JP2000513923A

JP2000513923A - 変異ｓ１８２遺伝子

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Publication number: JP2000513923A
Application number: JP09506692A
Authority: JP
Inventors: ゴート，アリソン・エム; ハーディ，ジョン・エイ
Original assignee: University of South Florida; Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: University of South Florida; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1995-07-18
Filing date: 1996-06-26
Publication date: 2000-10-24
Also published as: WO1997003999A1; AU6343196A; US5973133A; EP0842188A1; EP0842188A4

Abstract

(57)【要約】本発明は新規な変異Ｓ１８２配列、これらの新規な変異Ｓ１８２遺伝子を用いるアルツハイマー病の診断法、変異Ｓ１８２遺伝子からなるアルッハイマー病についてのモデル系、およびＳ１８２遺伝子に相同的な遺伝子中の変異の同定方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】変異Ｓ１８２遺伝子発明の背景アルツハイマー病（ＡＤ）は、痴呆により臨床的に、多くの老人性プラークおよび神経繊維のもつれにより神経生理学的に特徴付けられる中枢神経系の進行性の変性病である。典型的には、ＡＤは老人性疾患であり、６５歳の人の６％まで、８０歳の人の２０％までがかかっている。これを晩発性ＡＤという。加えて、該疾患が年齢依存的浸透度をもって常染色体性優性遺伝する少数の家系が報告されている。大抵の場合、該疾患の発症年齢は、これらの家系においては６５歳未満である。これを早発性ＡＤという。遺伝的因子は早発性および晩発性ＡＤの双方に関与している。この疾患に対する罹病性を遺伝的に付与する少なくとも３つの遺伝子座が同定されている。染色体１９に位置するアポリボ蛋白Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子のε４（１１２ＣｙｓＡｒｇ）対立遺伝子は、晩発性のケースについて有意な割合でＡＤに関連している。Strittmatterら、.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:1977−1981(1993)；Sau ndersら、Neurology，43：1467−1472(1993)。また、この対立遺伝子の遺伝は、その量に依存して発症年齢を低下させることも報告されている。Corderら、Scie nce，261：921−923(1993)。対照的に、アポリポ蛋白Ｅ ε２対立遺伝子は、ＡＤ発症危険性を低下させるように思われる。Corderら、Nature Genet.，7，180 −184(1994)。これらの影響の生化学的機構はいまだ不明であるが、これらが、１種または２種のε４対立遺伝子を有する患者の脳には著しく多数のＡβ沈着物数がある。Schmechelら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：9649−9653(1993)；Hym anら、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：3586−3590(1995)。染色体２１上のβ−アミロイド前駆体蛋白（βＡＰＰ）に関する遺伝子における変異は、６５歳未満で発症する少数の家族において見いだされている。Goate ら、Nature，349：704−706(1991)；Chartier-Harlinら、Nature，353：844−84 6(1991)；Murrellら、Science，254：97−99(1991)；Karlinskyら、Neurology， 42：1445−1453(１９９２)。これらの疾患の原因となる変異はトランスフェクション細胞または初代培養細胞において実験されており、ある意味では、そのアミロイド生成的かつ潜在的に神経毒性のあるＡβフラグメントの産生に都合のよい βＡＰＰの蛋白分解的プロセッシングの変化を導くことが明らかにされた。さらに、１の変異体βＡＰＰのトランスジェニック過剰発現により最初のマウスのＡＤモデルが得られ、該マウスにおいて、年齢に関連した脳へのＡβ沈着は神経、星状細胞およびミクログリア細胞の病気を伴っている。Gamesら、Nature，373： 523−527(1995)。遺伝的連鎖祖の研究により、第３の遺伝子座（ＡＤ３）が、早発性常染色体性優性ＡＤの７０％までの原因であるかもしれない、染色体１４ｑ２４．３にマッピングされた。Schellenbergら、Science，258：668−670(1992)；St.George-Hy slopら、Nature Genet.，2：330−334(1992)；Van Broeckhovenら、Nature Gene t.，2：335−339(1992)。ＡＤ３遺伝子座はこの最も活動的な形態の疾患（３０ないし６０歳で発症）に関与しており、この遺伝子座における変異が、生物学上必須のＡＤに至るプロセスをなすと示唆されている。Sherringtonら、Nature，3 75：754−760(1995)。