JP2000516445A

JP2000516445A - Vaccines containing synthetic genes

Info

Publication number: JP2000516445A
Application number: JP10503267A
Authority: JP
Inventors: シバー，ジヨン・ダブリユ; ダビース，メリー・エレン; フリード，ダニエル・シー; リウ，マーガレツト・エー; ペリー，ヘレン・シー
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1996-06-21
Filing date: 1997-06-17
Publication date: 2000-12-12
Also published as: EP0912607A2; WO1997048370A3; WO1997048370A2; AU3491897A; CA2258568A1; AU728422B2

Abstract

(57)【要約】ペプチド又はタンパタ質をコードするＤＮＡ配列を含む合成ポリヌクレオチドが提供される。この合成ポリヌタレオチドのＤＮＡ配列は、非同種宿主における発現に最適化されたコドンを含む。本発明は、ＨＩＶｅｎｖはもちろん、ＨＩＶｅｎｖの改変をコードする合成ＤＮＡ分子によって例示される。この合成分子のコドンは計画された宿主細胞が好むコドンを含む。この合成分子は外来遺伝物質の好ましい形態を提供する。この合成分子は、中和抗体及び細胞媒介免疫によりＨＩＶ感染に対する免疫学的予防をもたらすポリヌクレオチドワクチンとして用いることができる。本発明は、霊長類及びヒトのような哺乳動物を含むイン・ビホ脊椎動物に直接導入された場合に、コードされたタンパク質の発現をその動物体内で誘発するポリヌクレオチドを提供する。 (57) [Summary] Synthetic polynucleotides are provided that include a DNA sequence that encodes a peptide or protein. The DNA sequence of the synthetic polynucleotide contains codons optimized for expression in a heterologous host. The present invention is exemplified by a synthetic DNA molecule that encodes a modification of HIV env, as well as HIV env. The codons of the synthetic molecule include those preferred by the intended host cell. This synthetic molecule provides a preferred form of foreign genetic material. This synthetic molecule can be used as a polynucleotide vaccine to provide immunological protection against HIV infection by neutralizing antibodies and cell-mediated immunity. The present invention provides polynucleotides that, when introduced directly into in vivo vertebrates, including mammals such as primates and humans, induce expression of the encoded protein in the animal.

Description

【発明の詳細な説明】合成遺伝子を含むワクチン発明の背景１．ＨＩＶ感染：ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）は後天性ヒト免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び関連疾患の病因学的作用因子である。ＨＩＶ−１はレトロウイルス科のＲＮＡウイルスであり、全てのレトロウイルスの５’ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ −ｅｎｖ−ＬＴＲ３’構成を示す。加えて、ＨＩＶ−１は、ｔａｔ及びｒｅｖ遺伝子を含む、調節もしくは未知の機能を有する多少の遺伝子を含む。ｅｎｖ遺伝子はウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードし、これは１６０キロダルトン（ｋＤａ）の前駆体（ｇｐ１６０）として翻訳された後、細胞性プロテアーゼによる開裂を受けて外部１２０ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０）及び膜貫通４１ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ４１）を生じる。ｇｐ１２０及びｇｐ４１は会合したままであり、ウイルス粒子及びＨＩＶ感染細胞表面上に現れる。ｇｐ１２０はヘルパーＴリンパ球、マクロファージ及び他の標的細胞上に存在するＣＤ４受容体に結合する。ｇｐ１２０がＣＤ４に結合した後、ｇｐ４１はウイルス侵入の原因である融合現象に媒介する。ウイルス粒子上のｇｐ１２０がＴ４リンパ球又は他の標的細胞の表面上のＣＤ４受容体に結合したときに感染が始まる。結合したウイルスは標的細胞と合体し、そのＲＮＡゲノムを細胞の二本鎖ＤＮＡに逆転写する。ウイルスＤＮＡが細胞の核の遺伝物質に組み込まれ、そこでこのウイルスＤＮＡが新たなウイルスＲＮＡ、ウイルスタンパク質、及び新たなウイルス粒子の産生を導く。新たな粒子は標的細胞の膜から発芽し、他の細胞に感染する。免疫防御に重要であるＴ４リンパ球の破壊は、ＨＩＶ感染の特徴である進行性免疫機能障害の主因である。標的細胞の喪失はほとんどの侵入体に抗する身体の能力を大きく損なうが、ウイルス、真菌、寄生虫及びミコバクテリアを含む特定の細菌に対する防御に特に深刻な打撃を加える。ＨＩＶ−１は、感染した細胞を、複製し、それらから発芽し、かつ細胞膜に損傷を与えることにより殺す。ＨＩＶ−１は、感染した細胞の表面に現れるウイルスｇｐ１２０により標的細胞を間接的に殺すことがあろう。Ｔ細胞上のＣＤ４受容体がｇｐ１２０に対する強い親和性を有するため、ＣＤ４受容体を発現する健常細胞がｇｐ１２０に結合し、感染細胞と融合して融合細胞を形成することがある。融合細胞は生存することができない。また、ＨＩＶ−１は感染細胞に対する正常な細胞性免疫防御を誘発することもある。抗体の助力で、またはそれ無しに、細胞毒性防御細胞はその表面上にウイルスタンパク質を示す感染細胞を破壊することができる。最終的に、遊離のｇｐ１２０がＨＩＶ−１に感染した個体の血液中を循環し得る。この遊離のタンパク質は未感染細胞のＣＤ４受容体に結合し、それらを感染したように見せて免疫応答を誘発することが可能である。ＨＩＶ−１での感染はほとんど常に致死的なものであり、現時点ではＨＩＶ− １感染に対する治療は存在しない。ＨＩＶ−１感染を予防する上で有効なワクチンはいまだに得られていない。復帰突然変異又は感染の危険性のため、生弱毒化ワクチンはおそらくワクチンとして用いることができない。大部分のサブユニットワクチンのアプローチはＨＩＶ感染の予防では成功していない。ＨＩＶ−１感染の治療は、何人かのの感染者を延命させるものの、深刻な副作用を有する。したがって、この致死的感染との格闘に有効な治療及びワクチンに対する大きな必要性が存在する。２．ワクチンワクチン接種は疾患予防の有効な形態であり、いくつかの型のウイルス感染に対して成功することが立証されている。防御体液性及び細胞性免疫を誘発するためにヒト免疫系にＨＩＶ−１抗原を提示する方法の決定は困難な作業である。今日まで、有効なＨＩＶワクチンを生成しようとする試みは成功していない。ＡＩＤＳ患者においては、遊離のウイルスは低濃度でのみ存在する。ＨＩＶ−１の伝染は、細胞−細胞相互作用により融合及び融合細胞形成を介して高まる。したがって、遊離のウイルス又はウイルスサブユニットに対して産生する抗体は、ウイルス感染細胞の排除の点では一般に無力である。ワクチンは、抗原を“覚える”身体の能力を利用する。所定の抗原との最初の遭遇の後、免疫系はその抗原の免疫学的記憶を個体の一生の間保持する細胞を産生する。引き続いてその抗原に晒すと、免疫応答が刺激され、その病原体の排除又は不活性化が生じる。免疫系は病原体を２通りの方法：体液性応答及び細胞媒介応答により処理する。体液性応答においては、リンパ球が、抗原に結合し、それによりその病原体を不活性化する特異的抗体を産生する。細胞媒介応答は、感染細胞を特異的に攻撃して破壊する細胞毒性ヘルパ−Ｔリンパ球を含む。ＨＩＶ−１ウイルスを用いるワクチンの開発には、そのワクチンが免疫系において活性化することが必要な細胞と同じ細胞（すなわち、Ｔ４リンパ球）の幾つかにＨＩＶ−１が感染する問題がある。免疫系の損傷が生じる前にＨＩＶを不活性化するワクチンを開発することが有利である。特に適する型のＨＩＶワクチンは、ＨＩＶ変種を認識し、かつ感染の開始期のＨＩＶ陽性個体において作用する抗−ＨＩＶ免疫応答を生成する。中和及び防御免疫応答を誘発することが望まれる、ウイルス、特にはヒト免疫不全ウイルスのような高率で突然変異を生じるものに対するワクチンを開発する上での主な問題は、異なるウイルス単離体又は株の間でのウイルスエンベロープタンパク質の多様性である。マウス及びヒトの両者における細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は保存された内部ウイルスタンパク質から誘導されるエピトープを認識することか可能であり、ウイルスに対する免疫応答において重要であるものと考えられるため、異なるウイルス株に対する異種防御を提供することが可能なＣＴＬワクチンの開発に労力が注がれている。ＣＤ８⁺ＣＴＬは、それらのＴ細胞受容体がＭＨＣクラスＩ分子と会合したウイルスペプチドを認識したときにウイルス感染細胞を殺すことが知られている。このウイルスペプチドは、内生的に合成されたウイルスタンパク質から、そのタンパク質の位置又はウイルス内での機能とは無関係に誘導される。したがって、保存されたウイルスタンパク質に由来するエピトープを認識することにより、ＣＴＬは交差株防御をもたらすことが可能である。ＭＨＣクラスＩと会合することが可能なＣＴＬ認識のためのペプチドは、細胞質もしくは小胞体内に存在し、又はそれを通過するタンパク質に由来する。一般には、（ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される抗原の場合のように）エンンドソーム処理経路に入る外来性タンパク質はＣＤ８⁺ＣＴＬ応答の生成に有効ではない。ＣＴＬ応答を生成しようとする労力の大部分では細胞内でのタンパク質抗原の産生に複製ベクターが用いられるか、又は細胞質ゾルへのペプチドの導入に焦点が当てられている。これらのアプローチには、それらのワクチンとしての有用性が低下し得るという制限がある。レトロウイルスベクターには、その組換えウイルスの複製する能力を一方では維持しながら、融合タンパク質として発現し得るポリペプチドのサイズ及び構造に制限があり、そして、引き続く免疫のためのワクチニアのようなベクターの有効性はそれらのベクター自体に対する免疫応答により弱体化されよう。また、ウイルスベクター及び改変病原体にはヒトにおけるそれらの使用を妨げ得る固有の危険性がある。さらに、提示させようとするペプチドエピトープの選択は個体のＭＨＣ抗原の構造に依存し、したかって、ペプチドワクチンには、異種交配集団におけるＭＨＣハプロタイプの多様性のために有効性に限界がある可能性がある。３．ＤＮＡワクチンＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙ，Ｎ．及びＲｅｓｈｅｆ，Ｌ．［ＰＮＡＳ８３，９５５１−９５５５，（１９８６年）］は、マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）又は筋肉内（ｉ．ｍ．）により導入されたＣａＰＯ₄沈殿ＤＮＡが発現可能であることを示した。ＣａＣｌ₂処理無しでマウスにＤＮＡ発現ベクターをｉ．ｍ．注射することにより、筋肉細胞によるＤＮＡの取り込み及びそのＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現が生じた。このプラスミドはエピソーム的に維持され、複製しなかった。続いて、ラット、魚類及び霊長類の骨格筋、並びにラットの心筋へのｉ.ｍ.注射の後に持続性の発現が観察されている。核酸を治療薬として用いるこの技術はＷＯ９０／１１０９２号（１９９０年１０月４日）に報告されており、この報告では裸のポリヌクレオチドが脊椎動物のワクチン接種に用いられた。免疫が筋肉内であることはこの方法の成功に必要なことではない。ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡをコートした金微小弾丸をマウスの皮膚に導入することにより、そのマウスで抗−ＢＧＨ抗体が産生した。生きている動物の皮膚、筋肉、脂肋及び乳組織の形質移入にはジェットインジャクター（ｊｅｔｉｎｊｅｃｔｏｒ）が用いられている。核酸を導入するための様々な方法が再検討されている。マウスにおけるＤＮＡ：カチオン性リポソーム複合体の静脈内注射によりクローン化導入遺伝子の全身性発現を生じることはＺｈｕら［Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：２０９−２１１（１９９３年７月９日）］によって示された。Ｕｌｍｅｒら［Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１７４５−１７４９（１９９３年）］は、インフルエンザウイルスタンパク質をコードするＤＮＡの筋肉内注射によるインフルエンザウイルスの感染に対する異種防御に関して報告した。病原体及び腫瘍抗原に対する所望の免疫応答を誘発することが可能な特定の治療及び予防薬に対する必要性が、本発明によって満たされる。この治療アプローチにおいて特に重要な点は、抗原遺伝子が得られた株とは異種のウイルス株によって引き起こされた感染又は疾患であっても、それを予防することが可能なＴ細胞免疫応答を誘発する能力である。これはＨＩＶを扱う場合に特に関心のあるものであり、何故ならばこのウイルスは急速に突然変異するものと認識されており、かつ多くの毒性単離体が同定されているためである［例えば、２４５の別々のＨＩＶ単離体を同定しているＬａＲｏｓａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：９３２ −９３５（１９９０年）を参照］。この認識された多様性に対応して、研究者らはペプチド免疫に基づくＣＴＬの生成を試みている。このようにして、Ｔａｋａｈａｓｈｉら［Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：３３３−３３６（１９９２年）］は、ＨＩＶエンベロープ（ｇｐ１６０）決定基を認識する広範囲に交差反応性の細胞毒性Ｔ細胞の誘発について報告した。しかしながら、これらの研究者らは真の交差反応性ＣＴＬ応答を達成することが困難であることを認識し、Ｔ細胞の非常に厳格な初回刺激又は再刺激と既に刺激されているＣＴＬからの細胞毒性を含むエフェクター機能の誘発とは対立していることを示唆した。Ｗａｎｇらは、クローン化ゲノム（非スプライス化）ＨＩＶ遺伝子を筋肉内接種することによる、マウスにおけるＨＩＶに対する免疫応答の誘発に関して報告した。しかしながら、これらの研究において達成された免疫応答の水準は非常に低かった。加えて、ＷａｎｇらのＤＮＡ構築体では連続するＴａｔ／ｒｅｖ−ｇｐ１６０−Ｔａｔ／ｒｅｖコーディング配列をコードするＨＩＶの本質的なゲノム断片が用いられた。以下に詳述されるように、これはｇｐ１６０の高水準の発現を得るための準最適系である。また、これは、Ｔａｔの発現がカポジ肉腫の進行に寄与するため、潜在的な危険性を有する。ＷＯ９３／１７７０６号にはウイルスに対して動物をワクチン接種する方法が記述されており、この方法では担体粒子が遺伝子構築体で被覆され、その被覆粒子が加速されて動物の細胞に入れられた。ＨＩＶに関しては、末端反復配列を除く、本質的にゲノム全体を用いることが提案された。一般に、ワクチンの安全性を保証するため、ＨＩＶの構築体はＨＩＶのゲノムの約５０％以上を含むべきではないと信じられている。そうすることにより、その多くが未知の、又は理解が乏しい機能を有する酵素的部分及びウイルス調節タンパク質の除去が確実になる。このように、有用なヒトＨＩＶワクチンが遺伝子送達技術から現れるかどうか幾つかの問題が残っている。本発明では、ポリヌクレオチドを生体組織に導入してタンパク質の発現を誘発する既知の方法のいずれもが考慮されている。しかしながら、本発明は、ＨＩＶ及び他のタンパク質を抗原処理経路に導入してＨＩＶ特異的ＣＴＬ及び抗体を効率的に産生させるための新規免疫原を提供する。この医薬品は、細胞性及び体液性の両者の抗−ＨＩＶ及びＨＩＶ中和免疫応答を誘発するワクチンとして有用である。本発明においては、上述の問題に対する取り組みが行われ、動物体内に導入されたときにそれらの方法に付随する危険性を伴うことなくＨＩＶタンパク質及びエピトープの効率的な発現を導くポリヌクレオチド免疫原を提供することにより解決されている。このようにして生成した免疫応答は、ＨＩＶの認識、ＨＩＶの複製の阻害、ＨＴＶに感染した細胞を同定して殺すことに有効であり、かつ多くのＨＩＶ株に対して交差反応性である。４．コドンの用法及びコドンコンテキスト生物のコドン対形成は高度に非ランダムであり、生物間で異なる。この情報は所望の水準の翻訳効率を有する改変もしくは合成遺伝子の構築及び発現、ゲノムのどの領域がタンパク質コーディング領域であるのかの決定、異種遺伝子への翻訳休止部位の導入、及びヌクレオチド配列の関係又は系統起源の確認に用いられる。形質転換生物における外来異種遺伝子の発現は今や日常的なものである。例えばネズミ及びヒト遺伝子を含む多くの哺乳動物遺伝子が単細胞生物にうまく挿入されている。これに関する標準技術には、プラスミドもしくはファージのようなベクターに発現させようとする外来遺伝子を導入し、そのベクターを生物への遺伝子の挿入に用いることが含まれる。そのような遺伝子の本来のプロモーターは、一般に、その遺伝子が挿入される宿主に適合する強力なプロモーターと置換される。タンパク質配列決定機器は、例え微量であっても、天然タンパク質のアミノ酸配列を明らかにすることを可能にする。これらのアミノ酸配列から、それらのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を推定することができる。ＤＮＡ合成も急速に発展している技術であり、これらの推定ＤＮＡに相当する合成遺伝子を容易に構築することができる。発現系及び組換えＤＮＡの知識の萌芽にもかかわらず、生物において外来もしくは合成遺伝子を発現させようと試みる場合には重大な障害が残っている。例えば、多くの天然の活性タンパク質は、それらが外来宿主において発現される場合に生じるものとは異なる様式でグリコシル化される。このため、多くの哺乳動物遺伝子を発現させるための細菌宿主に酵母のような真核生物宿主が好ましいことがある。グリコシル化の問題は継続する研究の主題である。別の問題はより理解が乏しい。合成遺伝子の翻訳は、強力なプロモーターと組み合わせた場合であっても、しばしば予想よりも非常に劣る効率で進行する。同じことが発現生物にとって外来性の外来遺伝子にもよく当てはまる。回収可能な量の翻訳産生物が生成する十分に効率的な様式で遺伝子が転写される場合であっても、そのタンパク質はしばしば不活性であるか、又はその本来のタンパク質とは特性が何らかの点で異なる。後者の問題は、通常、様々な生物におけるタンパク質の折り畳みの相違のためであると認識されている。この問題の解決法はわかりにくく、タンパク質の折り畳みを制御する機構に対する理解は不十分である。翻訳効率に関連する問題はコドンコンテキスト効果に関連するものと信じられている。全ての生物におけるタンパク質コーディング領域は様々な機能的な束縛を受けており、その幾つかは適切な翻訳開始及び停止シグナルに加えて適切に作用するタンパク質をコードする必要性に依存している。しかしながら、これらの束縛の点からは容易に理解できないタンパタ質コーディング領域の幾つかの特徴が認められている。このような特徴の重要な分類はコドンの用法及びコドンコンテキストに関係している。コドンの使用は非常に偏向していて、異なる生物の間で大きく変化することが知られている。コドンの使用パターンはｔＲＮＡイソアクセプターの相対量に関連することが示されている。多量のタンパク質をコードする遺伝子と少量のタンパク質をコードする遺伝子とはコドン優先度が相違している。コドンの使用における偏向がペプチド伸長速度を変更する可能性は広く論じられている。コドンの使用における相違は翻訳速度の相違に関連するが、翻訳に対するコドン選択の直接効果を示すことは困難である。コドン使用パターンに関する他の提示される束縛には翻訳の忠実度の最大化及びタンパク質合成の動力学的効率の最適化が含まれる。コドンの非ランダム使用とは別に、コドン／アンチコドン認識がコドンそれ自体の外部の配列によって影響を受ける、“コドンコンテキスト”と呼ばれる現象のかなりの証拠が蓄積されている。非センスコドンはもちろんミスセンスコドンの抑制の効率に対する近傍ヌタレオチドの強力な影響が存在する。明らかに、天然の細菌集団における多量のサプレッサー活性はもちろん、セレノシステイン及びホスホセリンをコードする“終止”コドンの使用も終止がコンテキスト依存性であることを必要とする。類似のコンテキスト効果は、翻訳の忠実度はもちろん、翻訳開始の効率にも影響を及ぼすことが示されている。大腸菌のタンパク質コーディング領域の統計分析は“コドンコンテキスト”の別の表出を示している。ある位置での特定のコドンの存在は隣接するコドンにおける特定のヌクレオチドの出現頻度に影響を及ぼし、これらのコンテキストの束縛は高水準で発現する遺伝子と低水準で発現する遺伝子とでは顕著に異なる。コンテキスト効果は認識されてはいるが、コドンに隣接する好ましいヌクレオチドに関連する統計的規則の推定される価値は比較的低い。これは、所望の水準の翻訳効率を達成するためのコドンの選択のためにこのようなヌタレオチド優先度データの利用を制限している。自動ヌクレオチド配列決定機器の出現は様々な生物の多量の配列データを利用可能にしている。それらのデータの理解は実質的な困難を提示する。例えば、遺伝子配列データをタンパク質の配列に関連付けるためには、そのケノムのコーディング領域を特定することが重要である。加えて、特定の生物のゲノムの系統が実質的関心事である。幾つかの生物のゲノムは系統が混ざり合ったものであることが知られている。現在、ウイルス起源の配列の幾つかが真核生物のゲノムに安定に組み込まれている。これらウイルス配列それ自体は別の実質的に関連のない種に由来するものである可能性がある。遺伝子の系統の理解は、他の生物における関連遺伝子とそれらの翻訳産生物との適切な類似性を引き出す上で重要である可能性がある。翻訳に対するコドンコンテキスト効果のより良好な理解、及びあらゆる所望の翻訳効果に適するコドンを決定する方法が必要とされる。また、ヌクレオチド配列データからゲノムのコーディング領域を特定する方法も必要とされる。さらに、タンパク質の折り畳みを制御し、かつ外来遺伝子が宿主において発現したときに適切に折りたたまれることを保証する方法も必要とされる。所望の翻訳効率に従って変更又は構築された遺伝子は非常に価値のあるものである。産業上及び製薬上関心のあるタンパク質を微生物によって発現させるための組換えＤＮＡ技術の実施の別の側面は“コドン優先度”である。遺伝子発現のための既存の機構は遺伝的に形質転換された宿主細胞が所定かつ所望の産生物を構築するように“作動する”というものであることは以前に言及されているが、微生物内で達成される発現の水準は、部分的には挿入された外来遺伝子内に存在するアミノ酸特異的遺伝暗号の特定の代替形態に依存して広範な変動を受ける可能性がある。４種類の可能性のあるヌクレオチド塩基の“トリプレット”は６４種類の異なる形態で存在し得る。これらの形態が（転写開始及び終止に加えて）わずか２０種類の異なるアミノ酸のメッセージを提供するということは、幾つかのアミノ酸が２つ以上のコドンでコードされ得ることを意味する。実際、幾つかのアミノ酸は６種類もの“余分の”代替コドンを有し、これに対して別の幾つかのものは単一の必要とされるコドンを有する。完全には理解されていない理由により、代替コドンは異なる細胞型の外来ＤＮＡ内に完全に均一に存在するわけではなく、特定の細胞型においては特定のコドンに対する可変の天然階層もしくは“優先度”が存在するように思われる。一例として、アミノ酸ロイシンはＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡ及びＴＴＧ（それぞれ、ｍＲＮＡコドン、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、ＵＵＡ及びＵＵＧに対応する）を含む６つのＤＮＡコドンのいずれかによって指定される。微生物のゲノムコドン頻度の徹底的な分析により、大腸菌の外来ＤＮＡが最も一般的にはＣＴＧロイシン指定コドンを含み、これに対して酵母及び粘菌のＤＮＡが最も一般的にはＴＴＡロイシン指定コドンを含むことが明らかになっている。この階層の観点から、大腸菌宿主によってロイシンに富むポリペプチドの高水準の発現が得られる可能性がある程度はコドン使用の頻度に依存するものと一般に考えられる。例えば、ＴＴＡに富む遺伝子は全ての可能性において大腸菌における発現に劣り、これに対してＣＴＧに富む遺伝子はおそらく高度にポリペプチドを発現する。同様に、酵母細胞がロイシンに富むポリペプチドを発現させるために計画された形質転換宿主細胞である場合、挿入されるＤＮＡにおける使用に好ましいコドンはＴＴＡである。組換えＤＮＡ技術に関するコドン優先現象の暗示は明白であり、この現象は、うまく形質転換された宿主生物において外来遺伝子の高発現水準を達成することの従来の多くの失敗を説明している。“好ましさ”に劣るコドンが挿入された遺伝子内に繰り返し存在し、その宿主細胞の発現のための機構が効率的に作動していない可能性がある。この現象は、計画された宿主細胞の好ましいコドンを含むように設計されている合成遺伝子が組換えＤＮＡ技術を実施するのに好ましい形態の外来性遺伝物質を提供することを示唆する。５．タンパク質の輸送真核細胞を分類する機能の多様性はそれらの膜境界の構造的な分化に依存している。これらの構造を生成し、かつ維持するためには、タンパク質が、小胞体内のそれらの合成部位から細胞を通って予め決められた目的地に輸送されなければならない。これは、その輸送されるタンパク質が、主要輸送経路への接触点に位置する経路選択の主因である分子機構によって認識される選別信号を示すことを必要とする。大部分のタンパク質の選別決定は、それらの最終目的地、それらがその機能を発揮する細胞内の位置、がそれらの恒久的な滞留地となるため、それらがそれらの生合成経路を経るときに１回だけなされることが必要である。細胞内の整合性の維持は、部分的には、タンパク質の選択的な選別及びそれらの正しい目的地への正確な輸送に依存する。過去数年にわたり、タンパク質の標的設定及び局在化のための分子機構の精査が活発に研究されている。‘宛先ラベル’として作用し得るタンパク質上に定義された配列モチーフが同定されている。多くの選別信号が膜タンパタ質の細胞質ドメインに関連することが見出されている。発明の要約ペプチド又はタンパタ質をコードするＤＮＡ配列を含む合成ポリヌクレオチドが提供される。この合成ポリヌクレオチドのＤＮＡ配列は非同種宿主における発現に最適化されたコドンを含む。本発明はＨＩＶｅｎｖはもちろんのことＨＩＶｅｎｖの改変をもコードする合成ＤＮＡ分子によって例示される。この合成分子のコドンには計画された宿主細胞の好ましいコドンが含まれる。この合成分子は外来性遺伝物質の好ましい形態を提供する。この合成分子は、中和抗体及び細胞介在免疫によりＨＩＶ感染に対する有効な免疫予防を提供するポリヌクレオチドワクチンとして用いることができる。本発明は、霊長類及びヒトのような哺乳動物を含む脊椎動物にイン・ビボで直接導入されたときに、コードされたタンパク質の発現をその動物体内に誘発するポリヌクレオチドを提供する。図面の簡単な説明図１はＨＩＶｅｎｖカセットに基づく発現方策を示す。図２はＤＮＡワクチン媒介抗−ｇｐ１２０応答を示す。図３はネズミＤＮＡワクチン接種受容動物の血清の抗−ｇｐ１２０ＥＬＩＳＡ力価を示す。図４はＨＩＶｅｎｖＰＮＶ細胞培養物形質移入の後のｇｐ１２０の相対発現を示す。図５はｔＰＡ−ｇＰ１４３／ｏＰｔＡ対ｏｐｔＢＤＮＡワクチン接種の後の平均抗−ｇｐ１２０ＥＬＩＳＡ応答を示す。図６はネズミＤＮＡワクチン接種受容動物の血清によるＨＩＶの中和を示す。図７はネズミＨＩＶｅｎｖＤＮＡワクチン接種受容動物からの血清によるＨＩＶ中和を示す。図８は最適化されたＨＩＶｅｎｖＤＮＡ構築体の免疫ブロット分析である。図９はｇｐ１４０ＤＮＡ及びｏ−ｇｐ１６０タンパク質を最終的にワクチン接種した後のアカゲザルにおける抗−ｇｐ１２０ＥＬＩＳＡ応答を示す。図１０は最終ワクチン接種後のアカゲザルのＳＨＩＶ中和抗体応答を示す。発明の詳細な説明ペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む合成ポリヌタレオチドが提供される。この合成ポリヌタレオチドのＤＮＡ配列は非同種宿主における発現に最適化されたコドンを含む。本発明はＨＩＶｅｎｖをコードする合成ＤＮＡ分子によって例示されることに加えて、ＨＩＶｅｎｖの改変も提供される。この合成分子のコドンには計画された宿主細胞の好ましいコドンが含まれる。この合成分子は外来性遺伝物質の好ましい形態を提供する。この合成分子は、中和抗体及び細胞介在免疫によりＨＩＶ感染に対する免疫学的予防を提供するポリヌクレオチドワクチンとして用いることができる。本発明は、霊長類及びヒトのような哺乳動物を含む脊椎動物にイン・ビボで直接導入されたときに、コードされたタンパク質の発現をその動物体内に誘発するポリヌタレオチドを提供する。したがって、ＨＩＶｅｎｖをコードする合成ＤＮＡ分子及びＨＩＶｅｎｖの改変された形態をコードする合成ＤＮＡ分子が提供される。この合成分子のコドンは計画された宿主細胞によって好まれるコドンを用いるように設計される。上述のように、本発明のこの部分の合成分子は、中和抗体及び細胞媒介免疫によってＨＩＶ感染に対する有効な免疫学的予防を提供するポリヌクレオチドワタチンとして用いることができる。この合成分子は免疫原組成物として用いることができる。また、本発明のこの部分は、霊長類及びヒトのような哺乳動物を含む脊椎動物にイン・ビホで直接導入されたときに、コードされたタンパク質の発現をその動物体内に誘発するポリヌクレオチドをも提供する。ここで用いられる場合、ポリヌクレオチドは、生存する脊椎動物細胞に導入されたときにその細胞の機構をそのポリヌクレオチドを含む遺伝子によってコードされる翻訳産生物を生成するように導くことが可能であるような必須調節要素を含む核酸である。本発明の一態様においては、このポリヌクレオチドは、転写プロモーターに作動的に連結する少なくとも１つのＨＩＶ遺伝子を含むポリデオキシリボ核酸である。本発明の別の態様においては、ポリヌクレオチドワクチン（ＰＮＶ）は、真核細胞の機構（リボソーム、ｔＲＮＡ、及び他の翻訳因子）による翻訳を受容可能な少なくとも１つのＨＩＶ遺伝子をコードするポリリボ核酸を含む。このポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が病理学的状態を除く動物に通常生じることがないもの（すなわち、異種タンパク質）、例えば、ヒト免疫不全ウイルスに関連するタンパク質、（ＨＩＶ）、後天性免疫不全症候群の病因学的作用因子、（ＡＩＤＳ）である場合、その動物の免疫系は防御免疫応答を開始するように活性化される。これらの外来性タンパク質はその動物の組織によって生成されるため、発現したタンパク質は主要組織適合性系、ＭＨＣによって関連生物（ＨＩＶ）が実際に感染した場合と類似する方式で処理される。本開示において示されるように、その結果は同種病原体に対する免疫応答の誘発である。したがって、本発明者らは、生物学的系に導入されたときにＨＩＶタンパク質及びエピトープの発現を誘発する核酸を調製している。誘発された抗体応答は両者共に発現したＨＩＶタンパク質に特異的であり、ＨＩＶを中和する。加えて、ＨＩＶ感染細胞を特異的に認識して破壊する細胞毒性Ｔリンパ球が誘発される。本発明は、哺乳動物の組織に導入されたときに、単細胞内にイン・ビボで分散した遺伝子産生物の発現を誘発するポリヌクレオチドの使用方法を提供する。本発明は、ｒｅｖ−非依存性遺伝子を得るのにｒｅｖ依存性ＨＩＶ遺伝子の複数の操作を必要としない異なる解決法を提供する。ここに記述されるｒｅｖ−非依存性発現系はそれ自体の資質として有用であり、単細胞におけるイン・ビボでの単一の所望の遺伝子産生物の発現を示すための系である。本発明の用途の多くが抗ウイルスワクチンに適用されるため、このポリヌクレオチドはしばしばポリヌクレオチドワクチン、又はＰＮＶと呼ばれる。これは、免疫刺激及び坑腫瘍治療におけるこれらのポリヌクレオチドのさらなる有用性を本発明の範囲外とするものではない。本発明の一態様においては、ＨＩＶ遺伝子産生物をコードする遺伝子が発現ベクターに組み込まれる。このベクターは真核生物のＲＮＡポリメラーゼによって認識される転写プロモーターを含み、かつＨＩＶ遺伝子コーディング領域の末端に転写ターミネーターを含む。好ましい態様において、このプロモーターは、多くの他の既知プロモーター、例えば、強力な免疫グロブリン又は他の真核生物遺伝子プロモーターを用いることができることを当該技術分野における熟練者は認識するであろうが、イントロンＡ配列を有するサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ｉｎｔＡ）である。好ましい転写ターミネーターはウシ成長ホルモンターミネータ一である。ＣＭＶｉｎｔＡ−ＢＧＨターミネーターの組み合わせが特に好ましい。原核生物におけるポリヌクレオチドの調製を助けるため、真核生物細胞において抗生物質の発現が生じないように原核生物プロモーター転写制御の下で、抗生物質耐性マーカーも発現ベクターに好ましく含められる。アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子及び他の薬学的に許容し得る抗生物質耐性マーカーを用いることができる。原核細胞における発酵によるポリヌクレオチドの高水準の産生を助成するため、ベクターが原核生物の複製起点を含み、かつ高コピー数のものであることが有利である。幾つかの商業的に入手可能な原核生物クローニングベクターがこれらの利点をもたらす。非必須ＤＮＡ配列は除去することが望ましい。また、このベクターは真核生物細胞において複製できないことが望ましい。これは、ポリヌタレオチドワクチンの配列がレシピエントのゲノムに組み込まれる危険性を最小にする。ポリヌクレオチドの発現を特定の組織型に限定することが望まれる場合には、組織特異的プロモーター又はエンハンサーを用いることができる。態様の１つにおいては発現ベクターｐｎＲＳＶが用いられ、このベタターではラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）がプロモーターとして用いられる。別の態様においては、ＣＭＶプロモーター及びＢＧＨ転写ターミネーターがクローン化された突然変異ｐＢＲ３２２ベクターであるＶ１が用いられる。別の態様においては、Ｖ１及びｐＵＣ１９の要素を組み合わせてＶ１Ｊと呼ばれる発現ベクターが生成されている。Ｖ１Ｊ又は他の所望の発現ベクターにはＨＩＶ遺伝子、例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１６０、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、又は坑−ＨＩＶ免疫応答を誘発することが可能な他のあらゆるＨＴＶ遺伝子がクローン化される。別の態様においては、アンピシリン耐性遺伝子がＶ１Ｊから除去され、かつネオマイシン耐性遺伝子に置き換えられてＶ１Ｊ−ｎｅｏが生成され、これには本発明に従って用いるために異なるＨＩＶ遺伝子がクローン化されている。別の態様においてはこのベタターはＶ１Ｊｎｓであり、これは独自のＳｆｉ１制限部位がＶ１Ｊ−ｎｅｏの２１１４位の単一のＫｐｎ１部位に加工により組み込まれていることを除いてＶ１Ｊｎｅｏと同じである。ヒトゲノムＤＮＡにおけるＳｆｉ１部位の出現頻度は非常に低い（１００，０００塩基当たり約１部位）。したがって、このベクターは、抽出されたゲノムＤＮＡを単にＳｆｉ１消化することにより宿主ＤＮＡへの発現ベクターの組み込みを注意深く監視することを可能にする。さらなる改良においては、ベクターはＶ１Ｒである。このベクターにおいては、非常に小型のベクターを生成するため、可能な限りの非必須ＤＮＡがベクターから“切り取られ”た。このベクターはＶ１Ｊｎｓの誘導体である。このベクターは、望ましくない配列がコードされることを気にすることなくより大きなインサートを用いることを可能にし、細胞による取り込みを最適化する。本発明の一態様は、ＨＩＶｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇａｇ及びＨＩＶの実験室適合株、例えば、ＳＦ２、ＩＩＩＢもしくはＭＮに由来する遺伝子産生物をコードする遺伝子を含む。当該技術分野における熟練者は、ＨＩＶ−１に由来する遺伝子に類似する機能を有するＨＩＶ−２株に由来する遺伝子の使用がＨＩＶ−１構築体についてここに記述されるものに類似する免疫応答を生成するものと予想されることを認識するであろう。これらの遺伝子を得るためのクローン化及び操作方法は当該技術分野における熟練者に公知である。ＨＩＶの実験室適合株に対する免疫応答の誘発がＨＩＶの主要野外単離体の中和をもたらすのに適するものではない可能性があることは認識される。したがって、本発明の別の態様においては、ＨＩＶの毒性主要野外単離体に由来する遺伝子がポリヌクレオチド免疫原に組み込まれる。これは、このウイルス遺伝子のｃＤＮＡコピーを調製した後、個々の遺伝子をポリヌクレオチド免疫原にサブクローン化することにより達成される。多くのＨＩＶ株の多くの遺伝子の配列が現在公的にＧＥＮＢＡＮＫから入手可能であり、このようなＨＩＶの主要野外単離体は、これらの株を利用可能とするためにクオリティ・バイオロジカル社（ＱｕａｌｉｔｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）［７５８１リンドバーグ・ドライブ、ゲイザースバーグ、メリーランド２０８７９］と契約している国立アレルギー及び感染症研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ）（ＮＩＡＩＤ）から入手可能である。また、このような株は世界保健機構（ＷＨＯ）［ＨＩＶの単離及び特徴付けのためのネットワーク（ＮｅｔｗｏｒｋｆｏｒＨＩＶＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、ワクチン開発ユニット（ＶａｃｃｉｎｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＵｎｉｔ）、研究局（ＯｆｆｉｃｅｏｆＲｅｓｅａｒｃｈ）、ＡＩＤＳに関する世界的プログラム（ＧｌｏｂａｌＰｒｏｇｒａｍｍｅｏｎＡＩＤＳ）、ＣＨ−１２１１ジュネーブ２７、スイス］からも入手可能である。この研究から、当該技術分野における熟練者は、本発明の有用性の１つが、ＨＩＶの配列の多様性とＨＩＶの中和の血清学との相関を他のパラメーターに加えて作成することができるように、イン・ビボはもちろんのことイン・ビトロでの試験及び分析のための系を提供することであることを認識するであろう。ＨＩＶ株の主要単離体に由来する遺伝子の組み込みにより、このウイルスの臨床的な単離体に対する免疫応答を誘発し、したがって、当該分野において未だに満たされていない必要性を満たす免疫原が提供される。さらに、毒性単離体が変化するに従い、必要に応じて新しい配列を反映するようにこの免疫原を改変することができる。用語の一貫性を保つため、ここではポリヌクレオチド免疫原構築体の記述に当たり以下の慣例に従う：“ベクター名称−ＨＩＶ株−遺伝子−追加要素”。したがって、ＭＮ株のｇｐ１６０遺伝子が発現ベクターＶ１Ｊｎｅｏにクローン化されている構築体は、ここで与えられる名称は：“Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＭＮ−ｇｐ１６０”である。この構築体に加えられる追加要素は以下にさらに詳細に説明される。ウイルスの病因株が変化するため、医薬に組み込むのに最適である正確な遺伝子は変化し得る。しかしながら、以下に示されるように、異種株に対して防御することが可能なＣＴＬ応答が誘発されるため、全ウイルス又はサブユニットポリペプチドベースのワクチンと比較して、本発明の免疫原及びワクチンにおいては株の可変性はそれほど重要ではない。加えて、この医薬は新規遺伝子を挿入する操作が容易であるため、これは分子生物学の標準技術によって容易になされる調整である。ここで用いられる“プロモーター”という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ鎖上の認識部位を指す。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼと開始複合体を形成し、転写活性を惹起して駆動する。この複合体は、“エンハンサー” と呼ばれる活性化配列又は“サイレンサー”と呼ばれる阻害配列によって改変することができる。ここで用いられる“リーダー”という用語は、遺伝子と共に転写される、構造遺伝子の５’末端のＤＮＡ配列を指す。リーダーは、通常、しばしばプロ配列と呼ばれるＮ−末端ペプチド伸長を有するタンパク質を生じる。細胞外の媒体又は膜のいずれかに分泌されることが運命付けられているタンパク質については、一般には疎水性であるこのシグナル配列はそのタンパク質を小胞体内に導き、そのタンパク質はここから適切な目的地に放出される。ここで用いられる“イントロン”という用語は、遺伝子産生物内のアミノ酸をコードしない、遺伝子中央部に生じるＤＮＡの区画を指す。イントロンの前駆体ＲＮＡは切除され、したがってｍＲＮＡに転写されることもタンパク質に翻訳されることもない。 “カセット”という用語は、発現させようとする核酸配列を含む本発明の配列を指す。カセットは、概念上は、カセットテープに類似する。各々のカセットはそれ自体の配列を有する。したがって、カセットを交換することにより、そのベクターは異なる配列を発現する。５’及び３’末端の制限部位のため、カセットは容易に挿入し、除去し、又は別のカセットと置き換えることができる。 “３’非翻訳領域”又は“３’ＵＴＲ”という用語は、通常その遺伝子と共に転写される、構造遺伝子の３’末端の配列を指す。この３’ＵＴＲ領域は通常ポリＡ配列を含む。この３’ＵＴＲはＤＮＡから転写されるが、タンパク質に翻訳される前に切除される。 “非コーティング領域”又は“ＮＣＲ”という用語は、構造遺伝子の３’ＵＴＲ領域に近接する領域を指す。このＮＣＲ領域は転写終止シグナルを含む。 “制限部位”という用語は制限エンドヌクレアーゼの配列特異的開裂部位である。 “ベクター”という用語は、ＤＮＡ断片を宿主生物又は宿主組織に導入することが可能な幾つかの手段を指す。プラスミド、バクテリオファージ及びコスミドを含む様々な型のベクターが存在する。 “有効量”という用語は、適切な水準のポリペプチドを産生するのに十分なＰＮＶが注射されることを意味する。当該技術分野における熟練者はこの水準が変化し得ることを認識する。本発明を説明するため、以下のＨＩＶに関する背景を説明する。ヒト免疫不全ウイルスはリボ核酸（ＲＮＡ）ゲノムを有する。このＲＮＡゲノムは、ここで教示される方法に従ってクローン化及び操作するためのｃＤＮＡコピーを生成するため、当該技術分野において公知の方法に従って逆転写されなければならない。このゲノムの各末端はプロモーターとして作用する末端反復配列である。これらの末端の間で、このゲノムは、様々なリーディングフレームにおいて、ｇａｇ− ｐｏｌ−ｅｎｖを主要遺伝子産生物としてコードしている（ｇａｇはグループ特異的抗原であり、ｐｏｌは逆転写酵素、又はポリメラーゼであり、また、この領域によって、代わりのリーディングフレームにおいて、例えばｇｐ１６０のｇｐ１２０及びｇｐ４１への、翻訳後処理の原因となるウイルスプロテアーゼがコードされ、ｅｎｖはエンベロープタンパク質であり、ｖｉｆはビリオン感染性因子であり、ｒｅｖはビリオンタンパク質発現の調節因子であり、ｎｅｇは陰性調節因子であり、ｖｐｕはビリオン生産性因子“ｕ”であり、ｔａｔは転写のトランス活性化因子であり、ｖｐｒはウイルスタンパク質ｒである）。これらの要素の各々の機能は記述されている。本発明の一態様においては、ＨＩＶ又はＳＩＶタンパク質をコードする遺伝子が転写プロモーターに直接連結される。ｅｎｖ遺伝子は大きな膜結合タンパク質ｇｐ１６０をコードし、これは翻訳後にｇｐ４１及びｇｐ１２０に改変される。ｇｐ１２０遺伝子は発現のためにサイトメガロウイルスプロモーターの制御の下に配置することができる。しかしながら、ｇｐ１２０は膜に結合せず、したがって、発現の際に細胞から分泌され得る。ＨＩＶは感染細胞内で休止状態に留まる傾向があるため、細胞結合ＨＩＶエピトープに対する免疫応答も生じることが望まれる。加えて、ウイルスの中和に最も有効な抗体応答を生成させるため、ウイルス感染によって生じるものに構造上類似する膜結合オリゴマーＥＮＶ抗原をワクチンが産生することが望ましい。この目的は、分泌ｇｐ１４０エピトープ（ｇｐ１４０＞ｇｐ１２０＋ｇｐ４１の外部ドメイン）又は細胞膜会合エピトープｇｐ１６０をインビボ発現させて免疫応答を開始させることにより、本発明において達成される。しかしながら、ｇｐ１６０の発現は、ｒｅｖが存在しない状態では、非スプライス遺伝子の核から搬出されないために抑制される。この系を理解するためには、ＨＩＶの生活環をさらに詳細に説明しなければならない。ＨＩＶの生活環において、宿主細胞の感染の際、ＨＩＶＲＮＡゲノムがプロウイルスＤＮＡに逆転写され、単一の転写単位として宿主のゲノムＤＮＡに組み込まれる。そのＬＴＲはプロモーターをもたらし、これがＨＩＶ遺伝子を５’から３’の方向（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）に転写して全ゲノムの非スプライス転写体を形成する。この非スプライス転写体はｍＲＮＡとして作用し、そこからｇａｇ及びｐｏｌが翻訳され、これに対してｅｎｖをコードする遺伝子の翻訳には制限付きのスプライシングが生じなければならない。調節遺伝子産生物ｒｅｖが発現するためには、このゲノムの設定においてはｒｅｖ及びｅｎｖが重複しているため、２以上のスプライシング現象が生じなければならない。ｅｎｖの転写が生じるためにはｒｅｖの転写が停止しなければならず、逆も同様である。加えて、核からの非スプライスＲＮＡの搬出にはｒｅｖが存在することが必要である。しかしながら、ｒｅｖがこのように作用するためには、ｒｅｖ応答性要素（ＲＲＥ）か転写体上に存在しなければならない［Ｍａｌｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ３３８：２５４−２５７（１９８９年）］。本発明のポリヌクレオチドワクチンにおいては、完全にスプライスされた遺伝子を提供することにより（すなわち：リーディングフレームの切り替え又は非コーディング領域の除去を必要としない、所望の遺伝子産生物の完全なオープンリーディングフレームの提供；当該技術分野における通常の技術を有する者は特定の遺伝子をスプライスしたときに生じるその遺伝子に幾らかの許容範囲が存在することを認識する；しかしながら、機能的なコーディング領域が得られる限りこれは許容される）、この特定のＨＩＶ遺伝子の必須スプライスが排除されている。したがって、態様の１つにおいては、各遺伝子産生物の断続的な発現が必要とならないようにｇｐ１６０の全コーディング領域がスプライスされる。本発明によって生じる二重の体液性及び細胞性免疫応答は、ＨＩＶがその集団内はもちろんのこと感染した個体においても突然変異を生成する傾向を考えると、ＨＩＶ感染の阻止に特に重要である。ＨＩＶに有効な防御ワクチンを処方するためには、例えばｇｐ１６０（ｅｎｖは、ＵＳヒト集団に蔓延する株であるＨＩＶ−１、分岐群Ｂ株全体にわたって約８０％保存されている）、ＨＩＶの主要中和標的、はもちろん、ｇｐ１６０の保存部分及びｇａｇによってコードされている内部ウイルスタンパク質に対して反応性の細胞毒性Ｔ細胞に対する多価抗体応答の両者を生成させることが望ましい。我々は、通常の実験室株；感染集団内に見出される優性主要ウイルス単離体；抗体エピトープを中和する交差株を暴露するように設計された変異ｇｐ１６０；及びｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子（ＨＩＶ単離体全体にわたって〜９５％保存されている）のような他の代表的なＨＩＶ遺伝子から選択されるｇｐ１６０遺伝子を含むＨＩＶワクチンを作製している。免疫不全状態に進んでいない事実上全てのＨＩＶ血清陽性患者が坑−ｇａｇＣＴＬを有し、これに対してこれらの患者の約６０％は交差株ｇｐ１６０特異的ＣＴＬを示す。しかしながら、ＡＩＤＳとして知られる疾患状態まで進行している感染個体に見出されるＨＩＶ特異的ＣＴＬの量は非常に少なく、このことは、交差株ＣＴＬ応答を誘発することができるという我々の発見の重要性を示している。我々のｅｎｖ及びｇａｇポリヌクレオチドワクチン構築体によって誘発された免疫応答はマウス及び霊長類において示される。ｅｎｖに対する抗体の産生をマウスにおいて監視することにより、所定の構築体が適切に免疫原性であること、すなわち、ワクチン接種された動物の高い割合が抗体応答を示すことを確認することができる。また、マウスは、我々の構築体によるＣＴＬ誘発を試験するのに適する安易な動物モデルをもたらし、したがって、特定の構築体がそのような活性を生成することが可能であるかどうかを評価するのに用いられる。サル（アフリカザル、ミドリザル、アカゲザル、チンパンジー）は、より大きな非げっ歯類動物における抗体評価のための霊長類を含むさらなる種をもたらす。また、これらの種は、マウス血清中に観察されるレトロウイルスに対する高水準の内在性中和活性のため、抗血清中和検定を行う上でマウスよりも好ましい。これらのデータは、チンパンジー／ＨＩＶ_IIIB追加抗原モデルにおける実験において、この系について既知の中和抗体の防御水準に基づく防御を達成するのに十分な免疫原性が我々のワクチンによって生じることを示す。しかしながら、現在科学団体において浮かび上がり、徐々に受け入れられている防御の定義は、ＨＩＶ感染の完全な防御を示す、いわゆる“無菌化免疫”から疾患の予防に常に移りつつある。この目的の幾つかの関連項目には、ＨＩＶ逆転写酵素活性、血清試料の感染性、血液中のｐ２４又は他のＨＩＶ抗原の濃度のＥＬＩＳＡ検定、増加するＣＤ４⁺Ｔ細胞濃度、及び生存率の拡大のいずれかによる測定での血液ウイルス力価の減少が含まれる［例えば、抗−ＨＩＶワクチンの効力の定義を進展させることの考察については、Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１８２０−１８２１，１９９３年を参照］。また、本発明の免疫原は、ＨＩＶの感染性（臨床的、主要野外）単離体に対する中和免疫応答も生成する。免疫学Ａ．ｅｎｖに対する抗体応答１．ｇｐ１６０およびｇｐ１２０ＥＬＩＳＡ検定を用いて、分泌ｇｐ１２０又は膜結合ｇｐ１６０のいずれかを発現するワクチンベクターがｅｎｖ特異的抗体の産生に有効であるかどうかを決定する。我々のワクチン接種ベクターによるｅｎｖ発現の初期イン・ビトロ特徴付けはｇｐ１６０形質移入細胞溶解物の免疫ブロット分析によりもたらされる。これらのデータは、形質移入細胞のｇｐ１６０発現を可視化する抗−ｇｐ４１及び抗−ｇｐ１２０モノクローナル抗体を用いて、ｇｐ１６０の発現を確認し定量化する。本発明の一態様においては、以下の理由によりｇｐ１６０がｇｐ１２０より好ましい：（１）初期ｇｐ１２０ベクターはマウスにおいては矛盾した免疫原性をもたらし、ミドリザルにおいては応答性が非常に乏しいか、もしくは非応答性であった；（２）ｇｐ１６０は、ｇｐ４１を抱合することによる約１９０アミノ酸残基の追加をもたらすことにより、追加の中和抗体はもちろんのことＣＴＬエピトープにも寄与する；（３）ｇｐ１６０の発現は４量体組立体及び全体の立体配座に関してウイルスｅｎｖにより類似し、これはオリゴマー依存性中和エピトープをもたらし得る；および（４）我々は、マウス、フェレット、及び非ヒト霊長類において中和抗体を産生させるための膜結合インフルエンザＨＡ構築体の成功［Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１７４５−１７４９；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．ら，ＤＮＡａｎｄＣｅ１１Ｂｉｏｌ．１２：７７７−７８３，１９９３年を参照］と同様に、抗−ｇｐ１６０抗体の産生が抗−ｇｐ１２０抗体の産生を上回ることを見出している。どの型のｅｎｖか好ましいか、又はｅｎｖサブ断片のカタテルが好ましいかどうかの選択は以下に概述される実験によって決定される。２．中和活性の存在及び広さサルに由来するＥＬＩＳＡ陽性抗血清を試験し、それが同種及び非同種ＨＩＶ株の両者を中和することを示す。３．Ｖ３対非Ｖ３中和抗体ｅｎｖＰＮＶについての主な目的は広範な中和抗体を生成することである。Ｖ３ループに対する抗体が非常に株特異的であることが今や示されており、かつこの応答の血清学が株の定義に用いられている。ａ．非Ｖ３中和抗体は、ＣＤ４結合の原因である、ｇｐ１２０内の不連続構造エピトープを主として認識するように思われる。このドメインに対する抗体はポリクローナルであり、おそらくはそのウイルスが細胞リガンドに結合することを必要とすることにより強要される、突然変異の抑止のために、より広範に交差中和する。免疫動物の血清により９６ウェルプレートに固定化されたＣＤ４へのｇｐ１２０の結合のブロックを試験するのにイン・ビトロ検定が用いられる。第２のイン・ビトロ検定は、プラスチック上に固定化された、選択されたＶ３ドメインに相当する合成ペプチドへの直接抗体結合を検出する。これらの検定は、我々の研究において用いられるいずれの動物の型に由来する抗血清にも適合し、我々のワクチンが産生する中和抗体の型を決定することはもちろん、ウイルス中和とのイン・ビトロ相関も提供する。ｂ．ｇｐ４１は少なくとも１つの主要中和決定基を有し、これは、広範に中和する２Ｆ５モノクローナル抗体(バイラル・テスティング・システムズ社(ＶｉｒａｌＴｅｓｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓＣｏｒｐ．)、テキサス・コマース・タワー、６００トラビス・ストリート、スート４７５０、ヒューストン、ＴＸ７７００２−３００５（ＵＳＡ）、又はバルトハイム・ファルマツォイチカ（ＷａｌｄｈｅｉｍＰｈａｒｍａｚｅｕｔｉｋａ）ＧｍｂＨ、ボルツマンガッセ１１、Ａ−１０９１ウィーン、オーストリアから商業的に入手可能）によって認識される高度に保存された直鎖エピトープと、ｇｐ４１のＮ−末端に位置する十分に保存された“融合タンパク質”ドメインを含む他の潜在的部位に相当する。上述の免疫ブロットによるｇｐ４１に対する抗体の検出に加えて、プラスチックに固定化されたこれらドメインが提示している合成ペプチドに結合する抗体のためのイン・ビトロ検定試験が用いられる。４．抗体応答の成熟ＨＩＶ血清陽性患者においては、中和抗体応答が主として抗−Ｖ３から、ｇｐ４１エピトープを含む、上述の（＃３）構造ｇｐ１２０ドメインエピトープを含むより広範に中和する抗体を含むものへと進行する。これらの型の抗体応答を時間及び引き続くワクチン接種の全過程両方にわたって監視する。Ｂ．ｅｎｖ及びｇａｇに対するＴ細胞反応性１．ＣＴＬ応答の生成細胞内で合成されるウイルスタンパタ質はＭＨＣＩ制限ＣＴＬ応答を生成する。これらのタンパク質の各々が血清陽性患者においてＣＴＬを誘発する。我々のワクチンもまた、マウスにおいてＣＴＬを誘発することが可能である。マウス株の免疫原性は、インフルエンザＮＰで示されるように、このような研究の助けとなる［Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１７４５−１７４９，１９９３年を参照］。幾つかのエピトープがＨＩＶタンパク質、ｅｎｖ、ｒｅｖ、ｎｅｆ及びｇａｇについてＢａｌｂ／ｃマウスにおいて定義されており、それによりイン・ビトロＣＴＬ培養及び細胞毒性検定が容易になっている。これらの遺伝子が形質移入された、ネズミ肥満細胞腫Ｐ８１５のような同系腫瘍系を、ＣＴＬはもちろんイン・ビトロ抗原特異的再刺激の標的を提供するのに用いることが有利である。ＭＨＣクラスＩ制限細胞毒性Ｔリンパ球を誘発することが可能な免疫原を定義する方法は公知であり［Ｃａｌｉｎ−Ｌａｕｒｅｎｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ１１（９）：９７４−９７８，１９９３年を参照；特に、Ｅｒｉｋｓｓｏｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ１１（８）：８５９−８６５，１９９３年を参照、ここでは、ＨＩＶｇｐ１２０上のＴ細胞活性化エピトープが霊長類においてマッピングされており、ｇ１２０アミノ酸１４２−１９２、２９６−３４３、３６７−４００、及び４１０−４５３を含む幾つかの領域か各々リンパ球増殖を誘発することが見出された；さらに、不連続領域２４８−２６９及び２７０−２９５がリンパ球増殖性であった。アミノ酸１５２−１７６を含むペプチドもＨＩＶ中和抗体を誘発することが見出された］、これらの方法は、本発明のＰＮＶに含めるための免疫原性エピトープの同定に用いることができる。あるいは、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、プロテアーゼ、又はｇａｇをコードする遺伝子全体を用いることができる。この主題についてさらに再検討するには、例えば、Ｓｈｉｒａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１４８：１６５７−１６６７，１９９２年；Ｃｈｏｐｐｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１４７：５６９−５７４，１９９１年；Ｃｈｏｐｐｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１４７：５７５−５８３，１９９１年；Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８：８７６−８８４，１９９１年を参照のこと。ここで用いられているように、Ｔ細胞エフェクター機能は、成熟Ｔ細胞表現型、例えば、細胞毒性、Ｂ細胞活性化のためのサイトカイン分泌、及び／又はマクロファージ及び好中球の補充もしくは刺激に関連する。２．Ｔ_H活性化の測定ワクチン接種動物から誘導される脾臓細胞培養物を、組換えタンパク質又はペプチドエピトープのいずれかを添加することによる特異的抗原の記憶復活について、試験する。