に対する被験物
質の増強作用を検定することを特徴とする、腎疾患治療
薬もしくは予防薬のスクリーニング方法又は同定方法。
新規なマウス近位尿細管上皮細胞株。脂肪酸結合蛋白質
の発現増強作用を有する薬物を有効成分とする腎疾患治
療薬もしくは予防薬。ペルオキシソームプロリフェレー
タ活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニスト作用又はカルニ
チンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）阻害作
用を有する化合物などからなる脂肪酸結合蛋白質発現増
強薬、腎疾患治療薬もしくは予防薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、腎疾患治療薬のス
クリーニング方法および同定方法に関する。特に、脂肪
酸結合蛋白質の発現に着目したスクリーニング方法およ
び同定方法に関する。また、腎臓（近位尿細管）の細胞
から樹立した細胞株に関する。

【０００２】

【従来の技術】腎炎などの腎臓疾患は、複雑で多様な病
態を呈するが、いずれも慢性化すると、糸球体硬化や間
質の線維化などが起こり、さらには腎不全にいたる重篤
な経過をたどることがある。このため早い段階での的確
な治療が望まれるが、現状では有効な治療薬は極めて少
ない。また、数少ない治療薬の一つであるステロイド系
薬物は、明確な効果が認められる反面、副作用が非常に
強いという問題があり、新しい優れた治療薬が強く求め
られていた。

【０００３】一方、脂肪酸結合蛋白質（ＦＡＢＰ：fatt
y acid binding protein）は、サイトゾルに存在し、脂
肪酸と結合する能力を有する分子量約１５キロダルトン
前後の蛋白質群である。脂肪酸を細胞内に転送したり蓄
積することによって代謝酵素系の調節に関与していると
考えられているが、これまで、ＦＡＢＰと腎疾患との関
連性については何ら知られてはいなかった。

【０００４】ＦＡＢＰとしては、肝型（L-FABP）、腸型
（I-FABP）、心筋型（H-FABP）、脳型（B-FABP）、皮膚
型（C-FABP/E-FABP）、脂肪細胞型（aP2）、末梢神経細
胞型（ミエリンP2）等少なくとも７つの分子種が知られ
ている。これらはいずれも脂肪酸結合能を有し、共通の
祖先遺伝子から進化したファミリーであると考えられて
いる。各型のＦＡＢＰは特異的な組識分布を示し、命名
は、初めにどの組織から見出されたかを意味するが、そ
の組織にしか存在しないことを必ずしも意味するもので
はない。

【０００５】ヒトの腎臓組織中では、肝型（L-FABP）と
心筋型（H-FABP）の少なくとも二種類のＦＡＢＰが発現
しており、これらのうちＬ-ＦＡＢＰは近位尿細管に分
布し、Ｈ-ＦＡＢＰは主として遠位尿細管に分布してい
る（Maatmanら、BiochemicalJournal、第288巻、第285-
290頁、1992年；Maatmanら、Biochemical Journal、第2
73巻、第759-766頁、1991年）。

【０００６】ゲッ歯類の腎臓においては、ＦＡＢＰの発
現・分布がヒトとは異なる。Ｌ-ＦＡＢＰは近位尿細管
ではほとんど発現しておらず、ごく少量遠位尿細管に分
布している（Maatmanら、Biochemical Journal、第288
巻、第285-290頁、1992年）。ゲッ歯類の腎臓における
主要なＦＡＢＰは、Ｈ-ＦＡＢＰと腎型ＦＡＢＰ（Ｋ-Ｆ
ＡＢＰ）である。Ｈ-ＦＡＢＰは主に遠位尿細管に分布
している。Ｋ-ＦＡＢＰは、肝臓で合成されたα_2U-グロ
ブリンが血中から腎臓を経由して尿中に排出された後、
その一部が尿細管細胞内に再吸収され、細胞内でプロセ
ッシングを受けて腎型ＦＡＢＰに変換されると考えられ
ている（Kimuraら、FEBS Letters、第246巻、第101-104
頁、1989年）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
な作用機序を有する腎疾患治療薬もしくは予防薬、その
スクリーニング方法または同定方法を提供することにあ
る。また、前記スクリーニング方法または同定方法等に
有用な新規細胞株を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】前記の通り、ＦＡＢＰと
腎疾患との関連性については何ら知られてはいなかった
が、発明者らは、独自に、腎炎モデルマウスで、マクロ
ファージ浸潤や尿細管間質線維化に先行して、尿中ある
いは腎臓組織でＦＡＢＰが減少することを見出した。ま
た、ヒトでも、予後不良を示す腎疾患患者で腎組織のＬ
−ＦＡＢＰが減少していることを見出し、これら知見に
基づいて、ＦＡＢＰに着目した腎疾患の診断方法を確立
した（特開平１１−２４２０２６号、ＷＯ９９／２７３
６３）。また、発明者らは、さらに研究を進め、ＦＡＢ
Ｐの発現増強が腎炎などの腎疾患治療につながること、
すなわち、ＦＡＢＰの発現を増強する薬物は腎疾患治療
薬となり得ることを見出し、本発明を完成するにいたっ
た。

【０００９】すなわち、本発明は、動物細胞における脂
肪酸結合蛋白質（ＦＡＢＰ）の発現に対する被験物質の
増強作用を検定することを特徴とする、腎疾患治療薬も
しくは予防薬のスクリーニング方法又は同定方法であ
る。また、かかる方法により選択又は同定された腎疾患
治療薬もしくは予防薬である。また、腎臓の細胞又は組
織においてＦＡＢＰの発現を増強する作用を有する薬物
（ペルオキシソームプロリフェレータ活性化受容体（Ｐ
ＰＡＲ）のアゴニスト作用を有する化合物など）を有効
成分とする腎疾患治療薬もしくは予防薬である。さら
に、前記スクリーニング方法又は同定方法のために有用
な新規なマウス近位尿細管上皮細胞株である。

【００１０】本発明の方法で選択又は同定される腎疾患
治療薬もしくは予防薬、すなわちＦＡＢＰの発現を増強
する薬物の作用機作は、以下のように考えられる。

【００１１】高度蛋白尿は、最近では、単なる腎障害の
指標ではなくそれ自体危険因子の一つとされており、例
えば、蛋白尿の主成分であるアルブミンと脂肪酸を結合
させて尿細管上皮細胞に過剰負荷した場合、マクロファ
ージを活性化する脂質性因子が産生されること等が知ら
れている（Kees-Foltsら、Kidney International、第45
巻、第1697−1709頁、1994年；Eddyら、Journal of Ame
rican Society of Nephrology、第５巻、第1273−1287
頁、1994年）。

【００１２】尿蛋白と結合した脂肪酸は、近位尿細管上
皮細胞の刷子縁膜から再吸収され、細胞内のＦＡＢＰと
結合し、ミトコンドリアやペルオキシソームに輸送され
β酸化されると考えられる。しかし、ＦＡＢＰの存在量
が十分でない場合には、脂肪酸が正常なβ酸化を受け
ず、その結果、マクロファージを活性化する脂質性因子
（腎障害性因子）の産生等が誘導されて、免疫学的機序
による間質の線維化等を進展させるであろう。これに対
して、近位尿細管上皮細胞内でのＦＡＢＰの発現を増強
させることにより、脂肪酸代謝を正常化し、腎障害性を
有する脂質性因子の産生を抑制することで、病態を改善
し得ると考えられる。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明（スクリーニング方法、同
定方法及び治療薬）の対象とする疾患としては、糖尿病
性腎症、糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、巣状糸球体硬
化症、免疫複合体腎症（ＩｇＡ腎症、膜性腎症など）、
ループス腎炎、薬剤性腎障害および腎不全などの腎疾患
が挙げられる。

【００１４】また、本発明は、ヒトの疾患に適用される
ほか、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、
ウサギ、ラット、マウスなどの哺乳動物にも適用され
る。

【００１５】ヒトなどの哺乳動物（ゲッ歯類以外）にお
いて、腎臓の細胞又は組織には、Ｌ-ＦＡＢＰ及びＨ-Ｆ
ＡＢＰが発現している。これらのうちＬ-ＦＡＢＰは近
位尿細管に分布し、Ｈ-ＦＡＢＰは主として遠位尿細管
に分布している。腎疾患治療薬を創製するためには、腎
臓の細胞又は組織におけるＦＡＢＰ、特に、近位尿細管
細胞におけるＦＡＢＰ（すなわち、ヒトなどにおいては
Ｌ-ＦＡＢＰ）に着目することが重要と考えられる。

【００１６】本発明の方法は、以下のような形態で実施
できる。すなわち、動物細胞（哺乳動物の細胞又は組織
など）を被験物質の存在下に培養し、細胞内でのＦＡＢ
Ｐの発現量を、被験物質非存在下で培養した場合と比較
することにより、被験物質のＦＡＢＰ発現増強作用を検
定すればよい。あるいは、動物個体に被験物質を投与
し、腎臓の組織や細胞などにおけるＦＡＢＰの発現を非
投与の場合と比較することにより、被験物質のＦＡＢＰ
発現増強作用を検定してもよい。

【００１７】被験物質の存在下（又は投与例）でのＦＡ
ＢＰ発現量が高かった場合に、被験物質は、その度合い
に応じた増強作用を有すると判定され、腎疾患治療薬と
しての効果が期待できる。ＦＡＢＰ発現増強作用の強い
被験物質を選別し候補とすることにより、腎疾患治療薬
を好適にスクリーニングすることができる。

【００１８】また、候補薬のＦＡＢＰ発現増強作用を検
定し、ＦＡＢＰ発現増強作用を有する薬物として同定す
ることで、腎疾患治療薬としての作用機序が明確にさ
れ、治療薬としての優れた特徴付けを行うことができ
る。

【００１９】ＦＡＢＰの発現を検出する方法としては、
遺伝子の発現をレポーターアッセイ法によりレポーター
蛋白質を指標として測定する方法が挙げられる。また、
遺伝子発現をｍＲＮＡレベルで検出することもできる。
あるいはまた、細胞抽出液中のＦＡＢＰの発現を蛋白質
レベルで直接検出することできる。

【００２０】遺伝子発現をレポーターアッセイ法で測定
する場合、具体的には、例えば、ＦＡＢＰ遺伝子の転写
調節領域とその下流に連結されたレポーター遺伝子から
なるＤＮＡ構成を調製し、これを適当な動物細胞に導入
する。この細胞を、被験物質の存在下及び非存在下に培
養した後、細胞抽出液中のレポーター蛋白質の活性など
を測定することにより、発現量を定量し比較すればよ
い。

【００２１】ＦＡＢＰのアミノ酸配列や遺伝子配列は、
多くの種においてすでに報告されている（Veerkamp and
Maatman、Prog.Lipid Res.、第34巻、第17−52頁、199
5年）。例えば、Ｌ−ＦＡＢＰについては、ヒトのｃＤ
ＮＡ（Loweら、Journal of Biological Chemistry、第2
60巻、第3413−3417頁、1985年；Genbank/EMBL登録番号
M10050）、ラットの染色体遺伝子（Sweetserら、Journa
l of Biological Chemistry、第261巻、第5553−5561
頁、1986年；Genbank/EMBL登録番号M13501）などの配列
情報が既知である。

【００２２】従って、ＦＡＢＰのｃＤＮＡや染色体遺伝
子は、前記のような配列情報をもとにプラーマーやプロ
ーブを設計し、ＰＣＲ法、コロニーハイブリダイゼーシ
ョン法、プラークハイブリダイゼーション法等を適宜組
合せて、適当なＤＮＡライブラリーから取得できる。

【００２３】レポーター構成及びこれを含むレポーター
プラスミドは、ＦＡＢＰの染色体遺伝子中の５'上流域
に存在する転写調節領域と、適当なレポーター遺伝子を
用いて、通常の遺伝子組換え技術により調製することが
できる。