最近になって、早発性の常染色体性優性ＡＤをＡＤ３遺伝子座で分離している７家系にて、５つのミスセンス変異を有する新規な遺伝子がクローン化された。 Sherringtonら、Nature，375：754−760(1995)。この遺伝子はＳ１８２と呼ばれている。Ｓ１８２転写物のヌクレオチド配列分析により、６つの大きな家系の罹病構成員由来の逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応生成物においてヘテロ接合性ヌクレオチド置換が明らかとなった。ヌクレオチド置換は、各々、推定上のＳ１８２転写物の読み枠内において生じており、下記の位置においてコードされているアミノ酸が変化していると予想される(ＦＡＤ４およびＴｏｒｌ.1を番号付ける)。家系６０３におけるコドン１６３でのＨｉｓＡｒｇ；家系ＦＡＤ１におけるコドン２４６でのＡｌａＧｌｕ；家系ＦＡＤ２におけるコドン２８６でのＬｅｕＶａｌ；ならびに家系ＦＡＤ３およびＮＩＨ２におけるコドン４１０でのＣｙｓＴｙｒ。各家系において疾患と同時に分離されたすべてのヌクレオチド置換は、平均発症年齢に標準偏差の２倍以上を加齢した無兆候の家族構成員には全く見られず、対応する民族から抽出された無関係の神経学的に正常な対象由来の２８４個の染色体にも存在しなかった。Sherringtonら、Nature,375:754−760(1995)。他の変異Ｓ１８２遺伝子の数は現在同定されている。これらの変異体は早発性ＡＤの診断、ならびにこの疾患の治療に有用でありうる薬剤の評価において有用である。発明の概要本発明の一の目的は、新規変異Ｓ１８２配列を提供することである。本発明のもう一つ別の目的は、これらの新規Ｓ１８２遺伝子を用いてアルツハイマー病の診断方法を提供することである。本発明のさらにもう１つの目的は、変異Ｓ１８２遺伝子を含んでなるアルツハイマー病に関する実験系を提供することである。本発明のさらにもう一つの目的は、Ｓ１８２遺伝子に対して相同的な遺伝子における変異を同定する方法を提供することである。図面の簡単な説明図１Ａ−Ｄは、Ｓ１８２遺伝子（配列番号２４）のヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す。発明の詳細な説明遺伝的連鎖法により、染色体１４の長いアーム上のＤ１４Ｓ２８９およびＤ１４Ｓ６１の間に早発性の家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）を誘起する遺伝子が突き止められた。この領域にマッピングされるＳ１８２遺伝子中の５つの変異は、最近になって、早発性ＡＤに多重罹患したいくつかの家族において報告されている。Sheriingtonら、375：754-760(1995)。今回、ヒト・脳ライブラリー由来のＳ１８２の全長ｃＤＮＡクローンを単離した。このクローンの配列を分析することで、その予想アミノ酸配列が、位置２６ −２９にてアミノ酸ＶＲＳＱがないことを除き、Sherringtonらにより予想された配列と同一であることが明らかとなった。このクローンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図１に示す。この遺伝子は、以前同定されたマーカー、Ｄ１４Ｓ７７およびＤ１４Ｓ６６８Ｅの間の１００ｋｂの領域に位置している。この遺伝子のイントロン−エキソン構造が、Ｓ１８２遺伝子の別のスプライシングに関する証拠とともに決定された。本明細書は生物学的材料の寄託を要しない３５ＵＳＣ§１１２の規定を満たすのに対し、さらに公衆の便宜および利益のためだけに、ヒト・脳ライブラリー由来のＳ１８２の全長ｃＤＮＡクローンをブダペスト条約の定めるところによりＡＴＣＣに受託番号９７２３８（ｐｃＤＮＡ＋Ｓ１８２クローン１ｂ）として１９９５年７月２８日に寄託した。このクローンは、ＣＦＲ１．８０８（ｂ）による条件を除き、特許付与により何ら制限なく利用できるであろう。寄託先はAmeric an Type Culture Collection,Rockville,Maryland 20852,USAである。加えて、このＳ１８２遺伝子中にある新規な多数の変異が、早発性ＡＤに多重罹患している家族において同定された。Ｓ１８２転写物においてヌクレオチド置換が同定され、それは下記の位置においてコードされるアミノ酸の変化が予想される(番号付けは最初の開始コドンと推定されるものから始める)。家系Ｆ１４８およびＦ２０６におけるコドン１３５でのＭｅｔＶａｌ；および家系Ｆｉｎ１、ＮＹ５２０１およびＭＡＮ９２／２０におけるコドン１４２でのＭｅｔＶａｌ；家系Ｆ１９６におけるコドン２６３でのＰｒｏＳｅｒ；家系Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３および７７１におけるコドン２７８でのＧｌｕＡｌａ；および家系Ｆ１８３におけるコドン２７６でのＧｌｕＧｌｙ。各ケースにおいて、各家族の罹病構成員においてのみ変異が同定された。これらの変異はSherringtonら、Nature，375：754−760（1995）により記載されているものとは異なる。早発性ＡＤに多重罹患している４０の家族を変異についてスクリーニングした。これらの家族のうち、ＦＡＤ４から分岐したと考えられる１の家族のみが公表されている変異を有していた。しかしながら、これらの家族のいくつかは消化パターンの変化を示した。 Halitaら、Annals of Neurol.，36：362−367（1994）により記載された家族Ｆｉｎ１は、酵素ＲｃａＩとプライマー９１０／９１１とにより得られる制限パターンにおいて変化を示した。