付随する脾臓抗原提示細胞ＡＰＣによって提示される、このような抗原によるＴ細胞の活性化を、これらの培養物の増殖又はサイトカイン産生により監視する。サイトカイン産生のパターンはまた１型又は２型としてのＴ_H応答の分類を可能にする。ドメインＴ_H２応答は免疫無防備状態の血清陽性患者における細胞性免疫の排除と相関するように思われるため、患者において所定のＰＮＶによって生じる応答の型を定義することが可能であり、生じる免疫応答の操作を可能にする。３．遅延型過敏症（ＤＴＨ）ｉ．ｄ．注射の後のウイルス抗原に対するＤＴＨは、細胞性の主としてＭＨＣＩＩ制限性の免疫を示すものである。組換えＨＩＶタンパク質及び既知エピトープの合成ペプチドを商業的に入手することが可能性であるため、ＤＴＨ応答はこれらの試薬を用いてワクチン接種された脊椎動物において容易に決定され、したがって、細胞性免疫の誘発についてのさらなるイン・ビホ相関がもたらされる。防御上述の免疫学的研究に基づいて、我々のワクチンが脊椎動物において毒性ＨＩＶによる攻撃に対して有効であると断言することができる。これらの研究は、これらの動物をＰＮＶ構築体、又はｇｐ１６０_IIIB、ｇａｇ_IIIB、ｎｅｆ_IIIB及びＲＥＶ_IIIBを含むＰＮＶ構築体のカクテルで十分にワクチン接種した後に、ＨＩＶ_IIIB／チンパンジーウイルス投与モデルにおいてなされる。このＩＩＩＢ株は、この株の致死量のチンパンジー力価が確立されているため、これに関しては有用である。しかしながら、ＨＩＶのあらゆる株及び所定の株に特異的であり、又は非同種エピトープを用いる同じ研究が考えられる。第２のワクチン接種／ウイルス投与モデルは、チンパンジーに加えて、ｓｃｉｄ−ｈｕＰＢＬマウスである。このモデルは、ヒトリンパ球免疫系、及びマウス宿主におけるＨＩＶ投与が続く我々のワクチンの試験を可能にする。この系は、あらゆるＨＩＶ株での使用に容易に適合し、かつＨＩＶの主要野外単離体の複数の株に対する防御の証拠をもたらすため有利である。第３のウイルス投与モデルはハイブリッドＨＩＶ／ＳＩＶウイルス（ＳＨＩＶ）を用いる。そのうちの幾つかはアカゲザルに感染し、結果として死に至らしめる免疫不全症に導くことが示されている［Ｌｉ，Ｊ．ら，Ｊ．ＡＩＤＳ５：６３９−６４６，１９９２年を参照］。アカゲザルに我々のポリヌクレオチドワクチン構築体をワクチン接種することにより、引き続く致死量のＳＨＩＶ投与に対する防御が生じる。ＰＮＶ構築体の要約ＨＩＶ及び他の遺伝子を、ポリヌクレオチドワクチン接種に対して最適化されている発現ベクターにライゲートする。転写プロモーター、免疫原エピトープ、転写ターミネーター、細菌複製起点及び抗生物質耐性遺伝子の必須要素を残して、本質的に全ての外来性ＤＮＡを除去する。ｅｎｖ及びｇａｇのようなＨＩＶ後期遺伝子の発現はｒｅｖ依存性であり、ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）がウイルス遺伝子転写体上に存在することを必要とする。ｇｐ１２０の分泌形態は、ｒｅｖが存在しない状態において、ｔＰＡ（組織型プラスミノーゲン活性化因子）に由来するもののような異種リーダー、好ましくは、高度に発現した哺乳動物タンパク質において見出されるもののようなリーダーペプチド、例えば免疫グロブリンリーダーペプチド、でｇｐ１２０リーダーペプチドを置換することにより生成させることができる。我々は、形質移入細胞（ＲＤ、ヒト横紋筋肉腫系）において分泌ｇｐ１２０を効率的に発現するＶ１ＪｎｓにｔＰＡ−ｇｐ１２０キメラ遺伝子を挿入している。モノシストロンｇｐ１６０は、ｒｅｖ発現ベクターを加えることなしには、形質転換によっていかなるタンパク質をも産生しない。代表的な構築体成分には以下のものが含まれる（これらに限定されるものではない）１．ｔＰＡ−ｇｐ１２０_MN；２．ｇｐ１６０_IIIB；３．ｇａｇ_IIIB：抗−ｇａｇＣＴＬ用；４．ｔＰＡ−ｇＰ１２０_IIIB；５．ｔＰＡ−ｇｐ１４０６．構造的な突然変異：Ｖ１、Ｖ２、及び／又はＶ３ループ欠失又は置換を有するｔＰＡ−ｇＰ１６０；７．ＨＩＶ以外の病原体によって発現される抗原、例えば、これらに限定されるものではないか、インフルエンザウイルス核タンパク質、赤血球凝集素、マトリックス、ノイラミニダーゼ、及び他の抗原性タンパタ質；単純ヘルペスウイルス遺伝子；ヒトパピローマウイルス遺伝子；結核抗原；Ａ、Ｂ、又はＣ型肝炎ウイルス抗原をコードする遺伝子。引き続くウイルス投与に対するポリヌクレオチドＨＩＶ免疫原の防御効率は、本発明の非複製プラスミドＤＮＡでの免疫により示される。これは、感染性因子が含まれず、ウイルス粒子の組立体を必要とせず、かつ決定基の選択が可能であることから有利である。さらに、ｇａｇ及びプロテアーゼ及び幾つかの他のウイルス遺伝子産生物の配列がＨＩＶの様々な株の間で保存されているため、そのクローン化遺伝子が得られた株と同種であるＨＩＶの毒性株はもちろん、それとは異種の株による引き続くウイルス投与に対する防御が可能である。ｇｐ１６０をコードするＤＮＡ発現ベクターをｉ．ｍ．注射することにより、引き続くウイルス投与に対する相当程度の防御免疫が生じる。特に、ｇｐ１６０特異的抗体及び主要ＣＴＬが生じる。保存されているタンパク質に対する免疫応答は、可変性エンベロープタンパク質が抗原的シフト及びドリフトするにもかかわらず、有効であり得る。ＨＩＶ遺伝子産生物の各々がある程度の保存を示し、かつＣＴＬが細胞内発現及びＭＨＣ処理に応答して生じるため、多くのウイルス遺伝子がｇｐ１６０について達成されるものに類似する応答を生じるものと断言できる。このように、発現ベクターにおいてクローン化され、かつ配列決定された接合物によって示されるように、これらの遺伝子の多くが、これらの構築体が利用可能な形態の免疫原作用因子であるようにクローン化されている。本発明は、自己複製作用因子又はアジュバントを必要とすることなく交差株防御免疫を誘発するための手段を提供する。加えて、本発明のポリヌクレオチドでの免疫はいくつかの他の利点を提供する。このワクチン接種のアプローチは、ＣＤ８⁺ＣＴＬ応答が感染性作用因子と腫瘍の両方の病態生理学的処理にとって重要である［Ｋ．Ｔａｎａｋａら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，３５９（１９８８年）］ため、この両者に適用可能であるはずである。したがって、形質転換プロセスにとって重要なタンパク質に対する免疫応答の誘発は癌防御又は免疫治療の有効な手段であり得る。ウイルスタンパク質及びヒト成長ホルモンＤＮＡを注射した後に発現するタンパク質に対する高力価抗体の産生は、これが、保存された抗原を標的とする細胞毒性Ｔリンパ球ワクチンとは別に、もしくはそれと組み合わせて、抗体ベースのワクチンを作製する安易かつ非常に有効な手段であることを示唆する。ＤＮＡ構築体の産生及び精製の容易さは好都合なことにタンパク質精製の伝統的な方法に匹敵し、したがって、組み合わせワクチンの生成を容易にする。したがって、例えば、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、又は他のあらゆるＨＩＶ遺伝子をコードする複数の構築体を調製し、混合し、かつ同時投与することができる。ＤＮＡ注射の後にタンパク質の発現が維持されるため、Ｂ及びＴ細胞の記憶の持続が高められ、それにより長期間持続する体液性及び細胞媒介性免疫が生じ得る。ＤＮＡ構築体を調製し、かつ精製するための分子生物学の標準技術により、本発明のＤＮＡ免疫原の調製が可能となる。したがって、分子生物学の標準技術は本発明の生成物の生成に十分なものではあるが、ここに開示される特定の構築体は、驚くべきことに、これまで標準的な不活性化全ウイルス又はサブユニットタンパク質ワクチンでは達成することができなかった結果である交差株及び主要ＨＩＶ単離体の中和を生じる新規ポリヌクレオチド免疫原を提供する。ワクチンレシピエントに導入しようとする発現可能なＤＮＡ又は転写されたＲＮＡの量は、用いられる転写及び翻訳プロモーターの強度及び発現する遺伝子産生物の免疫原性に依存する。一般には、約１ｎｇないし１００ｍｇ、好ましくは約１０μｇないし３００μｇの免疫学的もしくは予防的有効量が筋肉組織に直接投与される。皮下注射、皮内導入、皮膚を通す圧入、及び他の投与様式、例えば、腹腔内、静脈内、又は吸入送達も期待される。追加ワクチン接種を施すことも期待される。ＨＩＶポリヌクレオチド免疫原をワクチン接種した後、ｇｐ１６０、ｇ１２０、及びｇａｇ遺伝子産生物のようなＨＩＶタンパク質免疫原で追加免疫することも考慮される。インターロイキン− １２タンパク質又はＧＭ−ＣＳＦ又は類似のタンパク質を、単独でもしくは組み合わせて、本発明のＰＮＶの非経口導入と同時にもしくはそれに続いて、非経口投与する、例えば、静脈内、筋肉内、皮下又は他の投与手段で投与することも有利である。このポリヌクレオチドは裸であってもよく、すなわち、あらゆるタンパク質、アジュバント又はレシピエントの免疫系に衝撃を与える他の作用因子と会合していなくともよい。この場合、ポリヌクレオチドは生理学的に許容し得る溶液、例えば、これらに限定されるものではないが、無菌生理食塩水又は無菌緩衝生理食塩水中にあることが望ましい。あるいは、このＤＮＡはリポソーム、例えば、レシチンリポソームもしくは当該技術分野において公知の他のリポソームと、ＤＮＡ−リポソーム混合物として会合していてもよく、又は当該技術分野において免疫応答を高めることが知られるアジュバント、例えば、タンパク質もしくは他の担体と会合していてもよい。細胞のＤＮＡ取り込みを補助する作用因子、例えば、これに限られるものではないが、カルシウムイオンも有利に用いることができる。これらの作用因子は、一般にここでは、形質移入促進試薬及び薬学的に許容し得る担体と呼ばれる。ポリヌクレオチドが被覆されている微小弾丸を被覆するための技術は当該技術分野において公知であり、同様に本発明に関連して有用である。以下の例は説明として提示されるものであり、いかなる方法においても本発明を限定することを意図するものではない。実施例１材料の説明ベクターｐＦ４１１及びｐＦ４１２：これらのベクターは、Ｒ．Ｇａｌｌｏの実験室において構築されたベクターｐＳＰ６２からサブクローン化した。ｐＳＰ６２はバイオテック・リサーチ・ラボラトリーズ社（ＢｉｏｔｅｃｈＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）から入手可能な試薬である。ｐＳＰ６２は、ラムダＨＸＢ２からサブクローン化したＨＸＢ２ゲノムの１２．５ｋｂＸｂａＩ断片を有する。ｐＳＰ６２をＳａｌＩ及びＸｂａＩ消化することによりＨＸＢ２断片：５’−ＸｂａＩ／ＳａｌＩ、６．５ｋｂ及び３’−ＳａｌＩ／ＸｂａＩ、６ｋｂが生じる。これらのインサートをｐＵＣ１８のＳｍａＩ及びＳａｌＩ部位にサブクローン化することによりｐＦ４１１（５’−ＸｂａＩ／ＳａｌＩ）及びｐＦ４１２（３’−ＸｂａＩ／ＳａｌＩ）が生じる。ｐＦ４１１はｇａｇ／ｐｏｌを含み、ｐＦ４１２はｔａｔ／ｒｅｖ／ｅｎｖ／ｎｅｆを含む。レプリゲン（ｒｅｐｌｉｇｅｎ）試薬組換えｒｅｖ（ＩＩＩＢ）、＃ＲＰ１０２４−１０組換えｇｐ１２０（ＩＩＩＢ）、＃ＲＰ１００１−１０抗−ｒｅｖモノクローナル抗体、＃ＲＰ１０２９−１０抗−ｇｐ１２０ｍＡＢ、＃１ｃ１、＃ＲＰ１０１０−１０ＡＩＤＳ研究及び参照試薬プログラム抗−ｇｐ４１ｍＡＢハイブリドーマ、Ｃｈｅｓｓｉｅ８、＃５２６この方策は、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）並びにＨＩＶ、主としてＨＩＶｇａｇ（〜９５％保存）及びｅｎｖ（ｇｐ１６０又はｇｐ１２０；７０−８０％保存）遺伝子産生物に対する中和抗体応答の両者を誘発するように設計されている。抗−ｅｎｖ及び抗−ｇａｇＣＴＬ応答の重要性が、これらの細胞性免疫の開始と中和抗体が出現する前に生じる感染後の一次ウイルス血症のクリアランスとが知られているように併行していることにより、疾患のない状態の維持におけるＣＴＬの役割と同様、強調されるか、ｇｐ１６０はＨＩＶ粒子上の既知の中和抗体エピトープのみを含む。ＨＩＶはその遺伝的多様性で名高いため、我々は、高度に保存されたｇａｇ遺伝子が広範な交差株ＣＴＬ応答を生成するはずではあるが、臨床的単離体及びｇｐ４１（〜９０％保存）から誘導される幾つかの代表的なｅｎｖ遺伝子を含めることにより、より幅の広い中和抗体が得られることを期待している。実施例２ＨＩＶ後期遺伝子産生物の異種発現ｅｎｖ及びｇａｇのようなＨＩＶ構造遺伝子は、完全長タンパク質を産生するために、ＨＩＶ調節遺伝子ｒｅｖの発現を必要とする。我々は、ｇａｇのｒｅｖ依存性発現が低水準のタンパク質を生じ、ｒｅｖそれ自体が細胞にとって毒性であり得ることを見出している。我々はイン・ビトロでｇｐ１６０の比較的高水準のｒｅｖ依存性発現を達成したけれども、このワクチンはｒｅｖ／ｇｐ１６０ＤＮＡでのイン・ビボ免疫化の後のｇｐ１６０に対する低水準の抗体しか誘発しなかった。これは、ｒｅｖの既知細胞毒性効果に加えて、数百の核を有する筋小管においてｒｅｖ機能を得ることの増加した困難性（ｇａｇ又はｅｎｖタンパク質の発現が生じるには、ｒｅｖタンパク質がｒｅｖ依存性転写体と同じ核内にあることが必要である）の結果生じるものと思われる。しかしながら、ｅｎｖ遺伝子の選択された改変によりｒｅｖ非依存性発現を得ることが可能である。これらのプラスミドのワクチンとしての利用は評価中である。一般に、我々のワクチンは、ＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーター、ＢＧＨポリアデニル化部位、及びｐＵＣ主鎖を含んでなる我々の一般化されたワクチン接種ベクターＶ１Ｊｎｓ内での発現を最適化するため、主としてＨＩＶ（ＩＩＩＢ）ｅｎｖ及びｇａｇ遺伝子を用いている。いかに大きな遺伝子セグメントが用いられるかに依存して（例えば、ｇｐ１２０対ｇｐ１６０）ｒｅｖ依存性発現の効率を変化させることは、ｅｎｖについて、その本来の分泌リーダーペプチドを組織特異的プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）遺伝子のものと置換し、ＣＭＶイントロンＡを有するＣＭＶＩＥプロモーターの後ろの得られたキメラ遺伝子を発現させることにより達成することができる。ｔＰＡ−ｇｐ１２０がこの方式で構築された分泌ｇｐ１２０ベクターの例であり、これはワクチン接種マウス及びサルにおいて抗−ｇｐ１２０免疫応答を誘発するのに十分作用する。膜固定化タンパク質が、分泌されたタンパク質に比較してより多量の（及び、おそらくは、ＨＩＶ中和に対してより特異的な）抗体応答を誘発し得、また追加の免疫エピトープを提供するという報告のため、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０及びＶ１Ｊｎｓ−ｒｅｖ／ｇｐ１６０を調製した。ｔＰＡ−ｇＰ１６０ベクターは、発現の水準はｒｅｖ／ｇｐ１６０、ｒｅｖ依存性ｇｐ１６０発現プラスミドで得られるものよりも非常に低いものの、形質移入細胞の免疫ブロット分析によって示されるように、ｒｅｖを添加することなく、検出可能な量のｇｐ１６０及びｇｐ１２０を産生した。これは、おそらく、ｇｐ１６０転写体にｒｅｖ依存性を付与する阻害領域（ＩＮＳと呼ばれる）がｇｐ４１のＣＯＯＨ−末端を含むｇｐ１６０内の複数の部位にあるためである（ｇｐ１４３構築体方策の模式図については図１を参照）。ｔＰＡ−ｇｐ１６０のＣＯＯＨ−末端が切りつめられた形態、ｔＰＡ−ｇｐ１４３についてベクターを調製した。これは、これらの阻害配列を除去することによりｅｎｖの発現水準全体を増大させるために設計された。また、このｇｐ１４３ベクターは、細胞表面ではなくリソソームへの膜タンパク質の転換を生じることが知られるペプチドモチーフ（例えば、ｌｅｕ−ｌｅｕ）を含む細胞内ｇｐ４１領域も取り除く。したがって、ｇｐ１４３は、完全長ｇｐ１６０と比較してｅｎｖタンパク質の発現（ｒｅｖ依存性を低下させることにより）及び細胞表面へのタンパク質の輸送効率の両者を高めることが期待され、ＤＮＡワクチン接種の後の抗−ｇｐ１６０抗体をより誘発することができよう。ｔＰＡ−ｇＰ１４３を、発現のさらなる阻害配列を除去するために、ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）配列（３５０ｂｐ）のさらなるサイレント突然変異により、さらに改変した。この構築体ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥは、２つの形態、ｇｐ１２０／４１のタンパク分解開裂部位の除去（形態Ａ）又は保持（形態Ｂ）のいずれかで調製した。両形態は、ワクチニアにおいて発現した開裂不可能なｇｐ１６０を用いるマウスのワクチン接種が開裂可能な形態よりも非常に高い水準のｇｐ１６０に対する抗体を誘発したという報告のために調製した。細胞形質移入体におけるｇｐ１６０／ｇｐ１２０の発現の定量的ＥＬＩＳＡを、これらのベクターの相対的発現可能性を決定するために開発した。２９３細胞のイン・ビトロ形質移入、続いて細胞会合対分泌／放出ｇｐ１２０の定量を行うことにより、以下の結果を得た：（１）ｔＰＡ−ｇＰ１６０は、細胞内対細胞表面への輸送で同様の特性を保持しつつ、ｒｅｖ／ｇｐ１６０よりも５− １０倍少ないｇｐ１２０を発現した；（２）ｔＰＡ−ｇｐ１４３は、低水準の細胞会合ｇｐ１４３で、ｒｅｖ／ｇｐ１６０よりも３−６倍多くｇｐ１２０を分泌し、ｇｐ１６０の細胞質のテールが、この配列を部分的に欠失させることにより解決することができる、ｇｐ１６０の細胞内滞留を引き起こすことが確認される；及び（３）ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥＡ及びＢは、形態Ａについてタンパク分解の除去が確認されたものの、親のｔＰＡ−ｇＰ１４３よりも〜１０倍高いタンパタ質の発現水準をもたらした。図４は要点（１）−（３）を支持する代表的なデータを示す。このように、我々のｒｅｖ非依存性発現を増加させる方策は、発現全体の段階的な増加と共に、膜固定化ｇｐ１４３のリソソームから細胞表面への再方向付けも与える。異なるウイルス株の間に幾つかの抗原性の相違が存在する場合、様々なウイルス単離体から誘導されるｇｐ１２０配列を、ＮＨ₂−末端（ｔＰＡリーダー）又はＣＯＯＨ−末端（ｇｐ４１）のいずれかにこれらの改変を含むベクターカセットに挿入することが可能であるはずであることに注意することが重要である。換言すると、これは、様々な主要ウイルス単離体から誘導されるｇｐ１２０を挿入することにより容易に改変して臨床的に関連するワクチンを得ることができる遺伝的構築体である。これらの発現方策をワクチン用途に関連するウイルスに適用し、我々のアプローチの普遍性を確認するため、我々は主要ＨＩＶ単離体（ノースアメリカンコンセンサスＶ３ペプチドループ；マクロファージ向性及び非融合細胞誘発性表現型を含む）から誘導されるｔＰＡ−ｇｐ１２０ベクターをも調製した。このベクターは形質移入２９３細胞でｇｐ１２０の高い発現／分泌をもたらし、かつマウスにおいて抗−ｇｐ１２０抗体を誘発し、これはそれが機能的形態でクローン化されていたことを示す。主要単離体ｇｐ１６０遺伝子も実験室株から誘導されるｇｐ１６０と同じ方法での発現に用いる。実施例３ＨＴＶ−１ｅｎｖポリヌクレオチドワクチンに対する免疫応答：ｇｐ１２０ＤＮＡワクチンを接種したミドリザル（ＡＧＭ）及びアカゲザル（ＲＨＭ）は２−３回のワクチン接種の後低水準の中和抗体を示し、これは追加ワクチン接種では増加させることができなかった。これらの結果は、オリゴマーｇｐ１６０かおそらくはｇｐ１２０単量体よりも中和抗体の誘発に関連する標的抗原であるというＨＩＶワクチン分野での認識（Ｍｏｏｒｅ及びＨｏ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７巻：８６３頁（１９９３年））の増加と共に、ｇｐ１６０ベースのベクター（上記参照）の有効な発現の獲得に焦点を当てる方向に我々を導いている。また、マウス及びＡＧＭに一次単離体誘導ｔＰＡ−ｇｐ１２０ワクチンをワクチン接種した。これらの動物は５００−５０００の範囲の抗−Ｖ３ペプチド（相同性配列を用いる）逆最終点（reciprocal endopoint）抗体力価を示し、このワクチンの設計が臨床的に関連するウイルス単離体に対して機能的であることを示す。ｇｐ１６０ベースのワクチン、ｒｅｖ−ｇｐ１６０及びｔＰＡ−ｇｐ１６０はマウス及び非ヒト霊長類において一貫して抗体応答を誘発することに失敗し、又は低抗体力価を生じた。ｔＰＡ−ｇｐ１４３プラスミドを用いた我々の最初の結果は、２回のワクチン接種の後、マウス及びＡＧＭにおいて＞１０³の幾何平均力価を生じた。これらのデータは、我々が、発現水準を高めることによりｇｐ１６０様ワクチンの免疫原性を大きく改善していることを示す。この構築体を、ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥＡ及びＢベクターに加えて、抗体応答、特にウイルスの中和について特徴付けを続ける。同様に、ｇｐ１２０ＤＮＡのワクチン接種は、ＴＨ−１様サイトカイン分泌プロフィール（すなわち、ＩＬ−４をほとんど、もしくは全く伴わないｇ−インターフェロン及びＩＬ−２産生）を有する試験した全てのリンパ性区画（脾臓、血液、鼠径部、腸間膜及び腸骨節）において強力なヘルパーＴ細胞応答を生じた。これらのサイトカインは一般に強力な細胞性免疫を促進し、ＨＩＶ血清陽性患者の疾患がない状態の維持に関連付けられている。リンパ節は、ウイルスが血液中に未だ検出することができないときでさえ、ウイルスの大貯蔵部を有する、ＨＩＶ複製の主要部位であることが示されている。我々のＤＮＡワクチンで示されているような、様々なリンパ部位に抗−ＨＩＶ免疫応答を誘発することが可能なワクチンは、最初の感染の後のリンパ管のコロニー形成の成功を妨げる手助けをし得る。前に述べられているように、我々は、以下の目的の実現がこのプログラムの成功の機会を最大化するのに必須であると考える：（１）霊長類においてより強い中和抗体応答を生成することが可能なｅｎｖベースのべクター；（２）霊長類においてＣＴＬ及びヘルパーエフェクター機能によって特徴付けられる強力なＴリンパ球応答を誘発するｇａｇ及びｅｎｖベクター；（３）臨床的に関連するＨＩＶ−１株に由来するｅｎｖ及びｇａｇ遺伝子の我々のワクチンにおける使用並びにそれらが誘発する免疫学的応答、特に主要単離体の中和の特徴付け；（４）適切に最適化されたワクチンを用いる、動物ウイルス投与モデル、例えば、チンパンジー／ＨＩＶ（ＩＩＩＢ）又はアカゲザル／ＳＨＩＶにおける防御の実証；並びに（５）臨床用途に適する免疫応答の持続期間の決定。これらの目的のうちの最初の３つについては大きな進歩が見られ、ｇｐ１６０及びｇａｇに対する我々の最近のワクチン接種構築体がこれらの初期結果を改善するかどうかを決定するための実験が進行中である。実施例４ワクチン生成のためのベクターＡ．Ｖ１Ｊｎｅｏ発現ベクター、配列番号１：大規模発酵器においてアンピシリンを用いることができない可能性があるため、Ｖ１Ｊを有する細菌の抗生物質選別に用いられるａｍｐ^rを除去する必要があった。ＳｓｐＩ及びＥａｍ１１０５Ｉ制限酵素を用いる消化により、Ｖ１ＪのｐＵＣ主鎖からのａｍｐ^rを除去した。残りのプラスミドをアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。トランスポゾン９０３から誘導され、かつｐＵＣ４Ｋプラスミドに含まれる商業的に入手可能なｋａｎ^r遺伝子をＰＳｔＩ制限酵素を用いて切り出し、アガロースゲル電気泳動により精製して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。この断片をＶ１Ｊ主鎖にライゲートし、Ｖ１Ｊｎｅｏ＃１及び３と命名される、ｋａｎ^r遺伝子をいずれかの方向に有するプラスミドを誘導した。これらのプラスミドの各々を制限酵素消化分析、接合領域のＤＮＡ配列決定により確認し、これらが同様の量のプラスミドをＶ１Ｊとして産生することが示された。これらのＶ１Ｊｎｅｏベクターは、異種遺伝子産生物の発現もＶ１Ｊに匹敵するものであった。Ｖ１Ｊにおけるａｍｐｒと同じ方向にｋａｎ^r遺伝子を含むＶ１Ｊｎｅｏ＃３を発現構築体として任意に選択し、以下これをＶ１Ｊｎｅｏと呼ぶ（配列番号１）。Ｂ．Ｖ１Ｊｎｓ発現ベクター：組み込み研究を容易にするため、Ｖ１ＪｎｅｏにＳｆｉＩ部位を加えた。商業的に入手可能な１３塩基対ＳｆｉＩリンカー（ニュー・イングランド・バイオラブス（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ））をこのベクターのＢＧＨ配列内のＫｐｎＩ部位に加えた。Ｖ１ＪｎｅｏをＫｐｎＩで直線化し、ゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化して平滑末端化ＳｆｉＩリンカーにライゲートした。制限マッピングによりクローン単離体を選択し、リンカー全体の配列決定により確認した。この新たなベクターをＶ１Ｊｎｓと命名した。（ＳｆｉＩを有する）Ｖ１Ｊｎｓにおける異種遺伝子の発現は（ＫｐｎＩを有する）Ｖ１Ｊｎｅｏにおける同じ遺伝子の発現に匹敵するものであった。Ｃ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ：分泌及び／又は膜タンパク質に異種リーダーペプチド配列を付与するため、ヒト組織特異的プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）リーダーを含むようにＶ１Ｊｎを改変した。２つの合成相補的オリゴマーをアニールした後、ＢｇｌＩＩ消化したＶ１Ｊｎにライゲートした。センス及びアンチセンスオリゴマーは、５’ −ＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣＧＡ−３’（配列番号２）、及び５’−ＧＡＴＣＴＣＧＣＴＧＧＧＣＧＡＡＡＣＧＡＡＧＡＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＣＴＣＴＣＴＴＣＡＴＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＴ−３’（配列番号３）であった。センスオリゴマーにおいてコザック配列に下線が付されている。これらのオリゴマーはＢｇｌＩＩ開裂配列へのライゲートに適合する突出塩基を有する。ライゲートの後、下流ＢｇｌＩＩは引き続くライゲートのために保持しながら、上流ＢｇｌＩＩ部位を破壊した。接合部及びｔＰＡリーダー配列全体をＤＮＡ配列決定により確認した。加えて、我々のコンセンサス最適化ベタターＶ１Ｊｎｓ（＝ＳｆｉＩ部位を有するＶ１Ｊｎｅｏ）と一致させるため、ＫｐｎＩ部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、次いでＳｆｉＩリンカー（カタログ＃１１３８、ニュー・イングランド・バイオラブス）と共にライゲートすることにより、ＳｆｉＩ制限部位をＶ１Ｊｎ−ｔＰＡのＢＧＨターミネーター領域内のＫｐｎＩ部位に配置した。この改変を、制限消化及びアガロースゲル電気泳動により確認した。実施例５Ｉ．ＨＩＶｅｎｖワクチン構築体：分泌ｅｎｖ誘導抗原（ｇｐ１２０及びｇｐ１４０）を産生するワクチンｇｐ１２０のようなｒｅｖ依存性ｅｎｖ遺伝子の発現を以下のように行った：ｇｐ１２０を、ＨＩＶのＭＮ株から、本来のリーダーペプチド配列と共に（Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１２０）、又は本来のリーダーペプチドを置換する組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）リーダーペプチドと共に融合体として（Ｖ１Ｊｎｓ −ｔＰＡ−ｇｐ１２０）、ＰＣＲクローン化した。ｔＰＡ−ｇｐ１２０の発現はｒｅｖ非依存性であることが示されている［Ｂ．Ｓ．Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９巻，３９７９頁（１９９１年）；ｇｐ１２０遺伝子をｒｅｖ非依存性にする上で他のリーダー配列が同様の作用をもたらすことに注意すべきである］。これは、上述のベクターを用いて以下のｇｐ１２０構築体を調製することにより達成された。実施例６１２０ワクチン構築体：Ａ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ＨＩＶ_MNｇｐ１２０：ペプチドリーダー配列の最初の３０個のアミノ酸を除去し、かつＶ１Ｊｎｓ− ｔＰＡにクローン化してアミノ酸残基３０の後の残りのｇｐ１２０配列が続くｔＰＡリーダーペプチドからなるキメラタンパク質の作製を容易にするように設計されたオリゴマーを用いて、ＨＩＶＭＮｇｐ１２０遺伝子（メドイムン（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ））をＰＣＲ増幅した。この設計は、ｒｅｖ非依存性ｇｐ１２０発現及びこのプラスミドを有する細胞からの可溶性ｇｐ１２０の分泌を考慮するものである。用いられたセンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマーは、５’−ＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＴＧＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣ−３’（配列番号４）、及び５’−ＣＣＣＣＡＧＧＡＡＴＣＣＡＣＣＴＧＴＴＡＧＣＧＣＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＴＣＴＣ−３’（配列番号５）であった。翻訳停止コドンに下線が付されている。これらのオリゴマーは、センスオリゴマーのＢａｍＨＩの３’側に位置するＢｃｌＩ部位と共に、翻訳オープンリーディングフレームのいずれかの末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を含む。このＰＣＲ産生物をＢｃｌＩ、次いでＢａｍＨＩで連続的に消化し、ＢｇｌＩＩ消化されているＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡにライゲートした後、子ウシ腸アルカリホスファターゼ処理した。得られたベクターを配列決定してｔＰＡリーダーとｇｐ１２０コーディング領域との間のインフレーム融合を確認し、ｇｐ１２０の発現及び分泌を形質移入ＲＢ細胞の免疫ブロット分析により検証した。Ｂ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ＨＩＶ_IIIBｇＰ１２０：このベクターは、ＨＩＶＩＩＩＢ株をｇｐ１２０配列に用いたことを除いて、Ｉ．Ａ．に類似する。用いられたセンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマーは、それぞれ：５’−ＧＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＴＧＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣ−３’（配列番号６）、及び５’−ＣＣＡＣＡＴＴＧＡＴＣＡＧＡＴＡＴＣＴＴＡＴＣＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号７）であった。これらのオリゴマーは、インサートのいずれかの末端にＢｃｌＩ部位をもたらすことに加えて、３’末端のＢｃｌＩ部位のすぐ上流にＥｃｏＲＶをもたらす。５’末端ＢｃｌＩ部位は、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡのＢｇｌＩＩ部位にライゲートしてｔＰＡリーダー配列及びその本来のリーダー配列を伴わないｇｐ１２０をコードするキメラｔＰＡ−ｇｐ１２０遺伝子の作製を可能にする。ライゲーション産生物を制限消化及びＤＮＡ配列決定により確認した。実施例７１４０ワクチン構築体：これらの構築体は、本来のリーダーの代わりにｔＰＡリーダーを有するｔＰＡ −ｇｐ１２０と同様にＰＣＲにより調製したが、遺伝子を膜貫通ペプチドのＮＨ₂ −末端で直ちに終止することにより分泌抗原を産生するように設計した（計画されたカルボキシ末端アミノ酸配列＝ＮＨ₂−．．．．．ＴＮＷＬＷＹＩＫ−ＣＯＯＨ）［配列番号８］。ｇｐ１２０産生構築体とは異なり、ｇｐ１４０構築体はオリゴマー抗原を産生し、かつ２Ｆ５モノクローナル抗体によって定義されるＥＬＤＫＷＡ（配列番号５３）のような既知のｇｐ４１含有抗体中和エピトープを保持するべきである。ｇｐ１２０及びｇｐ４１の接合部のｇｐ１６０タンパク分解開裂部位が保持されているか（Ｂ）又は除去されているか（Ａ）に応じて２つの形態（Ａ又はＢ）で、Ｋｉｅｎｙら（Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．２巻：２１９−２５５頁（１９８８年））によって記述されるように適切なアミノ酸置換により構築体を調製した（野生型配列＝ＮＨ₂−．．．．．ＫＡＫＲＲＶＶＱＲＥＫＲ．．．．．ＣＯＯＨ（配列番号９）及び突然変異配列＝ＮＨ₂−．．．．．ＫＡＱＮＨＶＶＱＮＥＨＱ．．．．．ＣＯＯＨ（配列番号１０）、変異アミノ酸には下線が付されている）。Ａ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｍｕｔＲＲＥ−Ａ／ＳＲＶ−１３’− ＵＴＲ（ＨＩＶ−１_IIIBベース）：この構築体は、（最適化されたＲＲＥ−Ａセグメントを含む）ベクターＩＶＢからＡｖｒＩＩ／ＥｃｏＲＶセグメントを得るために、以下のセンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマーを用いてＰＣＲにより得た：５’−ＣＴＧＡＡＡＧＡＣＣＡＧＣＡＡＣＴＣＣＴＡＧＧＧＡＡＴＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＴＣＴＧＧ−３’（配列番号１１）、及び５’−ＣＧＣＡＧＧＧＧＡＧＧＴＧＧＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＡＴＡＴＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＡＴＴＴＧＴＴＡＴＧ−３’（配列番号１２）。サルレトロウイルス−１（ＳＲＶ−１、下記参照）から誘導される、合成遺伝子セグメントとして調製された３’−ＵＴＲを、ｇｐ１４０オープンリーディングフレームのすぐ３’側に導入されたＳｒｆＩ制限酵素部位に挿入した。このＵＴＲ配列は、ＨＩＶｅｎｖ及びｇａｇのｒｅｖ非依存性発現を容易にするものとして前に記述されている。Ｂ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｍｕｔＲＲＥ−Ｂ／ＳＲＶ−１３’− ＵＴＲ（ＨＩＶ−１_IIIBベース）：この構築体は、構築体ＩＶＣを出発物質として用いることによりｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いて、ＩＴＡに類似する。Ｃ．Ｖ１ＪｎＳ−ｔＰＡ−ｇｐ１４／ｏｐｔ３０−Ａ（ＨＩＶ−１_IIIBベース）：この構築体は、ＡｖｒＩＩ及びＳｒｆＩで制限酵素消化し、次いでｇｐ３０に相当するが翻訳に最適のコドンを含んでなる合成ＤＮＡセグメント（下記ｇｐ３２−ｏｐｔを参照）をライゲートすることにより、ＩＶＢから誘導した。このｇｐ３０−ｏｐｔＤＮＡは、ｇｐ３２−ｏｐｔから、以下のセンス及びアンチセンスオリゴマーを用いるＰＣＲ増幅により得た：それぞれ、５’−ＧＧＴＡＣＡＣＣＴＡＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧ−３’（配列番号１３）及び５’−ＣＣＡＣＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＡＴＧＴＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＡＴＧ−３’ （配列番号１４）。このＤＮＡセグメントをＡｖｒＩＩ及びＥｃｏＲＶ制限酵素で消化し、対応するＤＮＡセグメントを除去するためにＡｖｒＩＩ及びＳｒｆＩで消化したＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇ１４３／ｏｐｔ３２−Ａ（ＩＶＤ）にライゲートした。得られた生成物をライゲーション接合部のＤＮＡ配列決定及び免疫ブロット分析により検証した。Ｄ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ３０−Ｂ（ＨＩＶ−１_IIIBベース）：この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＩＩＣに類似する。Ｅ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔａｌｌ−Ａ：この構築体のｅｎｖ遺伝子は完全に最適コドンを含んでなる。その定常領域（Ｃ１、Ｃ５、ｇｐ３２）は、可変領域１−５に対応する追加合成ＤＮＡセグメントが翻訳に最適のコドンを含んでなる合成ＤＮＡセグメントを用いて挿入されている、ＩＶＢ、Ｄ、Ｈに記述されるものである（以下のＨＩＶ−１ＭＮＶ１−Ｖ５に基づく例を参照）。Ｆ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔａｌｌ−Ｂ：この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＩＩＥに類似する。Ｇ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔａｌｌ−Ａ（非ＩＩＩＢ株）：この構築体は、ＩＩＩＢ以外の株に由来するｅｎｖアミノ酸配列が可変（Ｖ１ −Ｖ５）領域全体を通しての最適コドン用法の決定に用いられることを除いて、上記ＩＩＥに類似する。Ｈ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔａｌｌ−Ｂ（非ＩＩＩＢ株）：この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＩＩＧに類似する。実施例８ｇｐ１６０ワクチン構築体：上述のｇｐ１６０タンパタ分解開裂部位に応じて２つの形態（Ａ又はＢ）で構築体を調製した。Ａ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｒｅｖ／ｅｎｖ：このベクターは、エクソン１のｔａｔコーディング領域全体がｒｅｖオープンリーディングフレームの初めまで欠失していることを除いて、上記Ｄ項に記述されるものの変種である。Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０ＩＩＩＢ（上記Ａ項を参照）をＰｓｔＩ及びＫｐｎＩ制限酵素で消化してｇｐ１６０遺伝子の５’領域を除去した。ＰＣＲ増幅を用いて、ＨＸＢ２ゲノムクローンに由来するｇｐ１６０の第１ＲＥＶエクソンからＫｐｎＩ部位までをコードするＤＮＡセグメントを得た。センス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマーは、それぞれ、５’−ＧＧＴＡＣＡＣＴＧＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣ−３’（配列番号１５）及び５’−ＣＣＡＣＡＴＣＡＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＴＧＡＣＣ− ３’（配列番号１６）であった。これらのオリゴマーは、それぞれ、ＤＮＡ断片の５’及び３’末端にＰＳｔＩ及びＫｐｎＩ制限酵素部位を付与する。得られたＤＮＡをＰＳｔＩ及びＫｐｎＩで消化し、アガロース電気泳動ケルから精製してＶ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０（ＰｓｔＩ／ＫｐｎＩ）にライゲートした。得られたプラスミドを制限酵素消化により検証した。Ｂ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０：ＨＩＶ_IIIbクローンＨＸＢ２から誘導されるＨＩＶ_IIIbゲノムの３’末端側半分を含むプラスミドｐＦ４１２から、ＰＣＲ増幅により、ＨＩＶ_IIIbｇｐ１６０をクローン化した。ＰＣＲのセンス及びアンチセンスは、それぞれ、５’−ＧＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＴＡＴＣＡＧＣ−３’（配列番号１７）、及び５’−ＣＣＡＣＡＴＴＧＡＴＣＡＧＡＴＡＴＣＣＣＣＡＴＣＴＴＡＴＡＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＣＣ−３’（配列番号１８）であった。コザック配列及び翻訳停止コドンには下線か付されている。これらのオリゴマーは、ｅｎｖ遺伝子の両端の翻訳オープンリーディングフレームの外側にＢｃｌＩ制限酵素部位を付与する。（ＢｃｌＩ消化部位はＢｇｌＩＩ消化部位とのライゲートに適合し、その後、両制限酵素に対する感受性は喪失する。ＢｃｌＩはｇｐ１６０のＰＣＲクローン化のために選択した。これは、この遺伝子がＢａｍＨＩ部位の他に内部ＢｇｌＩＩを含むためである）。このアンチセンスオリゴマーはまた、上述の他のＰＣＲ由来の遺伝子のためＢｃｌＩサイトの前にＥｃｏＲｖを挿入する。増幅したｇｐ１６０遺伝子をアガロースゲル精製し、ＢｃｌＩで消化して、ＢｇｌＩＩで消化され、かつ子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理されているＶ１Ｊｎｓにライゲートした。このクローン化遺伝子は約２．６ｋｂのサイズであり、Ｖ１Ｊｎｓとのｇｐ１６０の各接合部をＤＮＡ配列決定により確認した。Ｃ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ６０（ＨＩＶ−１_IIIBベース）：こベクターは、本来のリーダー配列を含まない完全長ｇｐ１６０をＰＣＲにより得たことを除いて、上記実施例１（Ｃ）に類似する。センスオリゴマーはＩ．Ｃ．において用いられたものと同じであり、アンチセンスオリゴマーは、５’− ＣＣＡＣＡＴＴＧＡＴＣＡＧＡＴＡＴＣＣＣＣＡＴＣＴＴＡＴＡＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＣＣ−３’（配列番号１９）であった。これらのオリゴマーは、インサートのいずれかの末端はもちろん、３’末端のＢｃｌＩ部位のすぐ上流のＥｃｏＲＶにもＢｃｌＩ部位を付与する。５’末端ＢｃｌＩ部位は、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡのＢｇｌＩＩ部位にライゲートして、ｔＰＡリーダー配列及びその本来のリーダー配列を含まないｇｐ１６０をコードするキメラｔＰＡ−ｇｐ１６０を作製することを可能にする。ライゲーション産生物を制限消化及びＤＮＡ配列決定により検証した。Ｄ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ６０／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ４１−Ａ（ＨＩＶ− １_IIIBベース）：この構築体はＩＶＨに基づくものであり、ｇｐ３２ではなくＣ５及びｇｐ４１について完全に最適化されたコドンセグメントを有し、ｔＰＡリーダーが続くｇｐ１２０のアミノ末端でＣ１を置換するさらなる最適化コドンセグメント（下記参照）を有する。この新たなＣ１セグメントは、接合Ｃ１／１４３を合成するために下記ＰＣＲ用オリゴマーを用いるＳＯＥＰＣＲにより、残りのｇｐ１４３セグメントに接合させた：５’−ＣＣＴＧＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＣＡＣＴＧＡＴＴＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＴＡＣＴＡＡＴＡＣ−３’（配列番号２０）。得られるｇｐ１４３遺伝子はＶ１−Ｖ５領域を除いて最適のコドンの使用を含み、Ｃ１及びＶ１の接合部に配置される、他のＨＩＶ遺伝子に由来する可変領域を挿入するための独自ＰｍｅＩ制限酵素部位を有する。Ｅ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ４１−Ｂ（ＨＩＶ_II _IBベース）：この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＩＩＩＤに類似する。ＦＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔａｌｌ−Ａ（ＨＩＶ−１_IIIBベース）：この構築体のｅｎｖ遺伝子は完全に上述の最適コドンを含んでなる。その定常領域（Ｃ１、Ｃ５、ｇｐ３２）はＩＩＩＤ、Ｅに記述されるものであり、これは（全ての完全に最適化されたｇｐ１６０に用いられる）カセットとして用いられ、これに対して、可変領域Ｖ１−Ｖ５は最適コドンを含んでなる合成ＤＮＡセグメントから誘導される。Ｇ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔａｌｌ−Ｂ：この構築体は、ｅｎｖタンパタ分解開裂部位が保持されていることを除いてＩＩＩＦに類似する。Ｈ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔａｌｌ−Ａ（非ＩＩＩＢ株）：この構築体は、ＩＩＩＢ以外の株に由来するｅｎｖアミノ酸配列が可変（Ｖ１ −Ｖ５）領域全体にわたる最適コドン用法の決定に用いられたことを除いて、上記ＩＩＩＦに類似する。Ｉ．１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐt ａｌｌ−Ｂ（非ＩＩＩＢ株）：この構築体は、ｅｎｖタンパク分開裂部位が保持されていることを除いて、ＩＩＩＨに類似する。実施例９ｇｐ１４３ワクチン構築体：これらの構築体は、上述の他のｔＰＡ含有構築体と同様に、本来のリーダーの代わりにｔｐＡを用いてＰＣＲにより調製したが、ＣＯＯＨ末端化膜結合ｅｎｖを産生するように設計した（計画された細胞内アミノ酸配列＝ＮＨ₂−ＮＲＶＲＱＧＹＳＰ−ＣＯＯＨ）。この構築体は、ｔＰＡ導入が付随するｅｎｖの発現の増加と、ｅｎｖの細胞内部分に対応する転写体又はペプチド領域が発現又はタンパク質安定性／細胞表面への輸送に負に衝撃を与え得る可能性を最少化することとを組み合わせる目的で設計した。上述のように、ｇｐ１６０タンパク分解開裂部位が除去されているか、又は保持されているかに応じて２つの形態（Ａ又はＢ）で構築体を調製した。ｇｐ１４３に対する切り詰めから得られる残留ｇｐ４１断片をｇｐ３２と呼ぶ。Ａ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３：この構築体は、以下のセンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマーで、プラスミドｐＦ４１２を用いるＰＣＲにより調製した：５’−ＧＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＴＧＴＧＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣ−３ ’（配列番号２１）、及び５’−ＣＣＡＣＡＴＴＧＡＴＣＡＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＡＧＧＧＴＧＡＡＴＡＧＣＣＣＴＧＣＣＴＣＡＣＴＣＴＧＴＴＣＡＣ−３’（配列番号２２）。得られたＤＮＡ断片は、ｅｎｖオープンリーディングフレームのすぐ３’側に位置するＳｒ−ｆＩ部位で消化されたＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ／ＢｇｌＩＩにクローン化するためのＢｃｌＩ制限部位をいずれかの末端に含む。構築体を、ライケーション接合部のＤＮＡ配列決定及び形質移入細胞の免疫ブロット分析により検証した（図８）。Ｂ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥ−Ａ：この構築体は、独自ＭｕｎＩ制限酵素部位及び上述の下流ＳｒｆＩ部位を用いるＤＮＡセグメントの切除により、ＩＶＡに基づくものであった。このセグメントはｇｐ１２０Ｃ５ドメイン及びｇｐ３２全体のタンパク質に相当する。ｇｐ１６０のｒｅｖ応答性要素（ＲＲＥＡ）の〜３５０ｂｐに対応する、翻訳に最適なコドンを含む合成ＤＮＡセグメントを、スプライス重複伸長（ＳＯＥ）ＰＣＲにより残りのｇｐ３２セグメントの接合し、これによりこれらの２つの断片の接合部にＡｖｒＩＩ制限酵素部位が創出された（しかしながら、アミノ酸配列に変化はない）。これらのＰＣＲ反応は、ｇｐ３２含有ドメインを生成させるため、それぞれ以下のセンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマーを用いて行った：５’−ＣＴＧＡＡＡＧＡＣＣＡＧＣＡＡＣＴＣＣＴＡＧＧＧＡＴＴＴＧＧＧＧＴＴＧＣＴＧＴＧＧ−３’（配列番号２３）及び５’−ＣＣＡＣＡＴＴＧＡＴＣＡＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＡＧＧＧＴＧＡＡＴＡＧＣＣＣＴＧＣＣＴＣＡＣＴＣＴＧＴＴＣＡＣ−３’［配列番号２４］（これは、ＩＶＡに対してアンチセンスオリゴマーとして用いられた）。突然変異ＲＲＥ（ｍｕｔＲＲＥ−Ａ）セグメントを、以下のセンスオリゴマー、５’−ＧＧＴＡＣＡＣＡＡＴＴＧＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＴＴＡＴＡＴＡＡＡＴＡＴＡＡＧ−３’（配列番号２５）及びｇｐ３２セグメントの作製に用いたアンチセンスオリゴマーを用いるＳＯＥＰＣＲにより、ｇｐ３２の野生型配列に接合した。得られた接合ＤＮＡセグメントをＭｕｎＩ及びＳｒｆＩ制限酵素で消化し、親のｇｐ１４３／ＭｕｎＩ／ＳｒｆＩ消化プラスミドにライゲートした。得られた構築体を、ライゲーション及びＳＯＥＰＣＲ接合部のＤＮＡ配列決定並びに形質移入細胞の免疫ブロット分析により検証した（図８）。Ｃ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥ−Ｂ：この構築体は、ｍｕｔＲＲＥ−Ａの代わりにｍｕｔＲＲＥ−Ｂ合成遺伝子セグメントを用いることによりｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いて、ＩＶＢに類似する。Ｄ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ａ：この構築体は、ＡｖｒＩＩ及びＳｒｆＩ制限酵素消化、次いでｇｐ３２に対応するが翻訳に最適なコドンを含んでなる合成ＤＮＡセグメント（下記ｇｐ３２ｏｐｔを参照）のライゲーションにより、ＩＶＢから誘導した。得られた産生物をライゲーション接合部のＤＮＡ配列決定及び免疫ブロット分析により検証した。Ｅ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ｂ：この構築体は、ＩＶＣを初期プラスミドとして用いることによりｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いて、ＴＶＤに類似する。Ｆ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ＳＲＶ−１３’−ＵＴＲ：この構築体は、シミアンレトロウイルス（ＳＲＶ−１、下記参照）から誘導された３’−ＵＴＲがｇｐ１４３オープンリーディングフレームのすぐ３’側に導入されたＳｒｆＩ制限酵素部位に挿入されたことを除いて、ＩＶＡに類似する。このＵＴＲ配列は、ＨＩＶｅｎｖ及びｇａｇのｒｅｖ非依存性発現を容易にするものとして前に記述されている。Ｇ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ３２Ａ：この構築体はＩＶＤに基づくものであり、Ｃ５及びｇｐ３２について完全に最適化されたコドンセグメントを有し、ｔＰＡリーダーに続くｇｐ１２０のアミノ末端のＣ１がさらなる最適化コドン配列（下記参照）で置換されている。この新たなＣ１セグメントは、接合Ｃ１／１４３セグメントを合成するための以下のＰＣＲ用オリゴマーを用いるＳＯＥＰＣＲにより、残りのｇｐ１４３セグメントに接合した：５’−ＣＣＴＧＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＣＡＣＴＧＡＴＴＴＧＡＡＧＡＡＴＧＡＴＡＣＴＡＡＴＡＣ−３’（配列番号２６）。得られるｇｐ１４３遺伝子はＶ１−Ｖ５領域を除いて最適のコドンの使用を含み、他のＨＩＶ遺伝子に由来する可変領域を挿入するための独自ＰｍｅＩ制限酵素部位がＣ１及びＶ１の接合部に配置されている。Ｈ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ３２Ｂ：この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＩＶＨに類似する。Ｉ．Ｖ１Ｈｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐt ａｌｌ−Ａ：この構築体のｅｎｖ遺伝子は完全に最適コドンを含んでなる。その定常領域（Ｃ１、Ｃ５、ｇｐ３２）は４Ｂ、Ｄ、Ｈに記述されるものであり、可変領域Ｖ１ −Ｖ５に対応するさらなる合成ＤＮＡセグメントが翻訳に最適なコドンを含んでなる合成ＤＮＡセグメントを用いて挿入されている。Ｊ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔａｌｌ−Ｂ：この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＩＶＪに類似する。Ｋ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔａｌｌ−Ａ（非ＩＩＩＢ株）：この構築体は、ＩＩＩＢ以外の株に由来するｅｎｖアミノ酸配列が可変（Ｖ１ −Ｖ５）領域全体にわたる最適コドン用法の決定に用いられたことを除いて、上記ＩＩＩＧに類似する。Ｌ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔａｌｌ−Ｂ（非ＩＩＩＢ株）：この構築体は、ＩＩＩＢ以外の株に由来するｅｎｖアミノ酸配列が可変（Ｖ１ −Ｖ５）領域全体にわたる最適コドン用法の決定に用いられたことを除いて、上記ＩＩＩＧに類似する。実施例１０ｇｐ１４３／ｇｌｙＢワクチン構築体：これらの構築体は、上述の他のｔＰＡ含有構築体（ｔＰＡ−ｇｐ１２０、ｔＰＡ−ｇｐ１４０、ｔＰＡ−ｇｐ１４３及びｔＰＡ−ｇｐ１６０）と同様に、本来のリーダーの代わりにｔｐＡリーダーを用いてＰＣＲによって調製したが、ｇｐ１４３と同様にＣＯＯＨ末端化膜結合ｅｎｖを産生するように設計した。しかしながら、ｇｐ１４３／ｇｌｙＢ構築体は、６個のアミノ酸が細胞内ペプチドドメインを含むように計画され、最後の４個がヒトグリコホリンＢ（ｇｌｙＢ）タンパク質のカルボキシル末端のものと同じである点でｇｐ１４３とは異なる（計画された細胞内アミノ酸配列＝ＮＨ₂− ＮＲＬＩＫＡ−ＣＯＯＨ（配列番号２７）、ｇｌｙＢ並びにｅｎｖ及びｇｌｙＢの両者に共通の“Ｒ”に対応する残基には下線が付されている）。この構築体は、ｅｎｖの細胞内部分に対応するあらゆる転写体又はペプチド領域を完全に除去することにより、さらなるｅｎｖ発現及び細胞表面への定方向ターゲティングを獲得する目的で設計した。このｅｎｖの細胞内部分は、この領域を、短細胞質ドメイン（細胞内アミノ酸配列＝ＮＨ₂−ＲＲＬＩＫＡ−ＣＯＯＨ）を有する多量に発現するタンパク質（ｇｌｙＢ）からのペプチド配列で置換することにより、発現又はタンパク質安定性／細胞表面への輸送に負の衝撃を与え得る。上述のように、ｇｐ１６０タンパク分解開裂部位が除去されているか、又は保持されているかに応じて２つの形態（Ａ又はＢ）で構築体を調製した。Ａ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ａ／ｇｌｙＢ：この構築体は、ｇｐ１４３の細胞内ペプチドドメインを上述のグリコホリンＢのものに置き換えるのに以下のアンチセンスＰＣＲオリゴマーを用いたことを除いてＩＶＤと同じである：５’−ＣＣＡＣＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＡＴＴＡＧＧＣＣＴＴＧＡＴＣＡＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＡＧＣ−３ ’（配列番号２８）。Ｂ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ｂ／ｇｌｙＢ：この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＶＡに類似する。Ｃ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ３２−Ａ／ｇｌｙＢ：この構築体は、ｇｐ１２０の第１定常領域（Ｃ１）がＩＶＨと同様に翻訳に最適なコドンで置き換えられていることを除いてＶＡと同じである。Ｄ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ３２−Ｂ／ｇｌｙＢ：この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＶＣに類似する。Ｅ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔａｌｌ−Ａ／ｇｌｙＢ：この構築体のｅｎｖ遺伝子は完全に上述の最適コドンを含んでなる。Ｆ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔａｌｌ−Ｂ／ｇｌｙＢ：この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＶＥに類似する。Ｇ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔａｌｌ−Ａ／ｇｌｙＢ（非ＩＩＩＢ株）：この構築体は、ＩＩＩＢ以外の株に由来するｅｎｖアミノ酸配列が可変（Ｖ１ −Ｖ５）領域全体にわたる最適コドン用法の決定に用いられたことを除いて、上記ＩＩＩＧに類似する。Ｈ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔａｌｌ−Ｂ／ｇｌｙＢ（非ＩＩＩＢ株）：この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＶＧに類似する。様々なループの欠失を伴うＨＩＶｅｎｖワクチン構築体：これらの構築体は上に記載される全てのｅｎｖ形態（ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、ｇｐ１４３、ｇｐ１６０、ｇｐ１４３／ｇｌｙＢ）を含み得るが、調製の間にｇｐ１２０内の様々なループ（例えば、Ｖ１、Ｖ２、及び／又はＶ３）が欠失している。これらの改変の目的は、ＣＤ４結合部位のような保存された中和エピトープの露出を滞らせ得るペプチドセグメントを除去することである。例えば、Ｖ１／Ｖ２欠失を創出してＣ１及びＣ２セグメントの接合を生成させるため、ＰＣＲ反応において以下のオリゴマーが用いられる：５’−ＣＴＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧＣＴＧＧＣＡＧＴＴＧＴＡＡＣＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＴＡＣＡＣＡＧ−３’ （配列番号２９）。