HUT77509A

HUT77509A - Sequence-specific binding oligomers to nucleic acids and their use in antisense strategies

Info

Publication number: HUT77509A
Application number: HU9800097A
Authority: HU
Inventors: Piet André Maurits Herdewijn; Arthur Albert Edgard Van Aerschot
Original assignee: Stichting Rega Vzw
Priority date: 1994-08-17
Filing date: 1995-08-14
Publication date: 1998-05-28
Also published as: AU3384595A; NO970716L; FI970598A0; CN1158618A; JP2000505778A; WO1996005213A1; MX9701111A; EP0777676A1; FI970598A; NZ292140A; CA2196306A1

Description

A találmány tárgyát nukleinsavkötő tulajdonsággal rendelkező oligomerek képezik, amelyek teljes egészükben vagy részben 1,5-anhidrohexitol-nukleozidanalóg monomeregységekből épülnek fel. A találmány tárgyához tartoznak ezen felül a fenti oligomerek alkalmazása antiszensz technikákban, valamint az említett oligomerek előállítására szolgáló eljárások.BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to oligomers having nucleic acid-binding properties which consist wholly or partially of monomeric units of the 1,5-anhydrohexitol nucleoside analogue. The invention also relates to the use of the above oligomers in antisense techniques and to methods for preparing said oligomers.

Az antiszensz technikák azon az elven alapulnak, hogy egy DNS vagy RNS molekula kódoló szálának funkciója egy komplementer antiszensz szállal blokkolható. Az antiszensz technikáknak különböző alkalmazási területei ismeretesek, alkalmazhatók például a diagnosztizálásban, terápiában, DNS módosítására, izolálására stb. E technikák alkalmazásánál az antiszensz szál stabilitása mellett a szensz és antiszensz szálak által képzett duplex vagy triplex stabilitása, valamint az antiszensz szálnak a szensz szál irányában mutatott kötődési affinitása lényeges. Hasonlóképp, a hatékonyság meghatározásában lényeges szempont az oligomer, a duplex vagy a triplex érzékenysége lebontó enzimekkel, például nukleázokkal szemben.Antisense techniques are based on the principle that the function of a coding strand of a DNA or RNA molecule can be blocked by a complementary antisense strand. Various applications of antisense techniques are known, for example in diagnosis, therapy, DNA modification, isolation, and the like. In using these techniques, in addition to the stability of the antisense strand, the stability of the duplex or triplex formed by the sense strand and the antisense strand, as well as the binding affinity of the antisense strand toward the strand strand are important. Similarly, the sensitivity of the oligomer, duplex or triplex to degradable enzymes, such as nucleases, is an important consideration in determining efficacy.

Oligonukleotidoknak olyan oligomereket nevezünk, amelyekben a monomerek nukleotidok. A nukleotidok nukleozidok foszfát-észterei, amelyeket purin- vagy pirimidinbázisok, valamint cukrok alkotnak. A nukleotidok vázát felváltva elhelyezkedő cukor- és foszfátcsoportok alkotják.Oligonucleotides are those oligomers in which the monomers are nucleotides. Nucleotides are phosphate esters of nucleosides formed from purine or pyrimidine bases and sugars. The nucleotide backbone is composed of alternating sugar and phosphate groups.

A nukleotidok stabilitását és kötődési affinitását például a bázis módosítása befolyásolja. Az ezirányban végzett vizsgálatok szerint az ilyen módosítások kevésbé stabil duplexek képződéséhez vezetnek [Beaucage, S.L. & Iyer, R.P., • · ·For example, the modification of the base affects the stability and binding affinity of the nucleotides. Studies in this direction have shown that such modifications lead to the formation of less stable duplexes [Beaucage, S.L. & Iyer, R.P., • · ·

Tetrahedron, 49, 6123-6194. (1993); Sanghvi et al., Nucleosides and Nucleotides, 10, 345-346. (1991); Chollet et al. Chemica Scripta, 26, 37-40. (1986); Seela, F. & Kehne, A., Biochemistry, 24, 7556-7561. (1985); Wagner et al., Science, 260, 1510-1513. (1993)]. A váz módosításai vagy abba új struktúrák beépítése fokozott stabilitáshoz vezettek a nukleázokkal szemben, de hátrányosan befolyásolták annak a komplementer szálhoz történő kötődési affinitását. A cukrok módosításai a cél-molekulához történő kötődés affinitását csak korlátozott mértékben fokozták [Inoue et al., Nucleic Acids Rés., 15, 6131-6148. (1987); Perbost et al., Biochem. Biophys. Rés. Commun., 165, 742-747. (1989); Gagnor et al. ,Tetrahedron, 49, 6123-6194. (1993); Sanghvi et al., Nucleosides and Nucleotides, 10, 345-346. (1991); Chollet et al. Chemica Scripta, 26, 37-40. (1986); Seela, F. & Kehne, A., Biochemistry, 24, 7556-7561. (1985); Wagner et al., Science 260: 1510-1513. (1993)]. Modifications of the skeleton or the insertion of new structures into it led to increased stability to the nucleases but adversely affected its binding affinity to the complementary strand. Modifications of sugars have only limited enhancement of the binding affinity of the target molecule (Inoue et al., Nucleic Acids Res., 15, 6131-6148). (1987); Perbost et al., Biochem. Biophys. Gap. Commun., 165, 742-747. (1989); Gagnor et al. .

Nucleic Acid Rés., 15, 10419-10436. (1987)].Nucleic Acid Res., 15, 10419-10436. (1987)].

A találmány tárgyát új oligomerek képezik, amelyek az ismert oligomerekhez képest fokozott stabilitással és javított kötődési affinitással rendelkeznek.The present invention relates to novel oligomers which exhibit enhanced stability and improved binding affinity to known oligomers.

Kimutattuk, hogy teljes egészükben vagy részben 1,5-anhidro-2,3-didezoxi-D-//arabino-hexitol nukleozidanalógokból felépülő oligomerek - amennyiben a hexitol a 2-pozícióján keresztül egy pirimidin- vagy purinbázis heterociklusos gyűrűjéhez kapcsolódik - képesek a természetben előforduló oligonukleotidokhoz kötődni. Az oligomerek legalább részben (I) általános képletű monomerekből épülnek fel, a képletben B jelentése egy heterociklusos gyűrű, amely pirimidin- vagy purinbázisból származik. A monomerek foszfodiészter kötéseken át kapcsolódnak egymáshoz; az említett oligomerek szerkezetét a (II) általános képlet szemlélteti, ahol B egy heterociklusos gyűrű, amely pirimidin- vagy purinbázisból szár4 mazik; 1 értéke 1-15, egész szám; k és m értéke 1-15, egész szám, de ha k > 1, akkor m lehet 0, és ha m > 1, akkor k lehet 0; és X jelentése oxigén- vagy kénatom.It has been shown that oligomers consisting wholly or partially of nucleoside analogues of 1,5-anhydro-2,3-dideoxy-D-N-arabino-hexitol, when attached via the 2-position of hexitol to a heterocyclic ring of a pyrimidine or purine base binding oligonucleotides. The oligomers are at least partially composed of monomers of formula (I) wherein B is a heterocyclic ring derived from a pyrimidine or purine base. The monomers are linked through phosphodiester bonds; the structure of said oligomers is represented by Formula II, wherein B is a heterocyclic ring derived from a pyrimidine or purine base; 1 is an integer from 1 to 15; k and m are 1 to 15 integers, but if k> 1 then m may be 0 and if m> 1 then k may be 0; and X is oxygen or sulfur.

A találmány tárgykörébe tartozik továbbá a (II) általános képletű vegyület valamennyi lehetséges sója. Az (I) általános képletű monomereket az EP-92201803.1 számú dokumentum tárja fel. A (II) általános képletű oligomerek új vegyületek. Ezek bizonyos hasonlóságot mutatnak a természetben előforduló 2'-dezoxinukleotidokhoz, de a monomerek cukor alegységeinek mérete megnövelt, mivel a gyűrűben az oxigénatom és a bázishoz kapcsolódó szénatom közé egy metilcsoport kapcsolódik.The invention also encompasses all possible salts of the compound of formula II. The monomers of formula (I) are disclosed in EP-92201803.1. The oligomers of formula II are novel compounds. They exhibit some similarity to naturally occurring 2'-deoxynucleotides, but the size of the sugar subunits of the monomers is increased because a methyl group is attached between the oxygen atom and the carbon atom to the base.

Úgy találtuk, hogy a (II) általános képletű oligomerek és azok sói szekvenciaspecifikus módon kötődnek a (III) általános képletű, természetben előforduló oligonukleotidokhoz, ahol k egy egész számot jelent, és B az (I) és (II) képletnél megadott jelentéssel bír. Tehát hibridonok vagy szekvenciaspecifikusán kötődő polimerek új osztályát találtuk.It has been found that the oligomers of formula II and their salts bind sequence-specific to the naturally occurring oligonucleotides of formula III, wherein k is an integer and B is as defined in formulas I and II. Thus, a new class of hybridones or sequence-specific polymers has been found.

Az a tény, hogy a találmány szerinti, legalább részben piranóz nukleozidokból álló oligomerek nagy kötődési affinitással rendelkeznek, igen meglepő. Monomer piranóz nukleotidokból felépülő oligonukleotidok vizsgálatát végezték az elmúlt években többek között A. Eschenmoser és munkatársai.The fact that the oligomers of the invention, which are composed at least in part of pyranose nucleosides, have a high binding affinity is very surprising. Oligonucleotides composed of monomeric pyranose nucleotides have been studied in recent years by A. Eschenmoser et al.