プライマー９１０：５’−ＴＣＡＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧＡＧＡＣＴ−３’（配列番号１）およびプライマー９１１：５’−ＣＣＣＡＡＣＣＡＴＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧ−３’（配列番号２）はSherrington ら、Nature，375：754−760（1995）において開示されている。この家族の罹病構成員試料の直接配列決定により、ＦＡＤ４の変異と同じヌクレオチドにおいて生じる変異（ＡＧ）が明らかとなったが、コドン１４２（Sherringtonらの文献ではコドン１４６となっている）においてメチオニンからバリンへの別のアミノ酸置換を生じる。この変異は疾患とともに分離する。同じ変異が他の２つの家族、すなわちＮＹ５２０１およびＭＡＮ９２／２０においても存在した。Ｆ１４８由来の試料(Mullanら、Nature Genet.,2:340−343(1992))もまた、同じ酵素およびプライマーを用いると、消化パターンにて違いを示した。直接配列決定により、コドン１３５でのＡＧに由来する変化が示され、それはメチオニンからバリンへの予想アミノ酸変化をもたらした。これと同一の変化がＦ２０６においても観察されており(Mullanら、Natur e Genet.，2：340−343(1992))、両方の家族において疾患とともに分離した。ＰＣＲ直接配列決定を用いて、５つのエキソンフラグメントにおけるさらなる変異の存在について家族をスクリーニングした。コドン２７６にて２つの異なるアミノ酸置換およびコドン２６３にて第３の置換が同定された。コドン２６３でのＰｒｏＳｅｒ置換をもたらすＣＴ変異が家系Ｆ１９６において同定された。この変異は、ＡｖａIIおよびＳａｕ９６１部位の両方の消失を引き起こす。コドン２７６でのグルタミン酸のアラニンへのアミノ酸置換をもたらすＡＣトランスバージョンも同定された。この変異は、いずれもコロンビアのAtioquia州の３つの親族ならびに第４の家族（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３および７７１）から得られる単一試料において検出された(Loperaら、Acta Neurologia Columbiaba，10：1 73−187(1994))。７７１の個体はコロンビアの同じ地域の出身であり、陽性の早発性アルツハイマー病の家族歴を有する。該家族はＣ２家族と遠い関係があると考えられる。該疾患の発症年齢は４０歳台後半である。この変異は制限酵素部位を形成または破壊しない。それゆえ、プライマーの３’末端から５塩基対、変異から６塩基対のところにてミスマッチ塩基を含有するミスマッチプライマーを設計した。ＰＣＲ生成物に取り込まれた場合、変異（Ｃ）が存在するときに、このプライマーはＢｓｍＩ切断部位を生じる。このことは、ＰＣＲ生成物のＢｓｍＩでの消化により当該２つの対立遺伝子を識別することを可能にする。ＢｓｍＩ認識配列は５’・・・・ＧＡＡＴＧＣＮ・・・・３’（配列番号３）および３’・・・・ＣＴＴＡＣＧＮ・・・・５’（配列番号４）である。この変異の同定に用いたプライマーはＥ２７６：５’−ＡＡＣＡＧＣＴＣＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＴＧ −３’（配列番号５）および９５２：５’−ＧＡＴＧＡＧＡＣＡＡＧＴＮＣＣＮＴＧＡＡ−３’（配列番号６）（Sherringtonら、Nature，375：754−760(1995)）である。２５μｌの反応系においてＤＮＡ（５０−１００ｎｇ）を鋳型として用いた。反応混合物は、最終濃度０．２ｍＭｄＮＴｐｓ、３０ｐＭ各プライマー、１ｘＴＮＫ１００バッファー、０．５ＵＴａｑボリメラーゼからなっていた。下記条件下でＰＣＲを行った:９４℃５分（９４℃３０秒、４５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒）ｘ３５サイクル、７２℃ ３分。ＢｓｍＩ酵素（５Ｕ）をＰＣＲ生成物に添加し、６５℃で３時間消化を行った。消化生成物を３％アガロースゲル上で分離した。正常対立遺伝子の１５０ｂｐのフラグメントおよび変異対立遺伝子の１２８＋２２ｂｐフラグメントが観察された。変異は疾患とともに分離する。別の家族、Ｆ１８３において同じ塩基がＧに変異しており、グルタミン酸からグリシンへの置換を引き起こす。ＴＧ多型性のごとき制限部位を形成または破壊しないさらなる変異を、同様の方法で同定することができる。プライマーの３’末端から４および５塩基対ならびに多型性から５および６塩基対のところに２つのミスマッチ塩基対を含有するミスマッチプライマーを設計した。ＰＣＲ生成物中に取り込まれた場合、このプライマーは、多型性部位にＧが存在する時にはＢａｍＨＩ部位を形成し、多型性部位にＴが存在する時には、切断部位を生じない。このことは、ＰＣＲ生成物のＢａｍＨＩでの消化により当該２つの対立遺伝子を識別することを可能にする。ＢａｍＨＩ認識配列は５’・・・・ＧＧＡＴＣＣ・・・・３’（配列番号７）および３’・・・・ＣＣＴＡＧＧ・・・・５’（配列番号８）である。この変異の同定に使用できるプライマーは、９５１：５’−ＣＡＣＣＣＡＴＴＴＡＣＡＡＧＴＴＴＡＧＣ−３’（配列番号９）（Sherringtonら、Nature，375：754-760(19 95)）およびＴ−ＧＢａｍＨＩ：５’−ＣＡＣＴＧＡＴＴＡＣＴＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣ−３’（配列番号１０）を包含する。ＰＣＲ条件は上記と同様である。０．５ＵのＢａｍＨＩ酵素を添加し、３７℃で３時間ＰＣＲ生成物を消化する。消化生成物を３％アガロースゲルで分離する。