JP2000513586A

JP2000513586A - 酵母におけるリン脂質代謝物の製造方法

Info

Publication number: JP2000513586A
Application number: JP10548438A
Authority: JP
Inventors: ヘンリー，スーザン，エイ．; パットン，ジャナ，エル．; グリアク，ピーター; コールウェイン，ゼップ，ディ．
Original assignee: Carnegie Mellon University
Current assignee: Carnegie Mellon University
Priority date: 1997-05-07
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2000-10-17
Anticipated expiration: 2018-05-06
Also published as: JP3483578B2; EP0980423A4; CA2288313A1; WO1998050523A1; EP0980423A1; US5908752A

Abstract

(57)【要約】本発明は酵母において、コリンおよびイノシトール、コリンおよびイノシトール代謝物、ならびにコリンおよびイノシトール含有リン脂質の増加し、制御された製造法を提供するものであって、酵母においてホスファチジルコリン（PC）の代謝回転を増加させたステップを含む。本発明は、また、酵母においてin vivoでホスファアチジルコリンのホスホリパーゼD仲介代謝回転を検出する方法を提供するものであって、コリン排出の測定方法を含むものである。

Description

【発明の詳細な説明】酵母におけるリン脂質代謝物の製造方法謝辞本発明は、部分的に、国立衛生研究所（NIH）から授与された助成金番号GM-16 29による政府支援により開発された。政府は本発明に幾分かの権利を有している。発明の分野本発明は、一般的に、酵母細胞におけるリン脂質およびリン脂質代謝物のレベルを調節する方法に関する。本発明は、また、一般的に、in vivoでホスファチジルコリンの代謝回転を検出する方法に関する。本発明の方法は、ヒトまたは動物が消費するためのイノシトールおよびコリンの経済的な製造を可能にする。背景 In vitroで膜二重層間のリン脂質を交換することができるリン脂質転移タンパク質は、広範に特徴づけられているが、しかしながらこれらタンパク質のin viv oでの役割を確立するのは困難であった。例えば、Cleves，A.，et al.，Cell 64 :789(1991)、本開示は参照することにより本発明にとりいれられている（以下、全ての引用文献は、著者および年号のみをあげる）、を参照のこと。 Bankaitis，V．et al.，Nature 347:561(1990)、本開示は参照することによりここに取り入れられている、により報告されたように、Saccharomyces cerevisiae のSEC14遺伝子は、分泌経路および生存に必須であるホスファチジルイノシトール（PI）／ホスファチジルコリン（PC）輸送体／転移タンパク質をコードしているという発見により飛躍的な進歩が生じた。他の野生型細胞における酵母SEC14 遺伝子の欠失は致死的であり、温度感受性（sec14^ts）変異株におけるSEC14遺伝子産物の不活化は、Novic，P.，et al.，Cell 21:205(1980)、本開示は参照することによりここに取り入れられている、により報告されたように、後期ゴルジ期での分泌経路の停止を導く。限られた温度でsec14^ts変異体を増殖することを許容するサプレッサーの解析により、ホスファチジルコリン（PC）生合成のシチジンニリン酸コリン（CDPコリン）経路において（図１を参照）、変異が、Cleves，A.，et al．（1991）により報告されたように、SEC14遺伝子の全欠失した株においてさえも野生型の増殖を許容するsec14変異表現型を抑制するという発見が導かれた。 Kennedy，E.P．et al.，J ．Biol．Chem．222:193(1956)、本開示は参照することによりここに取り入れられている、により初めて記載されたCDPコリン経路、およびケネディー経路としても知られている経路は、酵母を含む真核細胞におけるPC合成の２経路の１つである。Bremer，J.，et al.，Biochim ．Biophys．Acta ，37:173(1960)、本開示は参照することによりここに取り入れられている、により最初に報告された、PC合成の第２の経路はホスファチジルエタノールアミン（ PE）のメチル化に関与している。酵母の細胞は、Griac，P.，et al.，J ．Biol． Chem. 271:25692(1996)、本開示は参照することによりここに取り入れられている、により報告されたように、正味PC合成のために、CDPコリンまたはPEメチル化経路のいずれか、あるいは２つの組み合わせを利用することができる。（図１を参照）。Griac，P.，et al.，J ．Biol．Chem. 269:14776(1994)、本開示は参照することによりここに取り入れられている、に報告されているように、CDPコリン経路は酵母に致死的ではなく、増殖に僅かに影響を及ぼしているだけである。酵母においてCDPコリン経路は外因性コリンの利用に大きく機能していることが広く推定されていた。しかしながら、最近の研究によると、CDPコリン経路は、外因性コリンが欠けていてもPC生合成に実質的に寄与していることが示唆されている。McMaster，C.R．et al.，J.Biol ．Chem. 269:14776(1994)；McDonough ，V.M.，et al.，J ．Biol．Chem. 270(32):18774(1995);およびMcGee，T.P.，et al.，J ．Cell．Biol. 124:273(1994)、本開示は参照することによりここに取り入れられている、を参照。外因性コリンが欠けていると、酵母細胞はPEのメチル化を経て主にPCを合成する。逆に、酵母細胞は、Summers，E.F.，et al.Genetic s 120:909(1988)、本開示は参照することによりここに取り入れられている、により報告されているように、酵母細胞は、PEからPCへの３段階の変換を行う２つのリン脂質メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の完全かつ同時欠失にも拘わらず、生存することができる、ということはコリンが培地中に供給されていることを示している。しかしながら、これら２つの経路のいずれかにおいて酵素をコードする遺伝子の欠失は、微妙に異なった表現型をもたらす。例えば、Cleves，A．et al.，Cel l 64:789(1998a)およびCreves，A．et al.，Trends Cell ．Biol．1:30(1991b)、本開示は参照することによりここに取り入れられている、により報告されているように、リン脂質メチルトランスフェラーゼのいずれかの欠失は、sec14増殖表現型を抑制しない。しかしながら、そのような突然変異は、PC生合成がCDPコリン経路を経て再貯蔵されない限り、外因性イノシトールに関連したイノシトール −１−リン酸シンセターゼ（図１を参照）をコードするINO1遺伝子を抑制することはできない。Summers，E.F.，et al．(1988)，and McGraw，P.，et al.，Gene tics 122:317(1989)、本開示は参照することによりここに取り入れられている、を参照。CDPコリン経路の酵素をコードする遺伝子の欠失はイノシトールに反応するINO1制御に影響しないが（Griac,P.,et al.(1996)参照）、そのような変異株はsec14表現型を抑制する（Cleves，A．et al.,(l991a)および(1991b)参照）。 INO1遺伝子は、複雑な協調制御にかかるリン脂質生合成の酵素をコードするもっとも高度に制御されている一組の遺伝子である。全てのこれらの遺伝子は、Pa ltauf，F．ら、酵母Saccharomycessの分子および細胞生物学（The Molecular an d Cellular Biology of Yeast Saccharomyces ）(Broach，J．et al．eds.）Vol ．II ，pp．415‐500，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY(1 992)，and Bachhawat，N.，et al.，J ．Biol．Chem. 270:25087(1995)、本開示は参照することによりここに取り入れられている、により報告されているように、基本的なヘリックス−ループ−ヘリックスクラスの転写因子の標準的な結合部位、CANNTG、内に含まれる、保存プロモーター要素、UAS_INO、を含んでいる。しかし、イノシトールおよびコリン、ならびにその他のイノシトールおよびコリン含有代謝物、同じくホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルコリンを製造するために、酵母においてin vivoでPC代謝回転およびINO1制御を行う方法が更に求められている。また、酵母培養中および種々の細胞培養中におけるホスホリパーゼD活性および得られたコリンを検出するための改善された試験方法が求められている。本発明によれば、PC生合成を遮断する突然変異を含み、PI／PC転移タンパク質に突然変異がある酵母株の使用と組み合せて、リン脂質生合成を制御するための代謝シグナル（ホスファチジン酸（PA））の同定により、酵母株において、イノシトールおよびコリンならびにその他のリン脂質代謝物を経済的に製造することができるようになる。本発明は、また、コリン排出のための平板測定によるin v ivoにおけるホスホリパーゼD仲介または他のPCの代謝回転を検出する手段を提供する。発明の概要本発明の第１の目的は、リン脂質生合成の抑制シグナルを測定し、それによってリン脂質およびリン脂質代謝物の製造を抑制するにある。本発明の別の目的は、増加したコリン排出に伴う、およびそれにより検出することができる酵母においてホスファチジルコリン（PC）代謝回転の増加による、コリンおよびイノシトール、コリンおよびイノシトール代謝物、コリンおよびイノシトール含有リン脂質を増加させる製造方法を提供するにある。