Eschenmoser furanózok természetben végbemenő szelekcióját tanulmányozta nukleinsavak cukor alegységeinek felépítésére [Eschenmoser, A., Pure & Appl. Chem., 65, 1179-1188. (1993)]. A cikk azonban nem utal azokra a kívánalmakra, amelyeket egy megfelelő antiszensz molekulának ki kell elégítenie egy természetes furanóz-DNS-hez történő kielégítő kötődéshez.He has studied the natural selection of Eschenmoser furanoses to construct sugar subunits of nucleic acids [Eschenmoser, A., Pure & Appl. Chem., 65, 1179-1188. (1993)]. However, this article does not refer to the requirements that an appropriate antisense molecule must satisfy to satisfactorily bind to a natural furanose DNA.

• β · · · • · · · ··«» • «·« «· « ««« • ····« · # ····«· · ·· ··• β · · · · · · · · ······································································•

Azt vizsgáltuk, hogy mely piranózszerű oligonukleotidok képesek stabil duplexet képezni természetes furanóz-DNS-sel [Augustyns et al., Nucleic Acid Rés., 20, 4711-4716. (1992);We investigated which pyranose-like oligonucleotides can form stable duplexes with natural furanose DNA (Augustyns et al., Nucleic Acid Res., 20, 4711-4716). (1992);

Augustyns et al., Nucleic Acid Rés., 21, 4570-4676. (1993)].Augustyns et al., Nucleic Acid Res., 21, 4570-4676. (1993)].

Elméletileg, egy piranóz-oligonukleotid szabadenergia előnynyel rendelkezik egy furanóz-oligomerhez képest, mivel a duplex képződés során kevesebb entrópiaváltozás jön létre.Theoretically, a free pyranose oligonucleotide has an advantage over a furanose oligomer because less entropy changes occur during duplex formation.

Az általunk korábbiakban tanulmányozott piranózszerű oligonukleotidok azonban nem voltak képesek kötődni vagy nem kötődtek eléggé a természetben előforduló furanóz-DNS komplementer szálaihoz. Ezek a piranózszerű oligonukleotidok (V) általános képletű 2,3-didezoxi-p-D-eritro-hexapiranozil nukleozidokból, (VI) általános képletű 2,4-didezoxi-P~D-eritro-hexapiranozil nukleozidokból és/vagy (VII) általános képletű 3, 4-didezoxi-p-D-eritro-hexapiranozil nukleozidokból álltak.However, the pyranose-like oligonucleotides we studied previously were not capable or sufficiently bound to complementary strands of naturally occurring furanose DNA. These pyranose-like oligonucleotides are derived from 2,3-dideoxy-β-erythro-hexapyranosyl nucleosides of formula (V), 2,4-dideoxy-β-D-erythro-hexapyranosyl nucleosides of formula (VI) and / or amino acids of formula (VII). Consisted of 4-dideoxy-pD-erythro-hexapyranosyl nucleosides.

A fentiek tükrében tehát még meglepőbb az a tény, hogy a (II) általános képletű, cukor-alegységekként piranózokat tartalmazó oligomerek esetében szekvencia-specifikus kötődés volt kimutatható. A furanóz-vegyületek furángyűrűjének pirángyűrűvé történő megnövelése nem eredményezett természetes oligonukleotidokhoz kötődni képes oligomereket. A pentofuranozilgyűrű 1,5-anhidrohexitol-gyűrűvé történő megnövelésének hatása tehát nem volt előre látható.In view of the foregoing, it is even more surprising that the oligomers of formula (II) containing pyranoses as sugar subunits have been shown to be sequence specific. Increasing the furan ring of furanose compounds to a pyran ring did not result in oligomers capable of binding to natural oligonucleotides. The effect of increasing the pentofuranosyl ring to the 1,5-anhydrohexitol ring was thus unpredictable.

A találmány szerinti vegyületek tehát olyan nukleozidanalógokból álló oligomerek, amelyekben az 1,5-anhidro-2,3-didezoxi-D-hexitol egy arabino-konfigurációjú 2-pozícióján keresztül a pirimidin- vagy purinbázis heterociklusos gyűrűjéhez kapcsolódik.Thus, the compounds of the present invention are oligomers of nucleoside analogs in which the arabino-configured 2-position of 1,5-anhydro-2,3-dideoxy-D-hexitol is attached to the heterocyclic ring of the pyrimidine or purine base.

» ·»·· «»·» ·· «

Az olígomerek a fenti nukleozidanalógokból épülnek fel, és foszfát-diészterekként vagy tiofoszfát-diészterekként kapcsolódnak egymáshoz. Az oligomereket a (II) általános képlet szemlélteti, ahol k, 1, m, B és X jelentése a fenti. Az oligomerek állhatnak kizárólag (I) képletű hexitol nukleozidanalógokból [mely esetben a (II) általános képletben 1=0] vagy közbeiktatva, illetve a molekula végén tartalmazhatnak természetes 2'-dezoxi-nukleotidokat is [mely esetben a (II) általános képletben 1= 1 vagy annál nagyobb]. A hexitol (D)-konfigurációval rendelkezik, és a szubsztituensek sztereokémiája arabino konfigurációnak felel meg.The oligomers are formed from the above nucleoside analogs and are linked together as phosphate diesters or thiophosphate diesters. The oligomers are represented by Formula II, wherein k, 1, m, B and X are as defined above. The oligomers may consist solely of the hexitol nucleoside analogs of formula (I) (in which case 1 = 0 in formula (II)) or may contain natural 2'-deoxynucleotides at the end of the molecule (in which case 1 = 0). 1 or greater]. The hexitol has the (D) configuration and the stereochemistry of the substituents corresponds to the arabino configuration.

Amennyiben a B csoport pirimidinbázisból származik, az lehet citozin vagy 5-metil-citozin, uracil vagy timin. Amenynyiben a B csoport purinbázisból származik, az lehet adenin, guanin, 2,6-diamino-purin, hipoxantin vagy xantin, vagy lehet a fentiek deaza származéka.When group B is derived from a pyrimidine base, it may be cytosine or 5-methylcytosine, uracil or thymine. When group B is derived from a purine base, it may be adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, hypoxanthine or xanthine, or it may be a deaza derivative thereof.

A találmány szerinti monomer összetevőket, azaz nukleozidanalógokat különböző eljárásokkal állíthatjuk elő; egy lehetséges eljárást ismertet az EP-92.201803.1 számú dokumentum. A fenti előállítási módokat ismertetik hasonlóképpen Verheggen és munkatársai [Verheggen et al., J. Med. Chem., 36, 2033-2030. (1993)]. A monomerek oligomerekké történő összeállítása a klasszikus utat követi, és végezhető szokásos foszforamidit kémiával [Matteucci en Caruthers, J. Am. Chem. Soc., 103, 3185-3191. (1981)] vagy H-foszforát kémiával [Froehler et al., Nucl. Acids Rés., 14, 5399-5407. (1986)]. Valamennyi eljárást a szokásos oligonukleotidszintézisre felhasznált automatizált DNS-szintetizáló • · · · · • · készülékkel végezhetjük. A fenti standard feltételek ismertetését illetően utalunk az alábbi szakirodalmi helyre: Methods in Molecular Biology 20. kötet, Protocols fór oligonucleotides and analogs, S. Agrawal (szerk.), Humana Press, Totowa, New Jersey, USA.The monomeric components of the invention, i.e. nucleoside analogues, may be prepared by various methods; a possible process is described in EP-92.201803.1. The above methods of preparation are similarly described in Verheggen et al., J. Med. Chem., 36, 2033-2030. (1993)]. The assembly of monomers into oligomers follows the classic route and can be carried out by conventional phosphoramidite chemistry (Matteucci en Caruthers, J. Am. Chem. Soc., 103, 3185-3191). (1981)] or H-phosphorate chemistry [Froehler et al., Nucl. Acids Res., 14, 5399-5407. (1986)]. All procedures can be performed using an automated DNA synthesizer used for conventional oligonucleotide synthesis. Reference is made to Methods in Molecular Biology, Vol. 20, Protocols for Oligonucleotides and Analogs, by S. Agrawal (ed.), Humana Press, Totowa, New Jersey, USA.

Előnyös eljárás a foszforamidit eljárás, amely a hexitol nukleozidanalógok foszforamiditjeit használja a 6'-irányban történő összeépüléshez beépítendő egységekként. A foszforamiditeket a (VIII) általános képlet szemlélteti, ahol B jelentése oligonukleotid-szintézisre alkalmas védett bázis [például timin, N⁴-benzoil-citozin, N⁶-benzoil-adenin, N²-izobutiril-guanin, melyeket a (IX), (X), (XI) és (XII) képletek szemléltetnek].A preferred process is the phosphoramidite process, which uses phosphoramidites of hexitol nucleoside analogues as units to be incorporated in the 6 'direction. The phosphoramidites correspond to the Formula (VIII) wherein B is suitable for oligonucleotide synthesis is protected by a base [e.g., thymine, benzoyl-cytosine, N ^4, N ⁶ -benzoyl-adenine, N ² isobutyryl-guanine, which (IX), (X), (XI) and (XII) are illustrated.

