JP2001033440A - 乾式蛍光測定による多重鎖核酸の検出／定量方法 - Google Patents
乾式蛍光測定による多重鎖核酸の検出／定量方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 特定の塩基配列を有する多重鎖核酸を蛍光
色素を用いて検出または定量する際の測定容器・照射方
向・試料溶液量の下限の制限を緩和する方法を提供す
る。 【解決手段】 以下の工程から構成される多重鎖核酸の
検出方法。 (１)多重鎖核酸の検出または定量対象としての試料溶液
に、該多重鎖核酸の存在下で、蛍光を発するか、また
は、蛍光が増大する蛍光特性を有し、かつ、該蛍光特性
が乾燥状態においても維持可能な蛍光色素を添加する工
程 (２)該蛍光色素が添加された前記試料溶液の既知量を、
観察用の清浄な基板上に載せ、該試料溶液を乾燥させる
工程、及び (３)該乾燥試料からの蛍光を測定し、得られた測定値に
基づいて前記試料溶液中における多重核酸の検出または
定量を行なう工程。
色素を用いて検出または定量する際の測定容器・照射方
向・試料溶液量の下限の制限を緩和する方法を提供す
る。 【解決手段】 以下の工程から構成される多重鎖核酸の
検出方法。 (１)多重鎖核酸の検出または定量対象としての試料溶液
に、該多重鎖核酸の存在下で、蛍光を発するか、また
は、蛍光が増大する蛍光特性を有し、かつ、該蛍光特性
が乾燥状態においても維持可能な蛍光色素を添加する工
程 (２)該蛍光色素が添加された前記試料溶液の既知量を、
観察用の清浄な基板上に載せ、該試料溶液を乾燥させる
工程、及び (３)該乾燥試料からの蛍光を測定し、得られた測定値に
基づいて前記試料溶液中における多重核酸の検出または
定量を行なう工程。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は二本鎖核酸等の多重
鎖核酸の検出/定量方法に関する。
鎖核酸の検出/定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より生物の特定遺伝子の検出のため
に特定塩基配列を有する標的核酸と該標的核酸に対する
核酸プローブの二本鎖核酸ハイブリッド体の検出の際に
エチジウムブロマイド(以下ＥＢと呼ぶ)等の二本鎖核酸
に作用して蛍光を増大する蛍光色素を用いて二本鎖核酸
をゲル中、もしくは、溶液中で検出/定量する技術は広
く用いられてきている。
に特定塩基配列を有する標的核酸と該標的核酸に対する
核酸プローブの二本鎖核酸ハイブリッド体の検出の際に
エチジウムブロマイド(以下ＥＢと呼ぶ)等の二本鎖核酸
に作用して蛍光を増大する蛍光色素を用いて二本鎖核酸
をゲル中、もしくは、溶液中で検出/定量する技術は広
く用いられてきている。
【０００３】また、近年ではごく微量の核酸を検出する
ために核酸を酵素的に増幅するポリメレースチェインリ
アクション(ＰＣＲ)が一般的となってきているが、この
ＰＣＲの増副産物を検出するため溶液中で二本鎖核酸に
作用してはじめて蛍光を発する蛍光色素２-メチル-４,
６-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノフェニル)ピリリウム
塩を用いる手法も用いられるようになってきている(Ｎu
cleic Ａcid Ｒesearch,1995,Ｖol.２３,Ｎo.８ 144
5-1446)。
ために核酸を酵素的に増幅するポリメレースチェインリ
アクション(ＰＣＲ)が一般的となってきているが、この
ＰＣＲの増副産物を検出するため溶液中で二本鎖核酸に
作用してはじめて蛍光を発する蛍光色素２-メチル-４,
６-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノフェニル)ピリリウム
塩を用いる手法も用いられるようになってきている(Ｎu
cleic Ａcid Ｒesearch,1995,Ｖol.２３,Ｎo.８ 144
5-1446)。
【０００４】また、特に最近では生体内に特殊な塩基配
列を有する三本鎖核酸、四本鎖核酸が存在し、これら
は、生体内で遺伝子の複製、細胞の寿命等に重要な役割
を果たしていることが知られるようになってきている。
列を有する三本鎖核酸、四本鎖核酸が存在し、これら
は、生体内で遺伝子の複製、細胞の寿命等に重要な役割
を果たしていることが知られるようになってきている。
【０００５】これらは三重鎖、四重鎖を形成し、そのな
かでは各鎖のそれぞれ対応する位置にある３個、４個の
塩基が平面的にトリオ、カルテットを形成している。
