JP2000517048A - 神経退行変性病理のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法及びこれらの方法を実施するためのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、人間又は動物の神経退行変性病理のin vitro診断方法を実施するための、インドール又はオキシインドール環を含む誘導体のすべての検出方法又は場合によっては定量方法の利用をその目的とする。本発明は同様に、上述のin vitro診断方法ならびにかかる方法の実施のためのキットにも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 神経退行変性病理のin vitro診断方法及びこれらの方法を実施するためのキッ ト 本発明の目的は、人間又は動物の神経退行変性疾患の新しいin vitro診断方法 、ならびにこれらの方法を実施するためのキットにある。 １９８８年以降、循環ボルタメータ測定技術により、得られたボルタモグラム 上で人間の退行変性痴呆（アルツハイマータイプの痴呆、混合型痴呆及びピック 病）及び人間の海綿状脳症（クロイツフェルトヤコブ病）及び動物の海綿状脳症 （羊の痒疹又はスクラピー及びウシの海綿状脳症）に共通のピーク（還元サイク ル中に見える、８５０mVでのもの）を立証することが可能となった。 人間において発明者が実施した調査は、痴呆でない対照(ｎ＝３８)、アルツハ イマータイプの痴呆(ｎ＝３０)、脈管由来の痴呆(ｎ＝１３)、混合型痴呆(ｎ＝ ５)、クロイツフェルトヤコブ病（ｎ＝２）という５つのグループに分けられた 高齢の８８人の被験者について行われた。このピークは、幾人かのアルツハイマ ータイプの痴呆被験者（陽性１２件、「擬陽性」５件、陰性１３件）及び混合型 痴呆症被験者（陽性１件、「擬陽性」２件、陰性２件）そして２件のクロイツフ ェルトヤコブ症被験者の尿の中で再び見い出されている。ピークは、純粋に脈管 タイプの痴呆症被験者(陰性１３件)由来の尿の中では全く立証されなかった。反 対に、痴呆でない３８名の被験者のうちの１名の尿においてこのピークが再び認 められた(陽性１件、陰性３７件)。アルツハイマータイプの痴呆症の幾人かの被 験者の経時的追跡調査により、このピークの発現が大幅な変動を受けており、そ のためこのピークは、病気を患う被験者の尿の中で常時検出できない、というこ とを示すことができた。したがって、唯一の分析から追跡された症例の百分率は 、アルツハイマータイプの痴呆患者については４０％（３０のうち１２件）にす ぎない(Banissi-Sabourdy C．et al．-Bioelectochemistry及びBioenergetics， 1992，28:127-147)。 反すう動物において発明者が実施した調査は、３５頭の羊(１６頭がスクラピ ーを患い、１９頭は健康)及び１００頭の海綿状脳症（ＥＳＢ）を患う雌牛につ いてのものであり、その診断の各々はその後病理解剖によって確認された。ピー ク は、痒疹をもつ羊の８７％(１６頭中陽性１４件)及びＥＳＢを患う雌牛の９５％ （１００頭のうち陽性１０４件）の尿中に、ピークが再び認められた。このピー クは、対照動物の尿中には全く認められなかった。(１９頭の健康な羊のうち陰 性１９件、１２頭の健康な雌牛のうち陰性１２件)。(Brugere H et al-Bull・Aca d.Vet．de France，1991，64:139 145;Brugere H．et al．-欧州共同体委員会、 ブリュッセル。１９９３年９月１４、１５日)。 以下の研究作業から、循環皮相電力計測定法の利用により、唯一の分析から、 羊と雌牛のそれぞれにおいて８１％及び８５％の公然の海綿状脳症症例を追跡す ることが可能となるという結論を下すことができる。(「公然の」というのは、そ の診断を臨床上の徴候から下すことができるということである)。これら２つの 百分率の間の差異は有意なものではない(p＞０．８)。実際ここで問題となって いるのは、両方の症例において、一般に約１ヶ月〜６ヶ月の比較可能な期間以内 で両者共進行する類似の病因をもつ疾病である。 人間において実施された調査は、循環皮相電力計測定法による尿の唯一の分析 が、アルツハイマータイプの公然の痴呆症の症例の４０％しか追跡できなかった ことを示した。この百分率は、海綿状脳症を患う反すう動物において観察された ものときわめて有意に異なっている(ｐ＜０．００５)。実際、このとき、同じく 異なる期間内（反すう動物の海綿状脳症について数ヶ月であるのに対しアルツハ イマータイプの痴呆については数年）で進行する異なる病因の２つの疾病が比較 されているのである。 本発明の目的は、人間又は動物の神経退行変性疾患のin vitro診断の信頼性の 高い方法を提供することにある。 本発明は、より厳密に言うと、特に１人の人間又は動物において読取られた臨 床的徴候が公然の神経退行変性疾患の診断に関する疑いを残しうるものである場 合において、この人間又は動物がこの病気にかかっていることを確認できるよう にするin vitro診断方法を提供することをその目的としている。 本発明のもう１つの目的は、まだ公然でない、すなわちその臨床的徴候がまだ 明らかでない神経退行変性疾患に人間又は動物がかかっていることを見つけ出す ことを可能にするin vitro診断方法を提供することにある。 本発明のもう１つの目的は、動物の群れの中で、公然のものであれそうでない ものであれ神経退行変性疾患（特に海綿状脳症）を患う動物を、かかる病気にか かっていない動物から明確に区別し、かくして罹患していない動物のみを食用肉 獲得のため屠殺場に導くことができるようにする、in vitro診断方法を提供する ことにある。 本発明のもう１つの目的は、これらのin vitro診断方法の実施のためのキット を提供することにある。 本発明は、公然の神経退行変性疾患を患う人間又は動物の尿から測定されたボ ルタモグラム上に現われる上述のピークが、これらの尿中のインドール又はオキ シインドール核を含む誘導体、特に、以下に示す一般構造式（Ｉ）を満たす誘導 体、より特定的には以下に示す構造式（Ｉｂ）の誘導体に対応するマーカーの存 在に対応している、という発明者によってなされた発見に由来するものである。 