JP2000515737A - 増殖停止遺伝子組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規遺伝子およびその遺伝子によってコードされる増殖停止遺伝子産物が開示される。増殖停止遺伝子Ｂ４Ｂの発現は、細胞増殖の阻害を生じる。この遺伝子および遺伝子産物は、ガン性および前ガン性状態のマーカーとして、および免疫状態のマーカーとして役立つ。

Description

【発明の詳細な説明】 増殖停止遺伝子組成物および方法 発明の分野 本発明は、新規の増殖停止因子をコードする新規のヌクレオチドコード配列、 その因子、その遺伝子産物を発現する細胞、ならびに前記組成物を産生する方法 に関する。 発明の背景 Ｂリンパ球の発生および分化は、哺乳動物種における免疫応答の確立および維 持において重要である。成熟したイムノグロブリン分泌Ｂ細胞は、骨髄に由来す る造血始原体からの分化の複雑な過程の結末である。 Ｂリンパ球の分化プログラムは、分子シグナルの複雑なセットを含み、おそら く、この分子シグナルの最も基本は、イムノグロブリン（Ｉｇ）可変ドメイン遺 伝子座の生産的再構成である。Ｂ細胞の個体発生の間、Ｉｇ遺伝子座の生産的再 構成は、成熟段階の記憶Ｂ細胞およびＩｇ分泌形質細胞へのＢ細胞分化の進行を 可能にする中心的事象のようであるが、機能的重鎖ポリペプチドを形成するため の、Ｃ領域と重鎖可変領域のＶ、Ｄ、およびＪ領域との正確な連結は、全ての始 94を参照）。 ポジティブ選択が、生産的Ｉｇ再構成を有するＢ細胞の連続的な生存能および 拡大を容易にすると考えられる一方、ｂｃｌ−２およびｆａｓにより調節される アポトーシス以外の、ネガティブ選択の特徴づけられていない機構もまた、非生 産的Ｉｇ遺伝子再構成を含む細胞の除去に関与することが示されている（Tarlin ton．1994）。事実、大多数の候補Ｂ細胞は、この初期の分化段階に失敗し、そ してＢ細胞レパートリーから除去される。対照的に、そしておそらく種々の形態 の除去の崩壊の結果として、Ｂ細胞分化のほとんど任意の段階の細胞は、腫瘍性 の不死化を経験し、その結果、そのような細胞を同定および破壊する身体の能力 が崩壊する場合、種々の形態の白血病およびリンパ腫の出現を生じることが知ら れている（Lukens、1993）。したがって、奇形細胞の早期検出手段は、白血病の 早期診断および処置の達成に有用である。本発明の基礎を形成するのは、「Ｂ４ Ｂ」と呼ばれる新規遺伝子の同定である。たとえＢ４Ｂ ｍＲＮＡの発現が、複 数の組織で検出され得ても、Ｂ４Ｂ遺伝子によってコードされるタンパク質の発 現は、細胞質μ鎖を発現しない始原体/プレＢ細胞のサブセットに厳しく限定さ れる。したがって、このような細胞は生産的Ｉｇ遺伝子再構成を欠き得、そして 身体にとって不必要であり得る。本発明の重要な特徴によれば、Ｂ４Ｂの細胞で の発現が、細胞増殖の阻害を誘導することがさらに認識される。したがって、Ｂ ４Ｂ抗原の発現は有用な細胞マーカーとして役立ち、そしてそのような発現の誘 導は、所望でない細胞増殖を妨げ得る。これらおよび本発明の有用な特色は、以 下の項に記載される。 発明の要旨 １つの局面において、本発明は、Ｂ４Ｂ増殖停止ファミリー遺伝子産物をコー ドする単離されたＤＮＡ分子を含む。より詳細には、本発明は、配列番号３およ び配列番号７として示される配列から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク 質に対する少なくとも５０％、そして好ましくは７５％以上の配列同一性により 特徴づけられるアミノ酸配列を有する増殖停止遺伝子産物をコードする単離され た遺伝子を含む。好ましい実施態様において、本発明に含まれる単離されたＤＮ Ａ分子は、増殖停止遺伝子産物をコードする。この増殖停止遺伝子産物は、その 遺伝子が上記の宿主細胞により発現される場合、その宿主細胞の増殖を阻害し得 る。発現可能な遺伝子を含むＤＮＡは、イントロンを含み得るか、または本明細 書に記載の遺伝子の連続したオープンリーディングフレームを単に含み得ること に留意すべきである。本発明はまた、このような遺伝子配列に対応するＲＮＡ分 子および以下に記載の本発明の種々の局面におけるそれらの使用を包含すること を意味する。 他の実施態様において、本発明の単離されたＤＮＡ分子は、配列番号２または 配列番号６ともまたハイブリダイズするプローブとハイブリダイズする。ここで 、全てのハイブリダイゼーションは、中程度のストリンジェンシー条件下で、参 照配列に対する少なくとも５０％の配列同一性、そして好ましくは少なくとも７ ５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を検出するために実行される。好ましい実 施態様において、本発明のＤＮＡ分子は、配列番号２の配列、または配列番号６ の配列を有する。 関連する局面において、本発明は、単離されたＢ細胞タンパク質抗原を包含す る。この単離されたＢ細胞タンパク質抗原は、（ｉ）その抗原がＣＯＳ−７細胞 のような真核生物細胞中にトランスフェクトされ、そしてその細胞によって発現 される場合、そのような細胞の増殖を阻害すること、および（ii）配列番号３お よび配列番号６として示される配列を有するタンパク質からなる群より選択され るタンパク質との少なくとも５０％の配列同一性（好ましくは少なくとも７５％ の同一性）により特徴づけられる。他の実施態様において、このタンパク質は、 ＣＤ１９、ＣＤ４５、およびＨＬＡ−ＤＲもまた発現するが、ＣＤ２０、ＣＤ３ 、ＣＤ６、ＣＤ５６は発現しないＢ細胞により発現される。抗原は、好ましくは 配列番号３または配列番号７のアミノ酸配列を有する。 さらに別の関連する局面において、本発明は、配列番号３および配列番号７か らなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質との少なくとも５０％ の配列同一性、そして好ましくは少なくとも７５％の同一性により特徴づけられ る配列を有するＢ４Ｂ遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターを 含む。好ましい形態のベクターは、上記のＤＮＡ分子について記載されたポリヌ クレオチドコード領域を含む。 関連する実施態様において、本発明は真核生物細胞を含む。その細胞は、配列 番号３および配列番号７として示される配列から選択されるアミノ酸配列を有す るタンパク質に対し少なくとも５０％の同一性、そして好ましくは少なくとも７ ５％の同一性を有するＢ４Ｂ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む非 相同なＤＮＡ分子を含む。 好ましい実施態様において、細胞は、配列番号２および配列番号６として示さ れる配列から選択される配列を有するＤＮＡ分子を含む。 本発明はまた、上記のＢ４Ｂタンパク質抗原を発現し得る原核生物細胞を含む 。 さらに他の関連する局面において、本発明は、宿主細胞の増殖を阻害し得る（ すなわち、本明細書に記載のＢ４Ｂ増殖停止遺伝子産物の発現による）増殖停止 遺伝子産物を産生する細胞の産生方法を含む。細胞は、配列番号３および配列番 号７から選択される配列を有するタンパク質との少なくとも５０％の配列同一性 、そして好ましくは少なくとも７５％の同一性により特徴づけられる配列を有す るＢ４Ｂ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むコード領域を含む発現 ベクターでトランスフェクトすることによって作製される。好ましい実施態様 において、細胞へ組み込まれるコード領域は、配列番号２または配列番号６とし て示される配列を含む。 