A (VIII) általános képletű termékeket ismert eljárásokkal állíthatjuk elő. A citozin-, adenin- vagy guaninbázis-egység védelmét az (I) képletű vegyületek hidroxilcsoportjainak átmeneti védelmét biztosító stratégiával érhetjük el [Ti et al., J. Am. Che,. Soc., 104, 1316-1319. (1982)]. Amint az A reakcióvázlaton látható, bázis védelmét azonban előnyösen az (la-d) képletű 4,β-benzilidén-védett nukleozidanalógok acilezésével hozzuk létre, amelyek az (I) általános képletű monomerek szintézisének köztitermékeit képviselik.The products of formula (VIII) may be prepared by known methods. Protection of the cytosine, adenine or guanine base units can be achieved by a strategy for the temporary protection of the hydroxyl groups of the compounds of formula I (Ti et al., J. Am. Che. Soc., 104, 1316-1319. (1982)]. However, as shown in Scheme A, base protection is preferably accomplished by acylation of the 4, β-benzylidene protected nucleoside analogs of formula (Ia-d), which are intermediates in the synthesis of monomers of formula (I).

A gyűrűn kívüli aminocsoport acilezését követően a benzilidéncsoportot 80 %-os ecetsavval eltávolítjuk, így kapjuk a (3a-d) képletű vegyületeket. A (3c) képletű vegyület előállításához a p-nitro-fenil-etil-csoportot DBU-val távolíthatjuk el.After acylation of the extracyclic amino group, the benzylidene group is removed with 80% acetic acid to give compounds of formula 3a-d. The p-nitrophenylethyl group can be removed by DBU to produce 3c.

A (3a-d) képletű 1,5-anhidro-hexitol-analógok elsődle• · · · · · • · · · · · ··«··· · ges hidroxilcsoportjainak védettségét dimetoxi-tritil-csoporttal érhetjük el, így kapjuk a (4a-d) képletű vegyületeket. Az (5a-d) képletű foszforamidit-egységek átalakítását oligonukleotid láncba történő beépítésre alkalmas egységekké 2-ciano-etil-N,N-di izopropi1-klór-foszfor-amidittel végezhetjük. 1,5-anhidrohexitol-analógokat tartalmazó hordozók a (4a-d) képletű vegyületek szukcinezésével állíthatók elő, így kapjuk a (6a-d) képletű vegyületeket, amelyek vagy hosszú láncú alkil-amino-csoporttal módosított porózus üveg (CCAA-CPG) aminocsoportjaihoz kapcsolhatók, vagy karbidiimid alkalmazásával megfelelő, aminocsoportokkal ellátott polisztirolhoz (például Tentagele®-Rapp Polymere) köthetők, így a (7a-d) képletű vegyületekhez jutunk [hordozók funkciós csoportokkal történő ellátására vonatkozó szakirodalmi helyet lásd: Pon et al., Biotechniques, 6, 768-775. (1988)].The protection of the primary hydroxyl groups of the 1,5-anhydrohexitol analogs of formula 3a-d can be achieved by the dimethoxytrityl group to provide the 4a-d. Conversion of phosphoramidite units of formula (5a-d) to units suitable for incorporation into an oligonucleotide chain can be accomplished with 2-cyanoethyl N, N-diisopropyl-chlorophosphoramidite. The carriers containing the 1,5-anhydrohexitol analogs can be prepared by succinating the compounds of formula 4a-d to give the compounds of formula 6a-d which have either the amino groups of a porous glass (CCAA-CPG) modified by a long chain alkylamino group. or by the use of carbidimide, they may be coupled to a suitable amino group-containing polystyrene (e.g., Tentagele®-Rapp Polymer) to give compounds of Formula 7a-d. See Pon et al., Biotechniques, 6, p. 768-775. (1988)].

Az összeállítást követően, a kapott oligonukleotidokat a hordozóról lehasítjuk, és a védőcsoportokat 16 órán át, 55 °C-on ammóniával végzett kezeléssel eltávolítjuk. Az így kapott (II) általános képletű oligomereket többféle módszerrel tisztíthatjuk [Methods in Molecular Biology, 26(9) kötet, Analysis and Purification of synthetic oligonucleotides by HPLC, S. Agrawel (szerk.), Humana Press, Totowa, New Jersey, USA]. Előnyös eljárás a bázikus pH (pH=12) mellett végzett anioncserélő FPLC, hogy valamennyi lehetséges másodlagos struktúrát megszüntessünk [Augustyns et al., Nucleic Add Rés., 20, 4711-4716. (1992)]. A sók eltávolítását liofilezést követően egyszerű gélszűréses technikákkal végezhetjük. Valamennyi elfogadható só szokásos módon • · · · · • · · állítható elő.After assembly, the resulting oligonucleotides are cleaved from the support and deprotected by treatment with ammonia at 55 ° C for 16 hours. The resulting oligomers of formula (II) can be purified by a variety of methods (Methods in Molecular Biology, Vol. 26 (9), Analysis and Purification of Synthetic Oligonucleotides by HPLC, S. Agrawel, Ed., Humana Press, Totowa, New Jersey, USA). ]. A preferred method is anion exchange FPLC at basic pH (pH 12) to eliminate all possible secondary structures (Augustyns et al., Nucleic Add Sl., 20, 4711-4716). (1992)]. Saline removal after lyophilization can be accomplished by simple gel filtration techniques. All acceptable salts may be prepared in the usual manner.

Amint azt a fentiekben említettük, a találmány szerinti oligomerek szekvencia-specifikus módon kötődnek természetes oligonukleotidokhoz. Erősebben kötődnek egy komplementer természetes oligodezoxinukleotidhoz, mint a módosítatlan szekvencia, és azoknál sokkal nagyobb biokémiai stabilitással rendelkeznek. Ily módon előnyösen alkalmazhatók antiszensz stratégiákban, ezen belül diagnosztizálásra, hibridizációra, nukleinsavak izolálására, DNS helyspecifikus módosítására és terápiás hatóanyagok előállítására, valamint valamennyi jelenleg alkalmazott, természetes oligodezoxinukleotidok felhasználásával végzett antiszensz stratégiában.As mentioned above, the oligomers of the invention bind in a sequence-specific manner to natural oligonucleotides. They bind more strongly to a complementary natural oligodeoxynucleotide than the unmodified sequence and have much greater biochemical stability. Thus, they are advantageously used in antisense strategies, including diagnostics, hybridization, nucleic acid isolation, site-specific DNA modification and production of therapeutic agents, and in all antisense strategies utilizing natural oligodeoxynucleotides currently in use.

A találmány szerinti vegyületeket, valamint azok kémiai szintézisét és a kiindulási anyagok előállítását a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.The compounds of the present invention, as well as their chemical synthesis and the preparation of starting materials, will now be illustrated by way of specific embodiments, without, however, being limited thereto.

A következő rövidítéseket alkalmaztuk:The following abbreviations were used:

FABMS = gyors atom bombázásos tömegspektrometriaFABMS = fast atom bombardment mass spectrometry

Thgly = tioglicerinThgly = thioglycerol

NBA = nitro-benzil-alkoholNBA = nitrobenzyl alcohol

Az 1 ,.5-anhidro-2,3-didezoxi-2-szubsztituált D-arabinohexitol nukleotidanalógok és azok 4,6-0-benzilidén-csoporttal védett származékainak előállítását Verheggen és munkatársai írták le [Verheggen et al., J. Med. Chem., 36, 2033-2030.The preparation of 1,5-anhydro-2,3-dideoxy-2-substituted D-arabinohexitol nucleotide analogs and their 4,6-O-benzylidene-protected derivatives has been described by Verheggen et al., J. Med. Chem., 36, 2033-2030.

(1993)].(1993)].

• · · • · • · · ·• · · • · · · · ·

1. példaExample 1

Bázis-védett nukleozidanalógokBase protected nucleoside analogs

1.1. 1,5-Anhidro-2- (N⁶-benzoil-adenin-9-il) -2,3-didezoxi-D-arabino-hexitol [(3b) képletű vegyület] ml piridinben oldott 2,3 g (6,51 mmól) 1,5-anhidro4,6-O-benzilidén-2-(adenin-9-il)-2,3-didezoxi-D-arabinohexitolhoz 0 °C-on 0,9 ml (7,8 mmól) benzoil-kloridot adunk. Miután az elegyet 4 órán át szobahőmérsékleten kevertük, az elegyet jégfürdőben lehűtjük, és .2 ml H₂O-t adunk hozzá.1.1. 1,5-Anhydro-2- (N ⁶ -benzoyl-adenin-9-yl) -2,3-dideoxy-D-arabino-hexitol (Compound 3b) dissolved in ml of pyridine 2.3 g (6.51) mmol) to 1,5-anhydro-4,6-O-benzylidene-2- (adenin-9-yl) -2,3-dideoxy-D-arabinohexitol at 0 ° C in 0.9 mL (7.8 mmol) benzoyl- chloride is added. After the mixture was stirred at room temperature for 4 hours, the mixture was cooled in an ice bath and .2 ml of H ₂ O was added.

