JP2000514287A

JP2000514287A - 酸化防止剤機能の生化学的分析

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Publication number: JP2000514287A
Application number: JP10503167A
Authority: JP
Inventors: クラウフォード，ジェイ．フレッド; ビュッシィ，リューク
Original assignee: Research Development Foundation
Current assignee: Research Development Foundation
Priority date: 1996-06-19
Filing date: 1997-06-18
Publication date: 2000-10-31
Anticipated expiration: 2017-06-18
Also published as: KR20000016773A; CN1109759C; RU2233323C2; CA2258803A1; AU720703B2; ATE230030T1; EP0925370A4; DE69718017T2; CA2258803C; ZA975359B; IL127576A0; KR100461205B1; NZ333231A; WO1997048821A1; CN1222940A; IL127576A; EP0925370B1; JP3679133B2; US5985665A; EP0925370A1

Abstract

(57)【要約】本発明はヒトリンパ球の酸化防止剤機能の生化学的分析に有用な細胞培養培地を提供する。前記培地は次の成分を含む。緩衝化無血清溶液：グルコース及び細胞内でグルコース生産が可能な生物学的化合物が構成する群から選択された炭水化物；生物的使用可能な形式のパントテン酸、コリンあるいは細胞内のコリン生産可能な生物学的使用可能な形式の基質；塩化物、リン酸塩、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムを含む無機イオン；生物学的利用可能な形式の鉄、クメンハイドロペルオキシド、脱イオン水、及び分析されるリンパ球を刺激する効果的な量のマイトジェン；pHが約6.8から7.6である前記緩衝化無血清溶液；前記細胞培養培地は栄養学的欠乏、不適切、及び不均衡及びリンパ球の酸化防止機能の生物学的分析に効果的なものとして特徴付されるもので構成される。さらに、提供されるものは、個体での細胞酸化防止剤機能の生化学的分析の方法：植え付けられた細胞培養培地のインキュベーション；及び；コントロール群の個人からのリンパ球の平均的な反応とそのリンパ球の反応との比較；の段階で構成される。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称酸化防止剤機能の生化学的分析発明の背景発明の分野本発明は栄養学及び生理化学の分野に広く関する。さらに具体的には言えば、本発明は酸化防止剤機能の生化学的分析に関する。関連技術の説明個々の細胞は酸化的ストレスの原因となるフリーラジカルと呼ばれる高い反応性をもちかつ不安定な分子に絶えずさらされている。これらの敵対分子は生命の通常の副産物であり酸素の代謝、すなわち細胞呼吸、免疫系細胞（外的異物の殺害）及び代謝に不可欠な非常に多くの酵素反応によって生産される。フリーラジカルの環境的発生源には煙、電離性放射線、大気汚染、化学薬品（発がん物質、多くの石油化学製品、生物致死剤、色素、溶媒、静細胞薬剤、その他）、毒性重金属、及び酸化（酸敗）脂肪が含まれる。最も一般的なフリーラジカルの中には超過酸化物、水酸基、一重項酸素及び過酸化物がある。ある原子価の鉄及び銅は短期間ではあるが、生物分子の変形、損傷の結果に続いて、ラジカルの形成の連鎖反応を促進し、フリーラジカルの形成を触媒することができる。フリーラジカルは生命有機体に対し毒性を持ち、すべての生物分子の構造的損傷の原因となる。分子状の損傷は遺伝子コードの変更、神経学的障害、細胞膜状熊の分裂、内分泌不安定、アレルギーの増加、血管内皮破壊、及び関節破壊と炎症へ転化されることがある。フリーラジカルの有毒な影響からの防護は酸化防止剤と呼ばれる多様な領域の分子において見いだされる。フリーラジカル、及びそれらが関連した副産物は酸化防止剤により中和され、害の少ない生産物に変換されることができる。酸化防止剤は酵素（超過酸化物不均化酵素、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシターゼのような）、必須栄養物（ベータカロチン、ビタミンＣ及びＢ、セレン及びシステインのような）、非常に様々な内生部質（グルタチオンのような）あるいは食物化合物（ビオフラボノイドのような）であってもよい。したがって、人間の体内にはフリーラジカルの種々の抑制物を持っている。ヒトでの調査では栄養性酸化防止剤の摂取の欠乏が、がん、心臓血管の病気、関節炎、白内障、その他の高い発生危険性と関連づけること示している。さらに、栄養性酸化防止剤の多量の摂取は慢性退行性症発生低下に高い関連性を持つ。励みになる研究では酸化防止剤の補充を含む干渉がヒトにおいて治療上の利点を持つといってもよいことを示す。酸化防止剤の状態の実験室レベルでの分析は多様な理由から決まった手順では行えなかった。フリーラジカルは著しく短期間で消え去り、一般に直接の測定を行うことができない。フリーラジカル損傷の副産物は血清あるいは尿中ではマロンジアルデイド（ＭＡＤ）、チオバルビーツール酸反応基質（ＴＢＡＲＳ）あるいは脂質ペルオキシターゼとして測定できる。これらの検査はある形式の生物分子（大部分は多不飽和脂肪及び核酸）に対する損傷に反映されるだけではなく、酸化的ストレスの指示薬となる。