【発明の詳細な説明】
新規植物ステロイド5αレダクターゼ、DET2
発明の分野
本発明は、一般的に植物の遺伝子操作に関し、特に作物収量の増大という表現
型を有する点に特徴をもつ遺伝子操作された植物の作製に関する。
発明の背景
植物の生長および発達は、環境シグナルと内部因子との間の複雑な相互作用に
より支配される。光は、発芽から開花誘導まで、植物のライフサイクルを通じて
多くの発達過程を調節し(Chory，J．Trends Genet.，9:167，1993;McNellisおよ
びDeng，Plant Cell，7:1749，1995)、若い実生に重大な形態変化をもたらす。
光の存在下では、胚軸生長が阻害され、子葉が展開し、葉が発達し、葉緑体が分
化し、クロロフィルが産生され、さらに、多くの光誘導遺伝子が同調して発現さ
れる。細胞の分裂、伸長および分化に影響を及ぼすことが知られている植物ホル
モンは、光シグナルに対する植物の応答に直接関与していることが示唆されてい
る(P.J．Davies，Plant Hormones:Physiology，Biochemistry and Molecular Bi
ology，1-836頁，1995;GreefおよびFreddericq，Photomorphogenesis，401-427
頁，1983)。しかしながら、光変換経路と植物ホルモンとの間の相互作用につい
ては十分に理解されていない。
ブラシノステロイド類は、高い比活性および植物ステロイドホルモン活性を有
する生物学的に活性のある天然産物の独特のクラスである。作物への使用のため
の有効濃度が低いので、それらは環境上安全であり、大規模に用いられる場合で
も、これらブラシノステロイド類は一般的に無毒である。生理学的レベルでは、
ブラシノステロイド類は多くの変化を誘導し、植物における新しいクラスのホル
モンといってもよい。ブラシノステロイド類は世界規模の経済的効果を持つ可能
性がある。ブラシノステロイド類は農薬および環境悪化からの植物防護剤として
用いることができる。加えて、ブラシノステロイド類は昆虫制御に重要であると
考えられる。さらに、ブラシノステロイド類は植物およびその他の種の生殖サイ
クルのいくつかのステージを調節し、それにより生殖過程を増強もしくは低下さ
せる手段を提供できる可能性がある。例えば、ある園芸作物においては、葉、球
根および他の貯蔵器官のごとき他の器官の生産の継続を確実にするため、開花過
程を排除することが望ましいと考えられる。このような生殖過程のモジュレーシ
ョンは、特定の種子担持雑草の制御に重要であり得、そこでは開花サイクルの休
止が次に続く発生を排除する。またブラシノステロイド類は、根の生長を刺激し
、外用しても植物の奇形を引き起こさないようである。
ブラシノステロイド類は生化学的農薬としての分類に適格である。このような
農薬は一般に、それらの独特の作用様式、低い有効濃度、標的種および特異性に
より、従来の化学農薬とは区別される。歴史的に見ると、ブラシノステロイド類
は、それらの生産にかかるコスト、並びにそれらの精製の難しさゆえに、実際に
は農業用途には用いられていない。
発明の概要
ステロイドホルモンは動物の発達に重要であるが、植物ステロイドの生理学的
な役割はほとんど知られていない。本発明は、哺乳動物ステロイド5α-レダクタ
ーゼに対して有意な配列同一性を有するタンパク質をコードし、ブラシノライド
生合成経路に関与しているDET2遺伝子の発見に基づくものである。ヒトステロイ
ドレダクターゼの活性に必要なグルタミン酸204の突然変異は、DET2のin vivo活
性を完全に破壊し、光調節発達の欠損をもたらす。これらの欠損は植物ステロイ
ド、ブラシノライドの適用によって改善することができる。
第一の態様では、本発明はDET2ポリペプチドおよびDET2をコードする単離ポリ
ヌクレオチド配列を提供する。
もう一つの態様では、本発明は野生型植物に比べて収量が増大した点に特徴を
有する遺伝子的に修飾された植物の作製方法を提供する。該方法は、作動可能に
プロモーターに連結させた少なくとも１コピーのDET2をコードするポリヌクレオ
チド、または他のステロイド5α-レダクターゼ（例えば、哺乳動物のもの）をコ
ードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入して形質転換植物細胞を得、該形質
転換植物細胞から植物を生産することを含む。このような遺伝子的に修飾された
植物は、例えば、作物収量の増大、またはバイオマスの増大を示す可能性がある
。
本発明のさらにもう一つの態様では、その天然プロモーターに作動可能に連結
した天然DET2遺伝子を有する植物を、DET2遺伝子の発現を誘導する薬剤のプロモ
ーター誘導量と接触させ、そこでDET2遺伝子発現の誘導の結果として、誘導剤と
接触していない植物に比べて収量が増大した植物が生産されることを特徴とする
植物の生産方法を提供する。かくして、収量を増大させるために、転写因子また
は化学薬剤を用いて植物内でDET2の発現を増強させることができる。
図面の簡単な説明
図１はDET2遺伝子のクローニングおよび配列解析の模式図である。図１Ａはポ
ジショナルクローニングの概略を示す。３つのクラスのｃＤＮＡは、プローブと
してコスミド217-61を用い、アラビドプシス(Arabidopsis)ｃＤＮＡライブラリ
ーから同定され、それらの相対的な位置および転写方向(5-3')が示されている。
図１ＢはDET2およびDET2遺伝子の変異の遺伝子構造地図を示す。太線はエキソン
を示し、中抜きの四角はイントロンを示す。突然変異の位置は開始コドンに対し
て相対的な位置である。Ｚは停止コドンである。図１ＣはDET2のヌクレオチド配
列および推定アミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号１および２）。
図２は、野生型DET2遺伝子によるdet2の補充後の、明所で生育させた12日齢の
実生（図２Ａ）および暗所で生育させた10日齢の実生（図２Ｂ）の写真を示す。
（各パネルの左から右へ）野生型Col-0、det2-1、およびコスミド217-61を含む
トランスジェニックdet2-1。
図３は、DET2と哺乳動物ステロイド5α-レダクターゼとの配列比較を示す。図
３Ａは、ラット(rS5R1およびrS5R2)およびヒト(hS5R1およびhS5R2)由来のステロ
イド5α-レダクターゼとともに並べたDET2遺伝子の推定アミノ酸配列である。ダ
ッシュは配列を最大にするために導入されたギャップを示し、５つの配列のうち
少なくとも２つにおいて保存されている残基には網掛けを施している。矢印はde
t2-1およびdet2-6対立遺伝子内で変異したグルタミン酸を示す。(アミノ酸残基
についての１文字表記は下記の通りである:A，Ala;C，Cys;D,Asp;E，Glu;F,-Phe
；G，Gly;H，His;I，Ile;K，Lys;L，Leu;M，Met;N，Asn;P，Pro;Q，Gln;R，Arg;
S，Ser;T，The;V，Val:W，Trp；およびY，Try)。図３Ｂは、DET2タンパク質と哺
乳動物ステロイド5α-レダクターゼとの間の関係の系統発生解析を示す。スケー
ルは配列間の相対的距離を表している。
図４Ａは、ブラシノライド生合成経路において提案されるDET2タンパク質の作
用を示す。アステリスク（*）は６つの中間工程を示す(Fujickaら，前記)。
図４Ｂは暗所で生育させた10日齢のアラビドプシス(Arabidopsis)実生を示し
、図４Ｃは明所で生育させた12日齢の実生を示す。各パネルは左から右に、野生
型、det2-1、およびブラシノライド処理det2-1植物を示す。
図４Ｄは、暗所で生育させた実生および明所で生育させた野生型植物の、用量
に対するブラシノライドにより誘導される胚軸伸長を示す。データは、各12個体
の実生の平均サンプルサイズの３回の測定から得られた平均±標準誤差を示す。
図５は、哺乳動物ステロイド5α-レダクターゼ（パネルＡ）およびアラビドプ
シス(Arabidopsis)DET2(パネルB)によって触媒される化学反応を示す。
図６は、アラビドプシス(Arabidopsis)DET2がステロイド5α-レダクターゼ活
性を有していることを示す。64nM[14C]プロゲステロンをヒトステロイド5α-レ
ダクターゼ１型のｃＤＮＡ（レーン１）、インサートなし（レーン２）、野生型
DET2（レーン３）、またはdet2-1（レーン４）を含有するpCMV5発現プラスミド
でトランスフェクトした293ヒト胚形成細胞と共にインキュベーションすること
によって得られたステロイド類の薄層クロマトグラフィーを示す。
図７は、DET2のステロイド5α-レダクターゼ活性の生化学的特性を示す。
図７Ａは、[14C]テストステロンに関するラインウェーバー・バーク・プロッ
ト(Lineweaver-Burkplot)である。
図７Ｂは、[14C]プロゲステロンに関するラインウェーバー・バーク・プロッ
ト(Lineweaver-Burkplot)である。
図７Ｃは、4-MAによるDET2酵素活性の拮抗阻害を示す。ステロイド5α-レダク
ターゼ活性は、示された濃度の4-MAおよび0.34mMまたは0.68mMの[14C]プロゲス
テロンの存在下でアッセイした。２本の直線の交点をKiとする(Dixon，M.および
Webb，E.C.，（1979）Enzymes Academic，NewYork)。
図７Ｄは、基質として[14C]テストステロンを用いるDET2ステロイド5α-レダ
クターゼ活性のｐＨプロフィールを示す。アッセイは、37℃にて20分間、5mgの
細胞ライゼートタンパク質、1mM[14C]テストステロンおよび2.0mMのNADPHの存在
下、示されたｐＨで行った。
図８は、ヒトステロイド5α-レダクターゼがdet2-1変異を補充できることを示
している。
図８Ａは、det2-1変異体を形質転換するのに用いたpMD-hS5R発現プラスミドの
模式図を示す。各種のヒトステロイド5α-レダクターゼｃＤＮＡについて、２種
の構築物、すなわち、切断された３'非翻訳領域を含有する短い構築物および全
長ヒトｃＤＮＡを含有する長い構築物を作製した。示されたＤＮＡ断片はヒトス
テロイド5α-レダクターゼ(hS5R)、ノパリンシンターゼプロモーター(NosPro)お
よび転写ターミネーター(Nos-ter)、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺
伝子(NPTII)、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(35Spro)、および
多重クローニング部位(MCS)である。
図８Ｂ−Ｄは、ヒトステロイド5α-レダクターゼｃＤＮＡによるdet2-1変異の
補充を示す。
図８Ｂは暗所で生育させた７日齢の実生である。
図８Ｃは明所で生育させた７日齢の実生である。
図８Ｄは明所で生育させた３週齢の実生である。（パネルＢ、ＣおよびＤの左
から右へ）野生型Col-0、det2-1、全長ヒトステロイド5α-レダクターゼ１型ｃ
ＤＮＡを含有するトランスジェニックdet2-1および全長ヒトステロイド5α-レダ
クターゼ２型ｃＤＮＡを含有するトランスジェニックdet2-1。
図９は、det2-1、野生型およびトランスジェニックdet2-1植物の胚軸長に対す
る4-MAの影響を示す。データは各遺伝子型の実生25個体から得た平均±標準誤差
で表す。
図１０は、ヒトステロイド5α-レダクターゼｃＤＮＡの発現レベルがトランス
ジェニックdet2-1植物の表現型と相関していることを示す。
図１０Ａは、暗所で生育させた野生型Col-0、det2-1および初代トランスジェ
ニツクdet2-1植物の分離後の世代の実生の胚軸長を示す。データは、60個体の実
生の平均サンプルサイズを有する集団から得た平均±標準誤差で示す。
図１０Ｂは、導入遺伝子の発現に関するノーザンブロット解析を示す。各レー
ンは全植物ＲＮＡ20mgを含有した。
図１０Ｃは、明所で生育させた14日齢の実生の形態を示す。(各パネルの左か
ら右へ)1，det2-1;2，hS5R1-1.3kb(04);3，hS5R1-1.3kb(08);4，hS5R1-2.1kb(04
