FR2751412A1 - Methodes de diagnostic in vitro de maladies neurodegeneratives et trousses pour la mise en oeuvre de ces methodes - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour objet l'utilisation de tout procédé de détection, et le cas échéant de dosage, de dérivés comportant un noyau indole ou oxindole, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de pathologies neurodégénératives humaines ou animales. L'invention concerne également les méthodes de diagnostic in vitro susmentionnées, ainsi que les trousses pour la mise en oeuvre de telles méthodes.
Description
METHODES DE DIAGNOSTIC IN VITRO DE MALADIES NEURODEGENERATIVES ET TROUSSES POUR LA MISE EN
OEUVRE DE CES METHODES.
OEUVRE DE CES METHODES.
La présente invention a pour objet de nouvelles méthodes de diagnostic in vitro de maladies neurodégénératives humaines ou animales, ainsi que des trousses (ou kits) pour la mise en oeuvre de ces méthodes.
A partir de 1988, une technique de voltamétrie cyclique a permis de mettre en évidence sur les voltamogrammes urinaires obtenus, un pic (à 850 mV) commun aux démences dégénératives humaines (démence de type
Alzheimer, démence mixte et maladie de Pick) et aux encéphalopathies spongiformes humaines (maladie de Creutzfeldt-Jakob) et animales (tremblante du mouton ou scrapie et encéphalopathie spongiforme bovine).
Alzheimer, démence mixte et maladie de Pick) et aux encéphalopathies spongiformes humaines (maladie de Creutzfeldt-Jakob) et animales (tremblante du mouton ou scrapie et encéphalopathie spongiforme bovine).
Les études réalisées par les inventeurs chez l'homme ont porté sur 88 sujets âgés répartis en cinq groupes : témoins non déments (n = 38), démences de type Alzheimer (n = 30), démences d'origine vasculaire (n = 13), démences mixtes (n= 5), Creutzfeldt-Jakob (n=2). Le pic est retrouvé dans les urines de certains sujets déments de type Alzheimer (12 cas positifs, 5 cas "douteux", 13 cas négatifs) et déments mixtes (1 cas positif, 2 cas "douteux", 2 cas négatifs) et dans les deux cas de Creutzfeldt-Jakob. Le pic n' a jamais été mis en évidence dans les urines provenant de sujets atteints de démence de type vasculaire pure (13 cas négatifs). I1 a en revanche été retrouvé dans les urines d'un des 38 sujets non déments (1 cas positif, 37 cas négatifs). Le suivi au cours du temps de certains sujets au teints de démence de type Alzheimer a permis de montrer que l'expression de ce pic est soumise à de fortes variations si bien que ce pic n'est pas détectable en permanence Jans les urines des sujets malades. Le pourcentage de cas dépistés à partir d'une analyse unique n'est donc que de 40% (12 cas/30) pour les sujets atteints de démence de type Alzheimer, (Banissi-Sabourdy C. et ai. - Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 1992, 28 127 - 147).
Les études réalisées par les inventeurs ehez les ruminants ont porté sur 35 moutons (16 atteints de scrapie et 19 sains) et 110 vaches atteintes d'encéphalopathie spongiforme (ESB), chacun des diagnostics ayant été ultérieurement confirmé par anatomopathologie. Le pic a été retrouvé dans les urines de 87% (14 cas positifs/16) des moutons à tremblante et de 95% (104 cas positifs/110) des vaches atteintes d'ESB. Le pic n'a jamais été retrouvé dans les urines des animaux témoins (19 cas négatifs/19 moutons sains, 12 cas négatifs/12 vaches saines). (Brugère H. et al. - Bull. Acad. Vét. de France, 1991, 64 : 139 - 145 ; Brugère H. et al. - Commission of the European
Communities, Brussels, 14-15 Sept. 1993).
Communities, Brussels, 14-15 Sept. 1993).
Il peut être conclu des travaux suivants que l'utilisation de la voltampérométrie cyclique permet de dépister à partir d'une analyse unique 81 % et 85% des cas d'encéphalopathie spongiforme déclarée, (c'est-à-dire dont le diagnostic peut être effectué par les signes cliniques), respectivement chez le mouton et la vache. La différence entre ces deux pourcentages n'est pas significative (p > 0,8). I1 s'agit en effet dans les deux cas de maladies d'étiologies similaires, évoluant toutes deux dans des délais comparables, en général de l'ordre de 1 à 6 mois.
Les études réalisées chez l'homme ont montré qu'une analyse unique de l'urine par voltampérométrie cyclique ne permettait de dépister que 40% des cas de démence déclarée de type Alzheimer. Ce pourcentage est très significativement différent (p < 0,005) de celui observé chez les ruminants atteints d'encéphalopathies spongiformes. En effet, nous comparons alors deux maladies d'étiologies différentes, évoluant dans des délais également différents (quelques mois pour les encéphalopathies spongiformes des ruminants contre plusieurs années pour la démence de type Alzheimer).
La présente invention a pour but de fournir des méthodes fiables de diagnostic in vitro des maladies neurodégénératives humaines ou animales.
L'invention a plus précisément pour but de fournir des méthodes de diagnostic in vitro, permettant de confirmer qu'un homme ou un animal est atteint ou non d'une maladie neurodégénérative déclarée, notamment dans le cas où les signes cliniques relevés chez cet homme ou cet animal peuvent laisser subsister un doute quant au diagnostic de cette maladie.
Un autre but de la présente invention est de fournir des méthodes de diagnostic in vitro permettant de déceler qu'un homme ou un animal est atteint ou non d'une maladie neurodégénérative qui n'est pas encore déclarée, c'est-àdire dont les signes cliniques ne sont pas encore apparents.
Un autre but de la présente invention est de fournir des méthodes de diagnostic in vitro permettant de distinguer sans ambiguïté au sein d'un troupeau d'animaux, ceux des animaux atteints d'une maladie neurodégénérative (notamment d'une encéphalopathie spongiforme) déclarée ou non, de ceux n'étant pas atteints par une telle maladie, seuls ces derniers étant alors susceptibles d'être dirigés vers un abattoir pour l'obtention de viandes destinées à l'alimentation.
Un autre but de la présente invention est de fournir des trousses (ou kits) pour la mise en oeuvre de ces méthodes de diagnostic in vitro.
La présente invention découle de la découverte faite par les inventeurs, que le pic susmentionné, apparaissant sur les voltamogrammes mesurés à partir d'urines d'hommes ou d'animaux atteints de maladies neurodégénératives déclarées, correspond à la présence dans ces urines, d'un marqueur correspondant à un dérivé comportant un noyau indole ou oxindole, et plus particulièrement à un dérivé répondant à la formule générale (I) indiquée ciaprès.
L'invention sera illustrée à l'aide des figures suivantes
- figure 1 : profil de séparation d'échantillons par voltampérométrie cyclique d'urine provenant de brebis saines (figure la), de brebis atteintes de tremblante (figure lb), de vaches atteintes de 1'ESB (figure 1 c), d'humains âgés sains (figure nid), et d'humains atteints de démence sénile de type Alzheimer (figure le),
- figures 2 à 4, 8 et 13 (a et b) : suivi par électro-voltampérogramme de l'extraction et de la purification du marqueur susmentionné à partir d'urine de mouton atteint de tremblante,
- figures 6 et 7 : spectres UV du marqueur susmentionné,
- figure 9 : chromatographie ionique du marqueur susmentionné,
- figure 10 : chromatographie couche mince sur plaque de cellulose du marqueur susmentionné,
- figure 1 1 : spectre de masse du marqueur susmentionné,
- figure 12: spectre de RMN de protons du marqueur susmentionné.