【００２４】レポーター遺伝子は特に限定されないが、
安定でかつ活性の定量的測定が容易な酵素の遺伝子など
を用いることが好ましい。このようなレポーター遺伝子
としては、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、
バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル
由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）等が挙げられ
る。

【００２５】遺伝子発現をｍＲＮＡレベルで検出する場
合は、例えば細胞や組織から、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽
出して、ＰＣＲ法（Polymerase chain reaction metho
d）（「PCR Protocols」Innis MA, Gelfad DH, Sninsky
JJ and White TJ eds., Academic Press, Sandiego, 1
990年）、ＲＮＡ分解酵素プロテクションアッセイ法（R
Nase protection assay method）（Nucleic Acid Resea
rch、第12巻、第7035−7056頁、1984年）、あるいはノ
ーザンブロット解析法などを利用して、ＦＡＢＰ遺伝子
から転写されたｍＲＮＡを検出定量すればよい。

【００２６】ＦＡＢＰの発現を蛋白質レベルで検出する
場合には、例えば抗ＦＡＢＰ抗体などを用いる免疫化学
的方法（ＥＬＩＳＡ法、免疫組織染色法など）を用いる
ことができる。抗体は、免疫抗原として精製ＦＡＢＰを
用い、常法により調製できる。ＦＡＢＰの各分子種につ
いては、すでにその臓器分布、分子量、一次構造などが
報告されている（藤井ら、動脈硬化、第24巻、353-361
頁、1996年； Veerkamp and Maatman、第34巻、17-52
頁、1995年；Drickamerら、J.Biol.Chem.、第256巻、36
34-3636頁、1981年； Untermanら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA、第78巻、3478-3482頁）。精製ＦＡＢＰは、これ
ら情報をもとに調製できる。あるいは、前記既知遺伝子
配列情報に基づいて、ｃＤＮＡを単離し、遺伝子組換え
技術により調製して用いてもよい。

【００２７】本発明の方法をインビトロにて、培養細胞
を用いて実施する場合、細胞は、動物細胞（哺乳動物の
細胞等）を用いることが望ましい。中でも、動物の腎臓
由来の細胞が好ましく、尿細管細胞がより好ましく、と
りわけ近位尿細管上皮細胞がとりわけ好ましい。細胞
は、初代培養細胞、不死化細胞（株化細胞）のいずれを
用いてもよい。不死化細胞（株化細胞）を用いた場合に
は、培養や取り扱いが容易となる点で有利である。

【００２８】ヒトの腎臓由来の細胞としては、ヒトの尿
サンプルから尿中落下細胞（特に近位尿細管上皮細胞）
を分離して用いることができる。ヒトの腎臓由来の細胞
を用いた場合には、ヒトでの作用をより確かに予測でき
る点で有利である。

【００２９】尿細管由来の既知細胞株としては、具体的
には例えば、イヌの尿細管（遠位尿細管）由来細胞株で
あるＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ６２５３）、ブタの
尿細管（近位尿細管）由来細胞株であるＬＬＣ−ＰＫ１
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １３９２）などが挙げられる。

【００３０】また、これらの他、マウス細胞株ｍＰｒｏ
ｘ３７−１３（受託番号 ＦＥＲＭＰ−１６９８５；受
託日 １９９８年９月９日）など、本発明者らが後記実
施例２においてマウスの近位尿細管細胞から樹立した不
死化細胞株が挙げられる。これら細胞株は、下記
（１）、（２）及び（３）の性質を有する。 （１）上皮細胞の形態を有する。 （２）アルブミン取り込み能を有する。 （３）上皮小体ホルモンによる刺激に応答して細胞内ｃ
ＡＭＰ産生が誘導されるが、バソプレッシンによる刺激
には応答しない。

【００３１】前記の既知尿細管由来細胞株のうち、ＬＬ
Ｃ−ＰＫ１は近位尿細管由来とされており上皮細胞であ
るが、生体内の近位尿細管細胞に特徴的なホルモン応答
性である（３）の性質を失っている（後記実施例２参
照）。これに対し、本発明者らの樹立した細胞株は、ホ
ルモン応答性も含めて近位尿細管上皮細胞の特徴を明確
に維持している株化細胞であるので、これら細胞株を使
用すれば、生体内の生理的環境により近い系となる。こ
のような細胞を、使用することは、効果的な腎疾患治療
薬のスクリーニング方法及び同定方法のために有利であ
る。

【００３２】本発明の方法により、ＦＡＢＰの発現を増
強する作用が認められた被験物質については、さらに腎
疾患の既知病態モデル（in vivo又はin vitro）におい
て治療効果及び予防効果を確認すればよい。

【００３３】このようなインビトロの病態モデルとして
は、尿細管細胞を用いる腎障害性リピド（炎症性リピ
ド）の産生モデル（Kees-Foltsら、Kidney Internation
al、第45巻、第1697−1709頁、1994年；後記実施例５）
などが挙げられる。また、インビボの病態モデルとして
は、加速型抗ＧＢＭ腎炎モデル（Nagaiら、Jpn.J.Pharm
acol.、第32巻、第1117-1124頁、1982年）、ＳＴＺ誘発
糖尿病性腎症モデル（Sharmaら、Diabetes.、第45巻、
第522-530頁、1996年）、ピューロマイシン誘発巣状糸
球体硬化症モデル（Hiranoら、Nephron、第60巻、第443
-447頁、1992年）、アドリアマイシン誘発糸球体硬化症
モデル（Chenら、Nephron、第78巻、第440‐452頁、199
8年）、シクロスポリン腎症モデル（Gillumら、Transpl
ant、第46巻、第285‐292頁、1988年）などが挙げられ
る。

【００３４】ＦＡＢＰ発現増強作用を有する薬物として
は、例えば、ペルオキシソームプロリフェレータ活性化
受容体（peroxisome proliferator-activated recepto
r；ＰＰＡＲ）のアゴニスト、カルニチンパルミトイル
トランスフェラーゼ（carnitine palmitoyltransferas
e；ＣＰＴ）の阻害剤などを見出している。ＦＡＢＰ遺
伝子の上流域にペルオキシソームプロリフェレータ応答
配列が見られることは、ＰＰＡＲアゴニストがＦＡＢＰ
発現増強作用を有することを裏付ける。

【００３５】ＰＰＡＲのアゴニストとしては、既知のＰ
ＰＡＲアゴニスト（Lehmannら、Journal of Biological
Chemistry、第270巻、第12953-12956頁、1995年； Wi
llsonら、Journal of Medicinal Chemistry、第39巻、
第665-668頁、1996年）の他、文献記載の方法（ＷＯ９
９／１０５３２； ＷＯ９６／３３７２４； ＷＯ９６
／２２８８４； Mizukamiら、Biochemical Biophysica
l Research Communications、第240巻、第61‐64頁、19
97年； Kreyら、Molecular Endocrinology、第11巻、
第779‐791頁、1997年； Buckleら、Bioorganic & Med
icinal ChemistryLetters、第6巻、第2121‐2126頁、19
96年； Tontonozら、Genes and Development、第8
巻、第1224‐1234頁、1994年）により、ＰＰＡＲアゴニ
スト作用が新たに確認された化合物も使用できる。これ
らのうち、ＰＰＡＲのアゴニストとしては、ＭＣＣ−５
５５（化学名 5-[6-(2-Fluorobenzyloxy)naphthalen-2
-ylmethyl]thiazolidine-2,4-dione；ＥＰ６０４９８
３）がとりわけ好適に使用できる。

【００３６】ＣＰＴの阻害剤としては例えば、既知のＣ
ＰＴ阻害剤（Current Pharmaceutical Design、第４
巻、第1-15頁、1998年）の他、文献記載の方法（Saeed
ら、Arch. Biochem. Biophys.、第305巻、第307-312
頁、1993年； Kanamuraら、Life Science、第37巻、第
217‐223頁、1985年； Shinagawaら、J. Med. Chem.、
第30巻、第1458‐1463頁、1987年）により、ＣＰＴ阻害
作用が新たに確認された化合物も使用できる。このう
ち、ＣＰＴの阻害剤としては、エトモキシール（Etomox
ir）（化学名 ethyl 2-[6-(4-chlorophenoxy)hexyl]-o
xiranecarboxylate；ＥＰ４６５９０および Current P
harmaceutical Design、第４巻、第1-15頁、1998年）、
４−ＴＨＡ（化学名 2-hydroxy-3-propyl-4-[6-(tetra
zol-5-yl)hexyloxy]acetophenone；Biochemi.J. 第252
巻、第409−414頁、1988年）が好適に使用できる。

【００３７】ＰＰＡＲアゴニストやＣＰＴ阻害剤は、糖
尿病の治療薬として知られている。また、糖尿病病態モ
デルにおいて、糖尿病に起因する腎疾患の症状が改善さ
れることが報告されている（Buckinghamら、Diabetes、
第47巻、第1326‐1334頁、1998年）。しかし、これは、
原疾患である糖尿病が改善されることに基づくものと推
察され、糖尿病に起因しない腎疾患に、ＰＰＡＲのアゴ
ニストやＣＰＴ阻害剤などを適応することについては何
ら知られておらず示唆もない。一方、本発明の治療薬又
は予防薬は、糖尿病に起因する腎疾患（例えば、糖尿病
性腎症）を除く腎疾患にも好適に適応されるものであ
る。

【００３８】本発明において、被験物質、ＦＡＢＰ発現
増強作用を有する薬物、ＰＰＡＲのアゴニスト、ＣＰＴ
の阻害剤などを動物個体あるいはヒトに投与する場合に
は、経口、静脈内、筋肉内、皮下などいずれの投与形態
を用いてもよい。投与形態に応じた不活性な担体と共
に、必要に応じては製剤化して用いることもできる。投
与量は、投与方法や個体の年齢、体重、疾患の程度など
によって異なるが、通常、１日当たり、経口投与の場合
は、１〜３００ｍｇ／ｋｇ、非経口投与の場合には、
０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で設定される。

【００３９】本発明の医薬（治療薬又は予防薬）は、Ｆ
ＡＢＰ発現増強作用（又はＰＰＡＲのアゴニスト作用、
又はＣＰＴの阻害作用）に基づいて生体内での薬効を発
現するものである。本発明の医薬としては、生体内での
薬効発現のために十分な強さのＦＡＢＰ発現増強作用
（又はＰＰＡＲのアゴニスト作用、又はＣＰＴの阻害作
用）を有しない薬物は含まれない。また、ＦＡＢＰ発現
増強作用（又はＰＰＡＲのアゴニスト作用、又はＣＰＴ
の阻害作用）以外の他の主作用に基づいて生体内での薬
効を発現する薬物は含まれない。また、本発明の医薬と
しては、毒性あるいは薬物動態の面での好ましからざる
性格等のために、疾病の治療又は予防に使用できないも
のは含まれない。

【００４０】以下、実施例をもって本発明をさらに詳し
く説明するが、これらの実施例は本発明を制限するもの
ではない。

【００４１】なお、下記実施例において、各操作は特に
明示がない限り、「モレキュラークローニング（Molecu
lar Cloning）」（Sambrook, J., Fritsch, E. F.及びM
aniatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pres
sより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、
または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の
指示書に従って使用した。

