【発明の詳細な説明】
核酸に関する配列特異的結合性オリゴマーおよびアンチセンス
ストラテジーにおけるそれらの用途
この発明は、核酸結合特性を有するオリゴマーであって、モノマー単位として
１,５−アンヒドロヘキシトールヌクレオシド類似体により完全または部分的に
構成されるオリゴマーに関するものである。さらにこの発明は、アンチセンス技
術におけるオリゴマーの用途およびオリゴマーの製造方法に関するものである。
アンチセンス技術は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のコーディングセンス鎖の機能
が相補的アンチセンス鎖により遮断され得るという原理に基づいている。アンチ
センス技術は、様々な適用性があり、例えば診断、治療、ＤＮＡ修飾および単離
等で使用され得る。これらの技術では、アンチセンス鎖自体の安定性に加えて、
センスおよびアンチセンス鎖により形成される二重らせんまたは三重らせんの安
定性並びにセンス鎖に対するアンチセンス鎖の結合親和力が重要である。同様に
、分解酵素、例えばヌクレアーゼに対するオリゴマー、二重らせんまたは三重ら
せんの感受性は、有効性に関連した因子である。
オリゴヌクレオチドは、モノマーがヌクレオチドのオリゴマーである。ヌクレ
オチドは、ヌクレオシドの燐酸エステルであり、プリンまたはピリミジン塩基お
よび糖により構成される。各ヌクレオチドのバックボーンは、交互になった糖お
よび燐酸基により構成される。
ヌクレオチドの安定性および結合親和力は、例えば塩基の修飾により影響され
得る。その方向での研究では(１−５)、上記修飾の結果、二重らせんは安定性の
劣るものにしかならないことが示された。バックボーンにおける改変またはそこ
への新規構造の組み込みにより、ヌクレアーゼ安定性は高められたが、相補鎖に
関する結合親和力については副作用がもたらされただけだった。糖を修飾するこ
とにより、標的分子に対する親和力は限定的に増加しただけであった(６−８)。
この発明の目的は、既知オリゴマーと比べて安定性および結合親和力が改善さ
れた新規オリゴマーを提供することである。
ヘキシトールがその２位のところでピリミジンまたはプリン塩基の複素環に結
合している１,５−アンヒドロ−２,３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘキシトー
ルヌクレオシド類似体により完全または部分的に構成されるオリゴマーは、天然
に存在するオリゴヌクレオチドに結合し得ることが見いだされた。少なくとも部
分的にオリゴマーを構成しているモノマーは、式Ｉ：
（式中、Ｂは、ピリミジンまたはプリン塩基から誘導される複素環である）
により示される。モノマーは燐酸ジエステル架橋により互いに連結されており、
これらのオリゴマーの構造は式II：
［式中、Ｂはピリミジンまたはプリン塩基から誘導される複素環であり、ｌは０
〜１５の整数、ｋおよびｍは各々１〜１５の整数であるが、ただしｋ＞１の場合
ｍは０であり得、ｍ＞１の場合ｋは０であり得、Ｘは酸素または硫黄を示す］
で示される。式IIで示される化合物の塩で可能なものは全てこの発明に包含され
る。式Ｉで示されるモノマーは、ヨーロッパ特許出願第９２２０１８０３.１号
の対象である。式IIのオリゴマーは新規化合物である。それらは、天然２’−デ
オキシヌクレオシドから成るオリゴヌクレオチドとある種の類似性を示すが、メ
チレン基が環オキシドおよび炭素間に組み込まれ、塩基に結合されているため、
モノマーの糖は拡大されている。
この発明によると、式IIで示されるオリゴマーおよびそれらの塩類は、式III
［式中、ｋは整数であり、Ｂは式ＩおよびIIの場合と同じ意味を有する］
で示される天然オリゴヌクレオチドに対する配列特異的結合性を呈することが見
いだされた。従って、新規種類に属するハイブリドンまたは配列特異的結合性ポ
リマーが見いだされた。
少なくとも部分的にピラノースヌクレオシドにより構成されるこの発明による
オリゴマーが高い結合親和力を有するという事実は、非常に驚くべきことである
。モノマーのピラノースヌクレオチドから構築されるオリゴヌクレオチドの研究
は、特にエシェンモーザー等のグループにより過去数年間にわたって手がけられ
てきた。エシェンモーザーは、核酸に関する糖ビルディングブロックとしてのフ
ラノースの自然淘汰について調べた（９）。しかしながら、彼は、天然に存する
フラノース−ＤＮＡとの良好な結合を達成するために適当なアンチセンス分子が
満たすべき必要条件については示さなかった。
しかしながら、本発明者らは、どのピラノース様オリゴヌクレオチドが天然フ
ラノース−ＤＮＡとの安定した二重らせんを形成し得るかを調査した（１０、１
１）。理論的には、ピラノースオリゴヌクレオチドは、二重らせん形成中におけ
るエントロピー変化が少ないため、フラノースオリゴマーを凌ぐ自由エネルギー
利点を有する。
しかしながら、以前に本発明者らにより試験されたピラノース様オリゴヌクレ
オチドは、天然フラノース−ＤＮＡの相補鎖に全く結合し得ないかまたは充分に
は結合し得なかった。これらのピラノース様オリゴヌクレオチドは、２,３−ジ
デオキシ−Ｂ−Ｄ−エリトロ−ヘキソピラノシルヌクレオシド（式Ｖ）、２,４
−ジデオキシ−β−Ｄ−エリトロ−ヘキソピラノシルヌクレオシド（式VI）およ
び／または３,４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリトロ−ヘキサピラノシルヌクレオ
シド（式VII）により各々構成された。
従って、配列特異的結合性が、糖ビルディングブロックとしてピラノースを含
む式IIのオリゴマーについて見いだされるという事実は、よりいっそう驚くべき
ことである。フラノース化合物のフラン環をピラン環に拡大しても、天然オリゴ
ヌクレオチドと結合し得るオリゴマーは得られなかった。すなわち、ペントーフ
ラノシル環を１,５−アンヒドロヘキシトール環に拡大する効果は、予想され得
なかった。
従って、この発明による化合物は、１,５−アンヒドロ−２,３−ジデオキシ−
Ｄ−ヘキシトールが、アラビノ−立体配置に従いその２位のところでピリミジン
またはプリン塩基の複素環に結合しているヌクレオシド類似体のオリゴマーであ
る。