- figure 1 : profil de séparation d'échantillons par voltampérométrie cyclique d'urine provenant de brebis saines (figure la), de brebis atteintes de tremblante (figure lb), de vaches atteintes de 1'ESB (figure 1 c), d'humains âgés sains (figure nid), et d'humains atteints de démence sénile de type Alzheimer (figure le),
- figures 2 à 4, 8 et 13 (a et b) : suivi par électro-voltampérogramme de l'extraction et de la purification du marqueur susmentionné à partir d'urine de mouton atteint de tremblante,
- figures 6 et 7 : spectres UV du marqueur susmentionné,
- figure 9 : chromatographie ionique du marqueur susmentionné,
- figure 10 : chromatographie couche mince sur plaque de cellulose du marqueur susmentionné,
- figure 1 1 : spectre de masse du marqueur susmentionné,
- figure 12: spectre de RMN de protons du marqueur susmentionné.
L'invention a pour objet l'utilisation de tout procédé de détection, et le cas échéant de dosage, de dérivés comportant un noyau indole ou oxindole, et plus particulièrement d'au moins un dérivé parmi ceux répondant à la formule générale (I) suivante
dans laquelle
- R1 représente un groupe hydroxyle OH, ou un hémiester de l'acide sulfurique (encore désigné groupe sulfate OS03-), ou un groupe ORa, Ra représentant un groupe conjugué (tel qu'un groupe carbohydrate ou glucidique), notamment un glucuronide, un glucose, un désoxyribose, ou un fructose,
- R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe Ra tel que défini cidessus,
- nl et n2, indépendamment l'un de l'autre, représentent zéro ou un, avec
* lorsque nl = 0, alors n2 = 1 et l'azote de l'hétérocycle (N1) de la formule (I) est lié par une double liaison au carbone en position 2, selon la formule (Ia) suivante
- R1 représente un groupe hydroxyle OH, ou un hémiester de l'acide sulfurique (encore désigné groupe sulfate OS03-), ou un groupe ORa, Ra représentant un groupe conjugué (tel qu'un groupe carbohydrate ou glucidique), notamment un glucuronide, un glucose, un désoxyribose, ou un fructose,
- R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe Ra tel que défini cidessus,
- nl et n2, indépendamment l'un de l'autre, représentent zéro ou un, avec
* lorsque nl = 0, alors n2 = 1 et l'azote de l'hétérocycle (N1) de la formule (I) est lié par une double liaison au carbone en position 2, selon la formule (Ia) suivante
dans laquelle R1 et R2 sont tels que définis ci-dessus,
* lorsque nl = 1 ,alors
soit n2 = o, et l'oxygène porté par l'hétérocycle de la formule (I) est lié par une double liaison au carbone en position 2, selon la formule (Ib) suivante
* lorsque nl = 1 ,alors
soit n2 = o, et l'oxygène porté par l'hétérocycle de la formule (I) est lié par une double liaison au carbone en position 2, selon la formule (Ib) suivante
dans laquelle R1 est tel que défini ci-dessus,
soit n2 = 1, et les carbones en position 2 et 3 de 1 'hétérocycle de la formule (I) sont reliés par une double liaison, selon la formule (Ic) suivante
soit n2 = 1, et les carbones en position 2 et 3 de 1 'hétérocycle de la formule (I) sont reliés par une double liaison, selon la formule (Ic) suivante
dans laquelle R1 et R2 sont tels que définis ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de pathologies neurodégénératives humaines ou animales, notamment des maladies dégénératives du système nerveux central, et plus particulièrement les démences dégénératives humaines, ou les encéphalopathies humaines et animales.
Il est bien entendu que les pointillés représentés sur la formule générale (I) susmentionnée indiquent la présence possible de double liaisons entre l'atome d'azote N1 de l'hétérocycle et l'atome de carbone en position 2, ou entre 1' atome d'oxygène situé sur l'hétérocycle et l'atome de carbone en position 2, ou entre les atomes de carbone en position 2 et 3, selon respectivement les formules Ia, Ib et Ic susmentionnées.
L'invention a également pour objet toute méthode de diagnostic in vitro de maladies neurodégénératives telles que définies ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de détection, et le cas échéant de dosage, dans un échantillon biologique humain ou animal approprié d'au moins un dérivé comportant un noyau indole ou oxindole, et plus particulièrement d'au moins un dérivé parmi ceux répondant à la formule générale (I) susmentionnée.
L'invention a plus particulièrement pour objet, l'application des méthodes susmentionnées au diagnostic in vitro des pathologies suivantes : démence de type Alzheimer chez l'homme, démence mixte chez l'homme, maladie de Pick chez l'homme, encéphalopathies spongiformes humaines, notant maladie de
Creutzfeldt-Jakob, encéphalopathies spongiformes animales, notamment tremblante (ou scrapie) du mouton et encéphalopathie spongiforme bovine (E.S.B.)
L'invention vise plus particulièrement l'application des méthodes susmentionnées au diagnostic in vitro des maladies neurodégénératives définies ci-dessus dont les signes cliniques sont déjà apparents chez l'homme ou 1' animal, ces méthodes permettant notamment de suivre l'évolution de la maladie.
Creutzfeldt-Jakob, encéphalopathies spongiformes animales, notamment tremblante (ou scrapie) du mouton et encéphalopathie spongiforme bovine (E.S.B.)
L'invention vise plus particulièrement l'application des méthodes susmentionnées au diagnostic in vitro des maladies neurodégénératives définies ci-dessus dont les signes cliniques sont déjà apparents chez l'homme ou 1' animal, ces méthodes permettant notamment de suivre l'évolution de la maladie.
Avantageusement, les méthodes de diagnostic de l'invention permettent le dépistage de ces maladies neurodégénératives chez des porteurs apparemment sains, chez lesquels les signes cliniques caractéristiques de ces maladies ne sont pas encore apparents.
L'échantillon biologique utilisé dans le cadre de la mise en oeuvre des méthodes de diagnostic de l'invention, est de préférence l'urine, ou le sang, ou autres liquides biologiques, tels que le liquide céphalo-rachidien (LCR).
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les méthodes de diagnostic susmentionnées comprennent
- une étape de séparation, physique ou biologique d'au moins un dérivé de formule (I) à détecter, des autres constituants de l'échantillon biologique, et le cas échéant, d'identification directe du dérivé, notamment par HPLC,
- le cas échéant, une étape de détection de la présence éventuelle dudit dérivé dans cet échantillon biologique, notamment à l'aide d'un (ou plusieurs) réactif(s) marqué(s).
- une étape de séparation, physique ou biologique d'au moins un dérivé de formule (I) à détecter, des autres constituants de l'échantillon biologique, et le cas échéant, d'identification directe du dérivé, notamment par HPLC,
- le cas échéant, une étape de détection de la présence éventuelle dudit dérivé dans cet échantillon biologique, notamment à l'aide d'un (ou plusieurs) réactif(s) marqué(s).
Une méthode de diagnostic telle que décrite ci-dessus par séparation physique et identification directe dudit dérivé, particulièrement préférée est celle effectuée par mise en oeuvre d'un procédé HPLC couplé à une détection par fluorescence. Un tel procédé peut être effectué notamment selon la méthode décrite par Volicer et al. dans le cadre de la détection des formes anormales de 5-hydroxytryptophane et de sérotonine dans le LCR (Volicer et al., Arch.