本発明は、以下の図を用いて例示される： − 図１：健康な雌牛(図１ａ)、痒疹を患う雌牛(図１ｂ)、ＥＳＢを患う雌牛( 図１ｃ)、健康な高齢者（図１ｄ）及びアルツハイマータイプの老人性痴呆症を 患う人間（図１ｅ）からの尿の循環皮相電力計測定法による標本の分離プロフィ ル。 − 図２〜４、８及び１３（ａ及びｂ）:痒疹を患う羊の尿からの上述のマーカ ーの抽出及び精製の電気−ボルトアンペアグラムによる追跡調査。 − 図６及び７：上述のマーカーのＵＶスペクトル、 − 図９：上述のマーカーのイオンクロマトグラフィー − 図１０：上述のマーカーのセルロース平板上の薄層クロマトグラフィー − 図１１：上述の構造式（Ｉｂ２）のマーカーの質量スペクトル。 − 図１２：上述の構造式（Ｉｂ２）のマーカーの陽子ＮＭＲスペクトル。 本発明の目的は、インドール又はオキシインドール核を含む誘導体、より特定 的には、次の一般構造式（Ｉ）: 式中、 − Ｒ₁は、水素原子又は硫酸塩基ＳＯ3^-又はＲ_a基を表し、Ｒaは共役基(groupe conjugue)(炭水化物又はグルシドといったもの)、特にグルクロニド、グルコー ス、デオキシリボース又はフルクトースを表し、 − Ｒ₂は、水素原子又は上で定義づけたようなＲ_a基を表し、 − ｎ₁、ｎ₂及びｎ₃は、互いに独立してゼロ又は１を表す、 を満たす誘導体の中から選ばれた少なくとも１つの誘導体であって、しかも、以 下の３つの互変異性体形態、すなわち １）− 還元された形が、次の構造式（Ｉａ１）: （式中、Ｒ₁及びＲ₂は、上述のものと同じ意味を有する）の誘導体に対応し、 − 酸化された形が、次の構造式（Ｉａ２）: （式中、Ｒ₁は、上述のものと同じ意味を有する）の誘導体に対応する、構造式 （Ｉａ）の形態、 ２）− 還元された形が、次の構造式（Ｉｂ１）: （式中、Ｒ₁は、上述の意味を有する）の誘導体に対応し、 − 酸化された形が、次の構造式（Ｉｂ２）: の誘導体に対応する、 構造式（Ｉｂ）の形態、 ３）− 還元された形が、次の構造式（Ｉｃ１）: （式中、Ｒ₁及びＲ₂は、上述の意味を有する）の誘導体に対応し、 − 酸化された形が、次の構造式（Ｉｃ２）: （式中、Ｒ₂は、上述のものと同じ意味を有する）の誘導体に対応する、 構造式（Ｉｃ）の形態、 に対応する誘導体のあらゆる検出方法又は場合によっては定量方法の人間又は動 物の神経退行変性病理、特に、中枢神経系の退行変性疾患、より特定的には、人 間の退行変性性痴呆症又は人間もしくは動物の脳障害のin vitro診断方法の実施 を目的として利用することにある。 当然のことながら、上述の一般構造式（Ｉ）上に表された破線は、構造式（Ｉ ）の化合物の環及び／又は複素環を構成する異なる原子の間の２重結合の存在の 可能性を表している。 本発明は、より特定的に言うと、還元された形（Ｉｂ１）又は酸化された形（ Ｉｂ２）での上述のような構造式（Ｉｂ）の少なくとも１つの誘導体のあらゆる 検出そして場合によっては定量の方法の上述の利用に関する。 本発明は、より特定的に言うと、Ｒ１＝Ｈである構造式（Ｉｂ１）の誘導体又 は構造式（Ｉｂ２）の対応するその酸化形態のあらゆる検出又は定量方法の上述 の利用をその目的とする。 本発明は同様に、上述のとおりの神経退行変性疾患のin vitro診断方法におい て、適切な人間又は動物の生物学的試料の中で、インドール又はオキシインドー ル核を有する少なくとも１つの誘導体、より特定的に言うと、上述の一般構造式 （Ｉ）を満たす誘導体のうちの少なくとも１つの誘導体を検出し、場合によって 定量する工程を含むことを特徴とする方法をもその目的としている。 本発明は、同様に、還元した形（Ｉｂ１）又は酸化した形（Ｉｂ２）で上述の とおりの構造式（Ｉｂ）の少なくとも１つの誘導体を検出し場合によっては定量 する工程を含む、上述のとおりのあらゆるin vitro診断方法にも関する。 本発明は、より特定的には、Ｒ１＝Ｈである構造式（Ｉｂ１）の誘導体又は構 造式（Ｉｂ２）の対応するその酸化形態を検出し場合によって定量する工程を含 む上述のとおりのあらゆるin vitro診断方法に関する。 本発明の目的は、より特定的には、以下の疾病のin vitro診断に対する上述の 方法の応用にある：すなわち、人間におけるアルツハイマータイプの痴呆、人間 における混合型痴呆、人間におけるピック病、人間の海綿状脳症、特にクロイツ フェルト・ヤコブ病、動物の海綿状脳症特にヒツジの痒疹及びウシの海綿状脳症 (Ｅ.Ｓ.Ｂ)。 本発明はより特定的に言うと、その臨床的徴候が人間又は動物にすでに現われ ている、以上で定義された神経退行変性疾患のin vitro診断に対する上述の方法 の応用を目的としており、これらの方法は特に疾病の進行を追跡調査することを 可能にする。 有利には、本発明の診断方法は、これらの神経退行変性疾患の特徴である臨床 的徴候がまだ出現していない、見かけ上は健康なキャリヤにおいてこれらの疾患 を追跡することを可能にする。 本発明の診断方法の実施の枠内で利用される生物学的標本は、好ましくは尿、 血液又は頭脊柱液（ＬＣＲ）といったその他の生物学的液体である。 発明の好ましい実施形態に従うと、上述の診断方法は、以下の工程を含む： − 検出すべき構造式（Ｉ）の少なくとも１つの誘導体特に酸化された形のもの 、そしてより特定的には構造式（Ｉｂ２）の誘導体を生物学的標本のその他の構 成成分から物理的又は生物学的に分離し場合によって特にＨＰＬＣ、ガスクロマ トグラフィー又は毛細管電気泳動法により誘導体を直接同定する工程、 − 場合によっては、特に標識づけされた単数（又は複数の）試薬を用いて、こ の生物学的標本中に前記誘導体が存在する場合にそれを検出する工程。 特に好ましい前記誘導体の物理的分離及び直接的同定による上述のような診断 方法は、螢光による検出と結びつけたＨＰＬＣ法の実施により行われるものであ る。このような方法は、特にVolicer et alにより、ＬＣＲ中の５−ヒドロキシ トリプトファン及びセロトニンの異常形態の検出の枠内で記述された方法に従っ て実施され得る。