実施例１１ｅｎｖ遺伝子の発現を増大させるための合成遺伝子セグメントの設計：遺伝子セグメントを、同一の翻訳された配列（注記される場合を除く）を有しつつ“アミノ酸配列データから推定される合成オリゴヌクレオチドプローブ：理論的及び実際的な考慮（ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｒｏｂｅｓＤｅｄｕｃｅｄｆｒｏｍＡｍｉｎｏＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａ：ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＰｒａｃｔｉｃａｌＣｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ）”と題するＪ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１８３巻，１−１２頁（１９８５年）からの研究論文においてＲ．Ｌａｔｈｅによって定義される代替コドン用法を伴う配列に変換した。ＨＩＶｅｎｖ遺伝子セグメントのｒｅｖ非依存性発現を増大させるための下記方法論は、哺乳動物細胞におけるこの遺伝子の効率的な発現の公知の不可能性が転写体組成物全体の影響であるという我々の仮説に基づいた。したがって、同じタンパク質配列をコードする代替コドンを用いることにより、ｒｅｖが存在しない状況におけるｅｎｖ発現に対する束縛を除去することができる。ｅｎｖ内でのコドン用法を精査することにより、コドンの高い割合が高度に発現するヒト遺伝子によってはほとんど用いられることがないもののうちにあることが明らかになった。用いられる特別なコドン置換法は、Ｌａｔｈｅらからのデータを用いて、以下のように記述することができる。１．適性オープンリーディングフレームについてコドンの配置を同定する。２．野生型のコドンを、観察されたヒト遺伝子による使用頻度と比較する（Ｌａｔｈｅらの表３を参照）。３．コドンが最も一般的に用いられるものではない場合には、表５のデータに基づいて、それを高発現に最適なコドンに置き換える。４．新たなコドンの第３ヌクレオチド及び第１のもののすぐ３’側に隣接するコドンの第１ヌクレオチドを検査する。新たなコドンの選択により５’−ＣＧ− ３’対形成が生じている場合には、それを表５に指示される選択に置き換える。５．この手順を全遺伝子セグメントが置換されるまで繰り返す。６．新たな遺伝子配列を、これらのコドン置換によって生じる望ましくない配列（例えば、“ＡＴＴＴＡ”配列、イントロンスプライス認識部位の不注意による創出、望ましくない制限酵素部位等）について検査し、これらの配列を除去するコドンを代わりに用いる。７．合成遺伝子セグメントを組み立て、発現の改善について試験する。これらの方法を、完全に発現に最適なコドン用法を含んでなる遺伝子を創出する、以下のＨＩＶｅｎｖの合成遺伝子セグメントを創出するために用いた：それぞれ、５６／１９、７３／２６、７８／２８、及び６１／２５のコドン置換／ヌクレオチド置換の割合が各々のセグメントについて得られている、（ｉ）ｇｐ１２０−Ｃ１（ｏｐｔ）；（ｉｉ）Ｖ１−Ｖ５（ｏｐｔ）；（ｉｉｉ）ＲＲＥ−Ａ／Ｂ（ｍｕｔ又はｏｐｔ）；及び（ｉｖ）ｇｐ３０（ｏｐｔ）。これらのセグメントの各々は上に詳細に記述されており、以下に記載される実際の配列を有する。ｇｐ１２０−Ｃ１（ｏｐｔ）これは、発現に最適なコドン用法を有するように設計された、成熟Ｎ−末端からＶ１の初めまでのｇ１２０定常領域１（Ｃ１）遺伝子である。ＭＮＶ１−Ｖ５（ｏｐｔ）これは、発現に最適のコドン用法を有する、ＨＩＶＭＮＶ１−Ｖ５の誘導タンパク質配列（１０６６ＢＰ）に対応する遺伝子セグメントである。ＲＲＥ．Ｍｕｔ（Ａ）これは、発現に最適なコドン用法を含んでなる、ＨＩＶ−１のｒｅｖ応答性要素（ＲＲＥ）に対応するＤＮＡセグメントである。“Ａ”形態は、ボールド体で示されるヌクレオチドを用いることにより、ｇｐ１２０／ｇｐ４１接合部の既知タンパク分解開裂部位も除去している。ＲＲＥ．Ｍｕｔ（Ｂ）これは、発現に最適なコドン用法を含んでなる、ＨＩＶ−１のｒｅｖ応答性要素（ＲＲＥ）に対応するＤＮＡセグメントである。“Ｂ”形態はｇｐ１２０／ｇｐ４１接合部の既知タンパク分解開裂部位を保持する。ｇｐ３２（ｏｐｔ）これは、発現に最適なコドンを含んでなる、（ＲＲＥの末端に接して開始する）ＡｖｒＩＩ部位からｇｐ１４３の末端までのｇｐ３２遺伝子セグメントである。ＳＲＶ−１ＣＴＥ（Ａ）これは、シミアンレトロウイルス−１ゲノムに由来する３’−ＵＴＲに対応する合成遺伝子セグメントである。このＤＮＡは、ｒｅｖ非依存性発現を増大させるため、以下の方向で、ＨＩＶ遺伝子の３’−末端に配置される。ＳＲＶ−１ＣＴＥ（Ｂ）この合成遺伝子セグメントは、ＡＴＴＴＡ配列の除去に１つのヌクレオチド突然変異（ボールド体で示される）を用いたことを除いて、上に示されるＳＲＶ− １ＣＴＥ（Ａ）と同一である。この配列は、増加されたｍＲＮＡターンオーバーを伴っている。実施例１１イン・ビトロでのｇｐ１２０ワクチンの発現：これらの構築体について、形質移入ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞において、イン・ビトロ発現を試験した。形質移入ＲＤ細胞から分泌されるｔＰＡ−ｇｐ１２０を定量することにより、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０ベクターが分泌ｇｐ１２０を産生することが示された。イン・ビボｇｐ１２０ワクチン接種：Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０_MNＰＮＶが誘発するクラスＩＩＭＨＣによって制限されるＴリンパ球ｇｐ１２０特異的抗原反応性２００μｇのＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０_MNを２回ワクチン接種しているＢａｌｂ／ｃマウスを犠牲にし、組換えｇｐ１２０に対するヘルパ−Ｔリンパ球の反応性をイン・ビトロ測定するためそれらの脾臓を抽出した。Ｔ細胞増殖検定を、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）と共に、組換えｇｐ１２０μ_IIIB（レプリゲン（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）、カタログ＃ＲＰ１０１６−２０）を５μｇ／ｍｌで用いて、４×１０⁵細胞／ｍｌで行った。これらの細胞による³Ｈ−チミジン取り込みの基礎レベルを、２μｇ／ｍｌでのＣｏｎＡ刺激を用いて最大増殖を誘発しながら、これらの細胞を培地単独で培養することにより得た。ＣｏｎＡ誘発反応性は〜３日でピークになり、その時点で培地対照試料と共に収集し、これに対して、抗原処理試料は５日目にさらなる培地対照と共に収集した。ワクチン接種マウスの応答性を、未処置の年齢が一致する同系マウスと比較した。ＣｏｎＡ陽性対照は、予想通り、未処置及び免疫マウスの両者で非常に高い増殖を示した。非常に強いヘルパーＴ細胞記憶応答性がｇｐ１２０処理によりワクチン接種マウスにおいて得られ、これに対して未処置のマウスは応答しなかった（非活性の閾値は＞３−４の刺激指数（ＳＩ）である；ＳＩは試料ｃｐｍ／培地ｃｐｍの比として算出する）。ワクチン接種マウスについて６５及び１４のＳＩが得られ、これは、それぞれ、これらのマウスについての５６４３及び１１，９００の抗−ｇｐ１２０ＥＬＩＳＡ力値に匹敵する。興味深いことに、これら２匹のマウスについて、抗体についてより応答が大きいものはより低い抗体力値を有するものよりもＴ細胞反応性が非常に低かった。この実験は、分泌されたｇｐ１２０ベクターがイン・ビボにおいてヘルパーＴ細胞を効率的に活性化するだけではなく、強力な抗体応答を生成することを示す。加えて、これらの免疫応答の各々を、接種ＰＮＶによってコードされるものと比較して異種である抗原を用いて決定した（ＩＩＩＢ対ＭＮ）。実施例１２ｇｐ１６０ワクチン分泌されるｇｐ１２０構築体に加えて、我々は完全長膜結合ｇｐ１６０の発現構築体を調製している。ｇｐ１２０に加えてｇｐ１６０構築体の理論的根拠は、（１）ＣＴＬ刺激、及び強力なＨＩＶ中和モノクローナル抗体（２Ｆ５、上記参照）が指向するｇｐ４１を含む中和抗体産生の両者についてより多くのエピトープが入手可能であること；（２）ウイルス産生ｇｐ１６０に関してより未変性のタンパク質構造を得ることが可能であること；及び（３）免疫原性のための膜結合インフルエンザＨＡ構築体の成功［Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９巻：１７４５−１７４９頁，１９９３年；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．ら，ＤＮＡａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１２巻：７７７−７８３頁，１９９３年］である。ｇｐ１６０は異種リーダーペプチド配列を有していてもかなりのｒｅｖ依存性を保持しており、そのため、ｒｅｖが存在しない状況での発現を増大させるためさらなる構築体を作製した。実施例１３ＨＩＶ細胞毒性Ｔリンパ球の検定：この項に記述される方法は、ワクチン接種マウスに用いられる検定を説明する。本質的に類似する検定を、各動物の標的細胞として自己Ｂ細胞系を確立しなければならないことを除いて、霊長類で用いることができる。これは、ヒトについてはエプスタイン・バーウイルスを用いて、アカゲザルについてはＢ型ヘルペスウイルスを用いて達成することができる。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、新たに採取された血液又は脾臓から、白血球から赤血球を分離するのにフィコール−ヒパーク遠心を用いて誘導する。マウスについては、リンパ節も用いることができる。エフェクターＣＴＬは、ＰＢＭＣから、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）及びコンカナバリンＡ（２μｇ／ｍｌ）中で６−１２日イン・ビトロ培養することにより、又は特異的抗原を用いることにより、同数の照射抗原提示細胞を用いて調製することができる。特異的抗原は、用いられる動物のＭＨＣハプロタイプのＣＴＬ認識のための既知エピトープである合成ペプチド（通常９−１５アミノ酸）、又は適切な抗原を発現するように加工されたワクチニアウイルス構築体であり得る。標的細胞は同系であっても、ＣＴＬのイン・ビトロ刺激について記述される適切な抗原を提示するように処理されているＭＨＣハプロタイプ一致細胞系であってもよい。Ｂａｌｂ／ｃマウスに対しては、Ｐ１８ペプチド（ＡｒｇＩｌｅＨｉｓＩｌｅＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒｇＡｌａＰｈｅＴｙｒＴｈｒＴｈｒＬｙｓＡｓｎ［配列番号３７］、ＨＩＶＭＮ株用）を、照射同系脾臓細胞を用いるイン・ビトロでのＣＴＬの再刺激に１０μＭの濃度で用いることができ、かつ細胞毒性検定の間の標的細胞の増感に、１−１０μＭで、この検定の前に３７℃年で約２時間インキュベートすることにより用いることができる。これらのＨ−２^dＭＨＣハプロタイプマウスに対しては、ネズミ肥満細胞腫細胞系Ｐ８１５が良好な標的細胞をもたらす。標的を３７℃ で１−２時間インキュベートし（〜５×１０⁶細胞について０．２ｍＣｉ）、次いで標的細胞を数回洗浄することにより、抗原−増感標的細胞にＮａ⁵¹ＣｒＯ₄ を結合させ、これはＣＴＬで殺したときに標的細胞の内部から放出される。ＣＴＬ集団を標的細胞と、エフェクターの標的に対する様々な比、例えば、１００：１、５０：１、２５：１で混合し、共にペレット化して３７℃で４−６時間インキュベートした後に上清を収集し、次いでこれを、ガンマカウンターを用いて放射能の放出について検定する。細胞毒性を、標的細胞からの自発的放出が差し引かれている、（０．２％トリトンＸ−１００処理を用いて得られる）標的細胞から放出され得る総カウントの割合として算出する。実施例１４ＨＩＶ特異的抗体の検定：特異的組換えタンパク質又は合成ペプチドのいずれかを基質抗原として用いて、ＨＩＶに対して産生された抗体を検出するようにＥＬＩＳＡを設計した。９６ウェルマイクロタイタープレートを、４℃で一晩、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中に２μｇ／ｍｌの組換え抗原を５０μｌ／ウェル用いて、振動プラットホーム上で被覆した。抗原は組換えタンパク質（ｇｐ１２０、ｒｅｖ：レプリゲン社；ｇｐ１６０、ｇｐ４１：アメリカン・バイオ− テクノロジーズ社（ＡｍｅｒｉｃａｎＢｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．））又は合成ペプチド（ＩＩＩＢに由来するウイルス単離体配列に対応するＶ３ペプチド等：アメリカン・バイオ−テクノロジーズ社；モノクローナル抗体２Ｆ５のｇｐ４１エピトープ）であった。プレートを洗浄バッファ（ＰＢＳ／０．０５％ツィーン２０）を用いて４回洗浄した後、室温で１時間、振動させながら２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファ（ＰＢＳ／０．０５％ツィーン２０中１％のカーネーション（Ｃａｒ−ｎａｔｉｏｎ）ミルク溶液）を添加した。プレ血清及び免疫血清をブロッキングバッファに所望の希釈範囲で希釈し、ウェル当たり１００μｌを加えた。プレートを室温で１時間、振動させながらインキュベートした後、洗浄バッファで４回洗浄した。次に、ブロッキングバッファで１：２０００に希釈した、セイヨウワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体（抗−アカゲザルＩｇ、サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ；抗−マウス及び抗−ウサギＩｇ、ジャクソン・イムノ・リサーチ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ））を１００μｌ／ウェルで各試料に添加し、振動させながら室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファで４回洗浄した後、１００ｍＭクエン酸バッファ、ｐＨ４．５中１ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン（ｏ−ＰＤ、カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））１００μｌ／ウェルを添加することにより発色させた。プレートを、４５０ｎｍでの吸収について、動力学的（反応の最初の１０分）並びに１０及び３０分終末点の両者で読み取った（サーモマックス（Ｔｈｅｒｍｏ−ｍａｘ）マイクロタイターリーダー、モレキュラー・デバイスイズ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ））。実施例１５ＨＩＶ中和抗体の検定：ワクチン接種動物から誘導した血清を用いる、ＨＩＶ単離体のイン・ビトロ中和の検定を以下の通りに行った。試験血清及び免疫前血清を、使用前に、５６℃ で６０分間熱不活性化した。滴定した量のＨＩＶ−１を試験血清の１：２連続希釈液に添加し、室温で６０分間インキュベートした後、９６ウェルマイクロタイター中の１０⁵ＭＴ−４ヒトリンパ球に添加した。このウイルス／細胞混合物を３７℃で７日間インキュベートし、培養物をテトラゾリウム染料で染色することによりウイルスが介在する細胞の死滅について検定した。ウイルスの中和は、ウイルスが介在する細胞の死の防止により観察される。実施例１６臨床的ＨＩＶ単離体からの遺伝子の単離：ＨＩＶウイルス遺伝子を、ＣｏｎＡ処理により活性化している感染ＰＢＭＣからクローン化した。ウイルス遺伝子を得るための好ましい方法は、所望の遺伝子に隣接する特定のオリゴマーを用いる感染細胞ゲノムからのＰＣＲ増幅によるものであった。ウイルス遺伝子を得るための第２の方法は、感染細胞の上清からウイルスＲＮＡを精製し、この物質から引き続くＰＣＲでｃＤＮＡを調製することによるものであった。この方法は、用いられるＰＣＲオリゴマー及び特定の初回刺激オリゴマーではなくｃＤＮＡを作製するのに用いられるランダム６量休を除いて、ネズミＢ７遺伝子のクローン化について上に記述されるものに非常に類似する。ゲノムＤＮＡを、感染細胞ペレットから、プロテイナーゼＫ及びＳＤＳをそれぞれ０．１ｍｇ／ｍｌ及び０．５％の最終濃度まで添加したＳＴＥ用液（１０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中で溶解することにより精製した。この混合物を５６℃で一晩インキュベートし、０．５容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出した。次いで、最終濃度０．３Ｍまでの酢酸ナトリウム及び２容量の冷エタノールを添加することにより水相を沈殿させた。溶液からＤＮＡをペレット化した後、そのＤＮＡを０．１×ＴＥ用液（１×ＴＥ＝１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ）に再懸濁させた。この時点で、２ＵのＲＮＡ分解酵素Ａと共にＳＤＳを０．１％まで添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。この溶液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出した後、前と同様にエタノールで沈殿させた。ＤＮＡを０．１×ＴＥに懸濁させ、その２６０ｎｍでの紫外吸収を測定することにより定量した。ＰＣＲに用いるまで、試料を−２０℃で保存した。パーキン・エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）キット及びｇｐ１６０用の下記センス及びアンチセンスオリゴマーを用いる手順を用いて、ＰＣＲを行った：それぞれ、５’−ＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡ−３’（配列番号３８）及び５’−ＧＧＧＣＴＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＣＣＣＧＧＧＣＡＴＧＴＧＧ−３’(配列番号３９)。これらのオリゴマーは得られるＤＮＡ断片の３’−末端にＳｒｆＩ部位を追加する。ＰＣＲ誘導セグメントをＶ１Ｊｎｓ又はＶ１Ｒワクチン接種ベクターのいずれかにクローン化し、ライゲーション接合部位に加えてＶ３領域をＤＮＡ配列決定により確認した。実施例１７Ｔ細胞増殖検定：ＰＢＭＣを得、ＰＢＭＣ集団内での増殖によって決定される特異的抗原に対する記憶復活応答について試験する。増殖を、細胞培養物に添加した³Ｈ−チミジンを用いて、収集前のインキュベーションの最後の１８−２４時間監視する。細胞収集装置は増殖が生じている場合アイソタイプ含有ＤＮＡをフィルター上に留め、これに対して、静止状態の細胞はアイソタイプを取り込まず、これは遊離形態でフィルター上に留まることがない。げっ歯類又は霊長類のいずれかの種について、４×１０⁵ 個の細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート内の合計２００μｌの完全培地（ＲＰＭＩ／１０％ウシ胎児血清）に塗布する。バックグランド増殖応答はＰＢＭＣ及び培地単独で決定し、これに対して、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）又はコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）のようなレクチンを１−５μｇ／ｍｌの濃度で用いて非特異的応答を生成させ、陽性対照として機能させる。特異的抗原は既知ペプチドエピトープ、精製タンパク質、又は不活性化ウイルスのいずれかからなる。抗原濃度は、ペプチドについては１−１０μＭ、タンパク質については１−１０μｇ／ｍｌの範囲である。レクチン誘発増殖は細胞培養インキュベーションの第３−５日にピークとなり、これに対して、抗原特異的応答は第５−７日にピークとなる。培地のバックグランドを少なくとも３倍上回る放射カウントが得られた場合に特異的増殖が生じ、これは、しばしば、バックグランドに対する割合、又は刺激指数（ＳＩ）として得られる。ＨＩＶｇｐ１６０は、ｇｐ１６０／ｇｐ１２０免疫化又はＨＩＶ感染個体のＴ細胞増殖を引き起こすことが知られる幾つかのペプチドを含むことが知られている。これらのうち最も一般的に用いられるものは：Ｔ１（ＬｙｓＧｌｎＩｌｅＩｌｅＡｓｎＭｅｔＴｒｐＧｌｎＧｌｕＶａｌＧｌｙＬｙｓＡｌａＭｅｔＴｙｒＡｌａ［配列番号４０］）；Ｔ２（ＨｉｓＧｌｕＡｓｐＴｌｅＩｌｅＳｅｒＬｅｕＴｒｐＡｓｐＧｌｎＳｅｒＬｅｕＬｙｓ［配列番号４１］）；及びＴＨ４（ＡｓｐＡｒｇＶａｌＩｌｅＧｌｕＶａｌＶａｌＧｌｎＧｌｙＡｌａＴｙｒＡｒｇＡｌａＩｌｅＡｒｇ［配列番号４２］）である。これらのペプチドは、抗原感作マウス、非ヒト霊長類、及びヒトに由来するＰＢＭＣの増殖を刺激することが示されている。実施例１８ベクターＶＩＲの調製：我々の基本的ワクチン接種ベクターの最適化を継続する努力において、我々はＶ１Ｊｎｓの誘導体を調製し、それをＶ１Ｒと命名した。このベクターの構築の目的は、最適化された異種遺伝子発現特性の全て及びＶ１Ｊ及びＶ１Ｊｎｓがもたらす高いプラスミド収率を依然として保持する最小サイズのベクターワクチン、すなわち不必要なＤＮＡ配列を含まないもの、を得ることである。我々は、文献からはもちろんのこと実験によっても、（１）大腸菌複製起点を含むｐＵＣ主鎖内の領域を細菌からのプラスミド収率に影響を及ぼすことなく除去することが可能であり；（２）細菌のターミネーターが代わりに挿入されている場合には、カナマイシンオープンリーディングフレームに続くｋａｎ^r遺伝子の３’領域が除去可能であり；かつ（３）ＢＧＨの３’側半分の〜３００ｂｐが（ＢＧＨ要素内の元来のＫｐｎＩ制限酵素部位に続く）その調節機能に影響を及ぼすことなく除去することが可能であることを決定した。それぞれ、ＣＭＶｉｎｔＡプロモーター／ＢＨＧターミネーター、複製起点、及びカナマイシン耐性を表す３つのＤＮＡセグメントをＶ１Ｊｎｓから合成するためにＰＣＲを用いることにより、Ｖ１Ｒを構築した。各セグメントに独自の制限酵素をＰＣＲオリゴマーを用いて各セグメント末端に追加した：ＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＨＧについてはＳｓｐＩ及びＸｈｏＩ；ｋａｎ^r遺伝子についてはＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩ；及びｏｒｉ^rについてはＢｃｌＩ及びＳａｌＩ。これらの酵素部位は、それらが、ＰＣＲ誘導ＤＮＡセグメントの各々の方向性ライゲーション及び各々の部位の引き続く喪失を可能にするため選択された：ＥｃｏＲＶ及びＳｓｐＩはライゲーションに適合する平滑末端化ＤＮＡを残し、これに対して、ＢａｍＨＩ及びＢｃｌＩはＳａｌＩ及びＸｈｏＩと同様の相補的突出を残す。これらのセグメントをＰＣＲにより得た後、各セグメントを上に指示される適切な制限酵素で消化し、次いで、３つのＤＮＡ全てを含む単一の反応混合物中で共にライゲートした。ｏｒｉｒの５’末端は、それがカナマイシン耐性遺伝子に終止情報をもたらすことができるように、この領域に通常見出されるＴ２ｒｈｏ非依存性ターミネーター配列を含むように設計した。ライゲートした産生物を、制限酵素消化（＞８酵素）はもちろんのことライゲーション接合部のＤＮＡ配列決定によっても確認した。ＤＮＡプラスミドの収量及びＶ１Ｒ内のウイルス遺伝子を用いる異種発現はＶ１Ｊｎｓに類似するように思われる。達成されたベクターサイズの正味の減少は１３４６ｂｐであった（Ｖ１Ｊｎｓ＝４．８６ｋｂ；Ｖ１Ｒ＝３．５２ｋｂ）、［本明細書の配列番号４３；図１１及びＷＯ９５／２４４８５号の配列番号１００も参照；ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／／０２６３３号］。Ｖ１Ｒの合成に用いられたＰＣＲオリゴマー配列（制限酵素部位には下線が付され、配列に続く括弧内に同定されている）：（１）５’−ＧＧＴＡＣＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＴＡＴＴＧＧＣＣＡＴＴＧＣＡＴＡＣＧ−３’［ＳｓｐＩ］、（配列番号４４）：（２）５’−ＣＣＡＣＡＴＣＴＣＧＡＧＧＡＡＣＣＧＧＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣ−３’［ＸｈｏＩ］、（配列番号４５）：（ＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＨＧセグメント用）（３）５’−ＧＧＴＡＣＡＧＡＴＡＴＣＧＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＴＣ−３’［ＥｃｏＲＶ］、（配列番号４６）：（４）５’−ＣＣＡＣＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＡＡＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＴＴＡＣＡＡＣＣ−３’［ＢａｍＨＩ］、（配列番号４７）：（カナマイシン耐性遺伝子セグメント用）（５）５’−ＧＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＣＧＴＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧ−３’［ＢｃｌＩ］、（配列番号４８）：（６）５’−ＣＣＡＣＡＴＧＴＣＧＡＣＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧ−３’［ＳａｌＩ］、（配列番号４９）：（大脳菌複製起点用）Ｖ１Ｒについて、以下のオリゴマーを用いてライゲーション接合部を配列決定した：５’−ＧＡＧＣＣＡＡＴＡＴＡＡＡＴＧＴＡＣ−３’（配列番号５０）：［ＣＭＶｉｎｔＡ／ｋａｎ^r接合部］５’−ＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣ−３’（配列番号５１）：［ＢＧＨ／ｏｒｉ接合部］５’−ＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣ−３’（配列番号５２）：［ｏｒｉ／ｋａｎ^r接合部］実施例１９ＨＩＶ後期遺伝子産生物の異種発現ｅｎｖ及びｇａｇのようなＨＩＶ構造遺伝子は、完全長タンパク質を効率的に産生するため、ＨＩＶ調節遺伝子ｒｅｖの発現を必要とする。我々は、ｇａｇのｒｅｖ依存性発現によっては低水準のタンパク質しか生じず、かつｒｅｖそれ自体が細胞にとって毒性であり得ることを見出している。我々はイン・ビトロで比較的高い水準のｇ１６０のｒｅｖ依存性発現を達成したが、このワクチンは、ｒｅｖ／ｇｐ１６０ＤＮＡでのイン・ビボ免疫化の後、ｇｐ１６０に対する抗体を低水準でしか誘発しない。これは、ｒｅｖの既知の細胞毒性効果に加えて、数百の核を有する筋小管においてｒｅｖ機能を得ることの困難性の増加（ｇａｇ又はｅｎｖタンパク質の発現が生じるには、ｒｅｖタンパク質がｒｅｖ依存性転写体と同じ核内にあることが必要である）の結果生じる可能性がある。しかしながら、ｅｎｖ遺伝子の選択された改変を用いてｒｅｖ依存性発現を得ることが可能である。１．ｅｎｖのｒｅｖ非依存性発現：一般に、我々のワクチンは、ＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーター、ＢＧＨ誘導ポリアデニル化及び転写終止配列、並びにｐＵＣ主鎖を含んでなる我々の一般化されたワクチン接種ベクターＶ１Ｊｎｓ内での発現を最適化するため、主としてＨＩＶ（ＩＩＩＢ）ｅｎｖ及びｇａｇ遺伝子を用いている。いかに大きな遺伝子セグメントが用いられるかに依存して（例えば、ｇｐ１２０対ｇｐ１６０）、ｒｅｖ依存性発現の効率を変化させることは、ｅｎｖについて、その本来の分泌リーダーペプチドを組織特異的プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）遺伝子のものと置換し、ＣＭＶイントロンＡを有するＣＭＶＩＥプロモーターの後ろの得られたキメラ遺伝子を発現させることにより達成することができる。ｔＰＡ−ｇｐ１２０がこの方式で構築された分泌ｇｐ１２０ベクターの例であり、これはワクチン接種マウス及びサルにおいて抗−ｇｐ１２０免疫応答を誘発するのに十分作用する。膜固定化タンパク質が、分泌されたタンパク質と比較して、より多量の（及び、おそらくは、ＨＩＶ中和に対してより特異的な）抗体応答を誘発し得、加えてさらなるエピトープを獲得するという報告のため、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０及びＶ１Ｊｎｓ−ｒｅｖ／ｇｐ１６０を調製した。ｔＰＡ−ｇｐ１６０ベクターは、発現の水準はｒｅｖ／ｇｐ１６０、ｒｅｖ依存性ｇｐ１６０発現プラスミドで得られるものよりも非常に低いものの、形質移入細胞の免疫ブロット分析によって示されるように、ｒｅｖを添加することなく、検出可能な量のｇｐ１６０及びｇｐ１２０を産生した。これは、おそらく、ｇｐ１６０転写体にｒｅｖ依存性を付与する阻害領域がｇｐ４１のＣＯＯＨ−末端を含むｇｐ１６０内の複数の部位に生じるためである。ｔＰＡ−ｇｐ１６０のＣＯＯＨ−末端が切りつめられた形態（ｔＰＡ−ｇｐ１４３）についてベクターを調製した。これは、これらの阻害配列を除去することによりｅｎｖの発現水準全体が増大するように設計された。また、このｇｐ１４３ベクターは、細胞表面ではなくリソソームへの膜タンパク質の転換を生じることが知られるペプチドモチーフ（例えば、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）を含む細胞内ｇｐ４１領域も取り除く。したがって、ｇｐ１４３は、（ｒｅｖ依存性を低下させることにより）ｅｎｖタンパク質の発現を増大させ、かつ完全長ｇｐ１６０と比較して細胞表面へのタンパク質の輸送効率を高めることが期待され、これらのタンパク質がＤＮＡワクチン接種の後の抗−ｇｐ１６０抗体のより高い誘発が予想される。ｔＰＡ−ｇｐ１４３を、発現のさらなる阻害配列を除去するためのｒｅｖ応答性要素（ＲＲＥ）配列（３５０ｂｐ）のさらなるサイレント突然変異により、さらに改変した。この構築体ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥは２つの形態：ｇｐ１２０／４１のタンパク分解開裂部位の除去（形態Ａ）又は保持（形態Ｂ）のいずれかで調製した。両形態は、ワクチニアにおいて発現した開裂不可能なｇｐ１６０を用いるマウスのワクチン接種が開裂可能な形態よりも非常に高い水準でｇｐ１６０に対する抗体を誘発したという文献報告のために調製した。細胞形質移入体におけるｇｐ１６０／ｇｐ１２０の発現用の定量的ＥＬＩＳＡを、これらのベクターの相対的発現可能性を決定するために開発した。２９３細胞のイン・ビトロ形質移入、続いて細胞会合対分泌／放出ｇｐ１２０の定量を行うことにより、以下の結果を得た：（１）ｔＰＡ−ｇｐ１６０は、細胞内対細胞表面からの放出で同様の特性を保持しつつ、ｒｅｖ／ｇｐ１６０よりも５−１０倍少ないｇｐ１２０を発現した；（２）ｔＰＡ−ｇｐ１４３は、低水準の細胞会合ｇｐ１４３で、ｒｅｖ／ｇｐ１６０よりも３−６倍多くｇｐ１２０を分泌し、これによりｇｐ１６０の細胞質のテールがこの配列を部分的に欠失させることにより解決することができるｇｐ１６０の細胞内滞留を引き起こすことが確認される；及び（３）ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥＡ及びＢは、形態Ａについてタンパク分解処理の除去が確認されたものの、親のｔＰＡ−ｇｐ１４３よりも〜１０倍高いタンパク質の発現水準をもたらした。このように、我々のｒｅｖ非依存性発現を増加させる方策は、発現水準全体の段階的な増加と共に、膜固定化ｇｐ１４３のリソソームから細胞表面への再方向付けをも生じている。これが遺伝的構築体であり、この構築体には、異なるウイルス株の間に幾つかの抗原性の相違が存在する場合、様々な一次ウイルス単離体から誘導されるｇｐ１２０配列を、ＮＨ₂−末端（ｔＰＡリーダー）又はＣＯＯＨ−末端（ｇｐ４１）のいずれかにこれらの改変を含むベクターカセット内に挿入することが可能であるはずであることに注意することが重要である。図２−７は、ｇｐ１４３ベースの構築体、好ましくはｔＰＡ−ｇｐ１４３ベースの構築体を含むがこれに限定されるものではない様々な構築体の、ＨＩＶ感染に対するＤＮＡワクチンとしての使用を支持するデータを示す。図２は、ｔＰＡ −１４３（ｏｐｔ４１）がＧＭＴ＝１０³の範囲で抗−ｇｐ１２０抗体応答を誘発することを示す。図３では、ｇｐ１４３ベースの構築体を含む幾つかのＤＮＡワクチンについて抗−ｇｐ１２０抗体の力価が測定され、比較されている。図４は、ｔＰＡ−ｇｐ１６０構築体と比較した、ｔＰＡ−ｇｐ１４３及びｔＰＡ−１４３／ｍｕｔＲＲＥの相対的な発現を示す。図５では、ｔＰＡ−ｇｐ１４３構築体のｏｐｔＡ及びｏｐｔＢ形態の両方について抗−ｇｐ１２０抗体の産生が測定されている。図６は、ネズミのＤＮＡワクチン接種に続くＨＩＶ株に対する中和抗体の産生を促進する、ｔＰＡ−ｇｐ１４３−ｏｐｔＡ及びｔＰＡ−ｇｐ１４３ −ｏｐｔＢを含む幾つかのＤＮＡワクチンの能力を示す。図７も、ｔＰＡ−ｇｐ１４３−ｏｐｔＡ、ｔＰＡ−ｇｐ１４３−ｏｐｔＢ、ｔＰＡ−ｇｐ１４３−ｏｐｔＡ−ｇｌｙＢ及びｔＰＡ−ｇｐ１４３−ｏｐｔＢ−ｇｌｙＢを含む様々なＤＮＡワクチン構築体のＨＩＶ中和データを示す。２．臨床的単離体から誘導されるｇｐ１２０の発現：これらの発現方策をワクチン用途に関連するウイルスに適用し、我々のアプローチの普遍性を確認するため、我々は一次ＨＩＶ単離体（ノースアメリカンコンセンサスＶ３ペプチドループ；マクロファージ向性及び非融合細胞誘発性表現型を含む）から誘導されるｔＰＡ−ｇｐ１２０ベクターをも調製した。このベクターは形質移入２９３細胞でｇｐ１２０の高い発現／分泌をもたらし、かつマウスにおいて抗−ｇｐ１２０抗体を誘発し、したがって、それが機能的形態でクローン化されていたことを示す。主要単離体ｇｐ１６０遺伝子も実験室株から誘導されるｇｐ１６０と同じ方法での発現に用いられる。３．ＨＩＶｅｎｖポリヌクレオチドワクチンに対する免疫応答マウスにおいて免疫応答に対するワクチン接種経路の効果：ｇｐ１６０の発現を改善しようとする努力は継続中であるが、我々は免疫応答及びそれらを増強する方法の評価にｔＰＡ−ｇｐ１２０ＤＮＡ構築体を用いている。筋肉内（ｉ．ｍ．）及び皮内（ｉ．ｄ．）ワクチン接種経路を、このベクターについて、１００、１０、及び１μｇの用量でマウスにおいて比較した。いずれの経路によるワクチン接種も、３種類全ての用量水準での２−３回のワクチン接種の後に、抗体応答（ＧＭＴ＝１０³−１０⁴）を誘発した。各々の経路は、類似の抗−ｇｐ１２０抗体力値を明確な用量依存性応答を伴って誘発した。しかしながら、我々はｉ．ｄ．ワクチン接種について、特に最初の接種後のより低い用量で、より大きな応答の可変性を観察した。さらに、抗原特異的イン・ビトロ増殖及びサイトカイン分泌によって測定されるヘルパーＴ細胞応答は、ｉ．ｄよりもｉ．ｍ．ワクチン接種の後により高かった。我々は、このワクチンについては、ｉ．ｍ．と比較して、ｉ．ｄ．ワクチン接種はいかなる利点をももたらさないものと結論づけた。４．マウスにおけるｇｐ１２０ＤＮＡワクチン媒介ヘルパーＴ細胞免疫：ｇｐ１２０ＤＮＡワクチン接種は、Ｔ_H−１様サイトカイン分泌プロフィール（すなわち、ＩＬ−４をほとんど、もしくは全く伴わないｇ−インターフェロン及びＩＬ−２産生）を有する試験した全てのリンパ性区画（牌臓、血液、鼠径部、腸間膜及び腸骨節）において強力なヘルパーＴ細胞応答を生じた。これらのサイトカインは一般に強力な細胞性免疫を促進し、ＨＩＶ血清陽性患者の疾患がない状態の維持に関連付けられている。リンパ節は、ウイルスが血液中に未だ検出することができないときでさえ、ウイルスの大貯蔵部を有する、ＨＩＶ複製の主要部位であることが示されている。我々のＤＮＡワクチンで示されているような、様々なリンパ部位に抗− ＨＩＶ免疫応答を誘発することが可能なワクチンは、最初の感染の後のリンパ管のコロニー形成の成功を妨げる手助けをし得る。５．ｅｎｖＤＮＡワクチン媒介抗体応答：ｇｐ１２０ＤＮＡワクチンを接種したミドリザル（ＡＧＭ）及びアカゲザル（ＲＨＭ）は２−３回のワクチン接種の後低水準の中和抗体しか示さず、これは追加ワクチン接種では増加させることができなかった。これらの結果は、オリゴマーｇｐ１６０がおそらくはｇｐ１２０単量体よりも中和抗体の誘発に関連する標的抗原であるというＨＩＶワクチン分野での認識の増加と共に、ｇｐ１６０ベースのベクター（上記参照）の有効な発現の獲得に焦点を当てることに我々を導いている。また、マウス及びＡＧＭに主要単離体誘導ｔＰＡ−ｇｐ１２０ワクチンをワクチン接種した。これらの動物は５００−５０００の範囲の（相同性配列を用いる）抗−Ｖ３ペプチド逆最終点抗体力価を示し、これは、このワクチンの設計が臨床的に関連するウイルス単離体に対して機能的であることを示す。ｇｐ１６０ベースのワクチン、ｒｅｖ−ｇｐ１６０及びｔＰＡ−ｇｐ１６０はマウス及び非ヒト霊長類において一貫して抗体応答を誘発することに失敗し、又は低い抗体力値しか生じない。ｔＰＡ−ｇｐ１４３プラスミドを用いた我々の最初の結果は、２回のワクチン接種の後、マウス及びＡＧＭにおいて＞１０³の幾何平均力価（ＧＭＴ）を生じた。これらのデータは、我々が、発現水準の増加及び細胞表面へのｅｎｖのより効率的な細胞内輸送によりｇｐ１６０様ワクチンの免疫原性を大きく改善していることを示す。この構築体を、ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥＡ及びＢベクターに加えて、抗体応答、特にウイルスの中和について特徴付けを続ける。６．サルにおけるｅｎｖＤＮＡワクチン介在ＣＴＬ応答：我々は、ｇｐ１２０及びｇｐ１６０／ＩＲＥＳ／ｒｅｖＤＮＡをワクチン接種したＲＨＭのＣＴＬ応答の特徴付けを継続した。このワクチンを接種された４頭のサルは全て、２回のワクチン接種の後に、有意のＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬ活性を示した（エフェクター／標的＝２０での２０−３５％の特異的キル活性）。第４のワクチン接種の後、これらの活性は同じ試験条件下で５０−６０％キル活性に増加し、これは、追加のワクチン接種が応答を大幅に引き上げたことを示す。このＣＴＬ活性は最後のワクチン接種の後少なくとも７ヶ月間それらのピーク水準の約５０％で持続し、これは、長期間の記憶が確立されていることを示す。実施例２０ＳＩＶ／ＨＩＶ（ＳＨＩＶ）キメラ：候補ＨＩＶ−１ワクチンの防御効力を試験する上で主な障害は、このウイルスに適切な動物ウイルス投与モデルを欠くことである。ＨＩＶに密接に関連するシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）がアカゲザルに感染してＡＴＤＳを引き起こすものの、ＨＩＶ−１ウイルス単離体に感染し得る唯一の動物種はチンパンジーである。しかしながら、この感染から得られるウイルス血症は低水準で、一過性で、かつ病原性効果（例えば、リンパ球減少症、免疫不全関連日和見感染等）を示さない。近年、ＳＩＶ及びＨＩＶゲノムを含んでなるハイブリッドウイルスが開発され、これらはアカゲザルに対しても感染性であり、かつ感染関連ＡＩＤＳを引き起こし得る。この型のウイルスの例はＳＨＩＶ−４（ＩＩＩＢ）である（Ｌｉら，Ｊ．ｏｆＡｃｑｕｉｒｅｄＩｍｍｕｎｅＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙＳｙｎｄｒｏｍｅ，Ｖｏｌ．５，６３９−６４６（１９９２年））。このウイルスは、調節遺伝子ｔａｔ及びｒｅｖ、並びに構造遺伝子ｅｎｖを除くＳＩＶ（ＭＡＣ２３９）ゲノムを含む。候補ＨＩＶワクチンの原則的な成分はｅｎｖに基づくため、このウイルスは、ヒトの臨床的な目的で開発されたワクチンを動物モデルにおける感染に対する防御効力について試験することを可能にする。実施例２１プラスミドＤＮＡ及び組換えタンパク質組み合わせワクチン：プラスミドＤＮＡＨＩＶｅｎｖ成分及び組換えＨＩＶｅｎｖタンパク質成分の両者を有するワクチンを、アカゲザルにおいて抗体応答を誘発するそれらの能力について試験した。図９及び図１０は、それぞれ、ＨＩＶｅｎｖ遺伝子含有ＤＮＡワクチン及び（適切なアジュバント中に配合された）組換えタンパク質をアカゲザルにワクチン接種した後に得られる抗−ｇｐ１２０ＥＬＩＳＡ抗体及びＳＨＩＶ−４（ＩＩＩＢ）ウイルス中和抗体力値を示す。これらのサルは、高力値のｅｎｖ特異的抗体及び中和抗体を産生した。遺伝子及び卵白アルブミンを含まない“ブランク”ＤＮＡをワクチン接種した対照サルは検出可能ないかなるｅｎｖ特異的応答をも示さず、これに対して、このワクチンのタンパク質成分のみをワクチン接種したサルはＥＬＩＳＡによって検出される低水準の抗原特異的抗体は示したが中和抗体は示さなかった。これらのサルにＳＨＩＶ− ４（ＩＩＩＢ）ウイルス投与した場合、全ての対照及びタンパク質のみのサルは感染し、これに対して、ｅｎｖＤＮＡ及びタンパタ質の両者が接種されたものは検出可能なＳＨＩＶウイルス血症を示さなかった。これらのサルは、現在、可能性のある感染の遅延開始について周期的に試験を行っている。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Vaccines containing synthetic genes Background of the Invention 1.HIV infection: Human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) is acquired human immunodeficiency syndrome (AI) DS) and its etiological agents. HIV-1 is a retroviridae 5 ′ LTR-gag-pol of all retroviruses -Env-LTR3 'configuration. In addition, HIV-1 has tat and rev Includes some genes with regulatory or unknown functions, including genes. env inheritance The offspring encode the viral envelope glycoprotein, which is 160 kilodaltons After being translated as a precursor (gp160) of (kDa), it is converted into a cellular protease. After cleavage by an external 120 kDa envelope glycoprotein (gp120) And a transmembrane 41 kDa envelope glycoprotein (gp41) is produced. gp12 0 and gp41 remain associated, on the surface of virus particles and HIV infected cells. Appears in gp120 is used for helper T lymphocytes, macrophages and other targets. Binds to the CD4 receptor present on target cells. After gp120 binds to CD4 , Gp41 mediates the fusion phenomenon responsible for virus entry. Gp120 on virions is CD on the surface of T4 lymphocytes or other target cells Infection begins when it binds to the 4 receptor. The bound virus coalesces with the target cell Reverse transcribe the RNA genome into double stranded DNA of the cell. Viral DNA is cell Into the nuclear genetic material, where the viral DNA is transformed into a new viral RN A, leads to the production of viral proteins and new viral particles. New particles It germinates from the membrane of the target cell and infects other cells. Destruction of T4 lymphocytes, which is important for immune defense, is a progressive feature of HIV infection It is a major cause of immune dysfunction. Loss of target cells can cause the body to resist most invaders. Specific loss of ability, including viruses, fungi, parasites and mycobacteria Devastating their defense against bacteria. HIV-1 replicates infected cells, germinates from them, and damages cell membranes. Kill by scratching. HIV-1 is a virus that appears on the surface of infected cells. Target cells by Sgp120 Will be indirectly killed. CD4 receptor on T cells is strong against gp120 Healthy cells expressing the CD4 receptor bind to gp120 In some cases, the cells may fuse with infected cells to form fused cells. Fusion cells survive Can not. HIV-1 may also induce normal cellular immune defenses against infected cells. is there. With or without the help of antibodies, cytotoxic protective cells can be Infected cells that display the Rus protein can be destroyed. Finally, free gp 120 can circulate in the blood of HIV-1 infected individuals. This free protein The quality binds to the CD4 receptor on uninfected cells, making them appear infected and immunoreactive. It is possible to elicit the answer. Infection with HIV-1 is almost always fatal and at this time HIV- There is no cure for one infection. Wakuchi effective in preventing HIV-1 infection Has not yet been obtained. Live attenuated due to reversion or risk of infection Vaccines probably cannot be used as vaccines. Most sub-units Vaccine approaches have not been successful in preventing HIV infection. HIV-1 feeling Dye treatment has spread some infected people Although life-threatening, it has serious side effects. Therefore, struggle with this lethal infection There is a great need for effective treatments and vaccines. 2.vaccine Vaccination is an effective form of disease prevention and can prevent some forms of viral infection. It has been proven successful. Induces protective humoral and cellular immunity Determining how to present the HIV-1 antigen to the human immune system is a difficult task. now To date, attempts to produce an effective HIV vaccine have been unsuccessful. AI In DS patients, free virus is only present at low concentrations. The story of HIV-1 Staining is enhanced through fusion and fusion cell formation by cell-cell interactions. But Thus, antibodies produced against free virus or viral subunits It is generally ineffective at eliminating ruth infected cells. Vaccines use the body's ability to "remember" antigens. First with a given antigen After an encounter, the immune system produces cells that retain the immunological memory of the antigen for the life of the individual. Live. Subsequent exposure stimulates the immune response and eliminates the pathogen Or inactivation occurs. The immune system treats pathogens in two ways: humoral and cell-mediated responses . In a humoral response, lymphocytes bind to antigens, thereby killing the pathogen. Produces specific antibodies that inactivate. Cell-mediated response specifically attacks infected cells And cytotoxic helper-T lymphocytes that destroy. The development of a vaccine using the HIV-1 virus requires that the vaccine And the same cells that need to be activated (ie, T4 lymphocytes) There is a problem of HIV-1 infection. Inactivates HIV before immune system damage occurs It would be advantageous to develop a vaccination vaccine. A particularly suitable type of HIV vaccine Recognizes HIV variants and acts in HIV positive individuals at the onset of infection Generates an anti-HIV immune response. Viruses, especially human immunity, which are desired to elicit neutralizing and protective immune responses Develop vaccines against high mutation rates such as deficiency virus The main problem above is the virus envelope between different virus isolates or strains Protein diversity. Cytotoxic T lymphocytes in both mice and humans (CTL) identifies epitopes derived from conserved internal viral proteins It is possible to understand To different viral strains because they are considered important in the immune response to Efforts focused on developing CTL vaccines that can provide heterogeneous protection against I have. CD8⁺CTLs show that their T cell receptors are associated with MHC class I molecules. It is known to kill virus-infected cells when recognizing an ils peptide. This viral peptide is derived from endogenously synthesized viral proteins. It is induced independently of the location of the protein or its function in the virus. Therefore, By recognizing epitopes from conserved viral proteins, TL can provide cross-strain protection. Meeting with MHC Class I Peptides for CTL recognition that can be located in the cytoplasm or endoplasmic reticulum Is derived from proteins passing through it. In general, (MHC class II molecules Thus, exogenous tags that enter the endosomal processing pathway (as in the case of presented antigens) The protein is CD8⁺It is not valid for generating a CTL response. Most of the effort to generate CTL responses Uses replication vectors for production or focuses on introducing peptides into the cytosol Has been applied. these Has a limitation that their usefulness as vaccines may be reduced. is there. Retroviral vectors have the ability to replicate the recombinant virus. While maintaining the size of the polypeptide that can be expressed as a fusion protein and Vaccinia-like vectors with limited structure and subsequent immunity Will be weakened by the immune response to those vectors themselves. Also , Viral vectors and modified pathogens may interfere with their use in humans. There is a danger. Furthermore, the choice of peptide epitope to be presented depends on the individual Depending on the structure of the body's MHC antigens, peptide vaccines are Potential limitations on efficacy due to diversity of MHC haplotypes in population is there. 