【００４２】

【実施例】実施例１ Ｌ−ＦＡＢＰレポータープラスミ
ドの作製 （１）ヒトＦＡＢＰのｃＤＮＡの単離 ヒトＬ−ＦＡＢＰのｃＤＮＡを、ヒト肝臓由来のcDNAラ
イブラリー（クロンテック社製、Cat#HL1115b LOT#562
1）からＰＣＲ（polymerase chain reaction）法にて単
離した。プライマーは、既知配列情報（Loweら、Journa
l of Biological Chemistry、第260巻、第3413-3417
頁、1985年；Genbank/EMBL登録番号M10050）を元に設計
し、ＰＣＲで得られる断片の両末端にはＢａｍＨＩ認識
部位が付加されるようにした。ＰＣＲにより得られたＤ
ＮＡ断片（約420塩基対）は、ヒトＬ−ＦＡＢＰｃＤＮ
Ａの全翻訳領域を含んでいた。この断片を適当なプラス
ミドに連結した。

【００４３】（２）ヒトＦＡＢＰの染色体遺伝子の単離 前項（１）で得たヒトＦＡＢＰｃＤＮＡを含む断片（約
420塩基対、ＢａｍＨＩ断片）をプローブとして用い、
ヒト染色体ＤＮＡライブラリー（クロンテック社製、Ca
t#HL1006d LOT#19412）から、プラークハイブリダイゼ
ーション法によりヒトＬ−ＦＡＢＰの染色体遺伝子をク
ローニングした。得られたクローンは、約２０ｋｂの挿
入断片を含んでいた。部分的に塩基配列を決定したとこ
ろ、この断片中にヒトＬ−ＦＡＢＰの全翻訳領域が含ま
れていることがわかった。

【００４４】この挿入断片のうち、５'上流域を含む断
片（約５３６０ｂｐ、ＳａｌＩ−ＫｐｎＩ断片）を切り
出し、ベクタープラスミドに組み込んで以下の実験に用
いた。５'上流域を含む断片（ＳａｌＩ−ＫｐｎＩ断
片）の塩基配列を、後記配列表の配列番号１に示した。

【００４５】（３）Ｌ−ＦＡＢＰレポータープラスミド
の作製 前項（２）で得たＬ−ＦＡＢＰ遺伝子断片（約5360塩基
対、ＳａｌＩ−ＫｐｎＩ断片）を鋳型とし、ＰＣＲ法に
より、ＮｓｐＶ認識部位（５'上流域中;配列番号１の46
70番目の塩基）から約100塩基ほど下流（開始コドンの
直前）までの領域を増幅し、断片（約100ｂｐ）を得
た。また、これとは別に、先のＳａｌＩ−ＫｐｎＩ断片
をプラスミドｐＵＣ１８のＳａｌＩ−ＫｐｎＩ切断部位
に組み込んだ後、得られたプラスミドをＮｓｐＶ及びＫ
ｐｎＩで消化して、ＮｓｐＶ認識部位から下流の部分を
欠失させた。先のＰＣＲで得た断片をこれと連結し、プ
ラスミドｐＵＣ１８−９／２５を得た。

【００４６】次いでこのプラスミドを、ＳａｌＩ及びＫ
ｐｎＩで消化し、得られる断片（約4760塩基対）を、ベ
クタープラスミドｐＧＶ−Ｂ（東洋インキ社製）に挿入
し、レポーターアッセイ用のプラスミドを得た。挿入断
片は、配列番号１の第１〜4760番目（開始コドン直前）
までに相当する塩基配列を含み、その３'末端にＫｐｎ
Ｉ認識配列（６塩基対）が付加されている。

【００４７】得られたＬ−ＦＡＢＰレポータープラスミ
ドは、ヒトＬ−ＦＡＢＰ遺伝子の転写調節領域を含む
５'上流域の下流にルシフェラーゼ遺伝子（プロモータ
ー領域を含まない）が連結されたレポーター構成を有す
る。

【００４８】実施例２ 尿細管細胞の初代培養・不死化
およびＬ−ＦＡＢＰレポーター構成の導入 （１）ネフロンの単離 顕微解剖法により、以下のようにして、マウスの腎臓か
らネフロンを単離した。マウスをペントバルビタールに
て麻酔後開腹し、０．１％ＢＳＡを含む冷ハンクス緩衝
液（Hank's buffered solution：ＨＢＳ）２０ｍｌを、
腹部大動脈より灌流した。次いで、０．１％ＢＳＡおよ
び０．１％コラゲナーゼ（collagenasetype1）を含む冷
ＨＢＳ １０ｍｌを灌流した。これら灌流液は、あらか
じめ５％ＣＯ₂−９５％Ｏ₂混合ガスにより飽和させたも
のを用いた。次に腎臓を摘出し、外科手術刃（Surgical
Brade）で厚さ０．５〜１．０ｍｍのスライス片を作製
した。これを０．１％コラゲナーゼ溶液（HBS中）１０
ｍｌに浸し、３７℃、１０分間酵素処理を行った後、Ｈ
ＢＳで２回洗浄した。このスライス片を、氷冷した状態
で実体顕微鏡にて観察しながら単一セグメント（ネフロ
ン）を単離した。

【００４９】（２）尿細管上皮細胞の初代培養 前項（１）で得られた単一セグメント（ネフロン）を用
い、以下のようにして尿細管細胞の初代培養を行った。
単一セグメントを、１０％ウシ胎児血清を含むＫ１培地
（50:50 DMEM/Ham's F-12、15mM Hepes、13.4mM sodium
bicarbonate、5μg/ml insulin、5μg/ml transferri
n、5ng/ml selenous acid、0.05μM hydrocortisone、1
0ng/ml epidermal growth factor）で２回洗浄した後、
９６穴プレートに播種し、同培地中一晩培養した。翌
日、支持細胞（Feeder layer）を添加（2.5〜5×10³cel
ls／well）し、単一セグメントと共培養した。支持細胞
としては、マウス腎間葉系由来細胞（密度勾配遠心法に
よりマウス腎臓から単離した後不死化して得た細胞株）
又はマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞をＸ線照射して増殖能を欠
如させたものを用いた。培地としては、１０％ウシ胎児
血清含有Ｋ１培地に、支持細胞の培養上清を等量加え、
さらにＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor）（25ng/m
l）を添加したものを用いた。また、プレートは、予め
０．１％ゼラチンにてコーティング処理したものを使用
した。４〜６日間培養後、セグメントから上皮細胞（尿
細管上皮細胞）の遊走が顕微鏡下で確認できた。

【００５０】（３）尿細管上皮細胞の不死化 前項（２）と同様にして尿細管上皮細胞の培養を行っ
た。

【００５１】上皮細胞の遊走が確認された後、SV40 Lar
ge T抗原遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を含むプラ
スミド（ネオマイシン耐性遺伝子を含む市販プラスミド
ｐＧＥＭ３ＳＲαｎｅｏにSV40 Large T抗原遺伝子を挿
入して作製したプラスミド）をトランスフェクションし
た。トランスフェクションは、プラスミドとトランスフ
ェクタム（エアブラウン社製；カチオン性リポソーム）
の混合液を添加した培地中で、細胞を１〜３時間３７℃
で培養することにより行った。

【００５２】トランスフェクション後、２〜３日間培養
した後、トリプシン−ＥＤＴＡにて処理して細胞を剥離
し、４８穴プレートに継代した。その際、新たに支持細
胞を添加（約1x10⁴cells／well）した。継代１〜２日後
に、再度、同プラスミドをトランスフェクションした。
以後培養スケールを拡大しながら上記操作を反復して行
い、不死化細胞を取得した。得られた不死化細胞の培養
は、以後、支持細胞を用いず、０．１％ゼラチンにてコ
ーティング処理した培養器を用い、１０％ウシ胎児血清
を含むＫ１培地中にて行った。

【００５３】（４）Ｌ−ＦＡＢＰレポータープラスミド
の導入 前項（３）で得られた不死化細胞を一晩培養した。次い
で、前記実施例１で調製したヒトＬ−ＦＡＢＰレポータ
ープラスミド（18μg）を、ハイグロマイシン耐性遺伝
子を含むプラスミド（ｐＰＵＲ、Clontech社製、カタロ
グ#6156-1）（1.8μg）とともに用い、トランスフェク
ションを行った。トランスフェクションは、前項（３）
と同様に、トランスフェクタムを用いて行った。

【００５４】トランスフェクション後、ハイグロマイシ
ン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した培地（１０％ウシ胎
児血清含有Ｋ１培地）にて培養した。６日培養後に一回
継代した後、さらに１０日間培養し、生じたハイグロマ
イシン耐性コロニーを顕微鏡下で採取して、これらを９
６穴プレートに接種し、培養した。かくして、プラスミ
ドが導入された数種の形質転換細胞株（Ｎｏ．１０〜Ｎ
ｏ．１９）を得た。

【００５５】これら細胞株は、以後、１０％ウシ胎児血
清を含む高グルコース含有ダルベッコ−イーグル培地
（以下、ＤＭＥＭ培地）（Gibco社製）中にて培養を行
った。

【００５６】（５）細胞株の形態学的及び生理学的解析 前項（４）で得られた細胞株について、近位尿細管上皮
細胞としての形態学的特徴および生理学的特徴（ホルモ
ンに対する応答能、ＢＳＡ取込み能の解析）を有してい
るかどうか解析した。

【００５７】細胞株について形態学的な観察を行ったと
ころ、位相差顕微鏡による観察では、いずれも上皮細胞
に特徴的な敷石構造を取っていることが確認できた。ま
た、細胞株Ｎｏ．１３について、電子顕微鏡で観察した
ところ、尖端（apical）側に微絨毛が存在すること、上
皮細胞に特徴的な密着結合（tight junction）が形成さ
れていること、側底（basolateral）側にアクチンが発
現し、ヘモデスモソーム（hemodesmosome）が形成され
ていること、および、部分的にではあるが極性を有して
いることが確認された。これらの観察像から、取得した
細胞株は、上皮細胞であると考えられた。図1には、細
胞株Ｎｏ.１３の電子顕微鏡写真を示す。

【００５８】尿細管の上皮細胞は、各種ホルモンに対
し、各々の分節で特異的な応答性を示し、細胞内のｃＡ
ＭＰ産生を誘導することが知られている。例えば、近位
尿細管細胞は、上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）に対しての
み応答し、バソプレッシン（ＡＶＰ）に対しては応答を
示さない。一方、集合管およびＨｅｎｌｅ係蹄などで
は、ＡＶＰに対して応答を示す。

【００５９】そこで、各細胞株（細胞株Ｎｏ．１０、１
３、１４、１５、１６及び１９）について、後記参考例
１（６）記載の方法に準じ、ＰＴＨ及びＡＶＰに対する
応答を調べた。その結果、図２に示したように、細胞株
Ｎｏ．１０を除き全ての各細胞株がＰＴＨ刺激に対して
応答を示し、特に細胞株Ｎｏ．１３は非常に高い応答能
を維持していた。一方、ＡＶＰに対しては全ての細胞株
が応答を示さなかった。これらの結果から、Ｎｏ．１０
を除く各細胞株は、ホルモン応答能に関して近位尿細管
細胞としての特徴を有しており、特にＮｏ．１３はその
特徴がよく維持されていると考えられた。

【００６０】また、既知の近位尿細管上皮細胞株である
ＬＬＣ−ＰＫ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１３９２）につい
て、前記と同様にホルモン応答能を調べた。その結果、
ホルモン刺激に対するｃＡＭＰ産生量の比は、コントロ
ール：ＰＴＨ刺激時：ＡＶＰ刺激時で、１：０．７：
７．４であり、ＰＴＨには応答せず、ＡＶＰに応答する
ことがわかった。すなわち、ＬＬＣ−ＰＫ１は、細胞株
Ｎ０．１３とは異なり、ホルモン応答能に関して近位尿
細管細胞としての特徴を有していなかった。