さらに別の関連する局面において、本発明は、細胞の混合物におけるＢ４Ｂ抗 原を含む細胞のサブセットの存在を検出する方法を含む。この方法は、細胞混合 物と、配列番号３の配列を有するタンパク質と免疫反応性である抗体とを接触さ せる工程、および細胞混合物中の細胞と抗体との結合を検出する工程を含む。好 ましい実施態様において、抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド 、および配列番号５のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群より選択される ペプチドに対する抗体である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅ア ッセイによる検出を含む、本発明の知見を利用する他の検出方法もまた、本発明 の部分を構成する。 本発明は、Ｂ４Ｂ＋細胞型、ならびにＢ４Ｂ遺伝子産物に対する抗体およびま たはそのフラグメント、ならびに本明細書に記載のヌクレオチド配列、抗原、お よび/または抗体を利用する診断キットをさらに含む。 本発明のこれらならびに他の目的および特徴は、添付の図面とともに以下の発 明の詳細な説明を読むと、より完全に明らかになる。 図面の簡単な説明 図１は、Ｂ４Ｂ ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（配列番号１）および 推定アミノ酸配列（配列番号３）を示す。ここでオープンリーディングフレーム は、ｎｔ１２３からｎｔ５９３（配列番号２）で構成され、このタンパク質の予 想される膜貫通領域は下線で示され、ペプチド１（ＣＳＤＳＬＳＹＡＳＥＤＡＬ Ｋ；配列番号４）およびペプチド２（ＳＨＹＡＮＲＤＧＴＱＹＨＨ；配列番号５ ）を含むアミノ酸残基はイタリック体で示され、可能性のあるＮ−グリコシル化 部位は太字で示され、そして１０１ｂｐのＤＤ−ＰＣＲフラグメントに含まれる ＤＮＡ配列は下線で示される； 図２は、ヒトＢ４Ｂゲノムプローブ、またはＢ４Ｂプローブとヒト第２０染色 体のセントロメア領域に特異的なプローブとの組合せを用いた蛍光インサイチュ ハイブリダイゼーションにより決定された、Ｂ４Ｂ遺伝子の染色体位置の模式図 を示す； 図３は、マウスＢ４Ｂコード領域のヌクレオチド配列を示す（配列番号６）； 図４は、配列番号６によりコードされるアミノ酸配列を配列番号７として示す 。 図５（Ａ−Ｂ）は、ＣＤ３４-ＦＩＴＣ、ＣＤ２０−ＰＥ、およびＣＤ１９− Ｔｒｉｃｏｌｏｒで染色され、そして多パラメーター分析に供された正常ヒト骨 髄単核細胞のフローサイトメトリー分析プロットを示す。ここで、象限ゲート（ quadrant gate）を、無関係なアイソタイプ適合コントロールｍＡｂで染色され た細胞の99.9％を除外するように設定し、そして、（Ａ）において、細胞を、Ｃ Ｄ１９の発現（ｘ軸）およびＣＤ２０の発現（ｙ軸）について分析し、一方、パ ネル（Ｂ）は、（Ａ）の右下象限の細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２０−）のＣＤ１９の 発現（ｘ軸）およびＣＤ３４の発現（ｙ軸）についての再プロットを示し、そし てパーセント値（４.６％、３.７％）は、対応する表現型を有する全細胞の割合 をいう； 図６Ａは、チミジン取り込みアッセイにおける、トランスフェクトされたＣＯ Ｓ−７細胞における細胞増殖に対するＢ４ＢまたはＣＤ３４発現の効果を示す； 図６Ｂは、細胞のＢ４Ｂ誘導増殖停止のキネティクスを示す；そして 図７（ＡおよびＢ）は、Ｂ４Ｂタンパク質（Ａ）およびＰＭＰ−２２タンパク 質（Ｂ）のハイドロパシー分析の比較を示す。ここで、相対的疎水性（Genework sバージョン２.４５ソフトウェアプログラムのハイドロパシーアルゴリズムを使 用して決定）は、縦座標の数値目盛りに正比例する。 発明の詳細な説明 Ｉ．定義 他に示さない限り、本明細書中で使用される全ての用語は、それらが本発明の 分野の当業者に対して有する意味と同じ意味を有する。実施する者は、特に、当 該分野の定義および用語についてCurrent Protocols in Molecular Biology（Au subelら、1988）を参照せよ。 用語「非相同ＤＮＡ」および「非相同ＲＮＡ」は、それらが存在する細胞に対 して内在性でないヌクレオチドをいう；一般に、このようなヌクレオチドは、ト ランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなど により細胞に添加されている。このようなヌクレオチドは、一般に、少なくとも １つのコード配列を含む。 用語「ベクター」または「発現ベクター」は、外来細胞において、非相同ＤＮ Ａフラグメントを組込み、そしてこれを発現する能力を有するベクターである。 多くの原核生物細胞および真核生物細胞の発現ベクターが、市販されている。適 切な発現ベクターおよびプロモーターの選択は、当業者の知識の範囲である。 「Ｂ４Ｂ増殖停止遺伝子ファミリー」とは、（ｉ）主に疎水性アミノ酸からな る４つの異なる領域、（ii）本明細書中の配列番号３または配列番号７として示 されるＢ４Ｂ遺伝子産物との少なくとも５０％、そして好ましくは７５％以上の 配列同一性、および（iii）遺伝子産物が細胞により発現される場合、または遺 伝子産物が細胞に挿入される場合、細胞の増殖（複製）を阻害する能力により特 徴づけられるタンパク質をコードする１セットの遺伝子を意味する。このような タンパク質遺伝子産物の例は、本明細書に記載されるヒトおよびマウス形態のＢ ４Ｂを含む。 本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、代表的なポリヌクレオチ ドに水素結合し得る塩基を支持する骨格を有するポリマー性分子をいう。ここで ポリマー骨格は、ポリマー分子と代表的なポリヌクレオチド（例えば、一本鎖Ｄ ＮＡ）との間で配列特異的な様式でそのような水素結合を可能にする方法で塩基 を提示する。このような塩基は、代表的には、イノシン、アデノシン、グアノシ ン、シトシン、ウラシルおよびチミジンである。ポリマー分子には、二本鎖およ び一本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡ、ならびにその骨格改変体（例えば、メチルホス ホネート結合）が含まれる。 用語「遺伝子」は、一般に、機能的ポリペプチドまたはＲＮＡ分子の合成に必 要な完全な核酸配列をいう。遺伝子は、イントロンのような非翻訳領域を含み得 る。本明細書中での請求の範囲に記載された遺伝子配列またはコード領域への言 及は、コード領域に挿入され得る任意の非翻訳領域（イントロン）を含むコード 領域をカバーすることを意図される。 本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結され た一本鎖のアミノ酸残基から作製された化合物をいう。用語「タンパク質」は、 用語「ポリペプチド」と同義であり得るか、または２つ以上のポリペプチドの複 合体を加えて呼ばれ得る。 本明細書で使用されるように、用語「実質的相同性」または「実質的同一性」 、およびそのずれ（declination）は、配列が最も適合したアラインメントで配 置される場合、アミノ酸配列と他のアミノ酸配列との、またはポリヌクレオチド 配列と他のポリヌクレオチド配列との、少なくとも５０％、そして好ましくは少 なくとも約７５〜８０％またはそれ以上の一致をいう。ヌクレオチド配列の場合 、これらの用語は、問題のヌクレオチド配列が、スクリーニングアッセイにおい て、中程度に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１、配列番号２、また は配列番号６として規定されるヌクレオチド配列に由来するハイブリダイゼーシ ョンプローブにより検出され得ることを意味する。 