かでは各鎖のそれぞれ対応する位置にある３個、４個の
塩基が平面的にトリオ、カルテットを形成している。
【０００６】これらの三本鎖、四本鎖に作用する色素、
特に蛍光色素に関する研究例は少ないが、日本化学会第
７２春季年会(1997)講演予稿集II(665)に２-メチル-４,
６-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノフェニル)ピリリウム
塩が三本鎖、四本鎖ＤＮＡに作用して溶液中で蛍光を発
する旨の記載がある。
特に蛍光色素に関する研究例は少ないが、日本化学会第
７２春季年会(1997)講演予稿集II(665)に２-メチル-４,
６-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノフェニル)ピリリウム
塩が三本鎖、四本鎖ＤＮＡに作用して溶液中で蛍光を発
する旨の記載がある。
【０００７】また、近年、これらの色素の他に溶液中で
二本鎖核酸に作用して蛍光を発する蛍光色素として、Ｍ
olecular Ｐrobe社からＹＯＹＯ１をはじめとするいく
つかの色素が販売されている。
二本鎖核酸に作用して蛍光を発する蛍光色素として、Ｍ
olecular Ｐrobe社からＹＯＹＯ１をはじめとするいく
つかの色素が販売されている。
【０００８】これらの色素のうち、ＥＢは一般的に二本
鎖核酸の塩基対間に入り込むインターカレーターである
とされ、また、文献(Ｎucleic Ａcid Ｓyｍposiuｍ
Ｓeries Ｎo.２９ 1993 83-84)には２-メチル-４,６
-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノフェニル)ピリリウム塩
もインターカレーターとの記載がある。一方、ＹＯＹＯ
１は一般的に二本鎖核酸のグルーブ内に入り込むグルー
ブバインディングタイプの蛍光色素とされている。
鎖核酸の塩基対間に入り込むインターカレーターである
とされ、また、文献(Ｎucleic Ａcid Ｓyｍposiuｍ
Ｓeries Ｎo.２９ 1993 83-84)には２-メチル-４,６
-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノフェニル)ピリリウム塩
もインターカレーターとの記載がある。一方、ＹＯＹＯ
１は一般的に二本鎖核酸のグルーブ内に入り込むグルー
ブバインディングタイプの蛍光色素とされている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】これまで述べてきたよ
うに二本鎖核酸をはじめとする多重鎖核酸に溶液中で作
用して、蛍光を増大する色素、もしくは、はじめて蛍光
を発する色素は知れているが、いずれも溶液中での蛍光
挙動が知られているのみであった。
うに二本鎖核酸をはじめとする多重鎖核酸に溶液中で作
用して、蛍光を増大する色素、もしくは、はじめて蛍光
を発する色素は知れているが、いずれも溶液中での蛍光
挙動が知られているのみであった。
【００１０】通常、蛍光色素の蛍光特性(強度、励起/蛍
光スペクトル等)は色素が溶解した試料溶液約１〜４ｍL
を測定用のガラスセルを用いて、一般的には蛍光光度計
で測定する。また、２００μL程度の微小セルも市販さ
れている。また、最近では最多９６穴のプラスチック製
のマイクロプレート中の各々約１００〜２５０μLの試
料溶液を自動的に連続して測定する装置も数社から市販
されている(例:Ｃyto Ｆluor、日本パーセプティブリ
ミテッド)。
光スペクトル等)は色素が溶解した試料溶液約１〜４ｍL
を測定用のガラスセルを用いて、一般的には蛍光光度計
で測定する。また、２００μL程度の微小セルも市販さ
れている。また、最近では最多９６穴のプラスチック製
のマイクロプレート中の各々約１００〜２５０μLの試
料溶液を自動的に連続して測定する装置も数社から市販
されている(例:Ｃyto Ｆluor、日本パーセプティブリ
ミテッド)。
【００１１】これらの測定は上述のようにいずれも溶液
中の試料溶液を測定するために測定容器に制限があり、
また、マイクロプレートで測定する際には励起光を液面
方向から照射すると表面で乱反射、散乱が起こるなどの
問題があり通常はプレート裏面から照射せざるを得ない
等の問題点もあった。
中の試料溶液を測定するために測定容器に制限があり、
また、マイクロプレートで測定する際には励起光を液面
方向から照射すると表面で乱反射、散乱が起こるなどの
問題があり通常はプレート裏面から照射せざるを得ない
等の問題点もあった。