血清あるいは細胞中の酸化防止栄養物レベル、及び酸化防止酵素活性の機能の測定は特異的な構成物の不足レベルを決定することができが、しかし、酸化防止剤の相互作用及び正確な機能についてはほとんど情報を与えない。酸化ストレスに対する他の検査は調査セッティングとして存在するが、しかしその複雑性と費用のために臨床実験室での定型的使用には適していない。以前の技術はヒトにおける酸化防止剤機能の生化学的分析の単純で安価な方法を欠く点で不完全である。本発明はこの技術の長期間にわたる必要性と要望を満たすものである。発明の要約本発明の一つの実施態様は、ヒトリンパ球における酸化防止剤機能の生化学的分析で使用に有用な細胞培養培地の提供があり、前記培地は、次の成分を含む緩衝化無血清溶液で構成される：グルコース及び細胞内でグルコース生産が可能な生物学的化合物が構成する群から選択された炭水化物、生物的使用可能な形式のパントテン酸、コリンあるいは細胞内のコリン生産可能な生物学的使用可能な形式の基質、生物学的利用可能な形式の塩化物、リン酸塩、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び鉄で構成される無機イオン、クメンハイドロペルオキサイド、脱イオン水、及び分析されるリンパ球を刺激する効果的な量の窒素；前記緩衝化無血清溶液のpHはおおよそ6.8から7.6である、前記細胞培養培地は栄養学的欠乏、不適切、及び不均衡及びリンパ球の酸化防止機能の生物学的分析に効果的なものとして特徴付される。本発明の別の実施形態は、個体における細胞酸化剤機能の生化学的な分析方法の提供である：本発明の細胞培養培地に前記個体からのリンパ球の植え付け；植え付けられた細胞培養培地のインキュベーション；コントロール群の個体からのリンパ球の平均的な反応とそのリンパ球の反応との比較、の段階で構成される。本発明のさらに別の実施形態は、個体での特異的要求栄養素に対する異常量栄養所要量の決定の方法の提供である：本発明の細胞培養培地に前記個体からのリンパ球の植え付け、前記培地は制限濃度のテストされる栄養物を持つ；植え付けられた細胞培養培地のインキュベーション；コントロール群の個人からのリンパ球の平均的な反応とそのリンパ球の反応との比較、の段階で構成される。本発明のさらに別の実施形態は、栄養因子あるいは栄養素の有害な効果を克服する生化学中間生成物、生化学中間生成物あるいはその生産物、及びこのような損害効果に対する個々の感受性を持つ薬剤を含む他の血液成分の識別方法の提供：少なくとも１種以上の栄養素を含む本発明の細胞培養培地に前記個体からのリンパ球の植え付け、生化学的中間産物あるいは生産物あるいは細胞応答に有害な影響を与える濃度の薬剤を含む他の血液生物；植え付けられた細胞培養培地のインキュベーション；及び栄養的、生化学的中間生産物あるいはその生産物あるいは検査する薬剤を含む他の血液成分に有害な影響を与えると推測される基質のもととなるものを与えられた同じ培地での反応との比較、の段階で構成される。本発明の他の及びそれ以上の局面、特徴及び利点は説明書のために与えられた発明のここに提出された具体化物の以下の記載から明らかにされるであろう。図面の簡単な説明発明の上記で述べられた特徴、利点及び目的の内容を明確化される他のものと同様に達成及び詳細に理解することができるために、上で簡単に要約された発明のより詳細な記載を添付した図面に図示されている具体化物に対する参照文として述べられる。これらの図面は明細書の一部を構成する。しかしながら、添付図面はこの発明の選ばれた具体化物を図示しており、したがってその範囲に限定して検討してはならないことを注意しなければならない。図１は参照範囲の集団からのクメンハイドロペルオキサイドの投与量反応曲線を示す。発明の詳細な説明本発明は細胞内ビタミン欠乏及び個々の細胞の新たな生化学的分析を提供する全酸化防止剤機能を評価する血液分析を指向する。このような分析は栄養素及び酸化防止システムが実際に個々の末梢リンパ球内での程度良く機能しているかをを反映する。以前は細胞内のビタミンの状態の測定が不可能の場所において、本発明の方法論により臨床上の問題とされる前に欠乏が正確に発見できる。本発明の開発までは、ビタミン検査は臨床でのある標識酵素及びタンパク質に加え、血清、尿あるいは毛髪中の静止レベルの測定に基づいていた。これらの検査は短期間の静止レベルは指示するが、これらの化合物が酵素補因子として加わっている多くの複雑な代謝経路を評価しない。このように、頻繁に報告されている他の方法論では機能的に不正確な結果となり、さらに臨床上実用的ではない。静的レベルの測定に代わり、本発明の方法はビタミン、無機物、アミノ酸及び酸化防止剤が実際個々の白血球内でどのように機能しているのかを分析した。機能的であると主張しているものすら含めた、他の方法論と異なって、本発明の方法はマイトジェン反応を制限する機能性細胞内欠乏を認知するために、代謝的に活性化した末梢リンパ球及びＤＮＡ合成（細胞成長）を利用した。このように、本発明の方法は血清レベルあるいは単独の生化学的経路を利用した分析ではなく全代謝機能を反映した分析結果を与える。リンパ球は顕著な利点を提供している、なぜならそれらは：（１）細胞媒介免疫系の主役を占め容易に成長（マイトジェネシス）を簡単に刺激できる；（２）時間的に平均化され、長期間の栄養素状態を反映し（１個のリンパ球の生存期間は約６カ月である）；（３）急速ＤＮＡ合成と細胞成長を可能にし標準的な静脈穿刺によって容易に回収される、別の細胞と共有の代謝経路を所有するからである。本発明の方法は化学的に定義された無血清あるいは無タンパク質の培地を使用してそれぞれの患者リンパ球内のＤＮＡ合成（細胞成長）の測定により細胞内の機能的欠乏血液検査のみである。