(Volicer et al.，Arch．Neurol.，1985，第42巻，1158-1161) 。 ＨＰＬＣに結びつけることのできるもう１つの検出方法は、電気化学的検出方 法である(ＥＳＡ５１００といったようなCoulometric検出器により、検出と量的 測定を実現することが可能となる)。有利には、合成で実現され検出すべき構造 式に対応する標準分子を利用することによって、測定を校正し、特に酸化された 互変異性体Ｉｂ２の形での構造式Ｉａ、Ｉｂ及びＩｃ内で記述された分子の溶離 条件を探し当てることが可能となるだろう。この酸化された互変異性体形態の検 出には、この分子に対する影響をもたない第１の酸化サイクルとそれに続く、循 環電気皮相電力計測定技術において８５０mVで記述されたものに対応する信号の 検出を可能にする還元（図１参照）が必要となるだろう。その後、有利には、マ ーカーは第２の酸化サイクルの際に検出されることになる。 もう１つの測定方法は、ガスクロマトグラフィー上で、一般構造式に対応する 分子を分離することからなる（ＯＨ基が存在するか否かに応じて、シリル化が必 要となる）。その後、標本は、質量分析法により測定される。構造式Ｉｂ２に従 った酸化された形態が、予備的なシリル化工程無しに検出可能であること、そし てその質量は１４７又は１４８であること（還元された形態の場合に比べ水素が ２個又は１個少ない）に留意されたい。 もう１つの検出方法は、直列に配置された質量分析法である(ＨＰＬＣ，Masse ，Masse)。 本発明の特に有利な１つの実施形態に従うと、上述の診断方法には、生物学的 標本の中に存在する可能性のある構造式（Ｉ）の誘導体をこの生物学的標本のそ の他の構成成分から、特にこれらの構造式（Ｉ）の誘導体に対し向けられた抗体 を用いて、特に構造式（Ｉｂ２）の誘導体に対し向けられた抗体を用いて、生物 学的方法で分離する工程が含まれている。 この点で、本発明は、より特定的に言うと、以下の工程を含む上述のようなあ らゆるin vitro診断方法を目的とする： − 上述の構造式（Ｉ）の少なくとも１つの誘導体に対して向けられ固体支持体 上に固定された抗体が存在する状態に生物学的標本を置き、かくしてこの生物学 的標本の中に存在する可能性のある前記誘導体と前記抗体の間の複合体を獲得す る工程； − 適切な溶液で固体支持体を洗浄する工程； − 上述の複合体を特異的に認識することのできる標識づけされた試薬、特に、 前記複合体を認識する標識づけされた抗免疫グロブリンを固体支持体上に添加す る工程； − 固体支持体を洗浄する工程、 − 固体支持体上に標識付けされた試薬が存在する場合それを検出する工程。 一例を挙げると、本発明の診断方法は有利には、ＥＬＩＳＡ技術（酵素結合免 疫吸着検定法）に従って実施され、この技術では、固体支持体上に固定された抗 体と検出すべき誘導体の間で形成される複合体を明らかにするために利用される 抗免疫グロブリンは、それ自体規定の基質と特異的に反応できる酵素に対するカ ップリングによって標識づけされている。このような方法は、例えば、Yie et a l．の論文（Clinical Chemistry，1993，第39巻，2322-2325）の中で記述されて いるプロセスに従って実施可能である。 本発明は同様に、上述の構造式（Ｉ）の少なくとも１つの誘導体、より特定的 には構造式（Ｉｂ２）の誘導体に対して導かれたポリクローナル又はモノクロー ナル抗体をもその目的とする。 本発明は、より特定的に言うと、上述の構造式（Ｉ）の誘導体のうちの単数又 は複数のものさらにはそのすべてに対し向けられたポリクローナル抗体をもその 目的とする。このようなポリクローナル抗体は、構造式（Ｉ）の誘導体のうちの 単数又は複数のものさらにはそのすべてを用いて動物を免疫化しその後前記動物 の免疫系により産生された抗体を回収することによって得ることができる。 本発明は同様に、一方では構造式（Ｉ）の誘導体のうちの１つに対し免疫化さ れた特にマウス又はラットといった動物の脾細胞から、又他方では適切な骨髄腫 の細胞から従来の方法により形成され得、しかもまず最初に動物の免疫化のため に利用される上述の構造式（Ｉ）の誘導体を認識するモノクローナル抗体を産生 するその能力によって選択され得るあらゆるハイブリドーマによって産生される ような上述の構造式（Ｉ）の誘導体に対して向けられたモノクローナル抗体にも 関する。 上述の抗体の獲得のために利用される上述の構造式（Ｉ）の誘導体であるため 、 これは、例えば以下に記述する精製方法に従って、神経退行変性疾患を患う人間 又は動物から採取された特に血液、尿又は頭脊柱液などの適切な生物学的標本か ら精製された形で得ることができる。 還元された形での構造式（Ｉ）のこれらの誘導体そしてより特定的には、Ｒ１ 及び／又はＲ２がＨを表す上述の構造式（Ｉａ１）、（Ｉｂ１）又は（Ｉｃ１） の誘導体は、同様に、Yamaguchi et al．(Wakayama Med．Rept.，1971，第15巻 ，127-134)の中で記述された方法に従ってか又はBeckett A．H et al．(Tetrahe dron，1968，第24巻，6093〜6109)の論文中に記述された方法に従って、化学合 成によっても得ることができる。 上述の還元された形のこれらの誘導体の酸化された形態は、還元された形態を 数ボルトを上回らない電界内で酸化することによって得ることができる。還元さ れた誘導体は、水及び単数又は複数の有機溶剤（例えばアルコール、アミド又は ニトリル）の混合物から成り、鉱酸（ＨＣｌ、Ｈ₂ＳＯ₄…）又はアルカリ金属塩 といった支持電解質の添加によって電流の導体にすることのできる１つの溶液の 中に導入される。電気化学セルは、従来どおりの当業者にとっては周知の方法で 、イオン交換膜により分離された２つのガラス容器又は、還元又は酸化された誘 導体の負の電極（陰極）に向かっての拡散を回避できるようにするその他のあら ゆる装置によって構成されている。還元誘導体の電気的酸化は、塊状又は繊維状 炭素又は非腐食性金属例えば白金などで構成されていてよい陽極におい誘発され る。