「中程度に高い」ストリンジェンシー条件とは、一般に、一定の温度（一般に 、約４２℃）にて、約５０％から約２５〜３０％のホルムアミドの存在下で標的 ＤＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションを意味する。より詳細には、 このようなハイブリダイゼーションは、上記の範囲にわたってホルムアミド濃度 の増分増加（incremental increase）の存在下で実施される。 アミノ酸残基は、本明細書において、標準的な１文字表記で言及される：Ａ、 アラニン；Ｃ、システイン；Ｄ、アスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸；Ｆ、フェ ニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ、ヒスチジン；Ｉ、イソロイシン；Ｋ、リジン ；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グル タミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、トレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリ プトファン；Ｘ、ヒドロキシプロリン；Ｙ、チロシン。 II．Ｂ４Ｂ遺伝子および遺伝子産物 Ａ．Ｂ４Ｂ遺伝子の単離および関連ヌクレオチド配列 本発明における使用のために、Ｂ４Ｂ遺伝子は、当該分野で公知の多数の方法 のうち任意の方法によりクローンライブラリーまたは天然の供給源から単離され 得る。下記に例示されるように、遺伝子は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）画分より 単離され得る。あるいは、本明細書のガイダンスを用いて、ポリヌクレオチドは 、例えば、Applied BioSystems DNA合成機（model 394）を使用する従来の方法 により合成され得る。 さらに、関連するヌクレオチド配列は、当該分野で周知の方法に従って、公知 のアミノ酸置換原理および/またはコドン使用頻度表を使用して、Ｂ４Ｂ増殖停 止ファミリータンパク質の発現を提供するように設計され得る。このような配列 は合成的に産生され得る。 １．末梢血単核細胞画分からのＢ４Ｂ遺伝子の単離 実施例１および２は、Ｂ４Ｂ遺伝子産物をコードする遺伝子を末梢血単核細胞 （ＰＢＭＣ）中で同定し、そして末梢血単核細胞から単離したかを記載する。こ れらの実施例において、使用されたＰＢＭＣはヒトであった；しかしそれらは多 数の供給源の任意のもの、そして特に他の哺乳動物種に由来し得る。手短に言え ば、ＰＢＭＣは標準的な方法に従って単離され、そして密度勾配法を使用して分 画される。ＰＢＭＣは、３０％、４０％、５０.５％および７５％のPERC0LL（Ph armacia、Piscataway、NJ）からなるPERC0LL密度段階勾配で遠心分離される。４ ０％画分と５０.５％画分との間の界面に分画される細胞を収集し、そしてＦｃ Ｒを有する細胞を除くためにヒトＩｇＧとさらにインキュベートする。残りの細 胞を再分画して低密度の単球および高密度のリンパ球が比較的除かれた中間密度 細胞（ＩＤＣ）画分を提供する。 ＩＤＣ画分（約２００倍の富化を示す約１〜５×１０⁶細胞/バフィーコート） は、代表的には、予想される系統前駆体に加えて、Ｔ細胞芽細胞、Ｂ細胞、樹状 細胞、およびナチュラルキラー細胞からなる。 ヒトＢ４Ｂ遺伝子は、初めは、実施例２に詳細に述べるように、ＩＤＣから単 離されたＲＮＡと、ＰＢＭＣの低および高密度の画分から単離されたＲＮＡとを 比較するディファレンシャルディスプレーＰＣＲ法を使用して同定およびクロー ン化された。１０１塩基対（ｂｐ）のインサートを、ＩＤＣ画分中に検出可能な レベルで発現させた。インサートをまた、より高いストリンジェンシー条件下で 、配列特異的プライマーを使用してバルクのＰＢＭＣにおいて検出した。インサ ー トは、高密度画分でも低密度画分中でも検出されず、ＥＢＶで形質転換された成 熟Ｂ細胞中にも検出されなかった。 １０１ｂｐ ＰＣＲ産物を放射標識し、そしてプローブとして使用して、ＩＤ Ｃ ｍＲＮＡから調製したλファージｃＤＮＡライブラリーから完全長２.７ｋｂ ｃＤＮＡインサートを得た。このインサートを、Ｅ.ｃｏｌｉ（Ｔｏｐ−１０株 ）クローン（「１〜１２＃６〜２９.ＢＳ」）により運ばれるプラスミドBluescr lpt IIKS中にサブクローン化した。クローンを含む細菌細胞を、Stanford Unive rsity Blood Bank（Edgar Engleman博士、Palo Alto、CA）に寄託している。完 全長Ｂ４Ｂ ｃＤＮＡ（図１）は、１２２ｂｐの５'非翻訳領域（代わりのＡＴＧ 翻訳開始コドンを含まない）に続いて４７１塩基対（ｂｐ）の単一オープンリー ディングフレーム、続いて約２.１ｋｂの３'非翻訳領域を含む。オープンリーデ ィングフレーム（ＯＲＦ）は、図に示されるように、１５７アミノ酸のポリペプ チドをコードし、これは、１７,５４２ダルトンの分子量と計算され、４つの推 定膜貫通スパニング（ＴＭ）ドメイン、および２つの可能性のあるアスパラギン リンクグリコシル化部位を有する。この配列は、現在、寄託番号Ｚ５０７５１と してＥＭＢＬ、Ｇｅｎｂａｎｋ、およびＤＤＢＪのヌクレオチド配列データベー スに見られる。 同様の方法を用いて、Ｂ４ＢのマウスホモログをコードするマウスｃＤＮＡク ローンもまた、単離した（配列番号６、図３）。このＯＲＦ ｃＤＮＡは、アミ ノ酸レベルでヒトホモログと７６％の配列同一性を示すポリペプチド（配列番号 ７、図４）をコードする。 ヒト２.７ｋｂ ｃＤＮＡを配列決定し、そしてプローブとして使用して、正常 ヒトゲノムライブラリーからＢ４Ｂゲノムクローンを同定した；この遺伝子は、 ヒト第２０染色体に位置した。 本開示から得られる情報は、本発明の一部を形成するＢ４Ｂ増殖停止遺伝子フ ァミリーの他のメンバーのｃＤＮＡを単離するために使用される。今や、ヒトお よびマウスＢ４Ｂ遺伝子の配列が公知なので、当該分野で周知の方法に従って、 （ｉ）ヒトおよび他の種由来の相同なＤＮＡセグメントを同定すること、（ii） 他の組織から相同なＤＮＡセグメントを単離すること、および（iii）合成Ｂ４ Ｂ遺伝子を産生することが可能であることもまた、理解される。具体的には、こ のような方法は、本明細書に開示されるＢ４Ｂ遺伝子配列（例えば、配列番号１ 、配列番号２、配列番号６）に由来するハイブリダイゼーションプローブを用い てｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること、または当該分野で公知のＰ ＣＲに基づくスクリーニング技術を包含するが、それらに限定されない。（Whit e）。従来のハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に示されるＢ４Ｂ ヌクレオチド配列の任意のフラグメントに由来し得るか、またはこのようなＢ４ Ｂポリヌクレオチドの完全な配列を含み得るが、一般に、少なくとも２０ヌクレ オチドの長さである。これらは、好ましくは、オープンリーディングフレームに 由来し、そして約１００ヌクレオチドと約５００ヌクレオチドの間の長さである 。このようなプローブの設計および構築は当業者の知識のうちである。同様の技 術が、上記のように、Ｂ４Ｂ増殖停止遺伝子ファミリーの他のメンバーの配列を 特徴づけるために使用される。 λファージｃＤＮＡライブラリーから単離された２.