【００６１】次に、細胞株Ｎｏ．１３及びＮｏ．１６に
ついて、後記参考例１（５）記載の方法に準じ、アルブ
ミン取り込み能を調べた。近位尿細管は、糸球体で濾過
された濾液中に含まれる蛋白の再吸収を担う分節であ
り、近位尿細管細胞は、血漿中に多量存在するアルブミ
ン等の取り込み能を有することが知られている。測定の
結果、図３に示したように、両細胞株にはアルブミン取
り込み能が認められた。特に細胞株Ｎｏ．１３は、コン
トロールに比して約５倍の高いアルブミン取込み能を示
し、このことから、細胞株Ｎｏ．１３は、アルブミン等
の取り込み能の点でも近位尿細管細胞としての特徴をよ
く維持していることがわかった。

【００６２】（６）Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子挿入領域の確認 細胞株Ｎｏ．１３は、前記の通り、マウス近位尿細管上
皮細胞株であるとともに、Ｌ−ＦＡＢＰレポータープラ
スミドが導入された細胞株である。その染色体上にレポ
ーター構成が挿入されていることを確認するために、以
下のようにサザンブロット解析を行った。

【００６３】レポータープラスミドに由来するヒトＬ−
ＦＡＢＰ遺伝子の転写調節領域が欠失を受けずに挿入さ
れていた場合、染色体ＤＮＡを制限酵素Ａｐａ−Ｋｐｎ
Ｉで切断することにより４．３Ｋｂの断片を生じるはず
である。細胞株Ｎｏ．１３の細胞から染色体ＤＮＡを調
製し、これを制限酵素ＡｐａおよびＫｐｎＩで処理した
後、アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後のゲルか
ら、ナイロン膜（Hyband N+ membrane、Amersham社製）
にＤＮＡをトランスファーした後、膜を２×ＳＳＣで洗
浄し乾燥させた。メンブレンを、プレハイブリダイゼー
ション処理後、プローブを含むハイブリダイゼーション
用緩衝液中にて、６５℃で一晩ハイブリダイゼーション
を行い、次いで２×ＳＳＣ（０．１％ＳＤＳ含有）で洗
浄（６５℃、３０分間）後、オートラジオグラフィーに
供した。プローブとしては、ヒトＬ−ＦＡＢＰ遺伝子の
５'上流配列を含む断片（１．２Ｋｂ）をＲＩ標識して
用いた。

【００６４】その結果、４．３Ｋｂの断片が検出され、
Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子転写調節領域が欠失なく挿入されて
いることが確認された。このことから、細胞株Ｎｏ．１
３は、その染色体上に、Ｌ−ＦＡＢＰレポータープラス
ミドに由来するＤＮＡ構成（ヒトＬ−ＦＡＢＰ遺伝子転
写調節領域およびルシフェラーゼ遺伝子からなる構成）
が挿入されていると考えられた。

【００６５】この細胞株Ｎｏ．１３（以下、ｍＰｒｏｘ
３７−１３と称する）は、細胞株の名称「マウス細胞株
ｍＰｒｏｘ３７−１３」として、工業技術院生命工学工
業技術研究所（ＦＥＲＭ）に寄託されている（受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１６９８５；受託日 １９９８年９月
９日）。

【００６６】実施例３ 近位尿細管上皮細胞におけるＬ
−ＦＡＢＰ発現増強作用の検定 前記実施例２で得られた、Ｌ−ＦＡＢＰレポーターＤＮ
Ａ構成を含む近位尿細管上皮細胞株ｍＰｒｏｘ３７−１
３（細胞株Ｎｏ．１３とも称する）を用い、以下のよう
に、レポーターアッセイ法により被験物質のＬ−ＦＡＢ
Ｐ発現増強作用を測定した。

【００６７】まず、細胞株ｍＰｒｏｘ３７−１３を、96
穴平底プレートに５ｘ１０⁴細胞/100μl/ウエルとなる
よう分注し、培養した。培養には、0.1％ゼラチンでコ
ーティング処理したプレートを用い、培地は１０％ウシ
胎児血清、ペニシリン（100単位／ml）及びストレプト
マイシン（100μg／ml）を添加した高グルコース含有ダ
ルベッコＭＥＭ培地（Dulbecco's MEM, high glucose；
ＤＭＥＭ）（Gibco社製）を用いた。４８時間培養後、
無血清培地で１回洗浄を行った後、被験物質を含む無血
清培地を加えた。コントロールは、被験物質無添加とし
た。さらに培養を行った後、２〜１０時間後のルシフェ
ラーゼ活性を測定した。

【００６８】ルシフェラーゼ活性は、以下のように測定
した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄
後、20μlの細胞溶解液（培養細胞溶解液ＬＣβ−５
１、東洋インキ社製）を加え、室温にて20分間放置後、
-80℃に一晩保存した。-80℃に保存したプレートを室温
に戻した後、100μlの発光基質液（ピッカジーン発光キ
ット、東洋インキ社製）を加え、反応を開始した。発光
量は、ルミノメータ（MicroLumat LP98P、BERTHOLD社
製）を用いて測定した。反応開始から１０秒間の相対光
度（ＲＬＵ）値を積算し、ルシフェラーゼ活性とした。
また、この活性値から、ルシフェラーゼ誘導率（Ｌｕｃ
誘導率）を以下のように算出した。

【００６９】Ｌｕｃ誘導率＝被験値／コントロール値 被験物質として、ペルオキシソームプロリフェレータ活
性化受容体（peroxisome proliferator-activated rece
ptor；ＰＰＡＲ）のアゴニスト（作動薬）であるＭＣＣ
−５５５、およびカルニチンパルミトイルトランスフェ
ラーゼ（carnitine palmitoyltransferase；ＣＰＴ）の
阻害剤であるエトモキシール（Etomoxir）を添加したと
ころ、ルシフェラーゼ活性誘導が認められた。このこと
から、これら化合物は、近位尿細管細胞においてＬ−Ｆ
ＡＢＰ遺伝子発現を増強する作用を有するものと同定さ
れる。測定結果を、図４に示した。

【００７０】ＭＣＣ−５５５（化学名 5-[6-(2-Fluoro
benzyloxy)naphthalen-2-ylmethyl]thiazolidine-2,4-d
ione；ＥＰ６０４９８３）およびエトモキシール（化学
名ethyl 2-[6-(4-chlorophenoxy)hexyl]-oxiranecarbox
ylate；ＥＰ４６５９０および Current Pharmaceutica
l Design、第４巻、第1-15頁、1998年）は文献記載の方
法に準じて合成したものを用いた。

【００７１】実施例４ 近位尿細管上皮細胞におけるＬ
−ＦＡＢＰ発現増強作用の検定 （ｍＲＮＡレベルおよび蛋白質レベルでの測定）前記実
施例１の（２）項にて単離したヒトＬ−ＦＡＢＰ染色体
遺伝子（全長）を含むプラスミドを線状化した後、ブタ
尿細管細胞株ＬＬＣ−ＰＫ１、又は前記実施例２の
（３）と同様にして得たマウスの不死化尿細管上皮細胞
にトランスフェクションし、安定な形質転換細胞を得
た。これら細胞は、ヒトＬ−ＦＡＢＰの染色体遺伝子が
欠失を受けることなく染色体上に組込まれていた。

【００７２】これら細胞を用い、以下のようにして被験
薬物のＬ−ＦＡＢＰ発現増強作用をｍＲＮＡレベルおよ
び蛋白質レベルで調べた。細胞を、コンフルエントにな
るまで培養した後、血清を含まないＤＭＥＭ培地に培地
交換し、最終濃度 １μＭになるよう被験薬物を培地中
に添加し、３７℃で培養した。また、対照例は、被験薬
物無添加とした。

【００７３】ｍＲＮＡレベルでの測定は以下のように行
った。培養後、細胞を回収しトータルＲＮＡを調製し
た。得られたトータルＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ
（Reverse transcriptase - Polymerase chain reactio
n）により、ヒトＬ−ＦＡＢＰのｍＲＮＡを検出した。
また、測定値の標準化のために、コントロールとしてＧ
ＡＰＤＨ（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenas
e）のｍＲＮＡを同様のＲＴ−ＰＣＲにて検出した。得
られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動後、エチジ
ウムブロマイドで染色して各バンドを検出し、デンシト
メトリー又は目視により発現量を判定した。その結果、
被験薬物としてＭＣＣ−５５５を添加した場合、培養後
１５分から２４時間までＬ−ＦＡＢＰｍＲＮＡの誘導作
用が認められた。

【００７４】蛋白質レベルでの測定は、以下のように行
った。培養後の細胞を回収し、超音波破砕した後、細胞
抽出液を調製した。抗ヒトＬ−ＦＡＢＰ抗体を用いるウ
エスタンブロティング法又はＥＬＩＳＡ法により、抽出
液中のＬ−ＦＡＢＰ量を測定した。その結果、被験薬物
としてＭＣＣ−５５５を添加することにより、Ｌ−ＦＡ
ＢＰ蛋白質の発現増強作用が認められた。また被験薬物
としてエトモキシールを添加した場合にも同様にＬ−Ｆ
ＡＢＰ蛋白質の発現増強作用が認められた。

【００７５】実施例５ 腎臓由来細胞における腎障害性
リピド産生誘導 （１）腎臓由来細胞の刺激 細胞として、ブタ尿細管細胞株ＬＬＣ−ＰＫ１又は前記
実施例４と同様の細胞（マウスの不死化尿細管上皮細胞
の染色体上にヒトＬ−ＦＡＢＰの染色体遺伝子が組み込
まれた安定な形質転換株）を用いた。以下のように、オ
レイン酸による刺激下で、細胞を培養することにより、
腎障害性リピド（Nephrotoxic lipid）の産生を誘導し
た。

【００７６】細胞は10cmディッシュを用い、10%牛胎児
血清を含むＤＭＥＭ培地中で培養した。コンフルエント
に達するまで培養した後、脂質（オレイン酸などの脂肪
酸を結合させたＢＳＡ、リポプロテインなど）を含む無
血清培地に培地交換し、３７℃で１６〜３６時間インキ
ュベートした。被験物質の作用を検定する場合には、脂
質とともに被験物質を添加した培地を用いた。

【００７７】（２）腎障害性リピドの抽出 培地中に産生される腎障害性リピドは、脂質成分として
酢酸エチルで抽出される。また、マクロファージ遊走活
性化能を有するので、その存在量は、マクロファージ遊
走試験により測定することができる。

【００７８】そこで、インキュベート後、培地を回収
し、これを遠心（3000rpm,5分間）して上清を分取し、
脂質成分を以下のように抽出した。すなわち、上清に2
倍量の酢酸エチルを加え、2分間激しく振盪した。10分
間静置した後、これを遠心し、その上層（酢酸エチル
層）を回収した。下層（水層）にさらに2倍量の酢酸エ
チルを加えて同様に再度抽出、回収した。回収した脂質
抽出物を、マクロファージ遊走試験に供した。

【００７９】（３）マクロファージ遊走試験 文献（Kees-Foltsら、Kidney International、第45巻、
第1697−1709頁、1994年）記載の方法に準じ、以下のよ
うに、脂質抽出物中のマクロファージ遊走活性を測定し
た。遊走試験は、96穴ケモタキシスチャンバー（Neurop
robe社製）と専用フレームフィルター（スタンダード、
ポアサイズ5μm、Neuroprobe社製）を用いて行った。遊
走細胞としては、マウスマクロファージ系細胞株RAW26
4.7（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−７１)を用いた。

【００８０】培養しておいたRAW264.7をスクレイパーで
回収後、２x10⁶個／mlになるように、10%牛胎児血清含
有ＤＭＥＭ培地に懸濁した。また、細胞を蛍光標識する
ためにカルセイン−ＡＭ（calcein-AM、同仁化学研究所
製）を最終濃度2μMになるように添加し、37℃、5分間
インキュベートした。これを10%牛胎児血清含有ＤＭＥ
Ｍ培地で一回洗浄後、１x10⁶個／mlとなるように同培地
に再懸濁した。