コントロールの培地には最善のリンパ球成長、あるいはマイトジェニック反応を支えるのに必要最小限の必須栄養素を含んでいる。細胞代謝における19種類のビタミン、無機物及びアミノ酸の機能的状態は培地でのそれぞれの栄養素の操作によってリンパ球の成長を作り出すことによって直接決定される。さらに重要なことは、本発明の方法はフリーラジカルあるいは他の型式の酸化ストレスが原因の損傷に対する抵抗力を細胞に与える全能力を評価する全酸化防止剤機能検査ができるようにする。相当数の細胞性酸化防止剤− 広範囲の相互作用、過剰部分、修理及び再負荷能力を伴う−のために、全機能の測定は全体の酸化防止剤状態を評価する最も正確で臨床的に有用な方法である。それぞれの患者の生きた、代謝的に活性化したリンパ球を使用することにより、本発明の方法はこれまでのいかなる実験室レベル検査よりもビタミン及び無機物についてより正確で臨床上有用な分析法をあたえる。公表された研究によれば、合衆国人口の70％が長期間のビタミン及び無機物欠乏の危険にさらされている。これらの欠乏は人体の効率的な機能及び病気に対する自身の抵抗性に悪影響を与えることができる。科学的な証明はビタミン欠乏の治療は免疫能及びエイズの予防あるいは慢性退行性健康状態を高めることを示している。研究はまた、有意な細胞内機能的欠乏がすでにビタミンを摂取している患者の40％を越える人で起こっていることを示している。さらに、奨励食餌許容量（ＲＤＡｓ）は個体のビタミン及び無機物要求量評価のための正確な指針がない。多くの人がこの発明の恩恵を受けることができる。ビタミン欠乏に対する治療が病気の患者が健康を維持して行くために不可欠なことである。これらの研究は最善のビタミン、無機物、アミノ酸及び酸化防止剤状態の予防的及び診療上の利点−心臓病及び多くの形式のがんの予防、免疫系機能の刺激及び年齢による生理機能の衰弱をおくらせることに貢献するような−を示している。アルコール中毒及び物質乱用、関節炎、慢性疲労、糖尿病、ＨＩＶ/ＡＩＤＳ及び他の免疫不全、黄斑変性、不快及び疲労感、多発性硬化症、神経管欠陥、肥満、骨粗しょう症及び妊娠のような健康状態は、直接あるいは間接にビタミン及び無機物欠乏に影響されることがあり、充満はこれら慢性健康状態の進行の抑止及び予防に貢献することが示されている。本発明の今回ここで提出された具体化したものは以下に詳細に記述されるが、本発明の分析の多くの基本化合物、たとえば、溶液、培養培地、塩、及び他の化合物はU．S．Patent No.4,499,064に記載されている。本発明は細胞培地をヒトリンパ球の酸化防止剤機能の生化学的分析に有効なものに導く、前記培地は、次の成分を含む緩衝化無血清溶液で構成される：グルコース及び細胞内でグルコース生産が可能な生物学的化合物が構成する群から選択された炭水化物、生物的使用可能な形式のパントテン酸、コリンあるいは細胞内のコリン生産可能な生物学的使用可能な形式の基質、塩化物、リン酸塩、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム構成される無機イオン、及び生物学的利用可能な形式の鉄、クメンハイドロペルオキサイド、脱イオン水、及び分析されるリンパ球を刺激する効果的な量のマイトジェン；前記緩衝化無血清溶液の pHはおおよそ6.8から7.6である、前記細胞培養培地は栄養学的欠乏、不適切、及び不均衡及びリンパ球の酸化防止機能の生物学的分析に効果的なものとして特徴付される。ひとつの実施形態において、細胞培養培地は生物的利用可能な形式のアミノ酸及びビタミンで構成される群から選ばれた栄養素補充で補足され、栄養素は栄養素補充での制限あるいは阻害量からはずれるあるいは存在しているかを検査される。この場合、ビタミンは、ビオチン、フォリニン酸あるいは生物学的に利用可能な形式の葉酸、ニコチンアミドあるいはニコチン酸、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ₆及びビタミンＢ₁₂及び細胞内でそれらを作り出す能力をもつ化合物で構成される群から選択される；そこにおいて前記アミノ酸あるいは生物学的にアミノ酸を細胞内で生産する能力をもつ化合物は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ− イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンで構成され、アミノ酸は集団として存在し、それぞれの総量は阻害濃度を越えることはない。一般に、本発明の細胞培養培地は作り出された酸化防止剤機能を正確な生化学的分析ができるように、ある濃度のクメンハイドロペルオキサイドを含んでいる。むしろ、細胞培地内のクメンハイドロペルオキサイドの濃度は約50μＭから約 500μＭが選ばれるべきである。別の実施の形態においては、本発明の細胞培養培地はおおよそ最大の反応を避ける濃度においてピルビン酸、アデニン、及びイノシトールあるいはそれらを細胞内で生産することのできる化合物で構成される群から選択された１もしくはそれ以上の刺激性栄養素で補充されている。一般に、細胞の最大反応に効果的な最小限近く濃度で存在するアミノ酸補充のそれぞれのアミノ酸は検査されるアミノ酸から除外される。さらに、培地にセリン及びグリシンの片方あるいは両方が無い場合、ビタミンＢ₆および利用可能な形式の葉酸の片方あるいは両方が細胞反応に対する有効濃度で培養培地に含まれている。別に具体化すると、培地にパントテン酸及びコリンの片方が無い場合、前記培地中の細胞培養は培地に無いパントテン酸及びコリンの反応制限量補充されたときに栄養素欠乏及び異常要求量の決定に有効である。