【００１２】また、試料溶液量が０.５〜５μL程度のご
く微量となると測定容器に制限があるばかりではなく、
これを顕微鏡を用いて測光しようとすると上述の励起方
向の問題点のほかに、試料が乾燥してしまい代表的な蛍
光色素ＦIＴＣ(fluoresceinisothiocyanate)であっても
蛍光が消光する等の問題点もあった。
く微量となると測定容器に制限があるばかりではなく、
これを顕微鏡を用いて測光しようとすると上述の励起方
向の問題点のほかに、試料が乾燥してしまい代表的な蛍
光色素ＦIＴＣ(fluoresceinisothiocyanate)であっても
蛍光が消光する等の問題点もあった。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの問
題点に鑑み、特に二本鎖核酸をはじめとする多重鎖核酸
を検出または定量するに当たり、鋭意検討した結果本発
明を為すに至った。本発明の多重鎖核酸の検出方法は以
下の工程から構成される。
題点に鑑み、特に二本鎖核酸をはじめとする多重鎖核酸
を検出または定量するに当たり、鋭意検討した結果本発
明を為すに至った。本発明の多重鎖核酸の検出方法は以
下の工程から構成される。
【００１４】(１)多重鎖核酸の検出または定量対象とし
ての試料溶液に、該多重鎖核酸の存在下で、蛍光を発す
るか、または、蛍光が増大する蛍光特性を有し、かつ、
該蛍光特性が乾燥状態においても維持可能な蛍光色素を
添加する工程(２)該蛍光色素が添加された前記試料溶液
の既知量を、観察用の清浄な基板上に載せ、該試料溶液
を乾燥させる工程、及び(３)該乾燥試料からの蛍光を測
定し、得られた測定値に基づいて前記試料溶液中におけ
る多重核酸の検出または定量を行なう工程。
ての試料溶液に、該多重鎖核酸の存在下で、蛍光を発す
るか、または、蛍光が増大する蛍光特性を有し、かつ、
該蛍光特性が乾燥状態においても維持可能な蛍光色素を
添加する工程(２)該蛍光色素が添加された前記試料溶液
の既知量を、観察用の清浄な基板上に載せ、該試料溶液
を乾燥させる工程、及び(３)該乾燥試料からの蛍光を測
定し、得られた測定値に基づいて前記試料溶液中におけ
る多重核酸の検出または定量を行なう工程。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明の方法によれば最終的に多
重鎖核酸と該多重鎖核酸に作用した蛍光色素が基板表面
に一定の面積をもって薄膜状に乾燥した状態で存在する
ので、試料の取り扱いが容易であるばかりでなく、励起
の方向に制限がない。また、乾燥した状態で蛍光を計測
するので試料容器の制限が大巾に緩和される。
重鎖核酸と該多重鎖核酸に作用した蛍光色素が基板表面
に一定の面積をもって薄膜状に乾燥した状態で存在する
ので、試料の取り扱いが容易であるばかりでなく、励起
の方向に制限がない。また、乾燥した状態で蛍光を計測
するので試料容器の制限が大巾に緩和される。
【００１６】もちろん、工程(２)で滴下する溶液の量が
比較的多ければ、それに対応した凹部を有する容器が必
要であるが、滴下する溶液の量が十分に少量であれば平
面状の基板でも差し支えない。ただし、定量的な評価が
必要な場合には滴下した液の面積を特定できる微小な凹
部は必要となる。
比較的多ければ、それに対応した凹部を有する容器が必
要であるが、滴下する溶液の量が十分に少量であれば平
面状の基板でも差し支えない。ただし、定量的な評価が
必要な場合には滴下した液の面積を特定できる微小な凹
部は必要となる。
【００１７】さらに、本発明によれば溶液中の多重鎖核
酸に該多重鎖核酸に作用した結果、蛍光を発する、また
は、蛍光が増大する色素を該多重鎖核酸に作用させるの
で原理的には多重鎖核酸に作用しなかった蛍光色素を洗
いの操作によって除く必要がなく、また、多重鎖核酸に
作用した状態で、乾燥状態においても蛍光の発光が維持
可能な蛍光色素を用いるので上述のような乾燥による蛍
光の消光の問題点も原理的に回避可能である。
酸に該多重鎖核酸に作用した結果、蛍光を発する、また
は、蛍光が増大する色素を該多重鎖核酸に作用させるの
で原理的には多重鎖核酸に作用しなかった蛍光色素を洗
いの操作によって除く必要がなく、また、多重鎖核酸に
作用した状態で、乾燥状態においても蛍光の発光が維持
可能な蛍光色素を用いるので上述のような乾燥による蛍
光の消光の問題点も原理的に回避可能である。
【００１８】本発明に用いる蛍光色素は溶液中の該多重
鎖核酸に作用した結果、蛍光を発する、または、蛍光が
増大し、かつ、該多重鎖核酸に作用して状態で、乾燥状