【００８１】前項（２）で得た脂質抽出物をガラスチュ
ーブ内で乾固し、ここに0.25%ＢＳＡ（lipid free、Sig
ma社製）を含むＤＭＥＭ培地を加えた。これを56℃にて
15分間インキュベーション後、15分間超音波処理（soni
cation）することにより懸濁化した。懸濁した脂質を、
ケモタキシスチャンバーの下室に31.5μlずつ注入し
た。フィルターで分けられた上室には、蛍光標識した細
胞の懸濁液（１x10⁶個／ml）を200μlずつ注入した。こ
のチャンバーを、CO₂インキュベーター中で3時間インキ
ュベートした後、チャンバーを上下反転し、さらに15分
間インキュベートした。

【００８２】インキュベーション終了後、フレームフィ
ルターを取り、上面の細胞を拭き取った後、フィルター
裏面の細胞を100%メタノールで90秒間固定した。裏面に
付着した細胞（すなわち遊走した細胞）の蛍光強度を、
蛍光プレートリーダー（Polar star 、BMG LabTechnolo
gies社製）を用いて測定（励起波長：485nm、蛍光波
長：538nm）し、サンプルのマクロファージ遊走活性を
測定した。

【００８３】刺激により腎臓由来細胞から産生誘導され
る腎障性リピドの量（遊走活性）が、被験物質の存在下
において非存在下の場合より少なければ、その被験物質
には、腎障性因子の産生を抑える作用があると判定し
た。

【００８４】実施例６ ヒト尿中落下細胞におけるＬ−
ＦＡＢＰ発現増強作用の検定 （ｍＲＮＡレベルでの測定） （１）ヒト尿中落下細胞の単離 腎組織から尿中に落下している尿細管上皮細胞（以下、
尿中落下細胞とよぶ）を以下のようにしてヒト尿サンプ
ルから分離し、培養に供した。

【００８５】まず、男児の腎炎患者（０から３才）か
ら、クリーンキャッチ法（clean-catch method）によ
り、尿サンプルを採取した。ついで、この尿サンプルを
室温で遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分）し、上清を
捨て、ペレットを、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清含有
のダルベッコ−イーグル培地（Dulbecco's modified Ea
gle's medium）にて２回、培養用培地で１回洗浄した。
培養用培地としては、ダルベッコ−イーグル培地とハム
ズＦ−１２培地（Ham's F-12 medium）を１：１で混合
したものに、ウシ胎児血清（１０％ｖ／ｖ）、インシュ
リン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍ
ｌ）、亜セレン酸ナトリウム（sodium selenite）（５
ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（１０^-8Ｍ）、ニコチン
アミド（５ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）及
びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した
ものを用いた。

【００８６】ペレットを培養用培地に懸濁し、適宜希釈
した後、タイプ４コラーゲンでコーティングを施した
３．５ｃｍ径ディッシュ（Falcon社製）中で培養を行っ
た。培養は５％ＣＯ₂、３７℃の条件で行った。

【００８７】培養した細胞が、尿細管上皮細胞であるこ
とは、培養器上でコンフルエントに達するとドーム形成
が観察されたこと、および アルカリホスファターゼ染
色で陽性を示すことにより確認した。

【００８８】（２）Ｌ−ＦＡＢＰ発現増強作用の検定 前記（１）で培養したヒト尿中落下細胞（ヒト尿細管上
皮細胞）を用い、以下のように、前記実施例４と同様に
して、被験薬物のＬ−ＦＡＢＰ発現増強作用をｍＲＮＡ
レベルで調べた。

【００８９】まず、細胞を、コンフルエントになるまで
培養した後、最終濃度 １μＭになるよう被験薬物を添
加したダルベッコ−イーグル培地（血清不含）に培地交
換し、３７℃で培養した。被験薬物としては、ＭＣＣ−
５５５および４−ＴＨＡ（2-hydroxy-3-propyl-4-[6-(t
etrazol-5-yl)hexyloxy]acetophenone）（ＣＰＴ阻害
薬）を用いた。また、対照例については、被験薬物を無
添加とした。

【００９０】培養後の細胞を回収しトータルＲＮＡを調
製した。得られたトータルＲＮＡを鋳型としてＲＴ−Ｐ
ＣＲ（Reverse transcriptase - Polymerase chain rea
ction）を行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳
動後、エチジウムブロマイドで染色して各バンドを検出
し、デンシトメトリー又は目視により発現量を判定し
た。また、測定値の標準化のために、コントロールとし
てｒＢＡＴ（related tob^0,+ system amino acid trans
porter；Purroyら、Genomics、第３７巻、第２４９−２
５２頁、１９９６年）のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにて検
出した。

【００９１】その結果、下表１に示した通り、ヒト尿中
落下細胞（ヒト尿細管上皮細胞）におけるＬ−ＦＡＢＰ
ｍＲＮＡの発現量は、ＭＣＣ−５５５および４−ＴＨＡ
の添加によって増加した。この結果から、これら化合物
は、ヒトにおいても、近位尿細管細胞のＬ−ＦＡＢＰの
発現増強作用を有するものと同定された。

【００９２】

【表１】

【００９３】実施例７ 細胞傷害に対するＬ−ＦＡＢＰ
発現抑制の影響 ブタ近位尿細管由来ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を用いた低酸素
・再酸素化モデル（インビトロ腎虚血再灌流モデル）に
より、細胞傷害に対するＬ−ＦＡＢＰ発現抑制の影響
を、以下のようにして調べた。

【００９４】まず、ブタＬ−ＦＡＢＰｃＤＮＡをＲＴ−
ＰＣＲでクローニングし、ｐＲＣ／ＣＭＶにサブクロー
ニングしてアンチセンスＲＮＡ発現用ベクターｐＬＦＡ
ＢＰ−ｐＲＣ／ＣＭＶを得た。

【００９５】ついで、６穴プレートにＬＬＣ−ＰＫ１細
胞をまき（１ｘ１０⁵／ウエル）、２４時間培養後、リ
ポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ社製）を用いてｐＬＦＡ
ＢＰ−ｐＲＣ／ＣＭＶをトランスフェクトした。またコ
ントロールとしては、ベクター（ｐＲＣ／ＣＭＶ）のみ
をトランスフェクトした。これら細胞を２４時間培養
後、嫌気性チャンバー（ＣＯＹ社）内に移し低酸素暴露
を２４時間行った。さらに、これら細胞を通常の大気中
に戻して２４時間再酸素化した後、細胞傷害度を測定し
た。

【００９６】細胞傷害度は、培地中に漏出したＬＤＨ
（lactic dehydrogenase；乳酸脱水素酵素）を指標にし
て測定した。すなわち、低酸素暴露後、培地を回収し、
測定キット「ＬＤＨ−細胞毒性テストワコー」（和光純
薬製）を用いて培地中のＬＤＨ活性を測定した。

【００９７】その結果、図５に示した通り、低酸素・再
酸素化した後に漏出したＬＤＨ活性は、Ｌ−ＦＡＢＰア
ンチセンスＲＮＡを一過性に発現させた細胞の場合、ベ
クターのみをトランスフェクトしたコントロールと比較
して大きい値を示し、細胞がより大きい傷害を受けてい
ることが示された。

【００９８】このように、Ｌ−ＦＡＢＰアンチセンスＲ
ＮＡの発現、すなわちＬ−ＦＡＢＰの発現抑制により、
低酸素・再酸素化時の細胞傷害が増大したことから、近
位尿細管細胞に傷害を与える腎虚血再灌流などの状態に
おいて、Ｌ−ＦＡＢＰは細胞を保護する機能を果たすも
のと考えられた。

【００９９】実施例８ 細胞傷害に対するＬ−ＦＡＢＰ
強制発現の影響 前記実施例７に準じ、近位尿細管細胞を用いた低酸素・
再酸素化モデル（インビトロ腎虚血再灌流モデル）を用
い、細胞傷害に対するＬ−ＦＡＢＰ強制発現の影響を調
べた。

【０１００】前記実施例１の（２）項にて単離したヒト
Ｌ−ＦＡＢＰ染色体遺伝子（全長）を含むプラスミドを
線状化した後、実施例２の（３）項と同様にして取得し
たマウス近位尿細管細胞（クローン２４）にトランスフ
ェクションし、安定な形質転換細胞（クローン２４−１
９）を得た。この細胞は、ヒトＬ−ＦＡＢＰの染色体遺
伝子が欠失を受けることなく染色体上に組込まれてい
た。

【０１０１】上記で得たクローン２４−１９及び対照細
胞としてクローン２４を、各々嫌気性チャンバー（ＣＯ
Ｙ社）内で低酸素暴露を２４時間行った。さらに、これ
ら細胞を通常の大気中に戻して２４時間再酸素化した
後、細胞傷害度を測定した。細胞傷害度は、培地中に漏
出したＬＤＨ（lactic dehydrogenas）を指標にして測
定した。

【０１０２】その結果、図６に示した通り、ヒトＬ−Ｆ
ＡＢＰ遺伝子を導入して強制発現させた細胞（クローン
２４−１９）では、低酸素・再酸素化後に漏出したＬＤ
Ｈ活性が、対照細胞（クローン２４）と比較して低値を
示し、低酸素・再酸素化に対してより抵抗性が強いこと
が示された。このように、Ｌ−ＦＡＢＰの強制発現によ
り、低酸素・再酸素化時の細胞傷害に対する抵抗性が増
大したことから、近位尿細管細胞に傷害を与える腎虚血
再灌流などの状態において、Ｌ−ＦＡＢＰは細胞を保護
する機能を果たすものと考えられた。

【０１０３】実施例９ 腎疾患モデルマウスに対する薬
物の作用 腎疾患モデルとして、アドリアマイシン誘発糸球体硬化
症マウスを用い、これに対するＰＰＡＲ作動薬ＭＣＣ−
５５５の効果を以下のように確認した。

【０１０４】アドリアマイシン（ＡＤ）誘発糸球体硬化
症マウスは、ネフローゼ症状を呈しながら、３週間目に
は巣状糸球体硬化症になり、不可逆的に慢性腎不全に到
る病態モデルである（Chenら、Nephron、第78巻、第440
-452頁、1998年）。また、ＭＣＣ−５５５は、実施例
３、４及び６にも示した通り、Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子発現
増強作用が確認されている化合物である。

【０１０５】マウスは、７週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ（日
本チャールスリバーより購入）を用いた。実験開始日
（０日目）に、アドリアマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）
を、１０ｍｇ／ｋｇ（生理食塩液に１ｍｇ／ｍｌの濃度
で溶解したものを１０ｍｌ／ｋｇ）静脈内投与した。正
常群には同容量の生理食塩液のみを静脈内投与した。こ
れらマウスに、ＭＣＣ−５５５又は担体のみを、実験開
始日から１４日間（０日目から１３日目まで）経口投与
した。初回投与はアドリアマイシン投与の１時間前に行
い、投与液量はいずれも１０ｍｌ／ｋｇとした。

【０１０６】薬物投与群（ｎ＝６）は、アドリアマイシ
ン投与マウスにＭＣＣ−５５５（０．１％Ｔｗｅｅｎ８
０含有精製水に懸濁したもの）を１０ｍｇ／ｋｇの用量
で投与した。対照群（ｎ＝６）は、アドリアマイシン投
与マウスに担体（０．１％Ｔｗｅｅｎ８０含有精製水）
のみを投与した。また、正常群（ｎ＝３）も担体のみを
投与した。