本発明はさらに、個体内で特異的に要求される栄養素に対する異常量的栄養要求量の決定の方法を導きだす：請求項１の細胞培養培地に前記個体からのリンパ球の植え付け、前記培地は制限濃度のテストされる栄養物を持つ；植え付けられた細胞培養培地のインキュベーション；コントロール群の個体からのリンパ球の平均的な反応とそのリンパ球の反応との比較、の段階で構成される。本発明はさらに、栄養因子あるいは栄養素の有害な効果を克服する生化学的中間産物、生化学的中間産物あるいはその生産物、及びこのような損害効果に対する個々の感受性を持つ薬剤を含む他の血液成分の識別方法を導き出す：少なくとも１種以上の栄養素、生化学的中間産物あるいは生産物あるいは細胞応答に有害な影響を与える濃度の薬剤を含む他の血液成分を含む請求項１の細胞培養培地に前記個体からのリンパ球の植え付け；植え付けられた細胞培養培地のインキュベーション；及び栄養的、生化学的中間生産物あるいはその生産物あるいは検査する薬剤を含む他の血液成分に有害な影響を与えると推測される基質のもととなるものを与えられた同じ培地での反応との比較、の段階で構成される。本発明は、個体における細胞酸化剤機能の生化学的な分析方法を与える：本発明の細胞培養培地に前記個体からのリンパ球の植え付け；植え付けられた細胞培養培地のインキュベーション；コントロール群の個体からのリンパ球の平均的な反応とそのリンパ球の反応との比較、の段階で構成される。この実施形態の様々な側面は以下に詳細に記載した以下の実施例は発明の様々な実施形態を説明する目的で示されており、いかなるやり方でも本発明を制限する意味のものではない。実施例１患者血液の採血酸ークエン酸塩−グルコースに保存された10mlの全血液の２個のサンプルが本発明の方法には必要とされる。絶食は必要でない。必要とされるすべてのことは採血で満たされる。本発明の分析はそれで行うことができ、あるいは患者の血液は室温で都合のよい実験室に移すべきである。血液の遠心分離は必要とされない。総合的な試験結果は患者の欠損の充分な科学的に基づいた分析結果を与える。実施例２サンプル処理：細胞分離すべての処理はサンプルの無菌状態を保持するために層流フードの元で無菌操作によって行われる。それぞれの患者の血液は実験室で受領書の登録番号に割り当てる。この割り当て番号は処理、データ収集及びデータ分析の期間を通じて追跡に使用できるサンプル番号として使用される。患者のサンプル処理に含まれるすべての試験管、遠心管およびデータ印刷物にはこのサンプル（登録）番号を記す。それぞれの患者サンプルは８mlの全血液を入れた（２）二本の酸−クエン酸塩 −グルコース（黄色キャップ）バキュテーナー型管で構成される。受け入れ（サンプル）番号の割り当て後、全血液は６回ひっくり返して混合された。二本のチューブの全血液は50mlディスポーザブル遠心管の中で一緒にされた。 500μｌアリコートがそれぞれのサンプルから無菌的に取り除かれ、12×17mm 管に入れられた。このアリコートはCoulter Celｌ Counter，Model T540を使った全血液細胞数計測を行うことに使用される。全血液数のCoulterから出力データには登録番号を記し、その患者のワークシートに添付した。それぞれのサンプルに対して二つの（２）フィコール勾配チューブが5.0mlのH istopaque 1077（フィコール／ナトリウムジアトリゾアイト、Sigma Chemicals ，St．Louis，Missouri）をそれぞれの15ml円錐形の遠心管に加えることにより準備された。10mlピペット及び電子ピペットエイドを使用し、８mlの全血液がそれぞれのフィコール勾配チューブの表面にゆっくりとおかれた。フィコール勾配チューブはキャップがされ、2160RPMで20分間遠心分離された。遠心分離が終了後、勾配を乱すことを避けるために遠心分離機から注意深く取り外された。中間フィコール層の界面に見いだされるバッフィーコート（リンパ球を含む）は５mlピペットを使用して15mlディスポーザブル円錐形遠心管に移された。バッフィーコートはリン酸緩衝化塩−0.72パーセントグルコース溶液（ＰＢＳ−Ｇ）に最終的に12mlとなるように加えられた。管はキャップがされ、バッフィーコートとＰＢＳ−Ｇを混合させるために６回ひっくり返された。バッフィーコートとＰＢＳ−Ｇが含まれた管は2l60RPMで５分間遠心分離された。遠心分離後、上清は細胞ペレットから吸引されて捨てられた。細胞ペレットは12mlのＰＢＳ−Ｇに再懸濁され、細胞ペレットの十分な分散が確実となるように６回ひっくり返された。サンプルはその後、上記条件で再び遠心分離された。２回目の遠心分離の後、上清は吸引されて捨てられた。細胞ペレットは６mlのＰＢＳ−Ｇに再懸濁された。細胞ペレットは電子ピペットエイドを付けた５mlピペットを使用しＰＢＳ−Ｇに分離混合された。同質の細胞懸濁液が得られた後、懸濁液の200μ１アリコートが12×75mm管に移された。このアリコートはCoulter Cell Counter Model T540を使用する初期細胞懸濁（ＩＣＳ）計測に使用された。このアリコートからの出力データはサンプル番号が記され、ワークシートに付着された。リンパ球数が3.9から1.2千細胞/mm³（ＴＨＳＤ/mm³）の間にあるならば、サンプルはプレート植え付け用に準備される。加えられるべき細胞懸濁液量は表ＩＩＩで示めされている。リンパ球数が3.9THSD/をmm³越えているならば、サンプルは再希釈しなけれまならなかった。一方、リンパ球数が1.2THSD/mm³未満の場合、サンプルは使用されなかった。適切な希釈に必要な加えられるＰＢＳ−Ｇ量は次の計算式によって決定される。Ｃ₁，Ｖ₁＝Ｃ₂Ｖ₂ Ｃ＝リンパ球濃度（THSD/mm³）Ｖ＝容量ここではＣ₂＝3.0THSD/mm³が最終細胞懸濁液に求められるリンパ球濃度である。例えば初期細胞懸濁計測が6.0ml＝（ＬＹ＃ of 5.6THSD/mm³とされた場合Ｃ₁，Ｖ₁＝Ｃ₂Ｖ₂ (5.6)(6.0ml)＝(3.0)(Ｘ) Ｘ＝11.2ml最終容量最終容量が11.2mlになるように適切量のＰＢＳ−Ｇが加えられた。