７ｋｂ ｃＤＮＡの配列を 、ABI model373 DNAシーケンサー（Perkin Elmer/Applied Biosystems、Foster City、CA）を使用して決定した。２.７ｋｂインサートの配列を、図１に配列番 号１として示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の推定アミノ酸配列 （ｎｔ１２３〜５９３；配列番号２）を、図１において配列番号３として示す。 ２．Ｂ４Ｂの組織位置決め ａ．染色体位置決め．ヒトＢ４Ｂ遺伝子の染色体位置を、実施例３に詳述した 方法に従って、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（Ｂ４Ｂゲノムプロー ブは、ヒト第２０染色体に特異的にハイブリダイズする）によって決定した。第 ２の実験において、第２０染色体セントロメアに特異的なプローブを、Ｂ４Ｂプ ローブと同時にハイブリダイズさせた。そして、１０の同時ハイブリダイズした 第２０染色体の測定により、Ｂ４Ｂ遺伝子は、セントロメアからアームｑのテロ メアまでの距離の４８％の位置（バンド２０ｑ１２とバンド２０ｑ１３．１との 間の境界に対応する区域）に存在することが示された（図２）。この領域に存在 することが公知の他の遺伝子には、ｓｒｃガン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ 、 骨形成因子２ａ、ならびに若年者の成人発症型糖尿病およびファンコーニ貧血に 関する配列未決定の遺伝子座が包含される。対照的に、ＰＭＰ−２２/ｇａｓ− ３をコードする遺伝子は、第１７染色体のバンドｑ１１.１に存在する（Patel、 Matsunami、Timmerman、Valentijin）。 ｂ．Ｂ４Ｂの組織分布．Ｂ４Ｂ ｍＲＮＡの発現は、末梢血のＩＤＣ画分に制 限されているようである。しかし、本発明の支持のために実施した研究において 、Ｂ４Ｂプローブを用いた複数組織のノーザンブロット分析により、脳、脾臓お よびＰＢＭＣを除いて、試験した実質的にすべての組織において２.７ｋｂ ｍＲ ＮＡ種が検出された。おそらく、ＰＣＲと比較して減少した感受性に起因するバ ルクＰＢＭＣからの検出可能なシグナルの欠如は、明らかに希な、ＩＤＣに制限 された、末梢血でのＢ４Ｂの発現と一致する。 ＰＭＰ−２２（ヒトＢ４Ｂとわずか３５％の相同性を有すると同定され、した がって増殖停止遺伝子産物ファミリーの一部と考えられないタンパク質）に対す る配列保存を最小にする基準に基づいて、Ｂ４Ｂの予想されるアミノ酸配列から 選択される２つの合成ペプチドに対して、抗血清を惹起させた。これらのペプチ ド配列を図１においてイタリック体で表記された残基として示す。Ｂ４Ｂのこれ ら２つの領域は、４つの膜貫通（ＴＭ）ドメイン（Wright）を含む他のタンパク 質との類似性によって、このタンパク質の推定細胞外ドメインに存在すると予測 される。アフィニティー精製抗ペプチド２ Ｉｇは、放射免疫沈降実験において 、期待されたサイズ（１８キロダルトン）のインタクトなＢ４Ｂタンパク質を認 識した。一方、抗ペプチド１ Ｉｇは認識しなかった。したがって、引き続き、 抗ペプチド１ Ｉｇをネガティブコントロールとして使用した。次いで、抗ペプ チド抗体を使用して、免疫組織学によって正常ヒト組織切片のパネルを検査した 。ｍＲＮＡレベルで観察されたＢ４Ｂの広範囲の組織分布とは対照的に、免疫組 織学によってポジティブであることが見出された唯一の細胞は、抗ペプチド１で 染色されたリンパ節と比較した場合、リンパ節の髄質洞を裏打ちする希な大きな 細胞であった。心臓および胎盤、ならびに試験したすべての他の組織（脳、肺、 腎臓、肝臓、膀胱、結腸、小腸、胃、副腎髄質、甲状腺、皮膚、脾臓、胸腺、舌 、前立腺、睾丸、乳房、子宮および卵巣）は、記載された感度レベルでこの検出 法 を使用して、ネガティブであった。 抗ペプチド２抗血清とリンパ節細胞との相互作用を、過剰な遊離ペプチド２と のプレインキュベーションによって完全にブロックした。このことは、抗ペプチ ド２抗血清でのリンパ節細胞の染色は、Ｂ４Ｂに対して特異的であることを示す 。 ｃ．Ｂ４Ｂ＋細胞のＰＢＭＣ分画細胞表面表現型内でのＢ４Ｂの分布．抗ペプ チド２ Ｉｇは、この抗体を使用したフローサイトメトリー分析を除いて、５％ パラホルムアルデヒドと有機溶媒との組合せで固定した細胞とのみ反応した。し かし、二色免疫蛍光顕微鏡観察を、パラホルムアルデヒド固定細胞と反応する表 現型マーカーの限定されたパネルを用いて実行した。抗Ｂ４Ｂ Ｉｇを使用して ＰＢＭＣを染色した。ここで、極端にまれな（約０.０１％）ポジティブ細胞が 観察され、これは、リンパ節と末梢血との間にＢ４Ｂ＋細胞についての平衡が存 在することと一致する。分析の容易のためにＢ４Ｂ＋細胞の頻度を増大させるた めに、５０％Percoll勾配の界面細胞を後の染色に使用した。ここで、Ｂ４Ｂ＋ 細胞の頻度は０.１〜１.０％に増大した。 本発明の支持として実施した研究において、正常ドナー由来のＰＢＭＣを、LY MPHOPREPによって精製し、５０％PERCOLL（Pharmacia、Piscataway、NJ）にわた って分画して、Ｂ４Ｂ＋細胞について富化し、次いで特異的抗体の混合物とイン キュベートして細胞性抗原の存在を決定した。さらなる研究において、細胞を抗 ペプチド２ ＩｇおよびＣＤ４５に特異的なマウスＩｇで、またはＨＬＡ−ＤＲ 、μ鎖、ＣＤ３４、もしくはＣＤ６８で染色した。結合したＡｂを、種特異的、 交差吸着ＰＥロバ抗ウサギＩｇＧとビオチン化ロバ抗マウスＩｇＧとの混合物、 続いてＦＩＴＣストレプトアビジンで検出した。代表的な顕微鏡写真の視野を調 製した。ＰＥまたはＦＩＴＣフィルターを通して写真撮影をして、Ｂ４Ｂおよび 系統マーカーをそれぞれ可視化し、そして種々の系統マーカーおよびＢ４Ｂの発 現の二重ポジティブ対相互排除の評価について分析した。 免疫前Ｉｇおよび抗ペプチド１ Ｉｇでの細胞の染色は、検出可能なシグナル を生じなかった。抗ペプチド２ Ｉｇと系統サブセットｍＡｂとの組合せでの染 色により、Ｂ４Ｂ＋細胞は、ＣＤ４５およびＨＬＡ−ＤＲを同時発現するが、細 胞質性もしくは表面μ鎖、ＣＤ３４およびＣＤ６８についてはネガティブである ことが明らかになった。 免疫選択によるＰＢＭＣの免疫細胞表現型サブセットへの分画化、続く固定、 および抗ペプチド２ Ｉｇでの染色は、汎用Ｂ細胞マーカーＣＤ１９を使用して Ｂ４Ｂ＋細胞が約１０倍富化されたことに基づいて、Ｂ４Ｂ＋細胞はＣＤ１９＋ であることを明らかにした。しかし、抗Ｂ４Ｂおよび抗ＣＤ２０での二色分析は 、Ｂ４Ｂ＋細胞がＣＤ２０についてネガティブであり、そして、末梢血において Ｂ細胞の希なＣＤ１９＋ＣＤ２０−サブセットを代表することを明らかにした。 ＣＤ３またはＣＤ１６およびＣＤ５６を認識するｍＡｂでのポジティブ免疫選択 は、Ｂ４Ｂ＋細胞頻度の検出不可能なレベルまでの減少を生じた。したがって、 このことは、Ｂ４Ｂ＋細胞がＣＤ３−ＣＤ１６−ＣＤ５６−であることを確認す る。 上記のＢ４Ｂ細胞表面マーカー発現パターンは、ＣＤ１９、ＣＤ４５およびＨ ＬＡ−ＤＲを発現するが、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ２０および細胞質μ鎖（成熟 Ｂ細胞）、ＣＤ１６およびＣＤ５６（ナチュラルキラー細胞）、ＣＤ６８（単球 /マクロファージ）およびＣＤ３４（造血幹細胞始原細胞）を欠くことに基づく 初期Ｂ系統表現型と一致する。Ｂ４Ｂは始原細胞/プレＢ系統細胞によって発現 されるという仮説に基づいて、正常成人骨髄（Ｂ系統細胞の起源区画）の単核細 胞について免疫蛍光顕微鏡分析を実施した。Ｂ４Ｂ＋細胞の頻度は、ＰＢＭＣに おけるＢ４Ｂ＋細胞の頻度（０.