JP2000509968A - Peptide ligand of urokinase receptor - Google Patents

Peptide ligand of urokinase receptor

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Abstract

(57)【要約】 uPARに結合し、そしてインテグリンおよびビトロネクチンの結合を阻害し得る新規ペプチドが記載される。また、新規ペプチドをコードする核酸配列も提供される。低分子、他のペプチド、または本発明のペプチドの拮抗機能を模倣するペプトイドをスクリーニングするための方法が記載される。本発明は、uPAおよびuPARのアップレギュレーションによって特徴づけられる障害、ならびにガンおよび慢性的炎症、細胞移動またはuPAR:インテグリン結合相互作用を処置するための治療法の設計における適用、ならびにこれらの障害に対する診断的適用を有する。   (57) [Summary] Novel peptides are described that bind to uPAR and can inhibit the binding of integrins and vitronectin. Also provided are nucleic acid sequences encoding the novel peptides. Methods for screening for small molecules, other peptides, or peptoids that mimic the antagonistic function of the peptides of the invention are described. The present invention relates to disorders characterized by up-regulation of uPA and uPAR, as well as applications in the design of therapeutics to treat cancer and chronic inflammation, cell migration or uPAR: integrin binding interactions, and diagnostics for these disorders Have a strategic application.

Description

【発明の詳細な説明】 ウロキナーゼレセプターのペプチドリガンド発明の分野 本発明は、ウロキナーゼのレセプター結合領域の存在下での、ウロキナーゼレ セプター上の新規な機能的部位の同定に関する。本明細書中には、部位を同定す るバクテリオファージ提示(display)に由来するペプチド、およびバクテリオフ ァージ提示を用いて、タンパク質上の機能部位を同定するための一般的方法が記 載される。また、ウロキーナーゼ：ウロキナーゼレセプター複合体とのビトロネ クチンおよびインテグリン相互作用の研究のために、ウロキナーゼレセプターの 機能部位を使用する方法が記載される。また、ビトロネクチンおよびインテグリ ンペプチドのウロキナーゼ：ウロキナーゼレセプター複合体との相互作用を拮抗 し得る治療的分子を開発するための本発明のペプチドの使用もまた記載される。発明の背景 ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(uPA)は、その細胞表面レセプ ター(uPAR)と相互作用するセリンプロテアーゼであり、これは誘導性の局在化し た細胞表面タンパク質分解活性を提供し、それにより細胞侵襲を促進する。uPA: uPAR複合体はプラスミノーゲンをプラスミンへ変換する。プラスミンは、Ellis ら，J．Biol．Chem.264:2185-2188(1989)，Vassiliら，J.Clin．Invest．88:106 7-1072(1991),および,MignattiおよびRifkin，Physiol．Rev．73:161-195(1993) によって記載されるように、種々のマトリックス糖タンパク質を分解することが 知られている。uPAとそのレセプターの同時発現は、正常細胞および腫瘍細胞の 指向された細胞移動の間に、局在化プラスミノーゲン活性化および細胞周囲マト リックスの分解に関連づけられてきた。 ウロキナーゼレセプター(uPAR)は、ウロキナーゼおよびビトロネクチンの283 アミノ酸グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーレセプタータン パク質であり、PloughおよびEllis，FEBS Lett．349:163-168(1994)、ならびにR oldanら，EMBO J.9:467-474(1990)に記載のように、90アミノ酸ドメインの３つ 組(triplication)であるようである。uPARのタンパク質分解は、Ploughら，J．B iol．Chem．268:17539-17546(1993)およびKiefferら，Biochem．33:4471-4482(1 994)に記載のように、ドメイン１およびドメイン2-3から構成されるフラグメン トを生成し得、続く分析は、ドメイン１のジスルフィド結合パターンが完全にド メインの内部であることを示した。 細胞の移動および侵襲は、細胞表面局在のタンパク質分解および細胞外マトリ ックスの特定の成分への接着を必要とするようである。これらのプロセスは、Fa zioliら，Trends Pharmacol．Sci．15:25-29(1994),およびMignattiら，Physiol ．Rev．73:161-195(1993)に記載のように、組織の再構築、胚移植、血管形成、 ならびに腫瘍細胞の侵襲および転移を含む、多くの正常のまたは病理学的プロセ スに必要である。細胞表面タンパク質分解および細胞接着カスケードの重要な成 分は、Felding-Habermannら，Curr．Biol．5 864-868(1993)に記載のように、プ ラスミノーゲンアクチベーター／プラスミン系、マトリックス金属プロテアーゼ 、およびインテグリンである。細胞外マトリックス成分であるビトロネクチンへ の接着は、Waltzら，J．Biol．Chem．269:14746-14750(1994),およびCiambrone ら，J．Biol．Chem．267:13617-13622(1992)に記載のように、UPAR発現と相関す ることが報告され、そしてuPA結合部位およびビトロネクチンレセプターは、HT1 080細胞に共存していることが示されている。より最近では、Weiら，J．Biol．C hem．269:32380-32388(1994)に記載のように、uPARは、uPAに依存した様式で、 ビトロネクチンの細胞接着レセプターとして機能し得ることが実証された。 Ploughら，Biochem．3:8991-8997(1994)に記載のように、化学的架橋を用いた 初期の実験は、uPARの最初のドメインが、uPAの高親和性結合に十分であること を示唆したが、続く研究はインタクトな３ドメイン分子が必要であり、そしてド メイン２および３にさらなる結合決定基が含まれるようであることを示した。未 決定の相互作用は、uPAのEGF様ドメインとの相互作用であるか、またはドメイン １の高次構造に影響する間接的な相互作用であり得る。前の研究は、ドメイン２ および３がuPAに対する測定可能な親和性を有するかどうかを識別することにお いて、成功しなかった。なぜなら、Ploughら，Biochem．3:8991-8997(1994)に 記載のように、微量の全長uPARからドメイン２および３を分離することが困難だ ったからである。 uPA:uPAR系は、細胞周囲のタンパク質分解を促進するとして同定されており、 そしてuPARに起因し得る機能として細胞移動、接着、および有糸分裂誘発が含ま れる。それゆえ、uPARのドメイン２および３の機能の解明が望まれる。発明の要旨 本発明の第１の実施態様は、 (a)以下を提供し、 (1)潜在的リガンドのライブラリー、 (2)標的ポリペプチドに対する公知のリガンドと接触している標的ポリペプ チド、 (b)潜在的リガンドのライブラリーと共に、標的ポリペプチドおよび公知のリ ガンドとを接触させ、そして (c)公知のリガンドの存在下で標的ポリペプチドと結合し、標的ポリペプチド および公知のリガンドとの結合対を形成する、潜在的リガンドを同定する、 ことにより、標的ポリペプチド配列のオーファン結合部位を同定する方法である 。 本発明の別の実施態様は、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレセ プター(uPAR)と結合し、uPARとインテグリンとの結合を阻害する単離されたペプ チドである。単離されたペプチドはYHXLXXGYMYT（配列番号５）またはAESTYHHLS LGYMYTLN（配列番号４）であり得る。 本発明の別の実施態様は、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(uPA R)と結合し、uPARとビトロネクチンとの結合を阻害する単離されたペプチドであ る。単離されたペプチドは、AEPVYQYELDSYLRSYY（配列番号１）、AEFFKLGPNGYVY LHSA（配列番号２）、またはAELDLSTFYDIQYLLRT（配列番号３）、またはFKLXXXG YVYL（配列番号６）であり得る。 本発明のさらに別の実施態様は、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベータ ーレセプター(uPAR)と結合し、uPARとインテグリンとの結合を阻害するペプチド をコードする単離された核酸配列である。単離された核酸配列は、アミノ酸配列 YHXLXXGYMYT（配列番号５）またはSTYHHLSLGYMYTLN（配列番号４）をコードし得 る。 本発明のなお別の実施態様は、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター レセプター(uPAR)と結合し、uPARとビトロネクチンとの結合を阻害するペプチド をコードする単離された核酸配列である。単離された核酸配列は、アミノ酸配列 AEPVYQYELDSYLRSYY（配列番号１）、またはFFKLGPNGYVYLHSA（配列番号２）、ま たはAELDLSTFYDIQYLLRT（配列番号３）、またはFKLXXXGYVYL（配列番号６）をコ ードし得る。 本発明のさらに別の実施態様は、uPAおよびuPARのアップレギュレーションに よって特徴づけられる障害を持つ患者を、uPAR:インテグリン結合対のアンタゴ ニストの有効量を提供し、そしてその患者にアンタゴニストを投与することによ って処置する方法である。 本発明のさらなる実施態様は、uPAR:インテグリン相互作用のペプチドアンタ ゴニストを提供する工程、uPARへの結合のための候補アンタゴニストと、そのペ プチドアンタゴニストとを競合させる工程、およびuPAR結合に対するペプチドア ンタゴニストとの競合能により候補アンタゴニストを同定する工程を包含する、 uPAR:インテグリン相互作用のアンタゴニストをスクリーニングする方法である 。 本発明のなおさらなる実施態様は、ちようど記載した方法により同定されたuP AR:インテグリン相互作用の低分子アンタゴニスト、その方法により同定されたu PAR:インテグリン相互作用のペプチドアンタゴニスト、および同じ方法により同 定されたuPAR:インテグリン相互作用のペプトイドアンタゴニストである。 本発明の別の実施態様は、uPAR:インテグリン結合対のアンタゴニストの有効 量および薬学的に受容可能なキャリアを含む、uPAおよびuPARのアップレギュレ ーションによって特徴づけられる障害を処置するための薬学的組成物である。 本発明のなお別の実施態様は、uPAR:インテグリン結合対のペプチドアンタゴ ニストをコードする有効量の核酸、およびそのペプチドを患者内で発現させるの に適した薬学的に受容可能なキャリアを含む、uPAおよびuPARのアップレギュレ ーションによって特徴づけられる障害を有する患者を処置するための薬学的組成 物である。図面の簡単な説明 図１。UPA1-48は、sUPARがビトロネクチンに結合するのに必要である。種々の 濃度のuPA1-48を、ビトロネクチンでコートされたウェル中で、ビオチン化sUPAR とインキュベートし、そしてビトロネクチン結合sUPARを実施例に記載されたよ うに検出した。それぞれの決定は、２つ組で行い、結果はsUPARとuPA1-48を合わ せたサンプルの450nmでの平均吸光度からsUPAR単独のサンプルの平均吸光度（約 0.03）を引いたものとして報告する。 図２。sUPARのビトロネクチンへの結合に対する、種々のペプチドリガンドの 効果。sUPAR/ビトロネクチン相互作用に対する指示したペプチドの効果を、ペプ チドを図１のようにuPA1-48存在下でビトロネクチンでコートされたウェル中で 、ビオチン化sUPARとインキュベートすることによって決定した。全てのペプチ ドを、アッセイのためにPBS/2% BSAで指示された濃度に希釈する前に、100% DMS O中で可溶化した。コントロールのサンプルは、suPARプラス20nM UPA1-48および sUPAR単独を含んでいた。試験されたペプチドは、クローン７、クローン7S（ス クランブル化(scrambled)クローン７）、クローン18、クローン25、クローン20 、クローン20A（14位がLからAへ置換）、およびuPA 13-32 C19Aであった。結果 を、３つ組の点の平均OD450値として報告する。エラーバーは、シンボルより少 ないものは示していない。 図３。ペプチド７および18は、ビトロネクチンのソマトメジンＢドメインと相 同である。ソマトメジンＢドメインおよびRGDモチーフを含むビトロネクチンの 残基1-47からの配列を、クローン７およびクローン18の配列と比較する。ビトロ ネクチンおよびバクテリオファージ由来ペプチドの22-28位の相同性残基を、ビ トロネクチンのRGD配列のように太字で示す。 図４。ペプチド７のアラニン置換は、UPARに対するバクテリオファージおよび ビトロネクチンの両方の結合に影響を及ぼす。材料および方法に記載し、そして パネルAに示したように、40μＭの合成ペプチドを、バクテリオファージ７のビ オチン化suPARへの結合に対する競合物として試験した。上記に記載のように、 バクテリオファージを、ウサギ抗M13抗体により検出した。示された値は、３つ 組 の決定の平均である。同じペプチドを、uPA１-48:uPAR:ビトロネクチン結合ELIS Aにおいて、50μＭで３つ組で試験した。 図５。バクテリオファージのsUPARドメイン2/3への結合。ファージを、そのプ ロテインＧを介したエピトープタグおよびそのエピトープタグに対するモノクロ ナル抗体により固定化されたsUPARドメイン2/3を含むウェルへ添加した。プロテ インＧおよび抗体を含むがドメイン2/3を含まないウェルを、非特異的ファージ 結合の決定のために含ませた。尿素溶出ファージおよび投入(input)ストックは 、プラーク形成アッセイによって力価測定した。結果は、投入力価のパーセント として計算した単一点決定であり、３つの別々の実験において繰り返された。 図６：表。図６の表は、選択されたファージペプチドについてのuPAR結合アッ セイにおける、配列、ファージの収率、およびIC50を示す。好ましい実施態様の詳細な説明 本明細書に記載の本発明は、これまでに刊行された研究および係属中の特許出 願を参考にする。例えば、このような研究は、科学論文、特許、または係属中の 特許出願からなる。本明細書で引用されるこのようなすべての刊行された研究は 、参照として本明細書に援用される。本発明は、本明細書に援用される以下の定 義によってより十分に理解され得る。定義 本明細書で使用される場合、用語「オーファン結合部位」とは、別のペプチド またはポリペプチド配列に結合し得るポリペプチド配列上のこれまでに同定され ていない部位をいう。オーファン結合部位は、天然のリガンドが公知である結合 部位とは区別され得る。本発明のオーファン結合部位は、標的ポリペプチド上の 部位に結合し得るペプチド配列のファージ提示によって見出される。結合部位は 、例えば、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレセプター（uPAR）が 、他のリガンドまたはポリペプチド（例えば、ビトロネクチンおよびインテグリ ンなど）を結合する以外に、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター（uP A）を結合する場合、第３または第４のさらなるポリペプチドの結合を含み得る 。 本明細書で使用される場合、用語「オーファンポリペプチド」とは、オーファ ン結合部位で結合し得るポリペプチド配列をいう。オーファンポリペプチドは、 例えば、オーファン結合部位を決定するためにファージ提示スクリーニングで使 用されるペプチドであり得、またはオーファン結合部位に結合する天然または合 成分子のポリペプチド配列であり得、そしてオーファン結合部位の位置を決定す るために使用されるペプチドと配列が相同である。 本発明で使用される場合、用語「潜在的リガンド」とは、標的ポリペプチドに 潜在的に結合し得る任意のペプチド、ポリヌクレオチド、多糖、または他の分子 をいう。 本発明で使用される場合、用語「潜在的リガンドライブラリー」とは、上で定 義したような潜在的リガンドである少なくとも50の化合物のコレクションまたは 混合物をいい、そしてより好ましくは、潜在的リガンドライブラリーは、少なく とも200の潜在的リガンド化合物であり、そしてさらにより好ましくは500を越え る化合物である。 本明細書で使用される場合、用語「未知のリガンド」とは、未だ発見されてい ないが、本発明の方法によって発見され得る標識ポリペプチドのリガンドをいう 。潜在的リガンドが標的ポリペプチドを結合し、そしてこれまでに未知のリガン ドの結合に拮抗し得る場合、未知のリガンドの同定および存在は、標的ポリペプ チドを結合する潜在的リガンドの構造分析によって、または結合がアンタゴニス トによって破壊されていることを示す機能的変化によってのいずれかで決定され 得る。未知のリガンドはまた、オーファン結合部位で標的ポリペプチドに結合し た潜在的リガンドとの競合アッセイで、天然に存在する配列を含むポリペプチド のライブラリーをスクリーニングすることによって決定され得る。 本明細書で使用される場合、用語「バクテリオファージライブラリー」とは、 提示のためにバクテリオファージの表面で発現されるペプチドのライブラリーを 作成しそして潜在的標的ポリペプチドを接触させる、分子生物学における技術を いう。ライブラリーは、ペプチドとして発現可能でありそしてバクテリオファー ジによって提示されるポリヌクレオチドであり、そしてこの技術によって使用ま たは生成されるDNAまたはアミノ酸部分であり得る。バクテリオファージパンニ ングまたは提示は、標的ポリペプチドのリガンドについてのスクリーニングのた めに本明細書に記載のような適用を有し、これはまた、同定された場合、標的ポ リペプチド上のオーファン結合部位を同定する。 本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」および用語「ポリペプチド」と は、分子生物学、生化学、または遺伝子治療の技術を使用してヒトによって操作 された環境で、インビボまたはインビトロで産生されたペプチドまたはポリペプ チドをいう。例えば、単離されたペプチドまたはポリペプチドは、自動化ペプチ ドまたはポリペプチド合成による無細胞系において、ペプチドまたはポリペプチ ドをコードする核酸配列および宿主細胞での発現のための調節配列で形質転換さ れた異種宿主細胞において、およびペプチドまたはポリペプチドのコード配列が 動物での発現のために導入されている動物において、産生され得る。本明細書の 目的のために、天然の産物として細胞の内部に天然状態で存在しない程度まで、 ペプチドまたはポリペプチドを単離した。例えば、このような単離されたポリペ プチドまたはポリヌクレオチドは、10％純粋、20％純粋、またはより高度な純度 であり得る。 ペプチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドに関して本明細書で使用さ れる場合、用語「誘導体」とは、誘導体であるペプチド、ポリペプチド、または ポリヌクレオチドの機能性を保持するペプチド、ポリペプチド、またはポリヌク レオチドを意味する。これらは、例えば、基礎になる核酸分子の部位特異的変異 による、アミノ酸欠失、置換、挿入、または逆位によって種々に改変され得る。 ペプチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドの誘導体はまた、そのフラグ メントであり得る。いかなる場合も、誘導体またはフラグメントは、それが由来 するペプチドまたはポリペプチドの機能の少なくともいくつか、および好ましく はすべてを保持する。 用語「薬学的組成物」とは、治療薬剤の投与のための組成物をいう。治療薬剤 は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、低分子、ペプトイド 、またはこれらの任意の誘導体であり得、そして組成物を受ける個体に有害な抗 体の産生をそれ自体が誘導しない任意の薬学的キャリアをいい、そしてこれは過 度の毒性なしに投与され得る。 本発明の治療薬剤の投与は、本発明の薬剤の治療的有効量の投与を含む。本明 細書で使用される場合、用語「治療的有効量」とは、本発明の組成物の投与によ って処置可能な症状を処置または予防するために十分な治療薬剤の量をいう。こ の量は、検出可能な治療、予防、または回復効果を示すために十分な量である。 この効果は、例えば、本明細書に挙げる症状の治療または予防を含み得る。被験 体への正確な有効量は、被験体のサイズおよび健康、処置されるべき症状の性質 および範囲、処置する医者の推奨、ならびに投与について選択された治療剤また は治療剤の組み合わせに依存する。従って、予め正確な有効量を特定することは 有用ではない。しかし、所定の状況の有効量は、日常的実験によって決定され得 る。投与はポリペプチドの投与を含み、そしてポリペプチドをコードするポリヌ クレオチドの投与によって、動物においてポリペプチドを発現させ得る。 本明細書において「組換えベクター」とは、本発明の細胞中のポリヌクレオチ ドの輸送または発現のための任意のベクターをいい、例えば、ウイルスベクター 、非ウイルスベクター、プラスミドベクター、ならびに異種宿主および発現系の 調節配列に由来するベクターを含む。 本明細書において「調節配列」とは、遺伝子配列の発現に影響を及ぼすかまた は変化を起こし得る１つ以上のエレメントをコードする核酸配列をいい、遺伝子 配列がその制御を受けるような位置に配置される場合、その転写または翻訳を含 む。このような調節配列は、例えば、最小プロモーター配列、完全プロモーター 配列、誘導された活性プロモーター、エンハンサー配列、上流活性化配列（「UA S」）、オペレーター配列、下流終結配列、ポリアデニル化配列、翻訳の開始を 最適にするための最適5'リーダー配列、またはシャイン−ダルガーノ配列であり 得る。あるいは、調節配列は、ハイブリッドエンハンサー／プロモーターエレメ ントのような、上記のいずれかのプロモーターのハイブリッドを含み得る。目的 の遺伝子の発現に適切な調節配列は、構築物が発現されるべき宿主系に依存して 異なる。本明細書での使用に適切な調節配列の選択は、当業者の能力の範囲内で ある。真核生物において、このような配列は、例えば、１つ以上のプロモーター 配列および／または転写終結配列を含み得る。本明細書での使用に適切な調節配 列は、原核生物供給源、真核生物供給源、ウイルス、ウイルスベクター、バクテ リオファージ、または直線状もしくは環状プラスミドを含む任意の供給源に由来 し得る。本明細書の調節配列はまた合成配列であり得、例えば、GADP/ADH2ハイ ブリッドプロモーターのような、１つの遺伝子のUASと別の遺伝子からの必須プ ロモーターの残りとを組み合わせることによって作成される配列である。調節配 列はまた、リプレッサー配列であり得る。 本明細書で使用される場合、「哺乳動物細胞」とは、宿主細胞として本発明で 有用な真核生物細胞のサブセットをいい、そしてヒト細胞、ならびにイヌ、ネコ 、ウシ、ウマ、ウサギ、マウス、ヤギ、ブタなど由来の細胞のような動物細胞を 含む。使用される細胞は、遺伝子改変されなくてもよく、あるいは、例えば、適 切な発現ベクター、マーカー遺伝子などでの形質転換によって遺伝子改変され得 る。本発明の方法に適切な哺乳動物細胞は、目的の遺伝子を発現し得る任意の哺 乳動物細胞、あるいはcDNAライブラリー、cRNAライブラリー、ゲノムDNAライブ ラリー、または本発明の方法に有用な任意のタンパク質もしくはポリペプチドを 発現し得る任意の哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞はまた、アメリカンタイプ カルチャーコレクション（ATCC）から入手可能な、不死化細胞株のような細胞株 由来の細胞を含む。このような細胞株には、例えば、ラット褐色細胞腫細胞（PC 12細胞）、胚性ガン細胞（P19細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞 、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞（COS）、ヒト肝 細胞ガン細胞（例えば、Hep G2）、ヒト胚腎臓細胞、マウスセルトリ細胞、イヌ 腎臓細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳腺ガ ン細胞などが挙げられる。また、造血幹細胞、神経球細胞のような神経幹細胞、 および胚幹細胞（ES細胞）も挙げられる。 本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸分子」「核酸 配列」、または「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列またはその相補鎖をコ ードするRNAまたはDNAのいずれかをいう。核酸分子はまた、機能的ペプチド（例 えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列またはリボザイム）をコードしても またはしなくてもよい、オリゴヌクレオチドプローブであり得る。 本明細書で使用される場合、用語「アナログ」とは、成熟タンパク質のスプラ イシング改変体、短縮型、改変体、対立遺伝子、および誘導体などをいう。他に 特に指示がなければ、「アナログ」は、「成熟タンパク質」の１つ以上の生物活 性を有し、またはペプチドの生物活性を有する。従って、ヒトまたは非ヒト供給 源のいずれに由来しても、成熟タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列と同一 であるか、あるいは少なくとも60％、好ましくは70％、より好ましくは80％、お よび最も好ましくは90％のアミノ酸配列相同性を含むペプチドまたはポリペプチ ドは、この定義の範囲内に含まれる。 本明細書における「改変体」は、アミノ酸置換、欠失、または挿入を含む。ア ミノ酸置換は保存的アミノ酸置換であり得るか、グリコシル化部位、リン酸化部 位、アセチル化部位を改変するため、または機能に必要ではない１つ以上のシス テイン残基の置換または欠失によってミスフォールディングを最小にするための ような、非必須アミノ酸残基を除去するための置換であり得る。保存的アミノ酸 置換は、置換されたアミノ酸の疎水性／親水性および／または立体嵩の一般的変 化を保存する置換であり、例えば、以下の基のメンバー間置換は保存的置換であ る：Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asn/Gln、Ser/Thr/Cys、および Phe/Trp/Tyr。本明細書におけるアナログは、タンパク質の生物活性を有するペ プトイドとしても公知である１つ以上のペプチド模倣物を有するペプチドをさら に含む。この定義の範囲内には、１つ以上のアナログアミノ酸（例えば、非天然 アミノ酸などを含む）を含むポリペプチド、置換された連結を有するポリペプチ ド、ならびに当該技術分野で公知の天然に存在するおよび天然に存在しない両方 の他の改変も含まれる。用語ポリペプチドもまた、例えば、グリコシル化、アセ チル化、リン酸化などの、ポリペプチドの発現後改変を排除しない。 用語「結合対」とは、分子の対をいい、通常はタンパク質／タンパク質対をい いうが、タンパク質／DNA対、またはタンパク質／RNA対、またはDNA／DNA対、DN A／RNA対、またはRNA／RNA対を排除せず、そしてタンパク質またはDNAまたはRNA に結合する低分子を含み得る。このような対の成分は、ランダムな分子よりも高 い親和性で互いに特異的に結合し、そのため、結合（例えば、リガンド／レセプ ター相互作用の場合）の際、結合対は、細胞性または細胞内応答を引き起こすか または複合体を形成する。リガンド／レセプター結合対の例は、PDGF（血小板由 来成長因子）とPDGFレセプターとの間で形成される対である。異なる結合対の例 は、抗原／抗体対であり、この抗体は抗原を有する宿主の免疫によって生成され る。有機分子−タンパク質結合対の例は、レチノイン酸と、そのタンパク質レセ プターであるレチノイン酸レセプターとの結合である。特異的結合は、低い解離 定数を有する結合相互作用を示し、これは非特異的なバックグラウンド結合と特 異的結合とを区別する。低い解離定数は、例えば、1.0μＭ、より好ましくは10n M、さらにより好ましくは1.0nMまたはそれ以下である。 本明細書で使用される場合、用語「アンタゴニスト」とは、例えば、レセプタ ーを結合し得るがレセプターによって細胞へ伝達されるべきシグナルを生じない 分子のような、検出可能な程度までシグナリングをブロックする分子をいう。ア ンタゴニストペプチドの場合、ペプチドアンタゴニストは、例えば、インテグリ ン結合部位でまたはその近くでuPARレセプターに結合し、そしてインテグリンが uPARとの結合対を形成することを阻止し得る。 本明細書で使用される場合、用語「アゴニスト」とは、例えば、レセプターに 結合し、そしてレセプターを介する細胞へのシグナル伝達を促進することによっ て、研究されている経路においてシグナリングを模倣する分子をいう。本発明の 場合、uPARのペプチドアンタゴニストのアゴニストは、uPAR:インテグリン結合 対の形成をブロックするためのペプチドアンタゴニストを模倣しまたはこれと競 合し得る。低分子またはペプトイドは、uPAR：インテグリン結合対相互作用のペ プチドアンタゴニストの同じまたは類似の機能を行う能力についてスクリーニン グされ得る。 本明細書で使用される場合、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレ セプター「uPAR」とは、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレセプタ ーをいう。uPARは、グリコシルホスファチジル-イノシトール結合したウロキナ ーゼおよびビトロネクチンレセプターである。uPARは、Blasiら，J．Cell．Biol ．104:801(1987)に記載のように、サイトカイン刺激または悪性形質転換の結果 として多くの細胞で発現される。 本明細書で使用される場合、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター「 uPA」とは、ウロキナーゼプラスミノーゲンを活性化し得るセリンプロテアーゼ をいう。その細胞表面レセプターuPARに結合した場合、uPAはプラスミノーゲ ンをプラスミンに変換する。 本明細書で使用される場合、「インテグリン」とは、細胞外マトリクスタンパ ク質への細胞接着を媒介することが公知であり、そして細胞能動性に重要な役割 を果たすことも公知である、細胞接着レセプターのインテグリンファミリーをい う。 本明細書で使用される場合、用語「細胞骨格疾患」とは、患者の少なくとも１ つの組織の細胞骨格における異常症状の形成によって、少なくとも一部を特徴づ けられ得る患者における疾患をいう。細胞骨格異常は、種々の症状に関連し得、 例えば、腫瘍増殖、転移性ガン、血管新生、創傷、および他の疾患を含む。 本明細書で使用される略号のいくつかは以下のとおりである：EGF、上皮増殖 因子；uPA、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター；uPA1-48、ウロキナ ーゼのアミノ酸１〜48；uPAR、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレ セプター；sUPAR、ウロキナーゼレセプターの可溶性の短縮形態；uPA13-32、Cys 19がAlaに変換されたヒトウロキナーゼのアミノ酸13〜32；PAI-1、プラスミノー ゲンアクチベーターインヒビター１型；ATF、uPAのアミノ末端フラグメント；HR P、西洋ワサビペルオキシダーゼ；PBS、リン酸緩衝化生理食塩水；BSA、ウシ血 清アルブミン。 本発明は、タンパク質上の新規な機能的部位を同定するためのバクテリオファ ージ提示の使用である。バクテリオファージ提示技術のこの新規な適用を使用し て、発明者らは、ヒトウロキナーゼのレセプター結合領域の存在でのヒトウロキ ナーゼレセプターに結合する新規なペプチド配列を同定し、そしてこのようにし て新規な機能的部位を同定した。 従って、同定されたペプチドは、ウロキナーゼレセプター上の２つの新しい機 能的部位を定義する。第１は、ウロキナーゼ：ウロキナーゼレセプター複合体の ビトロネクチンとの相互作用部位に対応し、そしてビトロネクチンのソマトメジ ンＢドメインとの相同性を示す部位である。第２の機能的部位は、ウロキナーゼ レセプターのインテグリンとのこれまでに予期されていない相互作用に関連し、 そしておそらくインテグリン：ウロキナーゼレセプター界面を定義する。この第 ２の部位の調節は、インテグリン活性／特異性の変化を導き得、そして細胞接着 および他のインテグリンが媒介する事象に影響を与える。 本発明は、uPAR：ビトロネクチン結合相互作用を阻害する３つのペプチドであ る、ペプチド７（配列番号１）、ペプチド９（配列番号２）、およびペプチド18 （配列番号３）、ならびにuPAR：ビトロネクチン相互作用を阻害するためのこれ らのペプチドの使用を包含する。ビトロネクチンは、Waltzら，J．Biol．Chem． 269:14746-14750(1994)に記載のように、uPARへの結合に関連している。Weiら， J．Biol．Chem．269:32380-32388(1994)に記載のように、ウロキナーゼレセプタ ーが、ビトロネクチンに対するuPA依存性接着レセプターであり得ることが示さ れている。Preissnerら，Annu．Rev．Cell Biol．7:275-310(1991)に記載のよう に、ビトロネクチンは、循環および細胞外マトリクスの両方の形態で存在する調 節ドメイン構造を有する複合糖タンパク質である。これは、Felding-Habermann ら，Curr．Biol．5，864-868(1993)に記載のように、α-vサブユニットを有する インテグリンを含む種々の細胞表面成分と、ならびにMimuroら，J．Biol．Chem ．264:936-939(1989)に記載のように、PAI-1の活性コンフォメーションと相互作 用する。この後者の相互作用は、Seiffertら，J．Biol．Chem．266:2824-2830(1 991)およびSeiffertら，J．Biol．Chem．269:2659-2666(1994)に記載のように、 ビトロネクチンのソマトメジンＢドメインを介するようである。より最近には、 Ciambroneら，J．Biol．Chem．267:13617-13622(1992)に記載のように、ビトロ ネクチンが、病巣接触で細胞外マトリクス中のuPAと同時に局在することが示さ れている。この現象の説明は、uPARが、ビトロネクチンに対する接着レセプター であるという実証によって提供され、この結合は、Weiら，J．Biol．Chem．269: 32380-32388(1994)に記載のようにuPAによって刺激される。 発明者らは、インビトロでuPA1-48：uPAR複合体のビトロネクチンへの結合を 阻害し、そしてU937細胞のビトロネクチンへの接着をブロックする、バクテリオ ファージ提示由来の15マーペプチドを見出した。これらのペプチドは、ビトロネ クチンのソマトメジンＢドメインとの相同性を示す。この相同性は、uPAR：uPA1 -48複合体およびPAI-1の結合部位が重複し得ることを示唆し、これは、PAI-1が これらの複合体のビトロネクチンへの結合について競合するという事実によって 示される。バクテリオファージ由来ペプチドおよびビトロネクチン配列の推定ア ライメントは、uPAR：uPA1-48複合体の結合が、uPAR結合部位のＣ末端から16ア ミノ酸のみ離れた残基45〜47で見られるRGD配列によって定義されるような、av インテグリンの結合部位に接近して生じることを示唆する。ビトロネクチン中の これらの結合部位の近接は、uPARとインテグリンとの間の協同相互作用の可能性 を示唆する。このような相互作用は、インテグリンビトロネクチンレセプターと の機能的カップリングを介するuPARのシグナリング能力についてのメカニズムを 提供し得、ここで、ビトロネクチンはuPARおよびインテグリンを架橋結合するた めに作用する。これは、GPI結合した必須の膜タンパク質がどのように細胞にシ グナルを伝達するかについての説明を提供する。 本発明はまた、ペプチド25（配列番号４）のようなuPAR：インテグリン部位の 例を示す特定のペプチドを包含する。クローン25は、異なる配列モチーフを示し 、そしてD23への等価結合に基づいて、suPAR上の独特の結合部位を同定する。uP ARとインテグリンとの間の結合対相互作用を阻害するために必要であるが十分で はないと発明者らが決定した配列モチーフは、GYZYであり、ここでZはMまたはV である。ペプチド25は、ウロキナーゼレセプターに結合し、そしてインテグリン 機能を調節することが示されている。ペプチド25の配列は、AESTYHHLSLGYMYTLN であり、ここで、アラニン置換によって、アミノ酸YHXLXXGYMYT（ここでXが任意 のアミノ酸である）は、インテグリンへのuPARの結合を阻害するために重要であ ることを決定した。 本発明のさらなる局面は、同じ活性を有する他の分子（例えば、低分子および ペプトイド）のアッセイの開発のためのリード化合物および手段としてのペプチ ド25の使用である。 Xueら，J．Immunol．152:4630-4640(1994)、Bohuslavら，J．Exp．Med．181:1 381-1390(1995)、Confortiら，Blood 83:994-1005(1994)、およびReinartzら，E xp．Cell Res．220:271-282(1995)に記載のように、他の研究者らは、uPARおよ び両方のb2インテグリン（特にMac-1、およびavb3およびavb5）が、細胞で同時 に局在するようであることを示した。しかし、これらのいずれの場合も、uPARと インテグリンとの間の潜在的生化学的相互作用を調べるための直接的プローブは 存在しなかった。 これまでの研究は、Goodsonら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:7129-7133(1 994)に記載のように、uPAR上のuPA結合部位に対する高い親和性のペプチドリガ ンドの選択が、比較的効果的なプロセスであることを実証した。発明者らは、St ratton-Thomasら，Prot．Eng．8:463-470(1995)に記載のように、uPA結合部位ペ プチドの選択を減少させるために、uPA（uPA1-48）の過剰の組換えEGF様ドメイ ンを含むことによって、uPAR上のさらなる機能的に重要な部位に対する親和性を 有するペプチド提示バクテリオファージについて選択することによって、この分 析を拡大した。EGF様ドメインは、レセプター結合モチーフであり、そしてuPAと 同様の親和性（0.1〜5nM）でuPARに結合する。Devlinら，Science 249:404-406( 1990)に記載のように、15マーランダムペプチドバクテリオファージライブラリ ーは、磁性ビーズに固定したsuPAR：uPA1-48複合体でアフィニティー選択された 。 uPAR：ビトロネクチン相互作用における種々のペプチドリガンドの効果を分析 するために、発明者らは、この相互作用についてのインビトロELLSAベースのア ッセイを開発した。アッセイの条件下で、ビオチン化したuPARのビトロネクチン への結合は、図１に示すように、uPA1-48に厳密に依存する。uPA1-48：suPAR複 合体のビトロネクチンへの明らかな化学量論的結合は、この相互作用の親和性が 複合体の濃度よりも高いこと（Kd＜20nM）を示す。 次いで、種々のバクテリオファージ由来ペプチドがuPA1-48：uPAR複合体のビ トロネクチンへの結合に影響を及ぼす能力を、ELISAアッセイで評価した。２つ のクラスのペプチドは、このアッセイで有効なアンタゴニストであった。第１に 、sUPARへのuPA１-48結合に直接的に競合するクローン20およびuPA13-32は、結 合を減少させる。非常に減少したレセプター結合活性を示すクローン20ペプチド のアナログは、ビトロネクチンへの結合に影響を与えなかった。第２に、uPA1-4 8結合に対して非常に減少した競合を示すクローン７および18（図６の表を参照 のこと）もまた複合体結合を阻害するが、クローン７のスクランブル化バージョ ン（クローン７と同じアミノ酸を有するが、異なる順序で）は阻害しない。単独 で試験した場合、どのペプチドもビオチン化sUPARのビトロネクチンへの結合を 増加させなかった。 バクテリオファージとしてsuPARに効果的に結合した第３のペプチドであるク ローン25は、uPA1-48刺激したビトロネクチン結合にほとんどまたは全く効果を 有さなかった。 クローン７および18ペプチドが、uPAR上のビトロネクチン結合部位に直接結合 し、そしてその部位に対する直接的競合によってuPAR：uPA1-48によるビトロネ クチン結合を阻害するかどうかを試験するために、発明者らは、これらのバクテ リオファージの結合におけるビトロネクチンの効果を検査した。ビトロネクチン は、uPA1-48：suPAR複合体へのバクテリオファージ結合を５〜10倍減少させ、こ れは、これらのペプチドがuPARリガンドとしてビトロネクチンを模倣するという 仮説に一致する。 これまでの結果は、Weiら，J．Biol．Chem．269:32380-32388(1994)に記載の ように、uPARによるビトロネクチン結合が、刺激されたU937細胞の細胞接着と相 互関係があることを示した。クローン７ペプチドがこれらの細胞のuPARが媒介す る接着をブロックし得るかどうかを次に試験し、その結果、クローン７はuPAR： ビトロネクチン相互作用の効果的ブロッカーであるが、一方同じペプチドのスク ランブル化バージョンは効果を示さなかった。 本発明者らは、uPA1-48:uPAR複合体のビトロネクチンへの結合がPAI-1、ビト ロネクチン、およびビトロネクチンのソマトメジンＢドメインによってブロック されることを示した。ビトロネクチンのもう１つの機能は、PAI-1の活性コンフ ォメーションを安定化させることであり、これは、Seiffertら，J．Biol．Chem ．269:2659-2666(1994)に記載のようにビトロネクチンのソマトメジンＢドメイ ンを介して生じるようである。PAI-1は、ビトロネクチンへのuPA1-48：suPAR複 合体結合の非常に効果的な競合物であり、10nMの見かけのIC50を有する。これは 、uPARおよびPAI-1の結合部位が重複していることを示唆した。Seiffertら，J． Biol．Chem．269:2659-2666(1994)に記載のように、活性PAI-1への高親和性ビト ロネクチン結合が主としてソマトメジンＢドメインを介することが示されてきた 。本発明者らは、ビトロネクチンおよび組換えソマトメジンＢドメインがまた、 ビトロネクチンへのuPAR結合を阻害するか否かを試験し、そして両方の分子が阻 害するが、ドメインの点変異によってその阻害を消失することを見いだした。 本発明者らは、PAI-1の結合部位である、ビトロネクチンのソマトメジンＢド メインに相同であるバクテリオファージペプチドを同定した。ビトロネクチンの ソマトメジンＢドメインはuPAR結合をブロックし、従って、本発明者らは、この ドメインに対する相同性について、バクテリオファージ由来のペプチド７および 18の配列を調べた。図４に示すように、ソマトメジンＢドメインの残基24-28と クローン７および18ペプチドとの間に、保存されたモチーフ、LXXArY（ここで、 Xは親水性残基であり、そしてAr＝F,Y）がある。さらに、クローン７および18は 、保存されたロイシンのすぐN-末端に配列E-D-Lを共有するが、関連する配列D-E -Lは、保存された配列LCSYYに隣接する残基22-24でビトロネクチンのソマトメジ ンＢドメインに見いだされる。 ペプチド７のどの残基がuPAR結合およびビトロネクチン結合の阻害に重要であ るかを決定するために、本発明者らは、各残基を別々にアラニンと置換し、そし てuPAへのバクテリオファージ結合の阻害、およびビトロネクチンへのuPA1-48： uPAR複合体の結合の妨害について、得られるペプチドを試験した。図５に示す結 果は、ペプチドとビトロネクチンとの間に保存される残基が、これらのアッセイ で活性に重要であることを示す。 さらに、本発明者らは、組換えuPARドメイン2-3フラグメントが、バクテリオ ファージを結合するが、uPA1-48は、結合しないとを決定した。uPARは、相同シ ステイン含有ドメインの３つの繰り返しを含むLy6/CD59ファミリーの唯一のメン バーである、Ploughら，FEBS Lett．349:163-168(1994)。本発明者らのこれまで の研究は、Weiら，J．Biol．Chem．269:32380-32388(1994)に記載のように、uPA R上のビトロネクチンに対する結合部位がドメイン２および３（D23）にあること を示唆する。この質問をさらに提出するために、本発明者らは、バキュロウイス ル感染したSf9昆虫細胞中でsuPARのフラグメント、残基93〜313を発現し、Ｃ末 端の６アミノ酸エピトープタグを有する第２および第３のCD59相同ドメインを含 むことを予測した。分泌されたタンパク質を、抗エピトープアフィニティーカラ ムで精製し、そしてsuPAR結合アッセイにおいて競合するその能力について最初 に試験した。同じ条件下で0.1nMのIC50を示すインタクトなsuPARとは反対に、10 0nM D23でこのアッセイでの競合がなかった。 次いで、本発明者らは、種々のリガンドを提示したuPARバクテリオファージの 固定化したD23に結合する能力を試験した。図６に示す結果は、リガンドがD23お よびsUPARへの結合に関して３つの異なるクラスに分かれることを示す。クロー ン20および13-32は、インタクトなsUPARにのみ顕著に結合するが、クローン９お よび25はD23フラグメントおよび全長レセプターに等価に結合する。クローン７ および18ペプチドを有するバクテリオファージは、中程度のD23への結合を示し 、そしてインタクトなレセプターへの実質的により良好な結合を示す。 インテグリンは、Dustinら，Nature 329:846(1987)およびShattilら，Curr．0 pin．Cell Biol．6:695(1994)に記載のように、細胞分化、移動、および生存に 重要な細胞輸送および細胞内シグナリング事象を調節する接着相互作用に関連す るヘテロダイマーレセプターのクラスである。インテグリンを介する細胞の接着 は、リガンド結合に加えて、Miyamotoら，Science 267:883(1995)およびBurridg eら，Annu．Rev．Cell Biol．4:487(1998)に記載のように、インテグリン分布の 再構築および細胞骨格にインテグリンを連結する連結エレメントの組み立てを必 要とする。β1インテグリンは、この点に関して広く研究されてきた。β1鎖の細 胞質テイルはテーリンおよびα-アクチンを結合し、これらはそれ自体が、Otey ら，J．Cell．Biol．111:721(1990)およびSchallerら，J．Cell．Biol．130:118 1(1988)に記載のように、アクチンと直接的に相互作用する。さらに、このよう な細胞骨格連結の組み立ては、厳密には細胞表面発現の結果ではないが、Faull ら，J．Cell．Biol．121:155(1993)、Masumotoら，J．Biol．Chem．268:228(199 3)、およびBurnら，Proc．Nat'l．Acad．Sci．U.S.A．85:497（1988）に記載の ように二次細胞シグナリングをしばしば必要とする。本発明を生じる実験的事象 の前に、インテグリンの機能的状態での動力学的変化を媒介するインテグリン関 連タンパク質は、ほとんど不確定のままであった。 本発明者らは、uPARの発現が、ビトロネクチンに対する接着性を与えるだけで なく、胎児性腎細胞(293細胞)のフィブロネクチンへのβ1-依存性接着を顕著に 減少させることを決定した。この研究は、293細胞でのuPARの発現が、インテグ リン依存性フィブロネクチンおよびコラーゲン接着性を改変したという基づいた 。ファージ提示ペプチドライブラリーを、uPAR結合ファージについてスクリーニ ン グした。多くのuPAR結合ペプチドは、Goodsonら，Proc．Nat'l．Acad．Sci．U.S .A．91:7129(1994)に記載されている。ペプチド25およびいくつかのコントロー ルを合成し、精製し、そして接着に対する効果についてスクリーニングした。ペ プチド25では、ビトロネクチンへの293細胞のグリコホスファチジルイノシトー ル（GPI）結合uPAR依存性接着を廃止し、約60μＭのIC50を有することを見いだ したが、コントロールでは見られなかった。ペプチド25は、接着をブロックする 濃度の約100μＭでβ1／カベオリン／uPAR複合体を大きく抑止したが、コントロ ールでは抑止されなかった。これらの観察は、細胞接着性を調節する細胞膜内の これまでに認識されていない機能的ユニットを同定する。このユニットは、GPI アンカーレセプター（uPAR）、インテグリン、およびカベオリン、ならびに細胞 骨格エレメントを含むβ1インテグリンおよびカベオリンの細胞質面と結合する ことが公知のおそらく他のタンパク質からなる。 uPARがインテグリンに結合するか否かを調べるために、トランスフェクトされ ていない293細胞を、組換え可溶性uPAR（suPAR）の存在下でフィブロネクチンま たはコラーゲンに接着させた。この結果は、suPARが用量依存様式でフィブロネ クチンおよびコラーゲンの接着を阻害し、そしてインヒビター効果が100μＭの ペプチド25の添加で可逆的であるが、コントロールではそうではなかったことを 示した。uPARが活性コンフォメーションであるインテグリンと相互作用し、そし てそうすることでインテグリン機能を顕著に改変すると結論した。ペプチド25（ 100μＭ）が、U937細胞株においてもう１つのインテグリンのMac-1とuPARとの間 の相互作用を無効にすることも示した。 細胞移動に対するuPAR／インテグリン相互作用の機能的結果を決定するための 研究もまた行われ、細胞移動を改変したという結果が、インテグリン依存性接着 性の消失を生じることによってuPARの存在で観察された。安定な細胞接着の消失 は、Huttenlocherら，Cell Biol．7:697(1995)、Burchillら，BioEssays 16:225 (1994)、およびLukashevら，J．Biol．Chem．26:18311(1994)に記載のように、 いくつかの実験的および臨床的状況での悪性形質転換、腫瘍細胞侵入、および転 移に関連している。 本発明は、炎症および腫瘍進行を改変することに使用するための、uPAR／イン テグリン結合を破壊し、そしてインテグリン機能を保存することが示されたペプ チド25によってプロトタイプにされる試薬、あるいは、例えば、uPAR：インテグ リン結合のインテグリン上の部位に対する抗体のような、インテグリン機能を損 なう可溶性uPARに匹敵する試薬の開発を含む。 ペプチド７および25によって代表されるような、本研究で選択されたsuPARに 結合する配列は、いくつかのラインの証拠に基づいて、異なる結合部位を有する 。第１に、これらのペプチドは、図６の表に示すように、uPA1-48結合に対する 競合物としてアニリノ-8-ナフタレンスルホネート（ANS）蛍光に対する種々の効 果を示す。第２に、ペプチド７のみがビトロネクチンへの複合体結合を阻害する 。第３に、バクテリオファージ25は、D23およびsuPARに等価な結合を示すが、７ はD23への約50倍減少した結合を示す。ペプチド18は、配列レベルで顕著な相同 性を示し、そして保存された残基が図５に示されるようにクローン７結合に重要 であるので、７と同じリガンドファミリーであるようである。