);5，hS5R1-2.1kb(17);6，野生型;7，hS5R2-0.8kb(01);8，hS5R2-0.8kb(12);9，
hS5R2-0.8kb(15);10，hS5R2-2.4kb(04);11，hS5R2-2.4kb(05);12,hS5R2-2.4kb(1
2)。
好ましい実施態様の説明
本発明は、植物ステロイドホルモンであるブラシノライドの合成に関与する、
新規ステロイド5α-レダクターゼ、DET2を提供する。トランスジェニック植物に
おけるDET2レダクターゼまたは哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ラット、マウス
）ステロイド5α-レダクターゼの過剰発現により、それらの野生型に相当するも
のよりもかかる植物は有意に大きく、より丈夫になり、かくして植物収量の増大
がおこる。
本明細書で用いる場合、「収量」もしくは「植物収量」とは、植物生長の増大
、作物生長の増大、および／またはバイオマス生産の増大をいう。
第一の実施態様において、本発明は、実質的に純粋なDET2ポリペプチドを提供
する。DET2ポリペプチドは、図１Ｃおよび配列番号２に示されるアミノ酸配列に
より例示される。DET2ポリペプチドは、SDS-PAGEにより測定した場合の推定分子
量は31kDaであり、ステロイド5α-レダクターゼ活性を有し、そしてブラシノラ
イド生合成経路に作用するという特徴を有する。
DET2遺伝子の推定アミノ酸配列は、哺乳動物ステロイド5α-レダクターゼのそ
れと類似しており、38ないし42%の配列同一性を有する。この配列の類似性は、
保存性置換を考慮に入れると54ないし60%まで高まる。ラットおよびヒトにおい
て、ステロイド5α-レダクターゼの2個のアイソザイム（１型および２型）が単
離された(Wilsonら，Endocr．Rev.，14:577，1993;RussellおよびWilson，Annu
．Rev.Biochem.，63:25，1994)。系統発生解析は、少なくとも２型酵素が１型酵
素と関連を持つ程度には、DET2が２型酵素と密接に関連していることを示してい
る。本明細書で用いる場合、“実質的に純粋”とは、本来会合している他のタン
パク質、脂質、炭水化物もしくはその他の物質を実質的に含まないDET2ポリペプ
チドをいう。当業者ならば、タンパク質の精製のための標準的な手法を用いてDE
T2を精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは、変性ポリアクリル
ア
ミドゲル上で約31kDの単一の主要なバンドを形成するであろう。また、DET2ポリ
ペプチドの純度はアミノ末端アミノ酸配列分析により測定することができる。
本発明は機能性DET2ポリペプチド、およびそれらの機能性断片も包含する。本
明細書で用いる場合、 「機能性ポリペプチド」とは、確立された機能性アッセ
イにより同定され、また細胞における特定の生物学的、形態学的、もしくは表現
型の変化に関連する生物学的機能または活性を有するポリペプチドをいう。「DE
T2ポリペプチドの機能性断片」とは、DET2活性、例えば、ステロイド5α-レダク
ターゼ活性を保持している全てのDET2断片をいう。例えば、抗体分子と結合する
能力を有するエピトープと同程度に小さなポリペプチド断片から、細胞中におけ
る特性誘導もしくは表現型の変化のプログラミングに携わる能力を有する大きな
ポリペプチドまで、生物学的に機能のある断片のサイズは多様である。
DET2のステロイド5α-レダクターゼ活性およびブラシノライド生合成経路にお
ける役割は、生物学的活性を有するDET2ポリペプチド断片または関連するポリペ
プチドの同定のためのバイオアッセイに利用することができる。例えば、DET2は
カンペステロールのカンペスタノールへの変換を触媒する可能性があり、従って
アッセイを行って、DET2の酵素活性を検出することができる。DET2の阻害剤を用
いて、例えば、雄生性不稔植物、背丈の減少などという結果を生じるDET2の機能
の低下を引き起こすことができる。例えば、DET2の阻害は、矮性種を作出するた
めに、園芸上有用である。
該DET2-次アミノ酸配列のマイナーな修飾により、結果として本明細書中配列
番号２（図１Ｃ）に記載されているDET2ポリペプチドと実質的に同等の活性を有
するタンパク質が生成する可能性がある。かかる修飾は、位置指定突然変異のご
とき意図されたものであってもよいし、自然発生のものでもよい。これらの修飾
により生産された全てのポリペプチドは、DET2の生物学的活性が存在する限り、
例えば植物または作物収量および／またはバイオマスの増大を促進するためのス
テロイド5α-レダクターゼ活性が存在する限り、本明細書に包含される。さらに
、１以上のアミノ酸の欠失によってもまた、その結果生じた分子の活性を有意に
変化させることなく、その構造を修飾することとなる。これにより、より幅広い
有用性を持ち得る、より小さい活性分子の開発を導くことができる。例えば、DE
T2
活性のために要求されるアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸を除去することが
可能であろう。
DET2ポリペプチドは、配列番号２で示される配列と実質的に同一のアミノ酸配
列を包含する。「実質的に同一」とは、本明細書に記載されているごときDET2活
性、例えばステロイド5α-レダクターゼ活性を保持するアミノ酸配列をいう。本
発明のDET2ポリペプチドは、該ポリペプチド配列の保存性変異を包含する。本明
細書で用いる場合、「保存性変異」とは、アミノ酸残基の、他の生物学的に類似
した残基による置換を表す。保存性変異の例としては、イソロイシン、バリン、
ロイシンまたはメチオニンのごとき１つの疎水性残基の他の残基による置換、ア
ルギニンのリジンへの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸への置換もしくはグ
ルタミンのアスパラギンへの置換のごとき、１つの極性残基の他の残基による置
換などが挙げられる。また「保存性変異」には、置換ポリペプチドに対して作製
された抗体が非置換ポリペプチドにもまた免疫応答するという条件で、非置換親
アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも含む。
本発明のタンパク質は、例えば標準的SDS-PAGEおよび／または免疫沈降分析お
よび／またはウエスタンブロット分析により分析することができる。それに加え
、本実施例に記載されているごときin vitro合成(IVS)タンパク質アッセイを用
いて、DET2タンパク質産物を分析することもできる。
また本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
単離ポリヌクレオチド配列も提供する。該DET2遺伝子は、アラビドプシス(Arabi
dopsis)第２染色体上の150kbを超える距離にマッピングされる。該DET2の転写物
は、262−アミノ酸タンパク質をコードする単一の長いオープンリーディングフ
レームを含有している。本明細書で用いられる場合「単離」とは、ポリヌクレオ
チドが本来会合している他の核酸、タンパク質、脂質、炭水化物もしくはその他
の物質を実質的に含まないポリヌクレオチドを包含する。本発明のポリヌクレオ
チド配列は、DET2をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含む。それ
らがDET2活性を有するポリペプチドをコードする限り、DET2の全てもしくは種々
の部分をコードするポリヌクレオチドが本明細書に包含されると理解される。か
かるポリヌクレオチドには自然発生、合成、および意図的に操作されたポリヌク
レオチ
ド、並びにスプライス変異体が含まれる。例えば、代替ＲＮＡスプライシングパ
ターンもしくはＲＮＡ転写のための代替プロモーターの使用により、ｍＲＮＡ配
列の一部分を改変してもよい。さらに、本発明のDET2ポリヌクレオチドは、核酸
配列が改変されてはいるが、なお機能性DET2をコードするポリヌクレオチドを含
む。DET2核酸における改変には、これに限定されるものではないが、遺伝子内の
突然変異（例えば、点突然変異、ナンセンス（停止）、アンチセンス、スプライ
ス部位およびフレームシフト）およびヘテロ接合またはホモ接合の欠失が含まれ
る。かかる改変の検出は、配列解析、サザンブロット解析、PCRに基づく解析（
例えば、マルチプレックスPCR、配列タグ部位(STSs)）およびin situハイブリダ
イゼーションを含む当業者に公知の常法により行うことができる。また、本発明
のポリヌクレオチド配列はアンチセンス配列も含む。本発明の該ポリヌクレオチ
ドは、遺伝子コードの結果として縮重している配列も含む。20個の天然アミノ酸
が存在し、そのほとんどが１以上のコドンにより指定されている。従って、全て
の縮重ヌクレオチド配列は、かかる核酸配列によってコードされているDET2ポリ
ペプチドのアミノ酸配列がDET2ステロイド5α-レダクターゼ活性を保持している
限りは、本発明に包含される。「機能性ポリヌクレオチド」とは、本明細書に記
載されているごとき機能性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを表す。
加えて、本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列の生物学的活性を有し、DET2
ポリペプチドに対して免疫応答性の抗体のための少なくとも１個のエピトープを
有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
本明細書で用いる場合、「本発明のポリヌクレオチドおよび核酸配列」とは、
ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列をいう。
DET2をコードするポリヌクレオチドは、図１Ｃ（配列番号１）のヌクレオチド
配列、並びにその配列に相補的な核酸配列をも含む。相補的な配列には、アンチ
センスヌクレオチドも含まれる。該配列がＲＮＡである場合、図１Ｃのデオキタ
リボヌクレオチドA、G、CおよびTはリボヌクレオチドA、G、CおよびUによりそれ
ぞれ置換される。本発明にはまた、プローブが図１Ｃ（配列番号２）のタンパク
質をコードするＤＮＡと選択的にハイブリダイズすることを可能にするために十
分な長さである少なくとも15塩基の前記核酸配列の断片(「プローブ」)も含まれ
る。「選択的ハイブリダイゼーション」とは、本明細書で用いる場合、関連のな
いDET2ヌクレオチド配列から関連のあるヌクレオチド配列を区別する、中程度に
ストリンジェントな、または高度にストリンジェントな生理学的条件下における
ハイブリダイゼーションをいう（例えば、参考として本明細書の一部とみなされ
るManiatisら、1989 Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Ha
rbor Laboratory，N.Y.参照）。
核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のレベルのストリンジェント
レベルを達成するために用いる条件は、ハイブリダイズされる核酸の特性によリ
異なる。例えば、ハイブリダイゼーション条件を選択する上で、核酸のハイブリ
ダイズ領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列組成（例えば、GC対AT含量
）、および核酸のタイプ（例えば、ＲＮＡ対ＤＮＡ）を考慮することができる。
さらには、核酸のうちの１つが、例えばフィルター上に固定化されるかどうかと
いうことも考慮される。
段階的に高めるストリンジェント条件の例は以下のとおりである：室温の前後
にて2xSSC/0.1%SDS（ハイブリダイゼーション条件）；室温の前後にて0.2xSSC/0
.1%SDS（低度ストリンジェント条件）；約42℃にて0.2xSSC/0.1%SDS(中程度スト
リンジェント条件)；約68℃にて0.1xSSC（高度ストリンジェント条件）。洗浄は