1,5 ml koncentrált (33 tömeg/térfogat%) NH₃-oldat hozzáadását és 45 percig szobahőmérsékleten végzett további keverést követően az elegyet bepároljuk. A maradékot oszlopkromatográfiával tisztítjuk (CH₂Cl₂-MeOH, 98:2), így 1,92 g (4,19 mmól, 64 %) 1,5-anhidro-4, 6-O-benzilidén-2- (N⁶-benzoiladenin-9-il)-2,3-didezoxi-D-arabinohexitolt kapunk.After adding 1.5 ml of concentrated (33% w / v) NH ₃ solution and stirring for 45 minutes at room temperature, the mixture was evaporated. The residue was purified by column chromatography (CH ₂ Cl ₂ -MeOH 98: 2) to give 1.92 g (4.19 mmol, 64%) of 1,5-anhydro-4,6-O-benzylidene-2- (N ^6). benzoyladenin-9-yl) -2,3-dideoxy-D-arabinohexitol is obtained.

Ezt a benzilidéncsoportok eltávolítása céljából 100 ml 80 térfogat%-os ecetsavval kezeljük 60 °C-on, 5 órán át. Bepárlás, toluollal együtt végzett bepárlás és oszlopkromatográfiával végzett tisztítás után (CH₂Cl₂-MeOH, 95:5-90:10), 1,10 g (2,98 mmól, 71 %) a példa címében említett vegyületet kapjuk.This was treated with 100 ml of 80% acetic acid at 60 ° C for 5 hours to remove the benzylidene groups. Evaporation, evaporation with toluene and purification by column chromatography (CH ₂ Cl ₂ -MeOH 95: 5 to 90:10) afforded 1.10 g (2.98 mmol, 71%) of the title compound.

UV (MeOH) Xmax: 282 nm (ε=20200)UV (MeOH) λmax: 282 nm (ε = 20200)

FABMS (Thgly, NaOAc) m/e:392 (M+Na)⁺.240(B+2H) ⁺ ^-NMR (DMSO-ds) δ: l,94(m, 1H, Η-3'ax), 2,32 (m, 1H,FABMS (Thgly, NaOAc) m / e: 392 (M + Na) ^+. 240 (B + 2H) ⁺ 1 H-NMR (DMSO-d 6) δ: 1.94 (m, 1H, Η-3'ax), 2.32 (m, 1H,

H-3eq) , 3,21 (m, 1H, H-5'), 3, 42-3, 76 (m, 3H, H-4’, H-6', H-6), 3,9 (dd, ²J=13Hz, 1H, H-l'ax), 4,27 (dd, ²J=12, 2Hz, 1H, H-l'eq), 4,67 (t, J=5,7Hz, 1H, 6'=OH), 4,88-5, 00 (m, 2H, H-2', 4ΌΗ), 7,47-7,68 (m, 3H, aromás H) , 8,00-8,07 (m, 2H, • · aromás Η), 8,60 (s, 1H), 8,73 (s, 1H) (H-2, H-8) ppm.H-3eq), 3.21 (m, 1H, H-5 '), 3, 42-3, 76 (m, 3H, H-4', H-6 ', H-6), 3.9 ( dd, ² J = 13Hz, 1H, H-1'ax), 4.27 (dd, ² J = 12, 2Hz, 1H, H-1'eq), 4.67 (t, J = 5.7Hz, 1H, 6 '= OH), 4.88-5.00 (m, 2H, H-2', 4ΌΗ), 7.47-7.68 (m, 3H, aromatic H), 8.00-8, 07 (m, 2H, • aromatic Η), 8.60 (s, 1H), 8.73 (s, 1H) (H-2, H-8) ppm.

¹³C-NMR (DMSO-d₆) Ö: 35,8 (C-3'), 50,7 (c-2' ) , 60,5, ¹³ C-NMR (DMSO-d ₆ ) δ: 35.8 (C-3 '), 50.7 (c-2'), 60.5,

60,7 (C-4', C-6'), 67,9 (C-l') , 83,1 (C-5' ) 125,1 (C-5) ,60.7 (C-4 ', C-6'), 67.9 (C-1 '), 83.1 (C-5') 125.1 (C-5),

128,5 (Co, Cm), 132,5 (Cp) , 133,6 (Cx) , 143,5 (C-8) , 150,3 (C-4), 151,4 (C-2) 152,4 (C-6) ppm.128.5 (Co, Cm), 132.5 (Cp), 133.6 (Cx), 143.5 (C-8), 150.3 (C-4), 151.4 (C-2) 152 , 4 (C-6) ppm.

1.2. 1,5-Anhidro-2,3-didezoxi -2- (íf-izobutirilguanin-B-il-D-arabinohexitol [(3c) képletű vegyület]1.2. 1,5-Anhydro-2,3-dideoxy-2- (1H-isobutyrylguanine-B-yl-D-arabinohexitol [Compound 3c)

1,85 g (7,5 mmól) N²-izobutiril-O^e- [2-(p-nitro-fenil) -etil]-guanint 1,18 g (5 mmól) 1,5-anhidro-4,6-O-benzilidén-3-dezoxi-D-glucitollal alkilezünk, így 1,35 g nyers 1,5-anhidro-4, 6-O-benzilidén-2, 4-didezoxi-2- (N²-izobutiril-guanin-9-il)-D-arabinohexitolt kapunk, miután a p-nitro-fenil-etil-csoportok 1,5 ml (10 mmól) DBU-val, vízmentes piridinben, 16 órán át történő kezeléssel eltávolítjuk, majd gyors oszlopkromatográfiát (CH₂C1₂ - MeOH 99:1 - 97:3) végzünk. A benzilidéncsoportok hidrolízisét 100 ml 80 %-os HoAc-val (5 óra, 60 °C) végezzük, így oszlopkromatográfiát (CH₂Cl₂-MeOH, 90:10) követően a kívánt (3c) képletű vegyületet kapjuk (610 mg, 1,74 mmól, 34 %).1.85 g (7.5 mmol) of isobutyryl-N ² O ^e - [2- (p-nitrophenyl) ethyl] 1,5-anhydro-4,6 guanine (1.18 g, 5 mmol) Alkylation with -O-benzylidene-3-deoxy-D-glucitol gave 1.35 g of crude 1,5-anhydro-4,6-O-benzylidene-2,4-dideoxy-2- (N ² -isobutyrylguanine). 9-yl) -D-arabinohexitol is obtained after removal of the p-nitrophenylethyl groups by treatment with 1.5 ml (10 mmol) of DBU in anhydrous pyridine for 16 hours, followed by flash column chromatography (CH ₂ Cl _2). ₂ - MeOH 99: 1 - 97: 3). Hydrolysis of the benzylidene groups was carried out with 100 ml of 80% HoAc (5 hours, 60 ° C) to give the desired compound (3c) (610 mg, 1: 1) after column chromatography (CH ₂ Cl ₂ -MeOH, 90:10). , 74 mmol, 34%).

UV (MeOH) Xmax : 27 3 nmUV (MeOH) λmax: 27 3 nm

FABMS (Thgly, NaOAc) m/e: 352(M+Na) ⁺ ^XH-NMR 6: 1,11 (d, J=6,7 Hz, 6H, CH₃) , 1,93 (m, 1H, H3'ax), 2,11-2,38 (m, 1H, Η-3'eq), 2,80 (q, 1H, CHMe-2), 3,25 (m, 1H, H-5'), 3,42-3,78 (m, 3H, H-4', H-6', H-6), 3,89 (dd, ²J=13Hz, 1H, H-l'), 4,21 (dd, ²J=13Hz, 1H, H-l) , 4,69 ppm ¹³C-NMR δ: 19,4 (CH₃) , 34,5 (CHMe₂) , 35,8 (C-3' ) , 50,5 (C-2'), 60,5, 60,7 (C-4', C-6'), 67,9 (C-l'), 83,1 (C-5'),FABMS (Thgly, NaOAc) m / e: 352 (M + Na) ⁺ ^X H NMR 6 1.11 (d, J = 6.7 Hz, 6H, _CH3), 1.93 (m, 1H, H3'ax), 2.11-2.38 (m, 1H, Η-3'eq), 2.80 (q, 1H, CHMe-2), 3.25 (m, 1H, H-5 '). , 3.42-3.78 (m, 3H, H-4 ', H-6', H-6), 3.89 (dd, ² J = 13Hz, 1H, H-1 '), 4.21 (dd, ² J = 13 Hz, 1H, Hl), 4.69 ppm ¹³ C NMR δ: 19.4 _(CH3), 34.5 (CH Me _2), 35.8 (C-3 '), 50 , 5 (C-2 '), 60.5, 60.7 (C-4', C-6 '), 67.9 (C-1'), 83.1 (C-5 '),

116,7 (C-5), 141,7 (C-8), 152,0 (C-4), 153,0 (C-2), 159,8 (C-6), 175,2 (C=0) ppm.116.7 (C-5), 141.7 (C-8), 152.0 (C-4), 153.0 (C-2), 159.8 (C-6), 175.2 (C) = 0) ppm.