０１％）と比較して１００倍以上高い（３〜１ ０％）ことが判明した。 ｄ．骨髄．三色フローサイトメトリー分析により、先に記載されていないプレ Ｂリンパ球のＣＤ１９＋ＣＤ２０−ＣＤ３４−表現型サブセットが正常骨髄に存 在することが明らかになった。ＣＤ１９およびＣＤ２０の２パラメータ分析にお いて、正常骨髄単核細胞は、４.６％のＣＤ１９＋ＣＤ２０−細胞を含んでいた 。ＣＤ１９＋ＣＤ２０−細胞をゲートし（gate）、そしてＣＤ３４発現について 分析した場合、２つのサブセットは、一方はＣＤ３４を同時発現し（総単核細胞 の０.９％）、他方はＣＤ３４についてネガティブである（総単核細胞の３.７％ ）ことが明らかであった。この後者ＣＤ１９＋ＣＤ２０−ＣＤ３４−サブセット は、上記の免疫蛍光顕微鏡観察により決定した場合の、表現型およびＢ４Ｂ＋サ ブセットが優勢であることの両方が一致する。 Ｂ．Ｂ４Ｂの非相同発現 Ｂ４Ｂ抗原は、当該分野において公知の方法に従って、真核生物細胞にトラン スフェクトされ、そしてこれにおいて非相同的に発現され得る。本発明のこの局 面を支持するために実施した研究において、当該分野において周知の標準的方法 に従って、ＣＭＶ初期プロモーターおよびバクテリオファージプロモーターｔ７ プロモーターの二重コントロールの下で、ＣＯＳ−７細胞を、上記のように単離 したＢ４Ｂ ｃＤＮＡか、またはコントロールとしてＣＤ４ ｃＤＮＡでトランス フェクトした。細胞を、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（このポ リメラーゼは、次いで、細胞質において直接Ｂ４Ｂ ｃＤＮＡのＲＮＡ転写を駆 動し得る）を発現する組換えワクシニアウイルスに感染させた場合、ＣＤ４につ いて観察された割合に匹敵する約６０〜８０％の細胞において、Ｂ４Ｂタンパク 質を検出した。抗Ｂ４Ｂ ＩｇはＢ４Ｂに特異的であった。なぜなら、これをワ クシニア感染ＣＤ４トランスフェクト細胞を染色するために使用した場合、シグ ナルが観察されなかったからである。 Ｃ．遺伝子ファミリー SwissProtタンパク質配列データベース（Rel.31）と配列相同性について比較 した場合、（Geneworksソフトウェアバージョン２.４５、Intelligenetics Corp .、Mountain View、CA）、Ｂ４Ｂタンパク質配列は、１つの遺伝子産物ＰＭＰ− ２２/ｇａｓ−３と相同性（アミノ酸レベルで３５％の同一性）を示す。Ｂ４Ｂ 配列をＤＮＡレベルでGenbankデータベース（Rel.88）と比較した場合、さらな る相同性は示されなかった。Geneworksソフトウェアパッケージのハイドロパシ ーアルゴリズムを使用したＢ４ＢおよびＰＭＰ−２２のハイドロパシー分析（図 ７Ａおよび７Ｂ）は、全体のドメイン構造の劇的な保存を示す。 したがって、本発明は、新たな増殖停止遺伝子ファミリーの最初の同定を示す 。このファミリーのメンバーには、本明細書に記載したＢ４Ｂ遺伝子産物（配列 番号３；配列番号６）のいずれかと少なくとも５０％、そして好ましくは少なく とも７５％のアミノ酸相同性を示し、（ｉ）主に疎水性アミノ酸からなる４つの 異なる領域、（ii）本明細書中に配列番号３および配列番号６として示されるＢ ４ Ｂ遺伝子産物との５０％を越える、そして好ましくは７５％を越える配列相同性 、および（iii）そのタンパク質を発現する細胞の増殖を停止する能力を有する タンパク質をカバーするタンパク質が含まれる。 III．有用性 Ａ．細胞増殖インヒビター 本発明を支持するために実施した実験において、Ｂ４Ｂタンパク質の発現が細 胞増殖を阻害することが見出された。上記のように、ＣＯＳ−７細胞をＢ４Ｂま たはコントロールとしてのＣＤ４でトランスフェクトし、そしてワクシニア/Ｔ ７に感染させた。トランスフェクト細胞を１５時間培養し、次いで［³Ｈ］チミ ジン（ＴｄＲ）でパルスし、そして回収して増殖応答を定量した。細胞を１８時 間培養し、最後の３時間は［³Ｈ］ＴｄＲの存在下で培養して回収した。図６Ａ のデータは、チミジン取り込みを４連の測定の平均として示す。図６Ｂは、Ｂ４ Ｂ誘導増殖停止のキネティクスを示す。細胞を、実施例８に記載のように、トラ ンスフェクトし、そしてワクシニアウイルスに感染させ、そしてｘ軸に示される 時間（最後の２時間が［³Ｈ］ＴｄＲパルスを構成した）培養した。 図６Ａに示されるように、ＣＯＳ−７におけるＢ４Ｂタンパク質の発現は、Ｃ Ｄ４を発現する細胞と比較して５０％を越えて細胞増殖を阻害した（ｐ＜０.０ ０１）。阻害のキネティクス（図６Ｂ）は、実験の初期相の間のＢ４Ｂ発現に起 因する増加性特異的阻害と、続く後期のワクシニアウイルス感染によって誘導さ れる非特異的阻害との組合せの期待される効果と一致する二相性パターンを示し た。 Ｂ４Ｂ発現が細胞増殖を阻害するという観察は、多くの方法で利用され得る。 第１に、遺伝子は、下記のように、増殖を制御または阻害するために細胞に挿入 され得る。 例えば、このような発現は、目的の細胞へのＢ４Ｂ遺伝子のレトロウイルス形 質導入によって達成され得る。あるいは、当該分野において公知である、遺伝子 移入のための他の方法のいずれか、例えば、リポフェクション、リン酸カルシウ ム沈降、ＤＥＡＥ媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、アデノ ウイルスもしくはアデノ随伴ウイルス媒介遺伝子移入が、標的細胞にＢ４Ｂを移 入するために使用され得る。 このような導入方法は、下記のような遺伝子治療方法に組み込まれ得る。例え ば、米国特許第５,３９９,３４６号（本明細書中に参考として援用される）は、 細胞を特定の組織部位に標的付けるためにリンパ球へ目的の遺伝子を挿入するこ とを記載する。同様に、米国特許第５,４７０,７３０号（本明細書中に参考とし て援用される）は、細胞傷害性Ｔリンパ球の遺伝子操作のための方法を教示する 。 Ｂ．細胞マーカー 本発明の重要な特徴は、Ｂ４Ｂ遺伝子産物が、Ｂ細胞の小さな、または「まれ な」サブセットに抗原として発現されるという認識である。全身循環またはリン パにおけるこのような細胞の存在は、ガンまたは前ガンの状態に関する診断マー カーとして役立つ。さらに、循環におけるこのような細胞の存在は、特定の免疫 状態の指標として役立つ。したがって、本明細書に提供される教示に従い、そし て診断分野において周知の方法に従って生成された抗体および遺伝子診断試薬は 、診断目的でこのような細胞の検出に使用され得る。このような方法は、本明細 書中実施例４〜７に示される。 例えば、診断テストは、本明細書中実施例５に記載されるように調製された抗 Ｂ４Ｂペプチド抗体を用いる標準的なＥＬＩＳＡ形式を使用して構築され得る。 抗体は、当該分野において公知の方法に従って、マイクロタイタープレート上に コートされ、細胞捕獲アッセイを生成する。次いで、Ｂ４Ｂポジティブ細胞を含 む液体は、マイクロタイターウェル中で、細胞の捕獲を達成するに十分な時間イ ンキュベートされる。結合した細胞の検出は、続いてＢ４Ｂまたはその細胞上に 存在する別の抗原（例えば、ＣＤ１９）に対する標識抗体を添加することによっ て達成され得る。あるいは、抗原の検出は、本明細書に開示される構築物および 配列を利用して、ＰＣＲ法または当該分野で公知の他の等価な方法によって達成 され得る。 Ｃ．遺伝子治療 Ｂ４Ｂタンパク質は、免疫グロブリン遺伝子座の非生産的ＶＤＪ再構成を経験 するＢリンパ球において発現する。これらの細胞において、Ｂ４Ｂは、他の機能 障害細胞型の増殖停止遺伝子として役立ち得る。逆に、非生産的ＶＤＪ再構成を 経験するプロＢ細胞においてＢ４Ｂタンパク質を発現できない欠損または消滅Ｂ ４Ｂ遺伝子は、悪性クローンの成長（outgrowth）を導き得る。