態においても蛍光の発光が維持可能な蛍光色素であれば
いかようなものでもかまわない。
鎖核酸に作用した結果、蛍光を発する、または、蛍光が
増大し、かつ、該多重鎖核酸に作用して状態で、乾燥状
態においても蛍光の発光が維持可能な蛍光色素であれば
いかようなものでもかまわない。
【００１９】本発明に用いる蛍光色素が多重鎖核酸に作
用し、その乾燥状態においても蛍光の発光を維持する機
構は定かではないが、蛍光強度が強く(別の見方をすれ
ば蛍光の量子収率が高い)、かつ、溶液中では比較的安
定なＦIＴＣやローダミンのそれぞれ単独の溶液を乾燥
状態に置くと、その蛍光が速やかに消光すること考える
と、本発明の蛍光色素が多重鎖核酸に作用した結果、色
素の周囲の微小環境が変化し、蛍光の発光の維持に適し
たものとなったのではないかと推察される。
用し、その乾燥状態においても蛍光の発光を維持する機
構は定かではないが、蛍光強度が強く(別の見方をすれ
ば蛍光の量子収率が高い)、かつ、溶液中では比較的安
定なＦIＴＣやローダミンのそれぞれ単独の溶液を乾燥
状態に置くと、その蛍光が速やかに消光すること考える
と、本発明の蛍光色素が多重鎖核酸に作用した結果、色
素の周囲の微小環境が変化し、蛍光の発光の維持に適し
たものとなったのではないかと推察される。
【００２０】そのような観点からすると本発明の蛍光色
素の多重鎖核酸に作用する様式としては色素分子が多重
鎖核酸に包括されるタイプが望ましい。そのような作用
様式としては色素が二本鎖核酸をはじめとする多重鎖核
酸の塩基対間に入り込むインターカレーション、あるい
は、多重鎖核酸のグルーブに入り込むグルーブバインデ
ィングがある。
素の多重鎖核酸に作用する様式としては色素分子が多重
鎖核酸に包括されるタイプが望ましい。そのような作用
様式としては色素が二本鎖核酸をはじめとする多重鎖核
酸の塩基対間に入り込むインターカレーション、あるい
は、多重鎖核酸のグルーブに入り込むグルーブバインデ
ィングがある。
【００２１】本発明者らはこれらの様式で多重鎖核酸に
作用する色素として、蛍光強度、安定性等を種々検討し
た結果、インターカレーターとしてはＥＢ、２-メチル
ー４,６-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノフェニル)ピリ
リウム塩、グルーブバインディングタイプの色素として
はＹＯＹＯ１が乾式蛍光測定による多重鎖核酸の検出/
定量に関して望ましいことを本発明において見出した。
作用する色素として、蛍光強度、安定性等を種々検討し
た結果、インターカレーターとしてはＥＢ、２-メチル
ー４,６-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノフェニル)ピリ
リウム塩、グルーブバインディングタイプの色素として
はＹＯＹＯ１が乾式蛍光測定による多重鎖核酸の検出/
定量に関して望ましいことを本発明において見出した。
【００２２】もっとも本発明はこれらの色素に限定され
るものではない。
るものではない。
【００２３】本発明によって検出/定量可能となる多重
鎖核酸としては通常の二本鎖ＤＮＡをはじめとして、先
に述べたような三本鎖ＤＮＡ、四本鎖ＤＮＡ、さらには
ＤＮＡ/ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ/ＲＮＡハイブリッ
ド等の天然型の多重鎖核酸のみならず、多重鎖の少なく
とも一本がホスホロチオエート型や、ハイドロジェンホ
スホネート型、また、バックボーンがヌクレオチドで構
成されているプロティン核酸等のバックボーンに非天然
型の構造を有しているもの、あるいは、糖部分、塩基部
分が修飾されているタイプの非天然型核酸であっても塩
基間の水素結合によりパートナーを認識して多重鎖を形
成可能なものであればいかようなものでも構わない。
鎖核酸としては通常の二本鎖ＤＮＡをはじめとして、先
に述べたような三本鎖ＤＮＡ、四本鎖ＤＮＡ、さらには
ＤＮＡ/ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡ/ＲＮＡハイブリッ
ド等の天然型の多重鎖核酸のみならず、多重鎖の少なく
とも一本がホスホロチオエート型や、ハイドロジェンホ
スホネート型、また、バックボーンがヌクレオチドで構
成されているプロティン核酸等のバックボーンに非天然
型の構造を有しているもの、あるいは、糖部分、塩基部
分が修飾されているタイプの非天然型核酸であっても塩
基間の水素結合によりパートナーを認識して多重鎖を形