2. példaExample 2

A nukleozidanalógok dimetoxi tritilezéseDimethoxy tritylation of nucleoside analogues

2.1 1,5-Anhidro-6-0-dimetoxi-tritil-2-(timin-l-il)-2,3-didezoxi-D-arabinohexitol [(4a) képletű vegyület]2.1 1,5-Anhydro-6-O-dimethoxytrityl-2- (thimin-1-yl) -2,3-dideoxy-D-arabinohexitol (Compound 4a)

330 mg (1,29 mmól) 1,5-anhidro-2-(timin-2-il)-2,3-didezoxi-D-arabinohexitolt [ (3a) képletű vegyület] feloldunk 20 ml vízmentesített piridinben, majd hozzáadunk 480 mg (1,42 mmól) dimetoxi-tritil-kloridot. Az elegyet egy éjszakán át szobahőmérsékleten kevertetjük, 100 ml CH₂Cl₂-vel hígítjuk, és 100 ml telített NaHCCh oldattal kétszer mossuk. A szerves réteget szárítjuk, bepároljuk, majd toluollal együtt bepároljuk. A kapott maradékot oszlopkromatográfiával tisztítjuk (CHCl3-ban oldott, 1 % trietil-amint tartalmazó 0-3 % MeOH gradienssel); így 373 mg (0,67 mmól, 52 %) címben említett vegyületet kapunk hab formájában.A solution of 330 mg (1.29 mmol) of 1,5-anhydro-2- (thimin-2-yl) -2,3-dideoxy-D-arabinohexitol (Compound 3a) in 20 ml of anhydrous pyridine was added and 480 mg of (1.42 mmol) of dimethoxytrityl chloride. The mixture was stirred at room temperature overnight, diluted with 100 mL of CH ₂ Cl ₂ and washed twice with 100 mL of saturated NaHCO 3. The organic layer was dried, evaporated and co-evaporated with toluene. The resulting residue was purified by column chromatography (gradient 0-3% MeOH in CHCl3 containing 1% triethylamine); This gave 373 mg (0.67 mmol, 52%) of the title compound as a foam.

FABMS (Thgly, NaOAc) m/e: 581 (M+Na) ⁺ .127 (B+2H)⁺ ¹H-NMR (CDC1₃) δ: 1, 60-2, 50 (m, 2H, H-3', H-3), 1,91FABMS (Thgly, NaOAc) m / e: 581 (M + Na) ^+. 127 (B + 2H) ⁺ ¹ H-NMR (CDCl ₃ ) δ: 1, 60-2, 50 (m, 2H, H-3). ', H-3), 1.91

(s, 3H, (s, 3H, CH₃), 3,12-3,CH ₃ ), 3.12-3, 62 (m, 62 (m, 2H, H-5', H-4'), 2H, H-5 ', H-4'), 3, 3 77 (s, 77 (s, 6H, 6H, 2xOCH₃) ,2xOCH ₃ ), . 3,65-4,17 (m, . 3.65-4.17 (m, 4H, H- 4H, H- 6' , H-6, H-l', H· 6 ', H-6, H-l', H · -í: -I: I, 4,53 I, 4.53 (s, (S, 1H, H-2 1H, H-2 '), 4,88 (d, 1H '), 4.88 (d, 1H) , J=5,l , J = 5.1 Hz, 4'-OH), 6,81 Hz, 4'-OH), 6.81 (d, (D, J=8,7, J = 8.7, 4H, 4H, aromás aromatic H), 7,09-7,53 H), 7.09-7.53 (m, 9H, (m, 9H, aromás H) , 8,09 aromatic H), 8.09 (s, (S, 1H, H- 1H, H- 6) , 6),

9,10 (br s, 1H, NH) ppm.9.10 (br s, 1H, NH) ppm.

¹³C-NMR (CDCI3) ¹³ C-NMR (CDCl 3) δ: 12, δ: 12, 5 (CH₃)5 (CH ₃ ) , 35, 5 , 35, 5 (C-3'), (C-3 '), 50, 7 50, 7 (C-2') (C-2 ') 54,9 54.9 (OCH₃), 62,4,(OCH ₃ ), 62.4, 63, 1 63, 1 (C-4', (C-4 ', C-6' ) , C-6 '), 68,2 68.2 (C-l') (C-l ') , 81, , 81, (C-5') (C-5 ') , 86,0 (Ph₃C), 86.0 (Ph ₃ C) 110, 0 110.0 (C-5), (C-5); 138,4 138.4 (C-6) , (C-6), 151,0 151.0 (C-2) (C-2) 163, 8 163, 8 (C-4), 112,9, (C-4), 112.9, 126, 6, 126, 6, 127,5, 127.5, 127,8, 127.8, 129,7, 129.7, 135, 6, 135, 6, 144, 6 144, 6 158,3, 158.3, (aromás C) ppm. (aromatic C) ppm.

2.2 1,5-Anhidro-6-0-dimetoxi-tritil-2- (N⁶-benzoil-adenin-9-il)-2,3-didezoxi-D-arabinohexitol [(4b) képletű vegyület]2.2 1,5-Anhydro-6-O-dimethoxy-trityl-2- (N ⁶ -benzoyl-adenin-9-yl) -2,3-dideoxy-D-arabinohexitol (Compound 4b)

370 mg (1 mmól) (3b) képletű nukleozidot és 400 mg (1,2 mmól) dimetoxi-tritil-kloridot 16 órán át szobahőmérsékleten, 25 ml vízmentesített piridinben keverünk. Az elegyet 100 ml CH₂Cl2-vel hígítjuk, és 100 ml telített NaHCO₃oldattal kétszer mossuk. A szerves réteget szárítjuk, bepároljuk, majd toluollal együtt bepároljuk. A kapott maradékot oszlopkromatográfiával tisztítjuk (CH₂Cl₂-ben oldott, 0,2 térfogat% piridint tartalmazó 0-3 térfogat% MeOH gradienssel); így 400 mg (0,6 mmól, 63 %) (4b) képletű vegyületet kapunk hab formájában.Nucleoside 3b (370 mg, 1 mmol) and dimethoxytrityl chloride (400 mg, 1.2 mmol) were stirred in 25 mL of anhydrous pyridine at room temperature for 16 hours. The mixture was diluted with CH ₂ Cl ₂ (100 mL) and washed twice with saturated NaHCO ₃ (100 mL). The organic layer was dried, evaporated and co-evaporated with toluene. The resulting residue was purified by column chromatography (gradient 0 to 0% MeOH in CH ₂ Cl ₂ containing 0.2% pyridine); This gave 400 mg (0.6 mmol, 63%) of 4b as a foam.

FABMS (Thgly, NaOAc) m/c: 594 (m+Na) ⁺ .24O (B+2H) ⁺ FABMS (Thgly, NaOAc) m / c: 594 (m + Na) ^+. 24O (B + 2H) ⁺

2.3 1,5-Anhidro-6-0-dimetoxi -tri til-2- (if-izobutiril -guanin-9-il)-2,3-didezoxi-D-arabinohexitol [ (4c) képletű vegyület]2.3 1,5-Anhydro-6-O-dimethoxy-triethyl-2- (ifisobutyryl-guanin-9-yl) -2,3-dideoxy-D-arabinohexitol (Compound 4c)

580 mg (1,65 mmól) (3c) képletű nukleozidot és 670 mg (2,0 mmól) dimetoxi-tritil-kloridot 16 órán át szobahőmérsékleten 25 ml vízmentes piridinben keverünk. Az elegyet 100 ml CH₂Cl₂-vel hígítjuk, és 100 ml telített NaHCO₃ oldattal kétszer mossuk. A szerves réteget szárítjuk, bepároljuk, majd toluollal együtt bepároljuk. A kapott maradékot oszlopkromatográfiával tisztítjuk (CH₂Cl₂-ben oldott, 0,2 térfogat?, piridint tartalmazó 0-3 térfogat% MeOH gradienssel); így 770 mg (1,18 mmól, 71 %) (4c) képletű vegyületet kapunk hab forrnáj ában.Nucleoside 3c (580 mg, 1.65 mmol) and dimethoxytrityl chloride (670 mg, 2.0 mmol) were stirred in anhydrous pyridine (25 mL) at room temperature for 16 hours. The mixture was diluted with 100 mL of CH ₂ Cl ₂ and washed twice with 100 mL of saturated NaHCO ₃ solution. The organic layer was dried, evaporated and co-evaporated with toluene. The resulting residue was purified by column chromatography (gradient 0.2 to 0% MeOH in CH ₂ Cl ₂ containing 0.2% pyridine); This gave 770 mg (1.18 mmol, 71%) of 4c as a foam.

FABMS (NBA) m/e: 654 (M+H)⁺ FABMS (NBA) m / e: 654 (M + H) < ⁺ > ^.

2.4 Amidit építőegységek előállítása [ (5a-c) képletű vegyületek]2.4 Preparation of amidite building blocks [Compounds of formula (5a-c)]

0,5 mmól 6'-O-védett nukleozidok [(5a-c) képletű vegyületek], 3 ekvivalens vízmentes N, N-diizopropil-etil-amin és0.5 mmol of 6'-O-protected nucleosides [5a-c], 3 equivalents of anhydrous N, N-diisopropylethylamine and

1,5 ekvivalens 2-ciano-etil-N,N-diizopropil-klór-foszforamidit elegyét 2,5 ml vízmentes CH₂Cl₂-ben szobahőmérsékleten 3 órán át keverjük. 0,5 ml EtOH hozzáadását és 25 percig tartó további keverést követően az elegyet 5 tömeg/térfogat%os NaHC0₃-oldattal és telített NaClcoldattal mossuk (15 ml), szárítjuk és bepároljuk. Et₃N-nel végzett gyors oszlopkromatográfiával fehér hab formájában amiditet kapunk, amelyet kis mennyiségű vízmentes CH₂Cl₂-ben oldunk, és cseppenként 100 ml hideg (-50 °C) n-hexánhoz adunk. A csapadékot elválasztjuk, n-hexánnal mossuk, szárítjuk, és DNS-szintézisre használjuk fel.A mixture of 1.5 equivalents of 2-cyanoethyl N, N-diisopropyl chlorophosphoramidite in 2.5 ml of anhydrous CH ₂ Cl ₂ was stirred at room temperature for 3 hours. After adding 0.5 ml of EtOH and stirring for 25 minutes, the mixture was washed with 5% w / v NaHCO ₃ and saturated NaCl (15 ml), dried and evaporated. Flash column chromatography with Et ₃ N afforded the amide as a white foam, which was dissolved in a small amount of anhydrous CH ₂ Cl ₂ and added dropwise to 100 ml of cold (-50 ° C) n-hexane. The precipitate was collected, washed with n-hexane, dried and used for DNA synthesis.