ホモ接合性正常対立遺伝子の２００ｂｐのフラグメント、ホモ接合性変異対立遺伝子の１８２ｂｐ＋１８ｂｐのフラグメント、およびヘテロ接合性対立遺伝子の２０ｂｐ＋１８２ｂｐ＋１８ｂｐのフラグメントが観察され得る。これらの変異体の同定は、Ｓ１８２遺伝子における変異が染色体１４連鎖家系の早発性アルツハイマー病の原因であるという強力な証拠を提供する。これらの変異体をＡＤの診断に用いることができ、さらにＡＤ発症モデルの開発に使用することもできる。現在のところ、種々の形態のＡＤに対する効果的な治療はわかっていない。しかし、治療が可能であり、アルツハイマー病に付随する痴呆と密接に類似する進行性の知能悪化をもたらす別の形態の痴呆がいくつかある。したがって、ＡＤの診断試験は、早発性アルツハイマー病を排除することができるため、これら他の症状の診断および治療における有用な手段を提供するであろう。ＡＤについて適当な療法が利用できるようになれば、さらに価値を有するであろう。アルツハイマー病に関連する遺伝的変異を検出し、同定するために用いることができる、組換えＤＮＡ技法を利用するいくつかの方法体系がある。これらは、直接プロービング、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法体系を包含するが、これらに限定されるものではない。直接プロービング法を用いる点突然変異の検出は、合成してまたはニック翻訳により調製したオリゴヌクレオチドプローブの使用を包含する。好ましい具体例において、該プローブは変異体Ｓ１８２遺伝子の少なくとも一部（その部分は、本明細書にて同定される、変異を有する）と相補的である。ＤＮＡプローブは、適宜、例えば、放射性標識、酵素標識、蛍光標識またはビオチン−アビジン標識を用いて標識化されていてもよく、その後で例えば、サザンブロットハイブリダイゼーション法にて可視化される。その標識化プローブを、ニトロセルロースまたはナイロン６６基質に結合した、ＡＤであると思われる患者に由来のＤＮＡのサンプルと反応させる。標識化ＤＮＡプローブに相補的なＤＮＡ配列を担持する領域は、リアニーリング反応の結果として、それ自身を標識化するようになる。かかる標識化を示すフィルターの領域を、例えば、オートラジオグラフィーにより可視化することができる。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などの別のプローブ法は、ミスマッチプローブ、すなわち、変異の点を除いて、標的と完全に相補的であるプローブの使用を包含する。ついで、その標的配列を、完全な相補性がある場合にのみハイブリダイゼーションを得ることが可能である条件下で、完全な相補性を有するオリゴヌクレオチド、すなわち、本発明のＳ１８２変異体と相補的なオリゴヌクレオチド、およびミスマッチを含有するオリゴヌクレオチドの両方とハイブリダイゼーションさせる。ミスマッチがあるならば、その場合、ハイブリダイゼーションが著しく減少する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は特異的なＤＮＡ配列を増幅させる技法である。変性、プライマーアニーリングおよび熱安定性酵素Ｔａｑボリメラーゼを用いて行う伸長のサイクルを繰返し、所望のＤＮＡ配列の濃度を指数的に増加させる。Ｓ１８２遺伝子をコードするヌクレオチド配列の知識が得られたならば、目的とするＤＮＡを側面に付加した配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを調製することが可能である。各オリゴヌクレオチドは２本の鎖の一方に対して相補的である。ついで、該ＤＮＡを高温（例、９５℃）で変性し、ついで大過剰のモルのオリゴヌクレオチドの存在下でリアニーリングに付す。相互に対向して３’末端で配向されたオリゴヌクレオチドを、標的とする配列の対向鎖とハイブリダイゼーションさせ、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩の存在下、核酸鋳型に沿って酵素的伸長をプライムする。ついで、その最終生成物を別のサイクル用に再び変性させる。この３工程のサイクルを数回繰返し、１００万倍以上のＤＮＡセグメントの増幅を達成することができる。ついで、いずれかの遺伝的改変を定位するために、その得られたＤＮＡを直接配列決定に付してもよい。別法として、本発明のＳ１８２変異体を同定することで、改変ＤＮＡに結合するだけのオリゴヌクレオチドを調製することが可能となり、その結果、ＰＣＲにより変異のあるＤＮＡの増殖だけが得られるであろう。ＰＣＲに付した後、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを用いてＡＤ点突然変異を検出することができる。また、特異的対立遺伝子のＰＣＲと称される増幅（ＰＡＳＡ）のアダプテーションを用いることができる；この方法は単一の塩基対が異なる対立遺伝子を迅速かつ正確に区別するために異なる増殖を用いるものである。Newtonら、Nucleic Acid Res.，17：2503(1989)；Nicholsら、Genomics，5：535(1989)；Okayamaら、J.Lab.Clin.Med.，1214：105(1989)；Sarkarら、Anal.Biochem.，186：64(199 0)；Sommerら、Mayo Clin.Proc.，64：1361(1989)；Wu、Proc.Nat'l.Acad.Sci.U SA，86：2757(1989)；およびDuttonら、Biotechniques,11：700(1991)。ＰＡＳＡは一が対立遺伝子特異的であるような２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することからなる。