これらの条件のうち１つ、例えば高度ストリンジェント条件のみを用いて行うこ
ともできるし、また、例えば、各々10-15分間で上記に挙げられた順で、挙げら
れた工程の何れかの反復または全てを用いるなど、各条件を用いて行うこともで
きる。しかしながら、上述のように、至適条件は、関与する特定のハイブリダイ
ゼーション反応により異なり、経験的に決定することができる。
本明細書ではDET2についてのｃＤＮＡ配列が具体的に開示されている。図１Ｃ
は、完全なｃＤＮＡおよび推定タンパク質配列（それぞれ配列番号１および２）
を示している。
本発明のＤＮＡ配列はいくつかの方法により得ることができる。例えば、該Ｄ
ＮＡは当該技術分野で十分に公知のハイブリダイゼーションまたはコンピュータ
ーに基づく手法を用いて単離することができる。かかる手法には、これらに限定
されるものではないが、１）相同なヌクレオチド配列を検出するためのプローブ
を用いたゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーション；２）
構造特性を共有するクローン化ＤＮＡ断片の検出のための発現ライブラリーの抗
体スクリーニング；３）対象のＤＮＡ配列とアニーリング可能なプライマーを用
いるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにおけるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)；４）類
似配列のための配列データベースのコンピューター探索；５）サブトラックＤＮ
Ａライブラリーのディファレンシャルスクリーニングが含まれる。
核酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法により、もし適切なプロ
ーブが利用できるならば、何れの生物体からの何れの遺伝子配列の単離も可能と
なる。問題のタンパク質をコードするDET2配列の一部に相当するオリゴヌクレオ
チドプローブは、化学的に合成することができる。これには、そのアミノ酸配列
の短いオリゴペプチドストレッチが知られていることが必要とされる。該タンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列は遺伝子コードから推定することができるが、しか
しながら、コードの縮重を考慮に入れなければならない。該配列が縮重している
場合は、混合添加反応を行うことが可能である。これには、変性させた二本鎖Ｄ
ＮＡの異種混合物が含まれる。かかるスクリーニングのために、一本鎖ＤＮＡも
しくは変性二本鎖ＤＮＡの何れかについてハイブリダイゼーションを行うことが
好ましい。ハイブリダイゼーションは、対象のポリペプチドに関与するｍＲＮＡ
配列が極めて微量しか存在しない供給源に由来するｃＤＮＡクローンの検出に特
に有用である。換言すれば、非特異的結合を避けるためにストリンジェントハイ
ブリダイゼーション条件を用いることにより、例えば標的ＤＮＡを、その完全補
体の混合物中の単一のプローブとハイブリダイズさせることにより、特異的なｃ
ＤＮＡクローンのオートラジオグラフによる視覚化が可能となる(Wallaceら，Nu
cl．Acid Res.，9:879，1981)。また、本明細書に説明されているごとくに、サ
ブトラックライブラリーは、非特異的ｃＤＮＡクローンを排除するのに有用であ
る。
対象のｃＤＮＡ配列を単離するための標準法のうちには、遺伝子を高レベルに
発現するドナー細胞に豊富なｍＲＮＡの逆転写により誘導されたプラスミド−も
しくはファージー担持ＤＮＡライブラリーを形成することが含まれる。ポリメラ
ーゼ連鎖反応技術と併用する場合、わずかな発現産物でさえもクローン化するこ
とができる。該ポリペプチドのアミノ酸配列の重要な部分が既知である場合、標
的ｃＤＮＡに存在すると推定される配列を複製する標識一本鎖または二本鎖ＤＮ
ＡもしくはＲＮＡプローブ配列の生産を、一本鎖型に変性させたｃＤＮＡのコピ
ーのクローン化において行われるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法に用
いればよい(Jayら，Nucl．Acid Res.，11:2325，1983)。
ラムダgtl1のごときｃＤＮＡ発現ライブラリーは、DET2に特異的な抗体を用い
てDET2ペプチドを間接的にスクリーニングすることができる。かかる抗体はポリ
クローナル、もしくはモノクローナルの何れとしても誘導することができ、DET2
ｃＤＮＡの存在を示す発現産物の検出に使用される。
DET2もしくは他の5α-レダクターゼをコードするＤＮＡ配列は、適切な宿主細
胞にＤＮＡを導入することによりin vitroで発現させることができる。「宿主細
胞」とは、そこでベクターが増殖し、そのＤＮＡを発現することのできる細胞を
いう。この語はまた、何れの後世代もしくは移植材料、例えば患者の宿主細胞の
それをも含む。複製の間に突然変異が起こる可能性があるので、全ての後世代が
親細胞と必ずしも同一でないことが理解される。しかしながら、「宿主細胞」と
いう語が用いられる場合は、かかる後世代も含まれる。外来ＤＮＡが宿主中で継
続的に維持されることを意味する、安定した導入法は当該技術分野において公知
である。
本発明では、該DET2ポリヌクレオチドもしくは他の（例えば、哺乳動物ステロ
イド5α-レダクターゼ）配列を組換え発現ベクターに挿入してもよい。「組換え
発現ベクター」もしくは「発現ベクター」とは、該DET2遺伝子配列の挿入または
組み込みにより操作された当該技術分野で公知のプラスミド、ウイルスもしくは
他の運搬体をいう。かかる発現ベクターは、挿入されたDET2配列の効率的な転写
を容易にするプロモーター配列を含む。該発現ベクターは典型的には複製起点、
プロモーター、並びに形質転換細胞の表現型を選択させる特異的遺伝子を含んで
いる。
当業者に十分に公知の方法を用いて、該DET2コーディング配列もしくは、例え
ば哺乳動物ステロイド5α-レダクターゼコーディング配列および適切な転写／翻
訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には
、in vitro組換えＤＮＡ法、合成法、およびin vivo組換え／遺伝子手法が含ま
れる。
種々の宿主−発現ベクター系を利用して、該DET2コーディング配列を発現させ
ればよい。限定されるものではないがこれらには、該DET2コーディング配列を含
む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発
現ベクターで形質転換させた細菌のごとき微生物；該DET2コーディング配列を含
む組換え酵母発現ベクターで形質転換させた酵母；該DET2コーディング配列を含
む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV
；タバコモザイクウイルス、TMV）で感染させた、若しくは組換えプラスミド発
現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；該DET2コー
ディング配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）
で感染させた昆虫細胞系；又は該DET2コーディング配列を含む組換えウイルス発
現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）
で感染させた動物細胞系、あるいは安定した発現のために操作された形質転換動
物細胞系が挙げられる。
用いる宿主／ベクター系により、構成プロモーターまたは誘導プロモーター、
転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む、多数の適切な転
写及び翻訳エレメントの何れを発現ベクターに用いてもよい（例えば、Bitterら
，1987，Methods in Enzymology 153:516-544参照）。例えば、バクテリア系の
クローン化には、バクテリオファージγのpL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lacハイ
ブリッドプロモーター)のごとき誘導プロモーターなどを使用してよい。哺乳動
物細胞系のクローン化には、哺乳動物細胞のゲノムから誘導されたプロモーター
（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスから誘導
されたプロモーター（例えば、レトロウイルス長末端反復；アデノウイルス後期
プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を使用すればよい。また
、組換えＤＮＡもしくは合成法により作製されたプロモーターを用いて、挿入さ
れたDET2コーディング配列の転写に供してもよい。
本発明により提供される、組換えにより発現するポリペプチドまたはそれらの
断片の単離および精製は、分取クロマトグラフィーおよびモノクローナルまたは
ポリクローナル抗体の関与する免疫学的分離法を含む常法により行えばよい。
また本発明には、DET2ポリペプチドとの免疫反応のある抗体、またはその抗体
断片が含まれる。実質的に異なるエピトープ特異性を有するプールしたモノクロ
ーナル抗体、並びに明瞭なモノクローナル抗体調製物から成る抗体が提供される
。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により、そのタンパク質断片を含
有する抗原から作製する(Kohlerら，Nature，256:495，1975)。
用語「抗体」とは本発明で用いる場合、DET2ポリペプチドに存在する抗原決定
基に結合することができるFab，F(ab')2およびFvのごとき完全分子、並びにその
断片を含む。かかる抗体断片はその抗原または受容体と選択的に結合する能力を
幾分か保持している。
これらの断片を作製する方法は当該技術分野で公知である（例えば、本明細書
中に参考として援用されるHarlowおよびLane，Antibodies:A Laboratory Manual
，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)参照）。
本発明で用いる場合、用語「エピトープ」とは、抗体のパラトープが結合する
抗原上の抗原決定基をいう。抗原決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖のごとき
、化学活性を有する表面群の分子から成り、通常は特異的な立体構造特性、並び
に特異的な電荷特性を有する。
本発明のDET2ポリペブチドに結合する抗体は、目的の小ペプチドを含有する全
ポリペプチドまたは断片を免疫感作抗原として用いて調製することができる。例
えば、DET2のＮ末端またはＣ末端ドメインと特異的に結合する抗体を作製するこ
とが望ましい。動物に免疫感作させるのに用いるポリペプチドまたはペプチドは
、翻訳されたｃＤＮＡまたは化学的に合成されたものに由来し、所望により担体
タンパク質に結合させることができる。一般的に用いられるかかる担体としてス
カシガイヘモシアニン(KLH)、チログロブリン、ウシ血清アルブミン(BSA)、およ
び破傷風トキソイドが挙げられ、これらは該免疫感作ペプチドに化学結合させる
。
発明のポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、例えば、それに対して抗
体が作製されたポリペプチドまたはペプチドが結合するマトリックスに結合させ
、そして溶出させることによりさらに精製することができる。当業者ならば、ポ
リクローナル抗体並びにモノクローナル抗体の精製および／または濃縮に関する
免疫学的技術における種々の一般的技術を承知しているであろう（例えば、本明
細書中に参考として援用するColiganら，Unit 9，Current Protocol sin in Imm
unol
ogy，Wiley Interscience，1994参照）。
また、抗イディオタイプ技術を用いて、エピトープを擬態する発明のモノクロ
ーナル抗体を作製することもできる。例えば、一次モノクローナル抗体に対して