Az alábbi táblázatban megadjuk a különböző amiditek esetében alkalmazott eluáló oldószert, és a kicsapást követően kapott hozamot:The following table shows the eluent solvent used for the various amidites and the yield after precipitation:

Vegyület Compound Oldószer Solvent Oldószer arány Solvent ratio Hatásfok efficiency FABMS (NBA) m/e FABMS (NBA) m / e 5a 5a n-Hexán/etil- -acetát/tri- -etil-amin n-hexane / ethyl acetate / tri- ethylamine 23:75:2 23: 75: 2 62 % 62% 759 (M+H) ⁺ 759 (M + H) ⁺ 5b 5b n-Hexán/etil- -acetát/tri- -etil-amin n-hexane / ethyl acetate / tri- ethylamine 50:48:2 50: 48: 2 65 % 65% 872 (M+H) ⁺ 872 (M + H) ⁺ 5c 5c n-Hexán/etil- -acetát/tri- -etil-amin n-hexane / ethyl acetate / tri- ethylamine 55:43:2 55: 43: 2 56 % 56% 854 (M+H)⁺ 854 (M + H) ⁺

• · • · · · · « • · · · • · · · · · • · · « · · • · · · · ·· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·

3. példaExample 3

A 6-Q-védett nukleozidanalógok szukcinezéseSuccination of 6-Q-protected nucleoside analogs

3.1 1,5-Anhidro-6-0-dimetil-tritil-4-0-szukcinil-2- (timin-l-il)-2,3-didezoxi-D-arabinohexitol [(6a) képletű vegyület] mg (0,14 mmól) (4a) képletű vegyület, 9 mg (0,07 mmól) DMAP és 43 mg (0,14 mmól) borostyánkősav-anhidrid elegyét 5 ml vízmentes piridinben 24 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Mivel a reakció nem, megy teljesen végbe, az elegyhez további 43 mg (0,43 mmól) mennyiséget adunk, és további 24 óráig keverjük. Az oldatot bepároljuk, majd toluollal együtt bepároljuk. A maradékot CH₂Cl₂-ben oldjuk, a szerves réteget telített NaCl-oldattal és vízzel mossuk, szárítjuk és bepároljuk; így 78 mg (0,12 mmól, 86 %) (6a) képletű vegyületet kapunk fehér hab formájában.3.1 1,5-Anhydro-6-O-dimethyl-trityl-4-O-succinyl-2- (thimin-1-yl) -2,3-dideoxy-D-arabinohexitol (Compound 6a) mg (0 A mixture of 4a (14 mmol), DMAP (9 mg, 0.07 mmol) and succinic anhydride (43 mg, 0.14 mmol) in anhydrous pyridine (5 mL) was stirred at room temperature for 24 hours. Since the reaction was not complete, an additional amount of 43 mg (0.43 mmol) was added and stirred for an additional 24 hours. The solution was concentrated and co-evaporated with toluene. The residue was dissolved in CH ₂ Cl ₂ , the organic layer was washed with saturated NaCl solution and water, dried and evaporated; This gave 78 mg (0.12 mmol, 86%) of 6a as a white foam.

3.2 1,5-Anhidro-6-0-dimetoxi-tritil-4-O-szukcinil-2- (if-benzoil-adenin-d-il) -2,3-didezoxi -D-arabinohexitol [ (6b) képletű vegyület]3.2 1,5-Anhydro-6-O-dimethoxy-trityl-4-O-succinyl-2- (1H-benzoyl-adenin-d-yl) -2,3-dideoxy-D-arabinohexitol (Compound 6b) ]

A (6a) képletű vegyület esetében ismertetettel megegyező eljárást alkalmazzuk a (6b) képletű vegyület szintézisére. 260 mg (0,39 mmól) (4b) képletű vegyületből 256 mg (0,33 mmól, 85 %) címben szereplő vegyületet kapunk hab formájában.The same procedure as described for compound 6a is used to synthesize compound 6b. 260 mg (0.39 mmol) of 4b gives 256 mg (0.33 mmol, 85%) of the title compound as a foam.

4. példaExample 4

Oligonukleotidok előállításaPreparation of oligonucleotides

4.1 Szilárd hordozó előállítása pg (6a, b) képletű szukcinát, 400 mg előzetesen4.1 Preparation of a solid support pg of 6a, b succinate, 400 mg in advance

aktivált LCAA-CPG [Pon et al., Biotechniques, 6, Ί68-ΊΊ5.activated LCAA-CPG [Pon et al., Biotechniques, 6, Ί68-ΊΊ5.

(1988)], 5 mg (40 mmól) DMAP, 35 μΐ EtaN és 153 mg (800 pmól) 1-(3-dimetil-amino-propil)-3-etil-karbodiimid-hidroklorid elegyét 4 ml vízmentes piridinben először 5 percig ultrahanggal kezeljük, majd szobahőmérsékleten 16 órán át rázatjuk. A rázatást követően a CPG szilárd hordozót kiszűrjük, majd egymást követően piridinnel, metanollal, és CH₂Ü2-vel mossuk, végül vákuumban szárítjuk. A hordozó felületének nem reagált helyeit 1,5 ml, THF-ben oldott 1-metil-imidazollal (Applied Biosystems) és 1,5 ml ecet-anhidrid-lutidin-THF-fel (1:1:8) (Applied Biosystems) fedjük. Négy órán át szobahőmérsékleten végzett rázatást követően a szilárd hordozót kiszűrjük, CH₂Cl2-vel mossuk, végül vákuumban szárítjuk. Kolorimetriás dimetoxi-tritil-analízis szerint 18,5 pmól/g (7a) képletű vegyületet és 21,5 pmól/g (7b) képletű vegyületet kapunk.(1988)], a mixture of 5 mg (40 mmol) of DMAP, 35 μΐ of EtaN and 153 mg (800 pmol) of 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride in 4 ml of anhydrous pyridine for the first 5 minutes. sonicate and shake at room temperature for 16 hours. After shaking, the CPG solid support was filtered off, washed successively with pyridine, methanol, and CH ₂ O ₂ and finally dried in vacuo. Unreacted sites on the support surface were covered with 1.5 mL of 1-methylimidazole in THF (Applied Biosystems) and 1.5 mL of acetic anhydride-lutidine-THF (1: 1: 8) (Applied Biosystems). . After shaking for four hours at room temperature, the solid support was filtered, washed with CH ₂ Cl ₂ and finally dried in vacuo. Colorimetric dimethoxytrityl analysis gives 18.5 pmol / g of compound 7a and 21.5 pmol / g of compound 7b.

4.2 DNS-szintézis4.2 DNA synthesis

Az oligonukleotid-szintézist egy ABI 381A típusú DNS-szintetizáló készülékkel végezzük (Applied Biosystems), a foszforamidit eljárás alkalmazásával (a végen található dimetoxi-tritil-csoport lehasításával). A kapott szekvenciáról a védőcsoportokat eltávolítjuk, és a szilárd hordozóról koncentrált ammóniával történő kezeléssel lehasítjuk (55 °C-on, 16 óra). NAP-10® oszlopon (Sephadex G25-DNA-grade,Oligonucleotide synthesis was performed on an ABI 381A type DNA synthesizer (Applied Biosystems) using the phosphoramidite method (cleaving the end-dimethoxytrityl group). The resulting sequence is deprotected and cleaved from the solid support by treatment with concentrated ammonia (55 ° C, 16 hours). On a NAP-10® column (Sephadex G25-DNA grade,

Pharmacia) történő tisztítást követően A-pufferrel eluáljuk (lásd az alábbiakban), majd a tisztítást mono-Q® HR 10/10 anioncserélő oszlopon végezzük (Pharmacia) a következő gradiens rendszerrel [A=10 mmól/1 NaOH, (pH=12), 0,1 mól/1 NaCl;After purification with Pharmacia), elute with buffer A (see below) and purify on a mono-Q® HR 10/10 anion exchange column (Pharmacia) with the following gradient system [A = 10 mM NaOH, pH 12]. 0.1 M NaCl;

• · · · · • · ·• · · · · · ·

B=10 mmól/1 NaOH (pH=12), 0,9 mól/1 NaCl; az oligonukleotidtól függő gradienst alkalmazunk; 2 ml/perc átfolyási sebesség]. A kisnyomású folyadékkromatográfiás rendszerhez Merck-Hitachi L6200-A Intelligent Pump készüléket, Mono-Q® HR 10/10 oszlopot (Pharmacia), Uvicord SJI 2138 UV-detektort (Pharmacia-LKB) és rögzítő készüléket alkalmazunk. A terméket tartalmazó frakciót NAP-10® oszlopon sómentesitjük és liofilizáljuk.B = 10 mM NaOH (pH 12), 0.9 M NaCl; using an oligonucleotide dependent gradient; 2 ml / min flow rate]. The low pressure liquid chromatography system uses a Merck-Hitachi L6200-A Intelligent Pump, Mono-Q® HR 10/10 column (Pharmacia), a Uvicord SJI 2138 UV detector (Pharmacia-LKB) and a recording device. The product-containing fraction was desalted on a NAP-10® column and lyophilized.