本発明の別の目的は、酵母においてホスファチジン酸（PA）および遊離コリンの同時製造をもたらすin vivoでのホスファチジルコリン（PC）の代謝回転を検出する方法を提供するにある。本発明のまた別の目的は、酵母におけるコリン排出を検出する平板測定法を提供するにある。本発明の更にまた別の目的は、イノシトールおよびコリン、イノシトールおよびコリン代謝物、ならびにイノシトールおよびコリン含有リン脂質の前以て定められた濃度を有する酵母株を製造するにある。本発明の別の目的は、イノシトールおよびコリン、イノシトールおよびコリン代謝物、ならびにイノシトールおよびコリン含有リン脂質の製造を随意に、制御することができる、あるいは「切り替える」ことができる、酵母株を製造するにある。本発明の更に別の目的は、イノシトールおよびコリンの実質的に増加した製造法を提供するにある。本発明の別の目的は、イノシトールおよびコリンの経済的な製造法を提供するにある。本発明のこれらの、および他の目的は、以下の実施の形態の１ないしそれ以上により達成される。一観点において、本発明は、酵母における、コリンおよびイノシトール、コリンおよびイノシトール代謝物、およびコリンおよびイノシトール含有リン脂質の増加した製造方法に特徴を有し、酵母において、ホスファチジルコリン（PC）代謝回転が増加するステップを含む。好ましい実施態様において、増加するステップは、酵母のSEC14遺伝子における突然変異、および酵母のケネディー経路の少なくとも１つの遺伝子における突然変異を有する酵母株を培養することを含む。別の観点において、本発明は、平板上で増殖する酵母におけるホスファチジルコリン（PC）代謝回転からコリン排出を検出するための平板測定法に特徴を有し、酵母と共に平板上においたコリン栄養要求株の増殖を可視化することにより酵母株のコリン排出を検出することを含む。本発明の別の特徴および進歩性は、好適な実施態様の以下の記載、および請求の範囲から明らかになるであろう。図面の説明図１はS．Cerevisiaeにおける³²P-H₃PO₄および¹⁴Cコリン標識経路の図解である。標識リン（³²P）は^*Pおよび標識コリン（¹⁴C）は†Cで表わされる。培地から取上げられ得る水溶性分子は丸で囲ってある（I、イノシトール;Gro^*PIns、グリセロホスホイノシトール）。細胞内水溶性代謝物は楕円形で示す（I-1-^*P、イノシトール−１−リン酸；Glu-6-^*P、グルコース−６−リン酸；†C-^*P、コリンリン酸；CD^*P-†C、シチジン二リン酸コリン）。脂質は長方形で示す（DAG、ジアシルグリセロール；^*PA、ホスファチジン酸；CD^*P-DG、シチジン二リン酸ジアシルグリセロール；^*PG^*P、ホスファチジルグリセロールリン酸；^*PG、ホスファチジルグリセロール；^*PS、ホスファチジルセリン；^*PE、ホスファチジルエタノールアミン；^*P†C、ホスファチジルコリン；^*PI、ホスファチジルイノシトール；^*PI^*P、ホスファチジルイノシトールリン酸；^*PI^*P₂、ホスファチジルイノシトールビホスフェート実線は代謝変換の経路を示す。破線は原形質膜を通過するポテンシャルフラックスを示す。図２は、イノシトール過剰生産（Opi-）表現型を示す25℃および37℃における平板測定の写真である。野生型（wt）、sec14ckil（sec14、cki1）、SEC14cki1 （cki）、sec14^tsCKI1(sec14)、およびopil株を試験した。株によるイノシトールの過剰発現および排出は試験した株の周囲の円光により観察される試験株の増殖をもたらしている。Opi1株は陽性対照として含まれる。図３A-３Cは、コリン過剰生産（Opc-）表現型を示す30℃および37℃における平板測定の写真である。株SEC14cki1（cki）（図３A）、sec14^tscki1(sec14、ck i1)（図３B）、および野生型（wt）（図３C）がここに記載したように試験された。コリンの排出は試験した株の周囲の円光により観察されるように試験株の増殖をもたらしている。図４A−４Cは、それぞれ、野生型(wt)、SEC14cki1、およびsec14^tscki1株の37 ℃における時間の関数としてのホスファチジルコリン代謝回転を示す。酵母株を１μCi／ml¹⁴C-コリンを含むI培地で中対数期まで増殖させた。データは、非標識培地に移した後、各時間における各分画において回収された総標識％として表わした：培地（○）、細胞水溶性分画（■）、および細胞クロロホルム可溶性分画（●）。データは２つの独立した実験の平均である。図５は、野生型(wt)、SEC14cki1、およびsec14^tscki1株の37℃における培養の培地中に蓄積されたコリンを示す。¹⁴Cコリンは、ここに記載したように陽イオン交換クロマトグラフィによる他の¹⁴Cコリン含有代謝物から分離したものである。データは各株における各点での回収総放射能の％として表わされ、２つの独立した実験の平均である。図６A-６Eは、時間の関数または増殖温度の関数としてのリン脂質の代謝回転を示すグラフである。酵母株を、表IIIに記載したように、１０μCi［³²P］オルトリン酸／mlを補充したI培地で中対数期まで増殖させた。開始時のリン脂質組成は各株および増殖条件について表IIIに示したのと同じであった。図６A、６B および６Cに示したデータは、各リン脂質種（それぞれ、野生型、SEC14cki1、およびsec14^tscki1）に保有された総標識の相対％を示す。図６A−６Cにおいて、ホスファチジルイノシトール（PI）；ホスファチジルコリン（PC）；ホスファチジルエタノールアミン（PE）；ホスファチジルセリン（PS）；およびホスファチジン酸（PA）を示す。「その他」の脂質はシチジンニリン酸（CDP-DG）、ホスファチジルモノメチルエタノールアミン（PMME）、ホスファチジルジメチルエタノールアミン（PDME）、カルジオリピン（CL）、および原点付近に残った脂質を含む。ホスファチジルイノシトール（PI）のホスファチジルコリン（PC）に対する比率（図６D）はPI対APCに関連した［³²P］標識の相対％から計算した。スフィンゴ脂質に関連した標識は野生型およびsec14^tscki1につき図６Eに描写した。図７は、野生型(wt)、SEC14ckil（cki1）、およびsec14^tscki1（sec14、cki1 ）株の25℃および37℃におけるINO1発現のノーザンブロット解析を示す。酵母株は指示したように、I⁺もしくはI^-培地またはC⁺もしくはC^-培地において増殖させた。RNAを抽出し、ノーザンブロット解析をここに記載したようにして行った。負荷対照としてTCM1プローブでハイブリダイゼーションを行った。図８A−８Hはsec14およびsec14^tscki1変異株におけるINO1脱抑制の反応速度論を示す。プラスミドpJH359を含む酵母株を、抑制条件（I⁺培地）下で25℃にて増殖の中対数期まで生育させた。細胞を濾過により集め、許容温度（25℃）または非許容温度（37℃）で新鮮培地（I⁺またはI^-）に移した。指示した時間点で、培地のOD₅₉₅（○）およびβ−ガラクトシダーゼ活性（△）を測定した。図８A−８ Dはsec14^tscki1株の：（図８A）I⁺培地25℃；（図８B）I^-培地25℃；（図８C）I⁺ 培地37℃；（図８D）I^-培地37℃、への変換を描いている。図８Eおよび８Fはse c14^tsCKI1株の（図８E）I⁺培地37℃、および（図８F）I^-培地37℃への変換を示す。図８Gおよび８Hは野生型（SEC14CK11）株の（図８G）I＋培地37℃、および（図８H）I−培地37℃への変換を示す。発明の詳細な説明 I．定義ここで使用されている、「代謝回転」は、例えば、酵母中のホスファチジルコリンのような分子または代謝物の異化作用または分解を意味する。「代謝シグナル」は、協調的に制御されているリン脂質生合成遺伝子の抑制に起因する代謝物、本発明においては、ホスファチジン酸（PA）または緊密に関連した代謝物を意味する。「平板測定」はホスホリパーゼD活性および／またはシグナル伝達研究に有用なホスファチジルコリン（PC）代謝回転によるコリンの測定方法を意味する。「CDPコリン経路」および「ケネディー経路」は、全ての真核細胞、例えば、酵母におけるホスファチジルエタノールアミン（PE）のメチル化を通る以外のホスファチジルコリン（PC）をつくる代替経路を云う。cki1突然変異の導入または同様の効果を有する他の突然変異の導入によるようなCDPコリン経路の遮断はコリンの排出をもたらす。cki1突然変異がsec14突然変異と結合すると、コリン排出は幾分大きくなる。「許容および非許容温度」は、温度感受性遺伝子産物が機能（許容）または非機能（非許容）である温度を云う。例えば、sec14^tsアレレによりコードされたタンパク質産物は37℃では非機能であり、その結果、ケネディー経路の遺伝子の一つにおける突然変異と組み合わされたとき、コリン排出の増加が起こる。 II．方法本発明によると、INO1遺伝子制御におけるホスファチジルコリン（PC）代謝回転の役割が調べられ、酵母、好ましくはパン酵母（Saccharomyces cerevisiae）におけるリン脂質生合成を制御する、即ち、「開始／停止」をするための方法が提供される。本発明は、協調的に制御されたリン脂質生合成遺伝子（例えば、IN O1）を抑制するための代謝シグナル／指標、およびそのような代謝シグナル／指標を制御し利用する手段を発見したことに基いている。本発明によると、ホスファチジン酸（PA）または緊密に関連した代謝物はイノシトールおよびイノシトール含有リン脂質および他の協調的に制御されたリン脂質生合成遺伝子の産生を制御する、ことが見出された。同時に、PAの各分子の産生は遊離コリン分子の製造に導かれることが兄出された。それゆえ、本方法は二つの栄養素、コリンおよびイノシトール、同じくリン脂質および他の化合物、例えばコリンリン酸の制御された製造に導く。コリンおよびイノシトールはヒトおよび動物により食品補助物として消費される。本発明は特に、in vivoでホスファチジルコリン（PC）のホスホリパーゼD （PLD）仲介代謝回転を検出する方法を提供する。この代謝回転は、図１に示すように、PAおよび遊離コリンの同時生産をもたらす。また、非PLD仲介経路により製造されたコリンの検出方法を提供する。