作製された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、一次モノクローナル抗体が
結合するエピトープの「イメージ」である超可変領域内の結合ドメインを有する
であろう。
もう一つの具体例では、本発明は遺伝的に修飾されていない植物（例えば、野
生型植物）に比べ、収量が増大したことを特徴とする遺伝的に修飾された植物を
生産する方法を提供する。用語「収量」とは本明細書で従前に定義されている。
本法は、植物細胞をステロイド5α-レダクターゼ、例えばDET2または哺乳動物酵
素（例えば、ヒト・１型または２型ステロイド5α-レダクターゼ）をコードする
少なくとも１種の核酸配列を含む少なくとも１つのベクターと接触させ（ここで
該核酸配列は作動可能なようにプロモーターに連結されている）、形質転換植物
細胞を得、該形質転換植物細胞から植物体を生産し、その後、高収量を示す植物
体を選択する工程を含む。
用語「遺伝的修飾」とは本明細書で用いる場合、１以上の異種核酸配列、例え
ば、DET2コーディング配列またはヒト・１型または２型5α-レダクターゼを、完
全かつ生殖能力を持ち、生存能力を有する植物体を形成することができる１以上
の植物細胞へ導入することをいう。用語「遺伝的に修飾された」とは本明細書で
用いる場合、後記の過程を通じて形成された植物体についていう。本発明の遺伝
的に修飾された植物体は自家受粉、または同種の他の植物個体と交雑受粉する能
力を持ち、その結果、外来遺伝子が生殖細胞系に運ばれ、農業上有用な植物品種
へと挿入され、またそこで繁殖することができる。用語「植物細胞」とは本明細
書で用いる場合、プロトプラスト、配偶子産生細胞および完全な植物体へと再分
化する細胞をいう。従って、完全な植物体へと再分化する能力を有する複数の植
物細胞から構成される種子も「植物細胞」の定義に包含される。
本明細書で用いる場合の用語「植物体」とは完全な植物体、植物体の一部、植
物細胞、または例えば植物組織のごとき植物細胞群の何れをもいう。また植物片
も「植物」に意味するところに含められる。本発明に含まれる植物体は、被子植
物、裸子植物、単子葉植物および双子葉植物を含む、形質転換技術に従う何れの
植物であってもよい。
単子葉植物の例としては、限定されるものではないが、アスパラガス、トウモ
ロコシおよびスィートコーン、オオムギ、コムギ、コメ、ソルガム、タマネギ、
パールミレット、ライムギ、およびオートムギが挙げられる。双子葉植物の例と
しては、限定されるものではないが、トマト、タバコ、ワタ、ナタネ、ソラマメ
、ダイズ、トウガラシ、レタス、エンドウ、アルファルファ、クローバー、アブ
ラナ科作物すなわちブラシカ・オレラセア(Brassica oleracea)(例えば、キャベ
ツ、ブロッコリー、カリフラワー、メキャベツ)、ダイコン、ニンジン、ビート
、ナス、ホウレンソウ、キュウリ、カボチャ、メロン、カンタロープ、ヒマワリ
および種々の観葉植物が挙げられる。木本種としては、ポプラ、マツ、セコイア
、ヒマラヤスギ、オークなどが挙げられる。
用語「異種核酸配列」とは本明細書で用いる場合、受容植物宿主に対して外来
の核酸配列をいい、また、その天然の核酸が実質的に元の形態から改変されてい
るならば、宿主に対する天然の核酸配列をいう。例えば、本用語は、該宿主内に
創出する核酸配列を含み、そこではかかる配列は天然または野生型プロモーター
とは異なるプロモーターに作動可能なように連結されている。本発明の広義の方
法では、DET2または他のステロイド5α-レダクターゼ（例えば、哺乳動物酵素）
をコードする少なくとも１つの核酸配列がプロモーターに作動可能なように連結
されている。相当するポリペプチドの発現を増強するためには、１コピー以上の
DET2または他のステロイド5α-レダクターゼポリペプチドを植物体へ導入するこ
とが望ましいと考えられる。例えば、DET2遺伝子の複数コピーは植物体内でDET2
の産生を増大する効果を有するであろう。ステロイド5α-レダクターゼをコード
する核酸配列をDET2、ヒト・１型または２型5α-レダクターゼ、および他のステ
ロイド5α-レダクターゼということが理解されるはずである。また、本発明の方
法は、これら酵素の何れの組み合わせをも含む。
本発明の遺伝的に修飾された植物体は、植物細胞をDET2をコードする少なくと
も１種の核酸配列を含有するベクターと接触させることにより作製される。植物
細胞への一度の導入で効果を上げるためには、DET2核酸配列が、植物細胞内でDE
T
2の転写を引き起こすのに効果的なプロモーター作動可能なように連結されてい
なければならない。さらに、植物細胞中でも認識されるポリアデニル化配列また
は転写制御配列を使用することもできる。本明細書に記載されたごとくに、培養
中、非形質転換細胞から形質転換細胞を選択できるように、挿入される核酸配列
を担持するベクターが１以上の選択可能マーカー遺伝子を含むことも好ましい。
用語「作動可能なように連結される」とは、プロモーター配列と該プロモータ
ーによって調節されるDET2核酸配列との間の機能的結合をいう。作動可能なよう
に連結されたプロモーターはDET2核酸配列の発現を制御する。
本発明に使用される構造遺伝子の発現は、多くのプロモーターによって駆動さ
れ得る。目的の外生のまたは天然の構造遺伝子プロモーターは、該遺伝子の転写
調節に利用してよいが、該プロモーターは外来の調節配列であることが好ましい
。植物の発現ベクターのための適切なウイルスプロモーターとしては、CaMVの35
SＲＮＡおよび19SＲＮＡプロモーター(Brissonら，Nature，310:511，1984；Ode
llら，Nature，313:810，1985)、ゴマノハグサ・モザイク・ウイルス(Figwort M
osaic Virus:FMV)由来の全長転写物プロモーター(Gowdaら，J．Cell Biochem.，13D
:301，1989)およびTMVに対するコートタンパク質プロモーター(Takamatsuら
，EMBO J．6:307，1987)が挙げられる。また、リブロースビス−リン酸カルボキ
シラーゼ小サブユニット(ssRUBISCO)由来の光誘導プロモーター(Coruzziら，EMB
O J.，3:1671，1984;Broglieら，Science，224:838，1984)、マンノピンシンタ
ーゼプロモーター(Veltenら，EMBO J.，3:2723，1984)、ノパリンシンターゼ(NO
S)およびオクトピンシンターゼ(OCS)プロモーター（アグロバクテリウム・ツメ
ファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の腫瘍誘導プラスミドで運ばれる）
、または熱ショックプロモーター、例えば、ダイズhsp17.5-Eまたはhsp17.3-B(G
urleyら，Mol．Cell．Biol.，6,559,1986;Severinら，Plant Mol．Biol.，15:82
7，1990)のごとき植物プロモーターを用いてもよい。
本発明に有用なプロモーターは天然の構成的プロモーターおよび誘導性プロモ
ーター、並びに操作したプロモーターの双方を含む。CaMVプロモーターは構成的
プロモーターの例である。最も有用とするためには、誘導性プロモーターが１）
誘導物質の非存在下では発現が低くなり、２）誘導物質の存在下では発現が高く
なり、３）その植物の正常な生理機能で妨害されない誘導スキームを利用し、か
つ４）他の遺伝子の発現に影響を及ぼさない方がよい。植物に有用な誘導性プロ
モーターの例としては、銅イオンによって活性化される酵母メタロチオネインプ
ロモーター(Mettら，Proc．Natl．Acad．Sci.，U.S.A.，90:4567，1993)、置換
ベンゼンスルホンアミド、例えば除草剤毒性緩和剤によって活性化されるIn2-1
およびIn2-2調節配列(Hersheyら，Plant Mol．Biol.，17.:679，1991)およびグ
ルココルチコイドによって誘導されるGRE調節配列(Schenaら，Proc．Natl．Acad
．Sci.，U.S.A.，88:10421，1991)のごとき化学的手段によって誘導されるもの
が挙げられる。構成および誘導双方の他のプロモーターも当業者に公知であろう
。
選択される特定のプロモーターは、その結果有効量の構造遺伝子産物、例えば
DET2を生産して収量の増大および／またはバイオマスの増大させるのに十分な発
現を引き起こすことができるべきである。本発明のベクターの構築に使用される
プロモーターを、所望によりそれらの制御特性に影響を与えるように修飾しても
よい。
組織特異的プロモーターを本発明で利用してもよい。組織特異的プロモーター
の例としては茎頂分裂組織において活性を有するプロモーターがある(Atanassov
aら，Plant J.，2:291，1992)。cdc2aプロモーターおよびcyc07プロモーターを
含むトランスジェニック植物に有用な他の組織特異的プロモーターも、当業者に
公知である。（例えば、Itoら，Plant Mol．Biol.，24:863，1994；Martinezら
，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:7360，1992；Medfordら，Plant Cell，3:35
9，1991；Teradaら，Plant Journal，3:241，1993;Wissenbachら，Plant Journa
l，4:411，1993を参照。）
必要に応じて、選択可能なマーカーを該核酸配列に結合させて挿入してもよい
。本明細書で用いる場合、用語「マーカー」とは、そのマーカーを含有する植物
体または植物細胞の選択、もしくはスクリーニングを可能にする特性または表現
型をコードする遺伝子をいう。好ましくは、該マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺
伝子であり、それによって、適当な抗生物質を用いて形質転換していない細胞の
中から形質転換細胞を選択することができる。適切な選択可能マーカーの例とし
ては、アデノシンデアミナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン
-B-
ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、キサンチン-グアニンホスホ-リ
ボシルトランスフェラーゼおよびアミノ-グリコシド3'−0-ホスホ-トランスフェ
ラーゼII(カナマイシン、ネオマイシンおよびG418耐性）が挙げられる。他の適
切なマーカーも当業者に公知であろう。
以下の記載はDET2について記載するものであるが、これは例示としての5α-レ
ダクターゼであり、哺乳動物もしくは他の5α-レダクターゼもまた下記記載に含
まれることが理解される。植物細胞の形質転換のために本発明に使用されるベク
ターには、作動可能なようにプロモーターに連結されたDET2をコードする核酸配
列が含まれる。本発明に従う形質転換工程を始めるためには、第一に適切なベク
ターを構築し、それを植物細胞に好適に導入する必要がある。本明細書で利用さ
れるベクターの構築の詳細は植物遺伝子工学の分野の熟練者に公知である。
本発明に利用されるDET2核酸配列は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
のTiプラスミド、根誘導(Ri)プラスミドおよび植物ウイルスベクターを用いて植
物細胞に導入することができる（かかる技術の総説に関しては、例えば、双方と
も本明細書中に参考として援用されるWeissbachおよびWeissbach，1988，Method
s for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，第VIII節，421-463頁;G
riersonおよびCorey，1988，Plant Molecular Biology，第２版，Blackie，Lond
on，7-9章およびHorschら，Science，227:1229，1985を参照）。アグロバクテリ
ウムのTiまたは根誘導(Ri)プラスミドから誘導された植物形質転換ベクターに加