Neurol., 1985, vol. 42, 1158-1161).
Selon un autre mode particulièrement avantageux de réalisation de l'invention, les méthodes de diagnostic susmentionnées comprennent une étape de séparation par voie biologique des dérivés de formules (I) susceptibles d'être présents dans l'échantillon biologique, des autres constituants de cet échantillon biologique, notamment à l'aide d'anticorps dirigés contre ces dérivés de formule (1).
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet toute méthode de diagnostic in vitro telle que décrite ci-dessus, et comprenant les étapes suivantes
- mise en présence de l'échantillon biologique avec des anticorps, dirigés contre au moins un dérivé de formule (I) susmentionnée, lesdits anticorps étant fixés sur un support solide, ce qui conduit à l'obtention de complexes entre lesdits anticorps et lesdits dérivés susceptibles d'être présents dans l'échantillon biologique,
- rinçage du support solide avec une solution appropriée,
- addition sur le support solide d'un réactif marqué susceptible de reconnaître spécifiquement les complexes susmentionnés, notamment des antiimmunoglobulines marquées, reconnaissant lesdits complexes,
- rinçage du support solide,
- détection de la présence éventuelle du réactif marqué sur le support solide.
- mise en présence de l'échantillon biologique avec des anticorps, dirigés contre au moins un dérivé de formule (I) susmentionnée, lesdits anticorps étant fixés sur un support solide, ce qui conduit à l'obtention de complexes entre lesdits anticorps et lesdits dérivés susceptibles d'être présents dans l'échantillon biologique,
- rinçage du support solide avec une solution appropriée,
- addition sur le support solide d'un réactif marqué susceptible de reconnaître spécifiquement les complexes susmentionnés, notamment des antiimmunoglobulines marquées, reconnaissant lesdits complexes,
- rinçage du support solide,
- détection de la présence éventuelle du réactif marqué sur le support solide.
A titre d'illustration, les méthodes de diagnostic de l'invention sont avantageusement effectués selon la technique ELISA (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay) dans laquelle les anti-immunoglobulines utilisées pour révéler les complexes formés entre les anticorps fixés sur le support solide et les dérivés à détecter, sont marquées par couplage à une enzyme elle-même susceptible de réagir spécifiquement avec un substrat déterminé. Une telle méthode peut par exemple être effectuée selon le procédé décrit dans l'article de
Yie et al. - Clinical Chemistry, 1993, vol. 39, 2322-2325.
Immunosorbent Assay) dans laquelle les anti-immunoglobulines utilisées pour révéler les complexes formés entre les anticorps fixés sur le support solide et les dérivés à détecter, sont marquées par couplage à une enzyme elle-même susceptible de réagir spécifiquement avec un substrat déterminé. Une telle méthode peut par exemple être effectuée selon le procédé décrit dans l'article de
Yie et al. - Clinical Chemistry, 1993, vol. 39, 2322-2325.
L'invention a également pour objet les anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre au moins un dérivé de formule (I) susmentionnée.
L'invention a plus particulièrement pour objet les anticorps polyclonaux dirigés contre un ou plusieurs, voire la totalité, des dérivés de formule a) susmentionnée. De tels anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec un ou plusieurs, voire la totalité des dérivés de formule (I), suivie de la récupération des anticorps produits par le système immunitaire dudit animal.
L'invention concerne également les anticorps monoclonaux dirigés contre des dérivés de formule (I) susmentionnée, et tels que produits par tout hybridome susceptible d'être formé, par des méthodes classiques, à partir des cellules spléniques d'un animal, notamment de souris ou de rat, immunisés contre l'un des dérivés de formule (I) d'une part, et des cellules d'un myélome approprié d'autre part, et d'être sélectionné par sa capacité à produire des anticorps monoclonaux reconnaissant le dérivé de formule (I) susmentionné, initialement utilisé pour l'immunisation des animaux.
S'agissant des dérivés de formule (I) susmentionnée, utilisés pour l'obtention des anticorps décrits ci-dessus, ceux-ci pouvant être obtenus soit sous forme purifiée à partir d'un échantillon biologique approprié, notamment à partir de sang, d'urine ou de liquide céphalo-rachidien, prélevé chez un homme ou un animal atteint d'une maladie neurodégénérative, par exemple selon le procédé de purification décrit ci-après.
Ces dérivés de formule (I), et plus particulièrement ceux de formules (Ia), (Ib) ou (Ic) susmentionnées, dans lesquelles R1 représente OH, et R2 représente
H lorsque n2 = 1, peuvent également être obtenus par synthèse chimique, notamment selon la méthode décrite dans l'article de Yamaguchi et al.
Wakayama Med. Rept., 1971, vol. 15, 127-134, ou encore selon la méthode décrite dans l'article de Beckett A.H. et al. - Tetrahedron, 1968, vol. 24, 60936109.
H lorsque n2 = 1, peuvent également être obtenus par synthèse chimique, notamment selon la méthode décrite dans l'article de Yamaguchi et al.
Wakayama Med. Rept., 1971, vol. 15, 127-134, ou encore selon la méthode décrite dans l'article de Beckett A.H. et al. - Tetrahedron, 1968, vol. 24, 60936109.
La sulfoconjugaison des dérivés de formules (Ia), (Ib) ou (Ic) susmentionnées, dans lesquelles R1 représente OH, et R2 représente H lorsque n2 = 1, peut être obtenue en utilisant une réaction enzymatique à l'aide d'une sulfotransférase de type M (EC 2.8.2.1) purifiée à partir de foie de rat ou de plaquettes humaines selon R. Sekura, M.Duffel, W. Jakoby (Methods in
Enzymology, Jakoby W, ed., Academic Press , New York, 1981, volume 77, pages 197 à 206) et le protocole de sulfoconjugaison est celui décrit par H.
Enzymology, Jakoby W, ed., Academic Press , New York, 1981, volume 77, pages 197 à 206) et le protocole de sulfoconjugaison est celui décrit par H.
Soliman, P. Boudou, J.M. Vilette et J. Fiet (J.Steroid Biochem. Molec.Biol., 1993, vol 46, Pages 631 à 634) pour la sulfoconjugaison du 5-Pregnen-3-ol-20one (PREG). On obtient ainsi les dérivés susmentionnés dans lesquels R1 représente OSO3-.
S'agissant de la préparation des dérivés de formules (Ia), (Ib) ou (lc) susmentionnées, dans lesquelles R1 représente un groupe ORaX et/ou R2 représente un groupe Ra, Ra étant tel que défini ci-dessus, celle-ci peut être effectuée selon un protocole dérivé de ceux décrits dans les articles de
Yamaguchi et al., et de Beckett A.H. et al. susmentionnés, ou dans l'ouvrage suivant. Methods in Enzymology, Jakoby W, ed., Academic Press , New York, 1981, volume 77.
Yamaguchi et al., et de Beckett A.H. et al. susmentionnés, ou dans l'ouvrage suivant. Methods in Enzymology, Jakoby W, ed., Academic Press , New York, 1981, volume 77.
Les dérivés de formule (I) utilisés pour l'obtention des anticorps décrits cidessus, peuvent avantageusement être couplés à des molécules porteuses habituellement utilisées pour les haptènes, selon des techniques connues de l'homme du métier, notamment en position a ou c sur la formule (I), afin d'augmenter les propriétés immunogéniques desdits dérivés, et ainsi d'augmenter la production des anticorps.