3.DNA vaccine Benvenisty, N .; And Reshef, L .; [PNAS 83,95 51-9555, (1986)] were given to mice intraperitoneally (ip) and intravenously (ip). i. v. ) Or intramuscularly (im) introduced CaPO_FourPrecipitated DNA is emitted It is shown that it is feasible. CaCl_TwoDNA expression vector for mice without treatment To i. m. By injection, DNA by muscle cells Uptake and expression of the protein encoded by the DNA. This Plasmids were maintained episomally and did not replicate. Next, rats and fish Expression after im injection into primate and primate skeletal muscle and rat myocardium Have been observed. This technique of using nucleic acids as therapeutics is described in WO 90/11092. (October 4, 1990), which reports that naked polynucleo Pide was used for vertebrate vaccination. Intramuscular immunity is not required for the success of this method. Cow growth Gold micro bullets coated with DNA encoding Remon (BGH) are applied to mouse skin Upon introduction, the mouse produced anti-BGH antibodies. Living animal For transfection of skin, muscle, sebaceous ribs and breast tissue, a jet injector (jet) Injector) is used. Various methods for introducing nucleic acids have been re- Are being considered. Intravenous DNA: cationic liposome complex in mice Injection produces systemic expression of cloned transgenes as described by Zhu et al. [Sci. ence261: 209-211 (July 9, 1993)]. . Ulmer et al. [Science259: 174-1749 (1993)] discloses influenza virus proteins. Influenza virus infection by intramuscular injection of encoding DNA Reported on species defense. Specific treatments that can elicit the desired immune response against pathogens and tumor antigens The need for therapeutic and prophylactic agents is met by the present invention. This treatment approach The most important point is that a virus strain different from the strain from which the antigen gene was obtained Infections or diseases caused by Ability to elicit a vesicular immune response. This is of particular interest when dealing with HIV Because the virus is recognized to mutate rapidly And many toxic isolates have been identified [eg, 245 separate LaRosa et al., Science, identifying HIV isolates.249: 932 -935 (1990)]. In response to this perceived diversity, researchers Have attempted to generate CTL based on peptide immunity. In this way, Taka hashi et al. [Science]255: 333-336 (1992)] Broadly cross-reactive cells recognizing the HIV envelope (gp160) determinant The induction of toxic T cells was reported. I However, these investigators have difficulty achieving a true cross-reactive CTL response. Recognizing the difficulty, very stimulating or restimulating T cells Of CTL induces effector functions including cytotoxicity Suggested that. Wang et al. Implanted a cloned genomic (unspliced) HIV gene into muscle. Reported on eliciting an immune response to HIV in mice by seeding did. However, the level of immune response achieved in these studies is very high. It was low. In addition, the DNA construct of Wang et al. The essential genotype of HIV encoding the p160-Tat / rev coding sequence Fragment was used. As detailed below, this is a high level emission of gp160. It is a suboptimal system for obtaining the reality. Also, this indicates that the expression of Tat promotes Kaposi's sarcoma There is a potential danger to contribute to the line. WO 93/17706 describes a method of vaccinating animals against the virus. In this method, a carrier particle is coated with a gene construct and the coated particle is coated. The pup was accelerated into the animal's cells. For HIV, terminal repeats are excluded. Essence It has been proposed to use the entire genome as a whole. In general, to ensure vaccine safety Therefore, HIV constructs should not contain more than about 50% of the HIV genome Is believed. By doing so, many are unknown or poorly understood machines. Removal of functional enzymatic moieties and viral regulatory proteins is assured. This Thus, whether a useful human HIV vaccine emerges from gene delivery technology The problem remains. In the present invention, a polynucleotide is introduced into a living tissue to induce protein expression. Any of the known methods for doing so are contemplated. However, the present invention relates to HIV And other proteins into the antigen processing pathway to make HIV-specific CTLs and antibodies effective A novel immunogen for efficient production is provided. This medicinal product has cellular and body fluids Useful as a vaccine to elicit both gendered anti-HIV and HIV neutralizing immune responses is there. In the present invention, the above-mentioned problems are addressed and introduced into an animal body. HIV proteins without the risks associated with those methods when introduced To provide a polynucleotide immunogen that leads to efficient expression of epitopes Has been resolved more. The immune response thus generated is based on HIV recognition, HI Inhibition of V replication, sensitive to HTV Effective in identifying and killing stained cells and crossing many HIV strains Reactive. 4.Codon usage and codon context Codon pairing in organisms is highly non-random and varies between organisms. This information Construction and expression of a modified or synthetic gene having a desired level of translation efficiency, genome Of which region is the protein coding region, conversion to heterologous gene It is used to introduce translational pauses and to confirm nucleotide sequence relationships or phylogenetic origin. You. Expression of foreign heterologous genes in transformed organisms is now routine. example Many mammalian genes, including murine and human genes, successfully inserted into unicellular organisms Have been. Standard techniques in this regard include plasmid or phage A foreign gene to be expressed is introduced into a vector, and the vector is transferred to an organism. Includes use for gene insertion. The original promoter of such a gene is Generally, replaced with a strong promoter compatible with the host into which the gene is to be inserted. It is. Protein sequencing equipment, even in trace amounts, is a natural protein The amino acid sequence. These amino acids From the sequence, the DNA sequence encoding those proteins can be deduced . DNA synthesis is also a rapidly evolving technology, corresponding to these putative DNAs. Synthetic genes can be easily constructed. Despite the emergence of knowledge of expression systems and recombinant DNA, Serious obstacles remain when attempting to express synthetic genes. example Many naturally-occurring active proteins, if they are expressed in a foreign host, Is glycosylated in a different manner from that which occurs in Because of this, many mammals Preferred eukaryotic host, such as yeast, as bacterial host for gene expression There is. The problem of glycosylation is the subject of ongoing research. Another problem is less understood. Translation of synthetic genes is paired with strong promoters. Even when combined, they often run much less efficiently than expected. same The same is true for foreign genes that are foreign to the expression organism. Recoverable When the gene is transcribed in a manner that is efficient enough to produce large amounts of translation products. However, the protein is often inactive or Are different in some way. The latter problem is usually due to differences in protein folding in different organisms. Is recognized. The solution to this problem is elusive and protein folding The mechanism for controlling folding is poorly understood. Issues related to translation efficiency are believed to be related to codon context effects ing. Protein coding regions in all organisms have various functional constraints Some of which have been properly implemented in addition to the appropriate translation start and stop signals. Depends on the need to encode the protein used. However, these Some features of the protein coding region that are not easily understood in terms of constraints Has been recognized. An important category of such features is codon usage and codon con Related to the text. Codon usage is highly biased and can vary widely between different organisms Are known. Codon usage patterns are related to the relative amount of tRNA isoacceptor. It is shown that they are linked. Gene encoding large amount of protein and small amount of tan It differs in codon preference from the gene encoding the protein. Codon usage Possibilities That Deflections Affect Peptide Elongation Rates Have been Differences in codon usage are associated with differences in translation rates, but It is difficult to show the direct effect of codon selection on Codon usage pattern Other suggested constraints on maximizing translation fidelity and driving protein synthesis Optimization of biological efficiency. Apart from non-random use of codons, codon / anticodon recognition is A phenomenon called "codon context" that is affected by sequences outside the body Considerable evidence has been accumulated. Missense codon as well as nonsense codon There is a strong effect of the neighboring nutreotide on the efficiency of the suppression of nucleosides. Clearly, heaven Selenocysteine and abundant suppressor activity in natural bacterial populations Termination is also context-dependent, using "stop" codons encoding phosphoserine and phosphoserine Need to be. A similar contextual effect is, of course, the translation fidelity Have also been shown to affect the efficiency of translation initiation. Statistical analysis of the protein coding region of Escherichia coli is a "codon context" Another expression is shown. The presence of a particular codon at one position may Influence the frequency of occurrence of specific nucleotides in The tied is Takasui Genes that are expressed at a low level are significantly different from genes that are expressed at a low level. Context Effect is recognized but associated with preferred nucleotides adjacent to the codon. The estimated value of such statistical rules is relatively low. This provides the desired level of translation efficiency The use of such nucleotide priority data for codon selection to achieve Use is restricted. The advent of automated nucleotide sequencing equipment makes use of large amounts of sequence data from various organisms Making it possible. Understanding those data presents substantial difficulties. For example, the remains To associate gene sequence data with protein sequences, the genomic code It is important to identify the switching area. In addition, the lineage of the genome of a particular organism It is of substantial interest. The genomes of some organisms are a mixture of strains. And is known. At present, some sequences of viral origin are cheap to eukaryotic genomes. It is built into the standard. These viral sequences themselves are another substantially unrelated It may be from a species. Understanding the gene system is important for other organisms. Is important in deriving appropriate similarities between related genes and their translation products there is a possibility. Better understanding of codon context effects on translation and There is a need for a method of determining codons that are suitable for any desired translation effect. Also Also needs a way to identify genomic coding regions from nucleotide sequence data It is said. In addition, it controls protein folding and allows foreign genes to be transmitted to the host. There is also a need for a method to ensure proper folding when expressed. Genes modified or constructed according to the desired translation efficiency are of great value. You. Set for microbial expression of proteins of industrial and pharmaceutical interest Another aspect of performing recombinant DNA technology is "codon preference". For gene expression 'S existing mechanism is that genetically transformed host cells construct the desired and desired product It has been mentioned earlier that it "acts" as The level of expression achieved in an object is partially in the inserted foreign gene Potential for wide variation depending on specific alternative forms of the amino acid-specific genetic code There is. 64 possible triplets of 4 possible nucleotide bases May exist in different forms. These forms (in addition to the start and end of transcription) Providing a message of 20 different amino acids means that some Codons with two or more amino acids Means that it can be coded. In fact, some amino acids are six extra Have several alternative codons, while some others have a single required codon. With don. For reasons that are not fully understood, alternative codons may Are not completely homogeneous within the foreign DNA of the Does not appear to have a variable natural hierarchy or “priority” for a particular codon. Will be As an example, the amino acids leucine are CTA, CTC, CTG, CTT, TTA and And TTG (mRNA codon, CUA, CUC, CUG, CUU, UU, respectively) A and UUG (corresponding to UUG). It is. A thorough analysis of microbial genomic codon frequencies has led to the discovery of E. coli foreign DNA. Most commonly it contains CTG leucine designated codons, whereas yeast and slime molds It has been found that DNA most commonly contains TTA leucine designated codons. I have. In view of this hierarchy, leucine-rich polypeptides are The likelihood that a high level of expression will be obtained depends on the frequency of codon usage. Generally considered. For example, the gene rich in TTA is E. coli in all possibilities. Inferior expression in In contrast, genes rich in CTG probably express polypeptides to a high degree. Likewise Transformation of yeast cells designed to express leucine-rich polypeptides In the case of a recombinant host cell, the preferred codon for use in the inserted DNA is TT A. The implication of the codon preference phenomenon for recombinant DNA technology is clear, Achieving high expression levels of foreign genes in successfully transformed host organisms Explains many conventional failures. Incorporation of codons inferior to "preference" It is present repeatedly in the gene and the mechanism for its expression in the host cell operates efficiently. May not be. This phenomenon involves the preferred codons of the planned host cell Designed synthetic genes are preferred forms for performing recombinant DNA technology It suggests providing foreign genetic material. 5.Protein transport Diversity of functions to classify eukaryotic cells depends on structural differentiation of their membrane boundaries I have. In order to generate and maintain these structures, proteins must be Must be transported from their synthesis site through the cell to a predetermined destination No. This means that the transported protein contacts the major transport pathways Shows the sorting signal recognized by the molecular mechanism responsible for the path selection located at the point Need that. Most protein sorting decisions are based on their final destination, The location in the cell where they perform their function is their permanent residence Need to be done only once as they go through their biosynthetic pathway . Maintaining intracellular integrity is partly due to the selective sorting of proteins and their Depends on accurate transport to the right destination. Over the past few years, protein markers Scrutiny of molecular mechanisms for strategic setting and localization is being actively studied. ‘Destination label Sequence motifs defined on proteins that can act as . Many sorting signals have been found to be associated with the cytoplasmic domain of membrane proteins I have.Summary of the Invention Synthetic polynucleotide containing a DNA sequence encoding a peptide or protein Is provided. The DNA sequence of this synthetic polynucleotide can be expressed in non-homologous hosts. Includes codons that are actually optimized. The present invention relates to HIV env as well as HIV env. Exemplified by synthetic DNA molecules that also encode modifications of Venv. The codons of the synthetic molecule include preferred codons for the intended host cell. This Provides a preferred form of exogenous genetic material. This synthetic molecule is neutralized Antibodies and poly-cells that provide effective immune protection against HIV infection by cell-mediated immunity It can be used as a nucleotide vaccine. The present invention relates to primates and humans. When introduced directly into vertebrates, including mammals, such as A polynucleotide that induces expression of the isolated protein in the animal.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows an expression strategy based on the HIV env cassette. FIG. 2 shows a DNA vaccine-mediated anti-gp120 response. FIG. 3 shows anti-gp120 ELISA of sera of murine DNA vaccinated recipients. Indicate the titer. FIG. 4 shows the relative expression of gp120 after transfection of HIV env PNV cell culture. Show the present. FIG. 5 shows tPA-gP143 / oPtA vs. optB DNA vaccination. Figure 7 shows the average anti-gp120 ELISA response. FIG. 6 shows HIV neutralization by sera of murine DNA vaccinated recipients. FIG. 7 shows sera from murine HIV env DNA vaccinated recipients. 5 shows HIV neutralization. FIG. 8 is an immunoblot analysis of the optimized HIV env DNA construct. . FIG. 9 shows that gp140 DNA and o-gp160 protein were finally vaccinated. Figure 3 shows the anti-gp120 ELISA response in rhesus monkeys after seeding. FIG. 10 shows the SHIV neutralizing antibody response of rhesus monkeys after the final vaccination.Detailed description of the invention Synthetic polynucleotide containing a DNA sequence encoding a peptide or protein Is provided. The DNA sequence of this synthetic polynucleotide was developed in a non-homologous host. Includes codons that are actually optimized. The present invention relates to a synthetic DN encoding HIV env. In addition to being exemplified by the A molecule, modifications of the HIV env are also provided. The codons of the synthetic molecule include preferred codons for the intended host cell. This Provides a preferred form of exogenous genetic material. This synthetic molecule is neutralized Polynus providing immunological protection against HIV infection by antibodies and cell-mediated immunity It can be used as a nucleotide vaccine. The present invention relates to primates and humans. When introduced directly into vertebrates, including mammals, in vivo. Polynucleotides that induce the expression of the protein in the animal. Thus, a synthetic DNA molecule encoding HIV env and HIV env Provided are synthetic DNA molecules encoding the modified forms of This synthetic molecule Dons are designed to use codons preferred by the intended host cell. As mentioned above, the synthetic molecules of this part of the invention may utilize neutralizing antibodies and cell-mediated immunity. Polynucleotide effective to provide effective immunological protection against HIV infection Can be used as This synthetic molecule can be used as an immunogenic composition it can. Also, this part of the invention is directed to spines, including primates and mammals such as humans. Expression of the encoded protein when introduced directly into vertebrates in vivo Also provided is a polynucleotide that is induced in the animal. As used herein, polynucleotides are introduced into living vertebrate cells. When encoded by the gene containing the polynucleotide Produce the desired translation product Nucleic acids containing essential regulatory elements that can be directed to Of the present invention In one aspect, the polynucleotide is operably linked to a transcription promoter. A polydeoxyribonucleic acid comprising at least one HIV gene. The present invention In another embodiment, the polynucleotide vaccine (PNV) comprises a eukaryotic cell machinery. Translationally acceptable (ribosomes, tRNAs, and other translation factors) And a polyribonucleic acid encoding one HIV gene. This polynucleotide That the protein encoded by the protein normally occurs in animals except for pathological conditions Lack (ie, a heterologous protein), such as those associated with the human immunodeficiency virus. Linked proteins, (HIV), etiological agents of acquired immunodeficiency syndrome, AIDS), the animal's immune system is active to mount a protective immune response. Be transformed into Because these exogenous proteins are produced by animal tissues The expressed protein is a major histocompatibility system, MHC-related organisms (HIV) Is handled in a manner similar to that of a real infection. As shown in this disclosure Thus, the result is the induction of an immune response against the allogeneic pathogen. Thus, the present inventors, when introduced into a biological system, Nucleic acids have been prepared that induce the expression of HIV proteins and epitopes. Triggered The resulting antibody response was specific for both expressed HIV proteins, Sum up. In addition, cytotoxic T lymphocytes that specifically recognize and destroy HIV-infected cells The ball is triggered. The present invention disperses in vivo in single cells when introduced into mammalian tissue. Methods for using polynucleotides to induce expression of a gene product are provided. Book The invention relates to the use of multiple rev-dependent HIV genes to obtain rev-independent genes. Provides a different solution that requires no operation. Rev-independent described here Sex expression systems are useful as their own qualities and can be used in single cells in vivo. A system for indicating the expression of one desired gene product. Because many of the uses of the present invention apply to antiviral vaccines, this polynucleotide Otides are often called polynucleotide vaccines, or PNVs. this is, Further usefulness of these polynucleotides in immunostimulation and anti-tumor treatment It is not outside the scope of the present invention. In one aspect of the invention, the gene encoding the HIV gene product is Is inserted into the expression vector. This vector contains eukaryotic RNA poly It contains a transcription promoter recognized by merase, and A transcription terminator is included at the end of the signaling region. In a preferred embodiment, this The promoter may be a number of other known promoters, such as strong immunoglobulins or States in the art that other eukaryotic gene promoters can be used. Those skilled in the art will recognize that the cytomegalo It is an ils promoter (CMV-intA). Preferred transfer terminator Is a bovine growth hormone terminator. CMVintA-BGH Terminator Combinations of tars are particularly preferred. To aid in the preparation of polynucleotides in prokaryotes, eukaryotic cells Antibiotics under transcriptional control of a prokaryotic promoter so that expression of the antibiotic does not occur. A substance resistance marker is also preferably included in the expression vector. Ampicillin resistance inheritance Offspring, neomycin resistance gene and other pharmaceutically acceptable antibiotic resistance markers Can be used. High levels of polynucleotides from fermentation in prokaryotes The vector contains a prokaryotic origin of replication and has a high copy number to assist in the production of That of Is advantageous. Several commercially available prokaryotic cloning vectors are available. Bring these advantages. It is desirable to remove non-essential DNA sequences. Also, Desirably cannot replicate in eukaryotic cells. This is a poly Minimize the risk that the nucleotide vaccine sequence will be integrated into the recipient's genome Make it small. Where it is desired to limit polynucleotide expression to specific tissue types In this case, a tissue-specific promoter or enhancer can be used. In one embodiment, the expression vector pnRSV is used. Rous sarcoma virus (RSV) long terminal repeat (LTR) used as promoter Can be. In another embodiment, the CMV promoter and BGH transcription terminator V1 is used, which is a mutated pBR322 vector cloned in the vector . In another embodiment, the elements of V1 and pUC19 are combined and designated V1J. Expression vectors have been generated. V1J or other desired expression vector contains H IV genes such as gp120, gp41, gp160, gag, pol, e nv, or any other HTV gene capable of eliciting an anti-HIV immune response The child is cloned. In another embodiment, The picillin resistance gene has been removed from V1J and placed in the neomycin resistance gene. In turn, V1J-neo is produced, which is different for use in accordance with the present invention. HIV genes have been cloned. In another embodiment, the gutter is V1Jns, whose unique Sfi1 restriction site is 2114 of V1J-neo. V1Jne except that it is engineered into a single Kpn1 site Same as o. Very low frequency of Sfi1 sites in human genomic DNA (About 1 site per 100,000 bases). Therefore, this vector is Expression vector into host DNA is obtained by simply digesting the genomic DNA thus obtained with Sfi1. Allows for close monitoring of the integration of the monitor. In further improvement , The vector is V1R. In this vector, a very small vector As much non-essential DNA as possible was "cut" from the vector to produce. This Are derivatives of V1Jns. This vector contains unwanted sequences. Larger inserts can be used without worrying about being coded To optimize cellular uptake. One embodiment of the present invention relates to HIV gp160, gp120, gag. And from a laboratory compatible strain of HIV, eg, SF2, IIIB or MN Includes genes encoding gene products. Those skilled in the art will be familiar with HI Gene derived from HIV-2 strain having a function similar to gene derived from V-1 Uses an immune response similar to that described herein for the HIV-1 construct. You will recognize that it is expected to produce. To get these genes Methods for cloning and manipulation of are known to those skilled in the art. Induction of an immune response against a laboratory-matched strain of HIV is among the major field isolates of HIV It will be appreciated that it may not be suitable to produce a sum. Accordingly Thus, in another aspect of the present invention, there is provided a hereditary cell derived from a major toxic field isolate of HIV The offspring are incorporated into the polynucleotide immunogen. This is the c of this viral gene. After preparing a DNA copy, the individual genes are subcloned into a polynucleotide immunogen. This is achieved by Sequences of many genes in many HIV strains are now Major field isolates of such HIV, publicly available from GENBANK Has set up Quality Biological (Qua) to make these strains available. lite