オリゴマーは、燐酸ジエステルまたはチオ燐酸ジエステルとして互いに結合し
た上記ヌクレオシド類似体により構成される。オリゴマーは、式II（ただし、ｋ
、ｌ、ｍ、ＢおよびＸは上記の意味を有する）により示され得る。オリゴマーは
、専ら式Ｉで示されるヘキシトールヌクレオシド類似体により構成され得るか（
ただし、式IIの１は０に等しい）、または天然２’−デオキシヌクレオシドを分
子に散在した状態またはその一端に有し得る（ただし、式IIの１は０またはそれ
より大きい）。ヘキシトールは（Ｄ）−立体配置を有し、置換基の立体化学はア
ラ
ビノ立体配置に従う。
基Ｂがピリミジン塩基から誘導される場合、それはシトシン、５−メチルシト
シン、ウラシルまたはチミンであり得る。Ｂがプリン塩基から誘導される場合、
それはアデニン、グアニン、２,６−ジアミノプリン、ヒポキサンチンもしくは
キサンチン環またはこれらのうちの１つに関するデアザ誘導体であり得る。
この発明のモノマー成分のヌクレオシド類似体は、様々な方法で製造され得、
製造方法の１つはヨーロッパ特許出願第９２.２０１８０３.１号の対象である。
これらの合成についてはフェルヘッゲン等（１２）にも同様に報告されている。
モノマーからオリゴマーへの組立は、古典的計画に従っており、標準ホスホルア
ミダイト化学（参考文献１３参照）またはＨ−ホスホレート化学（参考文献１４
参照）により行われ得る。手順は全て、好都合には標準的オリゴヌクレオチド合
成の場合と同様にＤＮＡ自動合成装置で行われる。これらの標準条件については
「メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」（１５）を参照。
好ましい方法は、「６’−方向」での組立用に入ってくるビルディングブロッ
クとしてヘキシトールヌクレオシド類似体のホスホルアミダイトを利用するホス
ホルアミダイト方法である。ホスホルアミダイトは、式VIII（ただし、Ｂ*はオ
リゴヌクレオチド合成に適した保護塩基部分である（例、各々式IX、Ｘ、ＸＩお
よびＸIIにより示されるチミン、Ｎ4−ベンゾイルシトシン、Ｎ6−ベンゾイルア
デニンおよびＮ2−イソブチリルグアニン））により示される。
式VIIIで示される生成物は、標準的方法に従って製造され得る。シトシン、アデ
ニンまたはグアニンの塩基部分の保護は、式Ｉで示される化合物のヒドロキシル
部分に関する一時的保護ストラテジーに従い達成される（１６）。しかしながら
、好ましくは、塩基保護は、上記式Ｉのモノマーの合成における中間体である、
４,６−ベンジリデン保護ヌクレオシド類似体１ａ−ｄのアシル化により行われ
る。
環外アミノ官能基のアシル化後、ベンジリデン部分は８０％酢酸により除去さ
れ、３ａ−ｄが得られる。化合物３ｃを得るため、ｐ−ニトロ−フェニルエチル
基はＤＢＵにより除去され得る。
１,５−アンヒドロヘキシトール類似体３ａ−ｄの１次ヒドロキシル官能基は
、ジメトキシトリチル基により保護され得、４ａ−ｄが得られる。オリゴヌクレ
オチド鎖への組み込みに適したホスホルアミダイトビルディングブロック５ａ−
ｄへの変換は、２−シアノ−エチル・Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルア
ミダイトにより達成され得る。１，５−アンヒドロヘキシトール類似体を含む支
持体の製造は、化合物４ａ−ｄをスクシニル化して６ａ−ｄを得、これらはカル
ボジイミドを利用して長鎖アルキルアミノ多孔質ガラス固相担体（ＣＣＡＡ−Ｃ
ＰＧ）または適当なアミノ官能化ポリスチレン（例、テンタゲル（商標）−ＲＡ
ＰＰポリメア）のアミノ官能基に結合され得、７ａ−ｄが得られる（支持体の官
能性化、すなわち参考文献１７）。
構築後、得られたオリゴヌクレオチドは、支持体から開裂され、１６時間５５
℃でのアンモニア処理により脱保護される。上記式IIの得られたオリゴマーの精
製は、幾つかの方法で達成され得る（１８）。好ましい精製方法では、１２とい
う塩基性ｐＨでのアニオン交換ＦＰＬＣを行い、可能な２次構造を全て崩壊する
（１０）。脱塩は、単純なゲル濾過技術、次いで凍結乾燥により行われ得る。許
容し得る塩類は全て慣用的方法で製造され得る。 上記で述べたところによると、これらのオリゴマーは、天然オリゴヌクレオチ
ドへの配列特異的結合性を示す。それらは、相補的天然オリゴデオキシヌクレオ
チドに対して非修飾配列の場合よりも強い結合性を示し、かなり高い生化学的安
定性があると考えられる。このように、それらは、診断、ハイブリダイゼーショ
ン、核酸の分離、部位特異的ＤＮＡ修飾および治療を含むアンチセンスストラテ
ジー並びに現在天然オリゴデオキシヌクレオチドにより遂行されている全アンチ
センスストラテジーに関して有利に使用され得る。
実施例
以下、実施例において、この発明による化合物並びにそれらの化学合成および
出発物質の製造についてさらに説明するが、それらはこの発明の限定を意図した
ものではない。次の略語が使用されている。
ＦＡＢＭＳ＝高速原子衝撃質量分析法
Ｔｈｇｌｙ＝チオグリセリン
ＮＢＡ＝ニトロベンジルアルコール
１,５−アンヒドロ−２,３−ジデオキシ−２−置換−Ｄ−アラビノ−ヘキシト
ールヌクレオシド類似体およびそれらの４,６−Ｏ−ベンジリデン保護誘導体の
合成については、フェルヘッゲン等（１２）により報告されている。
実施例１
塩基保護ヌクレオシド類似体
１.１．１,５−アンヒドロ−２−（Ｎ6−ベンゾイルアデニン−９−イル）−
２，３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノヘキシトール（３ｂ）
２０ｍｌの乾燥ピリジン中２.３ｇ（６.５１ミリモル）の１,５−アンヒドロ
−４,６−Ｏ−べンジリデン−２−（アデニン−９−イル）−２,３−ジデオキシ
−Ｄ−アラビノ−ヘキシトールから成る溶液に、０．９ｍｌ（７.８ミリモル）
のベンゾイルクロリドを０℃で加えた。室温で４時間撹拌後、混合物を氷浴で冷
却し、２ｍｌのＨ2Ｏを加えた。１.５ｍｌの濃縮ＮＨ3溶液（３３％ｇ／ｖ）を
加え、室温で４５分間さらに撹拌した後、混合物を濃縮した。残留物をカラムク
ロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2−ＭｅＯＨ、９８：２）により精製すると、１.