この例では、最終容量が11.2mlになるように原液6.Omlに5.2mlが加えられる。（ＩＣＳ）に必要量のＰＢＳ−Ｇが加えられると最終細胞懸濁液（ＦＣＳ）になった。ＬＹ＃計測数及びＰＢＳ−Ｇ容量はスペクトロクス検査ワークシートに記録された。再希釈後、再希釈細胞懸濁液の200μｌアリコートが新しい12×75mm管に移された。再希釈細胞懸濁液出力データ（最終細胞懸濁液ＬＹ＃）はワークシートに添付され、植え付け量が記録された。実施例３プレート植え付け最終細胞懸濁液は無菌容器に入れられた。層流フードの内に培地を含んだミクロタイタープレートを置く。無菌処理０〜50μｌ境界チップを付けた12チャンネル手動式マイクロピペットを使用して、指定量（表Ｉに従う）の最終細胞懸濁液がプレートの「Ｈ」列のそれぞれの穴に分け与えられた。培地に細胞を添加した後、クメンハイドロペルオキサイド（ＣｕＯＯＨ）溶液が以下の方式で「Ｈ」列に添加された。（１）カラム１，２，３には10μｌの100μＭＣｕＯＯＨが与えられた；（２）カラム４，５，６には10μｌの200μＭＣｕＯＯＨが与えられた；（３）カラム７，８，９には10μｌの300μＭＣｕＯＯＨが与えられた；及び（４）カラム10，11，12には10μｌの400μＭＣｕＯＯＨが与えられた。ミクロタイタープレートへのＣｕＯＯＨの添加の後、ＣＯ₂インキュベーター内に置かれたプレートにカバーがかけられ、37℃で96時間放置された。実施例４標識すべての標識作業はラジオアイソトープ室で行われた。三重水素標識チミジン（Ｈ³−ＴｄＲ）作業溶液が冷蔵保存庫から出され、湯槽で37℃に暖められる。9 6時間後、ミクロタイタープレートはインキュベーターから出される。Ｈ³−ＴｄＲ作業溶液は無菌状態におかれ、無菌処理０−50μｌ境界チップを付けた12チャンネル手動式マイクロピペットを使い10μｌＨ³−ＴｄＲ作業溶液がミクロタイタープレートの「Ｈ」列のそれぞれの穴に分け与えられた。プレートは37℃のインキュベーターに24時間の間戻された。データ及び標識作業を行った技術者のイニシャルがサンプル記録用紙に記された。実施例５収穫すべての収穫作業はラジオアイソトープ室で行われた。シングルグラスファイバーマット（Packard Part No.6005416）は２番鉛筆を使用してサンプル番号を記した。真空ポンプを作動させ、そして乾燥炉を100℃にセットした。ハーベスターに取り付けた蒸留水容器を充填した。Ｈ³−ＴｄＲ添加の24時間後にインキュベターからミクロタイタープレートを取り出した。データ及び収穫作業を行った技術者のイニシャルがサンプル記録用紙に記された。細胞ハーベスター（Packard Model No.Ｃ9619）を開放状態にして、Ｏ−リングを露出させる、グラスファイバーマットを荒面側をＯ−リングに接着させる形でハーベスターに装着した。細胞ハーベスターの蓋を閉め、リンストレイからの蒸留水で湿らせる。ハーベスターは真空周期（ＶＡＣ）にしておく。蓋をミクロタイタープレートをハーベスタープローブチップの下に置いた。プローブのチップがプレートの底に接触するまで、プレートがハーベストプローブに向けてゆっくり上昇された。培地の吸引とともに、穴の底がプローブチップをゆっくり円形に動かすことによりこすり落とされた。こすり落としは10秒間継続された。ミクロタイタープレートはハーベスタープローブチップと連携した状態で、こすり落としが継続され、「ウオッシュ」ボタンを10秒間押した。液体が穴から取り除かれ、そして上記の手順が繰り返された。プレートが取り外され、リンストレイがメタノールで充填され、トレイが洗われ、トレイが吸引されそしてトレイが下ろされた。フィルターマットが上断面に付着した状態で、ハーベスターが開放され、ＶＡＣの操作が５秒間継続された。５秒後、ＶＡＣは同時に停止され、フィルターマットはハーベスター表面から取り除かれた。フィルターマットは荒面側を上に乾燥炉で10分間放置された。フィルターマットは炉から取り除かれ、室温に冷やされた。実施例６放射能測定すべての測定作業はラジオアイソトープ室で実施された。フィルターマットは荒面を上に計測カセット内に積載された。視準器（フィルターマットを保持する薄いステンレス板）がフィルターマットのマットの上に置かれた。カセットがPa ckard Matrix 9600 Beta Particles Radioactivity Counterに掲載された。Ｑ− ガス（1.3パーセントｎ−ブタンを含むヘリウム）のMatrix 9600への流入が開始された。それぞれの穴に対して３分間の総放射能を計測する計測プロトコールを動かす「スタート」ボタンが押された。それぞれのサンプル計測数はMatrix 960 0のハードドライブに記憶された。加えて、生の放射能測定数ハードコピーが印刷された。実施例７データ変換データはMatrix 9600のハードドライブから3.5ディスクに移された。生データはMicrosoft Excelのマクロ実行により報告形式に変換された。このマクロはそれぞれのデータ点からプレートのバックグラウンドを取り去り、３つの穴の値の平均を計算し、この値をプレートのコントロールの値を100パーセントとした場合に対する数値として表す。実施例８データ分析（標準化）本発明の方法は全酸化防止剤機能を計算する。マイトジェンによって成長を刺激されたリンパ球を使用して、数種の量のＣｕＯＯＨの存在あるいは不在によるリンパ球の成長反応を測定することにより酸化防止剤機能が表現される。ＣｕＯＯＨはそれぞれの個体からのリンパ球の酸化防止剤機能を検査するときに使用される酸化ストレスであった。しかしながら、ＣｕＯＯＨそれ自身の性質は不安定なため、それは比較的安定期間が短く、その活性が時間とともに低下する。