え、代替法としては、例えばリポソーム、エレクトロポレーション、遊離ＤＮＡ
の取り込みを増強する化学薬品の使用、ウイルスまたは花粉を用いる形質転換、
およびマイクロインジェクションの使用が挙げられる。
当業者ならば、DET2をコードする核酸配列を比較的完全な状態で導入するのに
適当なベクターを選択することができるであろう。かくして、導入されたＤＮＡ
配列を有する植物体を生産するベクターであれば何れであっても十分であるはず
である。ＤＮＡの裸の断片を使用した場合でさえ、低い効率ではあるが発現して
本発明の特性を付与するであろう。ベクターの選択、あるいはベクターを使用す
るかどうかは典型的には選択した形質転換の方法によって左右される。
本発明に従う植物の形質転換は、本質的には植物分子生物学の分野の熟練者に
公知の種々の方法の何れにおいても実施できる（例えば、本明細書中に参考とし
て援用されるMethods of Enzymology，第153巻，1987;WuおよびGrossman編，Aca
demic Pressを参照）。本明細書で用いる場合、用語「形質転換」とはDET2核酸
配列の導入による宿主植物の遺伝子型の改変を意味する。
例えば、DET2核酸配列は、簡単に上記で記載したごとくに、Tiプラスミドを含
有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスを利用して、植物細胞に導入する
ことができる。形質転換運搬体としてＡ．ツメファシエンス培養物を用いる際、
ベクター担体としてアグロバクテリウムの非腫瘍形成系統を使用するのが最も有
利であり、その結果、形質転換組織の正常な非腫瘍形成的分化が可能である。バ
イナリーTiプラスミド系を担持するアグロバクテリウムも好ましい。かかるバイ
ナリー系は、1)植物体への転移DNA(T-DNA)の導入に必須なビルレンス領域を有す
る第一のTiプラスミド、および２）キメラプラスミドを有してなる。後者は転移
する核酸に隣接する野生型TiプラスミドのT-ＤＮＡ領域の境界領域を少なくとも
１つ含む。バイナリーTiプラスミド系は植物細胞を形質転換するのに効果的であ
ることが示されている(De Framond，Biotechnology，1:262，1983;Hoekemaら，N
ature，303:179，1983)。かかるバイナリー系は、より古い方法論であるアグロ
バクテリウムのTiプラスミドへの組み込みを必要としないので好ましい。
本発明に従う形質転換におけるアグロバクテリウムの使用を含む方法としては
、限定されるものではないが、１）アグロバクテリウムの培養単離プロトプラス
トとの共存培養、２）植物細胞または組織のアグロバクテリウムでの形質転換、
もしくは３）種子、頂端または分裂組織のアグロバクテリウムでの形質転換が挙
げられる。
さらに、遺伝子導入は、Bechtoldら，(C.R．Acad．Sci．Paris，316:1194，19
93)によって記載され、また本明細書の実施例で例示したごとくに、アグロバク
テリウムによるin planta形質転換によって達成することができる。このアプロ
ーチはアグロバクテリウム細胞の懸濁物の真空浸透に基づくものである。
植物細胞へDET2をコードする核酸を導入する好ましい方法は、かかる植物細胞
、外植片、分裂組織または種子に、上記のように形質転換アグロバクテリウム・
ツメファシエンスを感染させることである。当該技術分野で公知の適当な条件下
で、
該形質転換植物細胞を増殖させて芽、根を形成させ、さらに植物体へと発達させ
る。
別法としては、機械的または化学的手段を用いて、DET2をコードする核酸配列
を植物細胞へ導入することができる。例えば、該核酸は、マイクロピペットを用
いたマイクロインジェクションによって植物細胞に機械的に導入することができ
る。また、その細胞によって取り込まれる遺伝子物質と沈殿複合体を形成するポ
リエチレングリコールを用いることにより、該核酸を植物細胞へ導入してもよい
。
また、DET2核酸配列をエレクトロポレーションによって植物細胞へ導入するこ
ともできる(本明細書中に参考として援用されるFrommら，Proc．Natl．Acad．Sc
i.，U.S.A.，82:5824，1985)。この技術においては、植物プロトプラストを関連
する核酸配列を含有するベクターまたは核酸の存在下でエレクトロポレートする
。高い電場強度の電気的衝撃で可逆的に膜を透過性にし、核酸を導入する。エレ
クトロポレートした植物プロトプラストは細胞壁を再生し、分裂して植物カルス
を形成する。形質転換遺伝子で形質転換した植物細胞の選択は、本明細書に記載
したごとくに、表現型マーカーを用いて達成することができる。
DET2核酸を植物細胞に導入するもう一つの方法としては、その粒子のマトリッ
クス内か、もしくはその表面上かの何れかに含有された導入すべき核酸を伴った
小粒子による高速衝撃透過がある(Kleinら，Nature，327:70，1987)。衝撃形質
転換法はまたSanfordら(Techniques，3:3-16，1991)およびKleinら,(Bio/Techni
ques，10:286，1992)にも記載されている。典型的には新しい核酸配列の単回の
導入のみが必要とされるが、この方法は特に複数回の導入が可能である。
カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)も、植物細胞へ核酸を導入するためのベ
クターとして使用してよい（米国特許第4,407,956号）。CaMVウイルスＤＮＡゲ
ノムは、組換えＤＮＡ分子を作出する親バクテリアプラスミドに挿入され、それ
はバクテリア内で増殖することができる。クローニング後、該組換えプラスミド
を再びクローン化して、所望の核酸配列の導入によりさらに修飾してもよい。次
いで、該組換えプラスミドの修飾したウイルス部分を親バクテリアプラスミドか
ら切り出し、これを用いて植物細胞または植物体に接種する。
本明細書で用いる場合、用語「接触させる」とはDET2を植物細胞へ導入する何
れの手段をもいい、上記したごとき化学的および物理的手段が含まれる。好まし
くは接触させるとは、上記したごとくにDET2をコードする核酸で形質転換したア
グロバクテリウム・ツメファシエンスを介して、核酸またはベクターを植物細胞
（外植片、分裂組織または種子を含む）へ導入することをいう。
通常、形質転換工程から植物細胞を再分化させて完全な植物体を得る。該形質
転換の即時生成物は、「トランスジェノート」と呼ばれる。「生育する」または
「再分化」とは本明細書で用いる場合、植物細胞、植物細胞群、植物体の一部（
種子を含む）または植物片（例えば、プロトプラスト、カルスまたは組織の部分
に由来）から完全な植物体を生育させることを意味する。
プロトプラストからの再分化は植物の種によって様々であるが、一般にプロト
プラスト懸濁液がまず作製される。ある種では、次いで、該プロトプラスト懸濁
液から、天然の胚と同様に成熟および発芽段階まで胚形成させることができる。
一般に培養培地は増殖および再分化に必要な種々のアミノ酸やホルモンを含むで
あろう。利用されるホルモンの例としては、オーキシン及びサイトカイニンが挙
げられる。特にトウモロコシやアルファルファのごとき植物種には、グルタミン
酸やプロリンの培地への添加が有利であることがある。効果的な再分化は培地に
、遺伝子型に、さらに培養履歴によるであろう。これらの変数が制御されれば、
再分化には再現性がある。
また、再分化は植物カルス、外植片、器官またはその一部からも生じる。形質
転換は器官または植物の一部の再分化の情況において行われる。（Methods in E
nzymology，第118巻およびKleeら，Annual Review of Plant Physiology，38:46
7，1987参照）。Horschら，Sciene，227:1229，1985のリーフディスク−形質転
換−再分化法を用いて、ディスクを選択培地上で培養し、次いで約２−４週間で
芽を形成させる。発達した芽をカルスから切り取り、適当な根誘導選択培地の移
す。発根した幼植物体は根が現れた後できるだけ速やかに土壌に移す。該幼植物
体は成熟に達するまで必要に応じて別の鉢に植え替える。
栄養繁殖作物では、カッティングまたは組織培養法を利用して、成熟トランス
ジェニック植物を繁殖させて複数の同一植物を生産する。望ましいトランスジェ
ノートの選択を行い、新たな変種を得、商業用途のために栄養繁殖させる。
種子繁殖作物では、成熟トランスジェニック植物を自家交配させて、均一な同
型交配植物を生産することができる。得られた同型交配植物は新たに導入された
外来遺伝子を含有する種子を生産する。これら種子を生育させて、選択した表現
型、例えば収量の増大を示す植物を生産することができる。
再分化植物から得られた花、種子、葉、枝、根、果実などのごとき部分は、こ
れらの部分が記載したごとくに形質転換された細胞を含んでなるならば、本発明
に含まれる。また、再分化植物の後代および変種、並びに突然変異体も、これら
の部分が導入核酸配列を含んでなるならば、本発明の範囲内に含まれる。
野生型植物に比べて収量またはバイオマスの増大を示す植物体は、肉眼での監
察により選択できる。本発明には本発明の方法、並びに植物組織および種子によ
って生産される植物も含まれる。
さらにもう一つの具体例では、本発明は、その細胞から生産された植物が野生
型植物に比べ収量の増大をもたらすように遺伝的に修飾された植物細胞を生産す
る方法を提供する。本法は、植物細胞をDET2核酸配列と接触させて形質転換植物
細胞を得、該形質転換植物細胞を植物形成条件の下で生育させて収量の増大した
植物を得ることを含む。環境のごとき条件およびプロモーター誘導条件は種によ
り異なるが、ある種内では同じはずである。
もう一つの具体例では、本発明は、感受性植物をDET2プロモーター誘導量の、
DET2遺伝子発現を誘導する薬剤と接触させ、そこでDET2遺伝子発現の誘導の結果
、該薬剤に接触させなかった植物に比べて収量の増大した植物を生産することに
より収量の増大を特徴とする植物を生産する方法を提供する。
「感受性植物」とは、その外生DET2遺伝子を利用させて、収量の増大を達成で
きる植物をいう。用語「プロモーター誘導量」とは、その薬剤と接触させなかっ
た植物細胞におけるDET2発現を上昇させるのに必要な薬剤の量をいう。例えば、
DET2天然プロモーターからの遺伝子発現を上昇させるためには、転写因子または
化学薬剤を用いることができ、かくして、プロモーターが誘導され、次いでDET2
が発現する。
本発明のもう一つの態様では、植物細胞または植物体におけるDET2または他の
ステロイド5α-レダクターゼ（例えば、哺乳動物）の発現の増強が、その細胞／
植物体の、植物の害虫または植物の病原体に対する抵抗性を増強することが想定
される。例えば、フィールド研究では、ブラシノライドは農薬として効果的であ
ることが示されており、それゆえ、DET2または他の5α-レダクターゼの発現の増
強の結果、植物体内のブラシノライドの量を増大することになろう。さらに、DE
T2または他の5α-レダクターゼ発現の増強もまた、農薬耐性の増強をもたらし得
る（毒性緩和剤）。従って、DET2または他の5α-レダクターゼは害虫から、と同
時に農薬から植物体を保護する。
上記開示は本発明を概括的に説明するものである。より完全な理解は以下の具
体的実施例を参照することにより得られるが、それらは例示のためのものであっ
て、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
これまでに、暗所で生育させた場合でも明所で生育させた植物の特徴を有する
アラビドプシス(Arabidopsis)変異体が単離されている。少なくとも11個の、det
、cop、およびfusとして知られているような遺伝子座が同定されている(Bowler
およびChua，Plant Cell，6:1529，1994)。数種の光受容体変異体を用いた二重
突然変異解析は、DET1、COP1、およびCOP9は１つのシグナル変換経路で作用する
が、DET2は異なる経路で作用することを示唆している(BowlerおよびChua，前記)
。DET1、COP1、およびCOP9は全て、その作用様式がまだ理解されていない核局在