成可能なものであればいかようなものでも構わない。
【００２４】基板の状態は、流動性を有している水の存
在による蛍光測定への障害、あるいは水分を含むことに
よる蛍光測定への障害を排除する乾燥状態であればよ
い。例えば実際の測定に用いるサンプルと同じものを作
成し、実際と同じ乾燥方法で予備乾燥実験を行ない、該
乾燥したサンプルについてＮＭＲを測定し、その結果に
基づいて水が測定に障害とならない程度に十分除去され
る乾燥条件を決定すればよい。
在による蛍光測定への障害、あるいは水分を含むことに
よる蛍光測定への障害を排除する乾燥状態であればよ
い。例えば実際の測定に用いるサンプルと同じものを作
成し、実際と同じ乾燥方法で予備乾燥実験を行ない、該
乾燥したサンプルについてＮＭＲを測定し、その結果に
基づいて水が測定に障害とならない程度に十分除去され
る乾燥条件を決定すればよい。
【００２５】具体的乾燥方法としては下記実施例で用い
られる真空ポンプでのドライアップが挙げられるが、同
様の効果を奏するものなら特に制限はない。
られる真空ポンプでのドライアップが挙げられるが、同
様の効果を奏するものなら特に制限はない。
【００２６】
【実施例】以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明
する。
する。
【００２７】[実施例１] ＥＢ、２-メチル-４,６-ビス(４-Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノ
フェニル)ピリリウムアイオダイド(以下Ｐ２と呼ぶ)、
ＹＯＹＯ１による二本鎖核酸の検出 (１)salｍon testes ＤＮＡ(二本鎖ＤＮＡシグマアル
ドリッチジャパン)１ｍgを１０ｍＭ Ｔris-ＨＣl緩衝
液(pＨ７.５)１ｍLに溶解し、適宜超音波破砕すること
により平均ＤＮＡ鎖長を２００-３００塩基対とした。
なお、鎖長はアガロース電気泳動によって確認した。こ
の溶液を適宜水で希釈し塩基対として１００μＭのスト
ック溶液とした。
フェニル)ピリリウムアイオダイド(以下Ｐ２と呼ぶ)、
ＹＯＹＯ１による二本鎖核酸の検出 (１)salｍon testes ＤＮＡ(二本鎖ＤＮＡシグマアル
ドリッチジャパン)１ｍgを１０ｍＭ Ｔris-ＨＣl緩衝
液(pＨ７.５)１ｍLに溶解し、適宜超音波破砕すること
により平均ＤＮＡ鎖長を２００-３００塩基対とした。
なお、鎖長はアガロース電気泳動によって確認した。こ
の溶液を適宜水で希釈し塩基対として１００μＭのスト
ック溶液とした。
【００２８】(２)ＥＢ(シグマアルドリッチジャパン)４
ｍgをＤＭＳＯ１ｍLに溶解し、ここに水９ｍLを加え
た。この溶液をさらに水で１００倍に希釈し、１０μＭ
のストック溶液とした。
ｍgをＤＭＳＯ１ｍLに溶解し、ここに水９ｍLを加え
た。この溶液をさらに水で１００倍に希釈し、１０μＭ
のストック溶液とした。
【００２９】(３)Ｐ２(本発明者らが合成)５ｍgをアセ
トニトリル１ｍLに溶解し、ここに水９ｍLを加えた。こ
の溶液をさらに水で１００倍に希釈することにより１０
μＭストック溶液とした。
トニトリル１ｍLに溶解し、ここに水９ｍLを加えた。こ
の溶液をさらに水で１００倍に希釈することにより１０
μＭストック溶液とした。
【００３０】(４)ＹＯＹＯ１(Ｍolecular Ｐrobe社１
ｍＭ/ＤＭＳＯ)を水で１００倍希釈して１０μＭのスト
ック溶液とした。
ｍＭ/ＤＭＳＯ)を水で１００倍希釈して１０μＭのスト
ック溶液とした。
【００３１】(５)各色素溶液１０μL(最終濃度１μ
Ｍ)、ＤＮＡ溶液０、２、５、１０μL(最終濃度０、２.
０、５.０、１０.０μＭ)、を混合し、水を加えて１０
０μLとした。ＹＯＹＯ１は塩濃度が希薄であると不安
定であるので１０μLの１００ｍＭ Ｔｍs-ＨＣl緩衝液
(pＨ７.５)を加えて総量１００μLとした。
Ｍ)、ＤＮＡ溶液０、２、５、１０μL(最終濃度０、２.
０、５.０、１０.０μＭ)、を混合し、水を加えて１０
０μLとした。ＹＯＹＯ１は塩濃度が希薄であると不安
定であるので１０μLの１００ｍＭ Ｔｍs-ＨＣl緩衝液
(pＨ７.５)を加えて総量１００μLとした。
【００３２】(６)適宜洗浄、乾燥した厚さ１ｍｍの透明
アクリル基板(旭化成デラグラスＡ)に(５)の溶液を０.
５μL載せた。この状態のものと、別に、同様の操作を
し真空ポンプでドライアップしたものとの蛍光を観察、
蛍光強度を測定をした。溶液での蛍光測定は試料が少量
で蒸発のおそれがあるので速やかに短時間内で行なっ
た。
アクリル基板(旭化成デラグラスＡ)に(５)の溶液を０.