したがって、最初に作られた時の異なった効力が周期的に起こるはずである。それぞれのバッチはその有効期間の異なった時間から獲得され、それぞれの毎日作業値を元の参照値域に当てはめる必要があった。使用されたＣｕＯＯＨの量（100μ Ｍ，200μＭ，300μＭ，400μＭ）はＣｕＯＯＨのロット番号が1993/1994のもので確立された。この値の標準化はサンプルのそれぞれ毎日のバッチについて行われた。ＣｕＯＯＨに対する４点量−反応曲線がそれぞれの検査で作られ、それによりそれぞれ毎日のバッチのデータを元の参照範囲に当てはめることができ、試験の報告にその新たな値を使用することができる。標準化は毎日のそれぞれのＣｕＯＯＨ量の平均、メジアン、範囲及び分散の確認により実行される。元の参照範囲に最も近い値（コントロールの成長の50％）がｔ−検定によって統計的に比較された。そして参照範囲に最も近くに適合したＣｕＯＯＨ量が分析結果として使用された。また、ＣｕＯＯＨ量の間の中間値(200＋300/２のような)も使用される。標準化はMicrosoft Excel Spreadsheetプログラムを使用して実行された。実施例９概観患者サンプルのそれぞれ毎日のバッチに対して、標準化が行われた。統計的分析がExcelのDescriptive Statistic函数を使用してそれぞれのＣｕＯＯＨ量の平均、メジアン、範囲及び分散を決定するために行われた。参照範囲に最も近い量が選択され、そしてＣｕＯＯＨ量が参照範囲と異なっているか同じかを決定するためにExcelを使用してｔ−検定を実施した。1.0に近い（及び0.05以上）両側検定Ｐ値を持つ量が報告される値として使用された。結果は印刷され、そしてバッチごとにフォルダーに保管された。実施例10 器具、試薬及び溶液以下の器具を本発明の分析で使用した。：層流フード、遠心分離機、Beckman ＧＳ−６、細胞計測機(Coulter Model T540)、12チャンネルピペット（５−50μ ｌ）、電子ピペットポンプ（Drummond）、キャップ付無菌50ml円錐形プラスチックチューブ、12×75mmポリプロピレンチューブ、キャップ付無菌15ml円錐形プラスチックチューブピペット、ピペット（０−20，０−200，０−100μｌ範囲）、無菌ガラスディスポーザブルピペット−5.0ml，10.0ml、試験管ラック及びエアロソールバリアピペットチップ（０−50μｌ）。表ＩＩは本発明で使用された様々な試薬及びそれらのもととなるものを示している。実施例11 溶液すべての溶液は組織培養用グレード脱イオン水（tcd Ｈ₂Ｏ）で調製された。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）＋0.72パーセントグルコース（ＰＢＳ−Ｇ）溶液を調製するために、tcd Ｈ₂Ｏを使用した一連の指針にしたがって調合した。十分量の10％グルコース溶液が、最終的なグルコース濃度が0.72パーセントになるように加えられた。溶液は濾過により殺菌されて（２−８℃）の冷蔵庫中に保管された。濃縮（２Ｘ）貯蔵培地調製のため、（１）リットルの（２Ｘ）貯蔵培地には：（１）23.80ｇＨＥＰＥＳ；（２）14.02ｇ塩化ナトリウム：（３）1.05ｇリン酸二塩基カリウム；（４）0.241ｇ硫酸マグネシウム；（５）1.0mnl（10μＭ）塩酸アデニン；（６）30.0ml（1OOmM）ピルビン酸ナトリウム；（７）0.5ml 0.5 パーセントフェノールレッド；（８）5.0ml抗生物質混合物；（９）8.0ml ５Ｎ水酸化ナトリウム；（10）20.0ml Ｆｅ/ＥＤＴＡ（1.0mM ＦｅＳＯ₄/0.4・mMＮａ₂ＥＤＴＡ）を含む。すべての無機物を完全に混合した後、５Ｎ水酸化ナトリウムを使用してpHを7.60に調整した。tcdＨ₂Ｏを使用して最終的な容量を１Ｌにした。溶液は0.2μＭフィルターで濾過することにより殺菌され、そして４℃の冷蔵庫に保存されていた。これらの環境下で、安定性は約４週間であった。基礎培地は100パーセントプレートコントロール及び下記に示すように本発明の新方法に使用する。濾過後は無菌的技法を使うべきである。基礎培地は層流フードの下で調製された。すべての成分はtcdＨ₂Ｏに混合されて最終的な希望容量までにされた。溶液は無菌ボトル内で真空濾過で殺菌された。適する容量のＰＨＡ貯蔵溶液が添加された。実施例12 クメンハイドロペルオキサイド（ＣｕＯＯH)貯蔵溶液クメンハイドロペルオキサイド（シグマＣ0524）は有効期間が限られている。物質の期限満了日シグマからの領収書の日付から三（３）力月である。ボトルからＣｕＯＯＨをピペットで取る際には、ＣｕＯＯＨの粘度が増加することを承知すべきである。ピペットチップへの液体の吸引が完了したことを確実なものとしなければならない。これには正確な時間とピペットのチップが適量を確保するものであることに注意することが要求される。さらに、ピペットチップの外側にある余剰なＣｕＯＯＨを取り除くためにチップをふき取らなければならない。同様に、ＣｕＯＯＨの取り分けも完全にしなければならない。この手順に従うと、冷蔵庫の状態（２−８℃）で３カ月間好ましい安定性を保って保存できる。第一のＣｕＯＯＨ貯蔵溶液（1.0ＭＣｕＯＯＨＰＢＳ−Ｇ溶液）では、9.5 μｌのクメンハイドロペルオキサイド（ＣｕＯＯＨ）が990.5μｌＰＢＳ−Ｇと混合された。この手順に従うと、冷蔵庫の状態（２−８℃）で３カ月間好ましい安定性を保って保存できる。第二のＣｕＯＯＨ貯蔵溶液（ＰＢＳ−Ｇに100mM）細胞分離の前に毎日調製しなければならない。一晩以上蓄えておくべきではない。第二のＣｕＯＯＨ貯蔵溶液のため、200μｌの第一貯蔵溶液が1800μｌＰＢＳ−Ｇと混合された。クメンハイドロペルオキサイド作業溶液では、細胞分離の前に毎日４種の作業溶液が調製された。