タンパク質をコードする(BowlerおよびChua，前記)。
DET2における機能欠損変異は多面的な効果を有する(Choryら，同書，3:445，1
991)。暗所で、det2変異体は短く、太い胚軸を有し、アントシアニンを蓄積し、
展開・伸長した子葉を有し、および第一葉芽を発達させる。これらの形態学的変
化は、数種の光応答遺伝子の10ないし20倍の抑制解除を伴っている。明所では、
det2変異体は、野生型よりも小さく、濃い緑を呈し、試験した組織（胚軸、子葉
、および葉）における細胞の大きさが縮小していることを示し、さらに頂芽優勢
および雄性不稔を低下させた。det2突然変異はまた、光周性応答に影響を及ぼし
、開花の遅延、CAB（クロロフィルa／b−結合タンパク質）遺伝子発現の概日期
間の短縮、遺伝子発現の不適切な昼夜調節、並びに葉および葉緑体の老化遅延を
引き起こす(Choryら，前記;Choryら，Plant physiol.，104:339，1994;Millarら
，
Science，267:1163，1995)。かかる表現型の相違は、DET2がアラビドプシスの発
達を通じて重要な役割を果たすということを示している。
実施例１
DET2遺伝子を、アラビドプシス第２染色体上に150kb間隔でマッピングした（
図１Ａ）。図１は、DET2遺伝子のクローニングおよび配列解析の模式図である。
図１Ａはポジショナルクローニングの概要を示す。ホモ接合性det2-1変異体(Col
-0)は、野生型No.-0またはLa-er（地図上の単離名称）の何れかと交差している
。
単純配列長多型(SSLPs)(BellおよびEcker，Genomic，19：137，1994)および開
裂した増幅多型配列(CAPS)(KoniecznyおよびAusubel，Plant J.，4:403，1993)
のために、F2det2実生からＤＮＡを調製した(Deilaportaら，Plant Mol．Biol．
Rep.，1:19，1983)。重複酵母人工染色体(YAC)クローンを、アラビドプシスの３
つの別々のYACライブラリーから単離した(WardおよびJen，Plant Mol．Biol.，1 4
:561，1990;J.R．Ecker，Methods，1:186，1990;GrillおよびSomerville，Mol
．Gen．Genet.，226:484，1991)。m323-DET2領域(68組換え体、2マッピング集団
)内またはDET2-nga168間(31組換え体)内の何れかに組換え切断点を有するF2det2
植物を用いてファイン-RELP分析を行った。
分子マーカーnga168を、アラビドプシスゲノムＤＮＡの約800kbにわたる8個の
重複YACクローンを同定するための開始点として用いた。新規なCAPSマーカーを
、YAC挿入末端から直接変換するか、またはYAC末端プローブを用いて単離したア
ラビドプシスゲノムライブラリーのファージクローンから誘導した。RELP分析は
、アラビドプシス第２染色体のyUP2C12の左末端とyUPSE10との間の約150kbから
の領域にDET2遺伝子座を定めた。
コスミドコンティグは、yUP2C10、yUP6B10、YAC末端プローブ、またはコスミ
ド誘導プローブを用いたハイブリダイゼーションによって、２つのアラビドプシ
スゲノムライブラリー(Olszewskiら，Nucleic Acids Res.，16:10765，1988)か
ら単離したコスミドおよびファージクローン由来のこの領域内に集積した。
DET2遺伝子を含むコスミドを同定するために、コスミドＤＮＡを改変真空浸透
法(Bechtoldら，Acad．Sci．Paris，316:1194,1993;Bentら，Science，265:1856
，1994)によってdet2-1植物へ形質転換した。３つのコスミド、2C12-19、2C12-2
1、および217-61は、det2変異表現型をレスキューした。20-kbのゲノム断片は、
det2表現型をレスキューし得ることが確認された。図２は、野生型DET2遺伝子に
よるdet2の相補の後に、明所で生育させた12日齢の実生（図２Ａ）および暗所で
生育させた10日齢の実生（図２Ｂ）の写真を示す。（各パネルの左から右へ）野
生型Co1-O、det2-1、およびコスミド217-61を含むトランスジェニックdet2-1。
標識したコスミド217-61のEco R1断片をプローブとして用いて、ラムダZAPII中
に構築したアラビドプシス相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーの約2x106の
クローンをスクリーニングした(Kieberら，Cell，72:427，1993)。陽性クローン
を製造業者のプロトコール(Stratagene)に従ったin vivoでの切除によってプラ
スミドに変換し、遺伝子特異的プライマーを用いて配列決定した。20kbの断片は
、少なくとも３種の転写物（図１Ａ）を生成し、その１つは分析した全てのdet2
対立遺伝子で改変され、DET2遺伝子から誘導される（図１Ｂ）。
DET2転写物は、262個のアミノ酸タンパク質をコードする単一の長いオープン
リーディングフレームを含む。8つのdet2対立遺伝子の対応ゲノム配列が決定さ
れており、これらは全て類似の突然変異表現型を有する。DET2遺伝子の転写領域
は、野生型Col-0および8つのdet2対立遺伝子のゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連
鎖反応(PCR)によって増幅され、pGEM-Tベクター(Promega)中にサブクローン化さ
れ、次いで配列決定された。PCRの誤差を最小にするために、各々増幅させた２
種の断片由来の少なくとも４つの異なるクローンを配列決定のためにプールした
。４つの対立遺伝子はフレームシフト欠損を含み、他の２つの突然変異はDET2タ
ンパク質の未熟停止を引き起こす。残り２つの対立遺伝子は、204位にグルタミ
ン酸に対するリジンの非保存的置換を有する（図1Ｂ）。図1ＢはDET2およびDET2
遺伝子の変異の遺伝子構造地図を示す。太線はエキソンを示し、中抜きの四角は
イントロンを示す。突然変異の位置は開始コドンに対して相対的なものである。
Ｚは停止コドンである。図１ＣはDET2のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配
列を示す（それぞれ配列番号1および２）。
図３はDET2と哺乳動物ステロイド5α-レダクターゼとの配列比較を示す。図３
Ａはラット(rS5R1およびrS5R2)およびヒト(hS5R1およびhS5R2)由来のステロイド
5α-レダクターゼを用いて配列したDET2遺伝子の推定アミノ酸配列を示す。ダッ
シュは配列を最大にするために導入されたギャップを示し、５つの配列のうち少
なくとも２つにおいて保存されている残基には網掛けを施している。矢印はdet2
-1およびdet2-6対立遺伝子内で変異したグルタミン酸を示す。（アミノ酸残基に
ついてのｌ文字略号は下記の通りである:A，Ala;C，Cys;Asp;E，Glu;F，Phe;G，
Gly;H，His;I，Ile;K，Lys;L，Leu;M，Met;N，Asn;P，Pro;Q，Gln;R，Arg;S，Se
r;T，Thr;V，Val;W，Trp;およびY，Try）。図３ＢはDET2タンパク質と哺乳動物
ステロイド5α-レダクターゼとの間の関係の系統発生解析を示す。スケールは配
列間の相対的距離を表している。
DET2遺伝子の推定アミノ酸配列は、哺乳動物ステロイド5α-レダクターゼのそ
れと類似しており、38ないし42%の配列同一性を持つ。（データベースの検索は
、U.S.National Center for Biotechnology ioformationにて、BLASTプログラム
(Altschulら，J．Mol．Biol.，215:403，1990)を用いて行った。配列および系統
発生解析は、J．Heinの方法(HigginsおよびSharp，Comput．Appl．Biosci.，5:1
51，1989)によってMegalignプログラム(DNAStar)を用いて行った。）同類置換を
考慮に入れた場合には、配列の類似性が54ないし60%まで高まる。ステロイド5α
-レダクターゼの２つのアイソザイム(１型および２型)が、ラットおよびヒトに
おいて単離されている(Wilsonら，Endocr．Rev.，14:577，1993;RussellおよびW
ilson,Annu．Rev．Biochem.，63:25，1994)。系統発生解析は、２型酵素が１型
酵素と個連しているように、DET2が少なくとも２型酵素と密接に関連しているこ
とを示している（図３Ｂ）。
哺乳動物の酵素中に完全に保存された残基の80%が、推定DET2タンパク質中に
認められている。哺乳動物ステロイド5α-レダクターゼは、テストステロンのジ
ヒドロテストステロンへのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート
(還元型)(NADPH)-依存性変換を触媒し、それはステロイドの代謝における鍵とな
る段階であり、胎児の男性外部生殖器および前立腺の発達に不可欠である(Wilso
nら，前記）。この反応の重要性は、ステロイド5α-レダクターゼ欠損によって
引き起こされるヒトにおける男性の擬半陰陽のある種の遺伝形態から明白である
。影響を受けたファミリー由来のステロイド5α-レダクターゼ２型遺伝子の配列
解析では、DET2中のGlu204に対応するGlu197(Wilsonら，前記)のためのアスパラ
ギン
酸の保存的置換を引き起こすミスセンス突然変異を確認した。det2-1およびdet2
-6対立遺伝子においては、このグルタミン酸がリジンに変化し、このことはこの
グルタミン酸がヒト・5α-レダクターゼにおける場合と同様の決定的な機能を有
していることを示すものである。この位置での保存的置換はヒト酵素の不活性化
を引き起こすので(Wilsonら，前記)、非保存的グルタミン酸からリジンへの変化
がDET2活性を完全に消滅させるということが予想される。このことは、２つのミ
スセンス対立遺伝子の重大な表現型を説明するであろう。それとともに、データ
は、DET2酵素がヒト酵素によって触媒される反応に類似する生化学的反応を触媒
する可能性があることを示唆する。
実施例２
植物では、多くのステロイドが同定されているが(J.M.C．Geuns，Phytochemis
try，17:１，1978)、ブラシノステロイド類(BRs)だけが植物界の至るところに広
く分布し、かつ、外用した場合に植物の生育に独特の生物学的な活性を有してい
る(N.B．Mandava，Annu．Rev．Plant Physiol．Plant Mol．Biol.，39:23，19
88;R.N.Arteca，(2)，206-213)。最近、ブラシノライド、最も活性のあるBRの生
合成経路が、細胞懸濁培養および全実生実験からの証拠を基にして提案されてい
る(Fujiokaら，Bio．Sci．Biotechnical．Biochem.，59:1973，1995)。ブラシノ
ライドの生合成は多くの酸化工程を含んでいるが、還元に関するのは２つの工程
だけである。１つは、カンペステロール中の二重結合が還元されてカンペスタノ
ールを形成する経路の初期に起こる。この反応は、哺乳動物ステロイド5α-レダ
クターゼによって触媒されたものと同様であり、このことはDET2がカンペステロ
ールからカンペスタノールへの変換を触媒できることを示唆している。アラビド
プシスゲノムはDET2と密接に関連している他の何れの配列も含まないので、１つ
の可能性として、det2表現型がBR生合成の還元または脱離によるということがあ
る。
この仮説を調べるために、det2実生を外生ブラシノライドで処理した。図４Ａ
は、ブラシノライド生合成経路において提案されたDET2タンパク質の機能を示す
。アステリスク(*)は６つの中間工程を示す(Fujiokaら，前記)。図４Ｂは暗所で
生育させた10日齢の実生を示し、図４Ｃは明所で生育させた１２日齢の実生を示
す。野生型、det2-1，およびブラシノライドで処理したdet2-1植物を、各パネル