5. példaExample 5

Denaturációs hőmérséklet (melting temperature)Melting temperature

Az oligomereket a következő összetételű pufferben oldjuk: 0,1 mól/1 NaCl, 0,02 mól/1 kálium-foszfát (pH=7,5),The oligomers were dissolved in buffer containing 0.1 M NaCl, 0.02 M potassium phosphate pH 7.5,

0,1 mmól/1 EDTA. A koncentrációt a fényelnyelés 260 nm-en, 80 °C-on történő mérésével határozzuk meg, feltételezve, hogy az 1,5-anhidrohexitol nukleozidanalógok denaturált állapotban a természetes nukleozidokéval azonos extinkciós koefficienssel rendelkeznek.0.1 mM EDTA. The concentration is determined by measuring the absorbance at 260 nm at 80 ° C, assuming that the 1,5-anhydrohexitol nucleoside analogues, when denatured, have the same extinction coefficient as the natural nucleosides.

Adenin monomerek esetében ε=15000For adenine monomers, ε = 15000

Timin monomerek esetében ε=8500For thymine monomers, ε = 8500

Guanin monomerek esetében ε=12500For guanine monomers, ε = 12500

Citozin monomerek esetében ε=7500For cytosine monomers, ε = 7500

A koncentráció valamennyi kísérletben az egyes szálak esetében körülbelül 4 pmól/l. A denaturációs görbét Uvikon940 spektrofotométerrel határozzuk meg. A küvettákat a küvettatartón keresztül áramló vízzel tartjuk megfelelő hőmérsékleten, és az oldat hőmérsékletét közvetlenül a küvettába merített termisztor alkalmazásával mérjük. A hőmérséklet szabályozását és az adatok gyűjtését automatikusan végezzük, • · · · · egy IBM/Pc AT-kompatibilis komputer segítségével. A mintákat 0,2 °C/perc sebességgel felmelegítjük, majd lehűtjük; a melegítéssel és hűtéssel kapott denaturációs görbék között nem figyelhető meg különbség. A denaturációs görbéket úgy kapjuk, hogy a fényelnyelés első deriváltját ábrázoljuk a hőmérséklet függvényében. A szintetizált oligonukleotidokat és azok denaturációs görbéit szemléltető példákat az 1-4. táblázatokban foglaltuk össze.The concentration in each experiment is about 4 pmol / l for each fiber. The denaturation curve was determined with a Uvikon940 spectrophotometer. The cuvettes are maintained at a suitable temperature with water flowing through the cuvette holder and the temperature of the solution is measured directly using a thermistor immersed in the cuvette. Temperature control and data collection is performed automatically using an IBM / Pc AT-compatible computer. The samples were heated at 0.2 ° C / min and then cooled; there is no difference between the denaturation curves obtained by heating and cooling. The denaturation curves are obtained by plotting the first derivative of light absorption as a function of temperature. Examples illustrating the synthesized oligonucleotides and their denaturation curves are shown in Figures 1-4. are summarized in tables.

1. táblázatTable 1

Egy Ai₃/T₁₃-duplex közepébe beépült egyetlen anhidrohexitol nukleozidot (A*, T*) tartalmazó oligonukleotidok denaturációs hőmérsékletei (0,1 mól/1 NaCl koncentráció mellett meghatározva)Denaturation temperatures (determined at 0.1 M NaCl) of oligonucleotides containing a single anhydrohexitol nucleoside (A *, T *) inserted into the center of an Al ₃ / T ₁₃ duplex

d(T)₆Xd(T)₆ d (T) ₆ Xd (T) ₆ d(A)₆Yd(A)₆ d (A) ₆ Yd (A) ₆ Y/X Y / X G G C C A THE T T A THE 20, 0 20.0 17, 9 17, 9 18,5 18.5 34, 0 34, 0 A* THE* 20,2 20.2 17,1 17.1 17,7 17.7 32, 1 32, 1 X/Y X / Y G G C C T T A THE T T 21,0 21.0 20, 7 20, 7 21,3 21.3 34, 0 34, 0 15, 1 15, 1 15,2 15.2 18,3 18.3 28,7 28.7

Az 1. táblázat alapján nyilvánvaló, hogy az 1,5-anhidro-2-(adenin-9-il)-2,3-didezoxi-D-arabinohexitol beépülése egy oligodezoxi-adenilátba közel azonos hélix-spirál átmenetet eredményez, mint a természetes 2'-dezoxiadenozin.It is evident from Table 1 that incorporation of 1,5-anhydro-2- (adenin-9-yl) -2,3-dideoxy-D-arabinohexitol into an oligodeoxyadenylate results in nearly the same helix transition as natural 2'-deoxyadenosine.

Megemlítendő azonban, hogy egy oligodezoxi-adenilát/oligotimidin duplexben egyetlen nem kompatibilis bázis jelenléte jelentős hatást fejt ki a duplex stabilitására. Ezzel szemben, a timidin helyettesítése 1,5-anhidro-2, 3-didezoxi-2-(timin-l-il)-D-arabinohexitollal egy oligotimidilátban lényegesen csökkenti a denaturációs hőmérsékletet. Laboratóriumunkban 2,4-didezoxi-p-D-eritro-hexapiranozil nukeozidokkal végzett korábbi megfigyelésekkel szemben, ahol egy A*.G [A*:9-2,4-didezoxi-p-D-eritrohexo-piranozil)-adenin] téves bázispárosítás sokkal stabilabb hibridizációhoz vezetett, mint egy egy A*.T [A*:9-2,4-didezoxi-p-D-eritrohexopiranozil)-adenin] bázispárosítás [Augustyns et al., Nucleic Acid Rés., 21, 4570-4676. (1993)], oligodezoxiadenilát/oligotimidin duplex modell alkalmazásával az 1,5-anhidrohexitol nukleozidok esetében nem volt megfigyelhető eltérés a bázispárosítás specifitásában.It should be noted, however, that the presence of a single incompatible base in an oligodeoxyadenylate / oligotimidine duplex has a significant effect on the stability of the duplex. In contrast, the substitution of thymidine with 1,5-anhydro-2,3-dideoxy-2- (thymin-1-yl) -D-arabinohexitol in an oligotimidylate significantly reduces the denaturation temperature. In our laboratory, contrary to previous observations with 2,4-dideoxy-pD-erythro-hexapyranosyl nucleosides, where an A * .G [A *: 9-2,4-dideoxy-pD-erythrohexopyranosyl) -adenine] misapplication for more stable hybridization led as an A * .T [A *: 9-2,4-dideoxy-pD-erythrohexopyranosyl) adenine] base pairing (Augustyns et al., Nucleic Acid Res., 21, 4570-4676). (1993)], using the oligodeoxyadenylate / oligotimidine duplex model, no difference in base-pairing specificity was observed for 1,5-anhydrohexitol nucleosides.

··* • · · · · · · • »«· · · · • · ·««· · · _{Λ Λ} «·«·«« · * · ··* ·· • · · · · · · • »« • · · · · · · «« · · · _{Λ Λ} «·" · «« · · * ··

2. táblázatTable 2

Teljes mértékben módosított oligonukleotidok és mindkét végén módosított oligonukleotidok denaturációs hőmérséklete,Denaturation temperature of fully modified oligonucleotides and modified at both ends,

0,1 mól/1 NaCl mellett meghatározvaAs 0.1 M NaCl

Tm(°C) Tm (° C) Hipokrommicitás Hipokrommicitás (dA) i3 (14)-gyei alkotott ekvimoláris elegy (dA) an equimolar mixture of 13 (14) (dT)₆T*(dT)₆(8)(dT) ₆ T * (dT) ₆ (8) 27,8 27.8 33% 33% (T*)2(dT)9(T*)₂(9)(T *) 2 (dT) 9 (T *) ₂ (9) 27/6 27/6 32% 32% (T*)₁₃(10)(T *) ₁₃ (10) 45,4(1) 45.4 (1) 49% 49% (dT) i3 (15)-tel alkotott ekvimoláris elegy is an equimolar mixture of (dT) 13 (15) (dA)_6A* (dA)₆(4)(dA) _6A * (dA) ₆ (4) 31, 8 31, 8 31% 31% (A*) ₂ (dA) 9 (A*) ₂ (12)(A *) ₂ (dA) 9 (A *) ₂ (12) 30, 3 30, 3 33% 33% (A*)i₃(13)(A *) i ₃ (13) 21,0 21.0 49% 49% (T*)i₃: (A*) i₃ (10:13)(T *) i ₃ : (A *) i ₃ (10:13) 76,3 76.3 ND ND (dT)i₃: (dA) 13(15:14)(dT) i ₃ : (dA) 13 (15:14) 34,0 34.0 35% 35%

(1) 284 nm-en meghatározva.(1) determined at 284 nm.