L'invention a également pour objet toute méthode de diagnostic, in vitro de maladies neurodégénératives telles que définies ci-dessus, caractérisée en ce que la détection, voire le dosage, du ou des dérivés de formule (I) est effectuée sans séparation préalable dudit dérivé et des autres constituants de l'échantillon biologique, notamment par mise en oeuvre d'une réaction colorimétrique entre ledit dérivé et une molécule ou groupe de molécules réagissant spécifiquement avec ledit dérivé en entraînant l'apparition d'une coloration spécifique de cette réaction, celle coloration étant soit celle des produits issus de la réaction entre ledit dérivé et la molécule ou groupe de molécules susmentionnées, soit celle d'un substrat transformé par réaction avec l'un des produits de la réaction susmentionnée.
L'invention a également pour objet toute méthode de diagnostic telle que décrite ci-dessus, comprenant une étape préalable de traitement de l'échantillon biologique, notamment par hydrolyse acide, par exemple à l'aide d'acide chlorhydrique (pHI) pendant 2 heures à 80"C, afin de désulfater ceux des dérivés de formule (I) dans laquelle R1 représente OSO3- susceptibles d'être présents dans l'échantillon biologique, pour obtenir que des dérivés de formule (I) dans laquelle R1 représente OH dans ledit échantillon, cette étape étant suivie par une étape de détection, voire de dosage, des dérivés de formule (I) dans lesquelles R1 représente OH, notamment selon les techniques décrites ci-dessus.
L'invention a également pour objet les trousses (ou kits) pour la mise en oeuvre d'une des méthodes de diagnostic de l'invention.
Avantageusement les trousses de l'invention comprennent
- des anticorps tels que décrits ci-dessus, dirigés contre l'un ou moins des dérivés de formule (I), ces anticorps étant avantageusement fixés sur un support solide, notamment dans des puits de plaques de titration,
- le cas échéant:
un milieu propice à l'établissement d'une réaction immunologique entre lesdits anticorps, et le (ou les) dérivés de formule (I) susceptible(s) d'être présent(s ) dans l'échantillon biologique analysé,
une solution de rinçage du support solide,
des réactifs appropriés pour la détection des complexes éventuellement formés entre lesdits anticorps et lesdits dérivés de formule cri), notamment des anti-immunoglobulines marquées, par exemple de façon radioactive, enzymatique ou par fluorescence.
- des anticorps tels que décrits ci-dessus, dirigés contre l'un ou moins des dérivés de formule (I), ces anticorps étant avantageusement fixés sur un support solide, notamment dans des puits de plaques de titration,
- le cas échéant:
un milieu propice à l'établissement d'une réaction immunologique entre lesdits anticorps, et le (ou les) dérivés de formule (I) susceptible(s) d'être présent(s ) dans l'échantillon biologique analysé,
une solution de rinçage du support solide,
des réactifs appropriés pour la détection des complexes éventuellement formés entre lesdits anticorps et lesdits dérivés de formule cri), notamment des anti-immunoglobulines marquées, par exemple de façon radioactive, enzymatique ou par fluorescence.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de la purification et la caractérisation d'un marqueur potentiel de maladies dégénératives du système nerveux central.
Comme nous l'avons vu précédemment, ce marqueur excrété dans les urines est commun aux démences dégénératives humaines (démence de type
Alzheimer, démence mixte et maladie de Pick) et aux encéphalopathies spongiformes humaines (maladie de Creutzfeldt-Jakob) et animales (tremblante du mouton et encéphalopathie spongiforme bovine).
Alzheimer, démence mixte et maladie de Pick) et aux encéphalopathies spongiformes humaines (maladie de Creutzfeldt-Jakob) et animales (tremblante du mouton et encéphalopathie spongiforme bovine).
La présence de ce marqueur est mise en évidence directement sur des échantillons urinaires humains ou animaux par une technique de voltamétrie cyclique sur une électrode à poudre de graphite (figures la à le).
La purification du marqueur a été effectuée par des méthodes usuelles telles que . extraction, dialyse, chromatographie sur colonne échangeuse d'ions,..
La caractérisation du marqueur a été effectuée par des techniques analytiques classiques spectroscopie U.V., chromatographie ionique, spectrométrie de masse, RMN 1H.
Le marqueur est identifié par comparaison avec des molécules synthétisées comme étant un dérivé sulfaté de l'oxindole.
1) Purification du marqueur urinaire et caractérisation.
Ayant constaté que les ruminants atteints d 'encéphalopathies spongiformes excrétaient le marqueur à des concentrations relativement plus importantes que les sujets humains atteints de maladie d'Alzheimer, nous avons choisi d'utiliser l'urine de brebis atteintes de tremblante. Toutefois ce protocole s'applique aux urines quelqu'en soit l'origine.
Après acidification à pH = 1 de l'urine par HC1 aqueux, un tracé voltampérométrique est réalisé afin de vérifier la présence en quantité suffisante du marqueur.
1.1. Traitement par l'acétate d'éthyle
Après centrifugation, l'urine est soumise à plusieurs extractions par l'acétate d'éthyle afin d'éliminer le maximum de composés urinaires non chargés à ce pH (catécholamines, p-crésol, ...), le composé correspondant au marqueur n' étant apparemment pas soluble dans la plupart des solvants organiques classiques (éther, chloroforme, dichlorométhane, acétate d'éthyle, isopropanol, ...). Ainsi à un volume d'urine (20 ml) on additionne à température ambiante 20 ml d'acétate d'éthyle et on agite le mélange fortement dans une ampoule à décanter et l'on centrifuge à 10 000 tours minute pendant 10 minutes afin de séparer les phases. La phase d'acétate d'éthyle est éliminée et la même expérience est répétée 4 fois.
Après centrifugation, l'urine est soumise à plusieurs extractions par l'acétate d'éthyle afin d'éliminer le maximum de composés urinaires non chargés à ce pH (catécholamines, p-crésol, ...), le composé correspondant au marqueur n' étant apparemment pas soluble dans la plupart des solvants organiques classiques (éther, chloroforme, dichlorométhane, acétate d'éthyle, isopropanol, ...). Ainsi à un volume d'urine (20 ml) on additionne à température ambiante 20 ml d'acétate d'éthyle et on agite le mélange fortement dans une ampoule à décanter et l'on centrifuge à 10 000 tours minute pendant 10 minutes afin de séparer les phases. La phase d'acétate d'éthyle est éliminée et la même expérience est répétée 4 fois.
Après extraction des composés neutres, un nouveau contrôle électrochimique est effectué sur une aliquote de 1 ml de la phase aqueuse (figure 2).
1.2. Dialyse croisée
Le marqueur n'étant pas soluble dans la plupart des solvants organiques, même à pH = 1, les inventeurs en ont déduit qu'il s'agissait d'un produit très hydrophile, probablement chargé à ce pH. Les inventeurs ont donc tenté de l'extraire à partir des urines par des expériences de dialyse croisée réalisées à l'aide de membranes ioniques. Ils ont constaté que le marqueur ne traverse pas les membranes cationiques mais qu'il est au contraire retrouvé dans les dialysats lorsque l'expérience est réalisée à l'aide d'une membrane anionique. I1 s'agit donc d'une espèce chargée négativement, même en milieu très acide. Ils ont de plus observé que le dialysat se présente sous la forme d'un liquide pratiquement incolore et limpide, ce qui n' est évidemment pas le cas des urines de départ, si bien que toutes les expériences ultérieures ont été systématiquement réalisées après dialyse à travers une membrane anionique.