所望の対立遺伝子は効果的に増幅されるのに対して、他方の対立遺伝子はほとんど増幅されない。というのも、その対立遺伝子はその対立遺伝子特異的プライマーの３’末端にあるまたはその付近にある塩基とミスマッチだからである。かくして、ＰＡＳＡまたはその関連する方法のＰＡＭＳＡを用いて１またはそれ以上の変異Ｓ１８２対立遺伝子を特異的に増幅させることができる。かかる増幅を患者より得られた遺伝的材料において行う場合、患者にて１またはそれ以上の変異Ｓ１８２対立遺伝子の存在を検出するための方法としてその方法を供することができる。ＰＣＲ誘発性変異制限分析（しばしば、ＩＭＲＡと称される）を変異体の検出に用いることもできる。アルツハイマー病の実験モデルの開発もまた重要である。かかるモデルを用いてＡＤの変性経路を変える薬剤についてスクリーンすることもできる。Ｓ１８２遺伝子中の特定の遺伝子を早発性家族性アルツハイマー病の原因として同定すると、遺伝的操作を用いてトランスジェニックモデル系および／または変異Ｓ１８２遺伝子またはその一部を含有する全細胞系を開発することが可能である。そのモデル系を薬剤をスクリーニングし、アルツハイマー病を治療する薬剤の効能を評価するのに用いることができる。加えて、これらのモデル系はＳ１８２の基礎となる生化学およびそのＡＤとの関係を定めるための手段を提供し、それにより合理的な薬剤設計の基本が得られる。本発明において用いることのできるある型の細胞系は自然に誘導させることができる。この場合、罹患した個体由来の血液試料を得、例えば、エプスタイン− バールウイルスを用いてリンパ芽球（lymphoblastoid）細胞系に不変的に形質転換させる。一旦確立されると、かかる細胞系は懸濁培養液にて連続的に増殖し、Ｓ１８２発現およびプロセッシングを研究するために種々のインビトロ実験にて用いることができる。これらの実験に用いられる別の細胞系は患者から由来の皮膚繊維芽細胞からなる。ＦＡＤ変異は優性であるため、細胞系を構築する別法は、本明細書に記載されているように、選択した確立された細胞系に、Ｓ１８２変異遺伝子またはその部分を遺伝的に操作することである。かかる方法は、Sisodia、Science，248：492 （1990）およびOltersdorkら、J.Biol.Chem.，265：4492（1990）で例示されているように、すなわち、アミロイド先駆体ペプチド遺伝子が哺乳動物細胞にトランスフェクションされるように、当該分野においてよく知られている。バキュロウイルス発現系もまた、真核細胞中の異種遺伝子を高レベルで発現させるのに有用であることが判明した。変異遺伝子はまた、該変異遺伝子を含有するトランスジェニック動物を創造するのに用いるために取り出すこともできる。例えば、本発明の変異Ｓ１８２遺伝子をクローンし、クローニングベクターに入れることができる。用いることのできるクローニングベクターとして、例えば、Pcharon３５、コスミドまたは酵母人工染色体が挙げられるが、これに限定されない。ついで、変異Ｓ１８２遺伝子をマウスなどのヒト以外の宿主動物に転移させる。その転移の結果として、得られたヒト以外のトランスジェニック動物は、好ましくは、一またはそれ以上の変異Ｓ１２８ポリペプチドを発現するであろう。別法として、変異Ｓ１８２ポリペプチドをコードするミニ遺伝子を設計することもできる。かかるミニ遺伝子は、好ましくは完全長の変異Ｓ１８２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列、Ｓ１８２エキソンの組み合わせ、またはポリアデニル化シグナル配列の下流およびプロモーター（好ましくは、エンハンサー）の上流に連結したその組み合わせを含有していてもよい。そのようなミニ遺伝子構築物は、マウスまたはラットなどの適当なトランスジェニック宿主に導入されると、変異Ｓ１８２ポリペプチドを発現するであろう。トランスジェニック動物を創造する一の方法は、異種組換え操作により、変異をインビトロにおける胚幹（ＥＳ）細胞にて所望の遺伝子において生じさせ、つづいて修飾ＥＳ細胞系を宿主胚盤胞に微量注射し、その後育成器中でインキュベーションすることである。FrohmanおよびMartin、Cell，56：145(1989)。また、変異遺伝子またはその部分を一細胞の胚に微量注射し、つづいて育成器中でインキュベーションする技法を用いることができる。トランスジェニック動物を生成するためのさらなる方法は当該分野にて周知である。トランスジェニック動物は新規な治療組成物の評価および米国特許第５２２３６１０号で示されるように発癌性試験にて用いられる。これらの動物はまた、米国特許第５２２１７７８号に示されるように、ヒト病態用の推定動物モデルを開発するのに用いられる。トランスジェニック動物は、今回、アルツハイマー病( 米国特許第７７６９６２６号)、抗癌剤に対するマルチ薬剤耐性（米国特許第７２６０８２７号）および発癌性物質（米国特許第４７３６８６６号）を評価するために開発された。したがって、染色体１４−関連の家系にて早発性アルツハイマー病の誘起すると考えられる本発明の変異遺伝子は、トランスジェニック動物を開発し、この疾患を評価するための手段を提供する。また、部位関連の突然変異誘発法および／または遺伝子変換法を用い、変異遺伝子が本発明において記載されているように、改変されたアミノ酸を有するＳ１８２ポリペプチドをコードするように、内因的にまたはトランスフェクションを介してヒト以外の動物のＳ１８２対立遺伝子を変異させることができる。さらには、今回、Ｓ１８２遺伝子との相同性を示す遺伝子を同定するための方法が開発された。例えば、Ｓ１８２遺伝子に相同的な遺伝子が染色体１で同定された。このＳ１８２様遺伝子はある家系におけるＡＤの原因であると考えられる。