電解は、例えばCalomelといった基準電極との関係においてTacusselラジオ メータ由来のポテンシオスタットを用いて、還元誘導体の酸化を誘発するような 電位を課すことによって実施される。 Ｒ₁がＨを表している上述の構造式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（Ｉｃ）の誘導体 のスルホ接合は、R．Sekura，M．Duffel，W．Jakoby（Methods in Enzymology， Jakoby W ed.，Academic Press．New York，1981，第77巻，p197〜206）に従っ てラットの肝臓又はヒト血小板から精製されたＭタイプのスルホトランスフェラ ーゼ（ＥＣ２．８．２．１）を用いて酵素反応を利用して得ることができ、スル ホ接合プロトコルは、５−プレグネン−３−オール−２０−オン（ＰＲＥＧ）の スルホ接合について、H．Soliman，P．Boudou，J.M．Vilette及びJ．Fiet（J．S teroid Biochem．Molec．Biol.，1993，46巻，p631〜634）によって記述されているもの である。かくして、Ｒ₁がＳＯ₃ ^-を表す上述の誘導体が得られる。 Ｒ_aが上で定義づけされたとおりのものであるとしてＲ₁及び／又はＲ₂がＲ_a基 を表している上述の構造式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（Ｉｃ）の誘導体の調製の場 合、これらの誘導体の調製は、上述のYamaguchi et al.,及びBeckett A．H．et al.，の論文中又は「Method in Enzymology，Jakoby W．ed.，Academic Press， New York，1931，第77巻中に記述されたものから導かれたプロトコルに従って実 施することができる。 上述の抗体の獲得のために利用される構造式（Ｉ）の誘導体は、有利には、前 記誘導体の免疫学的特性を増大させかくして抗体の産生を増大させるべく、構造 式（Ｉ）上に特にａ又はｃの位置で、当業者にとって既知の技術に従って、通常 ハプテンのために利用される担体分子にカップリングされ得る。 本発明は同様に、構造式（Ｉ）の単数又は複数の誘導体の検出ひいては定量が 、この誘導体及びこの誘導体と特異的に反応する分子又は分子群の間の比色定量 反応を実施しこの反応の比呈色の出現をひき起こすことによって前記誘導体及び 生物学的標本のその他の構成成分の予備的分離なく行われ、この呈色は、前記誘 導体と上述の前記分子又は分子群の間の反応に由来する生成物の呈色であるか又 は上述の反応の生成物のうちの１つとの反応によって変性された基質の呈色であ ることを特徴とする、以上で定義づけされたとおりの神経退行変性疾患のあらゆ るin vitro診断方法をもその目的としている。 本発明は同様に、組合せ（コンビナトーリアル）化学プロセスにより合成され （例えばポリペプチド、ポリオリゴサッカリド）構造式Ｉに対応する化合物との 親和力基準に基づいて選別され、かくしてこれらの化合物の特定的探知及び最も 親和力の高い重合体の選択を可能にするような重合体の利用をもその目的とする (これらのaptameres専門方法、又はSelex法については、John Abelsonが編集し たAcademic Pressの「Methods in Enzymology」第267巻の中で記述されている) 。 診断キットを作製することを可能にするもう１つの定量方法が、有利にも、刻 印づけつまり「インプリンティング」技術により実現された鋳型から発展させら れる(K．Mosbach et O．Ramstrom，Biotechnology，14，163-169，1996)。 本発明は同様に、標本中にＲ₁がＨを表す構造式（Ｉ）の誘導体のみを得るた め生物学的標本中に存在する可能性のある、Ｒ₁がＳＯ₃ ^-を表している構造式（ Ｉ）の誘導体から硫酸塩を除去するべく、８０℃で２時間、例えば塩酸（pH１） を用いて特に酸性加水分解によって生物学的標本を処理する予備工程を含み、こ の工程の後には、特に以上で記述した技術に従って構造式（Ｉｂ１）の誘導体と いったようなＲ₁がＨを表す構造式（Ｉ）の誘導体を検出しひいては定量する工 程が続いている、上述のとおりのあらゆる診断方法をも目的としている。 本発明は、その診断方法の１つを実施するためのキットをもその目的としてい る。 有利には、本発明のキットには、次のものが含まれる： − 構造式（Ｉ）の誘導体の少なくとも１つ、特に構造式（Ｉｂ２）の誘導体に 対して導かれた上述のとおりの抗体であって、特に滴定プレートのウェルの中で 固体支持体上に有利にも固定されている抗体、 − 場合によっては、 ・ 前記抗体と、分析対象の生物学的標本中に存在する可能性のある構造式（ Ｉ）の単数又は複数の誘導体との間で免疫反応を樹立させるのに適した媒質、 ・ 固体支持体の洗浄用溶液 ・ 例えば放射線、酵素又は螢光によって、特に標識づけされた抗免疫グロブ リンといった、構造式（Ｉ）の前記誘導体と前記抗体との間に場合によって形成 される複合体の検出のための適切な試薬。 本発明は、中枢神経系の退行変性疾患の潜在的マーカーの精製及び特徴づけに ついての詳細な記述を用いて、さらに例示される。 以前に見てきたように、尿中で排泄されたこのマーカーは、人間の退行変性痴 呆（アルツハイマータイプの痴呆、混合型痴呆及びピック病）と人間の海綿状脳 症（クロイツフェルトヤコブ病）及び動物の海綿状脳症（羊の痒疹及びウシ海綿 状脳症）に共通のものである。 このマーカーの存在は、黒鉛粉末電極上で循環ボルタメトリー技法により人間 又は動物の尿の標本について直接立証される(図１ａ〜１ｅ)。 マーカーの精製は、抽出、透析、イオン交換カラム上のクロマトグラフィーな どによって実施された。 還元された形でのマーカーの特徴づけは、従来の分析技術すなわち、ＵＶ分光 法、イオンクロマトグラフィー、質量分析法、ＮＭＲＩＨなどによって実施され た。 還元された形でのマーカーは、オキシインドールの硫化誘導体として合成され た分子との比較によって同定される。 １）尿マーカーの精製及び特徴づけ 海綿状脳症を患う反すう動物がアルツハイマー病を患う人間の被験者よりも相 対的に大きい濃度でマーカーを排泄したことを確認したことから、我々は、痒疹 を患う雌羊の尿を利用することを選択した。ただし、このプロトコルは、その供 給源の如何に関わらず、尿に適用されるものである。 ＨＣｌ水溶液で尿をpH＝１にまで酸性化した後、充分な量のマーカーの存在を 確認するべく皮相電力プロットが作製される。 １.１） 酢酸エチルでの処理 遠心分離後、マーカーに対応する化合物はみかけ上従来の有機溶剤の大部分（ エーテル、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、イソプロパノール…） の中で溶解しないことから、このpHで帯電していない最大限の尿化合物（カテコ ールアミン、ｐ−クレゾール…）を除去するべく尿を酢酸エチルによる数回の抽 出に付す。かくして一定量（２０ml）の尿に対し、大気温で２０mlの酢酸エチル を添加し、傾瀉フラスコの中で混合物を強く撹拌し、相と分離させるべく１０分 間、分あたり１０,０００回転で遠心分離に付す。酢酸エチル相を除去し、同じ 実験を４度くり返し行う。 中性化合物の抽出後、１mlの水相アリコート上で新たに電気化学検査を行う( 図２)。 １.２） 交差透析 マーカーは、pH＝１であっても大部分の有機溶剤中で可溶でないことから、発 明者らは、それが恐らくこのpHで帯電したきわめて親水性の生成物であるという ことを演繹した。したがって発明者は、イオン膜を用いて実施される交差透析 実験により尿からそれを抽出しようと試みた。彼らは、マーカーが陽イオン膜を 横断せず、陰イオン膜を用いて実験した場合には逆に透析物の中に再び見い出さ れることを確認した。したがってここで問題となっているのは、極めて強い酸性 の媒質の中でさえ負に帯電した種である。さらに発明者らは、透析物が実際上無 色透明な液体の形を呈していることを観察したが、当然これは出発物質の尿には あてはまらず、そのため、その後のすべての実験は、系統的に陰イオン膜を通し た透析の後に実施された。 透析は、酢酸エチルによる中性化合物の抽出の後に得られた水相から実施され る。この水相は、酸性加水分解によるマーカーの劣化を回避するべく水酸化ナト リウムを添加することでpHを５〜６まで戻した後、４０℃未満の温度で回転蒸発 装置を用いて真空下で蒸発させられる。その後、残渣はＨＣｌ １０^-3Nにより 回収され、次に特別製のガラス製透析セル内で条件づけされた陰イオン交換膜( ＲＡ１ブランズＲ型ｎ°１０３０)を用いて実施される交差透析に付される。濃 縮区画は、pH＝３で１MのＮａＣｌを含み、これらの条件は、膜内外交換を最適 化するべく選択されたものである。透析は２４〜４８時間、４℃の低温チャンバ 内で磁気撹拌下で行われる。マーカーの存在を皮相電力計測定法により制御する べく、濃縮区画のアリコートが採取される。これと平行して、混合物のＵＶスペ クトルを実現する(図３)。 １.３） イオン交換カラム上での精製 透析物は、真空下で蒸発させられ、無水エタノールにより取戻され、その後塩 を除去するべくろ過される。エタノールの蒸発後、残渣は、陰イオン交換ポリエ チレンイミンセルロース（ＰＥＩ）の開放カラム上に注入される前に、最低量の ＨＣｌ １０^-3Nの中に溶解させられる。陰イオンの異なる構成成分は、ＮａＣ ｌ勾配により低温チャンバ内で分離される。このとき、電気化学的にマーカーの 特徴を呈する部分的に精製された分画が得られる。我々は、高さ１５cm、直径１ cmのポリエチレンイミンカラムを利用した。マーカーを含む標本は、分あたり１ mlの流量でカラム上に適用され、得られた溶離及びマーカーの位置は、図４及び ５に示されている。 溶離量は、ＮａＣｌ ４００ｍｌであり、１mlの分画を収集して電気皮相電力 計 測定法に付す(Ｃｏ＝４.５×１０２M、Ｃｌ＝９.５×１０^-2M)。 １.４） ＵＶ分光法 マーカーを含む分画のＵＶスペクトルは、λmax＝２４９−２５０nmといった 最大吸光度を呈する(図６及び７)。２８０nmでの急勾配は、Ｃ＝Ｏ結合の存在を 示す。 １.５） 硫酸塩イオンの検出 マーカーはpH＝１で負に帯電させられていることから、発明者は、それが硫酸 塩イオンに凝縮された形（「スルホ接合」誘導体）で尿中に排泄された化合物であ ると想定した。この仮説を試すため、精製された少量の生成物を２時間８０℃で 酸性加水分解に付した(この加水分解は、pHが１となるようＨＣｌを添加するこ とによって得ることができる)。同様にして、加水分解された標本に対応するＵ Ｖスペクトルは、加水分解前に得られたものと異なっている(図７)。したがって 我々はこのことから、マーカーが酸性加水分解に対し敏感であることを演繹する ことができる。加水分解の後の標本のボルトアンペアグラムが作成され、これは 、加水分解前の同じ標本のものと異なることがわかった(図８)。硫酸塩、りん酸 塩、硝酸塩及び塩化物イオンは、陰イオンＤＩＯＮＥＸカラム ＩＯＮ／ＰＡ Ｃ ＡＳ４Ａ−ＳＣ分析用カラム（イソクラティク溶離−伝導率による検出−溶 離液：電気伝導度測定による１.８mMのＮａ₂ＣＯ₃／１．７mMのＮａＨＣＯ₃）上 でのイオンクロマトグラフィーにより加水分解の前後の標本中で定量された。分 析により、基準としてとられた加水分解前の標本中に比べ加水分解を受けた標本 中では４倍の量の遊離硫酸塩の存在が明らかになった。この結果は、マーカーが スルホ接合された形の尿中で除去された誘導体となるとする仮説を確認するもの である。 １.６） 薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による精製 マーカーを含有する分画を乾式で蒸発させ、薄層クロマトグラフィー（供給業 者Merck）のためにセルロース平板上に被着させる前に少量のＨＣｌ １０^-3Nに より回復させる。移動溶剤はブタノール／酢酸／水８：２：２の混合物である。 移動後、分離された異なる生成物をＵＶ光の下で探知し、吸着層で離脱させる。 セルロースに結合した生成物をＨ₂Ｏで回収し、セルロースを遠心分離で除去す る。その後、マーカーの位置決定のため、電気化学的検査を行う。ＮＭＲ及び質 量分析法による分析を実施するのに充分な量の生成物を得るため、ＴＬＣによる 精製をくり返す(図１０)。 １.７） 質量分析法及びＮＭＲ１Ｈによる分析 ＴＬＣにより精製された還元された形でのマーカーの質量分析法(図１１)（電 子衝撃及び化学的イオン化）による分析は、それが１４９に等しい分子質量（又 はフラグメント）を呈する化合物であることを示している。この値ならびに、分 子のさまざまな断片化について観察された値は、ヒドロキシルラジカルの位置が 解決されていないことからそれがヒドロキシ−オキシインドールタイプの化合物 であることを想定させる可能性がある。硫酸塩基は明らかにされないが、これは 、対照化合物ＭＨＰＧ−硫酸塩の同じ条件下での質量分析計に＋よる分析が分子 ピークとして（硫酸塩基を失なった）ＭＨＰＧのものを与えているかぎり、全く 驚くべきことではない。 得られたＮＭＲ１Ｈスペクトルは、インドール又はオキシインドール核の存在 と相容れるものであり、このことは、Ｃ＝Ｏ基のＵＶ検出から考えて、唯一の可 能性としてオキシインドール核の可能性を提供することになる。なお、５の位置 におけるＯＨ基の存在にも留意されたい。これらの分析は、このマーカーを表す 目的で硫酸化された構造（図(ａ)）及び硫酸塩除去された構造（図(ｂ)）へと我 々を導くことになる。２） マーカーの定量例 尿中のマーカーの定量を実施するべく、複数の方法を利用することが可能であ る。上述の循環電気電流滴定法は、定量を実施することを可能にするこれらの方 法の１つである。マーカーは、その硫酸化された天然の形態で、又は硫酸塩除去 後に定量することができる。この硫酸塩除去は、酸性加水分解により前述のとお り達成することができる。 このマーカーの数量化を行うことができるようにするためには、基準生成物を 用いて校正を実施する必要がある。したがって我々は、A．H．Beckett，R．Dais ley及びJ．Walkerにより記述されたプロトコル（Tetrahedron，1968，第24巻，p 6093〜6109）に従って、オキシインドール形態（図ｂ）を合成した。５位におけ るオキシインドールのスルホ接合は、R．Sekura，M．Duffel，W．Jakoby(Method s in Enzymology，Jakoby W，ed.，Academic Press，New York，1981，第77巻， p197〜206)に従ってラットの肝臓又は人間の血小板から精製されたＭタイプのス ルホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．２．１）を用いる酵素反応を利用して得 られた。スルホ接合プロトコルは、５−プレグネン−３−オール−２０−オン（ ＰＲＥＧ）の硫酸化のためにH．Soliman，P．Boudou，J.M．Vilette及びJ．Fiet (J．Steroid Biochem．Molec．Biol.，1993，第46巻，p631〜634)によって記述 されたプロト コルである。このプロトコルにより、オキシインドールでＰＲＥＧを置換するこ とによって、必要とあらば硫黄により放射性標識付けされた硫酸化を達成するこ とが可能である。 酵素による合成及び硫酸化によって得られた２つの形態(図ａ及びｂ)は、２つ の形態の天然化合物から得られるものに重ねることのできるボルトアンペアグラ ム１を提供する(図１２及び１３)。 天然形態又は硫酸塩除去形態の定量のために、複数のクロマトグラフィー技術 を利用することが可能である。 網羅的な列挙とはならないが、逆相高性能クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（ 例えばカラム１８）又はイオン交換クロマトグラフィー（マーカーの精製のため に上述したもののようなもの）又は毛細管電気泳動といった技術を利用すること ができる。 マーカーの検出は、ＵＶによる吸収、螢光、電気化学、質量分析法など、及び 対応するピークの面積分及びマーカーの既知の用量で得られた２つのピークのも のとの比較による数量化に基づくものであってよい。 定量を実施するもう１つの方法は、抗体による認識を用いた技術の利用である 。ポリ又はモノクローナル抗体の獲得及び定量は、例えば、Clin．Chem．1993， 第39巻，p2322〜2325内でShang−Mian Yie．Erika Johansson et Gregory Brown によりメラトニンの定量について記述された当業者向けの従来のプロトコルに従 って行われる。定量は、例えば、放射能の測定又は酵素又は比色定量反応などの 測定を用いて実現される。 この定量のために日常的に利用されるプロトコルは、J．Chromatography，199 1，第164巻，441〜445中のMills M．II.，Filay D.C.，Haddad P.R.の報告及びV an Haarel A.，及びPavel S.，J．Chromatography，1988，第429巻，59-94に従 った、Ｃ１８上のＨＰＬＣのプロトコルであった。 尿の標本については、１mlを採取しこれに９１のエタノール／アセトン溶液（ ５０／５０）を添加する。混合物を１０分間低速（１，０００ＲＰＭ）で遠心分 離させ、１００μｌの上清の標本を凍結乾燥させ、１mMのＨＣｌ １００ml中に 再度溶解させる。この体積をＨＰＬＣカラム上に注入する。 血液中の定量については、プロトコルは以下のとおりである。１体積の血漿（ ２００μ）を３体積のエタノール／アセトン（５０／５０）溶液に混合する。混 合物を３０分間４℃に保ち、次に４℃で１０分間１,０００rpmで遠心分離する。 １００μｌの上清の標本を凍結乾燥させ、１００μｌの１mMのＨＣｌ中に再度溶 解させる。この体積をＨＰＬＣカラム上に注入する。 頭脊柱液内の定量については、１００μｌの標本をＨＰＬＣ上に直接注入する 。pH１を達成するため、酸性溶液により予め標本を処理することが望ましいこと もある。 図面の説明 図１ 以下のものに由来する尿標本の分離プロフィール −Iａ：健康な雌羊 −Iｃ：海綿状脳症を患う雌牛 −１ｄ：健康な高齢者 −１ｅ：アルツハイマータイプの老人性痴呆を患う人間。 塩酸によりpH１に酸性化された１mlの尿の標本を、循環走査式電流通電による 酸化還元反応に付す。 