プロＢ細胞白血 病の実質的部分は、Ｂ４Ｂ発現と代表的に関連する表現型を示し、したがって消 滅Ｂ４Ｂ遺伝子によって引き起こされ得る悪性疾患の候補である。この疾患の場 面において、不完全なＢ４Ｂ対立遺伝子を有する細胞への健常なＢ４Ｂ対立遺伝 子の挿入を使用する遺伝子治療アプローチは、プロＢ細胞白血病および他の悪性 疾患の進展を防ぐ。 治療的に使用される細胞へのＢ４Ｂの挿入は、本発明により認識されるさらな る利点を有する。例えば、Ｂ４Ｂは、「自殺インヒビター」カセットを形成する ために、調節可能なプロモーターもまた含むベクターに挿入され得る。ここで、 Ｂ４Ｂの発現は、細胞の拡大を停止させるために、細胞をプロモーターの外来性 化学的アクチベーター（例えば、ガンシクロビル）に曝すことによって誘導され 得る。このような組成物は、細胞をインビトロまたはインビボで拡大させ、次い で増殖を停止させることが望ましい場合、有用であり得る。移植のために培養物 中で増殖した皮膚細胞は、インビボでの発現のために、例えば、非相同サイトカ イン遺伝子を有し得るリンパ球と同様に、このような構築物から利益を受け得る 。 このような遺伝子治療は、当該分野において今や公知の方法に従い、そして特 に、米国特許第５,３９９,３４６号、第５,４７０,７３０号および第５,２５２ ，４７９号に、ならびにYang（1996）によって記載されるように実施され得る。 これらはすべて、本明細書中に参考として援用される。 以下の実施例は本発明を例示するが、いかなる方法においても限定を意図する ものではない。 実施例１ 中間密度細胞（ＩＤＣ）画分の単離 ＰＢＭＣを、Lymphoprep（Gibvo BRL、Gaithersburg、MD）を供給された取り 扱い説明書に従って使用して、正常成人血液ドナーのバフィーコート画分から単 離した。次いで、ＰＢＭＣを、３０％、４０％、５０.５％および７５％Percoll （Pharmacia LKB、Uppsala、Sweden）の段階からなる４段階不連続Percoll勾配 （１５）上で低および高密度画分に分画した。低密度細胞画分は、５０.５％段 階界面から回収されたものであった。７５％段階ペレットを回収し、ＲＰＭＩ１ ６４０/１０％プールヒト血清中で一晩培養し、そして１５.５％メトリザミド勾 配（Gibco BRL）で分画した。そしてペレット画分を高密度細胞画分として使用 した。５０.５％Ｐｅｒｃｏｌｌ界面画分を、ヒトＩｇＧをコートしたペトリ皿 で一晩培養して、ＦｃＲを有する細胞を除去し、そして１４％メトリザミド勾配 で再分画した。得られた界面を中間密度細胞（ＩＤＣ）画分として使用した。 実施例２ Ｂ４Ｂのクローニング Ｂ４Ｂ遺伝子を、ディファレンシャルディスプレイＰＣＲおよびｃＤＮＡによ って同定およびクローン化した。Fast Track Kit（Invitrogen、San Diego、CA ）を使用して、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、実施例１に記載の方法に従って単離され たＩＤＣ、低密度および高密度の細胞画分から、ならびにＥＢＶ形質転換リンパ 芽球様細胞株ＲＥＭ（Liuら、1990）から精製した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、オ リゴ（ｄＴ）およびｃDNA Copy Kit（Invitrogen）を使用してｃＤＮＡに逆転写 し、そしてＢｓｔＸＩで消化したｐｃＤＮＡ１プラスミド（Inbvitrogen）の誘 導体への挿入のための非自己相補的ＢｓｔＸＩアダプターに連結した。連結した インサートを使用して、エレクトロポレーションによりＥ.ｃｏｌｉ株ＭＣ１０ ６１を形質転換し、そして０.５〜２.０×１０⁶の範囲の独立クローンのｃＤＮ Ａライブラリーを生じた。テンプレートとして、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの代わりに 、増幅したｃＤＮＡライブラリーからの精製プラスミドＤＮＡを使用したこと以 外、LiangおよびPardeeに従って、ディファレンシャルディスプレイＰＣＲを 実施した。ＰＣＲ条件は、DNA Thermal Cycler（Perkin Elmer、Norwalk、CT） を使用して、以下のとおりであった：９４℃３０秒間、４２℃６０秒間、および ７２℃３０秒間を合計４０サイクル、続いて７２℃にて５分間の伸長。ＩＤＣラ イブラリーによって独自に提示されたバンドを、ＰＡＧＥゲルから単離し、同一 条件を使用してＰＣＲによって再び増幅し、そしてpCRII（Invitrogen）中にク ローン化し、そして配列決定した。ＤＮＡ配列をＧｅｎｂａｎｋデータベースと 比較し、そして新規であると判明したものを、３０マー配列特異的プライマー対 を合成すること、および以下のＰＣＲ条件（９４℃６０秒間、６０℃６０秒間、 ７２℃６０秒間を合計３０サイクル、続いて７２℃にて５分間の伸長）を使用し て、ポジティブコントロールとしてのインサートプラスミドＤＮＡと共に、４つ のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによってさらに特徴付けた。 完全長ｃＤＮＡクローンを得るために、１０１ｂｐ Ｂ４Ｂインサートを、ラ ンダムヘキサマー標識キット（Boehringer Mannheim、Indianapolis、IN）を使 用して［³²Ｐ］ｄＧＴＰおよび［³²Ｐ］ｄＣＴＰで標識し、そしてこれを使用し て、Lambda Superscript and Packaging Kit（Gibco BRL）をＥ.ｃｏｌｉにおい て供給された取り扱い説明書に従って使用してＩＤＣ ｍＲＮＡから調製したλ ファージｃＤＮＡライブラリーをプローブした。スクリーニングした合計１×１ ０⁶プラークのうち、４つを二次スクリーニングに選択し、そして２.７ｋｂイン サートを含む１つのクローンを、さらなる分析のために選択した。インサートを pBluescript II KS(+)（Stratagene、San Diego、CA）中にサブクローン化し、 そしてABI 373 DNAシーケンサー（Applied Biosystems、Foster City、CA）を使 用して配列決定した。Bluescript II KSプラスミド中にＢ４Ｂ配列を含むｃＤＮ Ａの２.７ｋｂインサートを含むＥ.ｃｏｌｉクローンを単離した。このクローン を「ｌ−１２＃６−２９.ＢＳ」と名付け、Stanford University Blood Bank（E dgar Engleman博士、Palo Alto、CA）に寄託している。 実施例３ 蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによるゲノムクローンの同定 実施例２に記載の２.７ｋｂ Ｂ４Ｂ ｃＤＮＡインサートをプローブとして使 用して、正常ヒトゲノムＤＮＡライブラリー由来のＢ４Ｂゲノムクローンを、Ｐ １ファージ系（BIOS Laboratories、New Haven、CT）を使用して同定した。Ｂ４ Ｂゲノムクローンを、ニックトランスレーションによりビオチンｄＵＴＰで標識 し、そして標準的技術に従って正常ヒト中期染色体とハイブリダイズさせた。ハ イブリダイズしたプローブをアビジン−ＦＩＴＣで検出し、そして染色体をヨー 化プロピジウムで対比染色した。第２の実験において、ヒト第２０染色体特異的 プローブをＢ４Ｂプローブと同時ハイブリダイズさせて、Ｂ４Ｂ遺伝子の染色体 内でのより細かな位置を決定した。合計８０の中期細胞を分析し、そして７３細 胞が特異的シグナルを示した。 実施例４ Ｂ４Ｂの発現の位置決め Ａ．