５μL載せた。この状態のものと、別に、同様の操作を
し真空ポンプでドライアップしたものとの蛍光を観察、
蛍光強度を測定をした。溶液での蛍光測定は試料が少量
で蒸発のおそれがあるので速やかに短時間内で行なっ
た。
【００３３】蛍光の観察にはオリンパス倒立型蛍光顕微
鏡IＭＴ２(対物レンズ１０倍)を使用した。蛍光観察用
のフィルターキューブはＥＢの場合にはＧ励起フィルタ
ーを、ＹＯＹＯ１の場合にはＢ励起フィルターを、ま
た、Ｐ２の場合には特別に製作(朝日分光株式会社励起:
５８０nｍ、蛍光５４０nｍ、ダイクロイックミラー６１
０nｍ)したものを使用した。
鏡IＭＴ２(対物レンズ１０倍)を使用した。蛍光観察用
のフィルターキューブはＥＢの場合にはＧ励起フィルタ
ーを、ＹＯＹＯ１の場合にはＢ励起フィルターを、ま
た、Ｐ２の場合には特別に製作(朝日分光株式会社励起:
５８０nｍ、蛍光５４０nｍ、ダイクロイックミラー６１
０nｍ)したものを使用した。
【００３４】蛍光強度の測定には上記蛍光顕微鏡と中継
レンズ(ＮＦＫ２.５×ＬＤ)を介して、イメージインテ
ンシファイヤー付きＣＣＤ(浜松ホトニクス IＣＣＤ
Ｃ２４００-８７)と画像処理装置(浜松ホトニクスＡrgu
s５０)を使用した。
レンズ(ＮＦＫ２.５×ＬＤ)を介して、イメージインテ
ンシファイヤー付きＣＣＤ(浜松ホトニクス IＣＣＤ
Ｃ２４００-８７)と画像処理装置(浜松ホトニクスＡrgu
s５０)を使用した。
【００３５】蛍光強度の測定領域は平均的な明るさで、
ある程度均一と判断される２００×２００μｍの領域
で、値は領域中の画素(２×２μｍ)の平均値を採用し
た。また、イメージインテンシファイヤーの増幅度は表
示値０.２である。
ある程度均一と判断される２００×２００μｍの領域
で、値は領域中の画素(２×２μｍ)の平均値を採用し
た。また、イメージインテンシファイヤーの増幅度は表
示値０.２である。
【００３６】なお、各々の色素の蛍光強度値はフィルタ
ーの分光特性がそれぞれ異なり、また、励起光源く高圧
水銀ランプ)が輝線から構成されること、さらにはIＣＣ
Ｄカメラの感度に波長依存性があるので直接比較するこ
とはできない。
ーの分光特性がそれぞれ異なり、また、励起光源く高圧
水銀ランプ)が輝線から構成されること、さらにはIＣＣ
Ｄカメラの感度に波長依存性があるので直接比較するこ
とはできない。
【００３７】得られた蛍光強度値を図１(溶液)、図２
(乾式)に示す。図１、図２よりＥＢ、Ｐ２、ＹＯＹＯ１
を用いて、蛍光強度の差、直線性に差が見られるものの
ドライアップ状態での二本鎖ＤＮＡの検出/定量が可能
であることがわかる。
(乾式)に示す。図１、図２よりＥＢ、Ｐ２、ＹＯＹＯ１
を用いて、蛍光強度の差、直線性に差が見られるものの
ドライアップ状態での二本鎖ＤＮＡの検出/定量が可能
であることがわかる。
【００３８】また、使用した三種の色素を比較するとＥ
Ｂ、ＹＯＹＯ１ではドライアップした際の消光の度合い
が強く、特に、ＥＢではその傾向が強い。それに比べる
とＰ２では相対的に乾燥時のクエンチングの度合いが弱
く、本発明の測定方式に適合しているといえる。
Ｂ、ＹＯＹＯ１ではドライアップした際の消光の度合い
が強く、特に、ＥＢではその傾向が強い。それに比べる
とＰ２では相対的に乾燥時のクエンチングの度合いが弱
く、本発明の測定方式に適合しているといえる。
【００３９】[実施例２] Ｐ２による三本鎖核酸の定量 (１)パラレル型三重鎖を形成する以下の３種の１１量体
オリゴデオキシヌクレオチドはすでに合成されているも
のを購入した(関東化学株式会社)。 a) ５'ＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣ３'(配列番号１) b) ３'ＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧ５'(配列番号２) c) ３'ＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣ５'(配列番号３) 各オリゴヌクレオチドを塩基対濃度として５００μＭ含
む溶液を１Ｍ ＮaＣl、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０
ｍＭリン酸緩衝溶液中(pＨ６.５)でアニール(最終４℃
まで冷却)し三重鎖を形成し、塩基トリオあたりの濃度
として５００μＭ(全塩基濃度の１/３)のストック溶液
とした。なお、使用した塩濃度等の条件は三重鎖形成に
適当とされているものである。
オリゴデオキシヌクレオチドはすでに合成されているも
のを購入した(関東化学株式会社)。 a) ５'ＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣ３'(配列番号１) b) ３'ＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧ５'(配列番号２) c) ３'ＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣ５'(配列番号３) 各オリゴヌクレオチドを塩基対濃度として５００μＭ含