水素の標準電極との関係において測定された酸化還元電位が横座標に（m Volt s単位）で記されている。縦座標では、電流の強さはミリアンペア単位で測定さ れている。 循環皮相電力計測定法は、白金製電極、水素電極及び黒鉛粉末ベースの作業電 極という３つの電極をもつシステムである。 矢印により示された８５０mVでのマーカーの特徴的ピークを指摘することがで きる。 図２ 一体積の酢酸による尿の処理、遠心分離及び水相回収の後の、痒疹を患う羊の 尿の電気ボルトアンペアグラム。 矢印により示された８５０mVでのマーカーの特徴的ピーク指摘することができ る。図３ 酢酸エチルでの抽出及び膜透析の後の尿標本の電気ボルトアンペアグラム。 矢印により示された８５０mVでのマーカーの特徴的ピークを指摘することがで きる。 図４ ＮａＣｌ勾配（０及び１M）によるカラムの溶離分画Ｎ°７０に対応する陰イ オンカラム（ポリエチレンイミン）による精製後の尿標本の電気ボルトアンペア グラム。 図５ ＮａＣｌ勾配（０及び１M）によるカラムの溶離分画Ｎ°９５に対応する陰イ オンカラム（ポリエチレンイミン）による精製後の尿標本の電気ボルトアンペア グラム。 図６ ＰＥＩカラムの分画ｎ°７０及び９５の間に含まれた回収されまとめられた分 画のＵＶスペクトル。横座標は波長（nm）であり、縦座標は光学密度である。 ２４９nmの主要ピーク（矢印）は、Ｃ＝Ｏ基に対応する２８６.１nmにおける ピークである。 これらすべてのボルトアンペアグラム上には、海綿状及びアルツハイマー病に 対応する、図１ｂ、１ｃ、１ｅ中のはっきり異なる８５０ミリボルトの還元ピー ク（矢印により示されているグラフの下部部分）の存在がわかる。 図７ 図６と同じ。標本８８は、８０℃で約２時間ＨＣｌにより加水分解された。 ２４９nmでのピークがここでは２５４.６nmにあることを指摘することができ る。 図８ 生成物（カラムＰＥ１の分画質８８）のボルトアンペアグラム。２回目の走査 での８５０mVの酸化ピーク（グラフの上部部分）に留意されたい。 図９ 酸性加水分解の後の陰イオンDionexカラム上の尿マーカーのイオンクロマト グラフィー。横座標は、伝導率測定値を表す。保持時間は、縦座標に示されてい る。 硫酸塩の校正保持時間に硫酸塩ピークが、そしてマーカーの加水分解用として のＨＣｌの利用に関連して塩化物ピークが現われる。 図１０ セルロース平板上の薄層クロマトグラフィーによるマーカーの精製。 ＰＥＩのカラム上のクロマトグラフィーの後のマーカーが豊富になった分画化 に対応する標本は、セルロース上の薄層クロマトグラフィーにより分離される。 矢印により示されたゾーンはマーカーに対応する。このゾーンは平板から採取 され、マーカーは水中のセルロースゲル上で溶離され、遠心分離に付され、皮相 電力計分析法に付される。 図１１ 還元された形でのマーカーの質量スペクトル。 質量スペクトルは２つの技術により測定された。すなわち電子衝撃（図１１ａ ）とアンモニアによる化学的イオン化（図１１ｂ）である。 図１１ａ上ではマーカーの分子質量に対応する１４９の質量で主要ピークが現 われ、小さいピークは、汚染物質又は分解物質に対応する。アンモニアでの化学 的イオン化の後のスペクトルは、水素の質量だけ増加したマーカーの質量に対応 する１５０の質量の１つのピーク、そして１８（ＮＨ₄の質量）だけ増加したマ ーカーの質量に対応する１６７での第２のピークを出現される。 図１２ 陽子のＮＭＲスペクトル。 横座標では、１０ppmを超えたところでのＮＨ基の存在を示すppmが記され、７ .５５〜６.９５のゾーンが拡大されてこの図の下部部分に表されている。これに より、陽子が７、６、４という位置にあること、そして５位がヒドロキシルによ り占有されていることがわかる。この解釈は、ピークＨａ、Ｈｂ、ＨＣｌの積分 の結果得られるものである。 図１３ａ及び１３ｂ オキシインドール形態の合成生成物の電気ボルトアンペアグラム。８５０mV （及び破線で表された２回目の走査において酸化で９６０mV）でのピークを指摘 することができる。 酵素法により硫化されたオキシインドール合成生成物の電気ボルトアンペアグ ラム。 硫酸塩の特徴である１回目の走査における還元で８５０mVのピークそして酸化 での１,１００mVのピークを指摘することができる。 図２、３、４及び５でも観察された，２回目の走査（破線）における９６０mV での酸化ピーク。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 トルペル，ミッシェル フランス国、エフ―77950 メンシ、アン パス・デュ・クロ・ドウ・ラ・ゴブレッ ト、９ (72)発明者 バニスィ，クレール フランス国、エフ―75011 パリ、リュ・ グエノ、８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．インドール又はオキシインドール核を含む誘導体、より特定的には、次の一 般構造式（Ｉ）: 式中、 − Ｒ₁は、水素原子又は硫酸塩基ＳＯ₃ ^-又はＲ_a基を表し、Ｒ_aは共役基(炭水 化物又はグルシドといったもの)、特にグルクロニド、グルコース、デオキシリ ボース又はフルクトースを表し、 − Ｒ₂は、水素原子又は上で定義づけたようなＲ_a基を表し、 − ｎ₁、ｎ₂及びｎ₃は、互いに独立して、ゼロ又は１を表す、 を満たす誘導体の中から選ばれた少なくとも１つの誘導体であって、しかも、以 下の３つの互変異性体形態、すなわち １）− 還元された形が、次の構造式（Ｉａ１）: （式中、Ｒ₁及びＲ₂は、上述のものと同じ意味を有する）の誘導体に対応し、 − 酸化された形が、次の構造式（Ｉａ２）: （式中、Ｒ₁は、上述のものと同じ意味を有する）の誘導体に対応する、構造式 （Ｉａ）の形態、 ２）− 還元された形が、次の構造式（Ｉｂ１）: （式中、Ｒ₁は、上述の意味を有する）の誘導体に対応し、 − 酸化された形が、次の構造式（Ｉｂ２）: の誘導体に対応する、 構造式（Ｉｂ）の形態、 ３）− 還元された形が、次の構造式（Ｉｃ１）: （式中、Ｒ₁及びＲ₂は、上述の意味を有する）の誘導体に対応し、 − 酸化された形が、次の構造式（Ｉｃ２）: （式中、Ｒ₂、上述のものと同じ意味を有する）の誘導体に対応する、 構造式（Ｉｃ）の形態、 に対応する誘導体の、検出又は定量方法の、 人間又は動物の神経退行変性病理、特に中枢神経系の退行変性疾患、より特定 的には人間の退行変性性痴呆症又は人間及び動物の脳障害のin vitro診断方法の 実施を目的とする利用。 ２．人間又は動物の神経退行変性病理、特に、中枢神経系の退行変性疾患、より 特定的には人間の退行変性性痴呆症又は人間もしくは動物の脳障害のin vitro診 断方法であって、 インドール又はオキシインドール核を含む少なくとも１つの誘導体、より特定 的には、次の一般構造式（Ｉ）: 式中、 − Ｒ₁は、水素原子又は硫酸塩基ＳＯ₃ ^-又はＲ_a基を表し、Ｒ_aは共役基(炭水 化物又はグルシドといったもの)、特にグルクロニド、グルコース、デオキシリ ボース又はフルクトースを表し、 − Ｒ₂は、水素原子又は上で定義づけたようなＲ_a基を表し、 − ｎ₁、ｎ₂及びｎ₃は、互いに独立して、ゼロ又は１を表す、 を満たす化合物の中から選ばれた少なくとも１つの化合物であって、しかも、以 下の３つの互変異性体形態、すなわち １）− 還元された形が、次の構造式（Ｉａ１）: （式中、Ｒ₁及びＲ₂は、上述のものと同じ意味を有する）の誘導体に対応し、 − 酸化された形が、次の構造式（Ｉａ２）: （式中、Ｒ₁は、上述のものと同じ意味を有する）の誘導体に対応する、構造式 （Ｉａ）の形態、 ２）− 還元された形が、次の構造式（Ｉｂ１）: （式中、Ｒ₁は、上述の意味を有する）の誘導体に対応し、 − 酸化された形が、、次の構造式（Ｉｂ２）: の誘導体に対応する、構造式（Ｉｂ）の形態、 ３）− 還元された形が、次の構造式（Ｉｃ１）: （式中、Ｒ₁及びＲ₂は、上述の意味を有する）の誘導体に対応し、 − 酸化された形が、次の構造式（Ｉｃ２）: （式中、Ｒ₂は、上述のものと同じ意味を有する）の誘導体に対応する、構造式 （Ｉｃ）の形態、 に対応する誘導体の存在を、適切な人間又は動物の生物学的標本の中で検出ひい ては定量する工程を含んでなることを特徴とする方法。 ３．検出できる病理が、人間におけるアルツハイマータイプの痴呆、人間におけ る混合型痴呆、人間におけるピック病、人間の海綿状脳症、特にクロイツフェル ト・ヤコブ病、動物の海綿状脳症、特に、ヒツジの痒疹及びウシの海綿状脳症（ Ｅ.Ｓ.Ｂ）であることを特徴とする請求項２に記載の診断方法。 ４．生物学的標本が尿、血液又は頭脊柱液（ＬＣＲ）であることを特徴とする請 求項２又は３に記載の診断方法。 ５．検出すべき構造式（Ｉ）の少なくとも１つの誘導体を生物学的標本のその他 の構成成分から物理的又は生物学的に分離し、場合によって特にＨＰＬＣにより 誘導体を直接同定する工程、 − 場合によっては、特に標識づけされた単数（又は複数の）試薬を用いて、 この生物学的標本中に前記誘導体が存在する場合にそれを検出する工程、 を含んでなることを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載の診断方法。 ６．− 上述の構造式（Ｉ）の少なくとも１つの誘導体に対して向けられ固体支 持体上に固定された抗体が存在する状態に生物学的標本を置き、かくしてこの生 物学的標本の中に存在する可能性のある前記誘導体と前記抗体の間の複合体を獲 得する工程； − 適切な溶液で固体支持体を洗浄する工程； − 上述の複合体を特定的に認識することのできる標識づけされた試薬、特に 、前記複合体を認識する標識づけされた抗免疫グロブリンを固体支持体上に添加 する工程； − 固体支持体を洗浄する工程、 − 固体支持体上に標識付けされた試薬が存在する場合それを検出する工程、 を含んでなることを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項に記載の診断方法。 ７．請求項２〜６のいずれか１項に記載のin vitro診断方法の実施の枠内で利用 することのできるポリクローナル又はモノクローナル抗体において、次の一般構 造式（Ｉ）を満たす化合物のうちの少なくとも１つに対し向けられており、 式中、 − Ｒ₁は、水素原子又は硫酸塩基ＳＯ₃ ^-又はＲ_a基を表し、Ｒ_aは共役基(炭 水化物又はグルシドといったもの)、特にグルクロニド、グルコース、デオキシ リボース又はフルクトースを表し、 − Ｒ₂は、水素原子又は上で定義づけたようなＲ_a基を表し、 − ｎ₁、ｎ₂及びｎ₃は、互いに独立して、ゼロ又は１を表し、 しかも、前記誘導体が以下の３つの互変異性体形態、すなわち、 １）− 還元された形が、次の構造式（Ｉａ１）: （式中、Ｒ₁及びＲ₂は、上述のものと同じ意味を有する）の誘導体に対応し、 − 酸化された形が、次の構造式（Ｉａ２）: （式中、Ｒ₁は、上述のものと同じ意味を有する）の誘導体に対応する、構造式 （Ｉａ）の形態、 ２）− 還元された形が、次の構造式（Ｉｂ１）: （式中、Ｒ₁は、上述の意味を有する）の誘導体に対応し、 − 酸化された形が、次の構造式（Ｉｂ２）の誘導体に対応する、 構造式（Ｉｂ）の形態、 ３）− 還元された形が、次の構造式（Ｉｃ１）: （式中、Ｒ₁及びＲ₂は、上述の意味を有する）の誘導体に対応し、 − 酸化された形が、次の構造式（Ｉｃ２）: （式中、Ｒ₂は、上述のものと同じ意味を有する）の誘導体に対応する、 構造式（Ｉｃ）の形態、 に対応する、ポリクローナル又はモノクローナル抗体。 ８．請求項２〜６のいずれか１項に記載の診断方法の実施のためのキットにおい て、 − 構造式（Ｉ）の誘導体の少なくとも１つに対して導かれた請求項７に記載 のとおりの抗体であって、特に滴定プレートのウェルの中で固体支持体上に有利 にも固定されている抗体、 − 場合によっては、 ・ 前記抗体と、分析対象の生物学的標本中に存在する可能性のある構造式 （Ｉ）の単数又は複数の誘導体との間で免疫反応を樹立させるのに適した媒質、 ・ 固体支持体の洗浄用溶液 ・ 例えば放射線、酵素又は螢光によって、特に標識づけされた抗免疫グロ ブリンといった、構造式（Ｉ）の前記誘導体と前記抗体との間に場合によって形 成される複合体の検出のための適切な試薬を含んでなることを特徴とするキット 。