ノーザン分析 Ｂ４Ｂ ｃＤＮＡインサートをファージライブラリースクリーニングのために 標識し、そしてこれを使用して、種々の正常ヒト組織（Clontech、Palo Alto、C A）から製造業者の取り扱い説明書に従って電気泳動的に分離したポリ（Ａ）＋ ＲＮＡを含むナイロンフィルターをプローブした。次いで、フィルターから取り 外し、そして供給されたβアクチンｃＤＮＡで再プローブした。放射活性バンド を、標準的技術（Rueggら、1995）に従って可視化した。 Ｂ．免疫組織学 ホルマリン固定しパラフィン包埋した正常ヒト組織（BioGenex、San Ramon、C A）の切片を含む顕微鏡スライドを、供給された取り扱い説明書に従って脱パラ フィンし、そして非特異的結合部位を、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水中の５％脱脂 粉乳/２０％正常ヤギ血清において２０分間インキュベートすることによってブ ロックした。次いで、ブロッキング緩衝液で希釈した抗ペプチドＩｇ（２μｇ/ ｍｌ）を添加し、そして４５分間インキュベートし、続いてＴｒｉｓ緩衝化生理 食塩水中で洗浄した。過剰な遊離ペプチドを用いるブロック研究のために、抗ペ プチド２ Ｉｇを、遊離ペプチド２（１ｍｇ/ｍｌ）とともに２０分間プレインキ ュベートし、次いでこの混合物を組織切片に添加した。ビオチン化ヤギ抗マウス Ｉｇ、続いてアビジン−アルカリホスファターゼ（BioGenex）を用いて、結合し たＩｇを検出した。ポジティブ細胞をFast Red基質で可視化し、そしてヘマトキ シリンで対比染色し、顕微鏡写真観察のためにマウントした。 実施例５ Ｂ４Ｂペプチド抗体の作製 Ｂ４Ｂ由来ペプチドであるペプチド１（ＣＳＤＳＬＳＹＡＳＥＤＡＬＫ；配列 番号４）およびペプチド２（ＳＨＹＡＮＲＤＧＴＱＹＨＨ；配列番号５）を合成 し（BioSynthesis、Lewisville、TX）、そしてInjet Activated Immunogen Conj ugation Kit（Pierce Chemical、Rockford、IL）を使用して、Ｎ末端システイン 残基を介してキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させた。ＫＬ Ｈ結合ペプチドを使用してウサギ（EL Labs、Soquel、CA）を免疫し、そして合 計３回の免疫後、血清を回収した。ImmunoPure Ag/Ab Immobilization Kit（Pie rce）を製造業者の取り扱い説明書に従って使用して、ペプチド１またはペプチ ド２のいずれかで誘導体化したカラムを通過させることによって、ペプチド特異 的Ｉｇを全血清からアフィニティー精製した。アフィニティー精製抗ペプチドＩ ｇを、後のすべての研究に使用した。 実施例６ Ｂ４Ｂタンパク質のインビトロ産生 Ｂ４Ｂタンパク質を、［³⁵Ｓ］システインの存在下で、TNT Kit（Promega、Ma dison、WI）を使用してインビトロで転写および翻訳した。次いで、反応混合物 を、１％Triton X-100/０.５％デオキシコール酸/０.１％ＳＤＳ中に可溶化した 。抗ペプチドＩｇを最終濃度２μｇ/ｍｌに添加し、そして免疫複合体をProtein G-Sepharose（Zymed、South San Francisco、CA）で回収した。免疫吸着した抗 原を、５％２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中 で煮沸することによって遊離させ、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、そ して放射活性バンドを記載（Rueggら、1992）のように可視化した。 実施例７ 免疫蛍光顕微鏡観察 ＰＢＭＣを、５０％Percoll勾配からの界面画分を使用することによって、Ｂ ４Ｂ＋細胞についてさらに富化し、そして直接分析するか、または代わりに、顕 微鏡スライドに付着する前に、Englemanら（1981）によって記載される方法に従 ってペトリ皿での抗体パニングにより分画した。正常成人ドナーからの骨髄吸引 物を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐにより加工した後、顕微鏡スライドに固定した。５ ％パラホルムアルデヒドと有機溶媒との組合せによる固定のみが、Ｂ４Ｂペプチ ド２エピトープを明らかにしたという観察に基づいて、すべての白血球調製物を 以下のように固定した：生存可能細胞を、ポリＬリジン（Sigma Chemical Co.、 St．Louis、MO）をコートした顕微鏡スライドに１５分間付着させ、５％パラホ ルムアルデヒド中で５分間、続いて５０％アセトン/５０％メタノール中で５分 間インキュベートし、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水中で再水和させ、そして非特異 的結合部位を、上記の組織切片に関してのようにブロックした。別の言及がなけ れば、免疫蛍光顕微鏡観察に使用したすべてのｍＡｂは、抗ＣＤ３４（Amac，In c.、Westbrook、ME）を除いて、Ｄａｋｏ（Carpinteria、CA）社製であった。Ｃ ＯＳ−７細胞トランスフェクタントの免疫蛍光顕微鏡観察のためには、細胞をカ バーガラス上で増殖させ、次いでまさに白血球についてのように固定および染色 した。 抗ペプチド１または抗ペプチド２ Ｉｇを、ホルマリン固定パラフィン包埋ヒ ト組織と反応させ、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇおよびアビジン結合アルカリホ スファターゼ、続いてFast Red基質で可視化し、そしてヘマトキシリンで対比染 色した。リンパ節を、抗ペプチド１（ネガティブコントロールとして）、抗ペプ チド２、または過剰な遊離ペプチド２とプレインキュベートした抗ペプチド２で 染色した。心臓、胎盤および他の組織もまた抗ペプチド２で染色した。 二色分析実験において、抗ペプチド２ Ｉｇ（ウサギ）をマウスｍＡｂと組み 合わせて使用し、そしてそれぞれを、種特異的、交差吸着フィコエリトリン（Ｐ Ｅ）４結合ロバ抗ウサギＩｇＧとビオチン化ロバ抗マウスＩｇＧとのカクテル、 続いてＦＩＴＣ結合ストレプトアビジン（Jackson ImmunoResearch、West Grove 、 PA）を使用して、特異的に検出した。細胞を、Zeiss Axiovert 100蛍光顕微鏡（ Carl Zeiss Inc.、Thornwood、NJ）を使用して、検査および写真撮影した。免疫 選択した細胞系統サブセットのためには、抗ＣＤ３（OKT3）、抗ＣＤ１９（Calt ag、South San Francisco、CA）、または抗ＣＤ１６および抗ＣＤ５６（Caltag ）の組合せを使用してポジティブ選択を実施した。ヤギ抗マウスＩｇＧをコート したペトリ皿でのパニングを、Englemanら（1981）により記載されるように実施 した。 実施例８ フローサイトメトリー実験 正常骨髄をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐで分画し、そして界面の細胞を、Ｄ−ＰＢＳ /２０％正常ヤギ血清とのＦｃＲ結合についてブロックし、続いて蛍光標識した 抗ＣＤ３４−ＦＩＴＣ（Becton-Dickinson，Inc.、San Jose、CA）、抗ＣＤ１９ −Ｔｒｉｃｏｌｏｒ、または抗ＣＤ２０−ＰＥ（Caltag，Inc.、South San Fran cisco、CA）、あるいは無関係なアイソタイプ適合コントロールで染色した。Ｆ ＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Becton-Dickinson）を使用して分析を実施 した。