９
２ｇ（４.１９ミリモル、６４％収率）の１,５−アンヒドロ−４,６−Ｏ−ベン
ジリデン−２−（Ｎ6−ベンゾイルアデニン−９−イル）−２,３−ジデオキシ−
Ｄ−アラビノヘキシトールが得られた。
これをさらに６０℃で５時間１００ｍｌの８０％酢酸で処理することにより、
ベンジリデン部分を除去した。濃縮し、トルエンと共濃縮し、カラムクロマトグ
ラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2−ＭｅＯＨ、９５：５〜９０：１０）により精製すると、
この実施例の標記化合物１.１０ｇ（２.９８ミリモル、７１％収率）が得られた
。
１.２．１,５−アンヒドロ−２,３−ジデオキシ−２−（Ｎ2−イソブチリルグ
アニン−９−イル）−Ｄ−アラビノヘキシトール（３ｃ）
Ｎ2−イソブチリル−Ｏ6−［２−（ｐ−ニトロフェニル）エチル］グアニン（
１.８５ｇ、７.５ミリモル）を１,５−アンヒドロ−４,６−Ｏ−ベンジリデン−
３−デオキシ−Ｄ−グルシトール（１.１８ｇ、５ミリモル）によりアルキル化
し、１６時間無水ピリジン中１.５ｍｌ（１０ミリモル）のＤＢＵによりｐ−ニ
トロフェニル−エチル基を除去し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2
Ｃｌ2−ＭｅＯＨ、９９：１〜９７：３）により精製した後、１.３５ｇの粗１,
５
−アンヒドロ−４,６−Ｏ−ベンジリデン−２,３−ジデオキシ−２−（Ｎ2−イ
ソブチリル−グアニン−９−イル）−Ｄ−アラビノヘキシトールが得られた。１
００ｍｌの８０％ＨＯＡｃによりベンジリデン部分を加水分解すると（６０℃で
５時間）、カラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2−ＭｅＯＨ、９０：１０）後
に、所望の化合物３ｃ（６１０ｍｇ、１.７４ミリモル、３４％全体収率）が得
られた。
ＵＶ（ＭｅＯＨ）λmax２７３ｎｍ
実施例２
ヌクレオシド類似体のジメトキシトリチル化
２.１．１,５−アンヒドロ−６−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−（チミン−１
−イル）−２,３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノヘキシトール（４ａ）
１,５−アンヒドロ−２−（チミン−２−イル）−２,３−ジデオキシ−Ｄ−ア
ラビノ−ヘキシトール（３ａ）（３３０ｍｇ、１．２９ミリモル）を、２０ｍｌ
の無水ピリジンに溶かし、４８０ｍｇ（１．４２ミリモル）のジメトキシトリチ
ルクロリドを加えた。混合物を室温で一夜撹拌し、１００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2で希
釈し、１００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液で２回洗浄した。有機層を乾燥し、濃
縮し、トルエンと共濃縮した。生成した残留物をカラムクロマトグラフィー（１
％トリエチルアミン含有ＣＨＣｌ3中０〜３％ＭｅＯＨの勾配による）により精
製すると、泡状物として３７３ｍｇ（０．６７ミリモル、５２％）の標記化合物
が得られた。 ２.２．１,５−アンヒドロ−６−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−（Ｎ6−ベン
ゾイルアデニン−９−イル）−２,３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノヘキシトール
（４ｂ）
２５ｍｌの乾燥ピリジンに３７０ｍｇ（１ミリモル）のヌクレオシド３ｂおよ
び４００ｍｇ（１.２ミリモル）のジメトキシトリチルクロリドを溶かした溶液
を、室温で１６時間撹拌した。混合物を１００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、１０
０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液で２回洗浄した。有機層を乾燥し、濃縮し、トル
エンと共濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（０.２％ピリジン含有
ＣＨ2Ｃｌ2中０〜３％のＭｅＯＨ）により精製すると、泡状物として４００ｍｇ
（０．６ミリモル、収率６３％）の化合物４ｂが得られた。ＦＡＢＭＳ（Ｔｈｇ
ｌｙ、ＮａＯＡｃ）ｍ／ｃ：６９４（ｍ＋Ｎａ）+、２４０（Ｂ＋２Ｈ）+。
２.３.１,５−アンヒドロ−６−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−（Ｎ2−イソブ
チリルグアニン−９−イル）−２,３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノヘキシトール
（４ｃ）
２５ｍｌの乾燥ピリジンに５８０ｍｇ（１.６５ミリモル）のヌクレオシド３
ｃおよび６７０ｍｇ（２０ミリモル）のジメトキシトリチルクロリドを溶かした
溶液を、室温で１６時間撹拌した。混合物を１００ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、
１００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ3溶液で２回洗浄した。有機層を乾燥し、濃縮し、
トルエンと共濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（０.２％ピリジン
含有ＣＨ2Ｃｌ2中０〜３％のＭｅＯＨの勾配）により精製すると、泡状物として
７７０ｍｇ（１.１８ミリモル、収率７１％）の化合物４ｃが得られた。ＦＡＢ
ＭＳ（ＮＢＡ）ｍ／ｅ：６５４（Ｍ＋Ｈ）+。
２.４．アミダイトビルディングブロック（５ａ−ｃ）の製造
２.５ｍｌの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中６’−Ｏ−保護ヌクレオシド（０.５ミリモル）
、３当量の乾燥Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−エチルアミンおよび１.５当量の２−シ
アノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルクロロ−ホスホルアミダイトから成る混合
物を、室温で３時間撹拌した。０.５ｍｌのＥｔＯＨを加え、さらに２５分間撹
拌した後、混合物を５％ＮａＨＣＯ3−溶液（１５ｍｌ）および飽和ＮａＣｌ溶
液で洗浄し、乾燥し、濃縮した。Ｅｔ3Ｎでのフラッシュカラムクロマトグラフ
ィーにより、白色泡状物としてアミダイトが得られ、これを少量の乾燥ＣＨ2Ｃ
ｌ2に溶かし、１００ｍｌの冷（−５０℃）ｎ−ヘキサンに滴下した。沈澱物を
分離し、ｎ−ヘキサンで洗浄し、乾燥し、そのままＤＮＡ合成に使用した。
下表は、種々のアミダイトに関する溶離溶媒および沈澱後の収率を示す。
実施例３
６−Ｏ−保護ヌクレオシド類似体のスクシニル化
３.１．１,５−アンヒドロ−６−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｏ−スクシニ
ル−２−（チミン−１−イル）−２,３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノヘキシトー
ル（６ａ）
５ｍｌの無水ピリジン中８０ｍｇ（０.１４ミリモル）の４ａ、９ｍｇ（０.０
７ミリモル）のＤＭＡＰおよび４３ｍｇ（０.１４ミリモル）の琥珀酸無水物か
ら成る混合物を、室温で２４時間撹拌した。反応が不完全なので、追加量の４３
ｍｇ（０.４３ミリモル）を加え、混合物をさらに２４時間撹拌した。溶液を濃
縮し、トルエンと共濃縮した。残留物をＣＨ2Ｃｌ2に溶かし、有機層を飽和Ｎａ
Ｃｌ溶液および水で洗浄し、乾燥し、濃縮すると、白色泡状物として７８ｍｇ（
０.１２ミリモル、８６％収率）の６ａが得られた。
３.２．１,５−アンヒドロ−６−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｏ−スクシニ
ル−２−（Ｎ6−ベンゾイルアデニン−９−イル）−２,３−ジデオキシ−Ｄ−ア
ラビノヘキシトール（６ｂ）
６ａについて記載したのと同じ方法を用いて、６ｂを合成した。２６０ｍｇ（
０.３９ミリモル）の量の４ｂから、泡状物として２５６ｍｇ（０.３３ミリモル
、８５％収率）の標記化合物が得られた。
実施例４
オリゴヌクレオチドの生成
４.１．固体支持体の製造
４ｍｌの無水ピリジン中８０マイクロモルのスクシネート（６ａ、ｂ）、４０
０ｍｇの予備活性化ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（１７）、５ｍｇ（４０ミリモル）のＤＭ
ＡＰ、３５μｌのＥｔ3Ｎおよび１５３ｍｇ（８００マイクロモル）の１−（３
−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド.ＨＣｌから成る混合
物を、まず５分間音波処理し、次いで室温で１６時間撹拌した。撹拌後、ＣＰＧ
固体支持体を濾過し、ピリジン、メタノールおよびＣＨ2Ｃｌ2により逐次洗浄し
、次いで減圧下乾燥した。１.５ｍｌの１−メチルイミダゾール（ＴＨＦ中）（
アプライド・バイオシステムズ）および１.５ｍｌの無水酢酸−ルチジン−ＴＨ
Ｆ１：１：８（アプライド・バイオシステムズ）を用いて、支持体の表面の未処
理部位を覆った。室温で４時間撹拌後、固体支持体を濾過し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄
し、減圧下乾燥した。比色定量ジメトキシトリチル分析により、７ａについては
１８.