特に、モチーフEL DおよびLxxArY中の確定された残基のすべては、アラニン置換によって判断され るように機能的に重要である。さらに、ペプチド18は、ペプチド７と同様にビト ロネクチンへの複合体の結合をブロックする。 本発明はまた、例えば、uPAR：ビトロネクチンまたはuPAR：インテグリン結合 相互作用の低分子またはペプトイドインヒビターを同定する目的で、本発明のペ プチド（例えば、ペプチド７およびペプチド25）の阻害活性の分子模倣物につい てのスクリーニングするための方法を包含する。uPAR相互作用のこのようなアン タゴニストは、例えば、ペプトイドのようなペプチド誘導体、低分子、またはポ リヌクレオチドであり得る。これらのアンタゴニストは、uPAR：ビトロネクチン 結合によって、あるいはuPAR：インテグリン結合によって、あるいはより一般的 には、細胞接着が損なわれるuPAおよびuPARのアップレギュレーションによって 特徴づけられる症状の処置のための治療剤の開発に有用である。本発明のペプチ ドおよびアンタゴニストは、uPAまたはuPARの生物学的活性によって引き起こさ れるかまたは悪化される病状または病気を処置することに有用であり得る。症状 はまた、例えば、腫瘍細胞侵入、転移性疾患のような疾患で見られるような、例 えば、細胞移動および侵入によって特徴づけられ得、そして症状はまた、慢性炎 症であり得る。 代表的には、本発明のペプチドの分子模倣物、ペプトイド、または低分子；あ るいは発明のアナログ、改変体、または誘導体は、huPARまたはhuPAR：インテグ リンの複合体もしくはビトロネクチンで、10μＭ未満；より好ましくは５μＭ未 満、さらにより好ましくは１μＭ未満；さらにより好ましくは100nＭ未満;さら により好ましくは10nＭ未満のKdを示す。 本発明の全長、誘導体、またはポリペプチドもしくはペプチドインヒビター、 またはアンタゴニストのいずれもが、標準的組換えDNAまたは化学的技法によっ て、クローニングされ得るか、発現され得るか、または合成され得る。これらの 目的に適用され得るいくつかの例示的発現系は以下のとおりである。本発明のペ プチド、ポリペプチド、およびポリヌクレオチド治療剤の投与は、合成されたペ プチドまたはポリペプチドの投与によって、あるいは動物での発現のためのポリ ヌクレオチドの投与によって、あるいは非コードポリヌクレオチドインヒビター の投与によって行われ得る。所望の活性についてのスクリーニングのための低分 子およびペプトイドライブラリープールを作製する方法も以下にさらに提供され る。ポリヌクレオチドまたは核酸分子によってコードされるポリペプチドまたは ペプチドを動物で発現する目的のために、本発明のポリヌクレオチドを患者に投 与するための遺伝子治療技術も提供される。さらに、例えば、リボザイムおよび アンチセンス分子のような非コード核酸分子は、適切な薬学的に受容可能なキャ リアとともに投与され得る。発現系 以下に記載の方法論は、当業者が本発明を実施し得るために十分な詳細を含む と考えられるが、プラスミドのような特に例示されていない他の項目は、例えば 、United States Dept．of HHS，NATIONAL INSTITUETE 0F HEALTH（NLH）GUIDEL INES F0R RECOMBINANT DNA RESEARCHに記載の現在の規定の下で、Sambrookら(19 89)，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，第2版(Cold Spring Harbor Pr ess，Cold Spring Harbor，N.Y.)、およびAusubelら，CURRENT PROTOCOLS IN MO LECULAR BIOLOGY(1994)，(Greene Publishing Associates and John Wiley & So ns，New York，N.Y.)に記載の標準的組換えDNA技法を使用して構築および精製さ れ得る。これらの参考文献は、以下の標準的方法についての手順を包含する：プ ラスミドを用いるクローニング手順、宿主細胞の形質転換、細胞培養、プラスミ ドDNA精製、DNAのフェノール抽出、DNAのエタノール沈殿、アガロースゲル電気 泳動、アガロースゲルからのDNAフラグメントの精製、ならびに制限エンドヌク レアーゼおよび他のDNA改変酵素反応。細菌細胞での発現 細菌での使用のための制御エレメントには、プロモーター（必要に応じてオペ レーター配列を含む）、およびリボソーム結合部位が含まれる。有用なプロモー ターには、ガラクトース、ラクトース（lac）、およびマルトースのような糖代 謝酵素に由来する配列が含まれる。さらなる例には、トリプトファン（trp）、 β-ラクタマーゼ（bla）プロモーター系、バクテリオファージλPL，およびT7の ような生合成酵素に由来するプロモーター配列が含まれる。さらに、tacプロモ ーターのような合成プロモーターが使用され得る。β-ラクタマーゼおよびラク トースプロモーター系は、Changら，Nature（1978）275:615、およびGoeddelら ，Nature（1979）281:544に記載される；アルカリホスファターゼ、トリプトフ ァン（trp）プロモーター系は、Goeddelら，Nucleic Acids Res．（1980）8:405 7およびEP 36,776に記載され、そしてtacプロモーターのようなハイブリッドプ ロモーターは、米国特許第4,551,433号およびde Boerら，Proc．Natl．Acad．Sc i．USA（1983）80:21-25に記載される。しかし、真核生物タンパク質の発現に有 用な他の公知の細菌プロモーターも適切である。当業者は、任意の必要とされる 制限部位を供給するリンカーまたはアダプターを使用して、例えば、Siebenlist ら，Cell（1980）20:269に記載のように、このようなプロモーターを目的のコー ド配列に作動可能に連結し得る。細菌系での使用のためのプロモーターはまた、 一般的には、標的ポリペプチドをコードするDNAに作動可能に連結されたShine-D algarno（SD）配列を含む。天然の標的ポリペプチドシグナル配列を認識および プロセスしない原核生物宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリ ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ipp、または熱安定性エンテロトキシンIIリ ーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換され得る。プラス ミドpBR322からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適切である。 上記の系は、Escherichia coliで特に適合性である。しかし、細菌宿主での使 用のための多くの他の系には、Bacillus spp.、Streptococcus spp.、Streptomy ces spp.のようなグラム陰性またはグラム陽性生物、P．aeruginosaのようなPse udomonas種、Salmonella typhimurium、またはSerratia marcescansが特に含ま れる。これらの宿主中へ外因性DNAを導入するための方法は、代表的には、CaCl2 、または二価カチオンおよびDMSOのような他の薬剤の使用を包含する。DNAはま た、Sambrookら(1989)，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，第2版(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)に一般的に記載のように、 エレクトロポレーション、核インジェクション、またはプロトプラスト融合によ って細菌細胞に導入され得る。これらの例は、限定よりもむしろ例示である。好 ましくは、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。ある いは、クローニングのインビトロ方法（例えば、PCRまたは他の核酸ポリメラー ゼ反応）が適切である。 本発明の標的ポリペプチドを産生するために使用される原核生物細胞は、Samb rookら(1989)，MOECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，第2版(Cold Spring H arbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)に一般的に記載されるように、適切な 培地中で培養される。酵母細胞での発現 染色体外レプリコンまたは組込みベクターのいずれかの、発現および形質転換 ベクターは、多くの酵母への形質転換について開発されている。例えば、発現ベ クターは、とりわけ、以下の酵母について開発されている：Hinnenら，Proc．Na tl．Acad．Sci．USA（1978）75:1929;Itoら，J．Bacteriol．（1983）153:163に 記載されるような、Saccharomyces cerevisiae；Kurtzら，Mol．Cell．Biol．（ 1986）6:142に記載のような、Candida albicans；Kunzeら，J．Basic Microbiol ．（1985）25:141に記載のような、Candida maltosa；Gleesonら，J．Gen．Micr obiol．（1986）132:3459およびRoggenkampら，Mol．Gen．Genet．（1986）20 2:302に記載のような、Hansenula polymorpha；Dasら，J．Bacteriol．（1984） 158:1165に記載のような、Kluyveromyces fragilis；De Louvencourtら，J．Bac teriol．（1983）154:737およびVan den Bergら，Bio/Technology（1990）8:135 に記載のような、Kluyveromyces lactis；Kunzeら，J．Basic Microbiol．（198 5）25:141に記載のような、Pichia guillerimondii；Creggら，Mol．Cell．Biol ．（1985）5:3376ならびに米国特許第4,837,148号および同第4,929,555号に記載 のような、Pichia pastoris；BeachおよびNurse，Nature（1981）300:706に記載 のような、Schizosaccharomyces pombe；およびDavidowら，Curr．Genet．（198 5）10:380およびGaillardinら，Curr．Genet．（1985）10:49に記載のような、Y arrowia lipolytica、Ballanceら，Biochem．Biophys．Res．Commun．（1983）1 12:284-289；Tilburnら，Gene（1983）26:205-221およびYeltonら，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA（1984）81:1470-1474に記載のようなA．nidulansならびにKel lyおよびHynes，EMBO J．（1985）4:475479に記載のようなA．nigerasなどのAsp ergillus宿主；EP 244,234に記載のような、Trichoderma reesia、ならびにWO 9 1/00357に記載のような、例えば、Neurospora、Penicilliium、Tolypocladiumな どの糸状菌類。 酵母ベクターについての制御配列は公知であり、そしてEP 284,044に記載のよ うなアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）、EP 329,203に記載のような、エノラ ーゼ、グルコキナーゼ、グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼ、グルタルア ルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPまたはGAPDH）、ヘキソキナー ゼ、ホスホフルクトキナーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、およびピルビン 酸キナーゼ（PyK）のような遺伝子からのプロモータ領域が含まれる。酸性ホス ファターゼをコードする酵母PHO5遺伝子はまた、Myanoharaら，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA（1983）80:1に記載のように、有用なプロモーター配列を提供する 。酵母宿主での使用に適切な他のプロモーター配列には、Hitzemanら，J．Biol ．Chem．（1980）255:2073に記載のような3-ホスホグリセレートキナーゼ、ある いはHessら，J．Adv．Enzyme Reg．（1968）7:149およびHollandら，Biochemist ry（1978）17:4900に記載のようなピルビン酸デカルボキシラーゼ、トリオース ホスフェートイソメラーゼ、およびホスホグルコースイソメラーゼのような他の 糖 分解酵素についてのプロモーターが含まれる。増殖条件によって制御される転写 のさらなる利点を有する誘導性酵母プロモーターには、上記のリストからのもの 、ならびに、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスフ ァターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデ ヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース 利用に寄与する酵素についての他のプロモーター領域が含まれる。酵母発現での 使用に適切なベクターおよびプロモーターは、Hitzeman，EP 073,657にさらに記 載される。酵母エンハンサーもまた酵母プロモーターとともに有利に使用される 。さらに、天然に存在しない合成プロモーターも、酵母プロモーターとして機能 する。例えば、１つの酵母プロモーターの上流活性化配列（UAS）は、別の酵母 プロモーターの転写活性化領域と連結し得、合成ハイブリッドプロモーターを生 じる。このようなハイブリッドプロモーターの例には、米国特許第4,876,197号 および同第4,880,734号に記載のように、GAP転写活性化領域に連結したADH調節 配列が含まれる。ハイブリッドプロモーターの他の例には、EP 164,556に記載の ようにGAPまたはPyKのような解糖系酵素遺伝子の転写活性化領域と合わせて、AD H2、GAL4、GAL10、またはPHO5遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモータ ーが含まれる。さらに、酵母プロモーターは、酵母RNAポリメラーゼおよび転写 開始を結合する能力を有する非酵母起源の天然に存在するプロモーターを含み得 る。 酵母発現ベクターに含まれ得る他の制御エレメントは、例えば、Hollandら，J ．Biol．Chem．（1981）256:1385に記載のようなGAPDHからおよびエノラーゼ遺 伝子からのターミネーター、ならびに分泌についてのシグナル配列をコードする リーダー配列である。適切なシグナル配列をコードするDNAは、EP 012,873およ びJP 62,096,086に記載のような酵母インベルターゼ遺伝子ならびに米国特許第4 ,588,684号、同第4,546,083号、および同第4,870,008号；EP 324,274；およびWO 89/02463に記載のようなa-因子遺伝子のような、分泌される酵母タンパク質に ついての遺伝子に由来し得る。あるいは、インターフェロンリーダーのような非 酵母起源のリーダーもまた、EP 060,057に記載のように、酵母での分泌について 提供される。 酵母宿主に外因性DNAを導入する方法は当該分野で周知であり、そして代表的 には、アルカリカチオンで処理したスフェロプラストまたはインタクトの酵母細 胞のいずれかの形質転換を含む。 酵母への形質転換は、Van Solingenら，J．Bact．（1977）130:946およびHsia oら，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）(1979)76:3829に記載の方法に従って行わ れ得る。しかし、核インジェクション、エレクトロポレーション、またはプロト プラスト融合によるような細胞へDNAを導入するための他の方法または、Sambroo kら，前出に一般的に記載されるように使用され得る。 酵母分泌については、天然の標的ポリペプチドシグナル配列は、酵母インベル ターゼ、α-因子、または酸性5-ホスファターゼリーダーによって置換され得る 。２μプラスミド起源由来の複製起点は酵母に適切である。酵母での使用に適切 な選択遺伝子は、Kingsmanら，Gene（1979）7:141またはTschemperら，Gene（19 80）10:157に記載される酵母プラスミドに存在するtrp1遺伝子である。trp1遺伝 子は、トリプトファンで増殖する能力を欠く酵母の変異株についての選択マーカ ーを提供する。同様に、Leu2-欠失酵母株（ATCC20,622または38,626）は、Leu2 遺伝子を有する公知のプラスミドによって補足される。 酵母における本発明の細胞内産生について、酵母タンパク質をコードする配列 は、発現に際して、酵母細胞によって細胞内で切断され得る融合タンパク質を産 生するために、ポリペプチドのコード配列に連結され得る。このような酵母リー ダー配列の一例は、酵母ユビキチン遺伝子である。昆虫細胞での発現 バキュロウイルス発現ベクター（BEV）は、組換え昆虫ウイルスであり、ここ で、発現されるべき外来遺伝子についてのコード配列は、SmithおよびSummers， 米国特許第4,745,051号に記載のように、ウイルス遺伝子（例えば、ポリヘドリ ン）のかわりにバキュロウイルスプロモーターの後ろに挿入される。 本明細書における発現構築物には、昆虫細胞系の感染または形質転換に対して 中間体として有用なDNAベクターが含まれ、ベクターは、一般的に、バキュロウ イルス転写プロモーターをコードするDNAを含み、必要に応じてであるが好まし くは、所望のタンパク質の分泌を指向可能な昆虫シグナルDNA配列、および外来 タンパク質をコードする外来遺伝子の挿入のための部位が下流に続き、このシグ ナルDNA配列および外来遺伝子は、バキュロウイルスプロモーターの転写制御下 に置かれ、この外来遺伝子は、本明細書においてポリペプチドのコード配列であ る。 本明細書での使用のためのプロモーターは、一般的に昆虫に感染する500を越 えるバキュロウイルス（例えば、Autographo californica MNPV、Bombyx mori N PV、rrichoplusia ni MNPV、Rachlplusia ou MNPV、またはGalleria mellonella MNPVのウイルスDNAを含むがこれらに限定されない、Orders Lepidoptera、Dipt era、Orthoptera、Coleoptera、およびHymenoptera）のいずれかに由来するバキ ュロウイルス転写プロモーター領域であり得る。したがって、バキュロウイルス 転写プロモーターは、例えば、バキュロウイルス前初期遺伝子IEIまたはIENプロ モーター；39Kおよび後初期遺伝子を含むHindIIIフラグメントからなる群より選 択されるバキュロウイルス後初期遺伝子プロモーター領域と組み合わせた前初期 遺伝子；またはバキュロウイルス後期遺伝子プロモーターであり得る。前初期ま たは後初期プロモーターは、転写エンハンサーエレメントとともに増強され得る 。 Friesenら（1986）「The Regulation of Baculovirus Gene Expression」:THE M OLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES(W.Doerfler編)；EP 127,839およびEP 155, 476に記載のようなDNAインサートの高レベルの発現を指向するバキュロウイルス の強ポリヘドリンプロモーター；ならびにVlakら，J．Gen．Virol．（1988）69: 765-776に記載のようなp10タンパク質をコードする遺伝子からのプロモーターが 、本明細書における使用に特に適切である。 本発明での使用のためのプラスミドは、Millerら、Ann．Rev．Microbiol．（1 988）42:177に記載されるようなポリヘドリンポリアデニル化シグナル、ならび にE．Coliにおける選択および増殖のための原核生物アンピシリン耐性（amp）遺 伝子および複製起点もまた含有する。適切なシグナル配列をコードするDNAもま た含有され得、それらは一般に、Carbonellら、Gene（1988）73:409に記載され るようなバキュロウイルスポリヘドリン遺伝子のような、分泌された昆虫または バキュロウイルスのタンパク質についての遺伝子、ならびに、以下をコードする 遺伝子に由来するような哺乳動物シグナル配列に由来し得る：Maedaら、Nature （1 985）315:592-594に記載されるようなヒトa-インターフェロン；Lebacq-Verheyd enら、Mol．Cell．Biol．（1988）8:3129に記載されるようなヒトガストリン放 出ペプチド；Smithら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1985）82:8404に記載され るようなヒトIL-2；Miyajimaら、Gene（1987）58:273に記載されるようなマウス IL-3；および、Martinら、DNA（1988）7:99に記載されるようなヒトグルコセレ ブロシダーゼ。 多数のバキュロウイルス株および変異体、ならびにSpodoptera frugiperda（ ケムシ）、Aedes aegypti（カ）、Aedes albopictus（カ）、Drosophila melano gaster（ミバエ）、およびBombyx mori宿主細胞のような宿主由来の対応する許 容昆虫宿主細胞が同定されており、本発明で使用され得る。例えば、Luckowら、 Bio/Technology（1988）6:47-55、Millerら、GENETIC ENGINEERING（Setlow，J ．K.ら編）第８巻（Plenum Publishing，1986）277-279頁、およびMaedaら、Nat ure（1985）315:592-594の記載を参照のこと。種々のこのようなウイルス株は公 的に入手可能であり、例えば、Autographa californica NPVのL-1変異体およびB ombyx mori NPVのBm-5株である。このようなウイルスは、Spodoptera frugiperd a細胞のような宿主細胞のトランスフェクションのためのウイルスとして使用さ れ得る。 ポリヘドリンプロモーターに加えて他のバキュロウイルス遺伝子もまた、バキ ュロウイルス発現系において有利に使用され得る。これらは、それらが発現され る間のウイルス感染期に従って、即時初期（α）、遅延初期（β）、後期（γ） 、または極後期（δ）を含む。これらの遺伝子の発現は、おそらく転写調節の「 カスケード」機構の結果として、連続して生じる。従って、即時初期遺伝子は、 他のウイルス機能の非存在下で感染後直ちに発現され、そして１つ以上の得られ た遺伝子産物が、遅延初期遺伝子の転写を誘導する。次いで、いくつかの遅延遺 伝子産物が後期遺伝子転写を誘導し、そして最終的に、極後期遺伝子が、前に発 現された遺伝子産物の制御下で、１つ以上のより早いクラスから発現される。こ の調節カスケードの１つの比較的よく規定された成分はIEIであり、これはAutog rapho californica核ポリヘドロシスウイルス（AcMNPV）の好ましい即時初期遺 伝子である。IEIは、他のウイルス機能の非存在下で発現され、GuarinoおよびSu mm ers，J．Virol．（1986）57:563-571およびJ．Virol．（1987）61:2091-2099に 記載されるような好ましい39K遺伝子を含む、遅延初期クラスのいくつかの遺伝 子、ならびにGuannoおよびSummers，Virol．（1988）162:444-451に記載される ような後期遺伝子の転写を促進する産物をコードする。 上記のような即時初期遺伝子は、遅延初期カテゴリーのバキュロウイルス遺伝 子プロモーター領域と組み合わせて使用され得る。即時初期遺伝子には類似せず 、このような遅延初期遺伝子は、他のウイルス遺伝子または即時初期遺伝子の産 物のような遺伝子産物の存在を必要とする。39Kのようないくつかの遅延初期遺 伝子プロモーター領域の任意のもの、またはバキュロウイルスゲノムのHindIII 上に見出される遅延初期遺伝子プロモーターの１つと、即時初期遺伝子の組み合 わせが作製され得る。この例では、39Kプロモーター領域は、上記で引用のL.A． GuarinoおよびSummers(1986a)；GuarinoおよびSummers（1986b）J．Virol．(198 6)60:215-223、およびGuarinoら(1986c)J．Virol．（1986）60:224-229に記載さ れるような、IEIの存在によって発現がさらに制御され得るように、発現される べき外来遺伝子に連結され得る。 さらに、即時初期遺伝子と遅延初期遺伝子プロモーター領域との組み合わせが 使用される場合には、異種遺伝子発現の促進は、遅延初期遺伝子プロモーター領 域との直接cis連結におけるエンハンサー配列の存在によって、達成され得る。 このようなエンハンサー配列は、即時初期遺伝子またはその産物が制限される状 況で、遅延初期遺伝子発現の促進によって特徴づけられる。例えば、hr5エンハ ンサー配列は、遅延初期遺伝子プロモーター領域、39Kに直接cis連結され得、そ れにより、GuarinoおよびSummers(1986a)、(1986b)、およびGuarinoら(1986)に 記載されるような、クローン化異種DNA発現を促進する。 ポリヘドリン遺伝子は、極後期遺伝子に分類される。従って、ポリヘドリンプ ロモーターからの転写は、未知であるがおそらく多数の他のウイルスおよび細胞 遺伝子産物の前の発現を必要とする。ポリヘドリンプロモーターのこの遅延発現 に起因して、例えば米国特許第4,745,051号にてSmithおよびSemmersによって記 載される例示的なBEV系のような、最新技術BEVが、ウイルスゲノムの残りからの 遺伝子発現の結果としてのみ、そしてウイルス感染がよく進行した後のみに、外 来遺伝子を発現する。これは、現存するBEVの使用に対する制限を示す。新たに 合成されたタンパク質をプロセスする宿主細胞の能力は、バキュロウイルス感染 の進行に伴って減少する。従って、ポリヘドロンプロモーターからの遺伝子発現 は、新たに合成されたタンパク質をプロセスする宿主細胞の能力が、ヒト組織プ ラスミノーゲン活性化物質のような特定タンパク質に対して潜在的に減少する場 合に生じる。結果的に、BEV系での分泌糖タンパク質の発現は、クローン化遺伝 子産物の不完全分泌に起因して複雑であり、それにより、細胞内のクローン化遺 伝子産物を、不完全プロセス型で捕捉する。 昆虫シグナル配列が、切断されて成熟タンパク質を産生し得る外来タンパク質 を発現するために使用され得ることが認識されてきたが、本発明は、好ましくは 、発現される遺伝子に適切な哺乳動物シグナル配列によって実施される。 本発明に適切な例示的な昆虫シグナル配列は、Lepidopteran脂肪動態ホルモン （AKH）ペプチドをコードする配列である。AKHファミリーは、昆虫におけるエネ ルギー基質動員および代謝を調節する、ショートブロックニューロペプチドから なる。好ましい実施態様では、Lepidopteran Manduca sexta AKHシグナルペプチ ドをコードするDNA配列が使用され得る。Orthoptera Schistocerca gregaria遺 伝子座に由来するペプチドのような、他の昆虫AKHシグナルペプチドもまた有利 に使用され得る。他の例示的な昆虫シグナル配列は、CP1，CP2、CP3、またはCP4 のようなDrosophila角質タンパク質をコードする配列である。 現在、外来遺伝子をAcNPVへ導入するために本発明において使用され得る、最 も一般的に使用される移入ベクターは、pAc373である。当業者に周知である他の 多数のベクターもまた、本発明において使用され得る。バキュロウイルス/昆虫 細胞発現系のための材料および方法は、Invitrogen（San Diego CA）（「MaxBac 」キット）のような会社から、キット形態で市販されている。本発明で利用され る方法は、一般に当業者に周知であり、SummersおよびSmith，A MANUAL OF METH ODS FOR BACULOVIRUS VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PROCEDURES，Texas Ag ricultural Experiment Station Bulletin No.1555，Texas A&M University(198 7)；Smithら、Mol．Cell．Biol．(1983)3:2156、およびLuckowおよびSummers(19 89)に十分に記載されている。これらは、例えば、ポリヘドリン開始コドン をATGからATTに変化させ、そしてLuckowおよびSummers，Virology(1989)17:31に 記載されるように、ATTから32塩基対下流のBamHIクローニング部位を導入する、 pVL985の使用を包含する。 従って、例えば、本発明のポリペプチドの昆虫細胞発現のために、所望のDNA 配列が、公知の技術を用いて、移入ベクター中へ挿入され得る。昆虫細胞宿主は 、野生型バキュロウイルスのゲノムDNAと共に挿入される所望のDNAを含有する移 入ベクターで、通常は共トランスフェクションによって共トランスフェクトされ 得る。ベクターおよびウイルスゲノムは、容易に同定および精製され得る、組換 えウイルスをもたらすように組み換えられ得る。封入された組換えウイルスが、 昆虫宿主細胞を感染して所望のポリペプチドを発現するために、使用され得る。 本発明に適用される他の方法は、昆虫細胞培養、共トランスフェクション、お よびプラスミド調製の標準的な方法であり、これらは前記で引用のSummersおよ びSmith（1987）に記載されている。これらの参考文献は、AcMNPV移入ベクター 中への遺伝子のクローン化、プラスミドDNAの単離、AcmMNPVゲノムへの遺伝子ト ランスファー、ウイルスDNA精製、組換えタンパク質の放射標識、および昆虫細 胞培養培地の調製の標準的な方法もまた記載する。ウイルスおよび細胞の培養手 順は、VolkmanおよびSummers，J．Virol．(1975)19:820-832、およびNolkmanら 、J．Virol．（1976）19:820-832に記載されている。 哺乳動物細胞での発現 本発明のポリペプチドの哺乳動物細胞発現の代表的なプロモーターは、とりわ け、SV40初期プロモーター、CMVプロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモー ター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ad MLP）、および単純ヘルペスウ イルスプロモーターを含む。マウスメタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター のような、他の非ウイルスプロモーターもまた、哺乳動物構築物中での使用が見 出される。哺乳動物発現は、プロモーターに依存して構成的または調節的（誘導 的）のいずれかであり得る。代表的には、転写終結およびポリアデニル化配列は また、翻訳終止コドンの3’末端に存在する。好ましくは、翻訳開始を最適化す るための配列もまた、ポリペプチドをコードする配列の5'末端に位置して存在す る。 転写終結/ポリアデニル化シグナルの例は、前に引用のSambrookら（1989）に記 載されるようなSV40由来のシグナルを含む。スプライスドナーおよびアクセプタ ー部位を含有するイントロンもまた、本発明の構築物中に設計され得る。 エンハンサーエレメントもまた、哺乳動物構築物の発現レベルを増大するため に、使用され得る。その例は、Dijkemaら、EMBO J．(1985)4:761に記載されるよ うな、SV40初期遺伝子エンハンサー、ならびにGormanら、Proc.Natl．Acad．Sci ．USA（1982b）79:6777に記載されるようなラウス肉腫ウイルスの末端反復配列 （LTR）に由来する、およびBoshartら、Cell（1985）41:521に記載されるような ヒトサイトメガロウイルスに由来するエンハンサー/プロモーターを含む。シグ ナルペプチドをコードする配列を含むリーダー配列もまた、哺乳動物細胞におい て外来タンパク質の分泌を提供するために、存在し得る。好ましくは、リーダー 配列がインビボまたはインビトロのいずれかで切断され得るように、リーダーフ ラグメントと目的遺伝子との間にコードされるプロセッシング部位が存在する。 アデノウイルス三部構成(tripartite)リーダーは、哺乳動物細胞において外来タ ンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。 一旦完成されると、哺乳動物発現ベクターは、数種の咄乳動物細胞の任意のも のを形質転換するために使用され得る。異種ポリヌクレオチドの哺乳動物細胞へ の導入方法は、当該分野で公知であり、デキストラン媒介トランスフェクション 、リン酸カルシウム沈澱、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラス ト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム中へのカプセ ル化、およびDNAの核への直接マイクロインジェクションを包含する。哺乳動物 細胞宿主系形質転換の一般的な局面は、米国特許第4,399,216号においてAxelに よって記載されている。 本発明で応答細胞または産生細胞として使用される哺乳動物宿主細胞は、種々 の培地において培養され得る。Ham's F10（Sigma）、最小必須培地（[MEM]、Sig ma）、RPMI-1640（Sigma）、およびダルベッコ改変イーグル培地（[DMEM]、Sigm a）のような市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Hamお よびWallace，Meth．Enz．(1979)58:44、BarnesおよびSato，Anal．Biochem．(1 980)102:255、米国特許第4,767,704号、同第4,657,866号、同第4,927,762号、ま たは同第4,560,655号、WO 90/103430号、WO 87/00195号、およびU.S．RE 30,985 号に記載される任意の培地が、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。 これらの培地の任意のものが、本発明の方法に従って細胞機能についての最適条 件を作製するために必要に応じて補充され得、これには、ホルモンおよび/また は他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子 ）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩 ）、緩衝液（例えば、HEPES）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミ ジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシンTMM薬剤）、微量元素（通常は、マ イクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、およびグルコ ースまたは等価なエネルギー源の範囲の必要に応じた補充が含まれる。任意の他 の必要な補充物もまた、当業者に周知である適切な濃度で含有され得る。温度、 pHなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用した条 件であり、当業者には明らかである。 本発明の構築物を送達するための遺伝子治療ストラテジーは、インビボまたは エキソビボ様式においてウイルスベクターまたは非ウイルスベクターのアプロー チを利用し得る。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーター または異種プロモーターを使用して、誘導され得る。インビボでのコード配列の 発現は、構成的または調節的のいずれかであり得る。 ウイルスベクターを使用する送達のために、Jolly，Cancer Gene Therapy 1:5 1-64(1994)に記載されるような、多数のウイルスベクターの任意のものが使用さ れ得る。例えば、コード配列は、Kimuraら、Human Gene Therapy(1994)5:845-85 2に記載されるようなレトロウイルスベクターにおける発現用、Connellyら、Hum an Gene Therapy(1995)6:185-193に記載されるようなアデノウイルスベクターに おける発現用、Kaplittら、Nature Genetics(1994)6:148-153に記載されるよう なアデノ随伴ウイルスベクターにおける発現用、およびシンドビスベクターでの 発現用に設計されたプラスミド中へ、挿入され得る。これらのベクターによる使 用に適切なプロモーターは、モロニーレトロウイルスLTR、CMVプロモーター、お よびマウスアルブミンプロモーターを含む。複製不全でないウイルスが産生され 得、そして動物またはヒトに直接的に注射され得るか、またはZatloukalら、P roc．Natl．Acad．Sci．USA(1994)91:5148-5152に記載されるようなエキソビボ での自己細胞の形質導入に続くインビボ注射によって、注射され得る。 改変コード配列もまた、インビボまたはエキソビボでのuPARポリペプチド発現 のためにプラスミドへ挿入され得る。インビボ治療については、コード配列は、 直接にまたは静脈注射によって組織へ送達され得る。この様式における使用に適 切なプロモーターは、CMVのような内因性および異種プロモーターを含む。さら に、合成T7T7/T7OBプロモーターが、Chenら、(1994)，Nucleic Acids Res．22:2 114-2120に従って構築され得、そこではT7ポリメラーゼがそれ自身のプロモータ ーの調節制御下にあり、uPARコード配列の転写を駆動し、それはまたT7プロモー ターの制御下に置かれている。コード配列は、Zhuら、Science（1993）261:209- 211に記載されるように、コード配列を安定にし得、コード配列の細胞への形質 導入を促進し得、そして/または標的化を提供し得る緩衝液を含有する処方物中 で、注射され得る。 ウイルスまたは非ウイルスベクターによる遺伝子治療目的のための送達に際し てのコード配列のインビボ発現は、Gossenら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA(199 2)89:5547-5551に記載されるように、調節遺伝子発現プロモーターの使用によっ て、最大の効果および安全性のために調節され得る。例えば、uPARコード配列は 、テトラサイクリン応答プロモーターによって調節され得る。これらのプロモー ターは、レギュレーター分子での処理によって、ポジティブまたはネガティブ様 式で調節され得る。 コード配列の非ウイルス送達については、配列は、高レベル発現用の従来の制 御配列を含有する従来のベクター中に挿入され、次いで、WuおよびWu、J．Biol ．Chem．(1987)262:4429-4432に記載されるような、アシアロオロソムコイドの ような細胞標的リガンドに連結された、ポリマー性DNA結合カチオン様ポリリシ ン、プロタミン、およびアルブミン；Huckedら、Biochem．Pharmacol．40:253-2 63(1990)に記載されるようなインスリン；Plankら、Bioconjugate Chem．3:533- 539（1992）に記載されるようなガラクトース；Midouxら、Nucleic Acids Res.2 1:871-878(1993)に記載されるようなラクトース；または、Wagnerら、Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 87:3410-3414(1990)に記載されるようなトランスフェリンの ような、合成遺伝子移入分子と共にインキュベートされ得る。他の送達システム は、Nabelら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:11307-11311(1993)、およびPhil ipら、Mol．Cell Biol．14:2411-2418(1994)に記載されるような、種々の組織特 異的プロモーターまたは遍在的活性(ubiquitously-active)プロモーターの制御 下での、uPAR遺伝子を含有するDNAをカプセル化するためのリポソームの使用を 含む。使用に適切なさらなる非ウイルス送達は、Woffendinら、Proc．Natl．Aca d．Sci．USA(1994)91(24):11581-11585に記載されるような、微粒子銃アプロー チのような機械的送達システムを含む。さらに、uPARコード配列およびこのよう な配列の発現産物は、光重合ヒドロゲル物質の沈着を介して送達され得る。uPAR コード配列の送達に使用され得る、遺伝子送達のための他の従来方法は、例えば 、米国特許第5,149,655号に記載されるような、手動の遺伝子移入パーティクル ガンの使用；米国特許第5,206,152号およびPCT出願WO92/11033号に記載されるよ うな、移入遺伝子を活性化するための電離放射線の使用を含む。 本発明のペプチドおよびポリペプチド、ならびにそれらのアナログまたは改変 体に関する遺伝子治療技術の適用が、例えば、uPARの任意のものの活性が患者に 対して有害である疾患状態において、なされ得る。本発明のポリペプチドおよび ペプチド、ならびにそれらのアナログまたは変異体を使用する遺伝子治療が、細 胞骨格破壊の状態（例えば、例えばuPAR:インテグリン結合対形成を遮断するた めのアンタゴニストまたはドミナントネガティブのインビボ発現、およびuPARと インテグリンとの結合対形成からもたらされる細胞移動のような細胞応答）を処 置する場合に適切であることもまた、発明者らによって着想されている。 一般的に、遺伝子治療は、uPARが、ビトロネクチンまたはインテグリンと結合 対相互作用を形成し、そして細胞骨格完全性を調節するように作用し、そして細 胞移動に影響を与える全ての状況において、例えば、uPAR結合対相互作用の通常 活性を調節するために十分な量の、本発明のペプチドまたはそのアナログ、変異 体、もしくはドミナントネガティブの遺伝子治療プロトコルに従う投与によって 、本発明に従って適用され得る。 本発明のペプチドの適用は、遺伝子治療プロトコルによって投与されるか否か に関係なく、細胞骨格破壊および/または細胞移動を含む他によっても特徴づけ られる症状に羅患した患者の治療状況においてなされ得る。癌の状態および/ま たは炎症状態が、このような状態の例である。 本発明の目的のために、本発明の新規ペプチドの配列および機能に基づくアッ セイが、例えば細胞骨格破壊および細胞移動の制御における使用のための、機能 性uPAR:ビトロネクチンおよびuPAR:インテグリンのインヒビター、アンタゴニス ト、およびアゴニストについての低分子ライブラリープールをスクリーニングす るために、開発され得る。これらのインヒビター、アンタゴニスト、またはアゴ ニストは、動物に投与され得、そして、例えばDepofoamTMのようなリポソーム組 成物、および、例えばFocalgelTMのような他のキャリアを含む、薬学的に受容可 能なキャリアとともに投与され得る。 低分子ライブラリーは、低分子がSIPの任意の作用を模倣するか、相乗効果を 与えるか、または減弱させる能力についてスクリーニングするために使用され得 、そして以下のようになされ得る。ペプチドの「ライブラリー」は、米国特許第 5,010,175号（'175号特許）およびPCT WO91/17823号に開示されている方法に従 って、合成されそして使用され得る。'175号特許の方法では、適切なペプチド合 成支持体（例えば樹脂）は、適切に保護された活性化アミノ酸混合物にカップリ ングされる。 WO91/17823号に記載される方法も同様である。しかし、合成樹脂の活性化アミ ノ酸混合物との反応の代わりに、樹脂は20の等しい部分に分割されるか、または その工程に添加される個々のアミノ酸の数に対応する多数の部分に分割され、各 アミノ酸はその樹脂部分に独立してカップリングされる。次いで、樹脂部分は組 み合わされ、混合され、そして第二アミノ酸との反応のために多数の部分に再び 分割される。さらに、各工程で全樹脂を組み合わせるのではなく、並行して部分 を処理することによって、別々の「サブプール」が維持され得る。これは、いず れのペプチドが、応答細胞における遺伝子発現の任意の観察される変化を担って いるかを決定するプロセスを単純化する。 WO91/17823号および米国特許第5,194,392号に記載される方法は、全ての合成 および再合成が数日間で実施され得るような並行しての自動化技術によって、こ のようなプールおよびサブプールの調製を可能する。 さらなる代替試薬は、遺伝子発現の刺激物質またはインヒビターとして、ある いはリガンドまたはアンタゴニストとして作用し得る、ペプチドのアナログおよ び誘導体を含む、低分子を含む。ペプチド、アナログ、または誘導体の産生のた めに考慮されるいくつかの一般的な方法は、CHEMISTRY AND BIOCHEMISRY OF AMI NO ACIDS，PEPTIDES，AND PROTEINS--A SURVEY OF RECENT DEVELOPMENTS，Weins tein，B.編、Marcell Dekker，Inc.発行、NewYork(1983)に概説されている。さ らに、D-アミノ酸によって通常のL-立体異性体を置換することが、分子の半減期 を増加するために実施され得る。 少なくともいくつかの置換アミノ酸のモノマーユニットからなるポリマーであ るペプトイドが、本発明の低分子刺激物質またはインヒビターとして作用し得、 そしてPCT 91/19735号に記載されるように合成され得る。現在好ましいアミノ酸 置換は、グリシンのN-アルキル化誘導体であり、これは容易に合成されそしてポ リペプチド鎖に組み込まれ得る。しかし、多様な分子のプールの配列特異的合成 を可能にする任意のモノマーユニットが、ペプトイド分子の産生における使用に 適切である。本発明の目的のためのこれらの分子の利点は、それらが、ペプチド とは異なる立体配置空間を占有し、そのためにプロテアーゼ作用に対してより耐 性であることである。 ペプトイドは、標準的な化学方法によって容易に合成される。好ましい合成方 法は、R．Zuckermannら、J．Am．Chem．Soc．(1992)114:10646-7に記載される「 サブモノマー」技術である。N-置換グリシンモノマーユニットが骨格を形成する 複素環式有機化合物の固相技術による合成は、1995年6月7日に出願された「Synt hesis of N-Substituted Oligomers」と称する同時係属出願に記載されており、 その全体が本明細書中で参考として援用されている。次いで、このような複素環 式有機化合物の混合物のコンビナトリアルライブラリーは、遺伝子発現を変化さ せる能力についてアッセイされ得る。 コンビナトリアルライブラリーにおける他の複素環式有機化合物の固相による 合成もまた、1995年6月7日に出願された「Combinatorial Libraries of Substra te-Bound Cyclic Organic Compounds」と称する同時係属出願の米国特許出願第0 8/485,006号に記載されており、その全体が本明細書中で参考として援用されて いる。高度に置換された環状構造が、サブモノマー法を強力な液相化学と組み合 わせることによって、固体支持体上で合成され得る。１、２、３、またはそれ以 上の融合された環を含有する環状化合物が、同じ出願に記載されるような、最初 の直鎖状骨格の合成に続く分子内環化または分子間環化による、サブモノマー法 によって形成され得る。 患者における投与のための本発明の治療に適切なキャリアは、本発明のペプチ ドの阻害効果に拮抗し得る分子（例えば、ペプチド７、９、18、および25、なら びにこれらのアナログまたは変異体）を含むがこれらに限定されず、例えば、低 分子、ペプチド、ペプトイド、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドを含み、 例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸 、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒予のような、大きくて緩徐に代 謝される高分子であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。薬学 的に受容可能な塩類、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの ような鉱酸塩；および、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など のような有機酸塩が、そこでは使用され得る。薬学的に受容可能な賦形剤の詳細 な議論は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES（Mack Pub．Co.，N.J．1991 ）において入手可能である。治療的組成物中の薬学的に受容可能なキャリアは、 水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールのような液体を含有し得る。 さらに、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤などのような補助物質が、このような賦 形剤中に存在し得る。代表的には、治療的組成物は、液体溶液または懸濁液のい ずれかのような注射可能形態として調製され得；注射前の液体ビヒクル中への溶 解または懸濁に適切な固体形態もまた調製され得る。リポソームが、薬学的に受 容可能なキャリアの定義内に含まれる。用語「リポソーム」は、例えば、米国特 許特許第5,422,120号、WO 95/13796号、WO 94/23697号、WO 91/14445号、および 欧州特許第524,968 B1号に記載されるリポソーム組成物をいう。リポソームは、 本発明のペプチド、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドのための、あるいは これらの治療剤の組み合わせのための薬学的キャリアであり得る。 本発明のさらなる目的、特徴、および利点が、以下の詳細な記載から明らかに なる。しかし、本発明の精神および範囲内での種々の変化または改変が、この詳 細な記載から当業者には明らかになるので、この詳細な記載は、本発明の好まし い実施態様を示すが、例示のみの目的で与えられていることが理解されるべきで ある。本発明はまた、本発明の要素の作用のいかなる理論にも限定されない。 実施例１ UPAR:uPA1-48 複合体上での15マーランダムペプチドライブラリーの アフィニティー選択 可溶性組換えヒトウロキナーゼレセプター(suPAR)を発現させ、そしてGoodson ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7129-7133(1994)に記載のようにバキュロウイ ルス感染sf9昆虫細胞から分泌させた。ヒトウロキナーゼのEGF様ドメイン(uPA残 基１−48)を、Stratton-Thomasら、Prot.Eng．8:463-470(1995)に記載のように 組換え酵母から発現させた。UPA1-48を、還元性条件下でのイオン交換クロマト グラフィーおよび逆相HPLC、続いて再フォールディング工程および酸化物質の逆 相HPLC上での再クロマトグラフィーを含む、公開された手順の修正により精製し た。可溶性uPARを、固定化uPA1-48のカラム上で精製し、低いpHで溶出させ、Kau fmanら、Anal.Biochem．211:261-266(1993)に従ってビオチン化し、そしてSoft- Avidinカラム(Promega Corporation，Madison，WI)上で精製した。Grussenmeyer ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:7952-7954(1985)に記載のように、E-Y-M-P-M-E のＣ末端エピトープタグを有するドメイン２および３（アミノ酸93〜313）を含 むuPARフラグメントを、バキュロウイルス感染Sf9昆虫細胞において発現させ、 そして抗エピトープ抗体カラム上でのアフィニティークロマトグラフィーにより 、馴化培地から精製した。