Biological, Inc. ) [7581 Lindbergh Drive, Gaithersburg, MD 208 79] with the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (National I nstate of Allergy and Infectious D available (NIAID). Such strains are also World Health Organization (WHO) [Network for the isolation and characterization of HIV (Ne work for HIV Isolation and Characte ration), Vaccine Development Unit Ment Unit), Office of Research, A Global Program on IDS (GlobalProgram on A IDS), CH-1211 Geneva 27, Switzerland]. From this study, those skilled in the art will recognize that one of the usefulness of the present invention is that HI The correlation of V sequence diversity with the serology of HIV neutralization, in addition to other parameters In-vitro and in-vitro trials so you can create It will be appreciated that this is to provide a system for testing and analysis. HIV strain The integration of genes from major isolates of Elicits an immune response against clinical isolates and is therefore still An immunogen is provided that meets the unmet needs. In addition, toxic isolates Modify the immunogen as necessary to reflect the new sequence as it changes Can be For consistency of terminology, the description of the polynucleotide immunogen construct is used here. The following convention is followed: "vector name-HIV strain-gene-additional element". did Thus, the gp160 gene of the MN strain was cloned into the expression vector V1Jneo. The constructed construct has the name given here: "V1Jneo-MN-gp16 0 ". Additional elements added to this construct are described in further detail below. . Precise inheritance that is optimal for incorporation into medicine due to the changing etiology of the virus The child can change. However, it does protect against heterologous strains, as shown below. Elicits a CTL response that is Compared to peptide-based vaccines, the immunogens and vaccines of the invention The variability of the strain is less important. In addition, the drug inserts new genes Due to the ease of operation, this is not easily done with standard techniques of molecular biology. Adjustment. As used herein, the term "promoter" refers to the binding of RNA polymerase. Refers to the recognition site on the DNA strand to be identified. The promoter is an initiator for RNA polymerase. A coalescence is formed, and transcriptional activity is induced to drive. This complex is an “enhancer” Modified by an activating sequence called an inhibitory sequence called a "silencer" Can be The term "leader" as used herein refers to a structure that is transcribed with a gene. Refers to the DNA sequence at the 5 'end of the gene. The leader is usually often a prosequence This produces a protein with an N-terminal peptide extension called. Extracellular medium or For proteins destined to be secreted to one of the membranes, This signal sequence, which is generally hydrophobic, directs the protein into the endoplasmic reticulum, From here the protein is released to the appropriate destination. The term "intron" as used herein refers to an amino acid in a gene product. Refers to a section of DNA that does not code and occurs in the center of a gene. Intron precursor RNA is excised and therefore transcribed into mRNA and translated into protein. To be Nor. The term "cassette" refers to a sequence according to the invention containing the nucleic acid sequence to be expressed. Point to. Cassettes are conceptually similar to cassette tapes. Each cassette is It has its own sequence. Therefore, by replacing the cassette, Vectors express different sequences. Cassette for 5 'and 3' end restriction sites Can be easily inserted, removed, or replaced with another cassette. The term "3 'untranslated region" or "3' UTR" is usually Refers to the sequence at the 3 'end of the structural gene that is transcribed. This 3'UTR area is usually Contains the A sequence. This 3'UTR is transcribed from DNA but translated into protein It is removed before being done. The term "uncoated region" or "NCR" refers to the 3'UT Refers to a region close to the R region. This NCR region contains a transcription termination signal. The term "restriction site" is a sequence-specific cleavage site for a restriction endonuclease. You. The term “vector” refers to the term DNA fragment used to describe a host organism or host. Refers to some means that can be introduced into an organization. Plasmids, bacteriophages There are various types of vectors, including phages and cosmids. The term "effective amount" refers to a P-protein sufficient to produce an appropriate level of polypeptide. Means that NV is injected. Experts in the field have changed this level. Recognize that it can be To illustrate the present invention, the following background on HIV is provided. Human immunodeficiency Viruses have a ribonucleic acid (RNA) genome. This RNA genome is taught here. Generate cDNA copies for cloning and manipulation according to the indicated method Thus, it must be reverse transcribed according to methods known in the art. Each end of the genome is a terminal repeat that acts as a promoter. these Between the ends of the gag, in various reading frames, gag- pol-env is encoded as a major gene product (gag is a group feature). Pol is a reverse transcriptase, or polymerase, and Depending on the region, in alternative reading frames, for example, gp160 gp The viral proteases responsible for post-translational processing to 120 and gp41 are And env is an envelope protein, vif is a virion infectious agent, rev is a regulator of virion protein expression, and neg is a negative regulator. Vpu is a virion-producing factor "u", and tat is a transactivation of transcription. And vpr is the viral protein r). Each of these elements Noh is described. In one aspect of the invention, a gene encoding an HIV or SIV protein Is directly linked to the transcription promoter. The env gene is a large membrane-bound protein It encodes gp160, which is post-translationally modified to gp41 and gp120. The gp120 gene is under the control of the cytomegalovirus promoter for expression. Can be arranged. However, gp120 did not bind to the membrane and thus Can be secreted from the cell upon expression. HIV remains dormant in infected cells Because of this tendency, it is hoped that an immune response against cell-associated HIV epitopes will also occur. I will. In addition, to generate the most effective antibody response for virus neutralization, A membrane-bound oligomeric ENV antigen structurally similar to that produced by virus infection. It is desirable that Kuching be produced. The purpose of this was to target the secreted gp140 epitope (g p140> gp 120+ ectodomain of gp41) or the cell membrane associated epitope gp160. This is achieved in the present invention by initiating an immune response upon expression in vivo. However, in the absence of rev, expression of gp160 was unspliced. Suppressed because the gene is not exported from the nucleus. To understand this system, The life cycle of HIV must be explained in more detail. In the HIV life cycle, the HIV RNA genome is pro- Reverse transcribed into viral DNA and assembled into the host genomic DNA as a single transcription unit Be included. The LTR provides the promoter, which will 3 'direction (gag, pol, env) to transcribe the whole genome Form a photomorph. This unspliced transcript acts as mRNA, from which g Ag and pol are translated, whereas the translation of the gene encoding env Limited splicing must occur. The regulatory gene product rev For expression, rev and env overlap in this genome setting. Therefore, two or more splicing phenomena must occur. env transcription Rev turns to occur The photography must stop, and vice versa. In addition, non-spliced R from the nucleus Rev must be present for NA export. However, rev To act like a rev responsive element (RRE) or not on the transcript [Malim et al., Nature338: 254-257 (19 1989)]. In the polynucleotide vaccine of the present invention, the fully spliced genetic By providing a child (ie: switching the reading frame or Complete open reading of the desired gene product without the need for Providing a coding frame; those of ordinary skill in the art are identified There is some tolerance for splicing of a gene However, as long as a functional coding area is available. This is tolerated), eliminating the essential splice of this particular HIV gene. . Thus, in one aspect, intermittent expression of each gene product is required. The entire coding region of gp160 is spliced out. The dual humoral and cellular immune responses generated by the present invention are: HIV produces mutations in infected individuals as well as in the population This tendency is particularly important in preventing HIV infection. Effective defense against HIV To formulate Kuching, for example, gp160 (env is known to be prevalent in the US human population) HIV-1, which is about 80% conserved across the entire clade B strain) , A major neutralization target of HIV, as well as conserved portions of gpl60 and gag. T cells responsive to internal viral proteins encoded by It is desirable to generate both a multivalent antibody response to it. We are a normal lab Strain; dominant major virus isolate found in infected population; neutralizes antibody epitopes Gp160 designed to expose crossing strains; and gag and pol Other representatives such as the gene (conserved ~ 95% throughout the HIV isolate) Of HIV vaccine containing gp160 gene selected from typical HIV genes are doing. Virtually all HIV seropositive patients who have not progressed to immunodeficiency are anti-gag Have CTLs, whereas about 60% of these patients have cross-strain gp160-specific Shows CTL. However, it has progressed to a disease state known as AIDS Infected individuals The amount of HIV-specific CTL found in the body is very low, indicating that the cross strain C This demonstrates the importance of our discovery that it can elicit a TL response. Induced by our env and gag polynucleotide vaccine constructs Immune responses are shown in mice and primates. production of antibodies to env That the given construct is appropriately immunogenic, That is, confirm that a high percentage of vaccinated animals show an antibody response be able to. Also, mice can be used to test CTL induction by our constructs. This results in suitable and easy animal models, and therefore, certain constructs Used to evaluate whether it is possible to generate gender. Monkeys (Ahu Lizards, green monkeys, rhesus monkeys, chimpanzees) are larger non-rodents Yields additional species including primates for antibody evaluation in animals. Also this These species have high levels of endogenous retroviruses found in mouse serum. Due to their sum activity, they are preferred over mice in performing antiserum neutralization assays. These days Ta is chimpanzee / HIV_IIIBIn experiments in a booster model, this system Levels of neutralizing antibodies known for That sufficient immunogenicity is achieved by our vaccine to achieve protection based on And However, it has now emerged in scientific organizations and has been gradually accepted The definition of protection provided is the so-called “sterilization immunity,” which indicates complete protection against HIV infection. There is a constant shift from disease to disease prevention. Some relevant items for this purpose include H IV reverse transcriptase activity, infectivity of serum samples, p24 or other HIV antigens in blood ELISA assay for concentration, increasing CD4⁺No increase in T cell concentration and viability This includes a reduction in blood virus titers as measured by [e.g., anti-HIV virus. For a discussion of evolving the definition of Kuching potency, see Cohen, J. et al. ,S science 262: 1820-1821, 1993]. In addition, The light immunogen is a neutralizing immune response to infectious (clinical, major field) isolates of HIV. Generate the answer.Immunology A.antibody response to env 1.gp160 and gp120 Using an ELISA assay, secreted gp120 Alternatively, a vaccine vector that expresses either membrane-bound gp160 is an env-specific antibody Whether it is effective for body production To decide. Early in vitro expression of env with our vaccination vector Characterization was provided by immunoblot analysis of gp160 transfected cell lysates. It is. These data indicate that anti-gp visualizes gp160 expression in transfected cells. Confirmation of gp160 expression using 41 and anti-gp120 monoclonal antibodies And quantify. In one embodiment of the present invention, gp160 is gp160 for the following reason. Preferred over 120: (1) the initial gp120 vector is inconsistent in mice Or very poor response in green monkeys Was non-responsive; (2) gp160 was approximately 1 by conjugating gp41. By providing an additional 90 amino acid residues, additional neutralizing antibodies are of course And CTL epitopes; (3) expression of gp160 is associated with tetramer assembly and More similar to the viral env in overall conformation, this is oligomer dependent And (4) we can provide mice, ferrets, and -Bound influenza HA for producing neutralizing antibodies in humans and non-human primates Success of the construct [Ulmer et al., Science2591745-1749; Montgomery, D .; Et al.DNA and Ce11 Biol. 12: 777-783, 1993] as well as anti-gp1 It has been found that the production of 60 antibodies exceeds that of anti-gp120 antibodies. Which Whether the type of env is preferred, or whether the env subfragment catathel is preferred. The choice is determined by the experiments outlined below. 2.Presence and breadth of neutralizing activity ELISA positive antisera from monkeys was tested Show that it neutralizes both homologous and non-allogeneic HIV strains. 3.V3 vs. non-V3 neutralizing antibodies Main purpose for env PNV is broad neutralization Is to produce antibodies. That antibodies to the V3 loop are very strain-specific Has now been shown, and the serology of this response has been used to define strains. a. Non-V3 neutralizing antibodies are discontinuous in gp120 responsible for CD4 binding It appears to primarily recognize structural epitopes. Antibodies to this domain Is polyclonal, and the virus probably binds to cellular ligands. Broader exchanges for the deterrence of mutations, forced by the need for Neutralize the difference. To CD4 immobilized on a 96-well plate with the serum of the immunized animal Try the gp120 binding block An in vitro test is used to test. The second in vitro test is positive To a synthetic peptide corresponding to the selected V3 domain immobilized on a tick Detect antibody binding directly. These tests were used in any of our studies. Neutralizing antibodies produced by our vaccine, compatible with antisera from these animal types Provides in vitro correlation with virus neutralization, as well as determining the type of virus . b. gp41 has at least one major neutralizing determinant, which is broadly Neutralizing 2F5 monoclonal antibody (Viral Testing Systems (V iral Testing Systems Corp. ), Texas Comer Su Tower, 600 Travis Street, Suit 4750, Houston, T X77002-3005 (USA) or Baltheim Falmatsuoiichika ( Waldheim Pharmazeutika) GmbH, Boltzmangase 11, A-1091 commercially available from Vienna, Austria) A highly conserved linear epitope recognized and located at the N-terminus of gp41 Represents other potential sites containing a well-conserved "fusion protein" domain . Gp by immunoblot as described above In addition to the detection of antibodies to 41, these domains immobilized on plastic In vitro assay for antibodies that bind to synthetic peptides presented by Can be. 4.Maturation of antibody response In HIV seropositive patients, the neutralizing antibody response is mainly From the anti-V3, the above-mentioned (# 3) structural gp120 domain containing the gp41 epitope. Proceed to those containing more broadly neutralizing antibodies, including the main epitope. this Monitor these types of antibody responses both over time and throughout the course of subsequent vaccination I do. B.T cell reactivity to env and gag 1.Generate CTL response Virus protein synthesized in cells is MHCI regulated Generate a limited CTL response. Each of these proteins has C Induce TL. Our vaccine also induces CTL in mice Is possible. The immunogenicity of the mouse strain, as shown by influenza NP, Support such studies [Ulmer et al., Science 259: 174. 5-1749, 1993]. Some epitopes are HIV proteins, env, rev, nef and gag defined in Balb / c mice Re Which facilitates in vitro CTL culture and cytotoxicity assays. You. Syngenes such as murine mastocytoma P815 transfected with these genes Provides tumor systems with targets for in vitro antigen-specific restimulation as well as CTL Is advantageously used. Induces MHC class I restricted cytotoxic T lymphocytes Methods for defining possible immunogens are known [Calin-Laurens]. Et al., Vaccine 11 (9): 974-978, 1993; Eriksson et al., Vaccine 11 (8): 859-865, 1993. , Where the T cell activation epitope on HIV gp120 is a primate And g120 amino acids 142-192, 296-3. 43, 367-400, and some regions including 410-453 or each lymphocyte It was found to induce proliferation; in addition, discontinuous regions 248-269 and 27 0-295 was lymphoproliferative. Peptides containing amino acids 152-176 Have also been found to elicit HIV-neutralizing antibodies]. It can be used to identify immunogenic epitopes for inclusion in NV. Or Encoding gp160, gp120, protease, or gag The entire gene can be used. To review this subject further See, for example, Shirai et al. Immunol 148: 1657-1667 Choppin et al., J. Mol. Immunol 147: 569-57 4, 1991; Choppin et al. Immunol 147: 575-5 83, 1991; Berzofsky et al. Clin. Invest. 88 : 876-884, 1991. As used herein, T Cell effector function is dependent on the mature T cell phenotype, eg, cytotoxicity, B cell activation For cytokines and / or recruitment of macrophages and neutrophils Is associated with the stimulus. 2.Measurement of _TH activation Spleen cell cultures derived from vaccinated animals, Specificity by adding either recombinant protein or peptide epitope Test for memory recovery of the target antigen. The accompanying spleen antigen presenting cells APC Activation of T cells by such antigens, as presented in Or monitor by cytokine production. The pattern of cytokine production is also type 1 Or T as type 2_HEnables response categorization. Domain T_H2 responses are immune defenseless Seropositive condition May be correlated with the elimination of cellular immunity in It is possible to define the type of response generated by the PNV of the Operation. 3.Delayed type hypersensitivity (DTH) i. d. DT against viral antigen after injection H indicates cellular predominantly MHCII-restricted immunity. Recombinant HI V protein and synthetic peptides of known epitopes are commercially available Vertebrates vaccinated with these reagents And therefore further information on the induction of cellular immunity N-bijo correlation is provided.defense Based on the immunological studies described above, our vaccines were toxic in vertebrates It can be asserted that it is effective against an attack by V. These studies are These animals were used to construct the PNV construct, or gp160._IIIB, Gag_IIIB, Nef_IIIBas well as REV_IIIBAfter sufficient vaccination with a cocktail of PNV constructs containing V_IIIB/ Chimpanzee virus administration model. This IIIB strain Since a lethal dose of chimpanzee for this strain has been established, It is for. However, it is specific for all strains of HIV and certain strains, or The same study using pitopes is conceivable. Second vaccination / virus administration model Dell is a scid-hu PBL mouse in addition to chimpanzees. This model Dell describes the human lymphocyte immune system and our administration following HIV administration in the mouse host. Enables vaccine testing. This system is easily adapted for use with any HIV strain. And provides evidence of protection against multiple strains of major field isolates of HIV This is advantageous. A third viral administration model is a hybrid HIV / SIV virus. (SHIV). Some of them infected rhesus monkeys, and as a result It has been shown to lead to a fatal immunodeficiency [Li, J. et al. Et al.J. AI DS 5: 639-646, 1992]. Rhesus monkey on our polynucus Subsequent lethal doses of SH are vaccinated with the leotide vaccine construct. Protection against IV administration occurs.Summary of PNV construct HIV and other genes are optimized for polynucleotide vaccination Ligated expression vector. Transcription promoter, immunogenic epitope, Transcription terminator, bacteria Essentially all exogenous D, leaving the origin of replication and the essential elements of the antibiotic resistance gene Remove NA. Expression of HIV late genes such as env and gag is rev dependent, and r requires that the ev response element (RRE) be present on the viral gene transcript . In the absence of rev, the secreted form of gp120 is tPA (histotype). Heterologous leaders, such as those derived from plasminogen activator), preferably Are leaders such as those found in highly expressed mammalian proteins Gp120 leader peptide, such as an immunoglobulin leader peptide It can be produced by substituting the peptide. We use transfected cells ( RD, human rhabdomyosarcoma lineage) efficiently expressing secreted gp120 s inserts the tPA-gp120 chimeric gene. Monocistron gp16 0 indicates that no transformation was performed by the transformation without adding the rev expression vector. It does not produce any protein.Representative construct components include (but are not limited to) the following: I) 1. tPA-gp120_MN; 2. gp160_IIIB; 3. gag_IIIB: For anti-gag CTL; 4. tPA-gP120_IIIB; 5. tPA-gp140 6. Structural mutation: V1, V2, and / or V3 loop deletion or substitution Having tPA-gP160; 7. Antigens expressed by pathogens other than HIV, including but not limited to Influenza virus nucleoprotein, hemagglutinin, Trix, neuraminidase, and other antigenic proteins; herpes simplex Russ gene; human papillomavirus gene; tuberculosis antigen; hepatitis A, B, or C Gene encoding viral antigen. The protective efficiency of the polynucleotide HIV immunogen against subsequent viral administration is Demonstrated by immunization with the non-replicating plasmid DNA of the present invention. This is an infectious agent And does not require assembly of virus particles, and allows selection of determinants. This is advantageous. In addition, gags and proteases and some other Because the sequence of the gene product is conserved among various strains of HIV, Same species as the strain from which the gene was obtained Virulent strains of HIV, as well as Defense against feeding is possible. A DNA expression vector encoding gp160 was used for i. m. By injecting A considerable degree of protective immunity to subsequent viral administration occurs. In particular, gp160 Specific antibodies and major CTL are generated. Immune response to stored proteins The answer is whether the variable envelope protein may shift antigenically and drift. Nevertheless, it can be effective. Each of the HIV gene products shows some conservation; And because CTLs are produced in response to intracellular expression and MHC treatment, many viruses Assert that a gene produces a response similar to that achieved for gp160 it can. Thus, cloned and sequenced in the expression vector Many of these genes, as shown by the It has been cloned to be an available form of immunogenic agent. The present invention provides a cross-protection without the need for a self-replicating agent or adjuvant. Provides a means for inducing immunity. In addition, the polynucleotide of the present invention Immunization offers several other benefits. This vaccination approach uses C D8⁺C TL response is important for pathophysiological processing of both infectious agents and tumors [K. Tanaka et al., Annu. Rev .. Immunol. 