本発明は、また、酵母におけるホスファチジルコリン（PC）代謝回転を増加する方法を提供する。そのような代謝回転は幾種かの方法、例えば、化学的手段および遺伝学的手段のような方法で達成することができる。PC代謝回転は、例えば、培地に適当な界面活性剤の添加により化学的に達成することができる。酵母におけるPC代謝回転を増加させる他の手段は、また、本発明により予測されることである。以下の例は、酵母におけるPC代謝回転をもたらす遺伝学的手段を利用するものである。本発明の観点は： sec14株、特にsec14^ts株、のようなPI／PC交換できない株に、例えば、cki1、 cct1、またはcpt1変位を導入することにより遊離コリンの再利用（図１における CDPコリン経路）のための経路を遮断し；そしてホスホリパーゼD活性を測定するためにコリン産出を半定量的に比較することが可能なバイオアッセイにおいてコリンの産出を検出するために、例えば、cho2 opi3、のようなコリン要求株を利用する；ことを含む。かくして、本発明は、PI／PC輸送体タンパク質（Sec14p）における突然変異と CDPコリン経路における突然変異とを組み合せることによりPCの加速されたPLD仲介代謝回転を開始する方法を包含する。例えば、sec14の温度感受性アレレを使用するとき、代謝回転を加速するための切替えは遺伝子型sec14^tscki1、sec14^ts cct1、またはsec14^tsctp1、またはこのような性質を有する他の遺伝子型、を有する株の温度を変換することにより達成することができる。しかしながら、sec1 4の温度感受性アレレは本発明の必要条件ではない。sec14の突然変異は、cki1、 cct1またはcpt1突然変異の背景にあるときは、致死的ではない。それゆえ、本発明はsec14^tsアレレに限定されない。加速されたPC代謝回転の結果、もしsec14^tsアレレがcki1突然変異と組み合せて使用されたなら培地中に排出される遊離コリンの産生がおこる。しかしながら、cct1またはcpt1突然変異体の使用により、コリンリン酸および／またはシチジンニリン酸（CDP）コリンがそれぞれ、遊離コリンと同じく高細胞内レベルでの製造が可能となる。加速されたPC代謝回転の別の結果は、PA産生を導き、それは、変って、イノシトール−１−リン酸の構造遺伝子であるINO1遺伝子の転写、およびリン脂質生合成の全ての他の共制御遺伝子の即「開始」を導く。この変化は、イノシトールの排出、ホスファチジルイノシトール（PI）、ホスファチジルイノシトールリン酸（PIP）、ホスファチジルイノシトールビスリン酸（PIP₂）およびイノシトール含有スフィンゴ脂質のようなイノシトール含有リン脂質の産生の増加を導く。本発明によれば、PAおよびコリンが産生されるホスファチジルコリン代謝回転を、ここに記載するようにコリン排出の平板測定によって逆に検出することにより代謝シグナルが検出される。それゆえ、酵母におけるPAのレベルを制御することにより、イノシトール、イノシトール含有リン脂質、および遊離コリンを随意に制御することができ、あるいは「開始する」ことができる。その結果、イノシトールおよびイノシトール含有代謝物の産生が従来の酵母株に比較して実質的に増加される。また本発明によれば、コリン排出のための平板測定が、シグナル伝達の検査に使用することができるPC代謝回転およびPLD活性を検出するために提供される。 Sec14pが不活化されると、PC代謝回転が増加し、INO1遺伝子が抑制され、Opi^- 表現型が作られる、しかしもしCDPコリン経路のみを同時に遮断すると、sec14^ts cki1株を37℃に変換した例のようになる。逆に、突然変異細胞がCDPコリン経路を使用してPCをつくることができるときにのみ、cho1、cho2およびopi3突然変異株中のOpi^-表現型は除去され、イノシトールに反応するINO1抑制は回復される。 cho1、cho2またはopi3株におけるような、これら二つの明白にはっきりと異なった代謝条件、一方はsec14^tscki1株におけるようにPC代謝回転の増加を含み、他方はcho1、cho2またはopi3株におけるように減少したPC生合成を含む、の両者は Opi^-表現型に起こり、従って、幾分普遍的でなければならない。 Opi^-表現型で起こるような突然変異株での普通の代謝因子は、以前に仮説されたようにPC生合成を減少させるのでなく、むしろPC生合成に至る経路において初期にリン脂質前駆体の産生対利用の相対比率における細胞のバランスである、と信じられる。本発明によると、抑制解除のための代謝シグナルを発生する特定の前駆体がその利用に過剰であるような割合でつくられるような条件下で、Opi^-表現型が産生され、INO1が抑制解除されるのであろう。限定的な温度にsec14^tscki 1株が変換されると、２つの前駆体、PAおよびコリン、がPC代謝回転により産生される。遊離コリンは代謝シグナルの原因ではないことが既に示されている。本発明によると、シグナルはPAあるいは緊密に関係する代謝物により生成されると信じられる。PAからPC生合成に導く経路のおける構造遺伝子を遮断する全ての突然 Opi^-表現型を有している。本発明によると、これらの変異体においてOpi^-表現型は、上流の代謝物の「せき止められた」結果である。このことが起こると、細代謝物を使用する反応を触媒する、を包含する、UAS_INOを含む協調制御酵素の全てを抑制する。これら下流の酵素の抑制解除は、例えば野生型細胞におけるPAのような前駆体のいかなる「せき止め」も除かれる傾向となる。しかしながら、PC 生合成が欠損した変異体のそれぞれにおいて、系を抑制解除することによっては救出できない代謝のボトルネックがある。本発明によると、この反応系における初期の前駆体の構築である。このモデルは、Opi^-表現型を提示するPEメチル化を経てPC生合成の頂点に達する反応系が欠失した構造遺伝子突然変異体は、INO1抑制解除のシグナルを造る代謝物より下流に位置する領域を有していなければならない。今までにOpi^-表現型を有することが示されたPCより最も遠い上流の突然変異体はCDG1である（Klig，L.S.，et al.，J ．Bacteriol . 170:1878(1988)、本開示は参照することによりここにとり入れられている）。cdg1突然変異体はシチジンジホスフェイトジアシルグリセロール（ CDP-DG）シンターゼ（CDS1に対する構造遺伝子を欠失していることが示された。 Shen，H.，et al.，J ．Biol．Chem. 271:789(1996)、本開示は参照することによりここに取り入れられている、を参照。更に、最近の証拠によると、INO1およびプロモーター中にUAS_INOを含む協調制御遺伝子の抑制解除はCDP-DGシンターゼの濃度に高度に相関している。本発明のモデルによると、制御反応を発生する原因となる代謝物は、cdg1突然変異体における遺伝子遮断の下流であるCDP-DG ではあり得ない。従って、代謝物はPAまたはPAの上流の代謝物でなければならない。このモデルと矛盾せずに、sec14^tscki1突然変異体におけるPLD仲介経路を経るPCの過剰代謝回転は、細胞がそれをつくることができるより速くPAを生産するものと、信じられる。それゆえ、cdg1、cho1、cho2またはopi3変異体におけるように下流のステップを経て流れの速度が低下するのでなく、PAの取り入れが加速されることにより、代謝バランスが傾くのである。PAは下流の反応に急速に使用される一過性の前駆体であるので、シグナルを造る検出機構は経路の代謝物の流れに非常に感度がよくなければならない。野生型細胞においては、本発明によると、増殖培地にイノシトールを添加すると、de novo脂質合成においてPAの利用率の増加によるINO1および協調制御遺伝子の抑制を導く。事実、イノシトールの存在下、³²pのリン脂質への取り込みの総比率は野生型株で増加する（表IV以下）。事実上、CDPコリン経路でPA中間体を経ておこったPCの³²P標識の場合を除いて、30分間のラベル標識で標識した全ての脂質（表IV）がPA中間体を経由して行われた（図１）。それゆえ、30分間ラベル標識では、PAとして実際に回収された標識の割合は、PA分岐点を経由した総³² Pのほんの僅かな割合である。しかし、PLD仲介代謝回転により産生されたPAは比較的標識されないので、それゆえ、³²Pパルス標識は、リン脂質代謝回転が増加している、例えば37℃におけるsec14^tscki1のように、株においてリン脂質合成の総比率を実際より小さく見積もることになるであろう。野生型細胞において、本発明のモデルは、PAのような初期の前駆体は、イノシトールが培地中に存在しないとき、それらの利用率のいくらか過剰にde novoで造られることが予想される。これらの前駆体の構築はINO1遺伝子の抑制解除となるシグナルを発生し、PI産生に使用されるイノシトールの産生を導き、それによってPAのような初期の前駆体のプールを引き出す。外因性イノシトールが存在するとき、PI産生の割合は、系を抑制する点までPAおよび他の前駆体のプールを低下するために、充分に増加する。かくして、イノシトール有用性は野生型細胞においてリン脂質前駆体の放出対取込みの総比率に影響する。このことは、しかし、 PAおよび他の初期前駆体を利用する経路の他の主要分枝が妨害されないとき、および／またはPAの流入に寄与する脂質代謝回転率が正常であるとき、にのみ抑制をもたらす。野生型細胞において、コリンの存在は、もしイノシトールが既に存在しさえすれば、更なる度合いの抑制を導く（Paltauf，F.，et al.，(1992)を参照）。cho1、cho2、およびopi3突然変異体において、増殖培地にコリンを添加すると、イノシトールに応じて抑制され得る状態に代謝系も回復する（例えば、 McGraw，P.，et al.(1989)を参照）。コリンがcho1、cho2、またはopi3突然変異体に供給されると、PCの主要な正味の合成が、脂質生合成における中間体として DAGを使用してCDPコリン経路を経て起こる（図１）。DAGはPAから由来する（図１）そして、それゆえ、これら突然変異体のコリン補充は替わりの経路分岐点、 PAの下流、を経て「水門」を開けることによって、PAレベルを高く保つ、前駆体の「ダム」を助けることになる。本発明のモデルは、また、イノシトールが存在するか否かにかかわらず定常状態において、UAS_INOを含む遺伝子が抑制される（抑制解除することができない）のはなぜかを説明する。