遊離アミノ末端およびアミド化カルボキシル末端を有 するペプチドを、Chiron Mimotopes(Melbourne，Australia)で合成し、そしてこ れはHPLCおよびMS分析により70％を越えて純粋であった。クローン20ペプチドの 改変体を、配列：AE PMPHSLNFSQYAWYT（配列番号７）を用いて調製した。クロー ン７のスクランブル化バージョン(scrambled version)は、配列：VEYRDAYSYPQYL SYLE（配列番号８）を有した。組換えPAI-1をAmeican Diagnosticaから入手した 。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ストレプトアビジンはPierce Chemical ，Rockford，ILに由来する。抗M13抗体は、Pharmacia，Piscataway，NJに 由来する。 アフィニティー選択を、ストレプトアビジンコート磁性ビーズ(Dynal，Roches ter，NY)上で実施した。ビオチン化suPAR(1.5μｇ)を、100μｌの総容量におい て、3.5μｇのuPA1-48と30分間室温にて混合した。磁性ビーズをPBS/１％BSA(PS B/BSA)で30分間ブロックし、次いでsuPAR:uPA1-48複合体をPBS/0.1％BSA中に添 加し、そして２時間室温にてインキュベートした。次いで、ビーズをPBS/BSAで ３回洗浄し、そして15マーランダムペプチドライブラリーの500μｌのアリコー トで再懸濁した。比較のために、ビーズの同一のアリコートを、親バクテリオフ ァージベクター(LP67、Devlinら、Science 249:404-406(1990)に記載される)と インキュベートした。バクテリオファージを室温にて45分間結合させ、次いで２ mlのPBS/BSAで７回洗浄し、そして結合バクテリオファージを500μlの60mMグリ シン、１.5M尿素（pH2.5）で溶出した。溶出バクテリオファージを力価測定し、 そしてGoodsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7129-7133(1994)、およびDevlin ら、Science 249:404-406(1990)に記載のように増幅した。次いで、増幅バクテ リオファージを、上記のようにsuPAR:uPA1-48複合体上でのさらなる回(round)の ために選択した。DNA配列決定を、ジデオキシ法により、各々のバクテリオファ ージプラークからのPCR増幅インサート上で行った。 実施例２ sUPAR へのバクテリオファージ結合 50mMのNa2CO3（pH9.6）中のストレプトアビジン100μｌ(0.1mg/ml)を、MaxiSo rpウェル(Nunc)に添加し、４℃にて一晩インキュベートし、次いでPBS/BSAで洗 浄した。ビオチン化sUPAR(PBS/BSA中25nM)をウェルに添加し、そして洗浄の前に 室温にて２時間インキュベートした。競合ペプチドインヒビターを、バクテリオ ファージの添加の直前にウェルに添加した。ウェルを室温にて１時間インキュベ ートし、次いで洗浄して、そして結合バクテリオファージを0.1N HCl（pH2.5） 中の６M尿素で溶出した。15分後、尿素溶出物を2M Tris baseの添加によって中 性pHにし、そしてインプットストックおよび溶出物のバクテリオファージ力価を プラーク形成アッセイにより測定した。結果は、ウェルに結合するインプットバ ク テリオファージのパーセントとして表される。あるいは、ELISAにおいてバクテ リオファージの量を決定した。ここで、ファージをHRP結合抗M13抗体と室温にて 30分間プレインキュベートし、次いで上記のように調製したウェルに分配し、そ して室温にて１時間インキュベートした。最終抗M13結合希釈は１：4000であっ た。洗浄の後、TMB基質(100μｌ／ウェル)を添加し、そして呈色を0.8 NH2SO4(1 00μｌ／ウェル)で停止させた。次いで、96ウェルプレートリーダーで450nmでの 吸光度を測定した。 uPA1-48:uPAR複合体のパンニングにより、新規なペプチド配列を得た。uPAR上 のuPA結合部位についての高親和性ペプチドリガンドの選択は、Goodsonら、Proc .Natl.Acad.Sci.USA 91:7129-7133(1994)に記載のように、比較的効率的なプロ セスであり、Stratton-Thomasら、Prot.Eng．8:463-470(1995)に記載のように、 uPA結合部位ペプチドの選択を減少するために、過剰なuPAの組換えEFG様ドメイ ン(uPA1-48)を含むことによって、UPAR上のさらに機能的に重要な部位に対する 親和性を有するペプチド提示(displaying)バクテリオファージを選択することに より、拡張した。EGF様ドメインは、Appellaら、J.Biol.Chem．262:4437-4440(1 987)およびRobbiatiら、Fibrinol．4:53-60(1990)に記載のように、レセプター 結合モチーフであり、そしてMazarら、Fibrinol．6:49-55(1992)に記載のように 、uPAと同様の親和性(0.1〜５nM)でuPARに結合する。Devlinら、Science249:404 -406(1990)に記載の15マーランダムペプチドバクテリオファージライブラリーを 、磁性ビーズ上で固定化されたsuPAR:uPA1-48複合体上でアフィニティー選択し た。バクテリオファージの収率は、２回目の0.008％から３回目の0.２4％へ30倍 増大し、このことは、結合バクテリオファージの富化を示唆した。 28個の非依存性バクテリオファージを単離し、そしてランダムペプチドをコー ドするDNAセグメントを配列決定した。これら28のバクテリオファージから、23 の異なる配列を得たが、固定化sUPAR上で別々にアフィニティー選択した場合、 ４つのクローン（７、９、18、および25）のみが実質的な収率（＞２％）を有し た。これは、選択した結合バクテリオファージのほとんどが実質的な収率を有し た、Goodsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7129-7133(1994)に記載された、uP AR単独でのアフィニティー選択の以前の結果と対照的である。これらの４つの バクテリオファージの収率を、suPAR上でuPA1-48の存在下および非存在下で決定 した。さらに、コードされたペプチドを合成し、そしてStratton-Thomasら、Pro t.Eng．8:463-470(1995)およびKaufmanら、Anal.Biochem．211:261-266(1993)に 記載のように、suPAR結合アッセイにおいて競合物として試験した。これらの結 果を、図６の表に要約する。 選択したバクテリオファージの結合は、1000倍モル過剰のuPA1-48の存在によ りほとんど影響されなかった。対照的に、以前記載された、uPA結合部位に結合 するバクテリオファージ(クローン20およびuPA13-32)は両方とも、suPAR上で２ 〜５％の収率を得たが、Goodsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7129-7133(199 4)に報告されたように、uPA1-48の存在下ではバックグラウンドレベル（500倍よ り大きい減少）まで減少した。これらの結果は、uPA1-48:uPAR複合体上で選択し たバクテリオファージが、クローン20およびuPA13-32とは異なるクラスのuPARリ ガンドを提示することを示唆した。 本発明者らは、バクテリオファージがsUPARドメイン2-3フラグメントに結合す ることもまた示した。100μｌの50mM Na2CO3（pH9.6)中の１mg/mlプロテインＧ をMaxiSorpウェルに添加し、４℃にて一晩インキュベートし、次いでPBS/BSAで 洗浄した。エピトープタグEYMPMEに対する50μｌのモノクローナル抗体を１mg/m lでPBS/BSAに添加し、そして室温にて２時間インキュベートした。ウエルを洗浄 し、組換えsUPARドメイン2-3(PBS/BSA中1.7μＭ)を添加し、そして室温にて1.5 時間インキュベートした。ウェルをバクテリオファージの添加(約108pfu)の前に 洗浄し、次いでsuPARへの結合について前節に記載のように処理した。実施例３ ビトロネクチン結合アッセイ ビトロネクチンを、Yatohgoら、Cello Struct．and Funct．13:281-292（1988 )の方法により、ヒト血漿から精製した。精製ビトロネクチンを、１mM CaCl2お よび0.5mM MgCl2を含むPBS中において20μｇ/mlまで希釈し、50μｌ／ウェルでI mmulon IIウェル(Dynatech，Chantilly，VA)に分配し、４℃にて一晩インキュベ ートし、そしてPBS/BSAで洗浄した。ビオチン化sUPARをPBS/BSA中において20nM ま で希釈し、試験リガンドを伴ってまたは伴わずに室温(22℃)にて30分インキュベ ートし、100μｌ／ウェルで分配し、そして90分間インキュベートした。次いで ウェルを洗浄し、そしてPBS/２％BSA中0.4μｇ/mlの西洋ワサビペルオキシダー ゼ(HRP)結合ストレプトアビジンを１時間添加し、次いで洗浄し、100μｌ／ウェ ルTMB基質を添加した。呈色を100μｌの0.8N H2SO4で停止させ、そして96ウェル プレートリーダー(Dynatech，Chantilly，VA)で450nmでの吸光度を測定した。試 験リガンドのアンタゴニスト的効果を、リガンドを20nM uPA1-48の存在下で20nM ビオチン化sUPARと共にインキュベートしたことを除いて、上記のように測定し た。 uPA1-48:uPAR複合体は高い親和性でビトロネクチンに結合することが見出され た。種々のペプチドリガンドのuPAR:ビトロネクチン相互作用に対する効果を分 析するために、本発明者らは、この相互作用についてのインビトロELISAに基づ くアッセイを開発した。ここでは、ビオチン化suPARおよびuPA1-48が、固定し尿 素精製したビトロネクチンに結合し、そして結合sUPARをHRP結合ストレプトアビ ジンで検出する。図１に示すように、このアッセイの条件下で、ビオチン化uPAR のビトロネクチンとの結合は、uPA1-48に厳密に依存する。uPA1-48:suPAR複合体 のビトロネクチンとの明らかに化学量論的な結合は、この相互作用の親和性が複 合体の濃度(Kd＜20nM)よりも高いことを示す。 バクテリオファージ由来のペプチドが複合体結合およびビトロネクチンへの細 胞接着をブロックすることもまた見出された。種々のバクテリオファージ由来の ペプチドがuPA1-48:uPAR複合体のビトロネクチンとの結合に影響する能力を、EL ISAアッセイにおいて評価した。２つのクラスのペプチドが、このアッセイにお いて効果的なアンタゴニストであった。第１に、sUPARへのuPA1-48結合に直接的 に競合するクローン20およびuPA13-32は結合を減少させた。非常に減少したレセ プター結合活性を示すクローン20ペプチドのアナログは、ビトロネクチンへの結 合に影響しなかった。第２に、非常に減少したuPA1-48結合に対する競合を示す クローン７および18（図６の表を参照）もまた複合体結合を阻害したが、一方ク ローン７のスクランブル化バージョンは阻害しなかった。単独で試験した場合、 ペプチドはビオチン化suPARのビトロネクチンとの結合を増加させなかった。バ クテリオファージとしてsuPARに効果的に結合する第３のペプチドであるクロー ン25は、uPA1-48刺激ビトロネクチン結合にほとんどまたは全く影響しなかった 。クローン７および18ペプチドがuPAR上のビトロネクチン結合部位に直接的に結 合し、そしてuPAR:uPA1-48によるビトロネクチン結合をこの部位についての直接 的競合により阻害するかどうかを試験するために、本発明者らは、これらのバク テリオファージの結合に対するビトロネクチンの効果を試験した。ビトロネクチ ンは、uPA1-48:suPAR複合体へのバクテリオファージ結合を５〜10倍減少させ、 これらのペプチドがuPARリガンドとしてのビトロネクチンを模倣するという仮説 に一致した。 Weiら、J.Biol.Chem．269:32380-32388(1994)に記載されるように、以前の結 果は、uPARによるビトロネクチン結合が、刺激U937細胞の細胞接着に相関するこ とを示した。クローン７ペプチドがこれらの細胞のuPAR媒介接着をブロックし得 るが、一方同じペプチドのスクランブル化バージョンは影響を有さないこともま た見出された。 さらに、uPA1-48:uPAR複合体のビトロネクチンとの結合がPAI-1、ビトロネク チン、およびビトロネクチンのソマトメジンＢドメインによってブロックされる ことが示された。ビトロネクチンの別の機能は、PAI-1の活性コンホメーション の安定化であると決定されており、これはSeiffertら、J.Biol.Chem．269:2659- 2666(1994)に記載のように、ビトロネクチンのソマトメジンＢドメインを介して 生じるようである。PAI-1は、uPA1-48:suPAR複合体のビトロネクチンとの結合の 非常に効果的な競合物であり、10nMの見かけのIC50を有する。これは、uPARおよ びPAI-1の結合部位が重複していることを本発明者らに示唆した。Seiffertら、J .Biol.Chem．269:2659-2666(1994)に記載のように、活性PAI-1との高親和性ビト ロネクチン結合は、主にソマトメジンＢドメインを介することが以前に実証され ている。従って、本発明者らは、ビトロネクチンおよび組換えソマトメジンＢド メインもまた、ビトロネクチンとのuPAR結合を阻害するかどうかを試験した。結 果的に、本発明者らは、分子は阻害するが、ドメインの点変異は阻害しないこと を示した。 次いで、バクテリオファージペプチドはビトロネクチンのソマトメジンＢドメ インと相同であり、これはまたPAI-1の結合部位であることもまた決定した。バ クテリオファージ由来のペプチド７および18の配列を、このドメインに対する相 同性について試験した。図３に示すように、ソマトメジンＢドメインの残基24〜 28とクローン７および18ペプチドとの間に保存されたモチーフLXXArY(ここで、X は親水性残基であり、そしてAr＝F、Yである)が存在する。さらに、クローン７ および18は、保存されたロイシンのすぐＮ末端側に配列E-L-Dを共有し、一方関 連配列D-E-Lが、保存された配列LCSYYに隣接して、ビトロネクチンのソマトメジ ンＢドメインの残基22〜24に見出される。 ペプチド７のどの残基がuPAR結合およびビトロネクチン結合の阻害に重要であ るかを決定するために、本発明者らは各残基を別々にアラニンに置換し、そして 生じたペプチドをuPARとのバクテリオファージ結合の阻害およびuPA1-48:uPAR複 合体のビトロネクチンとの結合の妨害について試験した。図４に示す結果は、こ れらのアッセイにおいて、ペプチドとビトロネクチンとの間で保存された残基が 活性のために重要であることを示す。 実施例４ SuPAR:1- アニリノ-8-ナフタレンスルホン酸（ANS）蛍光測定 種々のペプチドリガンドのsUPAR/ANS蛍光に対する効果の決定を、Plougら、Bi ochem．33:8991-8997(1994)の手順と同様の手順に従って行なった。競合物を含 むかまたは含まないsUPAR/ANS溶液の蛍光発光スペクトルを、386nmの励起波長、 5nm帯域励起および発光スリット、ならびに10mm透過長石英キュベットを有するH itachi F-4500蛍光分光光度計を使用して得た。400から600nmの発光スペクトル を記録した。競合測定のために、sUPAR/ANSストック溶液の希釈物を作製して、1 0％ DMSOを含有するPBS中に２μＭ sUPAR、10μＭ ANS、および０から20μＭ競 合物の最終濃度を有する個々の0.5mlアリコートを得た。蛍光の測定を25℃で１ 時間のインキュベーション後に行なった。 ANS蛍光増強がペプチド配列を識別したことを見出した。これらのペプチドリ ガンドの結合部位をさらに分析するために、本発明者らは、ANSの蛍光増強に対 するそれらの効果を試験した。ANSの蛍光増強は、uPAR結合の際に生じ、そしてu PAR分子のuPA結合部位の占有および機能状態と相関することが示されている（Pl ougら、Biochem．33:8991-8997(1994)）。いくつかのペプチドuPARリガンドのuP ARの存在下でのANS蛍光増強に対する効果は、uPA1-48およびクローン20がANS蛍 光を減少するという予想された結果を有した。このことは、レセプター結合アッ セイにおけるそれらの強力な活性と一致する。クローン７はまた、より高い濃度 においてであるが、用量依存様式で蛍光を減少した。一方、クローン25のペプチ ドは20μＭまで効果を有さない。これらの結果は、クローン７、20およびuPA1-4 8が、ANSとのuPARのいくつかの共通の結合決定基または共通の結合構造を共有す るが、クローン25は異なる部位と結合することを示唆した。 実施例５ 組換えUPARドメイン2-3フラグメントは バクテリオファージに結合するがuPA1-48には結合しない UPARは、Ploughら、FEBS Lett．349:163-168(1994)に記載の相同システイン含 有ドメインの３つの反復を含むLy6/CD59ファミリーの唯一のメンバーである。本 発明者らによる先の研究は、uPAR上のビトロネクチンの結合部位が、Weiら、J． Biol．Chem．269:32380-32388(1994)に記載のドメイン２および３（D23）中にあ ることを示唆した。この疑問についてさらに取り組むために、本発明者らは、バ キュロウイルス感染Sf9昆虫細胞において、Ｃ末端６アミノ酸エピトープタグと ともに第２および第３のCD59相同ドメインを含むことが予想されるsuPARのフラ グメント（残基93-313）を発現させた。分泌タンパク質を抗エピトープアフィニ ティーカラム上で精製し、そして最初にsuPAR結合アッセイにおいて競合するそ の能力について試験した。100nM D23でのこのアッセイにおいては、同じ条件下 では0.1nMのIC50を示すインタクトなsuPARとは対照的に、競合は存在しなかった 。 次いで、本発明者らは、種々のuPARバクテリオファージ提示リガンドの固定D2 3に結合する能力を試験した。図５に示す結果は、リガンドがD23およびsUPARへ の結合に関して３つの異なるクラスに分かれることを示す。クローン20および13 -32はインタクトなsUPARにのみ有意に結合する一方で、クローン９および25はD2 3フラグメントおよび全長レセプターに等しく結合する。クローン７および18の ペプチドを保有するバクテリオファージはD23に対し中程度の結合を示し、そし てインタクトなレセプターに対して実質的により良好な結合を示す。 実施例６ uPAR: インテグリン結合および結合部位の同定 インテグリン依存性接着に重要である細胞骨格結合エレメントがまたuPARによ り媒介される接着に関与するかどうかを確かめるために、胚腎臓細胞（293細胞 ）を操作して、相補性決定領域４（CD4）の膜貫通ドメインに融合したβ1細胞質 テイルからなるキメラタンパク質とともにuPARを同時発現させた。このキメラβ 1構築物の発現は、Lukashevら、J．Biol．Chem．26:18311(1994)に記載のβ鎖に 結合する細胞質エレメントを隔離することによりインテグリン媒介性接着に対し て優勢ネガティブ効果を働かせることが先に示されている。uPARのβ1細胞質ド メインとの同時発現は、uPAR依存性ビトロネクチン接着を完全に排除した。Luka shevら、J．Biol．Chem．26:18311(1994)におけるように調製した全長または短 縮β1細胞質テイルを発現するクローンを、GPI-uPARのcDNAでトランスフェクト し、そしてWeiら、J．Biol．Chem．169:32380(1994)におけるように選択した。 キメラβ1発現をカドミウムにより６時間誘導した後、ビトロネクチンへの接着 を37℃でアッセイした。全長β1キメラの誘導後、細胞はビトロネクチンコート 表面に本質的に全く接着しなかったが、短縮β1を発現する同時トランスフェク タントは良く接着した。 uPARと、コントロール（Lukashevら、J．Biol．Chem．26:18311(1994)に記載 の細胞骨格タンパク質と結合し得ない短縮β1細胞質ドメイン）とを同時発現す る細胞は、正常に接着した。37℃における接着の阻害が、共トランスフェクト間 で、４℃における匹敵するウロキナーゼおよびビトロネクチン結合にもかかわら ず生じ、これは接着に重要な細胞骨格結合エレメントについてのβ1細胞質テイ ルとuPARとの間の競合を示唆した。 これらの結果に基づいて免疫沈降実験を行なって、uPARが天然のβ1インテグ リンと物理的に会合するかどうかを決定した。IL-2R α膜貫通ドメインおよび短 い細胞質テイルに融合したuPARの細胞外ドメインから構成されるキメラuPAR（TM -uPAR）を発現する安定なトランスフェクタントをコントロールとして生成した 。このキメラuPARは、Huiら、J．Biol．Chem．269:8153(1994)における記載のよ うにGPI-uPARに匹敵して、ウロキナーゼを結合する。ヒトウロキナーゼレセプタ ーおよびヒトインターロイキン-２レセプターの全長cDNAを、ヒトマクロファー ジおよびヒトＴ細胞から、それぞれ、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応により 単離した。uPARの細胞外ドメイン（アミノ酸1-281）およびIL-2R αの膜貫通/細 胞質ドメイン（アミノ酸218-251）をコードするキメラcDNA構築物を調製した。 キメラcDNAをpBluescriptにサブクローニングし、ヌクレオチド配列決定（Seque nase，United States Biochemical Corp）により確認し、次いでXbaIおよびXhoI で消化し、そして最終的にpCEP4発現ベクターにサブクローニングした。同時ト ランスフェクタントは、Weiら、J．Biol．Chem．269:32380(1994)に記載の方法 によって、等量のビトロネクチンおよびウロキナーゼに４℃で結合することを示 した。 イムノブロッティングにより、293細胞におけるGPI-uPARおよびTM-uPARの匹敵 する発現、ならびに匹敵するウロキナーゼおよびビトロネクチン結合を確認した 。GPI-uPAR 293細胞のtriton X 100(0.2％)不溶性画分を極性界面活性剤中で可 溶化した場合、β1の免疫沈降は、明らかに、Filardoら、J．Cell．Biol．1995 ，印刷中に記載のように、uPARを同時沈降する：細胞（５×106）を一晩培養し 、微小管安定化緩衝液（0.1M PIPES(pH6.9)、２Mグリセロール、１mM EDTA、お よび１mM酢酸マグネシウム）で２回洗浄し、そして次いで氷上で５分間、0.2％ Triton X 100およびインヒビター（１mMオルトバナジウム酸ナトリウム、１mMフ ェニルスルホニルフルオリド、10mg/mlロイペプチン）を含む緩衝液中で抽出し た。不溶性残基を、４℃で20分間、プロテアーゼインヒビターを補充した１×RI PA緩衝液（150mM塩化ナトリウム、50mM Tris-HCl(pH7.5)、１％デオキシコール 酸、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、１％Triton X-100）で可溶化した。triton 可溶性画分を、２×RIPA緩衝液で1:1に希釈した。両画分を10分間、6000rpmで遠 心分離し、次いで非免疫血清およびプロテインＡ-アガロースとの４℃で２時間 のインキュベーションにより予備清澄化した。上清を新鮮なチューブに移し、そ してβ1またはカベオリンに対する抗体とともに４℃で２時間インキュベートし た。免 疫複合体をプロテインＡ-アガロースで回収した。洗浄した免疫沈降物を８％SDS -PAGEに供し、そしてニトロセルロースメンブレン上に移した。フィルターを５ ％脱脂粉乳でブロックし、そして１μｇ/mlの抗uPAR Mab R2（E．Ronne，Finsen Lab，Denmarkから）でプローブした。ブロットを洗浄し、そしてHRP結合抗体と ともに１時間インキュベートした。洗浄後、メンブレンを増強化学ルミネセンス （NEN DuPont，Wilmington，DE）を使用して、製造業者のプロトコルに従って発 色させた。 同様の結果を、ラットモノクローナルβ1抗体を置換した場合に得た。triton X 100界面活性剤可溶性画分のβ1免疫沈降物は全くuPARを示さなかった。さらに 、uPARとβ1との非常に少ない会合またはそれらが全く会合しないことが、いず れのtriton画分にもおけるTM-uPARによって示された。 細胞接着アッセイを行って、観察されたuPAR/β1/カベリオン複合体が機能的 に関連するかどうかを決定した。GPI-uPARおよびTM-uPARはともに４℃では同等 にビトロネクチンに結合したが、GPI-uPAR発現細胞のみがビトロネクチンに対し て増強した接着を示した。これは、β1とのuPARの会合が必要であることを示唆 する。 この仮説をさらに試験するために、ファージ提示ペプチドライブラリーを、uP AR結合ファージについてスクリーニングした。多くのファージペプチドを、Good sonら、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．91:7129(1994)に記載のように単離した 。１つのファージが、ウロキナーゼ/uPAR会合もビトロネクチン/uPAR会合もブロ ックしないuPAR結合ペプチドを提示した。このペプチド、ペプチド25およびいく つかのコントロールを合成し、精製し、そしてそれらの接着に対する効果につい てスクリーニングした。ペプチド25（コントロールではなく）が、293細胞のビ トロネクチンへのGPI-uPAR依存性接着を排除する（約60μＭのIC50）ことが見出 された。ペプチド25は、非トランスフェクト293細胞によるフィブロネクチンへ の接着に効果を有さなかった。次いで、免疫沈降実験を行って、このペプチドお よびコントロールペプチドのuPARのβ1との会合に対する効果を評価した。ペプ チド25（コントロールペプチドではなく）が、β1/カベオリン/uPAR複合体を、 接着をブロックした濃度（100μＭ）で十分に分裂させた。最初のスクリーニン グ からのいくつかのさらなる非阻害性ペプチドを試験し、そしてβ1/uPAR同時沈降 において効果を有さないことを見出した。これは、β1/GPI-uPAR/カベオリン複 合体が接着単位として働くことを確証する。 さらに、ペプチド25についての最小モチーフを、uPARへの結合を探索するペプ チド25のアラニンスキャンにより決定した： アラニンへの残基変化 ファージー結合の阻害％ なし（クローン25） 100 S-1 99 T-2 69 Y-3 21 H-4 17 H-5 100 L-6 0 S-7 99 L-8 96 G-9 16 Y-10 16 M-11 35 Y-12 17 T-13 39 L-14 98 N-15 100 これらのデータは、結合の阻害に必要な最小モチーフがクローン25中のYHXLXX GYMYT（配列番号５）（ここで、Xは任意のアミノ酸である）であることを示唆す る。 これらのデータは、uPARが特定のインテグリンと会合し、そしてその機能を修 飾することを示す。この会合は、特定のマトリクスタンパク質（ビトロネクチン ）への移動に対する接着を促進し、そしてインテグリンの正常な接着機能を不安 定化する。インビボでは、uPARのインテグリン依存性付着を不安定化する能力 は、プロテアーゼであるウロキナーゼの同時の結合により強化される。 実施例７ uPAR に結合するさらなるリガンドの同定 uPAR結合アッセイにおいて、以下のアナログを、ファージが提示するペプチド 25またはペプチド９のいずれかと競合させて試験した。アナログは天然および非 天然のアミノ酸の両方を含む。 以下の表において、アナログ配列を左に印刷したアナログのアミノ末端ととも に列挙した。アナログ配列には、特に記載しない限り、１文字アミノ酸略号を用 いた。小文字は、Ｄ-アミノ酸を示す。例えば、「ｓ」はＤ-セリンを示す。アナ ログ2-4および31-96は、遊離アミノ末端およびＣ末端カルボキサミドを有する。 アナログ5-30はアセチル化末端（Ac-オリゴマー-NH2）を含む。 アナログを、実施例２に記載の方法に類似する、可溶性uPARを使用するアッセ イにおいて試験した。アナログを、ファージが提示するペプチド９またはペプチ ド25のいずれかと競合するそれらの能力について試験した。アナログ3-61をペプ チド25と競合させて試験した。アナログ62-96をペプチド９と競合させて試験し た。約108プラーク形成単位のファージをアッセイに使用した。 アナログ3-30の結果 アナログを、ファージが提示するペプチド25とのuPAR競合アッセイにおいて、 40μＭの濃度で試験した。アナログが活性であった結果を以下に示す。 アナログ31-61の結果 アナログ31-61を、ファージが提示するペプチド25と競合するそれらの能力に ついて試験した。活性なアナログを、さらに２つの濃度（５μＭおよび2.5μＭ ） で試験した。これらの濃度を合成反応に基づいて計算した。しかし、配列*をさ らに試験したところ、多量のアミノ酸を含むことが決定され、試験した量は５μ Ｍまたは2.5μＭより高くあり得た。 活性なアナログでの試験の結果を以下に示す： オリゴマー62-79の結果 アラニンスキャンをペプチド９の配列を使用して行った。アナログ62-79の配 列は、アラニン残基を配列中のある位置で置換した以外は、ペプチド９と同じで ある。アナログ62-79は、ペプチド９中の可能なアラニン置換物の全てである。 Alaスキャンの結果は、６位のLeu、11位のTyr、12位のVar、および13位のTyr のアラニン置換がレセプター結合活性を破壊したことを示す。２位のGlu、４位 のPhe、または14位のLeuのアラニン置換は、ペプチド９に比較してオリゴマーの レセプター結合活性を減少したが、破壊しなかった。アナログ80-96の結果 アナログ80-96を、ファージが提示するペプチド９と競合するそれらの能力に ついて試験した。活性なアナログを、さらに２つの濃度（５μＭおよび2.5μＭ ）で試験した。これらの濃度を合成反応に基づいて計算した。しかし、配列*を さらに試験したところ、少量のアミノ酸を含むことが決定され、試験した量は５ μＭまたは2.5μＭより低くあり得た。 活性なアナログでの試験の結果を以下に示す： DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                 Peptide ligand of urokinase receptorField of the invention   The present invention relates to urokinase receptor in the presence of the receptor binding region of urokinase. For the identification of novel functional sites on the scepter. In the present specification, the site is identified. Bacteriophage display-derived peptides and bacteriophages Describes a general method for identifying functional sites on proteins using image presentation. Will be posted. Also, vitrone with urokinase: urokinase receptor complex For the study of Kuching and integrin interactions, the urokinase receptor Methods for using functional sites are described. In addition, vitronectin and integrin Antagonizes the interaction of urokinase with urokinase: urokinase receptor complex The use of the peptides of the present invention to develop potential therapeutic molecules is also described.Background of the Invention   Urokinase plasminogen activator (uPA) is its cell surface receptor. Is a serine protease that interacts with inducible localization (uPAR). Provide enhanced cell surface proteolytic activity, thereby promoting cell invasion. uPA: The uPAR complex converts plasminogen to plasmin. Plasmin, Ellis J. et al. Biol. Chem. 264: 2185-2188 (1989), Vassili et al., J. Clin. Invest. 88: 106 7-1072 (1991), and Mignatti and Rifkin, Physiol. Rev. 73: 161-195 (1993) Can degrade various matrix glycoproteins as described by Are known. The simultaneous expression of uPA and its receptor During directed cell migration, localized plasminogen activation and pericellular Rix has been linked to decomposition.   Urokinase receptor (uPAR) is 283 of urokinase and vitronectin. Amino acid glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor receptor tan Parkin, Plough and Ellis, FEBS Lett. 349: 163-168 (1994), and R oldan et al., EMBO J. 9: 467-474 (1990). Seems to be a triplication. Proteolysis of uPAR is described by Plow et al. B iol. Chem. 268: 17539-17546 (1993) and Kieffer et al., Biochem. 33: 4471-4482 (1 994), a fragment consisting of domain 1 and domain 2-3. Subsequent analysis indicates that the disulfide bond pattern of domain 1 is completely Showed that it was inside the main.   Cell migration and invasion depend on cell surface localized proteolysis and extracellular matrix. It appears to require adhesion to certain components of the box. These processes are zioli et al., Trends Pharmacol. Sci. 15: 25-29 (1994), and Mignatti et al., Physiol . Rev. 73: 161-195 (1993), tissue reconstruction, embryo transfer, angiogenesis, And many normal or pathological processes, including tumor cell invasion and metastasis Is necessary for Key components of cell surface proteolysis and cell adhesion cascade Minutes are described in Felding-Habermann et al., Curr. Biol. 5 As described in 864-868 (1993), Rasminogen activator / plasmin, matrix metalloprotease , And integrins. To vitronectin, an extracellular matrix component Is described in Waltz et al. Biol. Chem. 269: 14746-14750 (1994), and Ciambrone J. et al. Biol. Chem. 267: 13617-13622 (1992). And the uPA binding site and vitronectin receptor are HT1 080 cells are shown to coexist. More recently, Wei et al. Biol. C hem. 269: 32380-32388 (1994), uPAR is in a uPA-dependent manner, It has been demonstrated that vitronectin can function as a cell adhesion receptor.   Plow et al., Biochem. 3: 8991-8997 (1994), using chemical crosslinking Early experiments have shown that the first domain of uPAR is sufficient for high affinity binding of uPA Subsequent studies required intact three-domain molecules, and Main 2 and 3 were shown to contain additional binding determinants. Not yet The interaction of the decision is the interaction with the EGF-like domain of uPA or the domain It may be an indirect interaction affecting one conformation. The previous study, Domain 2 And 3 to determine if they have a measurable affinity for uPA And did not succeed. Because Plow et al., Biochem. 3: 8991-8997 (1994) As described, it is difficult to separate domains 2 and 3 from trace amounts of full-length uPAR Because it was.   The uPA: uPAR system has been identified as promoting pericellular proteolysis, And functions that can be attributed to uPAR include cell migration, adhesion, and mitogenesis It is. Therefore, elucidation of the functions of domains 2 and 3 of uPAR is desired.Summary of the Invention   A first embodiment of the present invention comprises:   (a) provide:     (1) a library of potential ligands,     (2) a target polypeptide in contact with a known ligand for the target polypeptide Tide,   (b) A library of potential ligands, along with a target polypeptide and a known library. Contact Gand, and   (C) binding to the target polypeptide in the presence of a known ligand, the target polypeptide Identifying potential ligands that form binding pairs with known ligands, A method for identifying an orphan binding site of a target polypeptide sequence .   Another embodiment of the present invention relates to a urokinase plasminogen activator receptor. Isolated peptide that binds to UPAR and inhibits the binding of uPAR to integrin It is a tide. The isolated peptide was YHXLXXGYMYT (SEQ ID NO: 5) or AESTYHHLS LGYMYTLN (SEQ ID NO: 4).   Another embodiment of the present invention relates to urokinase plasminogen activator (uPA R) and inhibits the binding of uPAR to vitronectin. You. The isolated peptides were AEPVYQYELDSYLRSYY (SEQ ID NO: 1), AEFFFKLGPNGYVY LHSA (SEQ ID NO: 2) or AELDLSTFYDIQYLLRT (SEQ ID NO: 3) or FKLXXXG YVYL (SEQ ID NO: 6).   Yet another embodiment of the present invention relates to urokinase plasminogen activator -A peptide that binds to the receptor (uPAR) and inhibits the binding between uPAR and integrin Is an isolated nucleic acid sequence encoding The isolated nucleic acid sequence has an amino acid sequence Can encode YHXLXXGYMYT (SEQ ID NO: 5) or STYHHLSLGYMYTLN (SEQ ID NO: 4) You.   Yet another embodiment of the present invention relates to a urokinase plasminogen activator A peptide that binds to the receptor (uPAR) and inhibits the binding between uPAR and vitronectin Is an isolated nucleic acid sequence encoding The isolated nucleic acid sequence has an amino acid sequence AEPVYQYELDSYLRSYY (SEQ ID NO: 1) or FFKLGPNGYVYLHSA (SEQ ID NO: 2), or Or AELDLSTFYDIQYLLRT (SEQ ID NO: 3) or FKLXXXGYVYL (SEQ ID NO: 6) Can be loaded.   Yet another embodiment of the present invention provides for up-regulation of uPA and uPAR. Therefore, patients with disorders characterized by uPAR: antago By providing an effective amount of the antagonist and administering the antagonist to the patient. It is a method of treating.   A further embodiment of the present invention provides a peptide antagonist of uPAR: integrin interaction. Providing a gonist, candidate antagonists for binding to uPAR, and their pairs. Competing with a peptide antagonist, and a peptide agent for uPAR binding. Identifying a candidate antagonist by its ability to compete with an antagonist. uPAR: a method to screen for antagonists of integrin interaction .   A still further embodiment of the present invention relates to a uP identified by the method just described. AR: small molecule antagonist of integrin interaction, u identified by that method PAR: Peptide antagonist of integrin interaction and the same method It is a defined uPAR: peptoid antagonist of integrin interaction.   Another embodiment of the present invention relates to the efficacy of an antagonist of a uPAR: integrin binding pair. Up-regulation of uPA and uPAR, including amount and pharmaceutically acceptable carrier A pharmaceutical composition for treating a disorder characterized by a solution.   Yet another embodiment of the present invention provides a peptide antagonist of the uPAR: integrin binding pair An effective amount of a nucleic acid encoding a nyst, and its peptides, are expressed in a patient. Up-regulation of uPA and uPAR, including pharmaceutically acceptable carriers suitable for Pharmaceutical compositions for treating patients with disorders characterized by Things.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. UPA1-48 is required for sUPAR to bind vitronectin. Various Concentrations of uPA1-48 were added to biotinylated sUPAR in vitronectin-coated wells. And vitronectin-binding sUPAR was described in the Examples. Detected. Each decision is made in duplicate and the result is the sum of sUPAR and uPA1-48. From the average absorbance at 450 nm of the treated sample, the average absorbance of the sUPAR alone sample (about 0.03).   FIG. Various peptide ligands for binding of sUPAR to vitronectin effect. The effect of the indicated peptide on the sUPAR / vitronectin interaction was In a well coated with vitronectin in the presence of uPA1-48 as shown in FIG. Determined by incubating with biotinylated sUPAR. All pepti 100% DMS before diluting the solution to the indicated concentration with PBS / 2% BSA for the assay. Solubilized in O. The control samples were suPAR plus 20 nM UPA1-48 and sUPAR alone was included. The peptides tested were clone 7, clone 7S (s Scrambled clone 7), clone 18, clone 25, clone 20 , Clone 20A (position L was replaced with A at position 14), and uPA 13-32 C19A. result Is the average OD of the triplets450Report as a value. Error bars are less than symbols Nothing is shown.   FIG. Peptides 7 and 18 interact with the somatomedin B domain of vitronectin It is the same. Vitronectin containing somatomedin B domain and RGD motif The sequence from residues 1-47 is compared to the sequence of clone 7 and clone 18. Vitro The homologous residues 22-28 of the peptides derived from Nectin and bacteriophage were It is shown in bold like the RGD sequence of tronectin.   