6,359 (19 1988)], and should be applicable to both. Therefore, the transformation Inducing an immune response to a protein important for the process is It can be an effective means of treatment. Viral proteins and human growth hormone DNA The production of high titer antibodies to proteins expressed after injection is Separately from or in combination with cytotoxic T lymphocyte vaccines targeting targeted antigens Combined, it is an easy and very effective means of producing antibody-based vaccines Suggest that. The ease of production and purification of DNA constructs is favored by the tradition of protein purification And therefore facilitate the production of combination vaccines. did Thus, for example, gp160, gp120, gp41, or any other HIV Multiple constructs encoding a gene can be prepared, mixed and co-administered. Wear. Since the expression of the protein is maintained after DNA injection, the expression of B and T cells The persistence of memory is enhanced, which produces long-lasting humoral and cell-mediated immunity. I can do it. Standard techniques of molecular biology for preparing and purifying DNA constructs The preparation of the DNA immunogen of the invention becomes possible. Therefore, the standard technology of molecular biology is Certain constructs disclosed herein that are sufficient to produce the products of the present invention Surprisingly, surprisingly, the standard inactivated whole virus or subunit Cross-strains and major H, a result that could not be achieved with protein vaccines Novel polynucleotide immunogens that result in neutralization of IV isolates are provided. Expressible DNA or transcribed R to be introduced into the vaccine recipient The amount of NA depends on the strength of the transcription and translation promoter used and the production of the expressed gene. Depends on the immunogenicity of the organism. Generally, about 1 ng to 100 mg, preferably An immunologically or prophylactically effective amount of about 10 μg to 300 μg directly to muscle tissue Is administered. Subcutaneous injection, intradermal introduction, press-through through the skin, and other modes of administration, such as Intraperitoneal, intravenous, or inhalation delivery is also expected. Additional vaccinations Be expected. After vaccination with an HIV polynucleotide immunogen, gp160 Immunization with HIV protein immunogens such as g120, g120, and gag gene products Plague is also considered. Interleukin- 12 proteins or GM-CSF or similar proteins, alone or in combination Together, or concurrently with or subsequent to parenteral introduction of the PNV of the present invention. May be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously or by other means of administration. It is profitable. The polynucleotide may be naked, ie, any protein, In association with adjuvants or other agents that impact the recipient's immune system It is not necessary. In this case, the polynucleotide is a physiologically acceptable solution, e.g. For example, but not limited to, sterile saline or sterile buffered saline Desirably in salt water. Alternatively, the DNA is in liposomes, for example, Cytin liposomes or other liposomes known in the art, and DN A-liposome mixture may be associated or Adjuvants known to enhance epidemiological responses, such as proteins or other It may be associated with a carrier. Agents that help cells take up DNA, for example , But is not limited to, calcium ions can also be advantageously used You. These agents are generally referred to herein as transfection facilitating reagents and pharmaceutically acceptable agents. It is called a carrier that can be used. The polynucleotide is coated Techniques for coating small microprojectiles are known in the art and likewise Useful in connection with the present invention. The following examples are offered by way of illustration and the present invention Is not intended to be limiting. Example 1 Material description Vectors pF411 and pF412: These vectors are Gallo's Subcloned from the laboratory constructed vector pSP62. pSP 62 is Biotech Research Laboratories. arch Laboratories, Inc. ). pSP62 is a member of the HXB2 genome subcloned from lambda HXB2. It has a 5 kb Xbal fragment. pSP62 is digested with SalI and XbaI HXB2 fragment: 5'-XbaI / SalI, 6.5 kb and 3'-Sa 11 I / XbaI, 6 kb is generated. These inserts were replaced with the SmaI of pUC18. And pF411 (5'-XbaI) by subcloning into the SalI site. / SalI) and pF412 (3'-XbaI / SalI). pF41 1 is gag / Pol, and pF412 contains tat / rev / env / nef.Repligen reagent Recombinant rev (IIIB), # RP1024-10 Recombinant gp120 (IIIB), # RP1001-10 Anti-rev monoclonal antibody, # RP1029-10 Anti-gp120 mAB, # 1c1, # RP1010-10AIDS Research and Reference Reagent Program Anti-gp41 mAB hybridoma, Chessie 8, # 526 This strategy involves cytotoxic T lymphocytes (CTL) as well as HIV, primarily HIV gag (〜95% storage) and env (gp160 or gp120; 70-80% Storage) designed to elicit both a neutralizing antibody response to the gene product You. The importance of anti-env and anti-gag CTL responses has been attributed to their cellular immunity. Clearance of primary viremia after initiation and before onset of neutralizing antibodies As is known, the parallelism in the maintenance of disease-free condition As well as the role of CTL, gp160 is known among HIV particles. Contains only the sum antibody epitope. Because HIV is renowned for its genetic diversity, we Should the highly conserved gag gene generate a broad cross-strain CTL response? There are some alternatives derived from clinical isolates and gp41 (~ 90% conserved) Broader neutralizing antibodies can be obtained by including a representative env gene I expect. Example 2 Heterologous expression of HIV late gene products HIV structural genes such as env and gag produce full-length proteins Requires the expression of the HIV regulatory gene rev. We are gag rev Dependent expression results in low levels of protein and rev itself is toxic to cells Find out what is possible. We have a relatively high level of gp160 in vitro Although the vaccine achieved rev-dependent expression of Induces only low levels of antibodies to gp160 after in vivo immunization with DNA Did not. This means that, in addition to the known cytotoxic effects of rev, muscles with hundreds of nuclei Increased difficulty in obtaining rev function in tubes (gag or env protein) For the expression of quality to occur, the rev protein Is required to be in the same nucleus as the rev-dependent transcript) Seem. However, the selected modification of the env gene makes it rev independent It is possible to obtain expression. The use of these plasmids as vaccines has been evaluated. It is in the process of being paid. Generally, our vaccines include the CMV immediate early (IE) promoter, BGH poly Our generalized vaccination comprising an adenylation site and a pUC backbone To optimize expression in the vector V1Jns, HIV (IIIB) The env and gag genes are used. How large gene segments are used (Eg, gp120 versus gp160) efficiency of rev-dependent expression Altering the env by recruiting its native secretory leader peptide Replacement with that of the specific plasminogen activator (tPA) gene The resulting chimeric gene behind the CMVIE promoter with It can be achieved by making it manifest. tPA-gp120 is configured in this manner. This is an example of a constructed secreted gp120 vector, which is vaccinated mice and mice. Works well to elicit an anti-gp120 immune response in mice. The membrane-anchored protein has a higher amount (and May elicit an antibody response (possibly more specific for HIV neutralization) V1Jns-tPA-gp16 for reporting that it provides an immune epitope for 0 and V1Jns-rev / gp160 were prepared. tPA-gP160 vector -Indicates that the expression level is rev / gp160, and the rev-dependent gp160 expression plasmid. Although much lower than that obtained with As shown, detectable amounts of gp160 without the addition of rev And gp120. This is probably rev dependent on the gp160 transcript Inhibitory region (referred to as INS) that confer properties includes the COOH-terminus of gp41 This is due to multiple sites within gp160 (see schematic diagram of gp143 construct strategy). See FIG. 1 for details). The COOH-terminus of tPA-gp160 was truncated Vectors were prepared for the form, tPA-gp143. This is because these inhibitors Designed to increase overall expression level of env by removing sequences . In addition, this gp143 vector is a membrane protein that is Peptide motifs that are known to result in protein conversion (eg, Also, the intracellular gp41 region containing leu-leu) is removed. Therefore, gp14 3 shows that expression of env protein (reduction of rev dependency is low) compared to full-length gp160. And increase the efficiency of protein transport to the cell surface. To induce more anti-gp160 antibody after DNA vaccination. I can do it. tPA-gP143 is used to remove additional inhibitory sequences of expression Further silent mutations of the rev response element (RRE) sequence (350 bp) Further modifications were made due to the differences. This construct gp143 / mutRRE has two forms Removal of the proteolytic cleavage site of gp120 / 41 (Form A) or retention (Form B). Both forms are non-cleavable expressed in vaccinia Vaccination of mice with a novel gp160 is much higher than the cleavable form Prepared for reports that elicited antibodies to levels of gp160. Quantitative ELISA for expression of gp160 / gp120 in cell transfectants , Were developed to determine the relative expressibility of these vectors. 293 cells In vitro transfection followed by quantification of cell association versus secreted / released gp120 The following results were obtained: (1) tPA-gP160 While maintaining similar properties for transport to the cell surface, it is more 5- Expressed 10-fold less gp120; (2) tPA-gp143 showed low levels of Vesicle-associated gp143 secretes gp120 3-6 times more than rev / gp160 However, the cytoplasmic tail of gp160 has been modified by partially deleting this sequence. Confirmed to cause intracellular retention of gp160, which can be resolved And (3) tPA-gp143 / mutRRE A and B are for Form A Although removal of proteolysis was confirmed, it was 10 to 10 times lower than that of parental Resulted in fold higher protein expression levels. FIG. 4 supports the points (1) to (3). Representative data are shown below. Thus, our strategy to increase rev-independent expression is at the overall expression stage. Of the membrane-immobilized gp143 from the lysosome to the cell surface, with a significant increase Also give. If there are some antigenic differences between different virus strains, The gp120 sequence derived from various virus isolates was_Two-Terminal (tPA Lee Vector containing these modifications at either the OH or COOH-terminus (gp41). It is important to note that it should be possible to insert is there. In other words, This involves inserting gp120 derived from various major virus isolates. Genetic constructs that can be more easily modified to obtain clinically relevant vaccines It is. Applying these expression strategies to viruses related to vaccine applications, our application In order to confirm the universality of the approach, we examined the major HIV isolates (North American Consortium). Census V3 peptide loop; macrophage tropic and non-fusogenic cell-induced phenotype Was also prepared. This vector -Resulted in high expression / secretion of gp120 in transfected 293 cells and Elicited an anti-gp120 antibody in which it was cloned in a functional form. To indicate that The major isolate gp160 gene is also derived from a laboratory strain g Used for expression in the same manner as p160. Example 3 Immune response to HTV-1 env polynucleotide vaccine : Green monkeys (AGM) and rhesus monkeys vaccinated with gp120 DNA vaccine ( RHM) showed low levels of neutralizing antibodies after 2-3 vaccinations, Increase with Kuching I couldn't do that. These results indicate that oligomer gp160 or possibly gp HIV vaccine is more likely to be a target antigen associated with the induction of neutralizing antibodies than 120 monomers Recognition in the Chin field (Moore and Ho,J. Virol.67: 863 ( 1993)), the efficacy of gp160-based vectors (see above) Leading us to focus on getting the right expression. Mouse and AGM Were vaccinated with the primary isolate-derived tPA-gp120 vaccine. These movements Antibodies ranging from 500-5000 anti-V3 peptides (using homologous sequences) Shows reciprocal endopoint antibody titers, and the design of this vaccine is clinically relevant. Indicates functional for the associated virus isolate. The gp160 based vaccines, rev-gp160 and tPA-gp160, Fail to elicit consistently antibody responses in mice and non-human primates; Resulted in low antibody titers. Our first ligation with the tPA-gp143 plasmid The results were> 10 in mice and AGM after two vaccinations.^ThreeThe geometric mean of A titer resulted. These data indicate that we increased gp1 by increasing expression levels. Greater immunogenicity of 60-like vaccine Indicates improvement. This construct was constructed using tPA-gp143 / mutRRE. Characterize antibody responses, especially virus neutralization, in addition to A and B vectors to continue. Similarly, vaccination with gp120 DNA will result in a secretion of TH-1-like cytokines. Lofir (ie, g-interrupt with little or no IL-4) -Feron and IL-2 production) with all lymphoid compartments tested (spleen, blood Fluid, groin, mesentery and iliac tract) produced a strong helper T cell response. These cytokines generally promote strong cell-mediated immunity, and The disease has been associated with maintaining no condition. Lymph nodes contain the virus in the blood HI, which has a large reservoir of virus, even when it is still not detectable It has been shown to be a major site of V replication. Shown in our DNA vaccine Are capable of eliciting anti-HIV immune responses at various lymphatic sites Kuching helps to prevent successful lymphatic colonization after the initial infection. obtain. As stated earlier, we believe that the following objectives will be realized in this program: Considered essential for maximizing the chances of success: (1) stronger in primates Generating a neutralizing antibody response (2) CTLs and helpers in primates Ga elicits a potent T lymphocyte response characterized by effector function g and env vectors; (3) env from clinically relevant HIV-1 strains Of gamma and gag genes in our vaccines and the immunology they elicit Characterization of specific responses, especially neutralization of major isolates; (4) appropriately optimized vaccines Animal virus administration model, such as chimpanzee / HIV (IIIB ) Or demonstration of protection in rhesus monkey / SHIV; and (5) suitable for clinical use The duration of the immune response. The first three of these objectives are large. Progress has been made, our recent vaccination construction against gp160 and gag Experiments are ongoing to determine if the body improves these early results . Example 4 Vectors for vaccine production A.V1Jneo expression vector, SEQ ID NO: 1 Ampicillin may not be available in large-scale fermenters Used for antibiotic screening of bacteria having V1J^rNeed to be removed Was. SspI and Eam Digestion with the 1105I restriction enzyme resulted in amps from the pUC backbone of V1J.^rTo Removed. The remaining plasmid was purified by agarose gel electrophoresis and T4DN After blunting with A polymerase, treatment with calf intestinal alkaline phosphatase Was. Derived from transposon 903 and contained in the pUC4K plasmid Commercially available kan^rThe gene was excised using PStI restriction enzyme and Purified by Rose gel electrophoresis and blunt-ended with T4 DNA polymerase . This fragment is ligated to the V1J backbone and is named V1Jneo # 1 and 3. , Kan^rPlasmids having the gene in either direction were derived. These programs Each of the rasmids was confirmed by restriction enzyme digestion analysis and DNA sequencing of the junction region, These were shown to produce similar amounts of plasmid as V1J. these The expression of heterologous gene products is comparable to that of V1J. there were. Kan in the same direction as ampr in V1J^rV1Jne containing gene o # 3 is arbitrarily selected as an expression construct and is hereinafter referred to as V1Jneo (sequence Number 1). B.V1Jns expression vector: V1Jneo added SfiI to facilitate integration studies Rank was added. Commercially available 13 base pair SfiI linker (New Ing Land Biolabs (New England BioLabs) At the KpnI site within the BGH sequence of the vector. V1Jneo is straight line with KpnI And gel-purified, blunt-ended by T4 DNA polymerase, and blunt-ended S ligated to fiI linker. Select clone isolates by restriction mapping And confirmed by sequencing of the entire linker. This new vector is called V1Jns It was named. Expression of the heterologous gene in V1Jns (with SfiI) is (K (with pnI) comparable to the expression of the same gene in V1Jneo Was. C.V1Jns-tPA: To provide a heterologous leader peptide sequence to secreted and / or membrane proteins, V1 to include a tissue-specific plasminogen activator (tPA) leader Jn was modified. After annealing the two synthetic complementary oligomers, the BglII And ligated to V1Jn. Sense and antisense oligomers are 5 ' -GATCACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GG G CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GA-3 '(SEQ ID NO: 2) and 5'-GAT CT C GCT GGG CGA AAC GAA GAC TGC TCC AC A CAG CAG CAG CAC ACA GCA GAG CCC TC T CTT CAT TGC ATC CAT GGT-3 '(SEQ ID NO: 3) there were. The Kozak sequence is underlined in the sense oligomer. these Oligomers have overhanging bases compatible with ligating to the BglII cleavage sequence . After ligating, the downstream BglII retains for subsequent ligating Disrupted the upstream BglII site. The junction and the entire tPA leader sequence are Confirmed by sequencing. In addition, our Consensus Optimized Better V1Jn s (= V1Jneo with SfiI site) to match KpnI site Blunt ends with T4 DNA polymerase, then SfiI linker (catalog # 1138, New England Biolabs) Thus, the SfiI restriction site was changed to K1 in the BGH terminator region of V1Jn-tPA. Located at the pnI site. This modification is performed by restriction digestion and agarose. It was confirmed by gel electrophoresis. Example 5 I.HIV env vaccine construct:Vaccines producing secreted env inducing antigens (gp120 and gp140) Expression of a rev-dependent env gene such as gp120 was performed as follows: gp120 was isolated from the MN strain of HIV with the native leader peptide sequence (V1 Jns-gp120), or tissue plasmino that replaces the native leader peptide (V1Jns) as a fusion with the antigen activator (tPA) leader peptide -TPA-gp120) and PCR cloned. Expression of tPA-gp120 is rev independence [B. S.ChapmanNuc . Acids Res. 19, 3979 (1991); gp120 gene Note that other leader sequences have similar effects in making rev independent Should be aware]. This uses the above vector to construct the following gp120 construct: Achieved by preparation.Example 6 120 vaccine construct : A.V1Jns-tPA-HIV _MN gp120: The first 30 amino acids of the peptide leader sequence are removed and V1Jns- Cloning into tPA followed by the remaining gp120 sequence after amino acid residue 30 Designed to facilitate the production of chimeric proteins consisting of PA leader peptides The HIVMNgp120 gene (Med-Imun (Med immune)) was PCR amplified. This design is based on the rev-independent gp120 Considering the secretion of soluble gp120 from the current and cells carrying this plasmid It is. The sense and antisense PCR oligomers used were 5'-CC C CGG ATC CTG ATC ACA GAA AAA TTG TG GGTC ACA GTC-3 '(SEQ ID NO: 4) and 5'-C CCC AG G AATC CAC CTGTTA GCG CTT TTC TCT C TG CAC CAC TCT TCT C-3 '(SEQ ID NO: 5). Transliteration The translation stop codon is underlined. These oligomers are sense oligomers Located on the 3 'side of BamHI With a BclI site, B at either end of the translational open reading frame. It contains an amHI restriction enzyme site. The PCR product was BclI and then BamHI And ligated to BglII digested V1Jns-tPA After that, the calf intestine was treated with alkaline phosphatase. Sequence the resulting vector In-frame fusion between tPA leader and gp120 coding region And gp120 expression and secretion were analyzed by immunoblot analysis of transfected RB cells. More verified. B.V1Jns-tPA-HIV _IIIB gP120: This vector was prepared using the HIV IIIB strain for the gp120 sequence, I. A. Similar to The sense and antisense PCR oligomers used were: Respectively: 5'-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAAT TG TGG GTC ACA GTC-3 '(SEQ ID NO: 6) and 5'-CC A CAT TGA TCA GAT ATC TTA TCT TTT TT C TCT CTG CAC CAC TCT TC-3 '(SEQ ID NO: 7) Was. These oligomers also have a BclI site at either end of the insert. In addition to the EcoRI, Eco just upstream of the BclI site at the 3 'end. Bring RV. The 5 'terminal BclI site is the BglII part of V1Jns-tPA. Ligated to the position without the tPA leader sequence and its native leader sequence It allows the generation of a chimeric tPA-gp120 gene encoding gp120. Ligation products were confirmed by restriction digestion and DNA sequencing. Example 7 140 vaccine construct : These constructs are based on tPA with the tPA leader in place of the native leader. -Prepared by PCR as for gp120, but with the gene transmembrane peptide NH_Two -Designed to produce secreted antigen by immediate termination at the terminus (design Carboxy-terminal amino acid sequence = NH_Two−. . . . . TNWLWYIK-C OOH) [SEQ ID NO: 8]. Unlike the gp120 producing construct, the gp140 construct Produces oligomeric antigens and is defined by a 2F5 monoclonal antibody Known gp41-containing antibody neutralizing epitopes such as ELDKWA (SEQ ID NO: 53) Should be kept. The gp160 proteolytic cleavage site at the junction of gp120 and gp41 is retained. Removed (B) or removed (A) In two forms (A or B), according to Kienny et al. (Prot. Eng.2 volumes: 219-255 (1988)). The construct was prepared by exchange (wild-type sequence = NH_Two−. . . . . KAKRRVVQ REKR. . . . . COOH (SEQ ID NO: 9) and mutant sequence = NH_Two−. . . . . KAQNHVVQNEHQ. . . . . COOH (SEQ ID NO: 10), mutant amino acid Carboxylic acids are underlined). A.V1Jns-tPA-gp140 / mutRRE-A / SRV-1 3'- UTR (HIV-1 _IIIB base) : This construct contains the vector IVB (containing the optimized RRE-A segment). To obtain the AvrII / EcoRV segment from Obtained by PCR using a sense PCR oligomer: 5'-CT GAA AG A CCA GCA ACT CCT AGG GAAT TTG GGG T TG CTC TGG-3 '(SEQ ID NO: 11) and 5'-CGC AGG G GA GGT GGT CTA GAT ATC TTA TTA TTT T AT ATA CCA CAG CCA ATT TGT TAT G-3 '( SEQ ID NO: 12). Simian retrovirus-1 (SRV-1, see below) 3'-UTR, prepared as a synthetic gene segment, derived from gp SrfI restriction enzyme introduced just 3 'of 140 open reading frame Inserted at the prime site. This UTR sequence is rev independent of HIV env and gag. It has been previously described as facilitating persistence. B.V1Jns-tPA-gp140 / mutRRE-B / SRV-1 3'- UTR (HIV-1 _IIIB base) : This construct is constructed using the construct IVC as a starting material by using the env protein Similar to ITA, except that the cleavage site is retained. C.V1JnS-tPA-gp14 / opt30-A (based on HIV-1 _IIIB ) : This construct was digested with AvrII and SrfI and then gp30. Synthetic DNA segments containing the corresponding but optimal codons for translation (gp3 below) Derived from IVB by ligating (see 2-opt). This g p30-opt DNA was prepared from gp32-opt by the following sense and antisense. 5'-GGT AC, respectively. A CCT AGG CAT CT G GGG CTG CTC TGG-3 '(SEQ ID NO: 13) and 5'-CCA CAT GAT ATCG CCC GGG CTTA TTA TTT GAT GTA CCA CAG CCA GTT GGT GAT G-3 ' (SEQ ID NO: 14). This DNA segment is used for AvrII and EcoRV restriction enzymes. With AvrII and SrfI to remove the corresponding DNA segment. To V1Jns-tPA-g143 / opt32-A (IVD) digested with I did it. The resulting product was used for DNA sequencing of the ligation junction and It was verified by lot analysis. D.V1Jns-tPA-gp140 / opt30-B (HIV-1 _IIIB base ) : This construct is identical to I construct except that the env proteolytic cleavage site is retained. Similar to IC. E. FIG.V1Jns-tPA-gp140 / opt all-A: The env gene of this construct completely comprises the optimal codon. Its constant region ( C1, C5, gp32) are additional synthetic DNA segments corresponding to the variable regions 1-5. Is inserted using a synthetic DNA segment comprising the optimal codons for translation. Yes, IV B, D, and H (based on the following HIV-1 MNV1-V5) See examples). F.V1Jns-tPA-gp140 / opt all-B: This construct is identical to I construct except that the env proteolytic cleavage site is retained. Similar to IE. G. FIG.V1Jns-tPA-gp140 / opt all-A (non-IIIB strain): This construct has a variable env amino acid sequence from strains other than IIIB (V1 -V5) except that it is used to determine optimal codon usage throughout the region Similar to IIE above. H.V1Jns-tPA-gp140 / opt all-B (non-IIIB strain): This construct is identical to I construct except that the env proteolytic cleavage site is retained. Similar to IG. Example 8 gp160 vaccine construct : There are two forms (A or B) depending on the site of gp160 proteolytic cleavage described above. A buried body was prepared. A.V1Jns-rev / env: In this vector, the entire tat coding region of exon 1 is rev-opened. Except for deletion to the beginning of the reading frame, Is a variant of what is V1Jns-gp160IIIB (see section A above) Digestion with PstI and KpnI restriction enzymes to remove the 5 'region of the gp160 gene Was. Using PCR amplification, the first of gp160 from the HXB2 genomic clone A DNA segment encoding from the REV exon to the KpnI site was obtained. C Sense and antisense PCR oligomers were 5'-GGT ACA, respectively. CTG CAG TCA CCG TCC T ATG GCA GGA AG A AGC GGA GAC-3 '(SEQ ID NO: 15) and 5'-CCA CAT CA GGT ACC CCA TAA TAG ACT GTG ACC- 3 '(SEQ ID NO: 16). Each of these oligomers is a DNA fragment To provide PStI and KpnI restriction enzyme sites at the 5 'and 3' ends. Got DNA was digested with PStI and KpnI and purified from agarose gel by electrophoresis. It was ligated to V1Jns-gp160 (PstI / KpnI). Obtained Rasmids were verified by restriction enzyme digestion.B. V1Jns-gp160 : HIV_IIIbHIV derived from clone HXB2_IIIb3 'terminal half of genome From the plasmid pF412 containing_IIIbgp160 Was cloned. PCR sense and antisense were 5'-GG, respectively. T ACA TGA TCAACC ATG AGA GTG AAG GA G AAA TAT CAG C-3 '(SEQ ID NO: 17), and 5'-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATCTTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3 '(SEQ ID NO: 18). Kozat And the translation stop codon are underlined. These oligomers have e BclI restriction enzyme outside the translational open reading frame at both ends of the nv gene Add a prime part. (The BclI digestion site is ligated to the BglII digestion site. Matches, after which the sensitivity to both restriction enzymes is lost. BclI is gp160 Was selected for PCR cloning. This indicates that this gene is located at the BamHI site. Because it additionally contains internal BglII). The antisense oligomer also EcoRv was inserted before the BclI site for the other PCR-derived genes described above. Enter. The amplified gp160 gene was purified by agarose gel and digested with BclI. Digested with BglII and treated with calf intestinal alkaline phosphatase Ligated to V1Jns. This cloned gene has a size of about 2.6 kb. Each junction of gp160 with V1Jns was confirmed by DNA sequencing. Was. C.V1Jns-tPA-gp60 (HIV-1 _IIIB base): This vector uses PCR to convert full-length gp160 without the original leader sequence. Similar to Example 1 (C) above, except that it was obtained. The sense oligomer is I. C. And the antisense oligomer is the 5'- CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3 '(SEQ ID NO: 19) . These oligomers are available at the 3 'end, as well as at either end of the insert. An EcoRV immediately upstream of the BclI site also provides a BclI site. 5 'end B The clI site was ligated to the BglII site of V1Jns-tPA, resulting in tPA Leader sequence and its original leader sequence To generate chimeric tPA-gp160 encoding gp160 that does not contain Make it work. Ligation products were verified by restriction digestion and DNA sequencing . D.V1Jns-tPA-gp60 / opt C1 / opt41-A (HIV- 1 _IIIB base) : This construct is based on IVH, with C5 and gp41 instead of gp32. G with a codon segment fully optimized for Further