もし主要細胞代謝物（即ち、炭素またはリン、等）が制限的であれば、PAおよび他の初期前駆体はde novoではできないであろうし、INO 1遺伝子および他のリン脂質代謝の酵素を変換することにより救済されるような前駆体の構築はないであろう。それゆえ、試験された全ての株は、37℃における sec14^tscki1を除いて、定常状態においてINO1 lacZレポーター構築の安定化を示す、ということが観察された。37℃で、sec14^tscki1株がINO1レポーター構築の発現が続いていることは、本発明のモデルにより、定常状態においてさえもINO1 の抑制解除をおこすことができた脂質代謝回転を経てPAの産生が進行しているという考えと矛盾しない。要するに、本発明の方法に対する統一モデルは、INO2およびINO4遺伝子産物と OPI1遺伝子産物を経て連絡しているS．cerevisiaeにおける代謝シグナルはリン脂質生合成の初期段階での代謝物である、ということである。シグナルはホスファチジン酸（PA）そのものである、あるいはPAに緊密に関連した代謝物であると信じられる。このモデルにおいて、UAS_INO含有遺伝子の転写は、PAの高レベルに条件が好都合であるときに、高いであろう。PAレベルは少なくとも４つの複合代謝因子により影響され得る。１．リンおよび炭素のような基本的代謝物のレベルを含む、一般的細胞代謝条件。定常期のように、一般的代謝活性が低いとき、PAレベルは低く、系は抑制状態にある。２．活発に増殖中のイノシトールの利用可能性。イノシトールを活発に増殖中の細胞に加えるとき、リン脂質生合成のパターンの変更が直ちに起こる。PI合成の比率が、上流の前駆体、PAおよびCDP-DG、を犠牲にして上昇する。PAおよびCDP- DGレベルは低下し、協調遺伝子は抑制される。コリンは、イノシトール不存在でそれ自身を加えるとき、経路の異なった点に入り、最初にDGの保存を引き起こす（図１）。しかし、DGおよびPAプールは未だ未確定の平衡を通して関連しているようにみえる。それゆえ、PAプールがイノシトールの存在により既に減少している条件下では、コリンは効果を有し、そして更に抑制の原因となる。コリンはまた、以下に考察するようにPEメチル化を経てPCの合成において遮断を有する突然変異体を制御する主な効果を有している。３．PAからPC生合成へと導く経路における総代謝の流れ。一般的に、PC生合成のを設ける遺伝子損傷は、PAを含む、損傷から上流の前駆体の蓄積を生ずる。逆に、このことは、INO1および他の協調遺伝子の高いレベルの抑制解除を導く。しかし、もし、コリンのような前駆体が増殖培地に加えられると、ケネディー経路を経てPCの合成のためのDGを利用することにより前駆体の蓄積を緩和することができる。そのような条件下で、INO1および他の協調遺伝子の過剰発現は緩和され、細胞はイノシトールに応じて抑制することができるようになる。４．リン脂質代謝回転。ホスホリパーゼD（PLD）仲介PC代謝回転はPAおよび遊離コリンを産生する。この経路によって産生されたPAは、ある種の状況下で、総PA プールの主要成分を構成することができる。それゆえ、もしPLD仲介代謝回転が異常に高いと、UAS_INOを含む遺伝子の予定外の抑制解除を導くことができる。このことは、逆に、イノシトール排出表現型を導くことができる。その他のPLD仲介代謝回転の主要産物は、ある種の条件下で（即ち、CDPコリン経路における cki1のような遮断）、細胞から排出されるコリンである。このことは限定された温度でsec14^tscki1株にみられる表現型に対する説明となる。以下の実施例において、37℃の限定的温度でI^-C^-培地においてCDPコリン／ケネディー回路で、sec14^tscki1および他の変異と組み合せたsec14^tsはPC代謝回転およびコリンおよびイノシトールおよびその他の代謝物の付随する過剰生産をもたらす。更に、コリン排出についての平板測定はPC代謝回転のコリン副産物の検出法を提供する。実施例酵母株。使用された酵母株は以下の表Iに示す。全ての株は、記載した供給源からの贈与であり、要求により入手可能である。更に、sec14 cki1、sec14 cct1 、およびsec14 cpt1変異株および個々の株は公知のよく知られた方法に従ってつくることができ、McGee，T.P．et al.，J ．Cell．Biol. 124:273(1994)、本開示は参照することによりここにとり入れられている、により記載されており、Sacc haromycesゲノムデータベース(http://genome/www.stanford.edu/saccharomyces /）は、遺伝子を含め、Saccharomycesゲノムの完全配列を含んでいる。Cho2 opi 3株は、Summers，E.F.，et al.，Genetics 120:909(1988)、本開示は参照することによりここにとり入れられている、により記載されているように公知のよく知られた方法に従ってつくることができる。AIDは公知のよく知られた方法に従ってつくることができる。培養条件。酵母株はYEPD培地（１％酵母エキス、２％バクトペプトン、３％グルコース）(Difco Labotratories，Inc．Detroit，MI）。化学的に定まった合成培地は、Griac，P.，et al．(1966)により記載されたようにして調製された。合成培地は、イノシトール欠乏（I^-）または75μＭイノシトール（I⁺）および／または1mMコリン（C+）を加えられている（Sigma Chemical，St．Louis，MO）。酵母形質転換。酵母形質転換は、Gietz，D.，et al.，Nucl ．Acids Res． 20 :1425(1992)、本開示は参照することによりここにとり入れられている、により報告された、酢酸リチウム法により行われた。 Opi^- （イノシトールの過剰生産）およびOpc^-（コリンの過剰生産）表現型の測定。Opi^-表現型（Greenberg，M.，et al．Genetics 100:19(1982)，and Swede， M.J.，et al.，Methods in Enzymology:Phospholipid Biosynthesis(Vance，D.E .，et al.，eds.)Vol ．29，pp．21-34(1992)、完全な方法の記載のため、本開示は参照することによりここにとり入れられている、を参照）を試験するため、酵母株を合成I^-培地に張り付け、指示された温度（25℃、30℃、および37℃）で、２日間増殖させた。平板に、ino1およびade1のホモ接合体である（表I）二倍体試験株（AID）の懸濁液を噴霧し、別に２日間インキュベートした。 Opc^-表現型については、酵母株を合成I⁺またはI^-培地を含みコリンを欠く（C^- ）平板上に貼り付け、指示された温度で２日間増殖させた。酵母株は、コリンの栄養要求株である、テスター株、cho2 opi3、（表I）と共に噴霧し、更に２日間 30℃または37℃、あるい別に３日間25℃にてインキュベートした。 β−ガラクトシダーゼ測定。各株を、Lopes，J.，et al.，Nucl ．AcidsRes.，19(7) :1687(1991)、その開示は参照することによりここにとり入れられている、により記載されたようにして、プラスミドpJH359（-359−-119 INO1−CYC1−lac I'Z）と共にウラシル原栄養体に形質転換した。形質転換株はI⁺またはI^-培地にて中対数増殖期まで増殖させた。β−ガラクトシダーゼ測定は、適量を５、10および15分に反応混合物を採取したこと以外は、Lopes，J.，et al．(1991)により記載されたようにして行った。温度変換実験のために、酵母株は最初25℃で抑制条件（I⁺培地）にて増殖させ、培地を濾過し、細胞を抑制条件（I⁺）または抑制解除条件（I^-）のいずれかにおいて、25℃または37℃にて増殖する、別々の培地に接種するために使用した。試料を時々集め、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。ノーザン解析。RNAプローブを、Hudak，K.A.，et al.，Genetics 136:475(199 4)、本開示は参照することによりここにとり入れられている、により記載された、プラスミドから合成した。プラスミドを制限酵素で直線化し、［³²P］シチジン 5'三リン酸の存在下、以下のRNAポリメラーゼを用いて、転写した（プラスミド／制限酵素／RNAポリメラーゼ）：pAB309／EcoRI／SP6（TCM1）、pJH310／HindI II／T7(INO1)。転写はSP6/T7 Riboprobe Combination System(Promega Corp.，M adison，WI)用の製造会社の仕様書に従って行った。実験的培養は、Elion，E.A ．et al.，Cell 39:663(1984)、本開示は参照することによりここにとり入れられている、により記載されたようにして、指示された温度で、増殖の初期対数期（OD₅₉₅、0.2および0.25の間）まで増殖させ、RNAをガラスビーズ破砕および熱フェノール抽出を用いて単離した。イノシトールおよびコリン利用性に関して構成的に発現するTCM1リボゾームタンパク質遺伝子を、Hirsch，J.P.，et al.，Mo l ．Cell．Biol . 6(10):3320(1986)、本開示は参照することによりここにとり入れられている、により記載されたように、RNA負荷に対する標準として使用した。ノーザンハイブリダイゼーションは、オートラジオグラフィにより可視化して行い、Griac，P.，et al．（1996）により記載されたAMBIS 4000 phosphorimage r(AMBIS，Inc.，San Diego，CA)で測った。リン脂質分析。定常状態のリン脂質組成を測定するために、酵母株を10μCi［³² P］オルトリン酸／mlを含むI⁺またはI^-合成培地で増殖させた。培養物を指示された温度で５ないし６世代増殖した後、中対数期(OD₅₉₅＝0.4-0.6)で集めた。標識した脂質を、Atkinson，K.D.，et al.，J ．Bacteriol. 141:558(1980)、本開示は参照することによりここにとり入れられている、により記載されたようにして抽出し、個々のリン脂質種を、Steiner，M.R.