FIG. The alanine substitution of peptide 7 was determined by bacteriophage to UPAR and Affects both binding of vitronectin. Described in Materials and Methods, and As shown in Panel A, 40 μM of synthetic peptide was transferred to bacteriophage 7 It was tested as a competitor for binding to otinylated suPAR. As noted above, Bacteriophages were detected with a rabbit anti-M13 antibody. Three values shown set Is the average of the decisions. The same peptide was used as uPA1-48: uPAR: vitronectin binding ELIS In A, triplicates were tested at 50 μM.   FIG. Bacteriophage binding to sUPAR domain 2/3. Phage Epitope tag via rotatein G and monochrome for that epitope tag It was added to wells containing sUPAR domain 2/3 immobilized with null antibody. Protection Wells containing inG and antibody but not domain 2/3 were plated with non-specific phage Included for binding determination. Urea-eluting phage and input stock Were titrated by a plaque formation assay. The result is a percentage of the input value As a single point determination, calculated as, and repeated in three separate experiments.   Figure 6: Table. The table in FIG. 6 shows the uPAR binding update for the selected phage peptides. Shown are sequence, phage yield, and IC50 in Sasay.Detailed Description of the Preferred Embodiment   The invention described herein is a subject of previously published work and pending patent applications. Refer to the wish. For example, such research may be in scientific papers, patents, or pending Consists of a patent application. All such published studies cited herein are , Incorporated herein by reference. The present invention has the following definitions incorporated by reference herein. It can be more fully understood by righteousness.Definition   As used herein, the term “orphan binding site” refers to another peptide Or previously identified on a polypeptide sequence capable of binding to the polypeptide sequence Not part The orphan binding site is the binding site where the natural ligand is known Sites can be distinguished. The orphan binding site of the present invention is located on the target polypeptide Found by phage display of a peptide sequence that can bind to the site. The binding site is For example, urokinase plasminogen activator receptor (uPAR) , Other ligands or polypeptides (eg, vitronectin and integrins) Urokinase plasminogen activator (uP When binding A), it may include binding of a third or fourth additional polypeptide. .   As used herein, the term “orphan polypeptide” refers to an orphan polypeptide. Refers to a polypeptide sequence capable of binding at the binding site. Orphan polypeptides For example, used in phage display screens to determine orphan binding sites. Used or a natural or synthetic peptide that binds to the orphan binding site. Can be an adult polypeptide sequence and locate orphan binding sites The sequence is homologous to the peptide used to   As used herein, the term "potential ligand" refers to a target polypeptide Any peptide, polynucleotide, polysaccharide, or other molecule that can potentially bind Say.   As used herein, the term "potential ligand library" is defined above. A collection of at least 50 compounds that are potential ligands as defined or Mixture, and more preferably, less potential ligand libraries Are both 200 potential ligand compounds, and even more preferably more than 500 Compound.   As used herein, the term "unknown ligand" has not yet been discovered. But refers to a ligand for a labeled polypeptide that can be found by the method of the present invention. . Potential ligand binds the target polypeptide and a previously unknown ligand If the binding of the unknown ligand can be antagonized by binding to the target polypeptide, Structural analysis of potential ligands that bind tide, or the binding is antagonis Determined by any of the functional changes that have been destroyed by the obtain. The unknown ligand also binds to the target polypeptide at the orphan binding site. Polypeptides containing naturally occurring sequences in competition assays with potential ligands Can be determined by screening a library of   As used herein, the term "bacteriophage library" A library of peptides expressed on the surface of bacteriophage for presentation Technology in molecular biology to create and contact potential target polypeptides Say. Libraries can be expressed as peptides and bacteriophage A polynucleotide that is presented by the Or the resulting DNA or amino acid portion. Bacteriophage panni Screening or presentation can be used to screen for ligands of the target polypeptide. Have applications as described herein, which, if identified, Identify the orphan binding site on the polypeptide.   As used herein, the terms “peptide” and “polypeptide” Manipulated by humans using molecular biology, biochemistry, or gene therapy techniques Or polypeptide produced in vivo or in vitro in a controlled environment Refers to tide. For example, an isolated peptide or polypeptide can be converted to an automated peptide. Peptide or polypeptide in cell-free systems by peptide or polypeptide synthesis. Transformed with a nucleic acid sequence encoding the nucleic acid sequence and regulatory sequences for expression in a host cell. In a heterologous host cell, and the coding sequence of the peptide or polypeptide is It can be produced in animals that have been introduced for expression in animals. In this specification For purposes, to the extent that they are not naturally present inside the cell as a natural product, The peptide or polypeptide was isolated. For example, such an isolated polypeptide Peptides or polynucleotides can be 10% pure, 20% pure, or more pure Can be   As used herein with respect to a peptide, polypeptide, or polynucleotide When used, the term "derivative" refers to a peptide, polypeptide, or Peptides, polypeptides, or polynucleotides that retain the functionality of the polynucleotide Means leotide. These include, for example, site-specific mutations of the underlying nucleic acid molecule. Can be variously modified by amino acid deletion, substitution, insertion, or inversion. Derivatives of peptides, polypeptides, or polynucleotides also have their flags May be a comment. In any case, the derivative or fragment is derived from At least some of the peptide or polypeptide functions, and preferably Holds everything.   The term “pharmaceutical composition” refers to a composition for administration of a therapeutic agent. Therapeutic drug Are, for example, peptides, polypeptides, polynucleotides, small molecules, peptoids Or any derivative thereof, and which are harmful to the individual receiving the composition. Refers to any pharmaceutical carrier that does not itself induce the production of the body, and It can be administered without any degree of toxicity.   Administration of a therapeutic agent of the present invention includes administration of a therapeutically effective amount of an agent of the present invention. Honcho As used in the specification, the term "therapeutically effective amount" refers to the amount of a composition of the present invention when administered. Refers to the amount of a therapeutic agent sufficient to treat or prevent a condition treatable thereby. This Is an amount sufficient to show a detectable therapeutic, prophylactic, or reversible effect. This effect may include, for example, treatment or prevention of the conditions listed herein. Subject The exact effective dose to the body depends on the subject's size and health, the nature of the condition being treated. And range, recommendations of the treating physician, and the therapeutic or Depends on the combination of therapeutic agents. Therefore, it is not possible to specify the exact effective amount in advance. Not useful. However, the effective amount for a given situation can be determined by routine experimentation. You. Administration includes administration of the polypeptide, and the polynucleotide encoding the polypeptide. The polypeptide can be expressed in the animal by administration of the nucleotide.   As used herein, the term "recombinant vector" refers to a polynucleotide in the cells of the present invention. Any vector for transport or expression of a virus, such as a viral vector , Non-viral vectors, plasmid vectors, and heterologous hosts and expression systems. Includes vectors derived from regulatory sequences.   As used herein, a "regulatory sequence" refers to a gene that affects expression of a gene sequence or Refers to a nucleic acid sequence encoding one or more elements capable of effecting a change, If the sequence is placed in a position subject to its control, including its transcription or translation No. Such regulatory sequences include, for example, a minimal promoter sequence, a complete promoter, Sequence, induced active promoter, enhancer sequence, upstream activating sequence ("UA S "), operator sequence, downstream termination sequence, polyadenylation sequence, translation initiation An optimal 5 'leader sequence for optimization, or a Shine-Dalgarno sequence obtain. Alternatively, the regulatory sequence may be a hybrid enhancer / promoter element. And a hybrid of any of the above promoters, such as a promoter. Purpose The appropriate regulatory sequences for expression of the gene will depend on the host system in which the construct is to be expressed. different. Selection of the appropriate regulatory sequences for use herein is within the ability of those skilled in the art. is there. In eukaryotes, such sequences may include, for example, one or more promoters. Sequence and / or transcription termination sequence. Adjustment arrangements suitable for use herein Rows include prokaryotic sources, eukaryotic sources, viruses, viral vectors, Lyophage or from any source, including linear or circular plasmids I can do it. The regulatory sequences herein can also be synthetic, for example, GADP / ADH2 high A UAS for one gene and an essential promoter from another gene, such as a bridging promoter. An array created by combining the rest of the motors. Adjustment The sequence can also be a repressor sequence.   As used herein, "mammalian cell" refers to a host cell according to the invention as a host cell. A useful subset of eukaryotic cells and refers to human cells, as well as dogs and cats Animal cells such as cells from cattle, cows, horses, rabbits, mice, goats, pigs, etc. Including. The cells used may not be genetically modified or, for example, Can be genetically modified by transformation with a suitable expression vector, marker gene, etc. You. Suitable mammalian cells for the method of the present invention include any mammalian cells capable of expressing the gene of interest. Live animal cells or cDNA library, cRNA library, genomic DNA live Rally, or any protein or polypeptide useful in the method of the invention. Any mammalian cell that can be expressed. Mammalian cells are also American-type Cell lines, such as immortalized cell lines, available from the Culture Collection (ATCC) Including cells of origin. Such cell lines include, for example, rat pheochromocytoma cells (PC 12 cells), embryonic cancer cells (P19 cells), Chinese hamster ovary (CHO) cells , HeLa cells, baby hamster kidney (BHK) cells, monkey kidney cells (COS), human liver Cell cancer cells (eg, Hep G2), human embryonic kidney cells, mouse Sertoli cells, dogs Kidney cells, buffalo rat hepatocytes, human lung cells, human hepatocytes, mouse mammary gland Cells. Neural stem cells, such as hematopoietic stem cells, neurosphere cells, And embryonic stem cells (ES cells).   As used herein, "polynucleotide sequence", "nucleic acid molecule", "nucleic acid" “Sequence” or “coding sequence” refers to a specific amino acid sequence or its complement. Refers to either RNA or DNA to be loaded. Nucleic acid molecules can also be functional peptides (eg, For example, an antisense oligonucleotide sequence or a ribozyme) Alternatively, it may be an oligonucleotide probe.   As used herein, the term "analog" refers to the sprat of the mature protein. Ising variants, truncations, variants, alleles, derivatives and the like. other Unless otherwise indicated, an "analog" refers to one or more biological activities of a "mature protein". Or has the biological activity of a peptide. Thus, human or non-human supplies Identical to amino acid sequence of mature protein or peptide, regardless of source Or at least 60%, preferably 70%, more preferably 80%, And most preferably peptides or polypeptides containing 90% amino acid sequence homology Is included within the scope of this definition.   “Variant” herein includes amino acid substitutions, deletions, or insertions. A The amino acid substitution can be a conservative amino acid substitution, a glycosylation site, a phosphorylation site. One or more cis not required to alter the position, acetylation site, or for function. To minimize misfolding by substituting or deleting tein residues Such may be a substitution to remove non-essential amino acid residues. Conservative amino acids Substitutions are a general modification of the hydrophobic / hydrophilic and / or steric bulk of the substituted amino acids. Are conservative substitutions, for example, substitutions between members of the following groups are conservative substitutions: Gly / Ala, Val / Ile / Leu, Asp / Glu, Lys / Arg, Asn / Gln, Ser / Thr / Cys, and Phe / Trp / Tyr. As used herein, an analog refers to a protein having the biological activity of a protein. Peptides having one or more peptidomimetics, also known as putoids, Included. Within this definition, one or more analog amino acids (eg, non-natural amino acids) Polypeptides having substituted linkages (including amino acids) And both naturally occurring and non-naturally occurring compounds known in the art. Other modifications are also included. The term polypeptide also includes, for example, glycosylation, It does not exclude post-expression modifications of the polypeptide, such as chilling and phosphorylation.   The term "binding pair" refers to a pair of molecules, usually a protein / protein pair. However, protein / DNA pairs, or protein / RNA pairs, or DNA / DNA pairs, DN Does not exclude A / RNA pairs, or RNA / RNA pairs, and proteins or DNA or RNA May be included. The components of such pairs are higher than the random molecules. Specifically bind to each other with high affinity and therefore bind (eg, ligand / receptor) Does the binding pair trigger a cellular or intracellular response? Or form a complex. An example of a ligand / receptor binding pair is PDGF (platelet (A growth factor) and a PDGF receptor. Examples of different binding pairs Is an antigen / antibody pair, which is produced by immunization of the host with the antigen. You. An example of an organic molecule-protein binding pair is retinoic acid and its protein receptor. Binding to the retinoic acid receptor, which is a putter. Specific binding, low dissociation Exhibit a constant binding interaction, which is characteristic of non-specific background binding. Distinguish from heterozygous binding. A low dissociation constant is, for example, 1.0 μM, more preferably 10 nM M, even more preferably 1.0 nM or less.   As used herein, the term "antagonist" refers to, for example, a receptor Binds but does not produce a signal that should be transmitted to cells by the receptor A molecule, such as a molecule, that blocks signaling to a detectable extent. A In the case of antagonist peptides, peptide antagonists can be Binds to or at the uPAR receptor at or near the It can prevent formation of a binding pair with uPAR.   As used herein, the term “agonist” refers, for example, to the receptor By binding and promoting signal transduction to cells via the receptor Refers to molecules that mimic signaling in the pathway being studied. Of the present invention If the agonist of the uPAR peptide antagonist is uPAR: integrin binding Mimic or compete with peptide antagonists to block pair formation Can match. Small molecules or peptoids are involved in the uPAR: integrin binding pair interaction Screening for the ability of a peptide antagonist to perform the same or similar function Can be   As used herein, urokinase plasminogen activator The scepter “uPAR” stands for urokinase plasminogen activator receptor - uPAR is a glycosylphosphatidyl-inositol-linked uroquina And the vitronectin receptor. uPAR is disclosed by Blasi et al. Cell. Biol . 104: 801 (1987), as a result of cytokine stimulation or malignant transformation. As expressed in many cells.   As used herein, urokinase plasminogen activator " uPA is a serine protease that can activate urokinase plasminogen Say. When bound to its cell surface receptor uPAR, uPA becomes plasminogen To plasmin.   As used herein, “integrin” refers to an extracellular matrix protein. Is known to mediate cell adhesion to proteins and plays a key role in cellular activity The integrin family of cell adhesion receptors, also known to U.   As used herein, the term “cytoskeletal disorder” refers to at least one patient. Characterized at least in part by the formation of abnormal symptoms in the cytoskeleton of one tissue Refers to a disease in a patient that can be affected. Cytoskeletal abnormalities can be associated with various conditions, For example, include tumor growth, metastatic cancer, angiogenesis, wounds, and other diseases.   Some of the abbreviations used herein are: EGF, epithelial proliferation Factor; uPA, urokinase plasminogen activator; uPA1-48, urokina Amino acids 1-48 of u-sease; uPAR, urokinase plasminogen activator Scepter; sUPAR, soluble truncated form of urokinase receptor; uPA13-32, Cys Amino acids 13 to 32 of human urokinase in which 19 has been converted to Ala; PAI-1, plasminol Genactivator inhibitor type 1; ATF, amino-terminal fragment of uPA; HR P, horseradish peroxidase; PBS, phosphate buffered saline; BSA, bovine blood Qing albumin.   The present invention provides bacteriophores for identifying novel functional sites on proteins. Page presentation. Using this novel application of bacteriophage presentation technology Thus, the inventors have determined that human uroki in the presence of the receptor binding region of human urokinase. A novel peptide sequence that binds to the enzyme receptor has been identified and New functional sites were identified.   Thus, the identified peptides represent two new mechanisms on the urokinase receptor. Define active sites. First, the urokinase: urokinase receptor complex Corresponds to the site of interaction with vitronectin, and This site shows homology with the B domain. The second functional site is urokinase Related to an unexpected interaction of the receptor with the integrin, And probably define the integrin: urokinase receptor interface. This second Regulation of the two sites can lead to changes in integrin activity / specificity and cell adhesion And other integrin-mediated events.   The present invention relates to three peptides that inhibit uPAR: vitronectin binding interaction. Peptide 7 (SEQ ID NO: 1), Peptide 9 (SEQ ID NO: 2), and Peptide 18 (SEQ ID NO: 3), as well as this to inhibit uPAR: vitronectin interaction The use of these peptides. Vitronectin is described in Waltz et al. Biol. Chem. 269: 14746-14750 (1994), and is associated with binding to uPAR. Wei et al. J. Biol. Chem. 269: 32380-32388 (1994), urokinase receptor May be a uPA-dependent adhesion receptor for vitronectin Have been. Preissner et al., Annu. Rev. Cell Biol. 7: 275-310 (1991) In particular, vitronectin is present in both circulating and extracellular matrix forms. A complex glycoprotein having a node domain structure. This is Felding-Habermann Curr. Biol. 5, α-v subunit as described in 5,864-868 (1993) Various cell surface components, including integrins, and Mimuro et al. Biol. Chem . 264: 936-939 (1989), the active conformation and interaction of PAI-1. To use. This latter interaction is described in Seiffert et al. Biol. Chem. 266: 2824-2830 (1 991) and Seiffert et al. Biol. Chem. 269: 2659-2666 (1994), It appears to be through the somatomedin B domain of vitronectin. More recently, Ciambrone et al. Biol. Chem. 267: 13617-13622 (1992). Nectin is shown to co-localize with uPA in extracellular matrix at focal contact Have been. The explanation for this phenomenon is that uPAR is an adhesion receptor for vitronectin. And this binding is described in Wei et al. Biol. Chem. 269: Stimulated by uPA as described in 32380-32388 (1994).   The inventors have determined that the binding of the uPA1-48: uPAR complex to vitronectin in vitro. A bacteriostat that inhibits and blocks U937 cell adhesion to vitronectin A 15-mer peptide derived from phage display was found. These peptides are 3 shows homology with somatomedin B domain of Kuching. This homology is based on the uPAR: uPA1 -48 complex and suggest that the binding sites of PAI-1 may overlap, which indicates that PAI-1 Due to the fact that these complexes compete for binding to vitronectin Is shown. Deduction of bacteriophage-derived peptides and vitronectin sequences The ligation shows that the binding of the uPAR: uPA1-48 complex is 16 a A, as defined by the RGD sequence found at residues 45-47 apart from the amino acidv It suggests that it occurs close to the integrin binding site. In vitronectin Proximity of these binding sites suggests possible cooperative interactions between uPAR and integrins Suggests. Such an interaction could be with the integrin vitronectin receptor. Mechanism for uPAR Signaling Ability via Functional Coupling Where vitronectin crosslinks uPAR and integrin Act on. This is how GPI-coupled essential membrane proteins shrink cells. Provide an explanation of whether to convey the signal.   The present invention also provides for a uPAR: integrin site such as peptide 25 (SEQ ID NO: 4). Includes specific peptides that provide examples. Clone 25 shows a different sequence motif , And based on equivalent binding to D23, identify unique binding sites on suPAR. uP Necessary but sufficient to inhibit the binding pair interaction between AR and integrin The sequence motif we determined not to be GYZY, where Z is M or V It is. Peptide 25 binds to the urokinase receptor and binds to integrin It has been shown to modulate function. The sequence of peptide 25 is AESTYHHLSLGYMYTLN Where the amino acid YHXLXXGYMYT (where X is any Are important for inhibiting uPAR binding to integrins. I decided to.   A further aspect of the invention is that other molecules having the same activity (eg, small molecules and Peptides as Lead Compounds and Tools for the Development of Peptoid Assays The use of C25.   Xue et al. Immunol. 152: 4630-4640 (1994); Bohuslav et al. Exp. Med. 181: 1 381-1390 (1995), Conforti et al., Blood 83: 994-1005 (1994), and Reinartz et al., E xp. Cell Res. 220: 271-282 (1995). And both bTwoIntegrins (especially Mac-1, and avbThreeAnd avbFive) But at the same time in the cell To be localized. However, in each of these cases, uPAR and A direct probe to examine potential biochemical interactions with integrins is Did not exist.   Previous studies have been described by Goodson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7129-7133 (1 As described in (994), high affinity peptide ligators for the uPA binding site on uPAR Selection has proven to be a relatively effective process. The inventors have found that St ratton-Thomas et al., Prot. Eng. 8: 463-470 (1995). To reduce the selection of peptides, an excess of recombinant EGF-like domain of uPA (uPA1-48) The affinity for additional functionally important sites on uPAR By selecting for a peptide-presenting bacteriophage that has The analysis was expanded. The EGF-like domain is a receptor binding motif, and Binds uPAR with similar affinity (0.1-5 nM). Devlin et al., Science 249: 404-406 ( 1990), a 15-mer random peptide bacteriophage library Was affinity-selected with suPAR: uPA1-48 complex immobilized on magnetic beads .   