Mind az egyszálú oligoA*, mind az egyszálú oligoT* rendezett struktúrával rendelkezik, de - magas sókoncentrációkkal szemben (az adatokat nem tüntettük fel) - a poliT* nem mutatja ugyanazt a hajlamot homoduplex képződésre. Ezt mutatja mind az oligoA*, mind az oligoT* esetében az UVfényelnyelés hőmérséklettel arányos többé kevésbé lineáris emelkedése. Az oligoT* és oligodezoxiadenilát ekvimoláris elegyének denaturációs hőmérséklete 45 °C, 49 %-os hipokromicitással 284 nm-en mérve. Ismert, hogy a sókoncentráció • (.·«·· V ·· »· · · ··** • ·<»* » · 4 ··· • * ···» · · «·«·«· · *· ·· változtatásával a DNS struktúrélis átalakulása következik be, és itt nyilvánvalóan ez az eset áll fenn. Az oligoT*:oligodezoxiadenilát összekapcsolódásnak az alacsonyabb sókoncentráció kedvez, míg magas sókoncentráció mellett az oligoT* homoduplexek képződése számára előnyösek a feltételek. A komplex hőmérsékletfüggő viselkedése 260 nm-en azonban arra utal, hogy az oligoT*:oligodezoxiadenilát összekapcsolódás nem klasszikus hélix-spirál átmenet. 260 nm-en a hipokromicitás először csökken, 46 °C-on (a 484 nm-en megfigyelhető denaturációs hőmérsékleten) ér el minimumot, majd növekszik'. Az adenin (A*) és guanin (G*) nukleozidanalógokat tartalmazó, teljes mértékben módosított kevert szekvenciákat (két hexamer és egy dodekamer) hasonlóképp vizsgáltuk.Both single-stranded oligoA * and single-stranded oligoT * have an ordered structure but, contrary to high salt concentrations (data not shown), polyT * does not show the same tendency for homoduplex formation. This is illustrated by the more or less linear increase in UV absorption relative to temperature for both oligoA * and oligoT *. The denaturation temperature of the equimolar mixture of oligoT * and oligodeoxyadenylate was 45 ° C, with 49% hypochromicity at 284 nm. It is known that the salt concentration • (. · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · By altering · ··, structural alteration of DNA occurs, and this is clearly the case: oligoT *: oligodeoxyadenylate coupling is favored by lower salt concentrations, while high salt concentrations favor oligoT * homoduplex formation. However, at 260 nm, it indicates that oligoT *: oligodeoxyadenylate coupling is a non-classical helix-helix transition: at 260 nm, the hypochromicity first decreases, reaching a minimum at 46 ° C (at 484 nm) and Fully modified mixed sequences (two hexamers and one dodecamer) containing the adenine (A *) and guanine (G *) nucleoside analogues were similarly tested.

3. táblázatTable 3

Teljes mértékben módosított hexamerek denaturációs hőmérsékleteDenaturation temperature of fully modified hexamers

Szekvencia (ekvimoláris elegyek a komplementer szekvenciával) Sequence (equimolar mixtures with complementary sequence) Tm (°C) Tm (° C) (16) (16) 6' -A*G*G*A*G*A* 6 '-A * G * G * A * G * A * 31,2 31.2 (17) (17) 5'-AGGAGA 5'-AGGAGA 10, 0 10.0 (18) (18) 6'-G*A*G*A*G*A* 6'-A * G * G * A * G * A * 14,7 14.7 (19) (19) 5'-GAGAGA 5'-GAGAGA 9,5 9.5

mól/1 NaCl, 20 mmól/1 KH₂PO₄ pH=7,5, EDTA 0,1 mmól/1 mellett meghatározvamole / l NaCl, 20 mM KH ₂ PO ₄ pH 7.5, EDTA 0.1 mM

Duplex-képződés jött létre a következő komplementer szekvenciákkal:Duplex formation was made with the following complementary sequences:

5'-TCTCCT(20) a 16.- és 17.-szekvencia esetében, és5'-TCTCCT (20) for sequences 16 and 17, and

5'-TCTCTC (21) a 18.- és 19.-szekvencia esetében.5'-TCTCTC (21) for 18 and 19.

Bár a fenti szekvenciák néhányánál a denaturációs hőmérsékletet meg lehetett határozni hexamerek esetében, a fenti oligonukleotidok denaturációs hőmérsékletét 1 mól/1 NaCl mellett (továbbá 20 mmól/1 KH₂PO₄ pH=7,5, EDTA 0,1 mmól/1 mellett) vizsgáltuk. A leglényegesebb jelenség, hogy nyilvánvalóan duplexek jöttek létre a piranózszerű oligonukleotidok és azok természetes párjai között. Ezenfelül, a módosított duplexek sokkal stabilabbak, mint a csupán Watson-Crick bázispárokat tartalmazó kontroll duplexek.Although the denaturation temperature of some of the above sequences could be determined for hexamers, the denaturation temperature of the above oligonucleotides was 1 M NaCl (plus 20 mM KH ₂ PO ₄ pH 7.5, EDTA 0.1 mM). We examined. The most important phenomenon is that obviously duplexes are formed between the pyranose-like oligonucleotides and their natural counterparts. In addition, modified duplexes are much more stable than control duplexes containing only Watson-Crick base pairs.

Szembetűnő azonban a jelentős eltérés a 16. (Tm=31,2 °C) és a 17. (Tm=14,7 °C) szekvenciák antiparalell komplementer oligonukleotidokkal szembeni denaturációs hőmérsékletében. Amennyiben mindkét módosított oligonukleotid 3 G*-t és 3 A*-t tartalmaz, amelyek csak a szekvencia sorrendjében térnek el, a 16. szekvencia denaturációs hőmérséklete duplája a 18. szekvenciáénak. Ez a szekvenciafüggő hatás csak kis mértékben jelentkezik a 17. és a 19. kontroll oligonukleotidok esetében.However, there is a marked difference in the denaturation temperature of the 16 (Tm = 31.2 ° C) and 17 (Tm = 14.7 ° C) sequences against the antiparallel complementary oligonucleotides. When both modified oligonucleotides contain 3 G * and 3 A *, which differ only in sequence order, the denaturation temperature of SEQ ID NO: 16 is twice that of SEQ ID NO: 18. This sequence-dependent effect is only slightly present in control oligonucleotides 17 and 19.

4. táblázatTable 4

A*- és G*-nukleotidokat tartalmazó, teljes mértékben módosított dekamerek denaturációs hőmérsékleteDenaturation temperature of fully modified decamers containing * and G * nucleotides

Szekvencia (ekvimoláris elegyek a komplementer szekvenciával) Sequence (equimolar mixtures with complementary sequence) Tm a 24. szekvenciával szemben (°C) Tm versus SEQ ID NO: 24 (° C) (22) (22) 6' -A*G*G*G*A*G*G*A*G*A 6 '-A * G * G * G * A * G * G * A * G * A 64, 8 64, 8 (23) (23) 5'-AGG GAG AGG AGA 5'-AGG GAG AGG AGA 49, 0 49, 0

mól/1 NaCl mellett meghatározva (24) 5'-TCT CCT CTC CCTmol / l NaCl (24) 5'-TCT CCT CTC CCT

A dodekamereket tekintve ismét észrevehető, hogy a teljes mértékben módosított oligonukleotid a 23. kontroll szekvenciához képest fokozott stabilitással rendelkezik, azaz, amennyiben mindkét szekvenciát az antiparalell 24. szekvenciával szemben vizsgáljuk, az előbbi esetben 16 °c-os denaturációs hőmérséklet emelkedést észlelünk.Again, with respect to dodecamers, it is noticeable that the fully modified oligonucleotide exhibits enhanced stability over control sequence 23, i.e., when both sequences are tested against the antiparallel sequence 24, an increase in denaturation temperature of 16 ° C is observed.

Claims

PATENT CLAIMS

Oligomers consisting wholly or partially of 1,5-anhydrohexitol analogs of a nucleoside analogue of formula (I) wherein B is a heterocyclic ring derived from a pyrimidine or a purine base.

The oligomers of formula (II) and salts thereof according to claim 1, wherein

B is a heterocyclic ring derived from a pyrimidine or purine base;

k, 1 and m are from 0 to 15, an integer provided that k and m are at least one, but if k> l then m may be 0 and if m> l then k may be 0;

X is oxygen or sulfur.

The oligomers of claim 1 or 2, wherein the heterocyclic ring comprises cytosine, 5-methylcytosine, uracil or thymine or a deaza derivative thereof.

The oligomers of claim 1 or 2, wherein the heterocyclic ring comprises adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, hypoxanthine or xanthine or a deaza derivative thereof.

5. The oligomers of any one of claims 1 to 4, wherein the compound of formula (I) has the (D) configuration and the substituents are in the arabinino configuration.

6. For use in oligomeric antisense techniques according to any one of claims 1 to 3.

7. Oligomers for use according to claim 6, characterized in that they are used in the following antisense techniques: diagnosis, hybridization, nucleic acid isolation, site-specific DNA modification and therapy.

8. A process for preparing oligomers of formula II comprising coupling an appropriate amount of a monomer of formula I.

Use of phosphoramidites of formula VIII wherein B * is a protected base for the preparation of oligomers according to claim 1.