，et al.，Biochim．Biophys ．Acta 260:222(1972)、本開示は参照することによりここにとり入れられている、により記載されたようにして、二次元ペーパークロマトグラフィにより分析し、液体シンチレーションカウンターで定量した。リン脂質の代謝回転実験のために、細胞を上記したようにして標識し、集菌し、標識オルトリン酸を含まない新鮮培地で２度洗滌し、指示された培養条件下で、OD₅₉₅＝0.1に懸濁した。指示された時間に、これら培養の適量を採り、リン脂質を分析した。In vivoでのリン脂質合成の速度を、Kelley，M.J.，et al．J ．Biol．Chern. 263:18078(1988)、本開示は参照することによりここにとり入れられている、により記載されたようにして、50μCi［³²P］オルトリン酸／ml、30分間、細胞をパルス標識して測定した、次いで、上記したようにして、ペーパークロマトグラフィにより脂質を抽出し分離した。スフィンゴ脂質に取込まれた［³²P］リン酸量を、Becke r，G.W.，et al．J ．Bacteriol. 142:747(1980)、本開示は参照することによりここにとり入れられている、により記載されたようにして抽出した脂質を脱アシル化し、一次元クロマトグラフィでスフィンゴ脂質を分離して、決定した。 ¹⁴C コリンでの代謝標識。酵母株を10μＭ濃度で、１μci／ml 1,2−¹⁴Cコリン（America Radiolabeled Chemicals，St．Louis，MO）を含むI^-培地で指示された温度で一夜増殖させた。培養は中対数期中に集め、新鮮な非放射性培地で２度洗滌し、I^-C^-培地中にOD₅₉₅＝0.1に懸濁した。指示された時間に培養の適量を採取し、細胞を遠心分離でペレットにした。上清は「培地」分画として取り分けた。細胞ペレットは、以下の処置を加えて脂質を抽出するために、Atkinson，K.D ．et al．(1980)により記載されたようにして処理した：細胞膜を透過性にするためTCAで細胞ペレットを処理した後、上清およびペレット洗滌物を合わせ、「細胞の細胞内水溶性分画」として取り分けた。カウントの＞90％が他の細胞分画のみ（脂質分画）に見出されるという事実により証明されるように大部分の細胞内水溶性カウントを含んでいるこの分画は、クロマトグラフィでPCであることが示された。コリン含有水溶性代謝物の分離。 Bio-Rex 70樹脂（50−100メッシュ）（Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA ）の陽イオン交換クロマトグラフィを、水性培地洗滌物中の1,2−¹⁴Cコリンまたは他の水溶性1,2−¹⁴Cコリン含有代謝物からのTCA抽出物を定量的に分離するため、Martin，T.W.，Biochim ．Biophys．Acta 962:282(1988)、本開示は参照することによりここにとり入れられている、により記載されたようにして使用された。水性試料（３ないし５ml）は、必要ならば、1.0M Trisバッファー、pH8.0で中和し、１ml Bio-Rex 70カラムにかけた。カラムは5ml H₂O、次いで、10ml、50mM グリシンおよび500mM NaCl、pH3.0で洗滌し、樹脂により保持されているコリンを溶出した。各分画は存在する種々の代謝物の割合を決定するためにカウントした。 III．結果 CDPコリン経路突然変異と組み合せたsec14^tsアレレを保持する株のイノシトールおよびコリン排出表現型。イノシトール過剰生産（Opi^-）（overproduction o f inositol）表現型（図２）は、Griac，P.，et al．(1996)；Paltauf，F.，et al．(1992)；and Greenberg，M.，et al．（1982）により記載されたように、IN O1遺伝子の誤制御と関連している。本発明により、Opc^-（overproduction of ch oline）と称する、関連するコリン排出表現型（図３）が示される。酵母株のOpi^- およびOpc^-表現型は図２および３に示され、以下の表IIに要約されている。Gri ac，P.，etal．(1996)により既に報告されているように、CDPコリン経路の突然変異のみを保持する株はOpi^-表現型を表わさない。しかし、CDPコリン経路の全ての突然変異体は異なった程度でOpc^-表現型を表わした。Sec14^ts突然変異（ただしCDPコリン経路には突然変異はない）を保持する株では、その許容温度、25 ℃または30℃ではOpi^-表現型は見られなかった（表II）。Sec14^ts突然変異を保持する株は、ほとんど以下の研究はSec14^tsおよびcki1突然変異の組み合わせを保持する株の組で行われたので、以後、Sec14^tsCKI1（表Ｉ）と称する。僅かのO pc^-表現型がSec14^tsCKI1株に見られたが、しかし30℃でのI^-培地においてのみであった。 30℃において、この温度はSec14^tsに許容される温度であるが、CDPコリン経路損傷（即ち、sec14^tscki1；sec14^tscct1；sec14^tscpt1）の各々との組み合わせでsec14^tsを含有する二重突然変異体は、問題のCDPコリン経路突然変異のみを保持する株により提示された表現型よりも幾分強いOpc^-表現型を有していた（表II ）。25℃では、これらの二重突然変異体はいずれもOpi^-表現型を表わさなかった。しかしながら、37℃では、この温度ではsec14^ts遺伝子産物は不活化されるが、全て３つの二重突然変異体はOpi^-表現型を表わし、同様に、それら同じ株で30 ℃において、あるいは、いずれの温度においても相当するCDPコリン経路領域を保持するのみの株において見られたよりも劇的に強いOpc^-表現型を表わした（図２、表II）。表II Opc^-およびOpi^-表現型の概要「実施例」に記載した相当するテスター株により生じた増殖円光（図２および３）のサイズに基くOpc^-（A）およびOpi^-（B）表現型の定量評価。Opc^-試験についてはI^-またはI⁺培地、およびOpi^-試験についてはI^-培地における指示された温度で酵母株を増殖した。コリン代謝。外因性コリン補充がないと、酵母細胞は、まずPEのメチル化経由でPCをつくる（図１）。CDPコリン経路突然変異体のコリン排出表現型（図３）は、コリンはPEのメチル化、次いでPCの代謝回転、を経てPCのde novo合成で産生されることを示唆している（代謝経路、図１）。野生型株においても標準の脂質代謝経路において同等の代謝回転が多分起こっているであろうが、しかしコリンは細胞から逃れることなくCDPコリン経路を経て急速に再利用される。それゆえ、CDPコリン経路突然変異体の一つと組み合せてsec14^tsアレレを保持する二重突然変異体において限定的な温度でコリンの排出が増加することは、PCの加速された代謝回転が生じつつあることを示唆している。この考えを試験するため、野生型、SEC14 cki1、sec14^tsCKI1およびsec14^tsck i1株をI^-C^-培地中にて¹⁴Cコリンで標識した。¹⁴CコリンはCDPコリン経路を経てP Cに取り込まれた（図１）、しかしcki1突然変異を保持する株は¹⁴CコリンをPCに取り込むための減少した容量を有していた。SEC14cki1およびsec14^tscki1株で¹⁴ CコリンのPCへの取込みはおよそ野生型のレベルのおよそ１３％であり、Griac， P.，et al.，（1996）and Hosaka，K.，et al.，J ．Biol．Chem．264:2053(1 989)、本開示は参照することによりここにとり入れられている、により記載されたように、cki1株について既に報告されたものと比較し得る、ことが見出された。25℃で標識した全ての４株（即ち、野生型、sec14^tsCKI1、SEC14 cki1およびs ec14^tscki1）から抽出したクロロホルム可溶性標識の分析は、標識の＞90％がPC に関連していることが示された。 PC代謝回転を研究するために、¹⁴Cコリン標識細胞を非標識培地に移し、標識の運命を図に印した。37℃における脂質可溶性プール、細胞内水溶性プール、および非標識培地に移した後の培地間の標識移行パターンを３株（野生型、SEC14c ki1およびsec14^tscki1）について図４および5に示す。４株全てを同様に25℃にて試験し（データは示さない）、そして2パターンの代謝回転のみを観察した。「野生型」パターンは25℃では野生型およびsec14^tsCKI1の両者により、そして3 7℃では野生型により提示された（図４A）。「cki1」パターンは25℃においてSE C14cki1およびsec14^tscki1株により、そして37℃においてSEC14cki1により提示された（図４B）。コリン代謝の「野生型」パターンを示す株において（即ち、25℃および37℃における野生型、ならびに25℃の許容温度においてのみにおけるsec14^tsCK1）、非標識培地に移す時に細胞は水溶性細胞内プールにおいてそれらの細胞¹⁴C標識の顕著な量（19−29％）を持った（図４A）。残りの細胞標識は脂質関連である。少量の標識（２−７％）は実験開始時の細胞外遊離コリン関連である。非標識培地に移して後最初の３時間の間に、培地から遊離コリンが取り込まれ、水溶性細胞内プールは数％に減少し、そして標識が脂質関連プールに現れ、それはPCの90 %より大きいことが示された。少ない標識（総標識の10%またはそれ以下）が、６時間の追跡を通して培地に現れた（図４A；図５）。野生型の細胞の場合、出現する細胞外標識は遊離コリンの形ではなかった（図５）。最もありそうなことは、Angus，W.W．et al.，Arch ．Biochem．Biophys. 151:483(1972)、本開示は参照することによりここにとり入れられている、により報告されたように、野生型の酵母細胞により排出されることが知られているグリセロホスホコリンである。コリン代謝の「cki1」パターンを現わす株において、（即ち、25℃および37℃ の両方におけるSEC14cki1、および25℃の許容温度においてのみのsec14^tscki1）、総細胞標識の大きな部分が実験開始時の脂質分画に存在した（図４B）。水溶性細胞内プールは総標識の12％またはそれ以下であった。