Analysis of the effects of various peptide ligands on uPAR: vitronectin interaction To achieve this, we have developed an in vitro ELLSA-based algorithm for this interaction. Hassay developed. Under the conditions of the assay, bionylated uPAR vitronectin Binding is strictly dependent on uPA1-48, as shown in FIG. uPA1-48: suPAR compound The apparent stoichiometric binding of the coalesced to vitronectin indicates that the affinity of this interaction is It is higher than the concentration of the complex (Kd <20 nM).   Next, various bacteriophage-derived peptides were used to analyze the uPA1-48: uPAR complex. The ability to affect binding to tronectin was evaluated in an ELISA assay. Two Class of peptides were effective antagonists in this assay. First Clone 20 and uPA13-32, which directly compete for uPA1-48 binding to sUPAR, Decrease the combination. Clone 20 peptide with greatly reduced receptor binding activity Did not affect binding to vitronectin. Second, uPA1-4 8 Clones 7 and 18 exhibiting greatly reduced competition for binding (see table in FIG. 6) Also inhibits complex binding, but the cloned scrambled version of (Which have the same amino acids as clone 7 but in a different order) do not inhibit. Alone All peptides tested the binding of biotinylated sUPAR to vitronectin when tested in Did not increase.   Ku, a third peptide that effectively binds to suPAR as a bacteriophage Lone 25 has little or no effect on vitronectin binding stimulated by uPA1-48 Did not have.   Clone 7 and 18 peptides bind directly to vitronectin binding site on uPAR And by direct competition for the site, uPAR: vitron by uPA1-48 To test whether it inhibits cutin binding, we used these bacteria. The effect of vitronectin on lyophage binding was examined. Vitronectin Reduces bacteriophage binding to the uPA1-48: suPAR complex by a factor of 5-10 It states that these peptides mimic vitronectin as uPAR ligands Match the hypothesis.   Previous results have been reported by Wei et al. Biol. Chem. 269: 32380-32388 (1994) Thus, vitronectin binding by uPAR is associated with cell adhesion of stimulated U937 cells. It shows that there is a correlation. Clone 7 peptide is mediated by uPAR in these cells Were next tested for their ability to block adherence, resulting in clone 7 having uPAR: It is an effective blocker of the vitronectin interaction, while blocking the same peptide. The rumble version had no effect.   We found that the binding of the uPA1-48: uPAR complex to vitronectin was PAI-1, Blocked by lonectin and the somatomedin B domain of vitronectin It was shown to be. Another function of vitronectin is to activate PAI-1 Stabilization, which is described in Seiffert et al. Biol. Chem . 269: 2659-2666 (1994), somatomedin B domain of vitronectin. It seems to occur through the application. PAI-1 binds uPA1-48 to vitronectin: suPAR complex It is a very effective competitor for coalescence binding and has an apparent IC50 of 10 nM. this is , Suggesting that the binding sites for uPAR and PAI-1 overlap. Seiffert et al. Biol. Chem. 269: 2659-2666 (1994), as described in High Affinity Bits for Active PAI-1. Lonectin binding has been shown to be primarily through the somatomedin B domain . We have found that vitronectin and the recombinant somatomedin B domain also Tested whether they inhibit uPAR binding to vitronectin, and both molecules inhibit Harm, but found that a point mutation in the domain abolished its inhibition.   The present inventors have studied the somatomedin B domain of vitronectin, which is the binding site of PAI-1. A bacteriophage peptide homologous to the main was identified. Vitronectin The somatomedin B domain blocks uPAR binding, and we therefore For homology to the domain, peptide 7 from bacteriophage and 18 sequences were examined. As shown in FIG. 4, residues 24-28 of the somatomedin B domain Between the clone 7 and 18 peptides, a conserved motif, LXXArY (where X is a hydrophilic residue and there is Ar = F, Y). In addition, clones 7 and 18 Shares the sequence E-D-L immediately N-terminal to the conserved leucine, but the related sequence D-E -L is the somatomedicine of vitronectin at residues 22-24 adjacent to the conserved sequence LCSYY Found in the B domain.   Which residues of peptide 7 are important for inhibition of uPAR binding and vitronectin binding To determine if, we substituted each residue with alanine separately and Inhibition of bacteriophage binding to uPA and uPA1-48 to vitronectin: The resulting peptides were tested for interference with the binding of the uPAR complex. The results shown in FIG. The result is that residues conserved between the peptide and vitronectin are Indicates that the activity is important.   In addition, the inventors have determined that the recombinant uPAR domain 2-3 fragment Phage bound, but uPA1-48 was determined not to bind. uPAR is a homologous system The only member of the Ly6 / CD59 family that contains three repeats of the stain-containing domain Bar, Plow et al., FEBS Lett. 349: 163-168 (1994). The present inventors In Wei et al. Biol. Chem. 269: 32380-32388 (1994), uPA Binding sites for vitronectin on R are in domains 2 and 3 (D23) Suggests. To further address this question, the present inventors Expresses the suPAR fragment, residues 93-313, in Sf9 insect cells infected with Includes second and third CD59 homology domains with terminal 6 amino acid epitope tags Was predicted. The secreted protein is converted to anti-epitope affinity And its ability to compete in a suPAR binding assay Tested. Contrary to intact suPAR which shows an IC50 of 0.1 nM under the same conditions, 10 There was no competition in this assay at 0 nM D23.   We then proceed to identify the uPAR bacteriophage that presented various ligands. The ability to bind to immobilized D23 was tested. The results shown in FIG. 6 indicate that the ligands are D23 and And shows that the binding to sUPAR falls into three different classes. Claw 20 and 13-32 bind significantly only to intact sUPAR, while clones 9 and 13 And 25 bind equivalently to the D23 fragment and the full length receptor. Clone 7 And bacteriophage with 18 peptides show moderate binding to D23 And substantially better binding to intact receptors.   Integrins are described in Dustin et al., Nature 329: 846 (1987) and Shattil et al., Curr. 0 pin. Cell Biol. 6: 695 (1994), as described in cell differentiation, migration, and survival. Related to adhesion interactions that regulate key cell trafficking and intracellular signaling events Class of heterodimeric receptors. Integrin-mediated cell adhesion Describe, in addition to ligand binding, Miyamoto et al., Science 267: 883 (1995) and Burridg e et al., Annu. Rev. Cell Biol. 4: 487 (1998). Requires reassembly and assembly of the linking element that links the integrin to the cytoskeleton. I need it. β1 integrin has been widely studied in this regard. β1 chain fine The cytoplasmic tail binds tailin and α-actin, which by themselves are Otey J. et al. Cell. Biol. 111: 721 (1990) and Schaller et al. Cell. Biol. 130: 118 Interacts directly with actin as described in 1 (1988). Furthermore, like this The assembly of a tight cytoskeletal linkage is not strictly the result of cell surface expression, J. et al. Cell. Biol. 121: 155 (1993), Masumoto et al. Biol. Chem. 268: 228 (199 3), and Burn et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 85: 497 (1988) Often requires secondary cell signaling. Experimental events that give rise to the invention Before the integrin mechanism mediates kinetic changes in the functional state of the integrin The run protein remained almost uncertain.   We show that uPAR expression only provides adhesion to vitronectin. Notably, β1-dependent adhesion of fetal kidney cells (293 cells) to fibronectin Decided to reduce. This study demonstrated that uPAR expression in 293 cells was Based on altered phosphorus-dependent fibronectin and collagen adhesion . Phage-displayed peptide library was screened for uPAR-binding phage. In I did it. Many uPAR binding peptides are described in Goodson et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S .A. 91: 7129 (1994). Peptide 25 and some controls Were synthesized, purified, and screened for effects on adhesion. Pe In peptide 25, glycophosphatidylinositol of 293 cells to vitronectin Abolishes uPAR-dependent adhesion (GPI) binding and reduces IC50Found to have But not in the controls. Peptide 25 blocks adhesion At a concentration of about 100 μM, the β1 / caveolin / uPAR complex was greatly inhibited, Rules were not deterred. These observations indicate that intracellular membranes that regulate cell adhesion Identify previously unrecognized functional units. This unit is a GPI Anchor receptor (uPAR), integrins, and caveolin, and cells Binds to the cytoplasmic surface of β1 integrins and caveolin containing skeletal elements Consists of possibly other proteins known to be.   Transfected to determine if uPAR binds to integrin Uninfected 293 cells in the presence of recombinant soluble uPAR (suPAR) or fibronectin Or collagen. This result indicates that suPAR responds to fibrone in a dose-dependent manner. Inhibits the adhesion of cutin and collagen and has an inhibitory effect of 100 μM It was reversible with the addition of peptide 25, but not with the control. Indicated. uPAR interacts with the active conformation, integrin, and It was concluded that doing so would significantly alter integrin function. Peptide 25 ( 100 μM) between the other integrin Mac-1 and uPAR in the U937 cell line It has also shown that the interaction can be disabled.   To determine the functional consequences of uPAR / integrin interaction on cell migration Studies have also been performed, and the consequences of altering cell migration have been shown to be integrin-dependent adhesion. Was observed in the presence of uPAR by causing loss of sex. Loss of stable cell adhesion Are described in Huttenlocher et al., Cell Biol. 7: 697 (1995), Burchill et al., BioEssays 16: 225. (1994), and Lukashev et al. Biol. Chem. 26: 18311 (1994), Malignant transformation, tumor cell invasion, and transformation in several experimental and clinical settings Related to relocation.   The present invention provides uPAR / in for use in modifying inflammation and tumor progression. Peptides that have been shown to disrupt tegulin binding and preserve integrin function Reagents prototyped by Pide 25 or, for example, uPAR: Integra Impair integrin function, such as antibodies to a site on the integrin for phosphorus binding Including the development of reagents comparable to soluble uPAR.   To the suPAR selected in this study, as represented by peptides 7 and 25 Binding sequences have different binding sites based on several lines of evidence . First, these peptides bind to uPA1-48 binding as shown in the table of FIG. Various effects on anilino-8-naphthalene sulfonate (ANS) fluorescence as competitors The result is shown. Second, only peptide 7 inhibits complex binding to vitronectin . Third, bacteriophage 25 shows equivalent binding to D23 and suPAR, while 7 Indicates approximately 50-fold reduced binding to D23. Peptide 18 has significant homology at the sequence level And conserved residues are important for clone 7 binding as shown in FIG. Therefore, it seems to be the same ligand family as 7. In particular, the motif EL All of the defined residues in D and LxxArY are determined by alanine substitution As functionally important. In addition, peptide 18 is similar to peptide 7 Blocks binding of the complex to Lonectin.   The invention also relates to, for example, uPAR: vitronectin or uPAR: integrin binding In order to identify small molecules or peptoid inhibitors of the interaction, Molecular mimetics of the inhibitory activity of peptides (eg, peptide 7 and peptide 25) Methods for screening. Such an en of uPAR interaction Tagonists can be, for example, peptide derivatives such as peptoids, small molecules, or It can be a nucleotide. These antagonists include uPAR: vitronectin By binding, or by uPAR: integrin binding, or more commonly Upregulation of uPA and uPAR impairs cell adhesion Useful for the development of therapeutics for the treatment of the condition characterized. The pepti of the present invention And antagonists are caused by the biological activity of uPA or uPAR It may be useful in treating a condition or condition that is or is worsened. Symptoms Also include, for example, those found in diseases such as tumor cell invasion, metastatic disease, etc. For example, they may be characterized by cell migration and invasion, and symptoms may also be chronic inflammation. Disease.   Typically, a molecular mimetic, peptoid, or small molecule of a peptide of the invention; Or an analog, variant, or derivative of the invention is huPAR or huPAR: integrate Phosphorus complex or vitronectin, less than 10 μM; more preferably less than 5 μM Full, even more preferably less than 1 μM; even more preferably less than 100 nM; More preferably less than 10 nM KdIs shown.   A full length, derivative, or polypeptide or peptide inhibitor of the invention; Or any of the antagonists can be obtained by standard recombinant DNA or chemical techniques. And can be cloned, expressed, or synthesized. these Some exemplary expression systems that can be applied for the purpose are as follows. The present invention Administration of peptide, polypeptide, and polynucleotide therapeutics depends on the synthetic peptide. By administration of a peptide or polypeptide, or for expression in an animal. By administration of nucleotides or by non-coding polynucleotide inhibitors Can be performed. Low volume for screening for desired activity Methods for generating offspring and peptoid library pools are further provided below. You. A polypeptide encoded by a polynucleotide or nucleic acid molecule or The polynucleotide of the present invention is administered to patients for the purpose of expressing the peptide in animals. Gene therapy techniques for delivery are also provided. Further, for example, ribozymes and Non-coding nucleic acid molecules, such as antisense molecules, are suitably pharmaceutically acceptable carriers. Can be administered with the rear.Expression system   The methodologies described below contain sufficient detail to enable those skilled in the art to practice the invention. However, other items not specifically exemplified, such as a plasmid, United States Dept. of HHS, NATIONAL INSTITUETE 0F HEALTH (NLH) GUIDEL Under the current provisions of INES F0R RECOMBINANT DNA RESEARCH, Sambrook et al. (19 89), MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (Cold Spring Harbor Pr. ess, Cold Spring Harbor, N.Y.), and Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MO. LECULAR BIOLOGY (1994), (Greene Publishing Associates and John Wiley & So ns, New York, NY) using standard recombinant DNA techniques. Can be These references include procedures for the following standard methods: Cloning procedure using Rasmid, transformation of host cells, cell culture, plasmid DNA purification, DNA phenol extraction, DNA ethanol precipitation, agarose gel electrolysis Electrophoresis, purification of DNA fragments from agarose gels, and restriction endonucleases. Rease and other DNA modifying enzyme reactions.Expression in bacterial cells   The control elements for use in bacteria include promoters (optionally And a ribosome binding site. Useful Promos Tar includes sugar substitutes such as galactose, lactose (lac), and maltose. Includes sequences derived from the enzyme. Further examples include tryptophan (trp), β-lactamase (bla) promoter system, bacteriophage λPL, and T7 And a promoter sequence derived from such a biosynthetic enzyme. In addition, tac promo Synthetic promoters such as promoters can be used. β-lactamase and lactam The toose promoter system is described in Chang et al., Nature (1978) 275: 615, and Goeddel et al. , Nature (1979) 281: 544; alkaline phosphatase, tryptophan. The fan (trp) promoter system is described in Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 405 7 and EP 36,776, and include hybrid promoters such as the tac promoter. Motors are described in U.S. Patent No. 4,551,433 and de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sc i. USA (1983) 80: 21-25. However, it is useful for eukaryotic protein expression. Other known bacterial promoters are also suitable. Anyone skilled in the art is required Using linkers or adapters to provide restriction sites, for example, Siebenlist Et al., Cell (1980) 20: 269. Can be operably linked to the array. Promoters for use in bacterial systems also include Generally, Shine-D operably linked to the DNA encoding the target polypeptide Contains the algarno (SD) sequence. Recognizes and recognizes the native target polypeptide signal sequence For prokaryotic host cells that do not process, the signal sequence may be, for example, alkaline. Phosphatase, penicillinase, Ipp, or thermostable enterotoxin II And can be replaced by a prokaryotic signal sequence selected from the group of leaders. plus The origin of replication from mid pBR322 is suitable for most Gram-negative bacteria.   The above system is particularly compatible with Escherichia coli. However, use in bacterial hosts Many other systems for use include Bacillus spp., Streptococcus spp., Streptomy Gram-negative or Gram-positive organisms, such as P. ces spp. Pse like aeruginosa specifically includes udomonas species, Salmonella typhimurium, or Serratia marcescans It is. Methods for introducing exogenous DNA into these hosts typically involve CaCl 2Two Or the use of divalent cations and other agents such as DMSO. DNA hammer Also, Sambrook et al. (1989), MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (Cold  Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) By electroporation, nuclear injection, or protoplast fusion Can be introduced into bacterial cells. These examples are illustrative rather than limiting. Good Preferably, the host cells should secrete minimal amounts of proteolytic enzymes. is there Alternatively, in vitro methods of cloning (eg, PCR or other nucleic acid polymerases) Reaction) is appropriate.   Prokaryotic cells used to produce the target polypeptides of the present invention are Samb rook et al. (1989), MOECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (Cold Spring H arbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) Cultured in medium.Expression in yeast cells   Expression and transformation of either extrachromosomal replicons or integration vectors Vectors have been developed for transformation into many yeasts. For example, expression Have been developed, inter alia, for the following yeasts: Hinnen et al., Proc. Na tl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 1929; Ito et al. Bacteriol. (1983) at 153: 163 Saccharomyces cerevisiae as described; Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. ( 1986) 6: 142, Candida albicans; Kunze et al. Basic Microbiol . (1985) 25: 141, Candida maltosa; Gleeson et al. Gen. Micr obiol. (1986) 132: 3459 and Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 20 Hansenula polymorpha, as described in 2: 302; Das et al. Bacteriol. (1984) Kluyveromyces fragilis, as described in 158: 1165; De Louvencourt et al. Bac teriol. (1983) 154: 737 and Van den Berg et al., Bio / Technology (1990) 8: 135. Kluyveromyces lactis as described in Kunze et al. Basic Microbiol. (198 5) Pichia guillerimondii, as described in 25: 141; Cregg et al., Mol. Cell. Biol . (1985) 5: 3376 and described in U.S. Patent Nos. 4,837,148 and 4,929,555 As described in Pichia pastoris; Beach and Nurse, Nature (1981) 300: 706. And Schizosaccharomyces pombe; and Davidow et al., Curr. Genet. (198 5) 10: 380 and Gaillardin et al., Curr. Genet. (1985) Y, as described at 10:49 arrowia lipolytica, Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 1 12: 284-289; Tilburn et al., Gene (1983) 26: 205-221 and Yelton et al., Proc. Natl . Acad. Sci. USA (1984) 81: 1470-1474. nidulans and Kel ly and Hynes, EMBO J. (1985) 4: 475479. Asp such as nigeras ergillus host; Trichoderma reesia, as described in EP 244,234, and WO 9 As described in 1/00357, for example, Neurospora, Penicilliium, Tolypocladium Which filamentous fungi.   The control sequences for yeast vectors are known and are described in EP 284,044. Enola, as described in EP 329,203 , Glucokinase, glucose-6-phosphate isomerase, glutarua Aldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAP or GAPDH), hexokiner , Phosphofructokinase, 3-phosphoglycerate mutase, and pyrvin Includes promoter regions from genes such as acid kinase (PyK). Acid hos The yeast PHO5 gene encoding fatase is also described in Myanohara et al., Proc. Natl. Aca d. Sci. Provide useful promoter sequences as described in USA (1983) 80: 1. . Other promoter sequences suitable for use in yeast hosts include Hitzeman et al. Biol . Chem. (1980) 255: 2073 as described in 3-phosphoglycerate kinase. Hess et al. Adv. Enzyme Reg. (1968) 7: 149 and Holland et al., Biochemist. py (1978) 17: 4900, pyruvate decarboxylase, triose Others such as phosphate isomerase, and phosphoglucose isomerase sugar A promoter for the degrading enzyme is included. Transcription controlled by growth conditions Inducible yeast promoters with additional advantages include those from the list above And alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphine Tatase, a degrading enzyme involved in nitrogen metabolism, metallothionein, glyceraldehyde Hyd-3-phosphate dehydrogenase, and maltose and galactose Other promoter regions for enzymes that contribute to utilization are included. In yeast expression Suitable vectors and promoters for use are further described in Hitzeman, EP 073,657. Will be posted. Yeast enhancers are also advantageously used with yeast promoters . In addition, non-naturally occurring synthetic promoters can also function as yeast promoters I do. For example, the upstream activating sequence (UAS) of one yeast promoter is Can be linked to the transcriptional activation region of the promoter to generate a synthetic hybrid promoter. I will. Examples of such hybrid promoters include U.S. Patent No. 4,876,197. And ADH regulation linked to the GAP transcription activation region, as described in US Pat. No. 4,880,734. Contains an array. Other examples of hybrid promoters include those described in EP 164,556. AD together with the transcriptional activation region of glycolytic enzymes such as GAP or PyK A promoter comprising a regulatory sequence of any of the H2, GAL4, GAL10, or PHO5 genes Is included. In addition, yeast promoters are used for yeast RNA polymerase and transcription. May include a naturally occurring promoter of non-yeast origin capable of binding initiation You.   Other control elements that can be included in yeast expression vectors are described, for example, in Holland et al. . Biol. Chem. (1981) from GAPDH and enolase residues as described in 256: 1385 Encodes a terminator from the gene, as well as a signal sequence for secretion Leader sequence. DNAs encoding appropriate signal sequences are described in EP 012,873 and Yeast invertase gene as described in U.S. Pat. Nos. 4,588,684, 4,546,083, and 4,870,008; EP 324,274; and WO  For secreted yeast proteins, such as the a-factor gene as described in 89/02463 About the gene. Or a non-interferon leader Leaders of yeast origin have also described secretion in yeast as described in EP 060,057. Provided.   Methods for introducing exogenous DNA into yeast hosts are well known in the art, and Spheroplasts or intact yeast cells treated with alkali cations Transformation of any of the vesicles.   