optimized codon segments replacing C1 at the amino terminus of p120 (see below) Reference). This new C1 segment is used to synthesize the junction C1 / 143. The remaining gp143 was obtained by SOE PCR using the following oligomers for PCR. Glued to the segment: 5'-CCT GTG TGT GAG TTT A AAC TGC ACT GAT TTG AAG AAT GAT ACT AAT AC-3 '(SEQ ID NO: 20). The resulting gp143 gene is V1-V Includes optimal codon usage except for 5 regions, located at the junction of C1 and V1 , A unique PmeI restriction enzyme for inserting variable regions derived from other HIV genes Has a site. E. FIG.V1Jns-tPA-gp160 / optC1 / opt41-B (HIV _II _IB base) : This construct is identical to I construct except that the env proteolytic cleavage site is retained. Similar to IID. FV1Jns-tPA-gp160 / opt all-A (HIV-1 _IIIB Source) : The env gene of this construct completely comprises the optimal codons described above. Its stationary The regions (C1, C5, gp32) are those described in IIID, E, which Used as cassette (used for all fully optimized gp160) In contrast, the variable regions V1-V5 are synthetic DNA segments containing optimal codons. Derived from the statement. G. FIG.V1Jns-tPA-gp160 / opt all-B: This construct is identical to I construct except that the env proteolytic cleavage site is retained. Similar to IIF. H.V1Jns-tPA-gp160 / opt all-A (non-IIIB strain): This construct has a variable env amino acid sequence from strains other than IIIB (V1 -V5) of optimal codon usage over the entire region Similar to IIIF above, except used in the determination. I.1Jns-tPA-gp160 / opt all-B (non-IIIB strain): This construct is identical to I construct except that the env protein cleavage site is retained. Similar to IIH. Example 9 gp143 vaccine construct : These constructs, like the other tPA-containing constructs described above, are native leaders. Instead, it was prepared by PCR using tpA, but the COOH-terminated membrane-bound env (Planned intracellular amino acid sequence = NH_Two-NRVR QGYSP-COOH). This construct provides for expression of env associated with tPA introduction. When the transcript or peptide region corresponding to the intracellular portion of env is expressed or Protein stability / minimizing the possibility of negatively impacting transport to the cell surface Designed for the purpose of combining with As described above, gp160 proteolytic cleavage There are two forms (A or B) depending on whether the site has been removed or retained. ) To prepare the construct. Residual gp41 from truncation to gp143 The fragment is called gp32. A.V1Jns-tPA-gp143: This construct is plasmid with the following sense and antisense PCR oligomers: Prepared by PCR using pF412: 5'-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3 '(SEQ ID NO: 21), and 5'-CCA CAT TGA TCA GCCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCC CTG CCT CA C TCT GTT CAC-3 '(SEQ ID NO: 22). The obtained DNA fragment is at the Sr-fl site immediately 3 'to the env open reading frame BclI restriction for cloning into digested V1Jns-tPA / BglII Restriction sites at either end. The construct is ligated to the DNA sequence of the ligation junction. Determination and validation by immunoblot analysis of transfected cells (FIG. 8). B.V1Jns-tPA-gp143 / mutRRE-A: This construct uses a unique MunI restriction enzyme site and the downstream SrfI site described above. Was based on IVA by excision of the DNA segment. This segment Corresponds to the gp120C5 domain and the entire gp32 protein. gp1 60 of The optimal code for translation corresponding to 〜350 bp of the rev responsive element (RREA) The synthetic DNA segment containing the primers is analyzed by splice overlap extension (SOE) PCR. The junction of the remaining gp32 segments, thereby joining the junction of these two fragments An AvrII restriction enzyme site was created (however, no change in the amino acid sequence was observed). No). Each of these PCR reactions generates a gp32-containing domain, Performed using the following sense and antisense PCR oligomers: 5'-CT GAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAT TTG GGG TTG CTG TGG-3 '(SEQ ID NO: 23) and 5'-CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT CAC-3 '[distribution Column No. 24] (this is used as an antisense oligomer for IVA T). The mutated RRE (mutRRE-A) segment was replaced with the following sense oligos: Mer, 5'-GGT ACA CAA TTG GAG GAG CGA GT T ATA TAA ATA TAA G-3 '(SEQ ID NO: 25) and gp32 SOE using antisense oligomer used for preparing segment It was joined to the wild-type sequence of gp32 by PCR. The obtained conjugated DNA segment Was digested with MunI and SrfI restriction enzymes and the parental gp143 / MunI / Sr Ligation to the fI digested plasmid. The resulting construct was ligated and DNA sequencing of SOE PCR junctions and immunoblot analysis of transfected cells (FIG. 8). C.V1Jns-tPA-gp143 / mutRRE-B: This construct uses the mutRRE-B synthetic gene segment instead of mutRRE-A. That the env proteolytic cleavage site is retained by using Except for IVB, except. D.V1Jns-tPA-gp143 / opt32-A: This construct was compatible with AvrII and SrfI restriction digests, followed by gp32. However, a synthetic DNA segment containing codons optimal for translation (gp32 below) derived from IVB by ligation (see opt). Product obtained Was verified by ligation junction DNA sequencing and immunoblot analysis. . E. FIG.V1Jns-tPA-gp143 / opt32-B: This construct uses IVC as the initial plasmid. Similar to TVD except that the more env proteolytic cleavage site is retained I do. F.V1Jns-tPA-gp143 / SRV-1 3'-UTR: This construct was derived from Simian retrovirus (SRV-1, see below). 3'-UTR leads just 3 'of the gp143 open reading frame Similar to IVA except that it was inserted into the inserted SrfI restriction enzyme site. This UTR sequence facilitates rev-independent expression of HIV env and gag. As previously described. G. FIG.V1Jns-tPA-gp143 / optC1 / opt32A: This construct is based on IVD and is completely optimized for C5 and gp32. Gp120 amino acid with an optimized codon segment followed by a tPA leader The terminal C1 has been replaced with a further optimized codon sequence (see below). This new The C1 segment consists of the following P for synthesizing the joined C1 / 143 segment: The remaining gp143 segment was obtained by SOE PCR using an oligomer for CR. Joined to: 5'-CCT GTG TGT GAG TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AA G AAT GAT ACT AAT AC-3 '(SEQ ID NO: 26). can get The gp143 gene contains optimal codon usage except for the V1-V5 region, The unique PmeI restriction enzyme site for inserting the variable region derived from the IV gene is C 1 and V1. H.V1Jns-tPA-gp143 / optC1 / opt32B: This construct is identical to I construct except that the env proteolytic cleavage site is retained. Similar to VH. I.V1Hns-tPA-gp143 / opt all-A: The env gene of this construct completely comprises the optimal codon. Its constant region ( C1, C5, gp32) are described in 4B, D, H, and the variable region V1 A further synthetic DNA segment corresponding to -V5 contains codons optimal for translation Using a synthetic DNA segment. J.V1Jns-tPA-gp143 / opt all-B: This construct is identical to I construct except that the env proteolytic cleavage site is retained. Similar to VJ. K.V1Jns-tPA-gp143 / opt all-A (non-IIIB strain): This construct has a variable env amino acid sequence from strains other than IIIB (V1 -V5) above, except that it was used to determine optimal codon usage over the entire region Similar to IIIG. L.V1Jns-tPA-gp143 / opt all-B (non-IIIB strain): This construct has a variable env amino acid sequence from strains other than IIIB (V1 -V5) above, except that it was used to determine optimal codon usage over the entire region Similar to IIIG. Example 10 gp143 / glyB vaccine construct : These constructs are compatible with the other tPA-containing constructs described above (tPA-gp120, tP A-gp140, tPA-gp143 and tPA-gp160) Prepared by PCR using the tpA leader instead of the It was designed to produce a COOH-terminated membrane bound env similar to 143. However However, the gp143 / glyB construct has six amino acids in the intracellular peptide domain. Planned to include the last 4 Are the same as those at the carboxyl terminus of human glycophorin B (glyB) protein. Gp143 (planned intracellular amino acid sequence = NH_Two− NRLIKA-COOH (SEQ ID NO: 27), glyB and env and glyB The residue corresponding to "R" common to both is underlined). This construct Completely removes any transcript or peptide region corresponding to the intracellular portion of env To enhance env expression and directed targeting to the cell surface Designed for acquisition. The intracellular portion of this env divides this region into short cytoplasmic domains. Main (intracellular amino acid sequence = NH_Two-RRLIKA-COOH) By substituting with a peptide sequence from a protein (glyB) expressed in Expression or protein stability / transport to the cell surface can be negatively impacted. As mentioned above Thus, the gp160 proteolytic cleavage site has been removed or retained. Constructs were prepared in two forms (A or B), depending on the type. A.V1Jns-tPA-gp143 / opt32-A / glyB: This construct describes the intracellular peptide domain of gp143 as described above. The following antisense PCR oligomer to replace the glycophorin B Same as IVD except that was used: 5'-CCA CAT GATA TCG CCC GGG C TTA TTA GGC CTT GAT C AG CCG GTT CAC AAT GGA CAG CAC AGC-3 '(SEQ ID NO: 28). B.V1Jns-tPA-gp143 / opt32-B / glyB: This construct has the same structure as the V Similar to A. C.V1Jns-tPA-g143 / optC1 / opt32-A / glyB: This construct shows that the first constant region (C1) of gp120 is similar to IVH for translation. Same as VA except replaced with the appropriate codons. D.V1Jns-tPA-gp143 / optC1 / opt32-B / glyB : This construct has the same structure as the V Similar to C. E. FIG.V1Jns-tPA-gp143 / opt all-A / glyB: The env gene of this construct completely comprises the optimal codons described above. F.V1Jns-tPA-gp143 / opt all-B / glyB: This construct has the same structure as the V Similar to E. G. FIG.V1Jns-tPA-gp143 / opt all-A / glyB (non-II IB) : This construct has a variable env amino acid sequence from strains other than IIIB (V1 -V5) above, except that it was used to determine optimal codon usage over the entire region Similar to IIIG. H.V1Jns-tPA-gp143 / opt all-B / glyB (non-II IB) : This construct has the same structure as the V Similar to G.HIV env vaccine constructs with various loop deletions : These constructs are compatible with all env forms described above (gp 120, gp140, gp143, gp160, gp143 / glyB) However, various loops within gp120 (eg, V1, V2, and / or Or V3) is deleted. The purpose of these modifications is to preserve such a CD4 binding site. Eliminating peptide segments that can delay the exposure of a stored neutralizing epitope It is. For example, create a V1 / V2 deletion to create a junction of the C1 and C2 segments. The following oligomers are used in the PCR reaction to achieve: 5'-CT G ACC CCC CTG TGT GTG GGG GCT GGC AG T TGT AAC ACC TCA GTC ATT ACA CAG-3 ' (SEQ ID NO: 29). Example 11 Designing synthetic gene segments to increase env gene expression : Gene segments must have the same translated sequence (unless noted) "Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid sequence data: Synthetic Oligonucleotides Probes Deduced from Amino Acid Sequence Data: Theoretic and Practi cal Considations) "by J. Molec. Biol. . 183, pp. 1-12 (1985). Lathe Were converted to sequences with alternative codon usage as defined by HIV env inheritance The following methodology for increasing the rev-independent expression of offspring segments is described in mammals The known impossibility of efficient expression of this gene in cells is a consequence of the overall transcript composition. Based on our hypothesis that it is an effect. Therefore, the same protein sequence By using alternative codons to encode, Constraints on v expression can be removed. Scrutinize codon usage in env Thus, depending on the human gene in which a high proportion of codons are highly expressed, It turned out to be among those that were never used. Features used Another codon replacement method, using data from Lathe et al., Is described as follows: Can be 1. Identify codon locations for the appropriate open reading frames. 2. Wild-type codons are frequently used by observed human genes. (See Table 3 of Lathe et al.). 3. If codons are not the most commonly used, the data in Table 5 Based on that, replace it with the optimal codon for high expression. 4. Adjacent to the third nucleotide of the new codon and immediately 3 'to the first Check the first nucleotide of the codon. By selecting a new codon, 5'-CG- If a 3 'pairing has occurred, replace it with the selection indicated in Table 5. 5. This procedure is repeated until all gene segments have been replaced. 6. New gene sequences are created using the undesired arrangements created by these codon substitutions. Sequence (eg, "ATTTA" sequence, inadvertent intron splice recognition site Creation, unwanted restriction sites, etc.) and remove these sequences. Use codons instead. 7. The synthetic gene segments are assembled and tested for improved expression. These methods can be used to create genes comprising codon usage that is perfectly optimal for expression. The following HIV env synthetic gene seg Were used to create the comments: 56/19, 73/26, 78/2, respectively. 8, and 61/25 codon / nucleotide substitution ratios for each segment (I) gp120-C1 (opt); (ii) V1-V 5 (opt); (iii) RRE-A / B (mut or opt); and (iv) gp30 (opt). Each of these segments has been described in detail above, It has the actual sequence described below. gp120-C1 (opt) This is a mature N-terminus designed to have optimal codon usage for expression. G120 constant region 1 (C1) gene from the beginning to the beginning of V1. MN V1-V5 (opt) This is an induction of HIV MN V1-V5 with optimal codon usage for expression. Gene segment corresponding to the protein sequence (1066BP). RRE. Mut (A) This indicates that the HIV-1 rev responsive element comprises optimal codon usage for expression. DNA segment corresponding to the element (RRE). The “A” form is bold By using the indicated nucleotides, the gp120 / gp41 junction is known. Proteolytic cleavage sites have also been removed. RRE. Mut (B) This indicates that the HIV-1 rev responsive element comprises optimal codon usage for expression. DNA segment corresponding to the element (RRE). “B” form is gp120 / g Retains a known proteolytic cleavage site at the p41 junction. gp32 (opt) It starts with the end of the RRE, comprising the optimal codon for expression. ) The gp32 gene segment from the AvrII site to the end of gp143. . SRV-1 CTE (A) This corresponds to the 3'-UTR from the Simian retrovirus-1 genome. Synthetic gene segment. This DNA increases rev-independent expression Therefore, it is located at the 3'-end of the HIV gene in the following orientation. SRV-1 CTE (B) This synthetic gene segment contains a single nucleotide protrusion to remove the ATTTA sequence. SRV- shown above, except that a mutation (shown in bold) was used. 1 Same as CTE (A). This sequence is associated with increased mRNA turnover. -Accompanied. Example 11 Expression of gp120 vaccine in vitro : These constructs were used in transfected human rhabdomyosarcoma (RD) cells. In vitro expression was tested. TPA-gp12 secreted from transfected RD cells By quantifying 0, V1Jns-tPA-gp120 vector is secreted gp 120 was produced.In vivo gp120 vaccination : V1Jns-tPA-gp120 _MN PNV induced class II MHC -Specific gp120-specific antigen reactivity 200 μg of V1Jns-tPA-gp120_MNHave been vaccinated twice Balb / c mice are sacrificed and recombinant gp To measure the reactivity of helper-T lymphocytes to B.120 in vitro Was extracted from the spleen. T cell proliferation assays were performed in pairs with PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells). Replacement gp120μ_IIIB(Repligen, Catalog # RP10 16-20) at 5 μg / ml and 4 × 10^FivePerformed at cells / ml. these By the cells^ThreeThe basal level of H-thymidine incorporation was determined at 2 μg / ml by Con These cells can be cultured in medium alone while stimulating maximal growth using A-stimulation. And obtained. ConA-induced reactivity peaks at ３3 days, at which time media vs. Control samples were collected along with the control samples, whereas the antigen-treated samples were supplemented with additional media controls on day 5. Collected with. Response of vaccinated mice to untreated, age-matched syngeneic Compared to mice. The ConA positive control was, as expected, in both untreated and immunized mice. Showed very high proliferation in the subjects. Very strong helper T cell memory responsiveness is gp12 0 treatment obtained in vaccinated mice versus untreated mice Did not respond (the threshold of inactivity was a stimulation index (SI) of> 3-4; SI was Calculated as the ratio of sample cpm / medium cpm). About vaccinated mice 6 5 and 14 SIs were obtained, which were assigned to these mice, respectively. Comparable to anti-gp120 ELISA titers of 5643 and 11,900 for . Interestingly, for these two mice, the response was greater for the antibody. The clones had much lower T cell reactivity than those with lower antibody titers. This experiment demonstrates that secreted gp120 vector is transformed in vivo with helper T cells. Not only efficiently activate cells but also generate strong antibody responses. In addition, each of these immune responses was compared to that encoded by the inoculated PNV. Determined using antigens that were heterogeneous in comparison (IIIB vs. MN). Example 12 gp160 vaccine In addition to the secreted gp120 construct, we express the full length membrane bound gp160. Constructs are being prepared. The rationale for the gp160 construct in addition to gp120 is: (1) CTL stimulation and strong HIV neutralizing monoclonal antibody (2F5, see above) See more epitopes for both gp41-containing neutralizing antibody production (2) more native for virus-producing gp160 The ability to obtain protein structures; and (3) membrane formation for immunogenicity Influence Success of the HA construct [Ulmer et al., Science 259: 1745-1 749, 1993; Montgomery, D .; Et al., DNA and Ce 11 Biol. , 12: 777-783, 1993]. gp16 0 retains considerable rev dependency even with a heterologous leader peptide sequence Therefore, additional structures to increase expression in the absence of rev A built body was made.Example 13 Assay for HIV cytotoxic T lymphocytes : The method described in this section describes the assay used in vaccinated mice . Essentially similar assays should establish an autologous B cell line as the target cell for each animal. It can be used in primates, except where it must. This is about humans Using Epstein-Barr virus and herpes type B for rhesus monkeys. This can be achieved using a virus. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were obtained from freshly collected blood or spleen using leukocytes. Is induced using Ficoll-Hipark centrifugation to separate erythrocytes from E. coli. mouse For, lymph nodes can also be used. Effector CTL is PBMC From I 6-12 days in L-2 (20 U / ml) and Concanavalin A (2 μg / ml) By in vitro culture or by using specific antigens, It can be prepared using irradiated antigen-presenting cells. The specific antigen is the Peptide, a known epitope for CTL recognition of the MHC haplotype of a product (Usually 9-15 amino acids) or a vaccine engineered to express the appropriate antigen It may be a Tinia virus construct. Even if the target cells are syngeneic, MH being processed to present the appropriate antigen described for in vitro stimulation It may be a C haplotype-matched cell line. For Balb / c mice, P 18 peptides (ArgIleHisIleGlyProGlyArgAlaPh eTyrThrThrLysAsn [SEQ ID NO: 37] for the HIV MN strain) In vitro restimulation of CTLs with irradiated syngeneic spleen cells at a concentration of 10 μM 1-10 μM can be used and for sensitization of target cells during cytotoxicity assays Use by incubating at 37 ° C for about 2 hours prior to this assay Can be. These H-2^dMurine obesity for MHC haplotype mice The cell tumor cell line P815 yields good target cells. Target at 37 ° C And incubated for 1-2 hours (~ 5 x 10⁶0.2 mCi for cells), next By washing the target cells several times, Na-sensitized target cells⁵¹CrO_Four Which is released from inside target cells when killed by CTL. CT The L population is divided into target cells and various ratios of effector to target, for example, 100: Mix at 1: 50: 1, 25: 1, pellet together and incubate at 37 ° C. for 4-6 hours. The supernatant was collected after cubation and then released using a gamma counter. Assay for release of radioactivity. Cytotoxicity is subtracted from spontaneous release from target cells Target cells (obtained using 0.2% Triton X-100 treatment) Calculated as the percentage of total counts that can be released from Example 14 Assay for HIV-specific antibodies : Using either specific recombinant proteins or synthetic peptides as substrate antigens ELISA was designed to detect antibodies raised against HIV. 96 Well microtiter plates were incubated overnight at 4 ° C in PBS (phosphate buffered saline). (Water) using 2 μg / ml of the recombinant antigen in 50 μl / well. Coated on the drum. The antigen is a recombinant protein (gp 120, rev: Repligen; gp160, gp41: American Bio- Technologies, Inc. (American Bio-Technologies, I nc. )) Or a synthetic peptide (corresponding to the virus isolate sequence from IIIB) V3 peptide, etc .: American Bio-Technologies, Inc .; Gp41 epitope of body 2F5). Wash plate with washing buffer (PBS / After washing four times with 0.05% Tween 20), do not shake for 1 hour at room temperature. 200 μl / well of blocking buffer (PBS / 0.05% Tween) 1% Carnation milk solution in 20) was added. . Dilute the pre-serum and immune serum to the desired dilution range in blocking buffer, and 100 μl was added per well. Shake the plate at room temperature for 1 hour After the cuvette, it was washed four times with a washing buffer. Next, the blocking buffer Secondary with horseradish peroxidase, diluted 1: 2000 with Antibodies (anti-rhesus monkey Ig, Southern Biotechnology Associates (So Southern Biotechnology Associates; Anti-Mau And anti-rabbit Ig, Jackson Immuno Research (Jacks) on Immuno Research) was added to each sample at 100 μl / well. And incubated for 1 hour at room temperature with shaking. Buff washing plate After washing 4 times with a buffer, 1 mg / ml in 100 mM citrate buffer, pH 4.5 O-phenylenediamine (o-PD, Calbiochem) )) Color was developed by adding 100 μl / well. Plate 450 Kinetics (first 10 minutes of reaction) and 10 and 30 minutes for absorption in nm Both end points were read (Thermo-max micro Tire Leader, Molecular Devices ices)). Example 15 Assay for HIV neutralizing antibody : In vitro of HIV isolates using serum derived from vaccinated animals The test of the sum was performed as follows. Test sera and pre-immune sera are used at 56 ° C before use. For 60 minutes. A titrated amount of HIV-1 was diluted in a 1: 2 serial dilution of the test serum. After incubating at room temperature for 60 minutes, 10 in the^FiveAdded to MT-4 human lymphocytes. this The virus / cell mixture was incubated at 37 ° C. for 7 days and the culture was Assayed for virus-mediated cell death by staining with chromium dye . Virus neutralization is observed by preventing virus-mediated cell death. Example 16 Isolation of genes from clinical HIV isolates : Infected PBMC activating HIV virus gene by ConA treatment Cloned. A preferred method for obtaining a viral gene is to use the desired gene By PCR amplification from infected cell genome using specific oligomers adjacent to It was. A second method for obtaining viral genes involves the use of supernatants from infected cells. Purifying irs RNA and preparing cDNA from this material by subsequent PCR It was due to. This method depends on the PCR oligomer used and the specific initial Except for the random 6-hour break used to generate cDNA instead of stimulating oligomers And is very similar to that described above for the cloning of the murine B7 gene I do. Genomic DNA was transferred from infected cell pellets to proteinase K and SDS. 0.1 mg / ml and 0.5% final concentration respectively STE solution (10 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 m M Tris-HCl, pH 8.0). This mixture Is incubated overnight at 56 ° C. and 0.5 volumes of phenol: chloroform: a Extracted with soamyl alcohol (25: 24: 1). Then a final concentration of 0.3M The aqueous phase is precipitated by adding up to sodium acetate and 2 volumes of cold ethanol. I let you go. After pelleting the DNA from the solution, the DNA is (1 × TE = 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) Turned cloudy. At this point, add SDS to 0.1% with 2 U of RNAse A. And incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Add this solution to phenol / chloroform After extraction with lum / isoamyl alcohol, precipitated with ethanol as before . Suspend the DNA in 0.1 × TE and measure its UV absorption at 260 nm. And quantified by: Samples were stored at -20 <0> C until used for PCR. Perkin-Elmer Cetus Key Procedure using the following sense and antisense oligomers for the kit and gp160 PCR was performed using: 5'-GA AAG AGC AGA AGA CAG TGG CA A TGA-3 '(SEQ ID NO: 38) and 5'-GGG CTT TGC TAA ATG GGT GGC AAG TGG CCC GGG CATG TG G-3 '(SEQ ID NO: 39). These oligomers are the 3'-terminal of the resulting DNA fragment. Add a SrfI site at the end. The PCR-derived segment was converted to V1Jns or V1R Cloned into one of the Kuching inoculation vectors and added to the ligation junction. The V3 region was confirmed by DNA sequencing. Example 17 T cell proliferation assay : Obtain PBMCs and target specific antigens as determined by expansion within the PBMC population Test for memory resurrection response. Proliferation was added to the cell culture^ThreeH-thymiji The last 18-24 hours of incubation prior to collection is monitored using Fine The cell harvester will keep the isotype-containing DNA on the filter if growth is occurring. In