Le marqueur n'étant pas soluble dans la plupart des solvants organiques, même à pH = 1, les inventeurs en ont déduit qu'il s'agissait d'un produit très hydrophile, probablement chargé à ce pH. Les inventeurs ont donc tenté de l'extraire à partir des urines par des expériences de dialyse croisée réalisées à l'aide de membranes ioniques. Ils ont constaté que le marqueur ne traverse pas les membranes cationiques mais qu'il est au contraire retrouvé dans les dialysats lorsque l'expérience est réalisée à l'aide d'une membrane anionique. I1 s'agit donc d'une espèce chargée négativement, même en milieu très acide. Ils ont de plus observé que le dialysat se présente sous la forme d'un liquide pratiquement incolore et limpide, ce qui n' est évidemment pas le cas des urines de départ, si bien que toutes les expériences ultérieures ont été systématiquement réalisées après dialyse à travers une membrane anionique.
La dialyse est réalisée à partir de la phase aqueuse obtenue après extraction des composés neutres par l'acétate d'éthyle. La phase aqueuse est évaporée sous vide à l'aide d'un évaporateur à rotation à température inférieure à 40"C après que le pH ait été ramené à 5-6 par addition de soude afin d'éviter une dégradation du marqueur par hydrolyse acide. Le résidu est ensuite repris par HC1 10-3 N puis soumis à une dialyse croisée laquelle est effectuée à l'aide d'une membrane échangeuse d'anions conditionnée (marque RAI modèle R n" 1030) dans une cellule de dialyse en verre fabriquée spécialement. Le compartiment de concentration contient NaCl 1 M à pH = 3, ces conditions ayant été choisies afin d'optimiser les échanges transmembranaires. La dialyse est effectuée pendant 24 à 48 heures sous agitation magnétique en chambre froide à 4"C. Une aliquote du compartiment de concentration est prélevée afin de contrôler par voltampérométrie la présence du marqueur. Parallèlement, on réalise un spectre U.V. du mélange (figure 3).
1.3. Purification sur colonne échangeuse d'ions
Le dialysat est évaporé à sec sous vide, repris par de l'méthanol absolu, puis filtré afin d'éliminer les sels. Après évaporation de l'éthanol, le résidu est dissous dans un volume minimum d'HCl 10-3 N avant d'être injecté sur une colonne ouverte de Poly Ethylène Imine cellulose (PEI) échangeuse d'anions.
Le dialysat est évaporé à sec sous vide, repris par de l'méthanol absolu, puis filtré afin d'éliminer les sels. Après évaporation de l'éthanol, le résidu est dissous dans un volume minimum d'HCl 10-3 N avant d'être injecté sur une colonne ouverte de Poly Ethylène Imine cellulose (PEI) échangeuse d'anions.
Les différents constituants anioniques sont séparés en chambre froide par un gradient de NaCl. On obtient alors des fractions partiellement purifiées présentant en électrochimie les caractéristiques du marqueur. Nous avons utilisé une colonne de Poly Ethylène Imine de 15 cm de hauteur et 1 cm de diamètre.
L'échantillon contenant le marqueur est appliqué sur la colonne avec un débit de 1 ml/minute et l'élution obtenue et la position du marqueur sont présentés dans les figures 4 et 5.
Le volume d'élution est de 400 ml de NaCl et les fractions de 1 ml sont collectées et soumise à l'électrovoltampérométrie (Co = 4,5 x 10-2 M - C1 = 9,5 x 10-2 M).
1.4. Spectroscopie U.V.
Les spectres U.V. des fractions contenant le marqueur présentent un maximum d'absorption tel que Bmax = 249-250 nm (figures 6 et 7).
L'épaulement à 280 nm montre l'existence d'une liaison C = O.
1.5. Détection des ions sulfates
Le marqueur étant chargé négativement à pH = 1, les inventeurs ont supposé qu'il s'agissait d'un composé excrété dans les urines sous forme condensée à l'ion sulfate (dérivé "sulfo-conjugué"). Afin de tester cette hypothèse une petite quantité du produit purifié a été soumise à une hydrolyse acide à 80"C durant 2 heures (cette hydrolyse pouvant être obtenue par addition de HCl afin que le pH soit de 1). De meme, le spectre U.V. correspondant à l'échantillon hydrolysé diffère de celui obtenu avant hydrolyse (figure 7). Nous pouvons donc en déduire que le marqueur est sensible à l'hydrolyse acide. Un voltampérogramme de l'échantillon après hydrolyse a été réalisé et s'est révélé différent de celui du même échantillon avant hydrolyse. (figure 8). Les ions sulfates, phosphates, nitrates et chlorures ont été dosés dans les échantillons avant et après hydrolyse par chromatographie ionique sur une colonne DIONEX anionique ION/PAC AS4A-SC Analytical colonne (séparation isocratique détection par conductivité - éluent : 1,8 mM Na2CO3/1,7 mM NaHCO3 conductimétrique. L'analyse a révélé la présence de sulfates libres en quantité quatre fois plus importante dans l'échantillon hydrolysé que dans l'échantillon avant hydrolyse pris comme référence. Ce résultat confirme l'hypothèse selon laquelle le marqueur serait un dérivé éliminé dans les urines sous forme sulfoconjuguée (figure 9).
Le marqueur étant chargé négativement à pH = 1, les inventeurs ont supposé qu'il s'agissait d'un composé excrété dans les urines sous forme condensée à l'ion sulfate (dérivé "sulfo-conjugué"). Afin de tester cette hypothèse une petite quantité du produit purifié a été soumise à une hydrolyse acide à 80"C durant 2 heures (cette hydrolyse pouvant être obtenue par addition de HCl afin que le pH soit de 1). De meme, le spectre U.V. correspondant à l'échantillon hydrolysé diffère de celui obtenu avant hydrolyse (figure 7). Nous pouvons donc en déduire que le marqueur est sensible à l'hydrolyse acide. Un voltampérogramme de l'échantillon après hydrolyse a été réalisé et s'est révélé différent de celui du même échantillon avant hydrolyse. (figure 8). Les ions sulfates, phosphates, nitrates et chlorures ont été dosés dans les échantillons avant et après hydrolyse par chromatographie ionique sur une colonne DIONEX anionique ION/PAC AS4A-SC Analytical colonne (séparation isocratique détection par conductivité - éluent : 1,8 mM Na2CO3/1,7 mM NaHCO3 conductimétrique. L'analyse a révélé la présence de sulfates libres en quantité quatre fois plus importante dans l'échantillon hydrolysé que dans l'échantillon avant hydrolyse pris comme référence. Ce résultat confirme l'hypothèse selon laquelle le marqueur serait un dérivé éliminé dans les urines sous forme sulfoconjuguée (figure 9).
1.6. Purification par chromatographie en couche mince (CCM)
Les fractions contenant le marqueur sont évaporées à sec et reprises par un faible volume de HCl 10-3 N avant d'être déposées sur des plaques de cellulose pour chromatographie en couche mince (Fournisseur Merck). Le solvant de migration est un mélange butanol/acide acétiqueleau 8:2:2. Après migration, les différents produits séparés sont repérés sous lumière U.V. et détachés avec la couche adsorbante. Les produits liés à la cellulose sont repris par H20 et la cellulose est éliminée par centrifugation. Un contrôle électrochimique est ensuite effectué afin de localiser le marqueur. La purification par CCM est renouvelée afin d'obtenir un quantité suffisante de produit pour réaliser des analyses par
RMN et par spectroscopie de masse (figure 10).