Transformation into yeast is described by Van Solingen et al. Bact. (1977) 130: 946 and Hsia o et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1979) 76: 3829 Can be However, nuclear injection, electroporation, or Other methods for introducing DNA into cells, such as by plast fusion or Sambroo k et al., can be used as described generally above.   For yeast secretion, the native target polypeptide signal sequence may be Can be replaced by an enzyme, an α-factor, or an acid 5-phosphatase leader . The origin of replication from the 2μ plasmid origin is suitable for yeast. Suitable for use in yeast Suitable selection genes are Kingsman et al., Gene (1979) 7: 141 or Tschemper et al., Gene (19). 80) This is the trp1 gene present in the yeast plasmid described at 10: 157. trp1 inheritance Offspring are selectable markers for mutants of yeast lacking the ability to grow on tryptophan Offer. Similarly, the Leu2-deficient yeast strain (ATCC 20,622 or 38,626) is Complemented by a known plasmid having the gene.   Sequences encoding yeast proteins for intracellular production of the invention in yeast Produces a fusion protein that can be cleaved intracellularly by yeast cells upon expression. Can be linked to the coding sequence of the polypeptide for production. Such yeast Lee One example of a der sequence is the yeast ubiquitin gene.Expression in insect cells   Baculovirus expression vector (BEV) is a recombinant insect virus, The coding sequence for the foreign gene to be expressed is described in Smith and Summers, As described in U.S. Patent No. 4,745,051, viral genes (e.g., polyhedrin Inserted after the baculovirus promoter.   The expression constructs herein include those for infection or transformation of insect cell lines. DNA vectors useful as intermediates are included, and the vector is generally Contains DNA encoding the irs transcription promoter and is optional but preferred An insect signal DNA sequence capable of directing secretion of a desired protein; A site for the insertion of a foreign gene encoding the protein follows downstream, Null DNA sequences and foreign genes are under the transcriptional control of the baculovirus promoter. The foreign gene is herein a coding sequence for a polypeptide. You.   Promoters for use herein generally exceed 500 to infect insects. Baculovirus (eg, Autographo californica MNPV, Bombyx mori N PV, rrichoplusia ni MNPV, Rachlplusia ou MNPV, or Galleria mellonella  Orders Lepidoptera, Dipt, including but not limited to viral DNA of MNPV era, Orthoptera, Coleoptera, and Hymenoptera) It may be a urovirus transcription promoter region. Therefore, baculovirus The transcription promoter is, for example, the baculovirus immediate-early gene IEI or IEN promoter. Motor; selected from the group consisting of 39K and HindIII fragments containing the immediate early genes Immediate early in combination with the baculovirus late early gene promoter region selected Gene; or a baculovirus late gene promoter. Before and early Or the immediate early promoter can be enhanced with transcriptional enhancer elements .   Friesen et al. (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression": THE M OLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (ed. By W. Doerfler); EP 127,839 and EP 155, Baculovirus directing high level expression of DNA inserts as described in 476 Strong polyhedrin promoter; and Vlak et al. Gen. Virol. (1988) 69: The promoter from the gene encoding the p10 protein as described in 765-776 is Particularly suitable for use herein.   Plasmids for use in the present invention are described in Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. (1 988) Polyhedrin polyadenylation signal as described in 42: 177, as well as E. Prokaryotic ampicillin resistance (amp) remains for selection and propagation in Coli It also contains genes and origins of replication. DNA encoding the appropriate signal sequence Which are generally described in Carbonell et al., Gene (1988) 73: 409. Secreted insects, such as the baculovirus polyhedrin gene Genes for baculovirus proteins, and encodes May be derived from a mammalian signal sequence such as from a gene: Maeda et al., Nature (1 985) Human a-interferon as described in 315: 592-594; Lebacq-Verheyd en et al., Mol. Cell. Biol. (1988) Human gastrin release as described in 8: 3129. Derived peptide; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 8404 Such a human IL-2; a mouse as described in Miyajima et al., Gene (1987) 58: 273. IL-3; and human glucoseles as described in Martin et al., DNA (1988) 7:99. Brosidase.   Numerous baculovirus strains and variants, and Spodoptera frugiperda ( Betula), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melano gaster, and corresponding licenses from hosts such as Bombyx mori host cells. Insect host cells have been identified and can be used in the present invention. For example, Luckow et al. Bio / Technology (1988) 6: 47-55, Miller et al., GENETIC ENGINEERING (Setlow, J . K. et al.), Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986) pp. 277-279, and Maeda et al., Nat. ure (1985) 315: 592-594. A variety of such virus strains are publicly available. L-1 variants and B of Autographa californica NPV ombyx mori NPV strain Bm-5. Such a virus is Spodoptera frugiperd a used as a virus for transfection of host cells such as cells Can be   In addition to the polyhedrin promoter, other baculovirus genes also It can be used advantageously in a urovirus expression system. These are where they are expressed Immediate (α), delayed early (β), late (γ) , Or very late (δ). The expression of these genes is probably It occurs continuously as a result of a "cascade" mechanism. Thus, the immediate early gene is Expressed immediately after infection in the absence of other viral functions, and The resulting gene product induces the transcription of the delayed early gene. Then some delays The gene product induces late gene transcription, and ultimately, the very late gene It is expressed from one or more earlier classes under the control of the expressed gene product. This One relatively well-defined component of the regulatory cascade of Preferred immediate early results of rapho californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) It is a messenger. IEI is expressed in the absence of other viral functions, Guarino and Su mm ers, J .; Virol. (1986) 57: 563-571 and J.M. Virol. (1987) 61: 2091-2099 Some inheritance of the delayed early class, including the preferred 39K gene as described And Guanno and Summers, Virol. (1988) 162: 444-451 It encodes a product that promotes the transcription of such late genes.   Immediate early genes such as those described above are baculovirus genes in the delayed early category. It can be used in combination with a child promoter region. Not similar to immediate early genes , Such delayed early genes may produce other viral genes or immediate early genes. Requires the presence of a gene product such as a product. Some delay early remains like 39K Any of the gene promoter regions or HindIII of the baculovirus genome Combination of one of the delayed early gene promoters found above with the immediate early gene An arrangement can be made. In this example, the 39K promoter region is the L.A. Guarino and Summers (1986a); Guarino and Summers (1986b) Virol. (198 6) 60: 215-223, and Guarino et al. Virol. (1986) 60: 224-229 As expressed, so that expression can be further controlled by the presence of IEI It can be linked to a foreign gene to be obtained.   Furthermore, the combination of the immediate early gene and the delayed early gene promoter region When used, the promotion of heterologous gene expression is controlled by the delayed early gene promoter region. This can be achieved by the presence of an enhancer sequence in direct cis ligation with the region. Such enhancer sequences may limit the immediate early gene or its products. In some situations, delayed early gene expression is characterized. For example, hr5 enha The sensor sequence can be directly cis-linked to the 39K delayed early gene promoter region, Thus, Guarino and Summers (1986a), (1986b), and Guarino et al. (1986) Promotes expression of cloned heterologous DNA as described.   The polyhedrin gene is classified as a very late gene. Therefore, polyhedrinp Transcription from motors is unknown but probably many other viruses and cells Requires prior expression of the gene product. This delayed expression of the polyhedrin promoter For example, by Smith and Summers in U.S. Pat.No. 4,745,051. State-of-the-art BEVs, such as the exemplary BEV system listed Only as a result of gene expression and only after the viral infection has progressed well To express the next gene. This represents a limitation on the use of existing BEVs. Newly The ability of the host cell to process synthesized proteins depends on the baculovirus infection. Decrease with progress. Therefore, gene expression from the polyhedron promoter Is the ability of host cells to process newly synthesized proteins. Potentially reduced sites for specific proteins such as rasminogen activators Occurs when Consequently, the expression of secreted glycoproteins in the BEV system is Complex due to incomplete secretion of progeny products, which results in intracellular cloning The gene product is captured in an incompletely processed form.   Foreign protein whose insect signal sequence can be cleaved to produce a mature protein It has been recognized that the present invention can be used to express This is done with a mammalian signal sequence appropriate for the gene to be expressed.   An exemplary insect signal sequence suitable for the present invention is Lepidopteran lipodynamic hormone. (AKH) is a sequence encoding a peptide. The AKH family is an energy From short-block neuropeptides that regulate lug substrate recruitment and metabolism Become. In a preferred embodiment, the Lepidopteran Manduca sexta AKH signal pepti A DNA sequence encoding the code may be used. Orthoptera Schistocerca gregaria remains Other insect AKH signal peptides, such as peptides from the locus, are also advantageous Can be used for Other exemplary insect signal sequences are CP1, CP2, CP3, or CP4 And a sequence encoding a Drosophila keratin protein.   At present, there are a number of methods that can be used in the present invention to introduce foreign genes into AcNPV. A commonly used transfer vector is pAc373. Other well known to those skilled in the art Many vectors can also be used in the present invention. Baculovirus / insect Materials and methods for cell expression systems are described in Invitrogen (San Diego CA) (“MaxBac It is commercially available in kit form from companies such as "Kit"). Used in the present invention Methods are generally well known to those skilled in the art and are described in Summers and Smith, A MANUAL OF METH ODS FOR BACULOVIRUS VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PROCEDURES, Texas Ag ricultural Experiment Station Bulletin No.1555, Texas A & M University (198 7); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3: 2156, and Luckow and Summers (19 89). These include, for example, the polyhedrin initiation codon From ATG to ATT, and in Luckow and Summers, Virology (1989) 17:31. Introduce a BamHI cloning site 32 base pairs downstream from the ATT, as described Includes the use of pVL985.   Thus, for example, for insect cell expression of a polypeptide of the invention, the desired DNA The sequence can be inserted into the transfer vector using known techniques. Insect cell host A transfer containing the desired DNA to be inserted with the genomic DNA of the wild-type baculovirus Input vector, usually co-transfected by co-transfection. obtain. Vectors and viral genomes can be easily identified and purified, Can be recombined to yield a virus. The encapsulated recombinant virus It can be used to infect insect host cells and express the desired polypeptide.   Other methods applied to the present invention include insect cell culture, co-transfection, And standard methods for plasmid preparation, these are the Summers and And Smith (1987). These references are based on the AcMNPV transfer vector. Into the AcmMNPV genome, clone the gene into Transfer, viral DNA purification, radiolabeling of recombinant proteins, and insect cells Standard methods for the preparation of vesicle culture media are also described. Virus and cell culture hands The order is described by Volkman and Summers, J. et al. Virol. (1975) 19: 820-832, and Nolkman et al. J. Virol. (1976) 19: 820-832.   Expression in mammalian cells   Representative promoters for mammalian cell expression of the polypeptides of the present invention include Virus, SV40 early promoter, CMV promoter, mouse mammary tumor virus LTR promoter And the adenovirus major late promoter (Ad MLP) and herpes simplex Includes Ils promoter. Promoter from mouse metallothionein gene Other non-viral promoters have also found use in mammalian constructs, such as Will be issued. Mammalian expression can be constitutive or regulated (inducible) depending on the promoter. Target). Typically, transcription termination and polyadenylation sequences are It is located at the 3 'end of the translation stop codon. Preferably, optimize translation initiation Also exists at the 5 'end of the sequence encoding the polypeptide. You. Examples of transcription termination / polyadenylation signals are given in Sambrook et al. (1989), cited earlier. Includes signals from SV40 as listed. Splice donor and acceptor Introns containing -sites can also be designed into the constructs of the invention.   Enhancer elements can also be used to increase the level of expression in mammalian constructs. Can be used. Examples are Dijkema et al., EMBO J .; (1985) 4: 761 , SV40 early gene enhancer, and Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci . Rous sarcoma virus terminal repeats as described in USA (1982b) 79: 6777. (LTR) and as described in Boshart et al., Cell (1985) 41: 521. Includes enhancer / promoter from human cytomegalovirus. Sig Leader sequences, including sequences encoding the null peptide, can also be found in mammalian cells. To provide secretion of foreign proteins. Preferably a leader Leaderframes so that sequences can be cleaved either in vivo or in vitro There is a processing site encoded between the fragment and the gene of interest. The adenovirus tripartite leader is an exogenous tag in mammalian cells. It is an example of a leader sequence that provides for protein secretion.   Once completed, the mammalian expression vector may contain any of a number of mammalian cells. Can be used to transform Heterologous polynucleotides to mammalian cells Transfection methods are known in the art and include dextran-mediated transfection. , Calcium phosphate precipitation, polybrene-mediated transfection, protopras Fusion, electroporation, encapsulation of polynucleotides into liposomes And direct microinjection of DNA into the nucleus. Mammal General aspects of cell-host system transformation are described in Axel in U.S. Patent No. 4,399,216. Therefore, it is described.   Mammalian host cells used as responder cells or producer cells in the present invention may be of various types. Culture medium. Ham's F10 (Sigma), minimum essential medium ([MEM], Sig ma), RPMI-1640 (Sigma), and Dulbecco's modified Eagle's medium ([DMEM], Sigm Commercial media such as a) are suitable for culturing host cells. In addition, Ham And Wallace, Meth. Enz. (1979) 58:44, Barnes and Sato, Anal. Biochem. (1 980) 102: 255; U.S. Pat.Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; No. 4,560,655, WO 90/103430, WO 87/00195, and U.S. Pat. RE 30,985 Any of the media described under No. may be used as the culture media for the host cells. Any of these media may provide optimal conditions for cell function according to the methods of the present invention. Can be supplemented as needed to produce the subject, including hormones and / or Are other growth factors (eg, insulin, transferrin, or epidermal growth factor) ), Salts (eg, sodium, calcium, magnesium, and phosphate) ), Buffers (eg, HEPES), nucleosides (eg, adenosine and thymidine) Gin), antibiotics (eg, gentamicinTMM drug), trace elements (usually (Defined as inorganic compounds present at a final concentration in the icromolar range), and Replenishment as needed for a range of sources or equivalent energy sources. Any other The necessary supplements may also be included at appropriate concentrations that are well known to those skilled in the art. temperature, Culture conditions, such as pH, are based on conditions previously used with the host cells selected for expression. Case, and will be apparent to those skilled in the art.   Gene therapy strategies for delivering the constructs of the invention may be in vivo or Application of viral or non-viral vectors in an ex vivo format Can be used. Expression of such a coding sequence is dependent on the endogenous mammalian promoter. Alternatively, it can be induced using a heterologous promoter. In vivo coding sequence Expression can be either constitutive or regulated.   For delivery using viral vectors, see Jolly, Cancer Gene Therapy 1: 5. Any of a number of viral vectors may be used, as described in 1-64 (1994). Can be For example, the coding sequence is described in Kimura et al., Human Gene Therapy (1994) 5: 845-85. For expression in retroviral vectors as described in 2, Connelly et al., Hum an Gene Therapy (1995) 6: 185-193. For expression in, as described in Kaplitt et al., Nature Genetics (1994) 6: 148-153. For expression in simple adeno-associated virus vectors and in Sindbis vectors It can be inserted into a plasmid designed for expression. Use by these vectors Suitable promoters for use include Moloney retrovirus LTR, CMV promoter, And the mouse albumin promoter. A virus that is not replication defective is produced And can be injected directly into animals or humans, or can be used as described in Zatloukal et al., P. roc. Natl. Acad. Sci. Ex vivo as described in USA (1994) 91: 5148-5152. Can be injected by in vivo injection following transduction of the autologous cells with the autologous cells.   Modified coding sequences can also be used to express uPAR polypeptides in vivo or ex vivo. Can be inserted into a plasmid. For in vivo therapy, the coding sequence is: It can be delivered to the tissue directly or by intravenous injection. Suitable for use in this style Clear promoters include endogenous and heterologous promoters such as CMV. Further Synthetic T7T7 / T7OB promoters have been described by Chen et al., (1994), Nucleic Acids Res. 22: 2 114-2120, where T7 polymerase has its own promoter Under the control of the gene, driving transcription of the uPAR coding sequence, which also promotes the T7 promoter. Under the control of The coding sequence is described in Zhu et al., Science (1993) 261: 209-. As described in 211, the coding sequence can be stabilized and the coding sequence In a formulation containing a buffer that can facilitate introduction and / or provide targeting And can be injected.   Delivery for gene therapy purposes with viral or non-viral vectors In vivo expression of all coding sequences is described in Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (199 2) As described in 89: 5547-5551, the use of a regulated gene expression promoter And can be adjusted for maximum effectiveness and safety. For example, the uPAR code sequence is , Can be regulated by a tetracycline-responsive promoter. These promotions Is positive or negative depending on the treatment with the regulator molecule It can be adjusted by the formula.   For non-viral delivery of a coding sequence, the sequence may be a conventional control for high level expression. The sequence is inserted into a conventional vector containing the control sequence, and then transferred to Wu and Wu, J. et al. Biol . Chem. (1987) 262: 4429-4432 of asialoorosomucoids. DNA-binding cation-like polylysates linked to such cell targeting ligands , Protamine, and albumin; Hucked et al., Biochem. Pharmacol. 40: 253-2 Insulin as described in J. 63 (1990); Plank et al., Bioconjugate Chem. 3: 533- Galactose as described in 539 (1992); Midoux et al., Nucleic Acids Res. 1: 871-878 (1993); or lactose as described in Wagner et al., Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990). Such can be incubated with a synthetic introgression molecule. Other delivery systems Are described in Nabel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11307-11311 (1993), and Phil ip et al., Mol. Cell Biol. 14: 2411-2418 (1994). Regulation of heterologous or ubiquitously-active promoters Below, the use of liposomes to encapsulate DNA containing the uPAR gene Including. Further non-viral delivery suitable for use is described in Woffendin et al., Proc. Natl. Aca d. Sci. U.S.A. (1994) 91 (24): 11581-11585. And a mechanical delivery system such as In addition, the uPAR coding sequence and Expression products of different sequences can be delivered via deposition of a photopolymerized hydrogel material. uPAR Other conventional methods for gene delivery that can be used to deliver coding sequences include, for example, Manual introgression particles, as described in US Pat. No. 5,149,655 Use of a gun; as described in US Pat. No. 5,206,152 and PCT application WO 92/11033. The use of ionizing radiation to activate the transferred gene.   Peptides and polypeptides of the invention, and analogs or modifications thereof The application of body-based gene therapy techniques, e.g., It can be done in disease states that are harmful to it. A polypeptide of the invention and Gene therapy using peptides and their analogs or variants States of disruption of the vesicle skeleton (eg, to block uPAR: integrin binding pairing) Expression of an antagonist or dominant negative for in vivo, and uPAR Process cellular responses, such as cell migration, resulting from binding pairing with integrins. It is also envisaged by the inventors that they are suitable for placement.   In general, gene therapy involves binding uPAR to vitronectin or integrin Act to regulate paired interactions and regulate cytoskeletal integrity, and In all situations affecting cell migration, for example, the normal Peptide of the present invention or an analog or mutant thereof in an amount sufficient to regulate the activity By dosing according to body or dominant negative gene therapy protocols Can be applied according to the present invention.   Whether the application of the peptides of the invention is administered by a gene therapy protocol Irrespective of other, including cytoskeletal disruption and / or cell migration, regardless of This can be done in the context of treatment of a patient suffering from the condition being experienced. Cancer status and / or Or inflammatory conditions are examples of such conditions.   For the purposes of the present invention, an update based on the sequence and function of the novel peptide of the present invention Say can be used, for example, for use in controlling cytoskeletal disruption and cell migration. UPAR: vitronectin and uPAR: antagonis inhibitor of integrins Screening of small molecule library pools for To be developed. These inhibitors, antagonists, or jaws The nyst can be administered to the animal, andTMLiposome pairs like Adult and, for example, FocalgelTMPharmaceutically acceptable, including other carriers such as Can be administered with a competent carrier.   