図１（配列番号２４）に示すポリヌクレオチド配列より製造したポリヌクレオチドプローブを用いるか、または本明細書（配列番号１−２３）に記載のプライマーを用い、このＳ１８２様遺伝子および他の遺伝子を同定することができる。以下の限定するものではない実施例を挙げて本発明をさらに説明する。実施例実施例１：ｃＤＮＡ単離完全なＳ１８２タンパク質をコードするｃＤＮＡを、製造者の指示に従って、 Gene Trapperキット（Gibco BRL、Gaithersburg、ＭＤ）を用いて単離した。ｐＣＭＶ.ＳＰＯＲＴのヒトSuperscript脳ライブラリー（Gibco BRL)を、９１７オリゴヌクレオチド（Sherringtonら、Nature、375：754−760(1995)）でプローブし、それをｃＤＮＡの５’−ＵＴＲとハイブリダイズさせる。実施例２：ＰＡＣ単離インター−Alu ＰＣＲをＹＡＣｓ９０５Ｃ２および７６３Ｂ１１について行った。アガロースに固定した非精製ＹＡＣＤＮＡを変性プライマーAlu ５’（５’ＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧ(Ｃ/Ｔ)(Ｇ/Ａ)ＴＧＡＧＣＣＡＣ３’（配列番号１１）およびAlu３’（５’ＧＡＴ(Ｃ/Ｔ)(Ａ/Ｇ)(Ｃ/Ｔ)(Ｇ/Ａ)ＣＣＡ(Ｃ/ Ｔ)ＴＧＣＡＣＴＣＣ３’（配列番号１２）で増幅させた。反応系（１００μｌ）を９４℃に５分加熱し、ついで９４℃で１分、５５℃で１分および７２℃で２分を３０サイクル処理し、最終の拡張工程を７２℃で１０分行った。増幅生成物のアリコートをアガロースゲル（１％）でチェックし、残りをWizard ＰＣＲミニカラム（Promega Corp.、Madison、ＷＩ）上で精製した。インター−Aluプローブ（１００ｎｇ）をα−³²ＰｄＣＴＰおよびReady−to−Goオリゴヌクレオチドキット（Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，ＮＪ）を用いて高特異的活性に標識化した。取込まれなかったヌクレオチドをNickカラム（Pharmacia Biotec h Inc.）を用いて除去した。各プローブをヒト胎盤ゲノムＤＮＡ（２μｇ／ｍｌの最終濃度）で４時間予め遮断し、ついで高密度ＰＡＣフィルター（Genome Sys tems，Inc.）と６５℃で２４時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは５ｘＳＳＣ、１ｘDenhardt's溶液、０.５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの音波処理したサケ精子ＤＮＡにて行った。フィルターを６５℃で０．１ｘＳＳＣ／０.１％ＳＤＳにまで洗浄し、ついで１ないし３日間フィルムに暴露した。そのフィルターを最初９０５Ｃ２インター−Alu ＰＣＲプローブでプローブし、ストリッピングし、７６３Ｂ１１プローブで再びハイブリダイゼーションに付した。染色体１４位置を示唆する、両方のプローブとハイブリッド形成したＰＡＣを選択し、さらに分析に付した。実施例３：ＰＡＣ末端インサート配列およびエキソン／イントロン境界の同定各ＰＡＣのヒトインサートの末端配列およびエキソン／イントロン境界配列をライゲーション−介在のＰＣＲ法を用いて得た。標準的なプラスミドアルカリ性溶菌プロトコルにより精製したＰＡＣＤＮＡ(Genome Systems ,Inc.)を種々の平滑末端切断制限酵素で消化し、ついでMuelleら、Science、246 ：780−786（1989）に記載の特異的に設計されたリンカーにライゲーションした。ついで、末端インサート配列をリンカー誘導プライマーとＰＡＣ末端のシーケンシング用ＳＰ6配列決定プライマー（５’−ＧＧＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣ(配列番号１３)）またはエキソン／イントロン境界シーケンシング用Ｓ１８２エキソン誘導プライマーのいずれかを用いてＰＣＲにより特異的に増殖させた。生成物の配列決定を、³²Ｐ末端標識化プライマーを用いる修飾ジデオキシヌクレオチド配列法およびSrivastavaら、ＰＣＲ Methods Appl.１：２５５：２５６（１９９２）に記載されているＴａｑＤＮＡポリメラーゼ温度サイクル化反応を用いることにより低融点アガロース中にて直接行った。実施例４：パルス化フィールドゲル電気泳動によるＹＡＣｓおよびＰＡＣｓのサイジングＣＥＰＨ'Ｂ'メガＹＡＣｓの大きさをＣＥＰＨ／Genethonデータベースから入手した。Cohenら、Nature，３６６：６９６−７０１(１９９３)。St.LouisおよびＣＥＰＨ'Ａ'ＹＡＣｓについては、高分子量酵母ゲノム／ＹＡＣＤＮＡをアガロースゲルに固定した酵母細胞より調製した。PAC ＤＮＡを標準的プラスミドアルカリ性溶菌法（Genome Systems，Inc.）により調製した。パルス化フィールドゲル電気泳動を、Bio-Rad ＣＨＥＦ装置を用い、２００Ｖおよび１４℃で、０ .５ｘＴＢＥ緩衝液（１ｘＴＢＥ＝９０ｍＭトリスボレート、ｐＨ８.３／２ｍＭＥＤＴＡ）中１％アガロースを介して行った。分子量標体としてファージλコンカテマーを用いた。そのゲルをナイロン膜(Hybond−Ｎ、Amersham Corp.、Arl ington Hts.、ＩＬ）上、０.２５ＭＨＣｌで３０分間処理し、つづいて０.５ＭＮａＯＨおよび１.５ＭＮａＣｌで中和し、０.２５ＭＮａＯＨおよび１.５ＭＮａＣｌのアルカリ性に移すことにより、サイズ分画を脱プリン化（depurinate）した。６ｘＳＳＣ／０.５％ＳＤＳ／０.１％Ficoll／０.１％ウシ血清アルブミン／０.