【０１０７】マウスは個別に代謝ケージに入れ、自由摂
食・摂水下で２４時間採尿した。

【０１０８】採尿は、３〜４、６〜７、９〜１０及び１
３〜１４日目の計４回行った。採取した尿については、
尿量を測定後、自動分析器（ＳｕｐｅｒＺ−８１８、ニ
ッテク）で尿中蛋白質、ＮＡＧ（N-acetyl-β-D-glucos
aminidase）およびクレアチニン（creatinine：CRE）濃
度を測定した。実験最終日（１４日目）の採尿後、エー
テル麻酔下に腹部大動脈より採血し、血清を分離して、
自動分析器（ＴＢＡ−８０ＦＲ、東芝）でコレステロー
ルおよびアルブミン濃度を測定した。また腎を摘出して
中性緩衝ホルマリン液で固定した。

【０１０９】実験の結果、図７に示したように、尿中蛋
白質および近位尿細管障害の指標であるＮＡＧ排泄量
は、対照群ではＡＤ投与後７〜１４日目に上昇した。こ
れに対して薬物投与群では、尿中蛋白質及びＮＡＧ排泄
量の上昇が有意に抑制された。

【０１１０】また、１４日目の血液生化学的検査の結果
を図８に示した。図８に示されたように、対照群では、
ネフローゼの主症状である高コレステロール血症、低ア
ルブミン血症の症状が認められた。これに対して、薬物
投与群ではこれら症状が改善されていた。

【０１１１】上記のように、ＭＣＣ−５５５は、腎疾患
モデルマウス（アドレアマイシン誘発糸球体硬化症モデ
ル）に対して、近位尿細管障害の指標となるＮＡＧ排泄
を抑制するとともに、ネフローゼの主症状である蛋白尿
や血液生化学的パラメータを改善した。さらに、腎組織
像を調べたところ、ＭＣＣ−５５５は、同モデルマウス
の腎臓における組織学的変化も抑制していることが確認
された。

【０１１２】実施例１０ ヒト型Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子導
入トランスジェニックマウスを用いた腎疾患モデルに対
する薬物の作用 ヒト型Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子を導入したトランスジェニッ
クマウス（ｈＦＡＢＰ−Ｔｇマウス）を作製した。この
ｈＦＡＢＰ−Ｔｇマウスを用いて、以下のように、実施
例９に準じた腎疾患モデルを作成し、ＭＣＣ−５５５の
作用を確認した。

【０１１３】ｈＦＡＢＰ−Ｔｇマウスの作製において
は、１３週齢以上のＢＣＦ１系雄マウスを不妊交配用及
び自然交配用に、１０週齢以上のＩＣＲ系雌マウスを胚
移植用および里親用に、１３週齢以上のＢＤＦ１系雄マ
ウスを交配用に、８週齢以上のＢＣＦ１系雌マウスを採
卵用に、それぞれ使用する。これにより得られるトラン
スジェニックマウス（Ｂ６Ｃ３Ｆ１系）についてＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスともどし交配を行った。

【０１１４】得られた雌性トランスジェニックマウスを
用いて、腎疾患モデル（アドリアマイシン誘発糸球体硬
化症モデル）の作製と薬物（ＭＣＣ−５５５）の作用確
認を行った。疾患モデルの作製と薬物の作用確認は、前
記実施例９に準じた。但、実験開始日（０日目）に投与
するアドリアマイシンの投与量は、１５ｍｇ／ｋｇ（生
理食塩液に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したものを１５ｍ
ｌ／ｋｇ）とした。

【０１１５】薬物投与群（ｎ＝５）は、アドリアマイシ
ン投与マウスにＭＣＣ−５５５（１０ｍｇ／ｋｇ）を投
与し、対照群（実験開始時ｎ＝５）はアドリアマイシン
投与マウスに担体のみを投与した。正常群（ｎ＝３）は
アドリアマイシン非投与マウスに担体のみを投与した。
採尿を、６〜７日目（Ｄａｙ７）、１０〜１１日目（Ｄ
ａｙ１１）、１３〜１４日目（Ｄａｙ１４）の計３回行
い、尿量測定後、自動分析器で尿中蛋白質、ＮＡＧ及び
クレアチニン濃度を測定した。

【０１１６】その結果、図９に示したように、対照群で
はＡＤ投与後、尿中蛋白質及びＮＡＧ排泄量が上昇した
のに対して、薬物（ＭＣＣ−５５５）投与群ではこれら
の上昇が顕著に抑制された。また、対照群では、実験期
間中３例が死亡したが、薬物（ＭＣＣ−５５５）投与群
では死亡例は認められなかった。

【０１１７】参考例１ 密度勾配遠心法による近位尿細
管上皮細胞の単離および初代培養 （１）近位尿細管細胞の分離 ビネー（Vinay）らの文献（American Journal of Physi
ology、第241巻、F403-F411、1981年）記載の密度勾配
遠心法に準じ、以下のようにして、マウスの腎臓から、
腎臓皮質部細胞を単離した。

【０１１８】マウス２匹を断頭脱血後、腎臓を摘出し、
これを冷ハンクス緩衝液（Hank's buffered solution：
ＨＢＳ）で洗浄した後、皮膜を摘除した。次に、皮膜か
ら皮質部のみを切り出し、１〜２ｃｍ角に細切した。細
切組織をＨＢＳで軽く洗浄後、コラゲナーゼ溶液（coll
agenase type4、４００μｇ／ｍｌ、ＨＢＳ中）５ｍｌ
を加えて３７℃、３０分間酵素処理を行った。次いで、
５分間攪拌後、ナイロンメッシュ（１００μｍ）で濾過
して組織塊を除去し、ＨＢＳで洗浄した。これにＨＢＳ
（１ｍｌ）を加え、軽くピペッテイングして細胞懸濁液
を調製した。

【０１１９】この細胞懸濁液を、３０％−５０％パーコ
ール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）重層液に重層した後、遠心した
（３５００ｒｐｍ、４℃、３０分間）。遠心後、パーコ
ール密度勾配中に分離された各層（上から画分１〜４の
４層）の細胞を注意深く回収した。

【０１２０】（２）分離した細胞のアルカリフォスファ
ターゼ染色 アルカリフォスファターゼは、腎臓では近位尿細管に局
在することが知られている。そこで、上記（１）で回収
した各層の細胞の一部を採取し、以下のようにアルカリ
フォスファターゼ染色を行った。すなわち、細胞懸濁液
を遠心した後、プレパラートに固定し、アルカリフォス
ファターゼ基質キット（フナコシ社製）を用いて染色
後、グリセロール封入した。その結果、最上層の画分１
において、アルカリフォスファターゼ陽性率が最も高
く、従って、近位尿細管細胞の含有率も最も高いと考え
られた。

【０１２１】（３）近位尿細管上皮細胞の初代培養 上記（１）の画分１の細胞について、以下のようにコラ
ゲナーゼ処理した後、初代培養を行った。すなわち、回
収した細胞を、ＨＢＳで１回洗浄し、コラゲナーゼ溶液
（collagenase type4、２ｍｇ／ｍｌ、ＨＢＳ中）１ｍ
ｌを加えて３７℃、５分間酵素処理を行った。さらにＨ
ＢＳで２回洗浄した後、培養に供した。

【０１２２】上皮細胞の初代培養の際には、線維芽細胞
が混入することが一般的に知られており、線維芽細胞の
増殖を抑制して上皮細胞だけを選択的に増殖させること
が必要となる。このため、培養に際しては、（ｉ）線維
芽細胞の増殖を選択的に阻害するＭＥＭ／Ｄ−Ｖａｌ培
地（ＭＥＭ培地のＬ−バリンをＤ−バリンに置換した培
地；Ｇｉｂｃｏ社製）にウシ胎児血清を添加した培地、
及び、（ｉｉ）上皮細胞を特異的に増殖させるホルモン
および成長因子を含み、線維芽細胞の増殖に関与する因
子を含まない無血清Ｋ１培地（50:50 DMEM/Ham's F-1
2、15mM Hepes、13.4mM sodium bicarbonate、5μg/ml
insulin、5μg/ml transferrin、5ng/ml selenous aci
d、0.05μM hydrocortisone、10ng/ml epidermal growt
h factor）を、以下のように組合せて用いた。

【０１２３】まず、細胞を、１０％ウシ胎児血清含有Ｍ
ＥＭ／Ｄ−Ｖａｌ培地にて１〜２日培養し、細胞の接着
と増殖を確認した後、培地を無血清Ｋ１培地に交換し
て、さらに約一週間培養を継続した。細胞は、あらかじ
め０．１％ゼラチンでコーテングしたプレートに播種
し、ＣＯ₂インキュベーター内で培養した。

【０１２４】（４）細胞の形態学的解析 前項（３）の培養細胞を、位相差顕微鏡にて観察したと
ころ、敷石状の細胞増殖が認められた。また、細胞がコ
ンフルエントになる頃に、ドーム形成が認められた。こ
れら所見は、溶質溶媒の経上皮輸送が行われていること
を示唆している。これらのことから、得られた培養細胞
は、尿細管上皮細胞であることが形態学的に確認され
た。

【０１２５】（５）アルブミン取込み能 近位尿細管細胞は、アルブミン等の取り込み能を有する
ことが知られている。

【０１２６】そこで、前項（３）の培養細胞について、
アルブミンの取り込み能を、以下のように調べた。細胞
を、１０ｃｍデイッシュでコンフルエントになるまで培
養した後、培地をＭＥＭ／Ｄ−Ｖａｌ培地に交換し、一
晩培養した。ついで、ウシ血清アルブミン（bovine ser
um albumin：ＢＳＡ）を、終濃度が５０ｍｇ／１０ｍｌ
になるよう培地に添加し、３７℃、９０分間培養を行っ
た。コントロールとしては、同様の細胞を用い、氷上で
インキュベーションを行った。培養後、細胞をリン酸緩
衝食塩水（phosphate buffered saline：ＰＢＳ）（ｐ
Ｈ７．４）で洗浄した後、回収した。この細胞を、プロ
テアーゼ阻害剤（protease inhibitor）を含むＰＢＳ
（ｐＨ９．６）２００μｌに懸濁した後、超音波破砕し
た。破砕液にＰＢＳ（ｐＨ６．４）を加えてｐＨを中性
領域に戻した後、遠心（１２０００ｒｐｍ、１５分間）
して上清を、細胞抽出液として回収した。得られた細胞
抽出液について、ＢＳＡの存在をＥＬＩＳＡ法にて測定
した。

【０１２７】ＥＬＩＳＡには、一次抗体として、抗アル
ブミン抗体（ウサギポリクローナル抗体、Ｓｉｇｍａ社
製）を用い、二次抗体としては、ビオチン標識した抗ア
ルブミン抗体を用いた。一次抗体を９６穴イムノプレー
トに吸着させた後、前記細胞抽出液（１００μｌ／穴）
を加えて室温で２時間反応させ、次いで、二次抗体希釈
液を添加し、室温で２時間反応させた。ウエルを洗浄し
た後、ストレプトアビジン及びビオチン標識ワサビペル
オキシダ-ゼを含む検出キット（ベクターラボラトリ-社
製、ベクタステインＡＢＣ−ＰＯキット）を用いて発色
検出を行った。

【０１２８】その結果、アルブミン添加条件下３７℃で
培養することにより、コントロールの２．３倍量のＢＳ
Ａ取り込みが認められた。このことから、細胞は、近位
尿細管細胞としての生理的機能を有することが確認され
た。

【０１２９】（６）ホルモンに対する応答能 近位尿細管細胞は、上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）に応答
して細胞内ｃＡＭＰ産生が誘導されるが、バソプレッシ
ン（ＡＶＰ）には応答しないことが知られている。前項
（３）の培養細胞について、以下のとおりこれらホルモ
ンに対する応答能を調べた。