両温度におけるSEC14c ki1株において、同様に25℃でのsec14^tscki1株においても、細胞内可溶性プールから非標識培地への変換後のPCに標識の移動はほとんどなかった。しかし、PCからの定常的な標識の喪失（３時間で約７％）が、増殖培地中に遊離コリンに関連した標識の相当する出現と共に、観察された（図４Bおよび図５に37℃でのSEC14 cki1株について示した）。最後に、PC代謝回転の第３で非常に顕著なパターンが37℃でsec14^tscki1株により提示された。37℃において、sec14^tscki1株は、SEC14cki1株に類似して非標識培地への転換時に初期の標識分布を有していたが、しかし、PCからより急速に標識を失った（最初の３時間で54%）。再び標識は遊離のコリンとして培地中に現れた（図４C;図５）。この発見は37℃でのsec14^tscki1株に関連した強いOpc^- 表現型と一致した（図３）。sec14^tscki1株およびSEC14cki1株におけるPCから¹⁴ C標識の喪失は、細胞を25℃において定常状態に¹⁴Cコリンで標識し、37℃で非標識培地に変換したときも、試験された。25℃および37℃で代謝回転の同じパターンを有したSEC14cki1株（図４B）、は意外ではなく25℃から37℃へ変換したときと類似した標識パターンを示した。しかし、25℃で標識した後37℃に変換したとき、２つの温度において異なった標識パターンを有していたsec14^tscki1株は、標識と代謝回転の両方を37℃で行ったときに見られたPCからの¹⁴C喪失パターンを示した（図４C）。それゆえ、代謝回転の加速されたパターンが37℃にsec14^tscki1 株を変換すると直ぐに起こったに違いないと結論された。リン脂質組成。I^-培地で25℃において、4株全てリン脂質組成（表III下）は互いに類似し、McGee，T.P.，et al．(1994)により記載された他の株、および、同様の増殖条件下で、Patlauf，F.，et al．(1992)により記載された他の株に類似していた。I^-培地で増殖したsec14^tscki1株および野生型株の組成は30℃で分析され、25℃で得られた組成に類似することが見出された。37℃でのI⁺培地において、生育し得る３株（即ち、野生型、SEC14cki1およびsec14^tscki1）は、McGee ，T.P.，et al．(1994)により、この増殖条件で以前に報告されたのと類似したリン脂質組成を示した。一般的に、I⁺で増殖する細胞のリン脂質組成は、I^-に比較して、PIのより高い比率を含んでいる（表III）。I^-培地で37℃において、sec 14^tscki1株は、しかしながら、同じ増殖条件下での野生型株で見られたPIの比率の約２倍のPI比率を含んでいた（総細胞リン脂質の19%）。37℃におけるsec14^ts cki1株を除いては、I^-培地で25℃または37℃で増殖する株の全てのPI含量は総リン脂質の９−15％の間であった。I⁺培地37℃で試験した全ての株では、PIの比率は総リン脂質の28−32％であった（表III）。表III イノシトールおよび温度のリン脂質に対する効果酵母株を、10μCi／ml［³²P］オルトリン酸を含むI⁺またはI^-培地中で指示された温度で５ないし６世代増殖させた。細胞を集め、「実施例」に記載されたようにリン脂質を抽出し、分解した。用語「他」は、原点に近く残留するスフィンゴ脂質を含む、CDP-DG、PMME、PDME、CLおよび極性脂質を含む。値は各リン脂質種に取り込まれた総脂質関連³²Pのパーセントで表わす。リン脂質代謝回転。細胞を、表IIIに示すように、³²Pで定常状態迄標識し、種種のリン脂質への³²Pの保持と分布を、細胞を非標識培地に移した後、追跡した（図６）。25℃において、４株の間に顕著な差は見られなかった（データは示さない）。37℃において、野生型およびSEC14cki1株（図６Aおよび６B）における³ ² P保持のパターンは互いに類似し、25℃で４株全てに得られた結果と類似した（データは示さない）。25℃での全４株において、および37℃における野生型およびSEC14cki1株（図６Aおよび６B）において、標識は、蓄積されたPCを除いて、全ての脂質から次第に消失した。37℃でのsec14^tscki1を除く全ての場合において（図６C）、PI対PCにおいて残存する標識の比率は時間とともに減少する傾向を示した（図６D）。しかし、37℃のsec14^tscki1において、PI／PC比は高いまま始まり、代謝回転実験の６時間の間増加した。スフィンゴ脂質を含む、「他」に分類したものに関連する標識は、37℃における代謝回転実験の間sec14^tscki1株中で上昇した。37℃でのsec14^tscki1株において、スフィンゴ脂質は実験の間、標識は蓄積した（図６E）。sec14^tscki1株において、PAに関連した標識の比率はほとんど一定に保たれた（図６C）、しかしながら、野生型（図６A）およびSEC1 4cki1株（図６B）においては、非標識培地に移動後最初の３時間で、約２倍低下した。リン脂質のパルス標識。図１に示した産物−前駆体関係の性質のゆえに、30分間のパルス標識（pulse labeling）期間中に導入される³²Pは、リン脂質組成を評価するのに使用された定常状態での標識よりも非常に異なったパターンを示す（表III）。37℃で増殖し得る３株を30分間³²Pでパルス標識し、３例全てにおいて、総取り込みは、I^-培地に比べI⁺培地における培養のOD単位当り大きかった（表IV下）。PCと比較したPIに関連して回収された標識の比率（PI／PC比）は、I^- 培地とは反対にI⁺培地で増殖した全３株で高かった（表IV）。しかし、sec14^tsc ki1株でのI^-培地において、標識のより高い比率がPIに関連していた、そして野生型株またはSEC14cki1株のいずれかにおけるよりもPI／PC比は高かった。 25℃で試験したとき、sec14^tsCKI1株は、37℃における野生型株と類似した30 分パルスの間に取り込まれた標識のパターンを示した。sec14^tsCKI1およびsec14^ts cki1株が、I⁺またはI^-培地中で25℃から37℃に変換に続いて³²Pでパルス標識された。これら条件下でのsec14^tscki1株の標識パターン（表IV、B）は、同じ株をI⁺またはI^-培地中で37℃に連続して保持したときに見られるパターンに非常によく類似していた。しかし、sec14^tscki1株に比較して37℃に変換した後４時間の培養のOD単位当り、sec14^tsCKI1株は少ない³²Pの取り込みであった、そして、より高い比率の標識が、どのような増殖条件下で試験した他の株におけるよりも、37℃でのCKI1株においてPCへ取り込まれた（表IV、B）。表IV リン脂質のパルス標識 Aにおいて、指示された温度でI⁺またはI^-培地中で中対数期（OD₅₉₅＝0.4−0.6 ）まで増殖した酵母株を50μCi／ml［³²P］オルトリン酸で30分間パルス標識した。脂質を「実施例」に記載したように抽出し分析した。Bにおいて、酵母細胞を25℃で増殖し、37℃に転換した。増殖４時間後、細胞を50μCi／ml［³²P］オルトリン酸で30分間パルス標識した。脂質を抽出し分析した。脂質に取り込まれた³²Pの量（³²P取り込み）はA₅₉₅×10³の光学密度当りCPMで表わした（CPM/ODU ×10³）。個々のリン脂質種における［³²P］標識の相対％は脂質に取り込まれた総³²Pの％として表わした。PI／PC比はPI対PCの割合から計算した。「他」の脂質は、原点付近に残った極性脂質、CDP-DG、PMME、PDME、カルジオリピン（CL）を含む。 sec14^tscki1 株におけるINO1の制御。37℃でsec14^tscki1株中に見られる、Opi^- 表現型はGreenberg，M.，et al．(1982)により報告されているように、INO1の誤制御に関連している。それゆえ、INO1制御は４株で検査した：野生型（SEC14CK1 1）、sec14^tsCKI1、SEC14^tsCki1およびsec14^tscki1。25℃において、全ての４株は、ノーザンブロット解析により試験したとき、イノシトールに反応してINO1転写の発現を示した（図７；表V下）。sec14^tsCKI1株を30℃で試験したが、正常な制御を示した。３株の各々の25℃または30℃においては、INO1転写は、I^-培地中で増殖した細胞と比較してI⁺培地中で増殖した細胞において、実質的に抑制されていた（即ち、10倍あるいはそれ以上）（図７；表V）。 37℃において、３株のみが増殖する：野生型、SEC14^tsCki1およびsec14^tscki1 。野生型およびSEC14^tsCki1株は両方37℃でINO1の正常制御を示した（表V；図７）。しかし、Opi^-表現型と一致して、sec14^tscki1株は37℃でINO1発現の異常パターンを示した。イノシトールが欠けると、INO1転写は野生型抑制解除よりも幾分高いレベルで発現した。更に、イノシトールを増殖培地に加えたとき、コリンが欠けると、INO1転写のレベルは、野生型株で10倍以上の抑制が見られたのに比較して、約2倍のみ抑制された（表V）。イノシトールおよびコリンを共に増殖培地に加えたとき、全く、INO1の抑制はsec14^tscki1株37℃で見られなかった（表V ）。表V ノーザンブロット定量法により測定したIN01遺伝子発現に対するイノシトールおよびコリンの効果図４に示したノーザンブロット解析の定量。酵母株は1mMコリン存在（C⁺）または不存在（C^-）でI⁺またはI^-培地中で増殖させた。RNA分析は「実施例」記載により実施した。TCM1プローブでのハイブリダイゼーションは負荷対照として行った。定量はAMBIS 4000ホスホイメージャー(phosphoimager)で行った。データは、I^-C^-条件下37℃で野生型（wt）で見られた発現の割合として表わした。 37 ℃へ変換したsec14^tscki1株におけるINO1誘導の反応速度論。INO1誘導の反応速度を研究するために、INO1 lacZレポーター構造を実施例記載のようにして使用した。この構造はINO1制御を研究するために使用した４株に形質転換され、そしてそれらの株につき種々の増殖条件下でβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。