contrast, quiescent cells do not take up the isotype, It does not stay on the filter in a state. Either rodent or primate species And 4 × 10^Five Cells were transferred to a total of 200 μl of complete culture in a 96-well microtiter plate. Smear (RPMI / 10% fetal calf serum). Background proliferation response is P Determined with BMC and medium alone, versus phytohemagglutinin (PHA) or A lectin such as concanavalin A (ConA) is used at a concentration of 1-5 μg / ml. Generate a non-specific response and serve as a positive control. Specific antigens are known Consists of either a peptide epitope, a purified protein, or an inactivated virus . The antigen concentration was 1-10 μM for peptides and 1-1 for proteins. It is in the range of 0 μg / ml. Lectin-induced growth is not It peaked on days 3-5, whereas the antigen-specific response peaked on days 5-7. And A radiation count at least three times higher than the culture background Specific growth occurs, often as a percentage of background, Alternatively, it is obtained as a stimulation index (SI). HIV gp160 is gp160 / g Some are known to cause T cell proliferation in p120 immunized or HIV infected individuals. It is known to contain some peptides. The most commonly used of these What is: T1 (LysGlnIleIleAsnMetTr pGlnGluValGlyLysAlaMetTyrAla [SEQ ID NO: 40] ); T2 (HisGluAspTleIleSerLeuTrpAspGlnS) erLeuLys [SEQ ID NO: 41]); and TH4 (AspArgValIle). GluValValGlnGlyAlaTyrArgAlaIleArg [sequence No. 42]). These peptides are used in antigen-sensitized mice, non-human primates, and And stimulate the growth of PBMCs from humans and humans. Example 18 Preparation of Vector VIR : In our efforts to continue optimizing our basic vaccination vector, we A derivative of V1Jns was prepared and named V1R. The construction of this vector The goal was to make sure that all of the optimized heterologous gene expression characteristics and V1J and V1Jns were Minimal size vector vaccines still retain high plasmid yields That is, to obtain those which do not contain unnecessary DNA sequences. We sentence In addition to experiments, (1) pUC mainly containing the E. coli origin of replication Intrachain regions can be removed without affecting plasmid yield from bacteria Is possible; (2) if a bacterial terminator is inserted instead, Kan following the kanamycin open reading frame^rThe 3 'region of the gene And (3) ３００300 bp of the 3 ′ half of the BGH (BGH element (Following the original KpnI restriction enzyme site in It was determined that it could be removed. CMVintA promoter / BHG terminator, origin of replication, And three DNA segments representing kanamycin resistance are synthesized from V1Jns The V1R was constructed by using PCR for PCR. Each segment has its own system Restriction enzymes were added to each segment end using PCR oligomers: CMVint For A / BHG, SspI and XhoI; kan^rEco for genes RV and BamHI; and ori^rFor BclI and SalI. these Enzyme sites are used to determine the orientation of each of the PCR-derived DNA segments. And selected to allow subsequent loss of each site: EcoRV and And SspI leave blunt-ended DNA compatible with ligation, whereas , BamHI and BclI leave similar overhangs as SalI and XhoI. these After obtaining the segments by PCR, place each segment into the appropriate restriction enzyme indicated above. Digestion, and then ligated together in a single reaction mixture containing all three DNAs. I did it. The 5 'end of the orir is responsible for providing termination information to the kanamycin resistance gene. As can be effected, the T2 rho independence normally found in this region It was designed to include a terminator sequence. The ligated product is transferred to a restriction enzyme Digestion (> 8 enzymes) as well as DNA sequencing at the ligation junction I confirmed it. Using DNA plasmid yield and viral gene in V1R Heterologous expression appears to be similar to V1Jns. Vector size achieved Was 1346 bp (V1Jns = 4.86 kb; V1R = 3 . 52 kb), [SEQ ID NO: 43 herein; FIG. 11 and WO95 / 24485. See also SEQ ID NO: 100; PCT International Application PCT / US95 / 02633]. . PCR oligomer sequence used for V1R synthesis (restriction enzyme sites are underlined And identified in parentheses following the sequence): (1) 5'-GGT ACAAAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC G-3 '[Ssp I], (SEQ ID NO: 44): (2) 5'-CCA CATCTC GAG GAA CCG GGT CA A TTC TTC AGC ACC-3 '[XhoI], (SEQ ID NO: 45): (For CMVintA / BHG segment) (3) 5'-GGT ACAGAT ATC GGA AAG CCA CG T TGT GTC TCA AAA TC-3 '[EcoRV], (SEQ ID NO: 46): (4) 5'-CCA CATGGA TCC G TAA TGC TCT GCC AGT GTT ACA ACC-3 '[BamHI], (SEQ ID NO: 4 7): (For kanamycin resistance gene segment) (5) 5'-GGT ACATGA TCA CGT AGA AAA GA T CAA AGG ATC TTC TTG-3 '[BclI], (SEQ ID NO: 48): (6) 5'-CCA CATGTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3 '[SalI], (SEQ ID NO: 49): (For cerebral bacteria replication origin) For V1R, sequence the ligation junction using the following oligomers did: 5'-GAG CCA ATA TAA ATG TAC-3 '(SEQ ID NO: 5 0): [CMVintA / kan^rJoint] 5'-CAA TAG CAG GCA TGC-3 '(SEQ ID NO: 51): [ BGH / ori junction] 5'-G CAA GCA GCA GAT TAC-3 '(SEQ ID NO: 52) : [Ori / kan^rJoint] Example 19 Heterologous expression of HIV late gene products HIV structural genes such as env and gag efficiently convert full-length proteins In order to produce, it requires expression of the HIV regulatory gene rev. We gag Rev-dependent expression produces only low levels of protein and rev itself It has been found that the body can be toxic to cells. We compare in vitro Despite achieving relatively high levels of g160 rev-dependent expression, this vaccine does not Antibodies to gp160 after in vivo immunization with ev / gp160 DNA Triggers only at low levels. This is in addition to the known cytotoxic effects of rev, hundred Increased difficulty in obtaining rev function in myotubes with multiple nuclei (gag or For expression of the env protein to occur, the rev protein must be a rev-dependent transcript. Need to be in the same nucleus). However Rev-dependent expression can be obtained using selected modifications of the env gene is there. 1.Rev independent expression of env: In general, our vaccines have a CMV immediate early (IE) promoter, BGH induced Our generalization comprising a polyadenylation and transcription termination sequence, and a pUC backbone In order to optimize expression in the vaccinated vaccination vector V1Jns, mainly The HIV (IIIB) env and gag genes are used. How big a gene Depending on whether the segment is used (eg, gp120 vs. gp160), r Altering the efficiency of ev-dependent expression is a function of env in its natural secretory pathway. Peptide for the tissue-specific plasminogen activator (tPA) gene Obtained after the CMVIE promoter with CMV intron A This can be achieved by expressing the chimeric gene thus obtained. tPA-gp 120 is built in this way Is an example of a secreted gp120 vector that has been vaccinated mice and monkeys. Works well to elicit an anti-gp120 immune response. The membrane-anchored protein has a higher amount (and May elicit an antibody response (possibly more specific for HIV neutralization) Due to reports of gaining additional epitopes, V1Jns-tPA-gp1 60 and V1Jns-rev / gp160 were prepared. tPA-gp160 vector The level of expression is rev / gp160, rev-dependent gp160 expression plus Immunoblot analysis of transfected cells, albeit much lower than those obtained with mid As shown by, no detectable amount of gp16 was added without adding rev. 0 and gp120 were produced. This is probably due to the rev. The plurality of inhibitory regions imparting viability in gp160 containing the COOH-terminal of gp41 This is because it occurs at the site. COPA-terminal of tPA-gp160 is truncated A vector was prepared for the modified form (tPA-gp143). This is Designed to increase the overall expression level of env by removing the inhibitory sequence of Was. Also, this gp143 Vectors cause the conversion of membrane proteins to lysosomes rather than the cell surface Intracellular gp41 containing a peptide motif known to be (eg, Leu-Leu) Also remove the area. Therefore, gp143 is required to reduce (rev Increased expression of env protein and compared to full-length gp160 These proteins are expected to increase the efficiency of protein transport to the cell surface. Higher induction of anti-gp160 antibody after DNA vaccination is expected . tPA-gp143 responds to rev response to remove additional inhibitory sequences of expression Further silent mutations of the sex element (RRE) sequence (350 bp) Modified. This construct gp143 / mutRRE has two forms: gp120 Either removal (form A) or retention (form B) of the proteolytic cleavage site of / 41 Was prepared. Both forms harbor non-cleavable gp160 expressed in vaccinia. The vaccination of the mice used has a much higher level of gp16 than the cleavable form. Prepared for literature reports that elicited an antibody to 0. Quantitative ELISA for expression of gp160 / gp120 in cell transfectants To determine the relative expressibility of these vectors. Developed to decide. In vitro transfection of 293 cells followed by cell association Quantification of secretory / released gp120 gave the following results: (1) t PA-gp160 retains similar properties in intracellular versus cell surface release, expressed 5-10 times less gp120 than rev / gp160; (2) tP A-gp143 is a lower level of cell-associated gp143 than rev / gp160. They secrete gp120 3-6 times more, which disrupts the cytoplasmic tail of gp160. Gp160 cells that can be solved by partially deleting the sequence of And (3) tPA-gp143 / mut RRE A and B are those in which removal of proteolytic treatment was confirmed for Form A Results in a protein expression level that is 10-fold higher than the parental tPA-gp143 did. Thus, our strategy to increase rev-independent expression is to reduce the overall expression level. Redirection of membrane-immobilized gp143 from lysosome to cell surface with gradual increase There is also an attachment. This is a genetic construct, which has a different window If there are several antigenic differences between L. strains, different primary virus isolates The gp120 sequence derived from_Two-Terminal (tP A leader) or COOH-terminal (gp41) with these modifications Note that it should be possible to insert into a vector cassette is important. FIGS. 2-7 show gp143-based constructs, preferably tPA-gp143-based. HIV infection of various constructs, including but not limited to 8 shows data supporting its use as a DNA vaccine against E. coli. FIG. -143 (opt41) is GMT = 10^ThreeInduces anti-gp120 antibody response in the range Indicates that it will be emitted. In FIG. 3, several DNAs containing gp143-based constructs Anti-gp120 antibody titers for the vaccine have been measured and compared. FIG. Shows tPA-gp143 and tPA-1 compared to the tPA-gp160 construct. 4 shows the relative expression of 43 / mutRRE. In FIG. 5, tPA-gp143 construction Anti-gp120 antibody production was measured for both optA and optB forms of the body Have been. FIG. 6. Neutralization against HIV strain following murine DNA vaccination. TPA-gp143-optA and tPA-gp143 that promote antibody production 2 shows the ability of several DNA vaccines, including -optB. FIG. 7 also shows tPA-gp 143-optA, tPA-gp 143-optB, tPA-gp143-optA-glyB and tPA-gp HIV neutralization data of various DNA vaccine constructs, including 143-optB-glyB Data. 2.Expression of gp120 derived from clinical isolates: Applying these expression strategies to viruses related to vaccine applications, our application To confirm the universality of the approach, we used primary HIV isolates (North American Consortium). Census V3 peptide loop; macrophage tropic and non-fusogenic cell-induced phenotype Was also prepared. This vector -Resulted in high expression / secretion of gp120 in transfected 293 cells and Elicits anti-gp120 antibodies in Indicates that the The major isolate gp160 gene was also derived from a laboratory strain. Used for expression in the same manner as gp160. 3.Immune response to HIV env polynucleotide vaccine Effect of vaccination route on immune response in mice: expression of gp160 Efforts are ongoing to improve the immune response, but we TPA-gp A 120 DNA construct is used. Intramuscular (im) and intradermal (id) The Kuching inoculation route was tested at doses of 100, 10, and 1 μg for this vector. Comparisons were made in mice. Vaccination by any route is for all three types After 2-3 vaccinations at the dose level, the antibody response (GMT = 10^Three-10^Four) Triggered. Each route has similar dose-dependent anti-gp120 antibody titres. Evoked with response. However, we have i. d. About vaccination, Greater variability in response was observed, especially at lower doses after the first inoculation. Further In addition, healing as measured by antigen-specific in vitro proliferation and cytokine secretion The par T cell response is i. i. m. Higher after vaccination. I For this vaccine, i. m. Compared to i. d. Vaccination It concluded that it did not bring any benefits. 4.Gp120 DNA vaccine-mediated helper T cell immunity in mice: gp120 DNA vaccination is performed at T_H-1 like cytokine secretion profile (Ie g-interferon with little or no IL-4 And IL-2 production) All lymphoid compartments tested (spleen, blood, groin, mesentery and iliac segments) And produced a strong helper T cell response. These cytokines are generally powerful Promotes cell-mediated immunity and is linked to maintaining disease-free status in HIV-seropositive patients Have been. Lymph nodes are when the virus is not yet detectable in the blood Even has been shown to be a major site of HIV replication, with a large reservoir of the virus. ing. Anti-antibodies to various lymph sites, as shown in our DNA vaccine Vaccines capable of eliciting an HIV immune response are found in lymphatic vessels after the initial infection. Can help hinder the successful colonization of the plant. 5.env DNA vaccine-mediated antibody response: Green monkeys (AGM) and rhesus monkeys vaccinated with gp120 DNA vaccine ( RHM) showed only low levels of neutralizing antibodies after 2-3 vaccinations, which Vaccination could not increase this. These results indicate that the oligomer Gp160 is probably a marker associated with the induction of neutralizing antibodies over gp120 monomer With the increasing recognition in the HIV vaccine field that it is a Led us to focus on obtaining effective expression of ing. Also, Vaccination of mice and AGM with major isolate-derived tPA-gp120 vaccine did. These animals have a range of 500-5000 anti-V (using homologous sequences). Three peptide reverse endpoint antibody titers are shown, indicating that the design of this vaccine is clinically relevant. Indicates functional for the associated virus isolate. The gp160 based vaccines, rev-gp160 and tPA-gp160, Fail to elicit consistently antibody responses in mice and non-human primates; Produces only low antibody titers. Using our tPA-gp143 plasmid, Initial results show> 10 in mice and AGM after two vaccinations.^ThreeNono What resulted in a mean titer (GMT). These data indicate that we have Of gp160-like vaccines by more efficient intracellular delivery of env to This shows that the immunogenicity is significantly improved. This construct was constructed using tPA-gp143. / MutRRE In addition to the A and B vectors, the antibody response, especially neutralization of the virus Continue characterization. 6.Env DNA vaccine-mediated CTL response in monkeys: We have vaccinated gp120 and gp160 / IRES / rev DNA. Continue to characterize CTL response of seeded RHM did. All four monkeys vaccinated with this vaccine were treated after two vaccinations. Showed significant MHC class I restricted CTL activity (effector / target = 20 20-35% specific kill activity). After the fourth vaccination, these activities Under the same test conditions, the kill activity is increased to 50-60%, which is Indicates that the response has significantly increased. This CTL activity is Lasts at least 50% of their peak level for at least 7 months, Indicates that the memory of has been established. Example 20 SIV / HIV (SHIV) chimera : The main obstacle in testing the protective efficacy of candidate HIV-1 vaccines is that the virus Lack of a suitable animal virus administration model. Systems closely related to HIV Mian immunodeficiency virus (SIV) infects rhesus monkeys causing ATDS However, the only animal species that can infect the HIV-1 virus isolate is the chimpanzee It is. However, the viremia resulting from this infection is low and transient. And pathogenic effects (eg, lymphopenia, immunodeficiency-related opportunistic infections, etc.) Not shown. recent years, Hybrid viruses comprising SIV and HIV genomes have been developed, Is also infectious to rhesus monkeys and can cause infection-associated AIDS . An example of this type of virus is SHIV-4 (IIIB) (Li et al., J. of. Acquired Immunity Definition Syndrome , Vol. 5, 639-646 (1992)). This virus has a regulatory gene tat and rev, and SIV (MAC239) geno except for the structural gene env System. Because the essential component of the candidate HIV vaccine is based on env, this window Lus is adapting vaccines developed for human clinical use to infection in animal models. To test for protective efficacy against it. Example 21 Plasmid DNA and recombinant protein combination vaccine : Plasmid DNA HIV env component and recombinant HIV env protein Vaccines having both of the components are those that elicit an antibody response in rhesus monkeys Was tested for ability. 9 and 10 show the HIV env gene, respectively. DNA vaccines and recombinants (formulated in a suitable adjuvant) Anti-gp120 ELI obtained after vaccination of rhesus monkeys with protein [Fig. 4] Fig. 4 shows SA antibody and SHIV-4 (IIIB) virus neutralizing antibody potency. these Monkeys produced high titers of env-specific and neutralizing antibodies. Genes and egg whites Control monkeys vaccinated with "blank" DNA without albumin are detectable Does not show any env-specific response, whereas the vaccine Monkeys vaccinated only with the cytoplasmic component have low levels detected by ELISA Antigen-specific antibodies were shown, but no neutralizing antibodies. SHIV- When the 4 (IIIB) virus was administered, all control and protein only monkeys Infected, to which both env DNA and protein were inoculated Showed no detectable SHIV viremia. These monkeys are currently We are periodically testing for delayed onset of potential infections.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ 5/10 ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号９６１４９４２．２ (32)優先日平成８年７月16日(1996．7．16) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号９６１４９４３．０ (32)優先日平成８年７月16日(1996．7．16) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ダビース，メリー・エレンアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者フリード，ダニエル・シーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者リウ，マーガレツト・エーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ペリー，ヘレン・シーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 5/06 C12N 5/00 E 5/10 B C12P 21/02 A61K 37/02 (31) Priority claim No. 9614942.2 (32) Priority date July 16, 1996 (July 16, 1996) (33) Priority claiming country United Kingdom (GB) (31) Priority claim number 9614943.0 (32) Priority date Heisei July 16, 1996 (July 16, 1996) (33) Priority claim country United Kingdom (GB) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR) , IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP ( GH, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY , CA, CN, CU, CZ, EE, GE, HU, IL, IS, JP, KG, KR, KZ, LC, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, US, UZ, VN, YU (72) Inventor Davies, Mary Ellen United States of America, New Jersey 07065, Lowway, East Lincoln Avenue 126 (72) Inventor Fried, Daniel Sea United States, New Jersey 07065, Lowway, East Lincoln Avenue 126 (72) Inventor Liu, Marga Bract-er United States, Niyu-Jiyaji-07065, Rouei, East linker down, Abeniyu-126 (72) inventor Perry, Helen Sea United States, Niyu-Jiyaji-07065, Rouei, East linker down, Abeniyu-126

Claims

[Claims] 1. A synthetic polynucleotide comprising a DNA sequence encoding a peptide or protein, wherein the DNA sequence comprises codons optimized for expression in a non-homologous host. 2. The synthetic polynucleotide according to claim 1, wherein the protein is an HIV protein. 3. The synthetic polynucleotide of claim 1, wherein said DNA sequence encodes an HIV env protein or a fragment thereof, said DNA sequence comprising codons optimized for expression in a mammalian host. 4. V1Jns-tPA-HTV _MN gp120; V1Jns-tPA-HIV _IIIB gp120; V1Jns-tPA-gp140 / mutRRE-A / SRV-1 3'-UTR; V1Jns-tPA-gp140 / mutRRE-B / SRV-1 'UTR; V1Jns-tPA-gp140 / opt30-A; V1Jns-tpA-gP140 / opt30-B; V1Jns-tPA-gp140 / optall-A; V1Jns-tPA-gp140 / optall-B; opt all-A; V1Jns-tPA-gp140 / opt all-B; V1Jns-rev / env :; V1Jns-gp160; V1Jns-tPA-gp160; V1Jns-tPA-gp160 / optC1. opt41-A; V1Jns-tPA-gp160 / optC1 / opt41-B; V1Jns-tPA-gp160 / opt all-A; V1Jns-tPA-gp160 / opt all-B; V1Jns-tPA-gp160 / opt; -TPA-gp160 / opt all-B; V1Jns-tPA-gp143; V1Jns-tPA-gp143 / mutRRE-A; V1Jns-tPA-gp143 / mutRRE-B; V1Jns-tPA-gp143 / opt-Apt-Apt gp143 / opt32-B; V1Jns-tPA-gp143 / SRV-1 3'-UTR; V1Jns-tPA-gp143 / optC1 / opt32A; V1Jns-tPA-gp143 / op. C1 / opt32B; V1Jns-tPA-gp143 / opt all-A; V1Jns-tPA-gp143 / opt all-B; V1Jns-tPA-gp143 / opt all-A; tPA-gp143 / opt32-A / glyB; V1Jns-tPA-gp143 / opt32-B / glyB; V1Jns-tPA-gp143 / optC1 / opt32-A / glyB; B; V1Jns-tPA-gp143 / opt all-A / glyB: V1Jns-tPA-gp143 / opt all-B / glyB; V1Jns-tPA-gp143 / opt all-A / glyB The polypeptide according to claim 3, which is selected from B; V1Jns-tPA-gp143 / opt all-B / glyB; and a combination thereof. 5. Induces anti-HIV neutralizing antibodies, HIV-specific T-cell immune responses, or protective immune responses when introduced into in vivo vertebrate tissues, including human tissues, wherein the polynucleotide or HIV gag, HIV protease and 3. The polynucleotide according to claim 2, comprising a gene encoding the combination. 6. 3. A method for eliciting an immune response to an HIV epitope in a vertebrate, comprising introducing 1 ng to 100 mg of the polynucleotide according to claim 2 into vertebrate tissue. 7. A method for using a rev-independent HIV gene to elicit an immune response in vivo, comprising: a) synthesizing a rev-independent HIV gene; b) synthesizing the synthesized gene Linked to a regulatory sequence so that it can be expressed by being operably linked to the control sequence, wherein the control sequence, when introduced into living tissue, directs the initiation of transcription and subsequent translation of the gene. A method that includes: 8. 3. A method for eliciting an immune response against an infection or disease caused by a virulent strain of HIV, comprising introducing the polynucleotide of claim 2 into a vertebrate tissue. 9. A vaccine for eliciting an immune response to HIV infection, comprising the polynucleotide of claim 2 and a pharmaceutically acceptable carrier. 10. A method for eliciting an anti-HIV immune response in a primate, comprising introducing the polynucleotide of claim 2 into the primate tissue and simultaneously interleukin 12, GM-CSF, or a combination thereof. A parenteral administration of 11. A method of inducing antigen presenting cells to stimulate effector functions including cytotoxicity and proliferation of helper T cells and secretion of HIV antigen-specific lymphokines, wherein the vertebrate cells are in vivo. A method comprising exposing to the described polynucleotide. 12. A method for increasing the rev-independent in vivo expression of DNA encoding HIV env or a fragment thereof, comprising: (a) identifying the appropriate open reading frame codon arrangement; (b) wild-type codons (C) replacing wild-type codons with codons optimized for high expression of the human gene; and (d) testing for improved expression. A method comprising: 13. A vaccine for eliciting an immune response against HIV infection, comprising the polynucleotide according to claim 2, wherein the polynucleotide is canaripox, vaccinia virus, adenovirus, adeno-associated virus, retrovirus, listeria, Shigella. , A specific ligand, a BCG, or a vaccine delivered by Salmonella. 14． A method of eliciting an immune response to HIV, comprising administering the polynucleotide of claim 2 and administering attenuated HIV, killed HIV, HIV protein, a fragment of HIV protein, or a combination thereof. The method wherein the administration of the polynucleotide is prior to, concurrently with, or subsequent to administration of the attenuated HIV, killed HIV, HIV protein, fragment of HIV protein, or a combination thereof. 15. A method of eliciting an immune response to HIV, comprising administering the polynucleotide of claim 2 with an adjuvant. 16. A method of treating HIV infection, comprising administering the polynucleotide of claim 2 to a patient and administering an anti-HIV compound to the patient, wherein administering the polynucleotide comprises administering the anti-HIV compound. Before, or simultaneously with, or following. 17． A method for increasing expression of a gene in a non-homologous host, comprising: a) comparing the codons of the wild-type gene with codons preferred by the non-homologous host; C) examining the third nucleotide of the new codon and the first nucleotide of the new codon immediately adjacent 3 ′ to the first codon and selecting 5 ′ by selecting the new codon Replacing CG-3 'pairings if they have been created; d) removing undesired sequences to obtain a synthetic optimized gene; and e) inserting the synthetic gene into a non-homogeneous host; A method comprising: 18. A method for expressing a peptide in a host, the method comprising administering the synthetic polynucleotide of claim 1 to the host. 19. A method of increasing the production of a recombinant protein by a host, comprising: a) transforming a host cell with the synthetic polynucleotide of claim 1 to produce a transformed host; and b) synthesizing the transformed host according to the synthetic method. Culturing under conditions that permit expression of the polynucleotide and production of the recombinant protein.