Les fractions contenant le marqueur sont évaporées à sec et reprises par un faible volume de HCl 10-3 N avant d'être déposées sur des plaques de cellulose pour chromatographie en couche mince (Fournisseur Merck). Le solvant de migration est un mélange butanol/acide acétiqueleau 8:2:2. Après migration, les différents produits séparés sont repérés sous lumière U.V. et détachés avec la couche adsorbante. Les produits liés à la cellulose sont repris par H20 et la cellulose est éliminée par centrifugation. Un contrôle électrochimique est ensuite effectué afin de localiser le marqueur. La purification par CCM est renouvelée afin d'obtenir un quantité suffisante de produit pour réaliser des analyses par
RMN et par spectroscopie de masse (figure 10).
1.7. Analyses par spectrométrie de masse et RMN 1H
L'analyse par spectrométrie de masse (figure 11) (impact électronique et ionisation chimique) du marqueur purifié par CCM, indique qu'il s'agit d'un composé présentant une masse moléculaire (ou un fragment) égale à 149. C
L'analyse par spectrométrie de masse (figure 11) (impact électronique et ionisation chimique) du marqueur purifié par CCM, indique qu'il s'agit d'un composé présentant une masse moléculaire (ou un fragment) égale à 149. C
schéma (b)
2) Exemples de dosage du Marqueur.
2) Exemples de dosage du Marqueur.
Afin d'effectuer un dosage du marqueur dans les urines plusieurs méthodes peuvent être utilisées. L'électroampérométrie cyclique décrite ci dessus est une de ces méthodes qui permet d'effectuer un dosage quantitatif. Le marqueur peut être dosé sous sa forme naturelle sulfatée ou après désulfatation.
La désulfatation pouvant être obtenue comme précédemment par hydrolyse acide.
Afin de pouvoir effectuer une quantification de ce marqueur, il est nécessaire de réaliser un étalonnage à l'aide d'un produit de référence. Nous avons donc synthétisé la forme indole (schéma b) selon le protocole décrit par
A.H Beckett, R.Daisley et J.Walker (Tetrahedron,1968, volume 24,pages 6093 à 6109). La sulfoconjugaison de l'oxindole en position 5 a été obtenue en utilisant une réaction enzymatique à l'aide de sulfotransférase de type M (EC 2.8.2.1) purifié à partir de foie de rat ou de plaquettes humaine selon R.
A.H Beckett, R.Daisley et J.Walker (Tetrahedron,1968, volume 24,pages 6093 à 6109). La sulfoconjugaison de l'oxindole en position 5 a été obtenue en utilisant une réaction enzymatique à l'aide de sulfotransférase de type M (EC 2.8.2.1) purifié à partir de foie de rat ou de plaquettes humaine selon R.
Sekura, M.Duffel, W. Jakoby (Methods in Enzymology, Jakoby W, ed.,
Academic Press , New York, 1981, volume 77, pages 197 à 206) et le protocole de sulfoconjugaison est celui décrit par H. Soliman, P. Boudou, J.M. Vilette et
J. Fiet (J.Steroid Biochem. Molec.Biol., 1993, vol 46, Pages 631 à 634) pour la sulfatation du 5-Pregnen-3-ol-20-one (PREG). Ce protocole permet en remplaçant le PREG par l'oxindole d'obtenir une sulfatation radiomarquée par le soufre si nécessaire.
Academic Press , New York, 1981, volume 77, pages 197 à 206) et le protocole de sulfoconjugaison est celui décrit par H. Soliman, P. Boudou, J.M. Vilette et
J. Fiet (J.Steroid Biochem. Molec.Biol., 1993, vol 46, Pages 631 à 634) pour la sulfatation du 5-Pregnen-3-ol-20-one (PREG). Ce protocole permet en remplaçant le PREG par l'oxindole d'obtenir une sulfatation radiomarquée par le soufre si nécessaire.
Les deux formes (schémas a et b) obtenues par synthèse et sulfatation enzymatiques, donnent un voltampérogramme superposable à ceux obtenus à partir des composés naturels des deux formes (figures 12 et 13).
Plusieurs techniques de chromatographie peuvent être utilisées pour le dosage, soit de la forme naturelle soit de la forme désulfatée.
Sans que la liste en soit exhaustive, des techniques de chromatographie à haute performance (HPLC) en phase reverse (colonne C18 par exemple), ou à échangeur d'ions (comme celle décrite plus haute pour la purification du marqueur), ou par électrophorèse capillaire, peuvent être utilisées.
La détection du marqueur peut être basée sur l'absorption par U.V., la fluorescence, ltélectrochimie, la spectrométrie de masse etc., et la quantification par intégration des surfaces des pics correspondant et leur comparaison avec celle deux pics obtenues avec des doses connues du marqueur.
Une autre façon d'effectuer le dosage est la mise en oeuvre de technique faisant appel à la reconnaissance par des anticorps. L'obtention d'anticorps poly ou monoclonaux et le dosage se fait selon des protocoles classiques pour l'homme de l'art et décrits par exemple pour le dosage de la mélatonine par
Shang-Mian Yie, Erika Johansson et Gregory Brown dans Clin.Chem. 1993 volume 39 pages 2322 à 2325). Les dosages se réalisent par exemple avec la mesure d'une radioactivité ou une réaction enzymatique ou colorimétrique etc.
Shang-Mian Yie, Erika Johansson et Gregory Brown dans Clin.Chem. 1993 volume 39 pages 2322 à 2325). Les dosages se réalisent par exemple avec la mesure d'une radioactivité ou une réaction enzymatique ou colorimétrique etc.
Le protocole mis en oeuvre en routine pour ce dosage a été celui de l'HPLC sur C18, selon la publication de Mills M.H., Finlay D.C., Haddad
P.R. dans J. Chromatography, 1991, vol. 164, 441-445, et Van Haarel A. et
Pavel S., J. Chromatography, 1988, vol. 429, 59-94.
P.R. dans J. Chromatography, 1991, vol. 164, 441-445, et Van Haarel A. et
Pavel S., J. Chromatography, 1988, vol. 429, 59-94.
Pour des échantillons d'urine, nous prélevons 1 ml auquel on ajoute 9 ml d'une solution(50/50) Ethanol/Acétone. Le mélange est centrifugé à basse vitesse (1000RPM) 10 minutes et un échantillon de 100 ,ul du surnageant est lyophilisé et redissous dans 100 ,ul de lmM d'HCl. Ce volume est injecté sur la colonne de HPLC.
Pour le dosage dans le sang, le protocole est le suivant : 1 volume de plasma (200y1) est mélangé à 3 volumes de la solution(50/50) Ethanol/Acétone.
Le mélange est conservé à 4 OC pendant 30 minutes puis centrifugé à 1000 rpm 10 minutes à 4"C. Un échantillon de 100 ,ul du surnageant est lyophilisé et redissous dans 100 y1 de lmM d'HCl. Ce volume est injecté sur la colonne de
HPLC.
HPLC.
Pour le dosage dans le liquide céphalo rachidien, l'échantillon de 100 y1 est directement injecté sur HPLC.
I1 peut être souhaitable de traiter préalablement les échantillons par une solution acide pour atteindre le pH de 1.
Légendes des figures
FIGURE I
Profil de séparation d'échantillons d'urine provenant de
- la : brebis saines
- lb : brebis atteintes de tremblante
- tic : vaches atteintes de l'encéphalopathie spongiforme
- ld: humains âgés sains
- le : humains atteints de démence sénile de type Alzheimer.