レポーター構造が天然INO1転写に類似したように制御されていることを確かめるために（図７；表V）、中対数期に増殖した細胞中のβ−ガラクトシダーゼの発現を最初に研究した（表VI下）。sec14^tsCKI1株は37℃で増殖せず、それゆえ、４株中３株、即ち、野生型、SEC14cki1およびsec14^tscki1、を37℃で試験した。 INO1 lacZ構造の全体の発現パターン（表VI）は、ノーザンブロット解析により測定した天然INO1転写体の発現に非常に類似していた（表V、図７）。25℃および30℃において、全４株は、sec14^tsCKI1株は抑制条件下で（I⁺培地）やや高レベルのβ−ガラクトシダーゼを有する以外は、野生型に比較し得るイノシトールに応じたβ−ガラクトシダーゼ制御を示した。37℃において、野生型およびSEC1 4cki1株は制御の正常パターンを示した；即ち、イノシトールに反応したINO1 la cZの抑制、これに対しsec14^tscki1株は37℃でINO1 lacZの誤制御を示す（表VI）。37℃におけるI^-培地でのOpi^-表現型およびINO1転写体のノーザンブロット解析により得られた結果に一致して（表V、図７）、sec14^tscki1株は、その野生型およびSEC14cki1対照物よりも約２倍高いβ−ガラクトシダーゼのレベルを発現した。また、37℃におけるI⁺培地でのノーザンブロット解析に一致して（表V）、単に約２倍のINO1 1acZレポーター構造の抑制がsec14^tscki1株において観察された（表VI）。 INO1プロモーター断片の制御下にlacZ遺伝子を含むレポーター構造を使用して、INO1抑制解除の反応速度論を調べた。25℃で、試験した全３株（野生型、sec1 4^tsCKI1、sec14^tscki1）は、I⁺培地からI^-培地に転換したときINO1 lacZ構造の急速な抑制解除を示した（データはsec14^tscki1のみ示す；図８B）。野生型株は 25℃のI⁺培地から37℃のI^-培地に変換したとき抑制解除の類似のパターンが示された（図８H）。これら各株において、培養が定常期に近づくとβ−ガラクトシダーゼ活性がプラトーになることは、細胞が定常期に入るとINO1発現が抑制されることが知られている、およびそのときに、予期されるように、新しいβ−ガラクトシダーゼ発現が停止していることを示唆している。このことは、Lamping，E .，et al.，Genetics 137:55(1995);Griac，P.，et al.，NATO ASI Series:Mole cular Dynamics of Biological Membranes （Op den Kamp，J.A.F.，ed.）Vol ．H 96 ，pp．339-346，Spinger-Verlag，Berlin/Heiderberg（1966）；and Jiranek ，V.，et al.，J ．Bacteriol．（投稿中）(1997)、本開示は参照することによりここにとり入れられている、により記載されている。 25℃のI⁺培地から37℃のI^-培地に転換すると、sec14^tscki1株のINO1 lacZ構造は、I^-培地に変換された他の株よりも、急速に抑制解除を示した（図８D）。37 ℃でのI^-に変換した野生型（または25℃でI⁺からI^-に変換した３株のいずれか）と違って、37℃でsec14^tscki1株におけるINO1 lacZ構造の抑制解除は定常期までよく続いた。25℃のI⁺培地から37℃のI⁺培地に変換したsec14^tscki1株は、また、β−ガラクトシダーゼの抑制解除を示した。I⁺培地において、25℃から37℃に変換したsec14^tscki1株のINO1 lacZ構造の初期抑制解除は細胞が37℃でI^-培地に変換したときよりも速くない。しかし、37℃において、I⁺培地においてさえも、 INO1構造の抑制解除はsec14^tscki1細胞が定常状態になった後まで続いた。sec14^ts CKI1株は37℃に変換すると５ないし６時間後増殖が止まった（図８Eおよび８F ）。しかし、これらの条件下で、INO1 lacZ構造はI^-培地において比較し得る条件下で増殖する野生型株をしのぐレベルまで抑制解除された（図８Ｆ［sec14^tsC KI1］と図８H［野生型］を比較）。I⁺培地において25℃から37℃に変換したとき、INO1 lacZ構造の抑制解除は、sec14^tsCKI1株において見られなかった（図８E ）。表VI β−ガラクトシダーゼ活性により測定されたINO1遺伝子発現に対するイノシトールおよび温度の効果「実施例」に記載したように、種々の酵母株をプラスミドpJH359で形質転換した。酵母株は指示された温度で増殖の中対数期までI⁺またはI^-培地において増殖させ、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。ここに示したデータは個個の形質転換体に使用した３実験の平均±標準偏差で表わす。 IV．考察野生型酵母細胞を使用した研究では、Angus，W.W.，et al．(1972)により記載されたように、ほんの少しのPC代謝回転しか検出されなかった。これらの初期の研究に一致して、³²Pおよび¹⁴Cを使用した野生型酵母におけるPC代謝回転の解析は、多くのPC代謝回転のほんの少しの証拠しか明らかにしていなかった（図４、５および６）。CDPコリン経路における突然変異を保持する細胞において、PC代謝回転により遊離したコリンの再利用が大きく遮断されている条件下でリン脂質の代謝を検討することが可能である。実質的なPC代謝回転を検出し、そしてこの過程により遊離されるコリンが増殖培地中に出現する（図４および５）というこれらの状況下で、平板測定により容易に検出される表現型（Opc^-）が提供される（図３）。PC代謝回転の程度は野生型に類似すること、しかし野生型細胞における代謝回転により遊離されるコリンはCDPコリン経路を経てPCに直ちに再取込みされると信じられている。それゆえ、cki1（cct1またはcpt1）遺伝子背景は酵母においてPC代謝回転の範囲を探索する独特な機会を提供する。コリン排出表現型は、酵母においてまず初めに、コリン不存在で増殖する細胞におけるCDPコリン経路での活性の程度を予測する手段を提供する。最近の研究によると、この経路は、McMaster，C.R.，et al．(1994);McDonough，V.M.，et al．(1995);and McGee，T.P.，et al．（1994）により記載されたように、外因性コリンの不存在においてさえも、PC生合成に実質的に貢献している、ことが示唆されていた。本発明はこの仮説を実証するものである。代謝回転により遊離されるコリンの再利用はコリン不存在での増殖する酵母細胞においてCDPコリン経路の主要機能であろう。37℃でSEC14 cki1株により排出されるコリンに基いて（図４および５）、細胞コリンのおよそ７％がPC代謝回転を経てリサイクルされ、そして各世代期間（約３時間）において再合成されることが予測されている。この事は、しかしながら、過小評価されていると信じられる、と言うのは、先ず第一に¹⁴Cコリンで細胞を標識する作用によって証明されているように、cki1細胞は遊離コリンを再使用する力を保持しているからである。それにもかかわらず、コリン排出平板測定と表現型（Opc^-）を使用して、異なった増殖条件下で、異なった株におけるPC代謝回転の程度の定量的比較を実行することが可能である。例えば、SEC14cki1株において、コリン排出環の程度は温度およびイノシトールの存在により影響されることが観察されている（図３、表２）。酵母におけるPC代謝回転の性質。cki1保持株の増殖培地に見出される遊離コリンはほとんど遊離コリンおよびホスファチジン酸（PA）を産生するホスホリパーゼD（PLD）仲介PC代謝回転から生じるものと信じられる。PLD仲介加水分解は、E xton，J.H.，Biochim ．Biophys．Acta 1212:26(1994)によって記載されているように種々の哺乳類細胞型においてPC分解の主要経路であることが認められた。増殖培地に検出されるSEC14 cki1株により排出される¹⁴Cコリンの大部分は遊離コリンであった（図５）。これは、Lee，K.S.，et al.，J ．Biol．Chem．269:1972 5（1994）により報告されているように、グリセロホスホコリンを産生するホスホリパーゼB（PLB）仲介代謝回転は、遊離コリンよりも矛盾しない。コリンリン酸およびヂアシルグリセロール（DAG）を産生するホスホリパーゼC（PL C）仲介代謝回転は、cki1変異体により排出される遊離コリンについては容易に説明することができない。更に、PC代謝回転が加速して、sec14^tscki1変異体が限定された温度に上昇されるとき、PLD機構を経てコリン排出の増加をもたらすと信じられている。この仮説に一致して、37℃でsec14^tscki1株の培地中に出現する¹⁴C標識は大部分は遊離コリンであり、そしてコリンのこのプールの生成はPCからの標識の損失に比例することが見出された（図４および５）。37℃において、sec14^tscki1株は３時間内、あるいは１世代時間、にPC関連¹⁴Cコリン標識の50％以上を失う（図４および５）。cki1株は、対照的に、これと同じ時間でPC関連標識の約7％を失う。 PC代謝回転がPLD仲介経路を経ておこると、PAの１分子が、産生された遊離コリンの全ての分子につき、生成し、そして関連する³²P標識は脂質分画から失われない（図１）。PLDを経由してリサイクルされる脂質関連³²P標識はPAプールに再入して、中間体としてCDP-DG、PS、およびPEを使用するPEメチル化経路を経て PCの再形成に導かれる一連の反応に直接再使用することができる。リサイクルした、標識PAは、図１に示すように、経路のCDP-DG分岐点を経て、PIの前駆体として作用することができる。図６に示す研究において、標識培地から分離した後３ないし６時間の野生型およびSEC14 cki1細胞における種々の脂質内の³²Pからの標識の分布は総³²Pがクロロホルム可溶性プールからゆっくりと失われることを示している。37℃で世代当りPCに関連する¹⁴Cコリン標識の50％またはそれ以上を失うsec14^tscki1細胞においてさえも、³²Pは総脂質プールから非常にゆっくりと失われる。これらの結果は、上記に考察したように、PLD仲介機構を経て生じる主な代謝回転に一致している。