５マイクロモル／ｇおよび７ｂについては２１.５マイクロモル／ｇのローディ
ングが示された。
４.２．ＤＮＡ−合成
オリゴヌクレオチド合成は、ホスホルアミダイト法（末端ジメトキシトリチル
脱離）を用い、ＡＢＩ ３８１Ａ ＤＮＡ合成装置（アプライド・バイオシステ
ムズ）において行われた。得られた配列を脱保護し、濃縮アンモニア処理（５５
℃、１６時間）により固体支持体から開裂した。緩衝液Ａ（下記参照）で溶離す
るＮＡＰ−１０（商標）カラム（セファデックスＧ２５−ＤＮＡ級、ファーマシ
ア）により精製後、勾配系［Ａ＝１０ミリモルＮａＯＨ、ｐＨ１２.０、０.１モ
ルＮａＣｌ、Ｂ＝１０ミリモルＮａＯＨ、ｐＨ１２.０、０.９モルＮａＣｌ、使
用勾配はオリゴにより異なる、流速２ｍｌ／分］によるモノ−Ｑ（商標）ＨＲ１
０／１０アニオン交換カラム（ファーマシア）において精製を行った。低圧液体
クロマトグラフィーシステムは、メルク−日立Ｌ６２００Ａインテリジェント・
ポンプ、モノＱ（商標）ＨＲ１０／１０カラム（ファーマシア）、ウビコードＳ
ＪＩ ２１３８ ＵＶ検出装置（ファーマシア−ＬＫＢ）および記録装置により構
成された。生成物含有分画をＮＡＰ−１０(商標)カラムで脱塩し、凍結乾燥した
。
実施例５
融解温度
オリゴマーを、緩衝液：０.１モルＮａＣｌ、０.０２モル燐酸カリウムｐＨ＝
７.５、０.１ミリモルＥＤＴＡに溶かした。８０℃、２６０ｎｍで吸光度を測定
し、１,５−アンヒドロヘキシトールヌクレオシド類似体が変性状態で天然ヌク
レオシドの場合と同じ吸収係数を有するものとして、濃度を決定した。
アデニンモノマーの場合 エプシロン＝１５０００
チミンモノマーの場合 エプシロン＝８５００
グアニンモノマーの場合 エプシロン＝１２５００
シトシンモノマーの場合 エプシロン＝７５００
全実験における濃度は、各鎖約４マイクロモルであった。ウビコン９４０分光光
度計により、融解曲線を決定した。キュベットホルダー全体を循環している水に
よるサーモスタットでキュベットを調温し、キュベットに直接浸したサーミスタ
ーで溶液温度を測定した。温度制御およびデータ獲得は、ＩＢＭ／Ｐｃ ＡＴ互
換性コンピューターにより自動的に行われた。試料を加熱し、０.２℃／分の速
度で冷却すると、加熱および冷却融解曲線間に差異は全く観察され得なかった。
吸光度対温度曲線の第１微分係数を調べることにより、融解曲線を評価した。合
成されたオリゴヌクレオチドの例をそれらの融解点と一緒に表１〜４に示す。
表１
Ａ13／Ｔ13二重らせんの中央に単一アンヒドロヘキシトールヌクレオシド（Ａ
*、Ｔ*）が組み込まれた（０.１モルＮａＣｌ濃度で測定された）オリゴヌクレ
オチドの融解点。
表１から明らかなのは、１,５−アンヒドロ−２−（アデニン−９−イル）−２,
３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノーヘキシトールをオリゴデオキシアデニレートに
組み込むと、天然２’−デオキシアデノシンの挿入とほぼ同一のヘリックス−コ
イル転移が行われることである。しかしながら、オリゴデオキシアデニレート／
オリゴチミジン二重らせんに１つの誤対合があると、二重らせんの安定性に多大
な効果を及ぼすことは注意すべきである。これに反して、１,５−アンヒドロ−
２,３−ジデオキシ−２−（チミン−１−イル）−Ｄ−アラビノヘキシトールに
よりチミジンをオリゴチミジレートに置換すると、融解温度は実質的に下がる。
２,４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリトロ−ヘキソピラノシルヌクレオシド（ただ
し、Ａ*．Ｇ［Ａ*：９−２,４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリトロヘキソピラノシ
ル）アデニン］誤対合の方が、Ａ*．Ｔ［Ａ*：９−２,４−ジデオキシ−β−Ｄ
−エリトロヘキソピラノシル）アデニン］塩基対合よりもハイブリダイゼーショ
ンの安定性を高くする）による我々の実験室の以前の観察結果とは反対に（１１
）、モデルとしてオリゴデオキシアデニレート／オリゴチミジン二重らせんを用
いたとき、１,５−アンヒドロヘキシトールヌクレオシドとの塩基対合特異性に
おける改変は無い。
表２
０．１モルＮａＣｌで測定された、完全修飾オリゴヌクレオチドおよび両端が
修飾されたオリゴヌクレオチドの融解温度。
（１）２８４ｎｍで測定
１本鎖オリゴＡ*およびオリゴＴ*は両方とも規則正しい構造を示すが、高塩濃度
での結果とは反対に（結果は示されていない）、ポリＴ*はホモ二本鎖形成の場
合と同じ傾向は示さない。これは、オリゴＡ*およびオリゴＴ*の両場合とも、温
度に従ったＵＶ吸収のある程度の直線的増加により立証される。オリゴＴ*およ
びオリゴデオキシアデニレートの当モル混合物は、２８４ｎｍで測定したとき４
９％の淡色性で４５℃の融解点を示す。塩濃度を変えることにより、構造転移が
ＤＮＡで行われることが知られており、この場合も事実は明らかにこの通りであ
る。オリゴＴ*：オリゴデオキシアデニレート会合は低塩濃度で有利であり、オ
リゴＴ*ホモ二本鎖の形成は高塩濃度で有利である。しかしながら、２６０ｎｍ
での複合体の熱反応は、オリゴＴ*：オリゴデオキシーアデニレート会合が古典
的ヘリックス−コイル転移ではないことを示している。２６０ｎｍでは、まず淡
色性が減少し、４６℃で最小値を示し（融解点は４８４ｎｍで観察される）、次
いで増加する。アデニン（Ａ*）およびグアニン（Ｇ*）ヌクレオシド類似体を含
む完全修飾された混合配列（２つの６量体および１つの１２量体）も同様に評価
された。
表３
完全修飾６量体の融解温度
１モルＮａＣｌ、２０ミリモルＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７.５、ＥＤＴＡ ０.１モルで
測定。
２本鎖は、相補的配列：
１６および１７の場合、５’−ＴＣＴＣＣＴ（２０）、および
１８および１９の場合、５’−ＴＣＴＣＴＣ（２１）
により各々形成された。
これらの配列のうちの幾つかの場合融解点は６量体について測定され得たが、
１モルＮａＣｌ（２０ミリモルＫ2ＨＰＯ4、ｐＨ７.５および０１ミリモルＥＤ
ＴＡ）中でこれらのオリゴヌクレオチドの熱変性を試験した。最も重要な現象は
、ピラノース様オリゴヌクレオチドおよびそれらの天然対応物質間における２本
鎖の明確な形成である。さらに、これらの修飾２本鎖は、全くワトソン−クリッ
ク
塩基対のみで構成される対照２本鎖よりも安定している。
しかしながら、注意を引くのは、逆平行相補的オリゴヌクレオチドを伴った配
列１６（３１.２℃）および１７（Ｔｍ＝１４.７℃）に関する融解温度の差異が
大きいことである。両修飾オリゴが３Ｇ*および３Ａ*を含み、それらの配列順序
のみ異なる場合、１６に関する融解温度は１８の場合の２倍である。この配列依
存的効果は、対照オリゴヌクレオチド１７および１９では僅かしか表されていな
い。
表４
Ａ*およびＧ*を含む完全修飾１２量体の融解温度
０.１モルＮａＣｌで測定
（２４）５’−ＴＣＴ ＣＣＴ ＣＴＣ ＣＣＴ
１２量体の場合を見ても、相補的逆平行配列２４を伴う両配列を評価した場合、
やはり完全修飾オリゴヌクレオチドの安定性が、その対照配列２３と比べて高く
、融解温度が１６℃高いことに気付く。
参考文献
１．ビューケージ、Ｓ.Ｌ.およびアイヤー、Ｒ.Ｐ.、「テトラヘドロン」４９
、６１２３−６１９４（１９９３）
２．サンフビ等、「ヌクレオサイズ・アンド・ヌクレオタイズ」１０、３４５
−３４６（１９９１）
３．チョレット等、「ケミカ・スクリプタ」２６、３７−４０（１９８６）
４．シーラ、Ｆ.およびケーネ、Ａ.、「バイオケミストリー」２４、７５５６
−７５６１（１９８５）
５．ワグナー等、「サイエンス」２６０、１５１０−１５１３（１９９３）
６．イノウエ等、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」１５、６１３１−６
１４８（１９８７）
７．パーボスト等、「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ
・コミュニケーションズ」１６５、７４２−７４７（１９８９）
８．ガグノア等、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」１５、１０４１９−
１０４３６（１９８７）
９．エシェンモーザー、Ａ.、「ピュア・アンド・アプライド・ケミストリー
」６５、１１７９−１１８８（１９９３）
１０．アウグスティンズ等、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」２０、４
７１１−４７１６（１９９２）
１１．アウグスティンズ等、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」２１、４
６７０−４６７６（１９９３）
１２．フェルヘッゲン等、「ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー
」３６、２０３３−２０４０（１９９３）
１３．マッテウッチ・エン・カルテルス、「ジャーナル・オブ・アメリカン・
ケミカル・ソサエティー」１０３、３１８５−３１９１（１９８１）
１４．フロエーラー等、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」１４、５３９
９−５４０７（１９８６）
１５．「メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、２０巻、『プロト
コルズ・フォー・オリゴヌクレオタイズ・アンド・アナログズ』、Ｓ．アグラワ
ル編、フマーナ・プレス、トトワ、ニュージャージー、アメリカ合衆国
１６．ティ等、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー」
１０４、１３１６−１３１９（１９８２）
１７．ポン等、「バイオテクニクス」６、７６８−７７５（１９８８）
１８．「メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、２６巻、フーフズ
ツック９、『アナリシス・アンド・ピュリフィケーション・オブ・シンセティッ
ク・オリゴヌクレオタイズ・バイ・ＨＰＬＣ』、Ｓ．アグラウェル編、フマーナ
・プレス、トトワ、ニュージャージー、アメリカ合衆国DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Sequence Specific Binding Oligomers for Nucleic Acids and Their Use in Antisense Strategies The present invention relates to oligomers having nucleic acid binding properties, comprising 1,5-anhydrohexitol nucleosides as monomer units It relates to oligomers that are completely or partially composed of analogs. Furthermore, the present invention relates to the use of the oligomer in the antisense technology and a method for producing the oligomer. Antisense technology is based on the principle that the function of the coding sense strand of a DNA or RNA molecule can be blocked by a complementary antisense strand. Antisense technology has various applications and can be used in, for example, diagnosis, therapy, DNA modification and isolation, and the like. In these techniques, in addition to the stability of the antisense strand itself, the stability of the double or triple helix formed by the sense and antisense strands and the binding affinity of the antisense strand for the sense strand are important. Similarly, the sensitivity of oligomers, duplexes or triple helices to degrading enzymes, such as nucleases, is a factor related to efficacy. Oligonucleotides are oligomers whose monomers are nucleotides. Nucleotides are phosphate esters of nucleosides and are composed of purine or pyrimidine bases and sugars. The backbone of each nucleotide is composed of alternating sugar and phosphate groups. Nucleotide stability and binding affinity can be affected, for example, by base modifications. Studies in that direction (1-5) have shown that as a result of the above