溶液は患者プレートの積載に対するＣｕＯＯＨ移送プレート（ミクロタイタープレートと離れる）に加えられた。溶液は一晩以上蓄えておくべきではない。４種の作業溶液は：（１）100μＭＣｕＯＯＨ：110μｌの第二貯蔵溶液を4890μｌのＰＢＳ− Ｇと混合；（２）200μＭＣｕＯＯＨ：220μｌの第二貯蔵溶液を4780μｌのＰＢＳ− Ｇと混合；（３）300μＭＣｕＯＯＨ：330μｌの第二貯蔵溶液を4670μｌのＰＢＳ− Ｇと混合；及び（４）400μＭＣｕＯＯＨ：440μｌの第二貯蔵溶液を4560μｌのＰＢＳ− Ｇと混合実施例13 チミジン（ＴｈＹ）貯蔵溶液チミジン（ＴｈＹ）貯蔵溶液（冷却）：（1.33mM ＴｈＹ，0.322ｇ/Ｌ）は以下のように調製された。：0.161ｇＴｈＹ（シグマＴ9250）は重量を測定して、tcd Ｈ₂Ｏに最終的な容量が500mlになるように溶解される。溶液は無菌的手法を使用し、無菌ボトル内で真空濾過で殺菌された。溶液は50ml遠心管に分別された。短期間の貯蔵では、冷蔵状態で（４℃）４で１カ月間安定性を保って保存できる。長期間の貯蔵では、冷凍状態で（−70℃）で６カ月間安定性を保って保存できる。チミジン作業溶液は細胞標識に使う放射性チミジン（Ｈ³ＴｄＲ）を希釈するのに使用される。チミジン作業溶液（ＴｈＹ＋³Ｈ−ＴｄＲ）調製のため、脱気tcd Ｈ₂Ｏを次のものに添加した：1.15mlの1.33mM ＴｈＹ（冷却）、1.70mlの³Ｈ−ＴｄＲ（ＩＣＮ Part No.24066）、及び300μCi/mmol特異的活性。この手順に従うと、冷蔵状態で（４℃）で１週間好ましい安定性を保って保存できる。この明細書で記述されている特許あるいは出版物は発明に関係する技術のこれらの技能の水準で示す。これらの特許及び出版物はそれぞれ個々の出版物が特異的に個別に参照により具体化されたのと同様の範囲でここにおいて具体化される。この技術の一つの技能はこの発明が目的を実行し、結果を得て利点を述べることによく適応していることを、それらがそこに本来備わっているものと同様に容易に評価するだろう。ここにおいて記載した方法、手順、処理、分子、及び特異的な化合物とともにこの実施例は選ばれた具体化例の現在の代表であり、典型例であり、さらに発明の範囲制限を意図するものではない。その中の変更及び他の使用法は請求の範囲で定義されるものとして発明の趣旨の範囲内でその技術の中のこれらの特殊技能に起こるであろう。

【手続補正書】【提出日】平成１１年４月９日（１９９９．４．９）【補正内容】特許請求の範囲 1. ヒトリンパ球における全酸化防止剤機能の生化学的分析に有用な細胞培養培地であり、前記培地は次の成分を含む緩衝化無血清溶液であり：グルコース及び細胞内でグルコースを生産する化合物が構成する群から選択された炭水化物、生物学的使用可能な形式のパントテン酸、コリンあるいは細胞内でコリンを生産する生物学的使用可能形式基質、塩化物、リン酸塩、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び鉄を含む生物学的使用可能な形式の無機イオン並びにクメンハイドロペルオキサイド、脱イオン水、及びリンパ球の生長を刺激する効果的な量のマイトジェン；前記緩衝化無血清溶液のpHはおおよそ6.8から7.6である、前記細胞培養培地は栄養学的欠乏、不十分、及び不均衡を測定し並びにリンパ球の酸化防止機能の生物学的分析に効果的であることを特徴とするものである。 2. 培地は生物学的に利用可能な形式のアミノ酸及びビタミンで構成される群から選択された栄養素補充物が補充されていて、栄養素補充においては制限あるいは阻害濃度から外れた状態にあるか、その状態であるのかを検査される請求項１の細胞培養培地。 3. ビタミンは、ビオチン、フォリニン酸、生物学的に利用可能な形式の葉酸、ニコチンアミド、ニコチン酸、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ₆、ビタミンＢ₁₂及び細胞内でそれらを作り出す化合物で構成される群から選択され；アミノ酸は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ −フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ− チロシン、Ｌ−バリン及び前記アミノ酸を生産する化合物で構成され、アミノ酸は集団として存在する請求項２の細胞培養培地。 4. クメンハイドロペルオキサイドが約50μＭから約500μＭの濃度で存在する請求項１の細胞培養培地。 5. 細胞培養培地はおおよそ最大の生長反応を引き出す濃度においてピルビン酸、アデニン、イノシトール及びそれらを細胞内で生産する化合物で構成される群から選択された１もしくはそれ以上の刺激性栄養素で補充されている請求項１の細胞培養培地。 6. 細胞の最大生長反応に効果的な最小限近くの濃度で存在するそれぞれのアミノ酸は検査されるアミノ酸は除外し、検査されるアミノ酸が除かれるか又は前記最大生長反応に効果的な最小限濃度より少ない濃度で存在する請求項３の細胞培養培地。 7. 培地にセリン及びグリシンの片方あるいは両方が無い場合、ビタミンＢ₆および利用可能な形式の葉酸の片方あるいは両方が細胞生長反応に対する有効濃度で培養培地に含まれている請求項３の細胞培養培地。 8. 培地にパントテン酸及びコリンの片方が無い場合、前記培地中の細胞培養はパントテン酸及びコリンの反応制限量補充されたときに栄養素欠乏及び異常要求量の決定に有効である請求項３の細胞培養培地。 9. 個体での特異的要求栄養素に対する異常量栄養所要量の決定の方法で次のステップを含む：請求項１の細胞培養培地への前記個体からのリンパ球の植え付け、前記培地は生長制限濃度のテストされる栄養物を持つ；植え付けられた細胞培養培地のインキュベーション；及びコントロール群の個体からのリンパ球の平均的な反応とそのリンパ球の生長反応とを比較する。 