FIGURE I
Profil de séparation d'échantillons d'urine provenant de
- la : brebis saines
- lb : brebis atteintes de tremblante
- tic : vaches atteintes de l'encéphalopathie spongiforme
- ld: humains âgés sains
- le : humains atteints de démence sénile de type Alzheimer.
Un échantillon de 1 mi d'urine acidifié à pH1 par l'acide chlorhydrique est soumis à une oxydoréduction par passage d'un courant électrique à balayage cyclique.
Les potentiels d'oxydoréduction sont notés en abscisse (en mVolts) mesurés par rapport à l'électrode normale d'hydrogène. En ordonnée, l'intensité du courant est mesurée en milli-ampères.
La voltampérométrie cyclique est un système à trois électrodes, une en platine, une à hydrogène et une de travail à base de poudre de graphite.
On peut noter le pic caractéristique du marqueur à 850 mv indiqué par la flèche.
FIGURE 2
Electrovoltampérogramme d'urine de mouton atteint de tremblante après traitement des urines par un volume d'acétate d'éthyle, centrifugation et récupération de la phase aqueuse.
Electrovoltampérogramme d'urine de mouton atteint de tremblante après traitement des urines par un volume d'acétate d'éthyle, centrifugation et récupération de la phase aqueuse.
On peut noter le pic caractéristique du marqueur à 850 mv indiqué par la flèche.
FIGURE 3
Electrovoltampérogramme de l'échantillon d'urine après extraction à l'acétate d'éthyle et dialyse membranaire.
Electrovoltampérogramme de l'échantillon d'urine après extraction à l'acétate d'éthyle et dialyse membranaire.
On peut noter le pic caractéristique du marqueur à 850 mv indiqué par la flèche.
FIGURE 4
Electrovoltampérogramme de l'échantillon d'urine après purification par colonne anionique (polyéthylène imine) correspondant à la fraction n" 70 d'élution de cette colonne par un gradient de NaCI (O et 1 M).
Electrovoltampérogramme de l'échantillon d'urine après purification par colonne anionique (polyéthylène imine) correspondant à la fraction n" 70 d'élution de cette colonne par un gradient de NaCI (O et 1 M).
FIGURE 5
Electrovoltampérograme de l'échantillon d'urine après purification par colonne anionique (polyéthylène imine) correspondant à la fraction n" 95 d'élution de cette colonne par un gradient de NaCI (O et 1 M).
Electrovoltampérograme de l'échantillon d'urine après purification par colonne anionique (polyéthylène imine) correspondant à la fraction n" 95 d'élution de cette colonne par un gradient de NaCI (O et 1 M).
FIGURE 6
Spectre UV des fractions récupérées et réunies comprises entre la fraction n" 70 et 95 de la colonne de PEI. En abscisse, la longueur d'onde (nm), en ordonnée, la densité optique.
Spectre UV des fractions récupérées et réunies comprises entre la fraction n" 70 et 95 de la colonne de PEI. En abscisse, la longueur d'onde (nm), en ordonnée, la densité optique.
Le pic principal à 249 nm (flèche) est celui à 286,1 nm correspondant à un groupement C = 0.
On note sur tous ces voltampérogrammes la présence d'un pic en réduction (partie inférieure du graphe, notée par une flèche) à 850 m volts, nettement distinct dans les figures lb, ic, le, correspondant aux pathologies spongiforme et Alzheimer.
FIGURE 7
Idem à la figure 6, l'échantillon 88 avait été hydrolysé par HC1 environ 2 heures à 80" C.
Idem à la figure 6, l'échantillon 88 avait été hydrolysé par HC1 environ 2 heures à 80" C.
On peut noter que le pic à 249 nm est maintenant à 254,6 nm.
FIGURE 8
Voltampérogramme du produit (fraction 88 de la colonne PEI). Noter le pic à 850 mV en oxydation (partie supérieure du graphe) au deuxième balayage.
Voltampérogramme du produit (fraction 88 de la colonne PEI). Noter le pic à 850 mV en oxydation (partie supérieure du graphe) au deuxième balayage.
FIGURE 9
Chromatographie ionique du marqueur urinaire sur une colonne Dionex anionique après hydrolyse acide. L'abscisse représente une mesure de la conductivité. Les temps de rétention sont présentés en ordonnée.
Chromatographie ionique du marqueur urinaire sur une colonne Dionex anionique après hydrolyse acide. L'abscisse représente une mesure de la conductivité. Les temps de rétention sont présentés en ordonnée.
I1 apparaît un pic de sulfate au temps de rétention d'étalonnage des sulfates et un pic de chlorure lié à l'utilisation d'HCl pour l'hydrolyse du marqueur.
FIGURE 10
Purification du marqueur par chromatographie couche mince sur plaque de cellulose.
Purification du marqueur par chromatographie couche mince sur plaque de cellulose.
Les échantillons correspondant aux fractionnements enrichis en marqueurs après la chromatographie sur colonne de PEI sont séparés par chromatographie en couche mince sur cellulose.
La zone indiquée par une flèche correspond au marqueur. Cette zone est prélevée de la plaque et le marqueur élué sur gel de cellulose dans de l'eau, centrifugé et soumis aux analyses voltampérométriques.
FIGURE 11
Spectre de masse du marqueur.
Spectre de masse du marqueur.
Le spectre de masse a été mesuré par deux techniques. L'impact électronique (figure lia) et l'ionisation chimique à l'ammoniaque (figure 11b).
I1 apparaît un pic principal à une masse de 149 sur la figure i la correspondant à la masse moléculaire du marqueur, les pics mineurs correspondant à des produits contaminants ou de dégradation. Le spectre après de l'ionisation chimique à l'ammoniaque fait apparaître un pic d'une masse de 150, correspondant à la masse du marqueur augmentée de celle de l'hydrogène et un second pic à 167 correspondant à la masse du marqueur augmentée de 18 (celle de NH4).
FIGURE 12
Spectre de RMN de protons
En abscisse les ppm qui montrent la présence du groupement NH au-delà de 10 ppm, la zone de 7,55 à 6,95 a été élargie et est représentée dans la partie basse de la figure. Ceci permet de voir que les protons sont en position 7, 6, 4 et que la position 5 est occupée par l'hydroxyle. Cette interprétation résulte de l'intégration des pics Ha, Hb, Hc.
Spectre de RMN de protons
En abscisse les ppm qui montrent la présence du groupement NH au-delà de 10 ppm, la zone de 7,55 à 6,95 a été élargie et est représentée dans la partie basse de la figure. Ceci permet de voir que les protons sont en position 7, 6, 4 et que la position 5 est occupée par l'hydroxyle. Cette interprétation résulte de l'intégration des pics Ha, Hb, Hc.
FIGURE 13 aetb
Electrovoltampérogramme du produit synthétisé de la forme oxindole.
Electrovoltampérogramme du produit synthétisé de la forme oxindole.
On peut noter le pic à 850 mV (et à 960 mV en oxydation au deuxième balayage en pointillé).
Electrovoltampérogramme du produit synthétisé oxindole et sulfaté par voie enzymatique.
On peut noter le pic à 850 mV en réduction au premier balayage et le pic à 1100 mV en oxydation, caractéristique des sulfates.
Le pic d'oxydation à 960 mV au deuxième balayage (en pointillé) que l'on observait également dans les figures 2, 3, 4 et 5.