modifications, the double helix is only inferior in stability. Modifications in the backbone or the incorporation of new structures therein increased nuclease stability, but only had side effects on binding affinity for the complementary strand. Modification of the sugar only increased the affinity for the target molecule to a limited extent (6-8). It is an object of the present invention to provide novel oligomers having improved stability and binding affinity compared to known oligomers. Hexitol is wholly or partially composed of a 1,5-anhydro-2,3-dideoxy-D-arabino-hexitol nucleoside analogue, which is attached at its 2-position to a pyrimidine or purine base heterocycle It has been found that the oligomer can bind to a naturally occurring oligonucleotide. The monomers at least partially constituting the oligomer are of the formula I: Wherein B is a heterocycle derived from a pyrimidine or purine base. The monomers are linked together by a phosphoric diester bridge, and the structure of these oligomers is represented by Formula II: Wherein B is a heterocyclic ring derived from a pyrimidine or purine base, l is an integer of 0 to 15, k and m are each an integer of 1 to 15, provided that when k> 1, m is 0 And where m> 1, k can be 0 and X represents oxygen or sulfur. All possible salts of the compounds of the formula II are included in the present invention. The monomers of the formula I are the subject of European patent application 92201803.1. The oligomer of formula II is a novel compound. They show some similarity to oligonucleotides consisting of natural 2'-deoxynucleosides, but the monomeric sugar is expanded because the methylene group is incorporated between the ring oxide and the carbon and attached to a base. I have. According to the present invention, oligomers of formula II and their salts are represented by formula III Wherein k is an integer, and B has the same meaning as in formulas I and II. Thus, a new class of hybridone or sequence-specific binding polymers has been found. The fact that the oligomers according to the invention, which are constituted at least in part by pyranose nucleosides, have a high binding affinity is very surprising. Research on oligonucleotides constructed from monomeric pyranose nucleotides has been undertaken over the past few years, especially by groups such as Eschen Moser. Eschen Moser examined natural selection of furanose as a sugar building block for nucleic acids (9). However, he did not indicate the requirements that a suitable antisense molecule must meet to achieve good binding to naturally occurring furanose-DNA. However, we investigated which pyranose-like oligonucleotides could form a stable double helix with natural furanose-DNA (10, 11). Theoretically, pyranose oligonucleotides have a free energy advantage over furanose oligomers due to less entropy change during double helix formation. However, the pyranose-like oligonucleotides previously tested by the inventors failed to bind to the complementary strand of native furanose-DNA at all or poorly. These pyranose-like oligonucleotides are 2,3-dideoxy-BD-erythro-hexopyranosyl nucleosides (formula V), 2,4-dideoxy-β-D-erythro-hexopyranosyl nucleosides (formula VI) ) And / or 3,4-dideoxy-β-D-erythro-hexapyranosyl nucleoside (Formula VII). Thus, the fact that sequence-specific binding is found for oligomers of formula II containing pyranose as a sugar building block is even more surprising. Even if the furan ring of the furanose compound was expanded to a pyran ring, no oligomer capable of binding to the natural oligonucleotide was obtained. That is, the effect of expanding the pentofuranosyl ring to the 1,5-anhydrohexitol ring could not be expected. Thus, the compounds according to the invention are nucleoside analogues in which 1,5-anhydro-2,3-dideoxy-D-hexitol is linked at its 2-position to a pyrimidine or purine base heterocycle according to the arabino-configuration. Oligomer. Oligomers are composed of the above nucleoside analogs linked together as phosphoric diesters or thiophosphoric diesters. Oligomers may be represented by formula II, wherein k 1, l, m, B and X have the meanings given above. The oligomer may be composed exclusively of hexitol nucleoside analogs of Formula I (where 1 of Formula II is equal to 0), or may have the natural 2'-deoxynucleoside interspersed with the molecule or at one end thereof. (Where 1 in Formula II is 0 or greater). Hexitol has the (D) -configuration and the stereochemistry of the substituents follows the arabino configuration. If group B is derived from a pyrimidine base, it can be cytosine, 5-methylcytosine, uracil or thymine. If B is derived from a purine base, it can be adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, a hypoxanthine or xanthine ring or a deaza derivative on one of these. The nucleoside analogs of the monomer component of the present invention can be prepared in a variety of ways, one of which is the subject of European Patent Application No. 92.201803.1. These syntheses are also reported in Ferhegen et al. (12). Assembly of the monomers into oligomers follows the classical design and can be performed by standard phosphoramidite chemistry (see ref. 13) or H-phosphorate chemistry (see ref. 14). All procedures are conveniently performed on a DNA automated synthesizer as in standard oligonucleotide synthesis. For these standard conditions, see “Methods in Molecular Biology” (15). A preferred method is the phosphoramidite method, which utilizes the phosphoramidite of a hexitol nucleoside analog as the incoming building block for "6'-direction" assembly. Phosphoramidites have the formula VIII where B * is a protected base moiety suitable for oligonucleotide synthesis (e.g., thymine, N, each represented by formula IX, X, XI and XII, respectively) Four -Benzoylcytosine, N 6 -Benzoyl adenine and N Two -Isobutyrylguanine)). The product of formula VIII can be prepared according to standard procedures. Protection of the base moiety of cytosine, adenine or guanine is achieved according to a temporary protection strategy for the hydroxyl moiety of compounds of formula I (16). However, preferably, base protection is effected by acylation of the 