Small molecule libraries are designed to mimic the effects of small molecules on the Can be used to screen for the ability to give or attenuate And can be done as follows. A "library" of peptides is described in U.S. Pat. No. 5,010,175 (the '175 patent) and PCT WO91 / 17823. Can be synthesized and used. In the method of the '175 patent, the appropriate peptide The synthetic support (eg, resin) is coupled to a suitably protected activated amino acid mixture. Is performed.   The same applies to the method described in WO91 / 17823. However, activation of synthetic resin Instead of reacting with the acid mixture, the resin is divided into 20 equal parts, or Divided into a number of parts corresponding to the number of individual amino acids added to the process, Amino acids are independently coupled to the resin portion. Next, the resin part is Combined, mixed, and recombined into multiple parts for reaction with the second amino acid Divided. Furthermore, instead of combining all the resins in each step, A separate "sub-pool" may be maintained. This is These peptides are responsible for any observed changes in gene expression in responding cells Simplifies the process of determining   The methods described in WO 91/17823 and U.S. Pat. And parallel automation techniques that allow resynthesis to take place in a few days. Allows the preparation of pools and subpools such as   Further alternative reagents are as stimulators or inhibitors of gene expression Or analogs of peptides that can act as ligands or antagonists And small molecules, including derivatives and derivatives. For the production of peptides, analogs or derivatives Some common methods considered for this are CHEMISTRY AND BIOCHEMISRY OF AMI NO ACIDS, PEPTIDES, AND PROTEINS--A SURVEY OF RECENT DEVELOPMENTS, Weins tein, B., Marcell Dekker, Inc., New York (1983). Sa Furthermore, the replacement of the normal L-stereoisomer with a D-amino acid can be attributed to the half-life of the molecule. May be implemented.   A polymer consisting of at least some substituted amino acid monomer units. Peptoids can act as low molecular stimulants or inhibitors of the invention, It can then be synthesized as described in PCT 91/19735. Currently preferred amino acids The substitution is an N-alkylated derivative of glycine, which is easily synthesized and It can be incorporated into a polypeptide chain. However, sequence-specific synthesis of diverse pools of molecules Are available for use in the production of peptoid molecules Is appropriate. The advantage of these molecules for the purposes of the present invention is that Occupy a different configuration space, and thus are more resistant to protease action. Sex.   Peptoids are readily synthesized by standard chemical methods. Preferred synthesis method The law, R. Zuckermann et al. Am. Chem. Soc. (1992) 114: 10646-7 "Sub-monomer" technology. N-substituted glycine monomer units form the backbone Synthesis of heterocyclic organic compounds by solid-phase technology is described in "Synt, filed on June 7, 1995. hesis of N-Substituted Oligomers " The entirety of which is incorporated herein by reference. Then, such a heterocyclic ring Combinatorial libraries of mixtures of formula organic compounds alter gene expression Can be assayed for the ability to   Solid phase of other heterocyclic organic compounds in combinatorial libraries Synthesis is also described in “Combinatorial Libraries of Substrata” filed on June 7, 1995. co-pending U.S. Patent Application No. 0 entitled `` te-Bound Cyclic Organic Compounds '' No. 8 / 485,006, which is hereby incorporated by reference in its entirety. I have. Highly substituted cyclic structures combine submonomer method with powerful liquid phase chemistry Can be synthesized on a solid support. 1, 2, 3, or more Cyclic compounds containing the above fused rings were first used as described in the same application. Submonomer method by the synthesis of a linear skeleton of, followed by intramolecular or intermolecular cyclization Can be formed by   Suitable carriers for the treatment of the invention for administration in a patient are the peptidic peptides of the invention. Molecules that can antagonize the inhibitory effect of the peptide (eg, peptides 7, 9, 18, and 25; And analogs or variants thereof), including, but not limited to, Including molecules, peptides, peptoids, polynucleotides, and polypeptides; For example, proteins, polysaccharides, polylactic acid, polyglycolic acid, polymeric amino acids Large, slow replacements such as amino acids, amino acid copolymers, and inactive virus particles It can be a recognizable macromolecule. Such carriers are well-known to those skilled in the art. Pharmacy Acceptable salts, such as hydrochlorides, hydrobromides, phosphates, sulfates, etc. Such mineral salts; and acetates, propionates, malonates, benzoates, etc. Organic acid salts such as can be used there. Details of pharmaceutically acceptable excipients An important discussion is REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991). ). A pharmaceutically acceptable carrier in the therapeutic composition comprises: It may contain liquids such as water, saline, glycerol, and ethanol. In addition, auxiliary substances, such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents, and the like, can provide such excipients. It may be present in a formulation. Typically, a therapeutic composition is a liquid solution or suspension. It can be prepared as an injectable form, for example; dissolved in a liquid vehicle before injection. Solid forms suitable for solution or suspension can also be prepared. Liposomes are pharmaceutically acceptable Within the definition of an acceptable carrier. The term "liposome" Patent No. 5,422,120, WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445, and Refers to liposome compositions described in EP 524,968 B1. Liposomes are For a peptide, polypeptide or polynucleotide of the invention, or It can be a pharmaceutical carrier for the combination of these therapeutic agents.   Further objects, features and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description. Become. However, various changes or modifications within the spirit and scope of the present invention may be This detailed description is preferred of the present invention, as will be apparent to those skilled in the art from the detailed description. It should be understood that these embodiments are provided for illustrative purposes only. is there. The invention is also not limited to any theory of operation of the elements of the invention.                                 Example 1 UPAR: uPA1-48 Of a 15-mer random peptide library on a complex Affinity selection   Express soluble recombinant human urokinase receptor (suPAR) and Baculoy as described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7129-7133 (1994). Secreted from Rus infected sf9 insect cells. EGF-like domain of human urokinase (with uPA residue Groups 1-48) can be prepared according to Stratton-Thomas et al., Prot. Eng. 8: 463-470 (1995) Expressed from recombinant yeast. UPA1-48 is subjected to ion-exchange chromatography under reducing conditions. Chromatography and reverse phase HPLC, followed by a refolding step and reverse oxidation Purification by modification of published procedures, including rechromatography on phase HPLC Was. The soluble uPAR was purified on a column of immobilized uPA1-48, eluted at low pH, fman et al., Anal. Biochem. 211: 261-266 (1993), and Purified on an Avidin column (Promega Corporation, Madison, WI). Grussenmeyer U.S.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-7954 (1985), E-Y-M-P-M-E Domain 2 and 3 (amino acids 93-313) with a C-terminal epitope tag of Expressing the uPAR fragment in baculovirus-infected Sf9 insect cells, And affinity chromatography on an anti-epitope antibody column , From the conditioned medium. Has a free amino terminal and amidated carboxyl terminal The peptide to be synthesized is synthesized by Chiron Mimotopes (Melbourne, Australia) and It was more than 70% pure by HPLC and MS analysis. Clone 20 peptide A variant was prepared using the sequence: AE PMPHSLNFSQYAWYT (SEQ ID NO: 7). Claw The scrambled version of step 7 has the sequence: VEYRDAYSYPQYL SYLE (SEQ ID NO: 8). Recombinant PAI-1 was obtained from Ameican Diagnostica . Horseradish peroxidase (HRP) conjugated streptavidin is available from Pierce Chemical , Rockford, IL. Anti-M13 antibody is available from Pharmacia, Piscataway, NJ Comes from.   Affinity selection was performed using streptavidin-coated magnetic beads (Dynal, Roches ter, NY). Biotinylated suPAR (1.5 μg) in a total volume of 100 μl Was mixed with 3.5 μg of uPA1-48 for 30 minutes at room temperature. The magnetic beads were replaced with PBS / 1% BSA (PS (B / BSA) for 30 minutes and then the suPAR: uPA1-48 complex was spiked in PBS / 0.1% BSA. And incubated for 2 hours at room temperature. Then, the beads are washed with PBS / BSA Wash three times, and add 500 μl aliquots of 15 mer random peptide library And resuspended. For comparison, an identical aliquot of the beads was Vector (LP67, described in Devlin et al., Science 249: 404-406 (1990)). Incubated. Bacteriophage is allowed to bind at room temperature for 45 minutes, then Wash 7 times with ml PBS / BSA and ligate bacteriophage with 500 μl 60 mM Syn, eluted with 1.5 M urea (pH 2.5). Titrating the eluted bacteriophage, And Goodson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7129-7133 (1994), and Devlin Amplification was performed as described in Science 249: 404-406 (1990). Next, the amplification Lyophage was further rounded on the suPAR: uPA1-48 complex as described above. Selected for. DNA sequencing was performed on each bacteriophore by the dideoxy method. Performed on PCR amplification inserts from zip plaques.                                 Example 2 sUPAR Bacteriophage binding to   50 mM NaTwoCOThree100 μl (0.1 mg / ml) of streptavidin (pH 9.6) in MaxiSo Add to rp wells (Nunc), incubate overnight at 4 ° C, then wash with PBS / BSA Was cleaned. Biotinylated sUPAR (25 nM in PBS / BSA) is added to the wells and prior to washing Incubated for 2 hours at room temperature. Competitive peptide inhibitors are Immediately before phage addition, they were added to the wells. Incubate the wells for 1 hour at room temperature And then washed, and the bound bacteriophage is washed with 0.1 N HCl (pH 2.5). Eluted with 6M urea in. After 15 minutes, the urea eluate was mediumd by adding 2M Tris base. PH and the bacteriophage titer of the input stock and eluate Measured by plaque formation assay. The result is the input bar binding to the well. K Expressed as a percentage of teriophage. Alternatively, in the ELISA The amount of lyophage was determined. Here, the phage was mixed with HRP-conjugated anti-M13 antibody at room temperature. Pre-incubate for 30 minutes, then dispense into wells prepared as above, And incubated for 1 hour at room temperature. The final anti-M13 binding dilution was 1: 4000 Was. After washing, TMB substrate (100 μl / well) is added and the color is changed to 0.8 NHTwoSOFour(1 (00 μl / well). Then at 450 nm in a 96-well plate reader The absorbance was measured.   A novel peptide sequence was obtained by panning the uPA1-48: uPAR complex. on uPAR Selection of high affinity peptide ligands for the uPA binding site of Natl. Acad. Sci. USA 91: 7129-7133 (1994). Sett., Stratton-Thomas et al., Prot. Eng. 8: 463-470 (1995) To reduce the selection of uPA binding site peptides, a recombinant EFG-like domain of excess uPA (UPA1-48) to provide more functionally important sites on UPAR Choosing a peptide displaying bacteriophage with affinity More extended. EGF-like domains are described in Appella et al., J. Biol. Chem. 262: 4437-4440 (1 987) and Robbiati et al., Fibrinol. 4: 53-60 (1990). Binding motif, and Mazar et al., Fibrinol. 6: 49-55 (1992) Bind to uPAR with similar affinity (0.1-5 nM) as uPA. Devlin et al., Science 249: 404. -406 (1990). Affinity selection on suPAR: uPA1-48 complex immobilized on magnetic beads Was. Bacteriophage yield is 30-fold from the second 0.008% to the third 0.24% Increased, suggesting an enrichment of bound bacteriophage.   28 independent bacteriophages were isolated and random peptides were coded. The DNA segment to be loaded was sequenced. From these 28 bacteriophages, 23 And different affinity selections on immobilized sUPAR, Only four clones (7, 9, 18, and 25) have substantial yield (> 2%) Was. This means that most of the selected binding bacteriophages have substantial yields Up described in Goodson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7129-7133 (1994). In contrast to previous results of affinity selection with AR alone. These four Determine bacteriophage yield on suPAR in the presence and absence of uPA1-48 did. In addition, the encoded peptide was synthesized and used in Stratton-Thomas et al., Pro. t.Eng. 8: 463-470 (1995) and Kaufman et al., Anal. Biochem. 211: 261-266 (1993) Tested as competitor in suPAR binding assay as described. These conclusions The results are summarized in the table of FIG.   Binding of the selected bacteriophage is due to the presence of a 1000-fold molar excess of uPA1-48. Was hardly affected. In contrast, binds to the previously described uPA binding site Bacteriophages (clone 20 and uPA13-32) were both present on suPAR. Acad. Sci. USA 91: 7129-7133 (199). As reported in 4), in the presence of uPA1-48, the background level (500 times Decrease). These results were selected on the uPA1-48: uPAR complex. Bacteriophage has a different class of uPAR than clone 20 and uPA13-32. Suggested to present gand.   We bind the bacteriophage to the sUPAR domain 2-3 fragment. Has also shown. 100 μl of 50 mM NaTwoCOThree1 mg / ml protein G in (pH 9.6) To the MaxiSorp wells, incubate at 4 ° C. overnight, then in PBS / BSA Washed. 50 μl of monoclonal antibody against the epitope tag EYMPME at 1 mg / m 1 to PBS / BSA and incubated for 2 hours at room temperature. Wash well And add recombinant sUPAR domain 2-3 (1.7 μM in PBS / BSA) and add 1.5 μM at room temperature. Incubated for hours. Add wells to bacteriophage (approximately 108before pfu) Washed and then processed for binding to suPAR as described in the previous section.Example 3 Vitronectin binding assay   Vitronectin was obtained from Yatogo et al, Cello Struct. and Funct. 13: 281-292 (1988 Purified from human plasma by the method of). Purify vitronectin with 1 mM CaClTwoYou And 0.5 mM MgClTwoDiluted to 20 μg / ml in PBS containing 50 μl / well of I Dispense into mmulon II wells (Dynatech, Chantilly, VA) and incubate overnight at 4 ° C. And washed with PBS / BSA. Biotinylated sUPAR at 20 nM in PBS / BSA Ma And incubate for 30 minutes at room temperature (22 ° C) with or without test ligand. And dispensed at 100 μl / well and incubated for 90 minutes. Then Wash wells and 0.4 μg / ml horseradish peroxidase in PBS / 2% BSA (HRP) conjugated streptavidin is added for 1 hour, then washed and 100 μl / well The TMB substrate was added. Coloring 100 μl of 0.8N HTwoSOFourStop at and 96 wells The absorbance at 450 nm was measured with a plate reader (Dynatech, Chantilly, VA). Trial The antagonistic effect of the test ligand was increased to 20 nM in the presence of 20 nM uPA1-48. Measured as above, except that it was incubated with biotinylated sUPAR. Was.   uPA1-48: uPAR complex found to bind vitronectin with high affinity Was. Distinguish the effects of various peptide ligands on uPAR: vitronectin interaction To analyze, we based on an in vitro ELISA for this interaction. The assay was developed. Here, biotinylated suPAR and uPA1-48 are Binds to purified vitronectin and binds sUPAR to HRP-conjugated streptavidin Detect with gin. As shown in FIG. 1, under the conditions of this assay, biotinylated uPAR Binding to vitronectin is strictly dependent on uPA1-48. uPA1-48: suPAR complex The apparent stoichiometric binding of this interaction with vitronectin indicates that the affinity of this interaction is It is higher than the concentration of the coalescence (Kd <20 nM).   Peptides from bacteriophages bind to complex binding and vitronectin Blocking cell adhesion has also been found. From various bacteriophages The ability of the peptide to affect the binding of the uPA1-48: uPAR complex to vitronectin was determined by EL Evaluated in ISA assay. Two classes of peptides have been identified in this assay. And was an effective antagonist. First, direct binding of uPA1-48 to sUPAR Clone 20 and uPA13-32 competed with reduced binding. Very reduced reception An analog of the clone 20 peptide, which exhibits a pter binding activity, binds to vitronectin. Had no effect. Second, shows competition for greatly reduced uPA1-48 binding Clones 7 and 18 (see table in FIG. 6) also inhibited complex binding, while clones The scrambled version of Loan 7 did not hinder. When tested alone, The peptide did not increase the binding of biotinylated suPAR to vitronectin. Ba Clo, a third peptide that binds effectively to suPAR as terrier phage 25 had little or no effect on uPA1-48 stimulated vitronectin binding . Clone 7 and 18 peptides bind directly to vitronectin binding site on uPAR And bind vitronectin binding by uPAR: uPA1-48 directly to this site. In order to test whether or not inhibition by The effect of vitronectin on the binding of teriophage was tested. Vitronecti Reduces bacteriophage binding to the uPA1-48: suPAR complex by 5-10 fold, Hypothesis that these peptides mimic vitronectin as uPAR ligand Matched.   Wei et al., J. Biol. Chem. 269: 32380-32388 (1994). The results show that vitronectin binding by uPAR correlates with cell adhesion of stimulated U937 cells. Was shown. Clone 7 peptide may block uPAR-mediated adhesion of these cells However, a scrambled version of the same peptide may have no effect. Was found.   Furthermore, the binding of the uPA1-48: uPAR complex to vitronectin was confirmed by PAI-1 and vitronectin. Blocked by the somatomedin B domain of chin and vitronectin It was shown that. Another function of vitronectin is the active conformation of PAI-1 Has been determined to be stable, which is described in Seiffert et al., J. Biol. Chem. 269: 2659- 2666 (1994), via the somatomedin B domain of vitronectin. Seems to occur. PAI-1 binds the uPA1-48: suPAR complex to vitronectin It is a very effective competitor and has an apparent IC50 of 10 nM. This is the uPAR and Suggested that the binding sites of PAI-1 and PAI-1 overlap. Seiffert et al., J .Biol.Chem. 269: 2659-2666 (1994), high affinity biotin with active PAI-1 Lonectin binding has previously been demonstrated to be primarily through the somatomedin B domain. ing. Thus, we have identified vitronectin and recombinant somatomedin B domain. Mein was also tested if it inhibited uPAR binding to vitronectin. Conclusion As a result, we believe that the molecule inhibits, but not point mutations in the domain. showed that.   Next, the bacteriophage peptide was converted to the somatomedin B domain of vitronectin. And was also determined to be a binding site for PAI-1. Ba The sequences of peptides 7 and 18 from Cteriophage were compared to the sequence for this domain. The same sex was tested. As shown in FIG. 3, residues 24 to of the somatomedin B domain The conserved motif LXXArY between 28 and the clone 7 and 18 peptides (where X Is a hydrophilic residue and Ar = F, Y) is present. In addition, clone 7 And 18 share the sequence ELD immediately N-terminal to the conserved leucine, while The sequence D-E-L is adjacent to the conserved sequence LCSYY, Found at residues 22-24 of the B domain.   Which residues of peptide 7 are important for inhibition of uPAR binding and vitronectin binding To determine if, we substituted each residue separately with alanine, and Inhibition of bacteriophage binding to uPAR and uPA1-48: uPAR complex The union was tested for interference with binding to vitronectin. The results shown in FIG. In these assays, residues conserved between the peptide and vitronectin were Significant for activity.                                 Example 4 SuPAR: 1- Anilino-8-naphthalenesulfonic acid (ANS) fluorescence measurement   Determination of the effect of various peptide ligands on sUPAR / ANS fluorescence was determined by Ploug et al., Bi. ochem. 33: 8991-8997 (1994). Including competitors Fluorescence emission spectrum of sUPAR / ANS solution with or without exclusion wavelength of 386 nm, H with 5 nm band excitation and emission slits and 10 mm transmission length quartz cuvette Obtained using an itachi F-4500 fluorescence spectrophotometer. Emission spectrum from 400 to 600nm Was recorded. For competition measurements, make dilutions of the sUPAR / ANS stock solution and 2 μM sUPAR, 10 μM ANS, and 0-20 μM competition in PBS containing 0% DMSO Individual 0.5 ml aliquots with the final concentration of the compound were obtained. Measure fluorescence at 1 at 25 ° C Performed after hours incubation.   It was found that ANS fluorescence enhancement identified the peptide sequence. These peptides To further analyze the binding site of Gand, we examined the fluorescence enhancement of ANS. Their effect was tested. ANS fluorescence enhancement occurs upon uPAR binding and It has been shown to correlate with the occupancy and functional status of the uPA binding site of the PAR molecule (Pl oug et al., Biochem. 33: 8991-8997 (1994)). UP for some peptide uPAR ligands The effects on ANS fluorescence enhancement in the presence of AR indicate that uPA1-48 and clone 20 It had the expected result of reducing light. This means that receptor binding Consistent with their strong activity in Say. Clone 7 also has a higher concentration But reduced fluorescence in a dose-dependent manner. On the other hand, the pepti of clone 25 Has no effect up to 20 μM. These results indicate that clones 7, 20 and uPA1-4 8 share some common binding determinants or common binding structures of uPAR with ANS However, clone 25 was suggested to bind to a different site.                                 Example 5 The recombinant UPAR domain 2-3 fragment Binds bacteriophage but not uPA1-48   UPAR is described in Plow et al., FEBS Lett. 349: 163-168 (1994) It is the only member of the Ly6 / CD59 family that contains three repeats of the domain. Book Previous work by the inventors has shown that the binding site of vitronectin on uPAR is described by Wei et al. Biol. Chem. 269: 32380-32388 (1994) in domains 2 and 3 (D23). Suggested that To address this question further, we have In Sf9 insect cells infected with culovirus, a C-terminal 6 amino acid epitope tag The suPAR flagella that is predicted to contain both the second and third CD59 homology domains Fragment (residues 93-313) was expressed. Secretory protein to anti-epitope affinity Purify on a tea column and first compete for that in the suPAR binding assay. Was tested for ability. In this assay at 100 nM D23, the same conditions There was no competition in contrast to intact suPAR with an IC50 of 0.1 nM .   We then proceed to fix the immobilized D2 of various uPAR bacteriophage presenting ligands. The ability to bind to 3 was tested. The results shown in FIG. 5 indicate that the ligand is D23 and sUPAR Are separated into three different classes for the binding of Clone 20 and 13 -32 binds significantly only to intact sUPAR, while clones 9 and 25 have D2 Binds equally to 3 fragments and full length receptor. Of clones 7 and 18 Bacteriophages carrying the peptide show moderate binding to D23 and And substantially better binding to intact receptors.                                 