【０１３０】細胞を、２４穴プレートでコンフルエント
になるまで培養した後、細胞表面を培地（ＭＥＭ／Ｄ−
Ｖａｌ培地）で２回洗浄した。これに、ＰＴＨ（１０^-7
Ｍ）又はＡＶＰ（１Ｕ／ｍｌ）を、ＩＢＭＸ（3‐イソ
ブチル1‐メチルキサンチン；ｃＡＭＰホスホジエステ
ラーゼ阻害剤）（１０^-4Ｍ）とともに添加した培地を加
えた。コントロールとしては、ＩＢＭＸのみを添加した
培地を加えた。

【０１３１】３７℃で１０分間反応させた後、細胞及び
培養液中のｃＡＭＰを６５％エタノールで抽出し、ｃＡ
ＭＰ量をＥＬＩＳＡ法（Amersham社製のｃＡＭＰ ＥＩ
Ａシステムキットを使用）により測定した。

【０１３２】その結果、ＰＴＨ刺激を行った場合、コン
トロールに対して約１．６倍の細胞内ｃＡＭＰ量が認め
られ、このことから、この初代培養には近位尿細管細胞
が含まれることが確認された。一方、ＡＶＰ刺激時にお
いても、コントロールの約４．６倍のｃＡＭＰ量が認め
られたことから、近位尿細管細胞に由来しない細胞もい
くらか混入しているものと考えられた。

【０１３３】

【発明の効果】本発明の方法によれば、新規な腎疾患治
療薬及び／又は予防薬を的確に効率よくスクリーニング
することができる。また、本発明の方法により同定され
特徴付けされた治療薬及び／又は予防薬（あるいは本発
明の治療薬及び／又は予防薬）は、作用機序の明確な優
れた腎疾患治療薬及び／又は予防薬となる。また、本発
明の新規細胞株は、近位尿細管上皮細胞としての生理的
特徴をよく維持しており、腎疾患治療薬などの研究開発
などに有用である。

【０１３４】「配列表フリーテキスト」配列番号１のフ
リーテキスト<223> ＧＡＴＡシグナル（GATA_signal）<
223> ペルオキシソームプロリフェレータ応答配列（per
oxisome proliferator responsive element(PPRE)）<22
3> ヘパティックヌクレアファクター（ＨＮＦ）結合サ
イト（hepatic nuclear factor(HNF) binding-site）<2
23> ヒポキシア誘導因子（ＨＩＦ）結合サイト（hypoxi
a inducible factor(HIF) binding-site）

【０１３５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TANABE SEIYAKU CO., LTD. <120> Medicine for treating renal diseases and screening method of such medicine <130> A00-4680 <150> JP268846/1998 <151> 1998-09-24 <160> 1 <210> 1 <211> 5357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (4767)...(4835) <221> intron <222> (4836)... <221> TATA_signal <222> (4691)...(4697) <221> misc_signal <222> (4136)...(4141) <223> GATA_signal <221> misc_binding <222> (4654)...(4659) <223> peroxisome proliferator responsive element(PPRE) <221> misc_binding <222> (4661)...(4666) <223> peroxisome proliferator responsive element(PPRE) <221> misc_binding <222> (4544)...(4551) <223> hepatic nuclear factor(HNF) binding-site <221> misc_binding <222> (3758)...(3765) <223> hypoxia inducible factor(HIF) binding-site <400> 1 GTCGACTGCA GTCAACGGAT CCTCTCCRTY CTCTVACCCT CACCCTCAAC TACGCCCCAG 60 TGTCTGTTGT TCCCCTACTA GTATCCATGT GTTCTCATTG TTTAGCTCCC ACTTATAAGT 120 GAGAACACAC AGTATTTAAT TTTCTGTTCC TGTGTTCGTT TGCTTAGGAT AATGGCCTCT 180 AGCTCCATCC ACGTTGCTGC AAAGGACATG ATCTCATGCT TTTTTATGGC TGCATCATAT 240 TCCATGGTGT ATGTATACCA CGCTTTCTTT ATTCAGTCTA CTGTTGGTGG GCATTAGGTT 300 GATTCCATGT CTTTGCTATT GTGAATAATG CTGCAATGAA CATACTCATG CATGTGTCCT 360 TATGGTAGAA CAATTTATAT TCTTTTGGGC ATATACCCAG TAGTGGGACT GCTGGGTCAA 420 ATGGTAATTC TGTTTTAAGT TCTTTGAGGA ATCACCACAC TGCTTTCCAC AATGGCTGAA 480 TTAATTCACA CTCTCACCAG TAGTCTGAAA TGTTCCTTTT CTCTGCAACC TTGCCAGCAT 540 GTTATTTTTT GACTTTTAAT AGTAGCCATT CTGACTGGTG TGTGATAGTA TCTCATTGTG 600 GTTGTGATTC GTTTACGCAA TTATTTCACA AGGCAAAAAA TGTTGTGACC ATTTAACAGA 660 TAAGCAAGTA GAGGCTCACC AAGGCTCCAC ATCAGGTATA AAGAAGAGCT GGGCCCAAAC 720 CCAAGTCCTT TCCCTCTGCA GCCCTGCCTG TAGCAGAATT ATGGGCTCCT CGGGCCACCT 780 CCTATGTTCA AAACACCCAG GAAATGGGCA GGCTGGCATT GCAGGCACTG AGGTCAAAGG 840 CGCTTGTTCT AAAATGAACA CCTGTCATAT CCTGGCCACC AAGAGGTGAC TCCCCTCCTT 900 TCCCACACCT GCACGCTGCC CGTCTGAGTA GGGATGTGAG AAGAGGGGAT GTCTAGTGTG 960 GAGTGAGCAG GGCCAGAATC TTTGGACACT CCAAAGCTGT GCCCACAGAG TGGGAGTCTC 1020 TTTTTTTCTT TCTTGAAAGC CACTTGAACT TTGTCATTGC AATTAAGCTT ATCTCTTCTT 1080 GTGTTTGCTC AGCTAGTGGG TGGAAGATGT CATTACCCTC TCCTAACTTT ATGGAAAACT 1140 CATGAGTATT AGTTTTTGAA ATGGCTACTG ATCTCTGTGC CCTCAAGATT CACACACACA 1200 CAAAAAAAAA GACAAAGGGA AGTCATCGGG GGTTGCCTAA GAATGGCCAT ATCTCAGACC 1260 TGGGGGAGAG GGGGAGTCCT GGCCTGGCGT TGATCAGCTC AATTTACTTG TCAGGCTGCC 1320 CATCTGCCAG GGAAACTGTC AAGGCTTCAC TGGTTGTGCC AGGCCCTTGA CCAACCTCTG 1380 GGTCAGCTGC ATTCCCAATG CTGTTCTGAG TCTGCAGCGT TGCCTGGACA GGGTAGGCAG 1440 GAAGTGCAGG GTGAGGCAGA GTGGTCCACA AGGAGACAGC TCATGGGTCC TGCTGTTCCT 1500 CAGACACCAG GAAAGGTGCA CCTGGTCCCT ACTTCACCTG AGGCCTCCGG GGTTGGTGCT 1560 GACTTGCTCT ATGGAGAAGC TTTCATGACG CTCCTTCCCA CTCCCCTCCG TAGATCCCAG 1620 AAAGCAGCAG TGTGGGGCAT GATACTTGAC ATTTGCGATC AAGGGGAGAG GGCCTAGTTG 1680 TGGAATGTAT AAGCCAGACA TCCCTTTATC TGAGCGGGAT GTCAGGCAGG CAGCTGGGGG 1740 CATGAGATAA CATGGGCACT TGGAGCAGAT TCTCCCAAAC GAAGCAACTG ATGGGTGTGA 1800 TGGGAGTTGG GCATGGTAAT GACTCTATCA CGGTCATTTT CCTCGGTGAT TATTTCATTG 1860 ATTTTAGGCT GCAAAACTCC TAAGCTCCCC ATCTAAGCAA GTGTTTACGT ATTCCTTCCT 1920 TGACAAATGC TAGAAGAGCT CTTTAGGTAG GTAGTGAATA GGATCTCAGG TATAGAGCTG 1980 AATTTAGCCC TGGGCTGAAC CTTCACATGG TCATTAGACA GACATATGCC AGCTATTGGT 2040 GCAGGCTTTA GGTGTCACAT GTAACCCAGA AGGATCTAAA TAAAATGACC TTGAATTCCT 2100 CCAAAGCCCT TCCTAGGATG TCTAGGGACC TGGGGAACCC TGTAGGGAAT GCATCCCCAC 2160 AGACACTCCA CTTCCTGCAG TCTGGGGGAG GGACAGGAAG ACACACCCAG CCTCTCCTGG 2220 TCTCCTGCAT GAGGGAGCTG CCCTTCTCTT GGTACTGCTT CTGCATGTGC CATCTCAGCC 2280 TCATCACATC CATCCAGAAA TAAAGCTCAG CCTTGCATCA TTTTCCACTT GCTCACATAT 2340 TGATTCAGGC ACTATATTTT ACTGAAGCTT TTGAAATAGT TGGGGTGGAA ATTAAAGAAA 2400 GATGGATGGG GATTCACTGC AGCAAATGAG CAGCTTCAAA GCCAATGCCA TCCTGGAGCT 2460 CCTTTCTGCA GTCTGGGGGA GGGACAGGAA GACACACCCA GCCTCTCCTG GTCTCCTGCA 2520 TGAGGGAGCT GCCCTTCTCT TCACCAGCTT GGCTCTCGCT GACACACGGG TCTGAGGTCT 2580 GGGGTCTCAC ACACTCTGTC TCCCAGGCAG CTAATCCAGT CATTTACACA CACACACACA 2640 CACACACACA CACACACACA CACTAGGAAT TCTCATGCCA GTTCTTAAGA CAATGGATTT 2700 TTTACTTCCT TGCATATACA AAAATGAAAA ATCAGCATCC CATCTGGAGA CCAGGGTCTA 2760 ATATGGACCC CTTTAGTACA ATAGACATGT TAAAAGATGT ATAATCAAAG CTCAGAGCAA 2820 GATGAGAGAA GGACTGTGGG TGTGCCCATA CTTCTTTGAG CCACCTCGCC CCTTCCTGCC 2880 CGCTGTTCAG GTAGTCGTGG TGATTATAAA AAGCCATAAG TTCTCAGCAT GCAGGCCCAC 2940 TTCGCTTGCT GCAGGGACAG CCCCAATTCA TGGCCTGGGA GGCACCTTGT GTCCTAGACA 3000 CTGTCAGAGG AGGGCCAAGC AGGGAGGGCC AGAGCACCCC TCTGTGCTGG AGGGAAAGGT 3060 CTGCTGGTGC CAGAATCTGC ATGGCAGGAC ACTCCATTAG TGAGTGTTCT CTGCCCACAG 3120 TGCTCCAAAG GTGAGGACCT CCCTGTGGCA GGGTACACCT TAACACCACC TGTCAGGGAT 3180 GCTGTAGAAG GACCCTGGCA CTGGGACTGT GGGTGGAGGA GAGAACTTCT GAAGTGCTTT 3240 GCTGGATCAA CATGTCCAAA TGCTGGAGAC CACGGAGGGC AGAGAGAGTG GCATGGACGC 3300 CCCCGATGTG TCCACTTGGC CCTGTGGCTG GAACTGTGGC TTGAGGAGAA GGAAGGAAAA 3360 AGGATGGAAA GGTAGACTGG AGTTGCCTTT TGAGGGCTGG CAGCCCTGCT AGAAGTTTAG 3420 GCAATGGGAG TCATTTTCCA AGCCAAAAAT TAGAACTCAT GATAGGGAAA TGGAAGTGTT 3480 ATTGGGGGTG GCCATCATGA CCCGTCACGT GACACTAGGC CATCCAGGAC CTGTGGCCTC 3540 TGAAGTGATG GGAACCACTG AGGCTCATGC CTGGAGCAGT GGCCCGACTC AGCCTATGCT 3600 TCAGGATGAT CTGTCTAACC ACAGAGTAGA GGAGGCCCAG AGGATGAAGG CTGGAGGCTG 3660 CAGGTGAAAA GGTTGACGCC AAAGTCCAGA CAAAGAAGGG AGAGAATCTA GGGGTGAGGG 3720 GGTGCTTGTA AAGAGCTGCC TCAGAGGCAG GAACTGGGAC GTGCACCCAT TGGGCACCAC 3780 GCCTCTCTGT GCTTCACAAC AAACTGGCAC ATCCCAAGGC CACTGGAAGC CCTGCTGGGC 3840 CATCTCCCCA AGGCCAGTGC TGTACACATA ACCCTACAAG ACCAGTTTCC TACACATAAC 3900 CCTACAAGAC CAGTTTCCTA CACATAACCC CAGATCCCTT GTCCTGTCTT CTCAGTGGGG 3960 CTGGAGCAAG TCAGCAGGTG CCACTTTCTC CTGCCTTGTC TCTGCCTAAT AAAATGCGTC 4020 TCAATGTTTT ACACCTGCCA TTTAGCATGG ACTGCTTTAA CACCTCAAAA AGGCCTGTGG 4080 AGGAGCCTAT AATCATCAAG GAGGAATTCC CAGAATACAA AATAACACTA GCGGCTGATA 4140 ACAACTCTAA AAAATAAGTT TGTGTAATAA TGGGGGTGAG AAGAGATCAT AAGGTTATGT 4200 AAATAAGGTG AGGTTTTGAG TTCAAAGGAA TTCTCTGGTA TTTTTCTGTG TGTGTACACA 4260 TGCACCCACA CACTTGTGTG TATATGTGTA CAGACATATA TAAACACATG CATATAATGT 4320 GTATATATGC ATTACATATA TGCACATTCA TACATCTTTA TGTACAAAAT ACATATATGT 4380 ATATATAAAC ACCGATGTAC AAACACATAC GCACACATCT ATATACATAC ACATGTGTGT 4440 GCACATATAC ACATACCTGC ATATACACAC ATTTCGTGGG GTGCGGAGAG TCACTTAAAG 4500 GCTGCAGGGC CATAAGGCTT CCTGCTTGAC TGATATTCAT TAATGTTTGC TGAATTACAG 4560 CAAACCTTTG CTGTGCCCAT CCTGTTCTTT ATCATTGACC ATTGCTCTCA GGAGTTAATG 4620 TTTGAACCTG GCCATAAAGG AATCAACAGC TGCTGACCTC TGGCCGCTAT TCGAAGGGAA 4680 GGGAGCCCCC TATAAAACAG CCTACAGTGG ACAGTCTGGT CGGCAGAGCC GCAGGTCAGT 4740 CGTGAAGAGG GAGCTCTATT GGATCCATGA GTTTCTCCGG CAAGTACCAA CTGCAGAGCC 4800 AGGAAAACTT TGAAGCCTTC ATGAAGGCAA TCGGTGAGTG CTGGACTGAA AGGCAAAGCT 4860 GTGGGTCACA TCAGTGAGGG TCTAGCTCTA CCAGCAGTGG CTATTTAGGG TCCAAATGTT 4920 GAGATGGGGG GAGAGATTCA GGCTATATAC ACAAACTAGG GGGCATTTTA CTGACTTCTG 4980 GAGTTATTTG CAGCAAGTCC TCACTGCACA AGGCCACCCC ATAGGCAAGT GGAAAGAGCA 5040 CTGAACTAGG GTGTGGTCTG GATTGATGGC CATGTCATTG GCACTTCGTT GTGTGATCCT 5100 ATTCCTGCAT TTATTCATTC TTCAAACAAA CAGTGATTCA AGGCCAACCA CACACTGAGC 5160 ACTGTGCTGG ATAGATACCA GGGAGACAGA TGATAAAGGC AATAAGGCAT TTTCTTATCA 5220 GGGAAGAGAA GAGAAGAAAT AAAGGTAATA AGGCATTCCC TCAGGTGTAT GGAGCGCTGA 5280 CTGTGCCAGG CGACTGTGCT GACCATGGGA TATGCAATAC CCCATCTATT CCTTGCCAAA 5340 AAACTAAGCT GGGTACC 5357