む溶液を１Ｍ ＮaＣl、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０
ｍＭリン酸緩衝溶液中(pＨ６.５)でアニール(最終４℃
まで冷却)し三重鎖を形成し、塩基トリオあたりの濃度
として５００μＭ(全塩基濃度の１/３)のストック溶液
とした。なお、使用した塩濃度等の条件は三重鎖形成に
適当とされているものである。
【００４０】(２)実施例１で用いたＰ２の溶液１０μ
L、(１)のＤＮＡ溶液０、０.５、１.０、２.０μL(最終
濃度０、２.５、５.０、１０.０μＭ)、を混合し、水を
加えて１００μLとした。
L、(１)のＤＮＡ溶液０、０.５、１.０、２.０μL(最終
濃度０、２.５、５.０、１０.０μＭ)、を混合し、水を
加えて１００μLとした。
【００４１】(３)実施例１と同様に乾式での蛍光強度を
測定した。
測定した。
【００４２】測定結果を図３に示す。実施例１と比較を
可能とするため、イメージインテンシファイヤーの増幅
度、また、グラフの縦軸は同一にしてある。図３から本
発明の方法により三重鎖核酸の検出/定量が可能である
ことがわかる。
可能とするため、イメージインテンシファイヤーの増幅
度、また、グラフの縦軸は同一にしてある。図３から本
発明の方法により三重鎖核酸の検出/定量が可能である
ことがわかる。
【００４３】[実施例３] Ｐ２による四本鎖核酸の定量 (１)四重鎖を形成するヒトのテロメア配列を有する下記
のオリゴデオキシヌクレオチドはすでに合成されている
ものを購入した(関東化学株式会社)。
のオリゴデオキシヌクレオチドはすでに合成されている
ものを購入した(関東化学株式会社)。
【００４４】d(ＴＴＧＧＧ)2 このオリゴヌクレオチド４００マイクロモルを１０ｍＭ
Ｋ+を含む２０ｍＭＴris-ＨＣl緩衝溶液(pＨ７.２)中
でアニール(最終４℃まで冷却)し四重鎖を形成し塩基カ
ルテットあたりの濃度として１００μＭ(全塩基濃度の
１/４)のストック溶液とした。
Ｋ+を含む２０ｍＭＴris-ＨＣl緩衝溶液(pＨ７.２)中
でアニール(最終４℃まで冷却)し四重鎖を形成し塩基カ
ルテットあたりの濃度として１００μＭ(全塩基濃度の
１/４)のストック溶液とした。
【００４５】(２)実施例１で用いたＰ２の溶液１０μ
L、(１)のＤＮＡ溶液０、２、５、１０μL(最終濃度
０、２.０、５.０、１０.０μＭ)を混合し、水を加えて
１００μLとした。
L、(１)のＤＮＡ溶液０、２、５、１０μL(最終濃度
０、２.０、５.０、１０.０μＭ)を混合し、水を加えて
１００μLとした。
【００４６】(３)実施例２と同様に乾式での蛍光強度を
測定した。
測定した。
【００４７】測定結果を図４に示す。図４においては実
施例１、２と比較を可能とするため、イメージインテン
シファイヤーの増幅度、また、グラフの縦軸は同一にし
てある。図４から本発明の方法により四重鎖核酸の検出
/定量が可能であることがわかる。
施例１、２と比較を可能とするため、イメージインテン
シファイヤーの増幅度、また、グラフの縦軸は同一にし
てある。図４から本発明の方法により四重鎖核酸の検出
/定量が可能であることがわかる。
【００４８】[比較例１] ＦIＴＣの乾式蛍光観察 水への溶解性を考慮してアミノ化されたＦIＴＣ(Ｍolec
ular Ｐrobe社)を用い、これを１μＭの水溶液とし、
適量をスライドガラスとカバーガラスの間に浸透させ
た。上記実施例の蛍光顕微鏡(Ｇ励起フィルター)＋IＣ
ＣＤ＋Ａrgus５０のシステムで蛍光を観察した。
ular Ｐrobe社)を用い、これを１μＭの水溶液とし、
適量をスライドガラスとカバーガラスの間に浸透させ
た。上記実施例の蛍光顕微鏡(Ｇ励起フィルター)＋IＣ
ＣＤ＋Ａrgus５０のシステムで蛍光を観察した。
【００４９】その結果、ガラス間に水が存在している間
は比較的強い蛍光が観察されたが、水が蒸発した領域か
らは全く蛍光は観察されなかった。
は比較的強い蛍光が観察されたが、水が蒸発した領域か
らは全く蛍光は観察されなかった。
【００５０】
【発明の効果】本発明の方法により二本鎖核酸をはじめ
とする多重鎖核酸をドライな条件で蛍光観察することが
可能となった。これにより検出/定量に使用する容器の
制限が緩和される、少量の試料も乾燥を気にすることな
く使用できる、ドライな条件なので操作が相対的に簡便
となる、蛍光の励起光照射の方向に制限がなくなる等の
効果をみることができた。
とする多重鎖核酸をドライな条件で蛍光観察することが
可能となった。これにより検出/定量に使用する容器の
制限が緩和される、少量の試料も乾燥を気にすることな
く使用できる、ドライな条件なので操作が相対的に簡便
となる、蛍光の励起光照射の方向に制限がなくなる等の
効果をみることができた。