4,6-benzylidene protected nucleoside analogs 1a-d, which are intermediates in the synthesis of monomers of formula I above. After acylation of the exocyclic amino function, the benzylidene moiety is removed with 80% acetic acid to give 3a-d. The p-nitro-phenylethyl group can be removed by DBU to obtain compound 3c. The primary hydroxyl function of the 1,5-anhydrohexitol analogs 3a-d can be protected by a dimethoxytrityl group to give 4a-d. Conversion to phosphoramidite building blocks 5a-d suitable for incorporation into an oligonucleotide chain can be achieved with 2-cyano-ethyl N, N-diisopropylchlorophosphoramidite. The preparation of supports containing 1,5-anhydrohexitol analogs involves the succinylation of compounds 4a-d to give 6a-d, which utilize carbodiimide to make long-chain alkylamino porous glass solid supports. (CCAA-CPG) or the amino functionality of a suitable amino-functionalized polystyrene (eg, Tentagel ™ -RAPP polymer) to give 7a-d (functionalization of the support, ie, reference Reference 17). After assembly, the resulting oligonucleotide is cleaved from the support and deprotected by ammonia treatment at 55 ° C. for 16 hours. Purification of the resulting oligomer of formula II above can be accomplished in several ways (18). In a preferred purification method, anion exchange FPLC is performed at a basic pH of 12 to disrupt all possible secondary structures (10). Desalting can be performed by a simple gel filtration technique followed by lyophilization. All acceptable salts can be prepared in a conventional manner. As stated above, these oligomers exhibit sequence-specific binding to natural oligonucleotides. They show stronger binding to complementary natural oligodeoxynucleotides than unmodified sequences, and are considered to have significantly higher biochemical stability. Thus, they can be used advantageously with respect to antisense strategies, including diagnostics, hybridization, nucleic acid isolation, site-specific DNA modification and therapy, as well as all antisense strategies currently being performed with natural oligodeoxynucleotides. EXAMPLES The following examples further illustrate the compounds according to the invention and their chemical synthesis and the preparation of starting materials, but they are not intended to limit the invention. The following abbreviations have been used: FABMS = fast atom bombardment mass spectrometry Thgly = thioglycerin NBA = nitrobenzyl alcohol 1,5-anhydro-2,3-dideoxy-2-substituted-D-arabino-hexitol nucleoside analogs and their 4,6- The synthesis of O-benzylidene protected derivatives has been reported by Ferheggen et al. (12). Example 1 Base-Protected Nucleoside Analog 1.1.1.1,5-Anhydro-2- (N 6 -Benzoyladenin-9-yl)-2,3-dideoxy-D-arabinohexitol (3b) 2.3 g (6.51 mmol) of 1,5-anhydro-4,6-O in 20 ml of dry pyridine. To a solution consisting of -benzylidene-2- (adenin-9-yl) -2,3-dideoxy-D-arabino-hexitol, 0.9 ml (7.8 mmol) of benzoyl chloride was added at 0 ° C. After stirring at room temperature for 4 hours, the mixture was cooled in an ice bath and 2 ml of H Two O was added. 1.5 ml concentrated NH Three A solution (33% g / v) was added and after further stirring at room temperature for 45 minutes, the mixture was concentrated. The residue was subjected to column chromatography (CH Two Cl Two -MeOH, 98: 2) to give 1.92 g (4.19 mmol, 64% yield) of 1,5-anhydro-4,6-O-benzylidene-2- (N 6 -Benzoyladenin-9-yl) -2,3-dideoxy-D-arabinohexitol. This was further treated with 100 ml of 80% acetic acid at 60 ° C. for 5 hours to remove the benzylidene portion. Concentrate, co-concentrate with toluene and column chromatography (CH Two Cl Two Purification by -MeOH (95: 5 to 90:10) gave 1.10 g (2.98 mmol, 71% yield) of the title compound of this example. 1.2,1,5-anhydro-2,3-dideoxy-2- (N Two -Isobutyrylguanin-9-yl) -D-arabinohexitol (3c) N Two -Isobutyryl-O 6 -[2- (p-Nitrophenyl) ethyl] guanine (1.85 g, 7.5 mmol) was converted to 1,5-anhydro-4,6-O-benzylidene-3-deoxy-D-glucitol (1.18 g, 5 mmol), the p-nitrophenyl-ethyl group was removed with 1.5 ml (10 mmol) of DBU in anhydrous pyridine for 16 hours, and flash column chromatography (CH Two Cl Two -MeOH, 99: 1 to 97: 3), after 1.35 g of crude 1,5-anhydro-4,6-O-benzylidene-2,3-dideoxy-2- (N Two -Isobutyryl-guanin-9-yl) -D-arabinohexitol was obtained. Hydrolysis of the benzylidene moiety with 100 ml of 80% HOAc (5 hours at 60 ° C.) gave column chromatography (CH Two Cl Two After -MeOH (90:10), the desired compound 3c (610 mg, 1.74 mmol, 34% overall yield) was obtained. UV (MeOH) λ max 273 nm Example 2 Dimethoxytritylation of Nucleoside Analog 2.1.1,5-Anhydro-6-O-dimethoxytrityl-2- (thymin-1-yl) -2,3-dideoxy-D-arabinohexitol ( 4a) 1,5-Anhydro-2- (thymin-2-yl) -2,3-dideoxy-D-arabino-hexitol (3a) (330 mg, 1.29 mmol) was dissolved in 20 ml of anhydrous pyridine and 480 mg (1.42 mmol) of dimethoxytrityl chloride was added. The mixture was stirred at room temperature overnight and 100 ml of CH Two Cl Two Diluted with 100 ml of saturated NaHCO Three Washed twice with the solution. The organic layer was dried, concentrated and co-concentrated with toluene. The resulting residue was subjected to column chromatography (CHCl containing 1% triethylamine). Three Purification by a gradient of 0-3% MeOH in) afforded 373 mg (0.67 mmol, 52%) of the title compound as a foam. 2.2. 1,5-anhydro-6-O-dimethoxytrityl-2- (N 6 -Benzoyladenin-9-yl) -2,3-dideoxy-D-arabinohexitol (4b) In 25 ml of dry pyridine were added 370 mg (1 mmol) of nucleoside 3b and 400 mg (1.2 mmol) of dimethoxytrityl chloride. The dissolved solution was stirred at room temperature for 16 hours. Mix the mixture with 100 ml CH Two Cl Two Diluted with 100 ml of saturated NaHCO Three Washed twice with the solution. The organic layer was dried, concentrated and co-concentrated with toluene. The residue was subjected to column chromatography (CH 2 containing 0.2% pyridine). Two Cl Two Purification by 0-3% MeOH in water afforded 400 mg (0.6 mmol, 63% yield) of compound 4b as a foam. FABMS (Thgly, NaOAc) m / c: 694 (m + Na) + , 240 (B + 2H) + . 