10．栄養因子あるいは栄養素の有害な効果を克服する生化学中間生成物、生化学中間生成物あるいはその生産物、及びこのような損害効果に対する個々の感受性を持つ薬剤を含む他の血液成分の以下のステップを含む識別方法。少なくとも１種以上の栄養素生化学的中間産物あるいは生産物あるいは細胞生長応答に有害な影響を与える濃度の薬剤を含む他の血液成分、を含む請求項１の細胞培養培地に前記個体からのリンパ球の植え付け；植え付けられた細胞培養培地のインキュベーション；及び栄養的、生化学的中間生産物あるいはその生産物あるいは検査する薬剤を含む他の血液成分に有害な影響を与えると推測される基質のもととなるものを与えられた同じ培地での生長反応とを比較する。 11．次のステップを含む個体における細胞酸化防止剤機能の生化学的分析の方法。前記個体のリンパ球を請求項１の細胞培養培地に植え付けるステップ、前記の植え付けられた細胞培養培地をインキュベーションするステップ；及びコントロール群の個体からのリンパ球の平均的な生長反応とそのリンパ球の生長反応とを比較するステップ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ビュッシィ，リュークアメリカ合衆国 84107 ユタ，ウエストバレーシイテイ，ピー．オー．ボックス 70505

Claims

【特許請求の範囲】 1. ヒトリンパ球における酸化防止剤機能の生化学的分析に有用な細胞培養培地であり、前記培地は次の成分を含む緩衝化無血清溶液であり：グルコース及び細胞内でグルコース生産が可能な生物学的化合物が構成する群から選択された炭水化物、生物学的使用可能な形式のパントテン酸、コリンあるいは細胞内でコリン生産可能な生物学的使用可能形式基質、塩化物、リン酸塩、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び鉄を含む生物学的使用可能な形式の無機イオン並びにクメンハイドロペルオキサイド、脱イオン水、及び分析されるリンパ球を刺激する効果的な量のマイトジエン；前記緩衝化無血清溶液のpHはおおよそ6.8から7.6である、前記細胞培養培地は栄養学的欠乏、不十分、及び不均衡を測定し並びにリンパ球の酸化防止機能の生物学的分析に効果的であることを特徴とするものである。 2. 培地は生物学的に利用可能な形式のアミノ酸及びビタミンで構成される群から選択された栄養素補充物が補充されていて、栄養素補充においては制限あるいは阻害濃度から外れた状態にあるか、その状態であるのかを検査される請求項１の細胞培養培地。３．ビタミンは、ビオチン、フォリニン酸あるいは生物学的に利用可能な形式の葉酸、ニコチンアミド又はニコチン酸、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ₆ 及びビタミンＢ₁₂及び細胞内でそれらを作り出す能力をもつ化合物で構成される群から選択され；アミノ酸あるいは生物学的にアミノ酸を細胞内で生産する能力をもつ化合物は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンで構成され、アミノ酸は集団として存在し、それぞれの総量は阻害濃度を越えることはないものである請求項１の細胞培養培地。 4. クメンハイドロペルオキサイドが約50μＭから約500μＭの濃度で存在する請求項１の細胞培養培地。 5. 細胞培養培地はおおよそ最大の反応を避ける濃度においてピルビン酸、アデニン、及びイノシトールあるいはそれらを細胞内で生産することのできる化合物で構成される群から選択された１もしくはそれ以上の刺激性栄養素で補充されている請求項１の細胞培養培地。 6. 細胞の最大反応に効果的な最小限近く濃度で存在するアミノ酸補充のそれぞれのアミノ酸は検査されるアミノ酸から除外される請求項３の細胞培養培地。 7. 培地にセリン及びグリシンの片方あるいは両方が無い場合、ビタミンＢ₆および利用可能な形式の葉酸の片方あるいは両方が細胞反応に対する有効濃度で培養培地に含まれている請求項３の細胞培養培地。 8. 培地にパントテン酸及びコリンの片方が無い場合、前記培地中の細胞培養は培地に無いパントテン酸及びコリンの反応制限量補充されたときに栄養素欠乏及び異常要求量の決定に有効である請求項３の細胞培養培地。 9. 個体での特異的要求栄養素に対する異常量栄養所要量の決定の方法で次のステップを含む：請求項１の細胞培養培地への前記個体からのリンパ球の植え付け、前記培地は制限濃度のテストされる栄養物を持つ；植え付けられた細胞培養培地のインキュベーション；及びコントロール群の個体からのリンパ球の平均的な反応とそのリンパ球の反応とを比較する。 10．栄養因子あるいは栄養素の有害な効果を克服する生化学中間生成物、生化学中間生成物あるいはその生産物、及びこのような損害効果に対する個々の感受性を持つ薬剤を含む他の血液成分の以下のステップを含む識別方法。少なくとも１種以上の栄養素生化学的中間産物あるいは生産物あるいは細胞応答に有害な影響を与える濃度の薬剤を含む他の血液成分、を含む請求項１の細胞培養培地に前記個体からのリンパ球の植え付け；植え付けられた細胞培養培地のインキュベーション；及び栄養的、生化学的中間生産物あるいはその生産物あるいは検査する薬剤を含む他の血液成分に有害な影響を与えると推測される基質のもととなるものを与えられた同じ培地での反応とを比較する。 11．次のステップを含む個体における細胞酸化防止剤機能の生化学的分析の方法。前記個体のリンパ球を請求項１の細胞培養培地に植え付けるステップ、前記の植え付けられた細胞培養培地をインキュベーションするステップ；及びコントロール群の個体からのリンパ球の平均的な反応とそのリンパ球の反応とを比較するステップ。