【００５１】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Canon Inc. <120> Detection/Quantification of Multi-fold nucleotide chains by fluore scence. <130> 3495013 <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA single chain pr epared for a triple chain. <400> 1 ttcttctttt c 11 <210> 2 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA single chain pr epared for a triple chain. <400> 2 gaaaagaaga a 11 <210> 3 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthesized DNA single chain pr epared for a triple chain. <400> 3 cttttcttct t 11
【図１】ＥＢ、Ｐ２、ＹＯＹＯ１による二本鎖核酸の検
出および定量(溶液系)
出および定量(溶液系)
【図２】ＥＢ、Ｐ２、ＹＯＹＯ１による二本鎖核酸の検
出および定量(乾式)
出および定量(乾式)
【図３】Ｐ２による三本鎖核酸の検出および定量
【図４】Ｐ２による四本鎖核酸の検出および定量
フロントページの続き (72)発明者 山本 伸子 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB48 DA12 DA13 DA14 FA16 FB12 FB15 HA09 2G054 CA22 CE02 EA03 FB01 GA04 GE01 4B024 AA11 AA20 CA01 CA11 HA11 4B063 QA01 QQ08 QQ42 QQ52 QR41 QR66 QS11 QX02
Claims (7)
- 【請求項１】 以下の工程を含むことを特徴とする多重
鎖核酸の乾式検出または定量方法。 (１)多重鎖核酸の検出または定量対象としての試料溶液
に、 該多重鎖核酸の存在下で、蛍光を発するか、または、蛍
光が増大する蛍光特性を有し、 かつ、該蛍光特性が乾燥状態においても維持可能な蛍光
色素を添加する工程 (２)該蛍光色素が添加された前記試料溶液の既知量を、
観察用の清浄な基板上に載せ、該試料溶液を乾燥させる
工程、及び (３)該乾燥試料からの蛍光を測定し、得られた測定値に
基づいて前記試料溶液中における多重核酸の検出または
定量を行なう工程。 - 【請求項２】 前記多重鎖核酸が二本鎖核酸、三本鎖核
酸、及び四本鎖核酸のいずれかである請求項１に記載の
方法。 - 【請求項３】 前記蛍光色素が前記多重鎖核酸の二本鎖
核酸部分の塩基対間に入り込むインターカレーターであ
る請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記蛍光色素が前記多重鎖核酸の二本鎖
核酸部分のグルーブ内に入り込むグルーブバインディン
クタイプの色素である請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項５】 前記蛍光色素が２-メチル-４,６-ビス
(４-Ｎ,Ｎ,-ジメチルアミノフェニル)ピリリウム塩であ
る請求項３に記載の方法。 - 【請求項６】 前記蛍光色素がエチジウムブロマイドで
ある請求項３に記載の方法。 - 【請求項７】 前記蛍光色素がＹＯＹＯ１である請求項
４に記載の方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11210702A JP2001033440A (ja) | 1999-07-26 | 1999-07-26 | 乾式蛍光測定による多重鎖核酸の検出／定量方法 |
| US09/764,050 US6960432B2 (en) | 1999-07-26 | 2001-01-19 | Detection/quantification of targeted nucleotide chains, and detection/quantification of multi-stranded nucleotide chains by fluorescence |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11210702A JP2001033440A (ja) | 1999-07-26 | 1999-07-26 | 乾式蛍光測定による多重鎖核酸の検出／定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001033440A true JP2001033440A (ja) | 2001-02-09 |
Family
ID=16593692
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11210702A Pending JP2001033440A (ja) | 1999-07-26 | 1999-07-26 | 乾式蛍光測定による多重鎖核酸の検出／定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001033440A (ja) |
-
1999
- 1999-07-26 JP JP11210702A patent/JP2001033440A/ja active Pending
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