2.3.1,5-Anhydro-6-O-dimethoxytrityl-2- (N Two -Isobutyrylguanin-9-yl) -2,3-dideoxy-D-arabinohexitol (4c) 580 mg (1.65 mmol) of nucleoside 3c and 670 mg (20 mmol) of dimethoxy in 25 ml of dry pyridine The solution in which trityl chloride was dissolved was stirred at room temperature for 16 hours. Mix the mixture with 100 ml CH Two Cl Two Diluted with 100 ml of saturated NaHCO Three Washed twice with the solution. The organic layer was dried, concentrated and co-concentrated with toluene. The residue was subjected to column chromatography (CH 2 containing 0.2% pyridine). Two Cl Two Purification by 0-3% MeOH in MeOH) provided 770 mg (1.18 mmol, 71% yield) of compound 4c as a foam. FAB MS (NBA) m / e: 654 (M + H) + . 2.4. Preparation of Amidite Building Blocks (5a-c) 2.5 ml of dry CH Two Cl Two 6'-O-protected nucleoside (0.5 mmol) in a mixture consisting of 3 equivalents of dry N, N-diisopropyl-ethylamine and 1.5 equivalents of 2-cyanoethyl-N, N-diisopropylchloro-phosphoramidite And stirred at room temperature for 3 hours. After addition of 0.5 ml of EtOH and stirring for a further 25 minutes, the mixture is quenched with 5% NaHCO3. Three -Washed with the solution (15 ml) and saturated NaCl solution, dried and concentrated. Et Three Flash column chromatography with N afforded the amidite as a white foam, which was added to a small amount of dry CH2. Two C l Two And dropped into 100 ml of cold (−50 ° C.) n-hexane. The precipitate was separated, washed with n-hexane, dried and used as is for DNA synthesis. The table below shows the elution solvent and yield after precipitation for various amidites. Example 3 Succinylation of 6-O-protected nucleoside analogs 3.1.1,1,5-Anhydro-6-O-dimethoxytrityl-4-O-succinyl-2- (thymin-1-yl) -2,3 -Dideoxy-D-arabinohexitol (6a) 80 mg (0.14 mmol) of 4a, 9 mg (0.07 mmol) of DMAP and 43 mg (0.14 mmol) of succinic anhydride in 5 ml of anhydrous pyridine Was stirred at room temperature for 24 hours. Because the reaction was incomplete, an additional amount of 43 mg (0.43 mmol) was added and the mixture was stirred for another 24 hours. The solution was concentrated and co-concentrated with toluene. CH residue Two Cl Two And the organic layer was washed with saturated NaCl solution and water, dried and concentrated to give 78 mg (0.12 mmol, 86% yield) of 6a as a white foam. 3.2.1,5-Anhydro-6-O-dimethoxytrityl-4-O-succinyl-2- (N 6 -Benzoyladenin-9-yl) -2,3-dideoxy-D-arabinohexitol (6b) 6b was synthesized using the same method as described for 6a. 4b in an amount of 260 mg (0.39 mmol) gave 256 mg (0.33 mmol, 85% yield) of the title compound as a foam. Example 4 Generation of Oligonucleotides 4.1. Preparation of solid support 80 micromolar succinate (6a, b) in 4 ml of anhydrous pyridine, 400 mg of preactivated LCAA-CPG (17), 5 mg (40 mmol) of DMAP, 35 μl of Et Three A mixture of N and 153 mg (800 μmol) of 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide.HCl was first sonicated for 5 minutes and then stirred at room temperature for 16 hours. After stirring, the CPG solid support was filtered and pyridine, methanol and CH Two Cl Two , And then dried under reduced pressure. Using 1.5 ml of 1-methylimidazole (in THF) (Applied Biosystems) and 1.5 ml of acetic anhydride-lutidine-THF1: 1: 8 (Applied Biosystems), uncover the surface of the support. Covered treatment area. After stirring at room temperature for 4 hours, the solid support was filtered and CH Two Cl Two And dried under reduced pressure. Colorimetric dimethoxytrityl analysis showed a loading of 18.5 micromol / g for 7a and 21.5 micromol / g for 7b. 4.2. DNA-Synthesis Oligonucleotide synthesis was performed on an ABI 381A DNA synthesizer (Applied Biosystems) using the phosphoramidite method (terminal dimethoxytrityl elimination). The resulting sequence was deprotected and cleaved from the solid support by concentrated ammonia treatment (55 ° C., 16 hours). After purification on a NAP-10 ™ column (Sephadex G25-DNA grade, Pharmacia) eluting with buffer A (see below), a gradient system [A = 10 mmol NaOH, pH 12.0, 0.1 mol NaCl , B = 10 mmol NaOH, pH 12.0, 0.9 mol NaCl, gradient used depends on oligo, flow rate 2 ml / min] on a Mono-Q ™ HR10 / 10 anion exchange column (Pharmacia). went. The low pressure liquid chromatography system consisted of a Merck-Hitachi L6200A intelligent pump, a Mono Q ™ HR 10/10 column (Pharmacia), a Ubicode SJI 2138 UV detector (Pharmacia-LKB) and a recorder. Product containing fractions were desalted on NAP-10 ™ columns and lyophilized. Example 5 Melting Temperature The oligomer was dissolved in buffer: 0.1 M NaCl, 0.02 M potassium phosphate pH = 7.5, 0.1 mM EDTA. Absorbance was measured at 80 ° C. and 260 nm, and the concentration was determined assuming that the 1,5-anhydrohexitol nucleoside analog had the same absorption coefficient as the natural nucleoside in a denatured state. For adenine monomer Epsilon = 15000 For thymine monomer Epsilon = 8500 For guanine monomer Epsilon = 12500 For cytosine monomer Epsilon = 7500 The concentration in all experiments was about 4 micromolar for each chain. Melting curves were determined with a Ubicon 940 spectrophotometer. The temperature of the cuvette was adjusted with a thermostat of water circulating in the entire cuvette holder, and the solution temperature was measured with a thermistor directly immersed in the cuvette. Temperature control and data acquisition were performed automatically by an IBM / Pc AT compatible computer. When the sample was heated and cooled at a rate of 0.2 ° C./min, no difference could be observed between the heated and cooled melting curves. The melting curve was evaluated by examining the first derivative of the absorbance versus temperature curve. Examples of synthesized oligonucleotides, along with their melting points, are shown in Tables 1-4. Table 1 A 13 / T 13 Melting point of oligonucleotide (measured at 0.1 molar NaCl concentration) incorporating a single anhydrohexitol nucleoside (A *, T *) in the center of the duplex. It is clear from Table 1 that when 1,5-anhydro-2- (adenin-9-yl) -2,3-dideoxy-D-arabinhohexitol is incorporated into oligodeoxyadenylate, natural 2'-deoxyadenosine is obtained. And a helix-coil transition almost identical to that of the insertion. However, it should be noted that a single mismatch in the oligodeoxyadenylate / oligothymidine duplex has a significant effect on the stability of the duplex. In contrast, when thymidine is replaced by oligothymidylate with 1,5-anhydro-2,3-dideoxy-2- (thymin-1-yl) -D-arabinohexitol, the melting temperature substantially increases. Go down. 2,4-dideoxy-β-D-erythro-hexopyranosyl nucleoside (however, A * .G [A *: 9-2,4-dideoxy-β-D-erythrohexopyranosyl) adenine] In the case of A *. T [A *: 9-2,4-dideoxy-β-D-erythrohexopyranosyl) adenine] makes hybridization more stable than base pairing) and previous observations in our laboratory. Conversely (11), there is no alteration in base pairing specificity with 1,5-anhydrohexitol nucleosides when using the oligodeoxyadenylate / oligothymidine duplex as a model. Table 2 Melting temperatures of fully modified oligonucleotides and oligonucleotides modified at both ends, measured at 0.1 molar NaCl. (1) Measured at 284 nm Both single-stranded oligo A * and oligo T * show regular structures, but contrary to the results at high salt concentrations (results not shown), poly T * was homozygous. It does not show the same tendency as in the case of main chain formation. This is evidenced in both oligo A * and oligo T * by some linear increase in UV absorption with temperature. An equimolar mixture of oligo T * and oligodeoxyadenylate exhibits a melting point of 45% with a pale color of 49% when measured at 284 nm. By changing the salt concentration, it is known that structural transitions take place in DNA, again in fact this is clearly the case. Oligo T *: oligodeoxyadenylate association is advantageous at low salt concentrations, and formation of oligo T * homoduplex is advantageous at high salt concentrations. However, thermal reaction of the complex at 260 nm indicates that oligo T *: oligodeoxy-adenylate association is not a classical helix-coil transition. At 260 nm, the tint decreases first, shows a minimum at 46 ° C. (melting point is observed at 484 nm), and then increases. Fully modified mixed sequences containing two adenine (A *) and guanine (G *) nucleoside analogs (two hexamers and one 12-mer) were evaluated as well. Table 3 Melting temperature of fully modified hexamer 1 mol NaCl, 20 mmol KH Two PO Four PH 7.5, measured at 0.1 mol EDTA. The duplex was formed by the complementary sequences: 5'-TCTCCT (20) for 16 and 17, and 5'-TCTCTC (21) for 18 and 19, respectively. In some of these sequences the melting point could be determined for the hexamer, but with 1 molar NaCl (20 mmol K Two HPO Four , PH 7.5 and 01 mmol EDTA) were tested for heat denaturation. The most important phenomenon is the distinct formation of a duplex between pyranose-like oligonucleotides and their natural counterparts. Furthermore, these modified duplexes are more stable than control duplexes, which are composed entirely of Watson-Crick base pairs. However, it should be noted that the differences in melting temperatures for sequences 16 (31.2 ° C) and 17 (Tm = 14.7 ° C) with antiparallel complementary oligonucleotides are large. If both modified oligos contain 3G * and 3A * and differ only in their sequence order, the melting temperature for 16 is twice that for 18. This sequence-dependent effect is only slightly expressed for control oligonucleotides 17 and 19. Table 4 Melting temperatures of fully modified 12-mers containing A * and G * Measured at 0.1 M NaCl (24) 5'-TCT CCT CTC CCT In the case of a 12-mer, when both sequences with complementary antiparallel sequence 24 were evaluated, the stability of the fully modified oligonucleotide was still observed. Is higher than the control sequence 23 and the melting temperature is 16 ° C. higher. References 1. View Cage, SL and Ayer, RP, "Tetrahedron" 49, 6123-6194 (1993). 2. Nucleosize and Nucleotides, 10, 345-346 (1991). 3. "Chemica Scripter", 26, 37-40 (1986). 4. Sheila, F. and Keene, A., "Biochemistry" 24, 7556-7561 (1985). 5. Wagner et al., Science, 260, 1510-1513 (1993). 6. Inouye et al., Nucleic Acids Research, 15, 6131-6148 (1987). 7. "Biochemical and Biophysical Research Communications," 165, 742-747 (1989). 8. Gacnoir et al., Nucleic Acids Research, 15, 10419-10436 (1987). 9. Eschen Moser, A., "Pure and Applied Chemistry" 65, 1179-1188 (1993). Augustines, et al., Nucleic Acids Research, 20, 4711-4716 (1992). Augustines, et al., Nucleic Acids Research, 21, 4670-4676 (1993). 12. Vergehgen et al., Journal of Medicinal Chemistry, 36, 2033-2040 (1993). 13. Matteucci en Cartels, Journal of the American Chemical Society, 103, 3185-3191 (1981). 14. Frouerer et al., Nucleic Acids Research, 14, 539-5407 (1986). "Methods in Molecular Biology", Volume 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S.M. 15. Agrawar, Humana Press, Totowa, New Jersey, USA 17. J. et al., Journal of American Chemical Society, 104, 1316-1319 (1982). 18. Pon et al., "Biotechnics" 6, 768-775 (1988). "Methods in Molecular Biology", Vol. 26, Hoofstukk 9, "Analysis and Purification of Synthetic Oligonucleotides by HPLC", S.M. Agrawell, Fumana Press, Totowa, New Jersey, USA
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，
ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ
Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ
，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，
ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ
Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ
，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，
ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 ファン・アエルスホット，アルツール・ア
ルベルト・エドガルト
ベルギー、ベー−2220ヘイスト・オー／デ
ー・ベルク、ヘイスト−ゴールストラート
29番────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M
C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG
, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN,
TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG),
AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, C
H, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB
, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR,
KZ, LK, LR, LT, LU, LV, MD, MG, M
N, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU
, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TT,
UA, UG, US, UZ, VN
(72) Inventors Van Aershot, Artur A
Robert Edgart
Belgium, Bee-2220 Heist O / de
-Berg, Heist-Goldstraat
No. 29