【図面の簡単な説明】

【図１】 マウス近位尿細管上皮細胞株Ｎｏ．１３（３
７−１３）の形態を示す電子顕微鏡写真。

【図２】 マウス近位尿細管上皮細胞株（Ｎｏ．１０、
１３、１４、１５、１６及び１９）のホルモン応答能
（ＰＴＨ及びＡＶＰで刺激した場合の細胞内ｃＡＭＰ産
生誘導）を測定した結果を示した図。

【図３】 マウス近位尿細管上皮細胞株（Ｎｏ．１３及
び１６）のＢＳＡ取込み能を測定した結果を示した図。

【図４】 マウス近位尿細管上皮細胞株を用いるレポー
ターアッセイにより被験物質のＬ−ＦＡＢＰ発現増強作
用を測定した結果を示した図。

【図５】 低酸素・再酸素化モデル（インビトロ腎虚血
再灌流モデル）における細胞傷害に対するＬ−ＦＡＢＰ
発現抑制の影響を示した図。Ｌ−ＦＡＢＰアンチセンス
は、Ｌ−ＦＡＢＰアンチセンスＲＮＡ発現ベクターを一
過性にトランスフェクトしたブタ近位尿細管由来ＬＬＣ
−ＰＫ１細胞を、コントロールは、ベクターのみを一過
性にトランスフェクトした同細胞を、各々表す。

【図６】 低酸素・再酸素化モデル（インビトロ腎虚血
再灌流モデル）における細胞傷害に対するＬ−ＦＡＢＰ
強制発現の影響を示した図。「２４」は、マウス近位尿
細管細胞（クローン２４）（対照細胞）、「２４−１
９」は、マウス近位尿細管細胞（クローン２４）にヒト
Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子を導入して強制発現させた細胞（ク
ローン２４−１９）を、各々表す。

【図７】 腎疾患モデル（アドレアマイシン誘発糸球体
硬化症モデル）マウスにおける蛋白尿とＮＡＧ排出量に
対する薬物（ＭＣＣ−５５５）の作用を調べた結果を示
した図。

【図８】 腎疾患モデル（アドレアマイシン誘発糸球
体硬化症モデル）マウスにおける血液生化学的パラメー
タ（血中コレステロール量および血中アルブミン量）に
対する薬物（ＭＣＣ−５５５）の作用を調べた結果を示
した図。

【図９】 ヒト型Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子を導入したトラン
スジェニックマウスを用いた腎疾患モデル（アドレアマ
イシン誘発糸球体硬化症モデル）における蛋白尿とＮＡ
Ｇ排出量に対する薬物（ＭＣＣ−５５５）の作用を調べ
た結果を示した図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/02 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 BB22 BB24 CB01 CB26 DA36 DA80 FB01 FB03 4B024 AA01 AA11 CA03 CA04 DA02 EA04 FA10 GA11 GA18 GA23 HA01 HA14 4B063 QA01 QA18 QQ26 QQ79 QQ95 QR69 QR80 QS05 QS28 QS36 QX02 4B065 AA91X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA06 BA25 BB01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA17 NA14 ZA812 ZC202 ZC422

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 動物細胞における脂肪酸結合蛋白質の発
   現に対する被験物質の増強作用を検定することを特徴と
   する、腎疾患治療薬もしくは予防薬のスクリーニング方
   法又は同定方法。
2. 【請求項２】 脂肪酸結合蛋白質が肝型脂肪酸結合蛋白
   質である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 動物細胞が腎臓の細胞又は組織である請
   求項１又は２記載の方法。
4. 【請求項４】 動物細胞が近位尿細管細胞である請求項
   １又は２記載の方法。
5. 【請求項５】 脂肪酸結合蛋白質遺伝子の転写調節領域
   とその下流に連結されたレポーター遺伝子からなるＤＮ
   Ａ構成が導入された細胞を用いるレポーターアッセイに
   より、被験物質の作用を検定する工程を含む、請求項１
   記載の方法。
6. 【請求項６】 （１）動物細胞を被験物質の存在下およ
   び非存在下で培養する工程；および（２）動物細胞中の
   脂肪酸結合蛋白質の発現量を決定するとともに、被験物
   質存在下での発現量と、被験物質非存在下での発現量を
   相互に比較する工程；を含む請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】 請求項１〜６いずれか１項記載の方法に
   より、選択又は同定された腎疾患治療薬もしくは予防
   薬。
8. 【請求項８】 脂肪酸結合蛋白質の発現を増強する作用
   を有する薬物を主成分とする腎疾患治療薬もしくは予防
   薬。
9. 【請求項９】 脂肪酸結合蛋白質の発現を増強する作用
   を有する薬物が、腎臓の細胞又は組織における脂肪酸結
   合蛋白質の発現を増強する作用を有する薬物である請求
   項８記載の治療薬もしくは予防薬。
10. 【請求項１０】 脂肪酸結合蛋白質が肝型脂肪酸結合蛋
    白質である請求項８記載の治療薬もしくは予防薬。
11. 【請求項１１】 腎疾患が、糖尿病性腎症、糸球体腎
    炎、ネフローゼ症候群、巣状糸球体硬化症、免疫複合体
    腎症、ループス腎炎、薬剤性腎障害および腎不全から選
    択されるものである、請求項７〜１０のいずれか１項記
    載の治療薬もしくは予防薬。
12. 【請求項１２】 ペルオキシソームプロリフェレータ活
    性化受容体（ＰＰＡＲ）のアゴニスト作用を有する化合
    物、またはカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ
    （ＣＰＴ）の阻害作用を有する化合物からなる、脂肪酸
    結合蛋白質の発現増強薬。
13. 【請求項１３】 ペルオキシソームプロリフェレータ活
    性化受容体（ＰＰＡＲ）のアゴニスト作用を有する化合
    物を有効成分とする、腎疾患治療薬もしくは予防薬。
14. 【請求項１４】 カルニチンパルミトイルトランスフェ
    ラーゼ（ＣＰＴ）の阻害作用を有する化合物を有効成分
    とする、腎疾患治療薬もしくは予防薬。
15. 【請求項１５】 腎疾患が、糖尿病に起因する腎疾患で
    はない請求項７、８、９、１０、１３又は１４記載の治
    療薬もしくは予防薬。
16. 【請求項１６】 腎疾患が、糸球体腎炎、ネフローゼ症
    候群、巣状糸球体硬化症、免疫複合体腎症、ループス腎
    炎、薬剤性腎障害および腎不全から選択されるものであ
    る請求項７、８、９、１０、１３又は１４記載の治療薬
    もしくは予防薬。
17. 【請求項１７】 腎疾患が、ネフローゼ症候群、巣状糸
    球体硬化症および薬剤性腎障害から選択されるものであ
    る請求項７、８、９、１０、１３又は１４記載の治療薬
    もしくは予防薬。
18. 【請求項１８】 マウスの近位尿細管の細胞から樹立さ
    れた不死化細胞株であって下記の（１）、（２）及び
    （３）の性質を有する細胞株。 （１）上皮細胞の形態を有する。 （２）アルブミン取り込み能を有する。 （３）上皮小体ホルモンによる刺激に応答して細胞内ｃ
    ＡＭＰ産生が誘導されるが、バソプレッシンによる刺激
    には応答しない。
19. 【請求項１９】 ヒト肝型脂肪酸結合蛋白質遺伝子の転
    写調節領域とその下流に連結されたレポーター遺伝子か
    らなるＤＮＡ構成が導入されている、請求項１８記載の
    細胞株。
20. 【請求項２０】 マウス細胞株ｍＰｒｏｘ３７−１３
    （ＦＥＲＭ Ｐ−１６９８５）。