１％ポリビニルピロリドン／標識プローブである１００ μｇ／ｍｌ音波処理サケ精子ＤＮＡ中、６５℃で一夜ハイブリダイゼーションを行った。洗浄をストリンジェントに６５℃で０.５ｘＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳまで行った。実施例５：ＳＴＳマッピングジヌクレオチドマーカーＤ１４Ｓ７７およびＤ１４Ｓ２６８用のオリゴヌクレオチドプライマーをGenethon１９９２および１９９４マップ(Weissenbachら、Na ture,３５９：７９４−８０１(１９９２);Gynapayら、Nature，７：２４６−３３９(１９９４)）より取得し、ＥＳＴｓＤ１４Ｓ６６８／Ｄ１４Ｓ６７７Ｅ用のオリゴヌクレオチドプライマーを、Auffrayら、C.R.Acad.des Science III，３１８：２６３−２７２（１９９５）により寄託されているＧＤＢより取得した。オリゴヌクレオチドプライマーを、ＳＴＳをプログラムOligo４を用いてＹＡＣ／ＰＡＣ末端、Ｓ１６４（Sherringtonら、Nature，３７５：７５４−７６０( １９９５)）およびＳ１８２の５’および３’ＵＴＲｓに結合させるように設計した。Ｓ１６４ＳＴＳを増幅するための、ＰＣＲ条件は、９４℃で３０分、４８ ℃で３０分、および７２℃で３０分（３５サイクル）であった。Ｓ１８２５’ＵＴＲＳＴＳ（プライマー：５’−ＡＡＡＣＧＡＴＴＴＧＣＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣ（配列番号１４）および５’−ＴＴＴＧＣＧＡＴＴＴＴＡＡＣＡＧＣＡＴＴＣ( 配列番号１５)）および３’ＵＴＲＳＴＳ（プライマー：５’−ＣＡＴＡＣＴＴＧＴＡＣＧＣＣＴＣＡＣＴＴＧＣ（配列番号１６）および５’−ＡＣＡＧＣＣＡＴＴＴＴＡＣＴＣＴＴＣＴＴＴ(配列番号１７)）を、９４℃で３０分間、５５℃ で３０分間および７２℃で３０分間（３５サイクル）で増幅させた。ＳＲＳｓ５４−１２Ｄ−Ｒ（プライマー：５’−ＴＡＡＴＡＴＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧ（配列番号１９）および１３４−８Ｃ−Ｒ（５’−ＧＡＴＣＴＧＡＣＴＡＡＣＣＡＡＧＴＣＴＴＡ（配列番号２０）および５’−ＡＧＡＡＣＴＧＴＡＡＴＡＧＴＡＣＴＣＧＡＡＧ(配列番号２１)）を９４℃で３０分、５０℃で３０分および７２℃で３０分（３５サイクル）で増幅させた。実施例６：ＲＴ−ＰＣＲ脳、肝臓、肺、心臓、胎盤および骨格筋からのポリＡ⁺ＲＮＡ（３μｇ）(Clon tech Laboratories Inc.,Palo Alto,ＣＡ)を、製造業者の指示に従って、ランダムヘキサマープライマー（１００ｎｇ）およびSupercript II酵素（６００単位、Gibco BRL）を含む６ｘ２０μｌ反応体にて逆転写した。ＲＮＡ鋳型を、つづいてＲＮＡａｓｅＨ（２単位）で５５℃で１０分間処理することにより減成させた。ＰＣＲを、プライマーＧＰ２６Ｆ（５’−ＴＧＣＡＣＡＧＡＴＧＴＣＴＧＡＧＧＡ−３’(配列番号２２)）およびGP29R（５’−ＴＣＣＡＴＴＡＧＡＴＡＡＴＧＧＣＴＣＡ−３’(配列番号２３)）を用い、非精製のｃＤＮＡ反応物（１ μｌ）に対して行った。増幅反応物（２５μｌ）は０.８μＭの各プライマー、１ｍＭｄＤＴＰｓ、１ｘＰＣＲ緩衝液（Promega Corp.）および１単位のTaqポリメラーゼ（Promega，Corp.）を含有した。反応物を氷上に設置し、ついで９４ ℃で５分間で加熱し、９４℃で３０秒、４６℃で３０秒および７２℃で１分を３５サイクル行い、最終の伸長工程を７２℃で１０分間行った。増幅産物（１０８ｂｐおよび１２０ｂｐ）を４％Metaphor(ＦＭＣ Corp.、Pine Brook、ＮＪ）１％アガロース（Promega Corp.）ゲル上で分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。実施例７：ＰＡＣランダムゲノムライブラリー構築、スクリーニングおよびシーケンシングランダムなショットカンライブラリーを約１０μｇの精製した組換えＰ１誘導人工染色体ＤＮＡ（ＰＡＣ５４−１２Ｄ）より調製した。ＰＡＣＤＮＡを、アルカリ性溶菌操作、つづいてカルボキシル被覆磁性粒子を用いる固相固定法を用いて、一夜培養物（２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補足した５００ｍｌのLuria ブロス）よりロケーションした。回収したＤＮＡを、ＰＡＣＤＮＡ１μｇ当たり１０単位の濃度でプラスミド−Safe ＡＴＰ−依存性Ｄ Nase（Epicentre Technologies，Madison，ＷＩ）を用い３７℃で３０分間処理し、残りのいずれの細菌性染色体ＤＮＡ夾雑物も除去した。ランダムＤＮＡフラグメントを音波処理により得、マングビーンヌクレアーゼで、つづいてＴ４ポリメラーゼおよびクレノーで末端を修復して突出部を除去し、凹部を充填した。修復したフラグメントをアガロースゲル電気泳動（１−３ｋｂ）によりサイズ選択し、平滑末端を回収し、ＳｍａＩ切断した、ホスファターゼ処理のｐＵＣ１８ベクターにライゲートさせた。ライゲートしたフラグメントのアリコートをEpicurean coli SURE２細胞(Stratagene,LaJolla,ＣＡ）に形質転換させ、ＳＯＢ／アンピシリン平板上に直接平板培養した。プラスミド鋳型を９６−ウェルのプラスミド調製系（Advanced Genetic Technology Co rp.，Gaithersberg，ＭＤ）のランダムに選択したコロニーより調製した。精製したプラスミドをグリッドし、放射性標識したＳ１８２ｃＤＮＡを用いるハイブリダイゼーションによりスクリーンに付した。