の左
から右へと示した。MS培地(0.5ｘMS塩(Gibco)、1xガンボーグ(Gamborg)のビタミ
ンB5(Sigma)、0.8%フィタガー(phytagar)、および1%ショ糖pH5.7)上に置いた湿
らせたワットマン(Whatman)濾紙上で２日間種子を発芽させ、種々の濃度のオー
キシン（IAA、0ないし10-5M）、ブラシノライド（0ないし10-6M）、およびジベ
レリン(GA1およびGA4、0ないし10-5M)を補足した新鮮プレートに移植した。ホル
モンは冷却MS培地へと除菌濾過した。暗所で生育させた実生については、それら
のプレートを３重のアルミホイルで覆って実生を緑色安全灯の下に移す前に、種
子を２時間の光に曝す処理を施した。10日齢の黄化実生および12日齢の明所で生
育させた野生型植物体の胚軸長を測定した。図４Ｄは、投与量に応答する、暗所
で生育させた実生および明所で生育させた野生型のブラシノライドが誘導した胚
軸伸長を示す。データは、各12個体の実生の平均サンプルサイズを用いて、３回
の測定から得られた平均±標準誤差で表す。
増殖培地への10-6Mのブラシノライドの添加は、暗所における野生型実生には
効果がなかったが、暗所で生育させたdet2実生の胚軸の短い表現型をレスキュー
した(図４、ＢおよびＤ)。同様に10-7Mの添加の場合も、ブラシノステライドは
野生型実生の葉柄および葉には効果がなかったが、明所で生育させたdet2植物に
おいてはこれら器官の矯性の表現型を十分に抑制した（図４Ｃ）。対照的に、ジ
ベレリン(GA1またはGA4、10-8ないし10-5M)またはオーキシン（IAA，10-6し10-5
M）を加えたものは何れもdet2の欠陥をレスキューできなかった。胚軸の伸長の
抑制を逆転させるブラシノライド処理は、det1突然変異または光の何れかによっ
て引き起こされた（図４Ｄ）が、それは暗所でまたは明所で生育させたdet1実生
の何れの突然変異表現型も相補せず、このことは、DET1およびDET2が光調節過程
を制御する別々の経路に作用するという従前の遺伝研究を支持するものである。
実施例３
アラビドプシスdet2変異体は、植物の生活環の複数の段階の光調節発達におい
て多面的欠損を表す小さい暗緑色の矯性植物である。DET2遺伝子は、哺乳動物ス
テロイド5α-レダクターゼと約40%の配列同一性を持ち、あるクラスの植物ステ
ロイド、ブラシノステロイドの合成に関係しているタンパク質をコードする。以
下の実施例は、DET2タンパク質が、ヒト胎児腎臓293細胞において発現した場合
に、
数種の動物ステロイド基質の5α還元を触媒し、さらに哺乳動物ステロイド5α-
レダクターゼ酵素と同様の速度論上の特性を有することを示す。さらに、det2変
異植物体において発現したヒト・ステロイド5α-レダクターゼは、ブラシノステ
ロイド生合成におけるDET2を代替することができる。これらのデータは、DET2が
哺乳動物ステロイド5α-レダクターゼのオーソログであることを示し、さらにブ
ラシノステロイドが光調節植物発達において必須の役割を果たすというさらなる
証拠を提供する。図５は、哺乳動物ステロイド5α-レダクターゼ(A)およびアラ
ビドプシスDET2(B)によって触媒される化学反応を示す。
１．植物材料および生育条件：
用いた標準の野生型遺伝子型は、アラビドプシス・サリアナ・コロンビア(Ara
gidopsis thaliana Columbia)(Col-0)であった。本研究において用いられるdet2
-1変異体は既に記載されている(Chory，J.，Nagpal，P.およびPeto，C.A．(1991
)Plant Cell 3，445-459)。95%エタノールで１分間、続いてO.02%(v/v)Tween-20
を含有する漂白剤(Clorox)の1:3希釈液で12分間洗浄することによって種子を表
面殺菌した。次いで、該種子を滅菌蒸留水で３回洗浄し、0.08%フィタガー(Gibc
o BRL)中に再懸濁させた。発芽を誘発するために４℃で２日間処理した後に、１
%ショ糖、0.8%フィタガー、および1X ガンボーグ(Gamborg)のビタミンB5(Sigma)
を補足した0.5X S(Murashige，T.およびSkoog，F．(1962)Physiol．Plant．15，
473-497)培地(pH5.7)を含むペトリ皿に種子をまき、16時間日長で21℃の生育箱
にて維持した。３重のアルミホイルでプレートを覆うことによって、植物を暗所
で生長させた。全ての実験について、det2およびCol-0野生型植物を、同一の光
および湿度条件下で並べて生育させた。
２．ヒト胎児腎臓293細胞におけるDET2ｃＤＮＡの発現
1bpの5'-翻訳配列、786bpのオープンリーディングフレームおよび14bpの3'-非
翻訳配列を含むDET2ｃＤＮＡクローン由来の948bp以上の断片を、pCMV5発現ベク
ターに連結した(Anderson，S.，Davis，D.L.，Dahlback，H.，Jornvall，Hおよ
びRussell，D.W．(1989)J．Biol．Chem.，264，8222-8229)。対照として、突然
変異det2タンパク質もまた、pCMV5ベクターで発現させた(pCMV5-det2-1)。G1u20
4をLys204に変化させる単一ヌクレオチド突然変異(G-A)を含むかくのごとき
構築は、野生型DET2配列をPCRで増幅したdet2-1ゲノムＤＮＡから誘導した同一
の制限断片で置換することによってなされた。次いで得られたプラスミドをEcoR
I/Bgliiで消化してpCMV5発現ベクターへクローン化した。野生型DET2または変異
したdet2-1ｃＤＮＡの何れかを含む5mgの発現プラスミドを、先に記載したごと
くにリン酸カルシウム沈殿法(Normington，K.およびRussell，D.W．(1992)J.Bio
l．Chem．267，19548-19554)によってヒト胎児腎臓293細胞(ATCC CRL1573)中に
トランスフェクトした。トランスフェクション後16時間、ステロイド5α-レダク
ターゼ活性を、記載のごとくに完全細胞または細胞ライゼートの何れかにおいて
アッセイした(Anderson，S.，Bishop，R.W.およびRussell，D.W．(1989)J．Biol
．Chem．264，16249-16255;Thigpen，A.E.およびRussell，D.W．(1992)J．Biol
．Chem．267，8577-8583)。
３．det2-1変異体の形質転換
１型または２型ステロイド5α-レダクターゼの何れかをコードするヒトｃＤＮ
Ａを、pMD1ベクター、カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーター(CaMV)お
よびノパリンシンターゼ転写ターミネーター(Nos-ter)を含むpBI121(Clontech)
の誘導体へクローン化し、pMD1-hS5R（ヒト・ステロイド5α-レダクターゼ）プ
ラスミド（図８Ａ）を作製した。pMD1-hS5R構築物で形質転換したアグロバクテ
リウムGV3101株を用いて、先に記載したごとくに真空浸透法によって、det2-1変
異体を形質転換した(Bechtold，N.，Ellis，J.およびPelletier，G．(1993)C.R
．Acad．Sci．Paris 316，1188−1193)。形質転換体(T1)を、1%ショ糖、0.8%フ
ィタガー、1Xガンボーグ(Gamborg)のビタミンB5、および25mg/mlカナマイシンを
補足した0.5X MS培地(pH5.7)(前記)上で選択した。カナマイシン耐性実生を土壌
に移植し、16時間明、8時間暗サイクル下で23℃に維持し、自家授粉させ、次い
でT2種子を採取した。
４．4-MAでの黄化実生の処理
1%ショ糖、1Xガンボーグ(Gamborg)のビタミンB5、0.8%フィタガー、および種
々の濃度の4-MA（17b-(N,N-ジエチル）カルバモイル-4-メチル-4-アザ-5a-アン
ドロスタン-3-オン、Merck SharpおよびDohme Research Laboratoriesから譲渡
）を補足した0.5X MS(pH5.7)培地（前記）上で種子を発芽させた。２時間の光処
理に
続き、プレートを３重のアルミホイルで覆って生育箱中で21℃に保った。10日齢
の黄化実生の胚軸長を測定した。
５．ＤＮＡおよびＲＮＡ解析
アラビドプシスＤＮＡを先に記載したごとくに単離した(Li，J.およびChory，
J.，(1996)Methods in Molecular Biology:Arabidopsis Protocols，Martinez-Z
apater，J.M.およびSallnas，J.編(Humana,・・，NJ),印刷中)。ゲノムDET2断片
の増幅のために、1ml(10-20ng)の植物ＤＮＡを、5mlの10X Taqポリメラーゼ緩衝
液(Stratagene)、200mMデオキシヌクレオシド三リン酸塩(dNTPs)、正・逆プライ
マー各125ng、および2.5ユニットのTaqポリメラーゼを含む50mlの反応混合液中
で鋳型として用いた。増幅反応をサーモサイクラー(ERICOMP)にて、鋳型ＤＮＡ
を95℃で10分間変性させ、続いて45秒間94℃での変性、45秒間50℃でアニーリン
グ、90秒間72℃で伸長を40サイクル行い、そして72℃で10分間最後の伸長をさせ
ることにより行った。トランスジェニックdet2-1植物のヒト・ステロイド5α-レ
ダクターゼｃＤＮＡを増幅させるために、CaMV35Sプロモーターおよびそれぞれ
のｃＤＮＡから誘導されたプライマーと共に、（ｃＤＮＡの高GC含量によって生
じた問題を打開するために）10%DMSOをPCR反応中に添加した。全ＲＮＡを２週間
齢の実生からNo.poliらの方法(Napoli，C.，Lemieux，C.およびJorgensen，R.(1
990)Plant Cell 2，279−289)によって単離し、先に記載したごとくにＲＮＡゲ
ルブロットハイブリダイゼーションを行った（Chory，J.，Nagpal，P.およびPet
o，C.A．(1991)Plant Cell 3，445-459)。
アラビドプシスDET2遺伝子座が機能を有するステロイド5α-レダクターゼをコ
ードするかどうかを決定するために、全長DET2ｃＤＮＡを哺乳動物の発現ベクタ
ー、pCMV5（前記）にクローン化し、CaP04を介したトランスフェクションプロト
コール（前記）によって、培養ヒト胎児腎臓293細胞へ導入した。トランスフェ
クション後16時間で、放射性標識したステロイドを細胞培地に添加し、それらの
5α還元型への変換を薄層クロマトグラフィーによってモニターした(Normington
，K．およびRussell，D.W.(1992)J．Biol．Chem．267，19548-19554)。図６に示
すごとくに、ｃＤＮＡ挿入部を欠いているpCMV5発現ベクターでトランスフェク
トした細胞は、測定可能なステロイド5α-レダクターゼ活性を示さず、一方、ヒ
ト・１
型ステロイド5α-レダクターゼまたはアラビドプシスDET2の何れかのｃＤＮＡを
含むpCMV5発現ベクターの導入の結果、放射性標識されたプロゲステロンの4,5-
ジヒドロプロゲステロンへの還元が起こった。発明者らのこれまでの推測に一致
して(Li，J.，Nagpal，P.，Vitart，V.，McMorris，C.T.およびChory，J．(1996
)Science 272，398-401)、det2ｃＤＮＡでトランスフェクトした293細胞のごと
き、DET2のステロイド5α-レダクターゼ活性を全体として不活性化したdet2-1の
Glu204Lys突然変異は、放射性標識したプロゲステロンをその5α-還元型へ変換
できなかった（図６）。
哺乳動物ステロイド5α-レダクターゼ(Russel，D.W.およびWilson，J.D．1994
Annu．Rev．Biochem.，63，25-61)と同様に、アラビドプシスDET2は、テストス
テロンおよびアンドロステネジオンを含む3-オキソ-D4,5構造を有する数種のス
テロイドの5α-還元を触媒することができる。BR生合成においてアラビドプシス
DET2の仮定された基質は、3b-ヒドロキシ-D5,6構造を含むカンペステロールまた