ここで、アイソタイプコントロール（無関係なアイソタイプ適合コントロ ールｍＡｂ）で染色された細胞の９９.９％を排除するように象限ゲートをセッ トした。結果を図５に示す。ここで、パネルＡは、ＣＤ１９の発現（ｘ軸）およ びＣＤ２０の発現（ｙ軸）について分析された細胞を示す。パネルＢは、ＣＤ１ ９の発現（ｘ軸）およびＣＤ３４の発現（ｙ軸）について再プロットされた、パ ネルＡの右下象限の細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ２０−）を示す。パーセント値（４. ６％、３.７％）は、対応する表現型を有する総細胞の割合を示す。前方散乱お よび側方散乱により非生存細胞を排除した。 実施例９ ＣＯＳ−７細胞における一過性発現 ＣＯＳ−７細胞を、ｐｃＤＮＡプラスミド（Invitrogen）において利用可能な ＣＭＶ即時プロモーターおよびバクテリオファージＴ７プロモーターの二重制御 下のＢ４ＢまたはＣＤ４（無関係なコントロール）のｃＤＮＡでのエレクトロポ レーションによってトランスフェクトした。細胞を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ を発現する組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３（２１）に直ぐに感染させた か、または感染させなかったかのいずれかであった。 実施例１０ 細胞増殖アッセイ 増殖アッセイのために、細胞（１ウェルあたり２×１０⁴）を９６ウェル平底 プレートにプレートし、そして３７℃にて指定された時間インキュベートした。 培養物を［³Ｈ］ＴｄＲ（１μＣｉ/ウェル）でパルスし、そして1205 BetaPlate （Wallac、Turku、Finland）を使用して取り込まれたチミジンを測定した。バッ クグランドの読み取り値は、平均１２ｃｐｍであった。 ％阻害を以下の式を用いて算出した： ％阻害＝（１−（Ｂ４Ｂ ｃｐｍ/ＣＤ４ ｃｐｍ））×１００ 二次多項式曲線をこのデータにフィットさせ、阻害の二相性過程をモデル化した 。統計学的有意性を、スチューデントのｔ検定を使用して決定した。 本発明は、特定の方法および実施態様に関して記載されているが、種々の改変 および変更が本発明を逸脱することなくなされ得ることが認識される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 イングルマン，エドガー ジー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94027, アサートン，レーン プレイス 60

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号３および配列番号７として示される配列から選択されるアミノ酸配 列を有するタンパク質との少なくとも５０％の配列同一性により特徴づけられる アミノ酸配列を有する増殖停止遺伝子産物をコードする遺伝子を含む、単離され たＤＮＡ分子。 ２．前記ＤＮＡが宿主細胞により発現される場合、該宿主細胞の増殖を阻害し得 る増殖停止遺伝子産物をコードする、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。 ３．配列番号２または配列番号６とハイブリダイズするプローブとハイブリダイ ズする、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子であって、ここで全ての該ハイ ブリダイゼーションが、中程度のストリンジェンシー条件下で実行される、単離 されたＤＮＡ分子。 ４．配列番号２の配列を有する、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。 ５．配列番号６の配列を有する、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。 ６．単離されたＢ細胞タンパク質抗原であって、 （ｉ）該抗原が、真核生物細胞にトランスフェクトされ、そして真核生物細胞 により発現される場合、真核生物細胞の増殖を阻害すること、および （ii）配列番号３として示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、および配 列番号６として示されるアミノ酸配列を有するタンパク質からなる群より選択さ れるタンパク質との少なくとも５０％の配列同一性、 によって特徴づけられる、抗原。 ７．ＣＤ１９、ＣＤ４５、およびＨＬＡ−ＤＲもまた発現するが、ＣＤ２０、Ｃ Ｄ３、ＣＤ１６、ＣＤ５６は発現しないＢ細胞により発現される、請求項６に記 載の抗原。 ８．配列番号３の配列を有する、請求項６に記載の単離されたＢ細胞抗原。 ９．配列番号７の配列を有する、請求項６に記載の単離されたＢ細胞抗原。 １０．配列番号３および配列番号７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有 するタンパク質との少なくとも５０％の配列同一性により特徴づけられる配列を 有するＢ４Ｂ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むコード領域を含む 、発現ベクター。 １１．前記コード領域が、配列番号２として示されるＤＮＡ配列を含む、請求項 １０に記載のベクター。 １２．前記コード領域が、配列番号６として示される配列を含む、請求項１０に 記載のベクター。 １３．配列番号３および配列番号７として示される配列から選択されるアミノ酸 配列を有するタンパク質に対し少なくとも５０％の同一性を有するＢ４Ｂ遺伝子 産物をコードするヌクレオチド配列を含む非相同ＤＮＡ分子を含む、真核生物細 胞。 １４．前記ＤＮＡ分子が、配列番号２および配列番号６として示される配列から 選択される配列を含む、請求項１３に記載の細胞。 １５．配列番号３および配列番号７として示される配列から選択されるアミノ酸 配列を有するタンパク質に対し少なくとも５０％の配列同一性を有するＢ４Ｂ遺 伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む非相同コード領域を含む、原核生 物細胞。 １６．前記非相同コード領域が、配列番号３として示されるアミノ酸配列を有す るＢ４Ｂ遺伝子産物をコードする、請求項１５に記載の原核生物細胞。 １７．宿主細胞の増殖を阻害し得る増殖停止遺伝子産物を産生する細胞を産生す る方法であって、 該細胞に、配列番号３および配列番号７から選択される配列を有するタンパク 質との少なくとも５０％の配列同一性により特徴づけられる配列を有するＢ４Ｂ 遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むコード領域を含む発現ベクター を挿入する工程、 を包含する、方法。 １８．前記コード領域が、配列番号２として示される配列を含む、請求項１７に 記載の方法。 １９．前記コード領域が、配列番号６として示される配列を含む、請求項１７に 記載の方法。 ２０．細胞混合物においてＢ４Ｂ抗原を含む細胞のサブセットの存在を検出する 方法であって、 該細胞混合物と、配列番号３の配列を有するタンパク質と免疫反応性である抗 体とを接触させる工程、および 該細胞混合物中の細胞への該抗体の結合を検出する工程 を包含する、方法。 ２１．前記抗体が、配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号 ５のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群より選択されるペプチドに対する 抗体である、請求項２０に記載の方法。