配列決定反応をＭ１３前方およびＭ１３後方プライマー用のApplied Biosystems PRISM Ready Reaction Dye Pr imer Cycle Sequencing Kitと共にApplied Biosystems（ＡＢ）Catalyst Lab St ationを用いて陽性組換えプラスミド鋳型で実施した。反応生成物をＡＢ３７３ＤＮＡシーケンサーに付した。実施例８：変異検出すべてのファミリーを、ＰＣＲ、つづいてSherringtonら、Nature，３７５：７５４−７６０（１９９５）に記載されているプライマーを用いる制限消化法により変異についてスクリーニングした。制限消化物をアガロースゲル上の電気泳動に付し、臭化エチジウムにより可視化した。制限消化物のパターンを改変する変異の正確な特性を決定し、制限部位を変えなかった変異についてスクリーンするために、プライマーの一方がビオチニル化されているが、同じＰＣＲを行った。一本鎖ＤＮＡ鋳型をストレプタビジン被覆の磁性ビーズを用いて誘導し、配列決定反応（Sequenase２.０キット，ＵＳ Biochemical Corp.，Cleveland，ＯＨ）をビーズに付着したままのＤＮＡを用いて行った。ビオチン化ＰＣＲ産物の自動化配列決定を、AutoRead and AutoloadＴ７配列決定キット（Pharmacia Biotech Inc. ）を用いるＡＬＦシーケンサー（Pharmacia Biotech Inc.）にて実施した。ＡＬＦマネージャーソフトウェアーパッケージを用いてヘテロ接合体を同定した。実施例９：Ｅ２８０Ａ変異の検出Ｓ１８２遺伝子のコドンにあるＡ−Ｃ変異によって、いずれの制限酵素部位も形成されなければ破壊もされない。プライマーの３’末端から５塩基に誤対号塩基およびその変異から６塩基離れて誤対号塩基を含有するプライマーを設計した。ＰＣＲ産物に組み込まれると、このプライマーは、変異（Ｃ）のある場合のBs mＩ切断部位を生成する。これにより、ＰＣＲ産物をBsmＩで消化することで２つの対立遺伝子を区別することができる。ＤＮＡ５０−１００ｎｇを２５μＰＣＲ反応における鋳型として用いた。反応混合物は以下の最終濃度で構される：０. ２ｍＭｄＮＴＰ'ｓ、３０ｐＭの各プライマー（順方向プライマーＥ２７６Ａ５ ’ＡＡＣＡＧＣＴＣＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡＴＧ−３’（配列番号５）および逆方向プライマー９５２５’−ＧＡＴＧＡＧＡＣＡＡＡＧＴＮＣＣＮＴＧＡＡ-３ ’(配列番号６))、１ｘＴＮＫ緩衝液、０.５ＵＴａｑＤＮＡポリメラーゼ。ＰＣＲを次の条件下で実施した。９４℃で５分(９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で３０秒)ｘ３５サイクル、７２℃で３分。ＰＣＲ後にＢｓｍＩ酵素（５Ｕ）を加え、６５℃で３時間消化を行った。消化された産物を３％アガロースゲル上の電気泳動に付した。正常な対立遺伝子で１５０ｂｐの産物が得られ、それに対して変異対立遺伝子では１２８ｂｐと２２ｂｐの２つの産物が得られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハーディ，ジョン・エイアメリカ合衆国32084フロリダ州セント・オーガスティン、ウォーター・ストリート 48番

Claims

【特許請求の範囲】１．コドン１３５、コドン１４２、コドン２６３、コドン２７６およびコドン２８０からなる群より選択されるコドンにて変異を有するＳ１８２蛋白をコードする単離ポリヌクレオチド。２．請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチド。３．個人より身体的試料を得、コドン１３５、コドン１４２、コドン２６３、コドン２７６およびコドン２８０、からなる群より選択されるコドンにてＳ１８２蛋白をコードするポリヌクレオチド中の変異を検出することからなる、患者におけるアルツハイマー病の診断方法。４．個人より身体的試料を得、コドン１３５、コドン１４２、コドン２６３およびコドン２７６からなる群より選択されるコドンにて変異を有するポリヌクレオチドでコードされるＳ１８２蛋白中の変異を検出することからなる、患者におけるアルツハイマー病の診断方法。５．検出工程にてポリヌクレオチドを含む請求項３記載の方法。６．検出工程がＰＣＲからなる請求項３記載の方法。７．検出工程にてポリヌクレオチドを含む請求項４記載の方法。８．検出工程がＰＣＲからなる請求項４記載の方法。９．アルツハイマー病となる素質があると思われる個人より身体的試料を得、コドン１３５、コドン１４２、コドン２６３、コドン２７６およびコドン２８０からなる群より選択されるコドンにてＳ１８２蛋白をコードするポリヌクレオチド中の変異を検出することからなる、Ｓ１８２ポリヌクレオチド配列中の変異の検出方法。１０．アルツハイマー病となる素質があると思われる個人より身体的試料を得、コドン１３５、コドン１４２、コドン２６３およびコドン２７６からなる群より選択されるコドンにて変異を有するポリヌクレオチドによりコードされるＳ１８２蛋白中の変異を検出することからなる、Ｓ１８２ポリヌクレオチド配列中の変異の検出方法。１１．検出工程にてポリヌクレオチドを含む請求項９記載の方法。１２．検出工程がＰＣＲからなる請求項９記載の方法。１３．検出工程にてポリヌクレオチドを含む請求項１０記載の方法。１４．検出工程がＰＣＲからなる請求項１０記載の方法。１５．請求項１に記載のポリヌクレオチドからなるトランスジェニック動物。１６．請求項２に記載のポリペプチドからなるトランスジェニック動物。