はその類似体（シトステロールまたはスチグマステロール）であるので、発明者
らは、コレステロール、プレグネノロン、およびデヒドロエピアンドロステロン
を含むこの構造を有する数種の放射性標識ステロイドに対するDET2のステロイド
5α-レダクターゼ活性を測定した。哺乳動物ステロイド5α-レダクターゼを用い
て得られた結果と一致するラインにおいて(Hsia，S.L.およびVoigt，Ｗ．(1974)
J.Invest．Dermatol．62，224-227)、ヒト・１型ステロイド5α-レダクターゼま
たはDET2の何れかのｃＤＮＡでトランスフェクトした293細胞は、これらの基質
を5α-還元することができず（データは示さず）、このことは、植物がDET2酵素
による5α-還元前にカンペステロールを3-オキソ-D4,5-カンペステロールに変換
するために付加的な酵素の存在が必要であることを意味している。
発現したDET2タンパク質の速度論の特性。in vitroアッセイ（前記）を用いて
、腎臓293細胞で発現したDET2タンパク質の酵素速度論について研究した。テス
トステロンに対する見かけのKm値を決定すると2.5mMであってVmaxが0.2nmol/(mi
n-1・mg-1)であった（図７Ａ）が、一方、プロゲステロンに対する見かけのKm値
は0.4mMでVmaxが0.5nmol/(min-1・mg-1)であった（図７Ｂ）。これらの値を好適
にヒト・１型アイソザイムに対して計算されたものと比較する（テストステロン
に対してはKm=1.7mMおよびプロゲステロンに対してはKm=1.3mM）。哺乳動物の酵
素と同様に、DET2のステロイド5α-レダクターゼ活性は補因子としてNADHよりむ
しろNADPHを必要とし、その触媒反応は不可逆的である。
4-アザステロイドは、あるクラスの選択性があり、かつ強力な哺乳動物ステロ
イド5α-レダクターゼアイソザイムの阻害剤である。DET2酵素がまたこれら薬剤
によっても阻害されるかどうかを決定するために、組換えDET2を含む細胞ライゼ
ートを、基質としてのプロゲステロンおよび種々の量の4-アザステロイド、4-MA
と共にインキュベーションした。反応混合物中の4-MAの濃度が増加するに従って
、DET2酵素活性はますます阻害された（図７Ｃ）。このデータを調べることによ
って阻害の競合様式が明らかになり、計算された見かけのKi値は300nMであった
。示されていない実験においては、哺乳動物ステロイド5α-レダクターゼアイソ
ザイムの他の２つ阻害剤、フィナステライド(4-アザステロイド)およびLY191704
(非ステロイド系ベンゾキノリノン)は、組換えDET2の活性に影響を及ぼさなかっ
た。
哺乳動物ステロイド5α-レダクターゼ１型および２型アイソザイムは、最適ｐ
Ｈによって区別される。これまで試験した全ての種において、１型アイソザイム
はアルカリ性の最適ｐＨを有し(Vmaxは約pH8.0)、２型アイソザイムは酸性の最
適ｐＨを有する(VmaxはpH5.0-5.5)(前記)。植物酵素の最適ｐＨを測定して、ど
の哺乳動物アイソザイム酵素DET2酵素がこの生化学的パラメーターに関して最も
よく類似しているかを決定した。図７Ｄのデータは、組換えDET2タンパク質を含
む細胞ライゼートを用いて得られたpH対酵素活性の曲線は最適値のpH6.8で対称
であったことを示す。この値は、２つの哺乳動物アイソザイムの最適ｐＨの間に
ある。
ヒト・ステロイド5α-レダクターゼｃＤＮＡは、植物det2-1突然変異を相補す
る。DET2がヒト・ステロイド5α-レダクターゼの機能的同族体である場合には、
ある１つのまたは他のヒト酵素の発現は植物におけるdet2-1突然変異を補足し、
突然変異表現型をレスキューするはずである。この仮説を調べるために、発明者
らは、１型または２型ヒト・ステロイド5α-レダクターゼの何れかをコードする
ｃＤＮＡをアグロバクテリウムが介在する形質転換（前記）を用いてdet2-1突然
変異体中に安定して導入した。これらの実験において、全長ｃＤＮＡまたはトラ
ンケートした3'-非翻訳領域を有するｃＤＮＡの何れかを有する２つの構築物を
、各種ヒト・ステロイド5α-レダクターゼｃＤＮＡに対して調製した。これらを
、バイナリーベクター、カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーターおよび
ノパリンシンターゼ3'−非翻訳配列（図８Ａ）を含むpMD1中にクローン化した。
１セットの形質転換実験において、64個体のトランスジェニック植物が得られ
た。これらの中で、57個体が野生型の表現型を示し、残りの７ラインがdet2-1と
野生型植物との間の中間表現型を示した（表１）。図８Ｂ−８Ｄに示すごとくに
、det2-1突然変異の背景において何れかのヒト5α-レダクターゼｃＤＮＡが存在
することで、該突然変異の暗・明表現型の双方がレスキューされた。64個体のト
ランスジェニックラインを、CaMV35Sプロモーターおよびヒト5α-レダクターゼ
ｃＤＮＡから誘導したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCRによって、ヒ
トｃＤＮＡのそれらのゲノムへの挿入について調べた。何れかの型のヒト・ステ
ロイド5α-レダクターゼｃＤＮＡに対して期待される大きさのPCR生成物を（表
ｌにまとめられた）全てのトランスジェニック植物のゲノムＤＮＡから増幅し、
その一方で野生型またはdet2-1のヘテロ接合性およびホモ接合性植物の非形質転
換対照は、ポジティブな増幅シグナルを与えなかった。det2-1突然変異はG-A転
移を引き起こし、MnlI制限部位の削除を導くので、MnlI制限断片長多型(RFLP)は
det2-1変異体と野生型植物との間に存在する。PCRに基づくRFLP解析を用いて、
該64個体のトランスジェニックラインの何れかがまだなおdet2-1突然変異を含ん
でいることを確認し（表１）、それにより、観察した表現型の標準化が野生型DE
T2遺伝子のそれらのゲノムへの偶然の導入、もしくは変異した部位での復帰によ
るものである可能性は除去される。
表１
ヒト・ステロイド5α-レダクターゼｃＤＮＡを担持する トランスジェニックdet2-1植物の要約
植物の個体数
カナマイシン hS5RcDNA det2-1変異 野生型の表現型
構築物 耐性を示す を含有 を有する を示す
hS5R1-1.3kb 8 8 8 8
hS5R1-2.1kb 18 18 18 18
hS5R2-0.8kb 18 18 18 16
hS5R2-2.4KB 20 20 20 15
各構築物のトランスジェニック植物は２つの独立した形質転換実験から得られた
。構築物の記載については前記記載および図８Ａを参照。
観察した表現型の標準化がトランスジェニック植物におけるヒト・ステロイド
5α-レダクターゼｃＤＮＡの発現によって引き起こされたことを証明するために
、種々の濃度の哺乳動物ステロイド5α-レダクターゼの阻害剤4-MAを伴う合成増
殖培地上で、１型または２型ヒトｃＤＮＡの何れかを含む２つの代表的なトラン
スジェニックラインから発芽種子を回収した。図９は暗所で生育させた植物体の
子葉の伸長に対する4-MAの濃度上昇の効果を示す。4-MAの濃度上昇は野生型また
はｄet2-1実生の何れの子葉伸長にもほとんど効果を持たないが、該薬剤は該２
つのトランスジェニックラインにおける子葉生長を著しい低下させた。これら実
験で観察したdet2-1、野生型および２つのトランスジェニックラインに対する4-
MAの効果の違いは個々のヒト・ステロイド5α-レダクターゼおよびDET2の生化学
特性と一致していた。ヒト・ステロイド5α-レダクターゼ１型(8.0nM)の4-MAに
対するKiは、２型酵素(4.0nM)のそれの２倍であり、一方、DET2の4-MAに対するK
iはヒトアイソザイムのそれより少なくとも３０倍大きい(300nM)（図７Ｃ）。
第二のラインの、ヒト・ステロイド5α-レダクターゼｃＤＮＡ発現がdet2-1変
異表現型をレスキューしたという根拠は、それらの親ラインは十分な野生型の表
現型を示したが、個々の形質転換体のいくつかの後代が野生型植物に対するよリ
もdet2-1変異体により類似すると思われるという観察から来るものである。発明
者らはこの現象が、pMD1バイナリーベクターを用いた種々のトランスジェニック
ラインで従前に観察されたT2世代における導入遺伝子発現の低下によるものと推
測した。従って、いくつかのトランスジェニックラインにおいて、ヒトｃＤＮＡ
の発現レベルをＲＮＡブロッティングにより調べた。トランスジェニックdet2-1
植物で発現される定常レベルのヒト・ステロイド5α-レダクターゼｍＲＮＡ（図
１０Ｂ）は、暗所で生育させた実生の胚軸長（図１０Ａ）および明所で生育させ
た植物の全体的な形態（図１０Ｃ）の双方によって示されたごとくに、突然変異
のレスキューの程度に相関していた。調査した全てのラインのうち、最も高いレ
ベルのヒト転写物を示す植物は明所では十分な野生型伸長を示し、暗所ではそれ
らの子葉は野生型対照のそれよりずっと長かった。これに対し、最も低いレベル
のヒトｍＲＮＡ示すラインは、明所では野生型植物よりもdet2-1変異体により似
ている様であり、暗所では中間的な子葉長を有していた。これらの結果に基づき
、発明者らはヒトｃＤＮＡがdet2-1欠損をレスキューし、det2-1トランスジェニ
ック植物におけるヒト・ステロイド5α-レダクターゼｃＤＮＡの発現がそれらの
変異表現型のレスキューの程度に相関していたと結論付けた。
実施例４
DET2に関して過剰発現および低発現（アンチセンス）する２種の構築物でコメ
を形質転換した。DET2コーディング配列をカリフラワーモザイクウイルス35Sプ
ロモーターから逆方向に発現させる標準的なアグロバクテリウム発現ベクターを
用いた(Metzlaffら，Cell 88:845，1997)。該アンチセンス植物はdet2-1変異体
に類似した表現型を有しており、すなわち、それらは小さく、優勢不稔の低下お
よび頂芽優性の低下を伴っていた。適度の過剰発現を示すラインは野生型より大
きく、それはいくつかのラインが約15%の収量増加(種子質量が野生型種子より15
%重い)を有していたことに基づくものである。高度の過剰発現は健全ではなく、
それは多すぎるホルモンが有害であるという見解に一致するものである。
以上、本発明を好ましい具体例を参照して説明したが、本発明の精神から逸脱
することなく種々の変形や変更をなすことができるということを理解すべきであ
る。従って、本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定されるものである。
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ
//(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ
，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ
，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，
ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ
Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ
，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，
ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ
Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ
，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，
ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 リ，ジアンミング
アメリカ合衆国 92122 カリフォルニア
州，サン ディエゴ，デコロ ストリート
34番 4158