Claims (8)
1. Utilisation d'un procédé de détection ou de dosage de dérivés comportant un noyau indole ou oxindole, et plus particulièrement d'au moins un dérivé parmi ceux répondant à la formule générale (I) suivante
* lorsque nl = 0, alors n2 = 1 et l'azote de l'hétérocycle (N1) de la formule (I) est lié par une double liaison au carbone en position 2, selon la formule (la) suivante
- ni et n2, indépendamment l'un de l'autre, représentent zéro ou un, avec
- R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe Ra tel que défini cidessus,
- R1 représente un groupe hydroxyle OH, ou un hémiester de l'acide sulfurique (encore désigné groupe sulfate OS03-), ou un groupe ORa, Ra représentant un groupe conjugué (te; qu'un groupe carbohydrate ou glucidique), notamment un glucuronide, un glucose, un désoxyribose, ou un fructose,
dans laquelle
soit n2 = o, et l'oxygène porté par l'hétérocycle de la formule (I) est lié par une double liaison au carbone en position 2, selon la formule (lob) suivante
* lorsque nl = 1 ,alors
dans laquelle R1 et R2 sont tels que définis ci-dessus,
soit n2 = 1, et les carbones en position 2 et 3 de l'hétérocycle de la formule (I) sont reliés par une double liaison, selon la formule (Ic) suivante
dans laquelle R1 est tel que défini ci-dessus,
pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de pathologies neurodégénératives humaines ou animales, notamment des maladies dégénératives du système nerveux central, et plus particulièrement les démences dégénératives humaines, ou les encéphalopathies humaines et animales.
dans laquelle R1 et R2 sont tels que définis ci-dessus,
2. Méthode de diagnostic in vitro de pathologies neurodégénératives humaines ou animales, notamment les maladies dégénératives du système nerveux central, et plus particulièrement les démences dégénératives humaines, ou les encéphalopathies humaines et animales, caractérisées par la détection, voire le dosage, dans un échantillon biologique humain ou animal approprié, de la présence d'au moins un dérivé comportant un noyau indole ou oxindole, notamment d'au moins un composé parmi ceux répondant à la formule générale (I) suivante
* lorsque nl = 0, alors n2 = 1 et l'azote de l'hétérocycle (N1) de la formule (lest lié par une double liaison au carbone en position 2, selon la formule (Ia) suivante
- ni et n2, indépendamment l'un de l'autre, représentent zéro ou un, avec:
- R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe Ra tel que défini cidessus,
- R1 représente un groupe hydroxyle OH, ou un hémiester de l'acide sulfurique (encore désigné groupe sulfate OS03-), ou un groupe ORa, Ra représentant un groupe conjugué (tel qu'un groupe carbohydrate ou glucidique), notamment un glucuronide, un glucose, un désoxyribose, ou un fructose,
dans laquelle
soit n2 = o, et l'oxygène porté par l'hétérocycle de la formule (I) est lié par une double liaison au carbone en position 2, selon la formule (Ib) suivante:
* lorsque nl = 1 ,alors
dans laquelle R1 et R2 sont tels que définis ci-dessus,
soit n2 = 1, et les carbones en position 2 et 3 de l'hétérocycle de la formule (I) sont reliés par une double liaison, selon la formule (Ic) suivante
dans laquelle R1 est tel que défini ci-dessus,
dans laquelle R1 et R2 sont tels que définis ci-dessus.
3. Méthode de diagnostic selon la revendication 2, caractérisée en ce que les pathologies susceptibles d'être détectées sont les suivantes : démence de type
Alzheimer chez l'homme, démence mixte chez l'homme, maladie de Pick chez l'homme, encéphalopathies spongiformes humaines, notamment maladie de
Creutzfeldt-Jakob, encéphalopathies spongiformes animales, notamment tremblante du mouton et encéphalopathie spongiforme bovine (E.S.B.)
4. Méthode de diagnostic selon revendication 2 ou la revendication 3, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est de l'urine, du sang, ou du liquide céphalo rachidien (LCR).
5. Méthode de diagnostic selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend
- une étape de séparation, physique ou biologique d'au moins un dérivé de formule (I) à détecter, des autres constituants de l'échantillon biologique, et le cas échéant, d'identification directe du dérivé, notamment par HPLC,
- le cas échéant, une étape de détection de la présence éventuelle dudit dérivé dans cet échantillon biologique, notamment à l'aide d'un (ou plusieurs) réactif(s) marqué(s).
6. Méthode de diagnostic selon l'une des revendications 2 à 5 caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes
- mise en présence de l'échantillon biologique avec des anticorps, dirigés contre au moins un dérivé de formule (I) susmentionnée, lesdits anticorps étant fixés sur un support solide, ce qui conduit à l'obtention de complexes entre lesdits anticorps et lesdits dérivés susceptibles d'être présents dans l'échantillon biologique,
- rinçage du support solide avec une solution appropriée,
- addition sur le support solide d'un réactif marqué susceptible de reconnaître spécifiquement les complexes susmentionnés, notamment des antiimmunoglobulines marquées, reconnaissant lesdits complexes,
- rinçage du support solide,
- détection de la présence éventuelle du réactif marqué sur le support solide.
7. Anticorps polyclonaux ou monoclonaux susceptibles d'être utilisés dans le cadre de la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic in vitro selon l'une des revendications 2 à 6, lesdits anticorps étant dirigés contre au moins un composé parmi ceux répondant à la formule générale (I) suivante
* lorsque nl = 0, alors n2 = 1 et l'azote de l'hétérocycle (N1) de la formule (I) est lié par une double liaison au carbone en position 2, selon la formule (Ia) suivante
- ni et n2, indépendamment l'un de l'autre, représentent zéro ou un, avec
- R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe Ra tel que défini cidessus,
- R1 représente un groupe hydroxyle OH, ou un hémiester de l'acide sulfurique (encore désigné groupe sulfate OS03-), ou un groupe ORa, Ra représentant un groupe conjugué (tel qu'un groupe carbohydrate ou glucidique), notamment un glucuronide, un glucose, un désoxyribose, ou un fructose,
dans laquelle
soit n2 = o, et l'oxygène porté par l'hétérocycle de la formule (I) est lié par une double liaison au carbone en position 2, selon la formule (Ib) suivante
* lorsque nl = 1 ,alors
dans laquelle R1 et R2 sont tels que définis ci-dessus,
soit n2 = 1, et les carbones en position 2 et 3 de l'hétérocycle de la formule (I) sont reliés par une double liaison, selon la formule (Ic) suivante
dans laquelle R1 est tel que défini ci-dessus,
dans laquelle R1 et R2 sont tels que définis ci-dessus.
8. Trousse (ou kit) pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisée en ce qu'elle comprend
- des anticorps tels que définis dans la revendication 7, dirigés contre l'un ou moins des dérivés de formule (I), ces anticorps étant avantageusement fixés sur un support solide, notamment dans des puits de plaques de titration,
- le cas échéant:
un milieu propice à l'établissement d'une réaction immunologique entre lesdits anticorps, et le (ou les) dérivés de formule (l) susceptible(s) d'être présent(s ) dans l'échantillon biologique analysé,
une solution de rinçage du support solide,
des réactifs appropriés pour la détection des complexes éventuellement
formés entre lesdits anticorps et lesdits dérivés de formule (I), notamment des
anti-immunoglobulines marquées, par exemple de façon radioactive,
enzymatique ou par fluorescence.
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