Example 6 uPAR: Identification of integrin binding and binding sites   A cytoskeletal binding element that is important for integrin-dependent adhesion is also Embryonic kidney cells (293 cells) to determine whether they are involved in ) To manipulate the β1 cytoplasm fused to the transmembrane domain of complementarity-determining region 4 (CD4) UPAR was co-expressed with the tail chimeric protein. This chimera β Expression of one construct is described in Lukashev et al. Biol. Chem. 26: 18311 (1994) Isolates binding cytoplasmic elements to protect against integrin-mediated adhesion Has been shown to exert a dominant negative effect. uPAR β1 cytoplasm Co-expression with mains completely eliminated uPAR-dependent vitronectin adhesion. Luka shev et al. Biol. Chem. 26: full length or short prepared as in 1831 (1994) Transfected clone expressing the reduced β1 cytoplasmic tail with GPI-uPAR cDNA And Wei et al. Biol. Chem. 169: 32380 (1994). Induction of chimeric β1 expression by cadmium for 6 hours before adhesion to vitronectin Was assayed at 37 ° C. After induction of full-length β1 chimera, cells were coated with vitronectin Cotransfectants that essentially did not adhere at all to the surface but express truncated β1 Tanto adhered well.   uPAR and control (described in Lukashev et al., J. Biol. Chem. 26: 18311 (1994)). Co-expresses a shortened β1 cytoplasmic domain that cannot bind to other cytoskeletal proteins Cells adhered normally. Inhibition of adhesion at 37 ° C Despite comparable urokinase and vitronectin binding at 4 ° C This is the result of β1 cytoplasmic tying of cytoskeletal binding elements important for adhesion. And a competition between uPAR was suggested.   Based on these results, immunoprecipitation experiments were performed to confirm that uPAR It was decided whether to physically associate with phosphorus. IL-2R alpha transmembrane domain and short Chimeric uPAR (TM) composed of the extracellular domain of uPAR fused to a cytoplasmic tail -uPAR) -expressing stable transfectants were generated as controls . This chimeric uPAR is described in Hui et al. Biol. Chem. 269: 8153 (1994) It binds urokinase, comparable to GPI-uPAR. Human urokinase receptor Human and human interleukin-2 receptor full length cDNA From di and human T cells by reverse transcription and polymerase chain reaction, respectively. Isolated. uPAR extracellular domain (amino acids 1-281) and IL-2R α transmembrane / A chimeric cDNA construct encoding the cytoplasmic domain (amino acids 218-251) was prepared. The chimeric cDNA was subcloned into pBluescript and nucleotide sequenced (Sequence nase, United States Biochemical Corp), followed by XbaI and XhoI And finally subcloned into the pCEP4 expression vector. Simultaneous Lansfectant is described in Wei et al. Biol. Chem. 269: 32380 (1994) Shows binding to equivalent amounts of vitronectin and urokinase at 4 ° C. did.   By immunoblotting, comparable to GPI-uPAR and TM-uPAR in 293 cells Expression and comparable urokinase and vitronectin binding . Triton X 100 (0.2%) insoluble fraction of GPI-uPAR 293 cells can be dissolved in polar detergent When solubilized, immunoprecipitation of β1 was clearly demonstrated by Filardo et al. Cell. Biol. 1995 Co-precipitate uPAR as described during printing: cells (5 × 106) And culture overnight , Microtubule stabilizing buffer (0.1 M PIPES (pH 6.9), 2 M glycerol, 1 mM EDTA, And 1 mM magnesium acetate) and then 0.2% on ice for 5 minutes Triton X 100 and inhibitor (1 mM sodium orthovanadate, 1 mM filter) Phenylsulfonyl fluoride, 10 mg / ml leupeptin). Was. Insoluble residues were removed by adding 1 × RI supplemented with protease inhibitor at 4 ° C. for 20 minutes. PA buffer (150 mM sodium chloride, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1% deoxychol Acid, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 1% Triton X-100). triton The soluble fraction was diluted 1: 1 with 2 × RIPA buffer. Separate both fractions for 10 minutes at 6000 rpm Hearts are separated and then 2 hours at 4 ° C. with non-immune serum and protein A-agarose Was pre-clarified by incubation. Transfer the supernatant to a fresh tube and And incubated with antibodies to β1 or caveolin at 4 ° C for 2 hours Was. Exemption Epidemic complexes were recovered on protein A-agarose. Washed immunoprecipitate with 8% SDS -PAGE and transferred onto nitrocellulose membrane. 5 filters % Skim milk powder and 1 μg / ml anti-uPAR Mab R2 (E. Ronne, Finsen  Lab, Denmark). Wash the blot and add HRP-conjugated antibody Both were incubated for 1 hour. After washing, enhance membrane by chemiluminescence (NEN DuPont, Wilmington, DE) using the manufacturer's protocol. Color.   Similar results were obtained when the rat monoclonal β1 antibody was replaced. triton The β1 immunoprecipitate of the X100 detergent soluble fraction showed no uPAR. further Very little or no association between uPAR and β1, This was demonstrated by TM-uPAR in the triton fraction.   The observed uPAR / β1 / cavelion complex is functional in cell adhesion assays Determined if relevant. GPI-uPAR and TM-uPAR are the same at 4 ℃ But only GPI-uPAR expressing cells responded to vitronectin Showed enhanced adhesion. This suggests that uPAR association with β1 is required I do.   To further test this hypothesis, a phage-displayed peptide library was constructed using uP Screened for AR binding phage. Good phage peptides son et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 7129 (1994). . One phage blocks both urokinase / uPAR and vitronectin / uPAR association. A uPAR-binding peptide that does not check was presented. This peptide, peptide 25 and Several controls were synthesized, purified, and evaluated for their effect on adhesion. Screened. Peptide 25 (but not control) Eliminate GPI-uPAR-dependent adhesion to tronectin (about 60 μM IC50Find that Was done. Peptide 25 is transferred to fibronectin by untransfected 293 cells Had no effect on adhesion. Next, immunoprecipitation experiments were performed to determine whether this peptide The effect of uPAR and control peptide on the association of uPAR with β1 was evaluated. Pep Tide 25 (but not the control peptide) binds the β1 / caveolin / uPAR complex, Sufficient disruption was achieved at a concentration that blocked adhesion (100 μM). First screenin G Tested some additional non-inhibitory peptides from and the β1 / uPAR co-precipitation Has no effect. This is the β1 / GPI-uPAR / caveolin complex Confirm that the coalescing acts as an adhesive unit.   In addition, the minimal motif for peptide 25 was Determined by alanine scan of Pide 25:   Residue change to alanine Percentage inhibition of phage binding     None (clone 25) 100   S-1 99   T-2 69   Y-3 21   H-4 17   H-5 100   L-6 0   S-7 99   L-8 96   G-9 16   Y-10 16   M-11 35   Y-12 17   T-13 39   L-14 98   N-15 100   These data indicate that the minimum motif required for binding inhibition is YHXLXX in clone 25. GYMYT (SEQ ID NO: 5) (where X is any amino acid) You.   These data indicate that uPARs associate with specific integrins and modify their function. Indicates to decorate. This association is based on a specific matrix protein (vitronectin) Promotes adhesion to migrating to, and anxiety about the normal adhesion function of integrins To standardize. In vivo, the ability of uPAR to destabilize integrin-dependent adhesion Is enhanced by the simultaneous binding of the protease, urokinase.                                 Example 7 uPAR Of additional ligands that bind to   In the uPAR binding assay, the following analogs were used Tested in competition with either 25 or peptide 9. Analogs are natural and non- Contains both natural amino acids.   In the table below, the analog sequence is shown with the amino terminus of the analog printed on the left. Listed. Unless otherwise specified, use single letter amino acid abbreviations for analog sequences. Was. Lowercase letters indicate D-amino acids. For example, "s" indicates D-serine. Anna Logs 2-4 and 31-96 have a free amino-terminal and C-terminal carboxamide. Analog 5-30 has an acetylated end (Ac-oligomer-NHTwo)including.   The analog was converted to an assay using soluble uPAR, similar to the method described in Example 2. Tested in a. The analog was converted to phage-displayed peptide 9 or peptide. Were tested for their ability to compete with any of C.25. Pep analog 3-61 Tested in competition with Pide 25. Analogues 62-96 were tested in competition with peptide 9. Was. About 108Plaque forming units of phage were used in the assay. Analog 3-30 results   Analogs were assayed in a uPAR competition assay with peptide 25 displayed by phage. Tested at a concentration of 40 μM. The results where the analog was active are shown below. Analog 31-61 Results   Analogues 31-61 are linked to their ability to compete with phage displayed peptide 25 Was tested. The active analog was added at two additional concentrations (5 μM and 2.5 μM ) Tested. These concentrations were calculated based on the synthesis reaction. But the array*The As a result of the tests, it was determined that they contained a large amount of amino acids. M or could be higher than 2.5 μM.   The results of the test with the active analog are shown below: Results for oligomers 62-79   An alanine scan was performed using the sequence of peptide 9. Distribution of analog 62-79 The row is the same as peptide 9 except that the alanine residue was replaced at a certain position in the sequence. is there. Analogs 62-79 are all of the possible alanine substitutions in peptide 9.   The results of the Ala scan are Leu at position 6, Tyr at position 11, Var at position 12, and Tyr at position 13. Shows that the alanine substitution of A destroyed the receptor binding activity. 2nd place Glu, 4th place Substitution of Phe or Leu at position 14 by an alanine of the oligomer compared to peptide 9 Receptor binding activity was reduced but not destroyed.Analog 80-96 results   Analogues 80-96 are converted to their ability to compete with phage displayed peptide 9 Was tested. The active analog was added at two additional concentrations (5 μM and 2.5 μM ). These concentrations were calculated based on the synthesis reaction. But the array*To Further testing determined that it contained a small amount of amino acids, and the amount tested was 5 It could be below μM or 2.5 μM.   The results of the test with the active analog are shown below:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 4/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 7/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 33/566 37/64 (72)発明者 ローゼンバーグ，スティーブン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94602, オークランド，バイウッド ドライブ 2323 (72)発明者 ドイル，マイケル アメリカ合衆国 カリフォルニア 94611, オークランド，マウンテンゲート ウェイ 2709 (72)発明者 チャップマン，ハロルド エイ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02168，ニュートン，ワバン アベニュー 435──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C07K 4/12 C12P 21/02 C 7/08 G01N 33/15 Z C12P 21/02 33/50 Z G01N 33 / 15 33/566 33/50 A61K 37/02 33/566 37/64 (72) Inventor Rosenberg, Steven United States of America California 94602, Auckland, Bywood Drive 2323 (72) Inventor Doyle, Michael United States of America 94611, Auckland, Mountain Gateway 2709 (72) Inventor Chapman, Harold A. Massachusetts, USA 02168, Newton, Wabana Avenue 435

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．標的ポリペプチド配列上のオーファン結合部位を同定する方法であって、 (a)潜在的リガンドのライブラリーを提供する工程、 (b)該標的ポリペプチドの公知のリガンドと接触している該標的ポリペプチド を提供する工程、 (c)該標的ポリペプチドおよび公知のリガンドを該潜在的リガンドと接触させ る工程、および (d)該公知のリガンドの存在下で、該標的ポリペプチドに結合し、該標的ポリ ペプチドと結合対を形成する該潜在的リガンドを同定する工程、 を包含する、方法。 ２．前記該潜在的リガンドのライブラリーが、バクテリオファージライブラリー 含む、請求項１に記載の方法。 ３．前記標的ペプチド配列が、レセプター、リガンド、成長因子、ポリペプチド ホルモン、サイトカイン、分化因子、シグナル伝達可能な分子、酵素、細胞外マ トリックス相互作用に関与するポリペプチドからなる群より選択される配列を含 む、請求項１に記載の方法。 ４．前記レセプターが、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレセプタ ー、ならびにビトロネクチンおよびuPAからなる群より選択される１つを含む公 知のリガンドである、請求項３に記載の方法。 ５．前記潜在的リガンドが、ランダム合成ペプチド、低分子、ペプトイド、ポリ ペプチド、およびポリヌクレオチドからなる群より選択される１つを含む、請求 項１に記載の方法。 ６．前記潜在的リガンドを、前記標的ポリペプチドおよび未知のリガンドと接触 させ、該標的ポリペプチドと未知のリガンドとの間の結合対相互作用を拮抗する 潜在的リガンドを同定する、請求項１に記載の方法。 ７．前記未知のリガンドがインテグリンである、請求項６に記載の方法。 ８．ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレセプター(uPAR)と結合し、 そしてuPARのインテグリンとの結合を阻害する、単離されたペプチド。 ９．AESTYHHLSLGYMYTLN（配列番号4）、YHXLXXGYMYT（配列番号5）（Xは任意の アミノ酸）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の単 離されたペプチド。 １０．ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレセプター(uPAR)と結合し 、そしてuPARのビトロネクチンとの結合を阻害する、単離されたペプチド。 １１．AEPVYQYELDSYLRSYY（配列番号１）、およびAELDLSTFYDIQYLLRT（配列番号 ３）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の単離さ れたペプチド。 １２．AEFFKLGPNGYVYLHSA（配列番号２）、およびFKLXXXGYVYL（配列番号６）（ Xは任意のアミノ酸）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ウロキナ ーゼプラスミノーゲンアクチベーターレセプター(uPAR)と結合する単離されたペ プチド。 １３．ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレセプター(uPAR)と結合し 、そしてuPARのインテグリンとの結合を阻害するペプチドをコードする配列を含 む、単離されたポリヌクレオチド。 １４．前記配列が、AESTYHHLSLGYMYTLN（配列番号4）、およびYHXLXXGYMYT（配 列番号5）（Xは任意のアミノ酸）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む ペプチドをコードする、請求項１３に記載の単離されたポリヌクレオチド。 １５．ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレセプター(uPAR)と結合し 、そしてuPARのビトロネクチンとの結合を阻害するペプチドをコードする配列を 含む、単離されたポリヌクレオチド。 １６．前記配列が、AEPVYQYELDSYLRSYY（配列番号１）、およびAELDLSTFYDIQYLL RT（配列番号３）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコー ドする、請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチド。 １７．ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレセプター(uPAR)と結合す るペプチドをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該 ペプチドが、AEFFKLGPNGYVYLHSA（配列番号２）、およびFKLXXXGYVYL（配列番号 ６）（Xは任意のアミノ酸）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単 離されたポリヌクレオチド。 １８．uPAおよびuPARのアップレギュレーションによって特徴づけられる障害を 有する患者を処置する方法であって、 (a)uPAR:インテグリン結合対の有効量のアンタゴニストを提供する工程、 (b)該アンタゴニストを該患者に投与する工程 を包含する、方法。 １９．前記アンタゴニストが、AESTYHHLSLGYMYTLN（配列番号4）およびYHXLXXGY MYT（配列番号5）（Xは任意のアミノ酸）からなる群より選択されるアミノ酸配 列を含むペプチドである、請求項１８に記載の方法。 ２０．前記アンタゴニストが、AESTYHHLSLGYMYTLN（配列番号4）およびYHXLXXGY MYT（配列番号5）（Xは任意のアミノ酸）からなる群より選択されるアミノ酸配 列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１８に記載の方 法。 ２１．前記障害が、細胞移動をさらに含むuPAおよびuPARのアップレギュレーシ ョンによって特徴づけられる、請求項１８に記載の方法。 ２２．前記障害が、ガンおよび慢性の炎症からなる群より選択される１つをさら に含む、請求項１８に記載の患者を処置する方法。 ２３．uPAR:インテグリン相互作用のアンタゴニストをスクリーニングする方法 であって、 (a)uPAR:インテグリン相互作用のペプチドアンタゴニストを提供する工程； (b)uPARへの結合に対する候補アンタゴニストと該ペプチドアンタゴニストを 競合させる工程； (c)uPAR結合に対する該ペプチドアンタゴニストとの競合能により候補アンタ ゴニストを同定する工程； を包含する、方法。 ２４．前記ペプチドアンタゴニストが、AESTYHHLSLGYMYTLN（配列番号4）および YHXLXXGYMYT（配列番号5）（Xは任意のアミノ酸）からなる群より選択されるア ミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。 ２５．前記候補アンタゴニストが、低分子、ペプチド、およびペプトイドからな る群より選択される、請求項２４に記載の方法。 ２６．uPAR:ビトロネクチン相互作用のアンタゴニストをスクリーニングする方 法であって、 (a)uPAR:ビトロネクチン相互作用のペプチドアンタゴニストを提供する工程； (b)uPARへの結合に対する候補アンタゴニストと該ペプチドアンタゴニストを 競合させる工程； (c)uPAR結合に対する該ペプチドアンタゴニストとの競合能により候補アンタ ゴニストを同定する工程； を包含する、方法。 ２７．前記ペプチドアンタゴニストが、AEPVYQYELDSYLRSYY（配列番号１）、お よびAELDLSTFYDIQYLLRT（配列番号３）からなる群より選択されるアミノ酸配列 を含む、請求項２６に記載の方法。 ２８．ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレセプター（uPAR）に結合 する候補をスクリーニングする方法であって、 (a)AEFFKLGPNGYVYLHSA（配列番号２）、およびFKLXXXGYVYL（配列番号６）（X は任意のアミノ酸）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを提 供する工程； (b)ｕＰＡＲへの結合に対する候補と該ペプチドを競合させる工程； (c)uPAR結合に対する該ペプチドとの競合能により候補を同定する工程； を包含する、方法。 ２９．uPAR:インテグリン結合対の有効量のアンタゴニストおよび薬学的に受容 可能なキャリアを含む、uPAおよびuPARのアップレギュレーションによって特徴 づけられる障害を処置するための薬学的組成物。 ３０．前記アンタゴニストが、AESTYHHLSLGYMYTLN（配列番号4）およびYHXLXXGY MYT（配列番号5）（Xは任意のアミノ酸）からなる群より選択されるアミノ酸配 列を含むペプチドを含む、請求項２９に記載の薬学的組成物。 ３１．前記障害が、細胞移動をさらに含むuPAおよびuPARのアップレギュレーシ ョンによって特徴づけられる、請求項２９に記載の薬学的組成物。 ３２．AEPVYQYELDSYLRSYY（配列番号１）、AEFFKLGPNGYVYLHSA（配列番号２）、 AELDLSTFYDIQYLLRT（配列番号３）、AESTYHHLSLGYMYTLN（配列番号4）、YHXLXXG YMYT（配列番号5）およびFKLXXXGYVYL（配列番号6）（Xは任意のアミノ酸）から なる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする有効量の核酸を 含む、uPAおよびuPARのアップレギュレーションによって特徴づけられる障害を 有する患者を処置するための薬学的組成物。 ３３．前記薬学的受容可能なキャリアが、リポソーム、ゲル、ポリマーマトリッ クス、泡、および緩衝液からなる群より選択される１つを含む、請求項３２に記 載の薬学的組成物。[Claims] 1. A method for identifying an orphan binding site on a target polypeptide sequence, comprising:   (a) providing a library of potential ligands,   (b) the target polypeptide in contact with a known ligand for the target polypeptide Providing the process,   (c) contacting the target polypeptide and a known ligand with the potential ligand Process, and   (d) binding to the target polypeptide in the presence of the known ligand, Identifying the potential ligand that forms a binding pair with the peptide, A method comprising: 2. The library of potential ligands is a bacteriophage library The method of claim 1, comprising: 3. The target peptide sequence is a receptor, a ligand, a growth factor, a polypeptide Hormones, cytokines, differentiation factors, signaling molecules, enzymes, extracellular Contains a sequence selected from the group consisting of polypeptides involved in The method of claim 1. 4. The receptor is urokinase plasminogen activator receptor And one comprising a member selected from the group consisting of vitronectin and uPA. 4. The method of claim 3, which is a known ligand. 5. The potential ligand is a random synthetic peptide, small molecule, peptoid, poly Claims comprising one selected from the group consisting of a peptide and a polynucleotide Item 1. The method according to Item 1. 6. Contacting the potential ligand with the target polypeptide and an unknown ligand To antagonize the binding pair interaction between the target polypeptide and an unknown ligand 2. The method of claim 1, wherein the potential ligand is identified. 7. 7. The method of claim 6, wherein said unknown ligand is an integrin. 8. Binds to urokinase plasminogen activator receptor (uPAR), And an isolated peptide that inhibits the binding of uPAR to integrins. 9. AESTYHHLSLGYMYTLN (SEQ ID NO: 4), YHXLXXGYMYT (SEQ ID NO: 5) (X is any The amino acid sequence of claim 8, comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: Released peptide. 10. Binds to urokinase plasminogen activator receptor (uPAR) And an isolated peptide that inhibits uPAR binding to vitronectin. 11. AEPVYQYELDSYLRSYY (SEQ ID NO: 1) and AELDLSTFYDIQYLLRT (SEQ ID NO: 11. The isolated according to claim 10, comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of 3). Peptide. 12. AEFFKLGPNGYVYLHSA (SEQ ID NO: 2) and FKLXXXGYVYL (SEQ ID NO: 6) ( X is an amino acid sequence selected from the group consisting of Isolated plasmid that binds to plasminogen activator receptor (uPAR) Puchido. 13. Binds to urokinase plasminogen activator receptor (uPAR) And a sequence encoding a peptide that inhibits the binding of uPAR to integrin. , An isolated polynucleotide. 14． The sequence has AESTYHHLSLGYMYTLN (SEQ ID NO: 4) and YHXLXXGYMYT (SEQ ID NO: 4). Column No. 5) includes an amino acid sequence selected from the group consisting of (X is any amino acid) 14. The isolated polynucleotide of claim 13, which encodes a peptide. 15. Binds to urokinase plasminogen activator receptor (uPAR) And a sequence encoding a peptide that inhibits uPAR binding to vitronectin An isolated polynucleotide comprising: 16. The sequence comprises AEPVYQYELDSYLRSYY (SEQ ID NO: 1) and AELDLSTFYDIQYLL A peptide containing an amino acid sequence selected from the group consisting of RT (SEQ ID NO: 3) 16. The isolated polynucleotide of claim 15, wherein the polynucleotide is a polynucleotide. 17． Binds to urokinase plasminogen activator receptor (uPAR) An isolated polynucleotide comprising a sequence encoding a peptide, The peptides were AEFFFKLGPNGYVYLHSA (SEQ ID NO: 2) and FKLXXXGYVYL (SEQ ID NO: 6) a single amino acid sequence comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of (X is any amino acid) Released polynucleotide. 18. Disorders characterized by upregulation of uPA and uPAR A method of treating a patient having   (a) providing an effective amount of an antagonist of uPAR: integrin binding pair,   (b) administering the antagonist to the patient A method comprising: 19. The antagonist is AESTYHHLSLGYMYTLN (SEQ ID NO: 4) and YHXLXXGY An amino acid sequence selected from the group consisting of MYT (SEQ ID NO: 5) (X is any amino acid) 19. The method of claim 18, which is a peptide comprising a sequence. 20. The antagonist is AESTYHHLSLGYMYTLN (SEQ ID NO: 4) and YHXLXXGY An amino acid sequence selected from the group consisting of MYT (SEQ ID NO: 5) (X is any amino acid) 19. The method of claim 18, comprising a polynucleotide encoding a peptide comprising the sequence. Law. 21. The disorder may further include cell migration Upregulation of uPA and uPAR 19. The method according to claim 18, characterized by an option. 22. The disorder further comprises one selected from the group consisting of cancer and chronic inflammation. 19. The method of treating a patient according to claim 18, comprising: 23. uPAR: a method to screen for antagonists of integrin interaction And   (a) providing a peptide antagonist of uPAR: integrin interaction;   (b) a candidate antagonist for binding to uPAR and the peptide antagonist Competing;   (c) candidate antagonists due to their ability to compete with the peptide antagonist for uPAR binding Identifying a gonist; A method comprising: 24. The peptide antagonist is AESTYHHLSLGYMYTLN (SEQ ID NO: 4) and A member selected from the group consisting of YHXLXXGYMYT (SEQ ID NO: 5) (X is any amino acid) 24. The method of claim 23 comprising a amino acid sequence. 25. The candidate antagonist comprises a small molecule, a peptide, and a peptoid. 26. The method of claim 24, wherein the method is selected from the group consisting of: 26. uPAR: Screening for antagonists of vitronectin interaction Law,   (a) providing a peptide antagonist of uPAR: vitronectin interaction;   (b) a candidate antagonist for binding to uPAR and the peptide antagonist Competing;   (c) candidate antagonists due to their ability to compete with the peptide antagonist for uPAR binding Identifying a gonist; A method comprising: 27. The peptide antagonist is AEPVYQYELDSYLRSYY (SEQ ID NO: 1); And an amino acid sequence selected from the group consisting of AELDLSTFYDIQYLLRT (SEQ ID NO: 3) 27. The method of claim 26, comprising: 28. Binding to urokinase plasminogen activator receptor (uPAR) A method of screening candidates for   (a) AEFFKLGPNGYVYLHSA (SEQ ID NO: 2) and FKLXXXGYVYL (SEQ ID NO: 6) (X Is a peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of Providing;   (b) competing the peptide with a candidate for binding to uPAR;   (c) identifying a candidate by its ability to compete with the peptide for uPAR binding; A method comprising: 29. uPAR: an effective amount of an integrin binding pair antagonist and pharmaceutically acceptable Characterized by uPA and uPAR up-regulation, including possible carriers Pharmaceutical compositions for treating the indicated disorders. 30. The antagonist is AESTYHHLSLGYMYTLN (SEQ ID NO: 4) and YHXLXXGY An amino acid sequence selected from the group consisting of MYT (SEQ ID NO: 5) (X is any amino acid) 30. The pharmaceutical composition of claim 29, comprising a peptide comprising a sequence. 31. The disorder may further include cell migration Upregulation of uPA and uPAR 30. The pharmaceutical composition according to claim 29, wherein the composition is characterized by the following: 32. AEPVYQYELDSYLRSYY (SEQ ID NO: 1), AEFFKLGPNGYVYLHSA (SEQ ID NO: 2), AELDLSTFYDIQYLLRT (SEQ ID NO: 3), AESTYHHLSLGYMYTLN (SEQ ID NO: 4), YHXLXXG From YMYT (SEQ ID NO: 5) and FKLXXXGYVYL (SEQ ID NO: 6) (X is any amino acid) An effective amount of a nucleic acid encoding a peptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: Disorders characterized by up-regulation of uPA and uPAR, including Pharmaceutical composition for treating a patient having. 33. The pharmaceutically acceptable carrier is a liposome, gel, polymer matrix. 33. The method according to claim 32, comprising one selected from the group consisting of a liquid, a foam, and a buffer. The pharmaceutical composition as described above.
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