これらの観察は、Angus，W.W.，et al．(1972) により記載されているように、野生型酵母細胞の標識研究において、なぜ実質的なPC代謝回転が前以て検出されないかを説明している。PLD仲介代謝回転とは逆に、リン脂質代謝回転のPLCおよびPLB仲介経路は、コリンリン酸およびグリセロホスホコリンのような水溶性産物に³²P標識が回るからクロロホルム可溶性プールから³²Pの消失を導くものと予想されている（図１）。本データは、それゆえ、酵母細胞におけるPC代謝回転の大部分はPLD仲介機構を経て実行されていることを示唆している。 ³²Pは37℃でsec14^tscki1変異体中の総脂質からほんのゆっくりと失われるので、追跡した６時間の間の³²P分布のパターンは25℃で同じ株、あるいは37℃でSEC 14cki1を含む他のいずれの株において観察したのとは、厳密には異なっていた。 37℃でsec14^tscki1株においては、PIのPCに対する比率は代謝回転実験の開始時では高く、他の株とは異なって、この比率は実験が進行するにつれて増加した。 sec14^tscki1株で37℃では、³²P標識はPIに蓄積する傾向を示し、そして、スフィンゴ脂質を含む「他」の群においては（図６）、パターンはPLD仲介機構を経て上昇した代謝回転と一致した。各時間PCはPLD仲介代謝回転における基質として作用し、PC仲介³²PはPAとしてリサイクルし、そしてPIを経過する可能性を有し、スフィンゴ脂質に入る。PI中に脂質関連³²Pおよびイノシトール含有スフィンゴ脂質の蓄積は、従って、PCの上昇したPLD仲介代謝回転の予期された結果である。標識蓄積のこのパターンは、大量のイノシトールが、以下に考察するように、INO1遺伝子の抑制解除により、外因性起源あるいは内因性合成のいづれかによって、存在するとき、さらに強調される。 sec14^ts 表現型の抑制におけるPC代謝回転の役割。抑制的な温度に昇温されたs ec14^tsCKI1株において、PCの加速された代謝回転が致死の原因であるとは信じられない。sec14^tscki1株は機能的SEC14遺伝子産物が欠けていても37℃で非常によく増殖し、そして大きく増加したPC代謝回転を呈する（図４および５）。実際、大量の進行しつつあるPC代謝回転に直面すると、この株は野生型およびSEC14cki 1株に比較し得る倍加時間を有する。cki1損傷は、加速された代謝回転に次いでP Cの再合成が予防されるので個々の温度で精密にSec14pの不活化による致死性を抑制する、ことが提案された。Sec14pは、合成の極部位から、多分McGee，T.P． et al．(1994)により記載されたようにゴルジにおいて、CDPコリン経路を経て合成されるPCの脱離に必要であると思われる。もしPCがSec14pの作用により脱離されないなら、そのPLDを経る代謝回転率は、図４にみられるように、明らかに増加する。そのような状況において、CDPコリン経路が遮断されていないとき、sec 14^tsCKI1株において、PCは直ちに再合成され、無駄なサイクルをつくる。INO1 遺伝子の制御におけるPC代謝回転の役割。イノシトールの存在下であっても、sec14^tscki1株を37℃（図８cおよび８D）に変換した後急速に生じるINO1遺伝子の抑制解除は、Sec14pが不活化されたとき生じるPC代謝回転の速度の増加に直接関係し、そして原因となるものである、と信じられている。Paltauf，F.，e t al．（1992）and Henry，S.A.，Molecular Bio1ogy of the Yeast Saccharomy ces:Metabolism and Gene Expression （Strathern，J.N.，et al．eds.）Vol ．2 ，pp．101-158，2vols.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor ，NY(1982)，本開示は参照することによりここに取り入れられている、により報告されているように、PCとイノシトール代謝の間に関連がある。最近の研究により、抑制的な温度にsec14^tscki1株をおくと、PCの代謝回転が増加し、INO1の抑制解除のシグナルが発生することが示された。抑制的温度に変換してみられる、INO1の抑制解除は、著しく急速な反応速度論的現象を示し（図８）またPC代謝回転の増加に関連している。Griac，P.，et al．（1996）による以前の研究において、酵母株がPEメチル化における突然変異とPC生合成のCDPコリン経路の組み合わせを含んで採用された。その研究において、PC生合成のいずれかの経路における単一の代謝物でINO1の抑制／抑制解除に対するシグナルの産生に関連するものはないことが証明された。INO1抑制／抑制解除におけるそれらの役割について以前試験された代謝条件は相対的PC含量および遊離コリン利用性を含んでいた。それらの因子のいずれもがINO1抑制解除に関連しなかった。むしろ、INO1制御を調節する代謝シグナルは、Griac，P.，et al．(1996)により報告されたように、細胞増殖を促進するPC生合成を増加させる総能力につながって出現するものと思われる。ここにあげられたデータはINO1抑制解除はPC代謝回転に相関していることを示唆している。INO1抑制解除はまた、増加したPC代謝回転により産生されたリン脂質代謝における全体の変更過程において生起した代謝シグナルに応じて生じるものと信じられる。本発明は、例示のために詳細に記述したが、そのような詳細記述はこの目的のためであり、変形が当業者によって、本請求の範囲により限定される場合を除き発明の精神および範囲から離れることなく、なされ得ることが理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者グリアク，ピータースロバキア国，ブラティスラバ，バビロボバ１ (72)発明者コールウェイン，ゼップ，ディ. オーストリア国，グラツ，カーネリガッセ 12

Claims

【特許請求の範囲】１．コリンおよびイノシトール、コリンおよびイノシトール代謝物、ならびにコリンおよびイノシトール含有リン脂質を酵母において増加させた製造方法であって、該酵母においてホスファチジルコリン（PC）の代謝回転を増加させる工程を含む方法。２．該増加させる工程は：該酵母のSEC14遺伝子において突然変異、および該酵母のケネディ経路の少なくとも１つの遺伝子において突然変異を有する酵母株を培養し；該コリンおよびイノシトール、コリンおよびイノシトール代謝物、ならびにコリンおよびイノシトール含有リン脂質を回収することを含む請求項１記載の方法。３．該SEC14遺伝子中の該変異がsec14^tsである請求項２記載の方法。４．該酵母のケネディー経路の少なくとも１つの遺伝子における該突然変異が CKI1、CCT1、およびCPT1からなる群から選択されたものである請求項２記載の方法。５．該酵母株が非許容温度で培養される請求項３記載の方法。６．該酵母がSaccharomyces cerevisiae型である請求項２記載の方法。７．該株がsec14^tscki1である請求項３記載の方法。８．該株がsec14^tscct1である請求項３記載の方法。９．該株がsec14^tsctp1である請求項３記載の方法。 10．酵母において、ホスファチジルコリンの代謝回転およびINO1遺伝子の抑制解除を同時に促進する方法であって：該酵母のSEC14遺伝子における突然変異および該酵母のケネディー経路の遺伝子における突然変異を内部にもつ酵母株を培養することを含む方法。 11．該SEC14遺伝子における該突然変異がsec14^tsである請求項１０記載の方法。 12．ケネディー経路の該遺伝子における突然変異がCKI1、CCT1およびCPT1からなる群から選択されたものである請求項１０記載の方法。 13．該酵母株が非許容温度で培養される請求項１１記載の方法。 14．該酵母がSaccharomyces cerevisiae型である請求項１０記載の方法。 15．該株がsec14^tscki1である請求項１１記載の方法。 16．該株がsec14^tscct1である請求項１１記載の方法。 17．該株がsec14^tsctp1である請求項１１記載の方法。 18．酵母で遊離コリンを製造する方法において：該酵母のSEC14遺伝子の突然変異および該酵母のCKI1遺伝子の突然変異を内部にもつ酵母株を培養することを含む上記方法。 19．該酵母株がsec14^tscki1である請求項１８記載の方法。 20．該酵母株が非許容温度で培養される請求項１９記載の方法。 21．該酵母株がSaccharomyces cerevisiae型である請求項１８記載の方法。 22．遊離コリンおよびコリンリン酸（C-P）を酵母で製造する方法であって：該酵母のSEC14遺伝子の突然変異およびCCT1遺伝子の突然変異を内部にもつ酵母株を培養することを含む方法。 23．該酵母株がsec14^tscct1である請求項２２記載の方法。 24．該酵母株が非許容温度で培養される請求項２３記載の方法。 25．該酵母がSaccharomyces cerevisiae型である請求項２２記載の方法。 26．酵母において遊離コリン、コリンリン酸（C-P）およびシチジンニリン酸コリン（CDP-C）を製造する方法であって： SEC14遺伝子の突然変異およびCPT1遺伝子の突然変異を内部にもつ酵母株を培養することを含む方法。 27．該酵母株がsec14^tscpt1である請求項２６記載の方法。 28．該酵母株が非許容温度で培養される請求項２７記載の方法。 29．該酵母株がSaccharomyces cerevisiae型である請求項２６記載の方法。 30．酵母におけるin vivoでのホスファチジルコリンのホスホリパーゼD仲介代謝回転を検出する方法であって、コリン排出を測定することを含む方法。 31．該測定がコリン栄養要求株を使用する平板測定である請求項３０記載の方法。 32．該コリン栄養要求株がcho2opi3である請求項３１記載の方法。 33．平板上で増殖する酵母におけるホスファチジルコリン（PC）代謝回転からコリン排出を検出する平板測定法であって：該酵母で該平板上においたコリン栄養要求株の増殖を可視化することにより該酵母株のコリン排出を検出することを含む平板測定法。 34．該コリン栄養要求株がcho2opi3である請求項３３記載の方法。