【発明の詳細な説明】
診断造影用の細胞蛋白質及び血清蛋白質アンカー
技術分野
本発明の分野は、哺乳動物の血管空間の非侵襲的診断造影法（イメージング）
に関する。
技術的背景
血流における異常を検出したり、心臓機能を測定したり、循環系の解剖学的構
造を視覚化するなどの目的で、哺乳動物の血管空間を非侵襲的に造影することは
しばしば望ましいことである。例えば、血流に影響を与える血管系のある疾患の
場合又は血管系へのある障害の場合、異常な出血若しくは血栓症の存在を検出し
又は視覚化したいと望む場合がある。また、心臓効率又は心室排出量におけるあ
る血管傷害の影響を測定することを望む場合がある。更に、哺乳動物の血管系の
解剖学的構造の非侵襲的診断造影法によって、血管系に関連する発達する異常又
は種々の病変、例えば、ガンの早期検出を行うことができるかもしれない。
哺乳動物の血管系を非侵襲的に造影する現在の方法には、陽電子射出断層撮影
（ＰＥＴ）や、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、単一光子放射型コンピュータ
断層撮影法(ＳＰＥＣＴ) 、磁気共鳴画像法(ＭＲＩ) 、核磁気画像法(ＮＭＩ)
、エックス線透視法（フルオロスコピー）、超音波法等がある。しかしながら、
これらの技術は種々の異なる用途に対して非常に有用ではあるが、特に単一又は
限られた数の、特定の細胞型又は哺乳動物の血管空間に関連した解剖学的構造だ
けを優先的に造影したり、長期にわたって血管空間を造影したい場合には、しば
しば、これらの技術の所望の有用性は、遥かに少ない。
従って、特定の細胞型又は哺乳動物の血管空間の区画(compartment) を優先的
に造影し、また、長期にわたって哺乳動物の血管空間を診断的に造影する能力を
高めるための新規な方法を提供することには、重要な興味がある。
発明の要約
循環する血液細胞膜上に存在する蛋白質、又は、哺乳動物の血管系の血漿中の
蛋白質と共有結合できる２官能試薬を使用することによって、解剖学上の区画を
非侵襲的に造影するための方法及び組成物が提供される。これらの方法によって
、長期にわたる、哺乳動物の血管区画をモニターすることができる。本発明の試
薬組成物は、活性化できる官能基を有する２官能アンカー（固着）分子であり、
この官能基は、活性化されると、哺乳動物の血管系に存在する標的蛋白質上の反
応性官能性(functionality) と共有結合を形成し、もって、その標的蛋白質に対
してその分子を「アンカー（固着）」する。本発明の２官能アンカー分子は、ま
た、直接又は間接的に、哺乳動物の区画を診断的かつ非侵襲的に造影する能力を
提供する、興味のある診断薬に結合(conjugate) する。
本発明の用途には、ＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ造影や、血流、異常出
血、血栓症及び血管炎症の検出、血管(vessel)造影、心臓効率測定及び／又は循
環系の解剖学的構造の視覚化がある。
具体的な実施の態様の説明
解剖学的区画、特に、血管区画の非侵襲的造影及び診断のための方法及び組成
物が提供される。この方法には、興味のある診断薬を哺乳動物の血管系に存在す
る蛋白質に共有結合させることが含まれ、この診断薬は、血管系に存在する長寿
(long-lived)蛋白質に結合して、長期にわたる哺乳動物の区画空間を診断的に造
影できるようにし、及び／又は診断薬は、血管系に存在する特定の蛋白質又は限
定された数の蛋白質と優先的に結合して、特定の区画だけを診断的に造影できる
能力を高める。共有結合は、哺乳動物の宿主に、１ないし２の化合物を投与する
ことによって形成され、その化合物の少なくとも第一の化合物は、血管蛋白質上
の反応性官能性と共有結合を形成することができる活性化された官能基を有する
２官能アンカー分子を含み、この第一の化合物は、興味のある診断薬か、特異的
結合相手の第一の結合メンバーの何れかと結合する。
哺乳動物宿主の血管系に第一の化合物を投与することによって、活性化された
官能基は、血管系中に存在する蛋白質上の反応性官能性と共有結合し、もって、
一群の官能性化された血管蛋白質を形成する。もし第一の化合物が、特異的結合
相手の第一の結合メンバーと連結された２官能アンカー分子を含有する場合には
、興味のある診断薬に結合した相対的な第二の結合メンバーを含有する第二の化
合物を、官能性化された血管蛋白質の生存期間にわたって、随時、血管系に投与
する。投与後、第二の結合メンバーは、第一の結合メンバーと結合して、所定の
診断薬は官能性化された血管蛋白質に固着される。第一の結合メンバーは、また
、結合化合物と診断薬との複合体であってもよい。次いで、宿主の血管系に存在
する診断薬を造影することができる。
２官能アンカー分子は、哺乳動物の血管系に長寿蛋白質上の反応性官能性、診
断薬又は特異的結合相手の第一の結合メンバーと共有結合できる活性な官能基と
、上記部位と結合するリンカーとを有する。長寿血管蛋白質のインビボ半減期は
、少なくとも約12時間、好ましくは、少なくとも約48時間、更に好ましくは、少
なくとも約５日を有する。そのようなものとして、２官能アンカー分子がかかる
蛋白質に結合すると、少なくとも、約６時間、好ましくは、少なくとも約24時間
、更に好ましくは、約３日の長期にわたって血管空間を造影することができる。
哺乳動物の脈管構造に存在する長寿蛋白質の例としては、例えば、血清アルブミ
ンや、フェリチン、免疫グロブリン、α1−ミクログロブリン、α2−マクログロ
ブリン、α、β又はγ−グロブリン、チロキシン結合蛋白質、ステロイド結合蛋
白質が挙げられる。具体的な蛋白質標的には、細胞の一部として、赤血球の表面
膜蛋白質、特に、グリコホリンＡ及びＣ、Ｔ又はＢ細胞表面蛋白質、例えば、Ｃ
Ｄ３や、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ28、ＣＤ34、Ｂ７、ｐ28、ＣＴＬＡ−４
、Ｔｈｙ１、ＬＦＡ１、ｓｌｇＥ、ｓｌｇＭ、IIb/IIIA等、白血球表面膜蛋白質
、IL-2受容体、インテグリン、血清アルブミン、免疫グロブリン、特に、IgG及
び IgM、アポリポ蛋白質、例えば、ＬＤＬ、ＨＤＬ及びＶＬＤＬ、内皮細胞表面
蛋白質、例えば、インテグリン、接着蛋白質等が挙げられる。
二官能性アンカー分子と共有結合を形成する血管蛋白質にある反応性官能基は
、第１級アミノ基、カルボキシル基及びチオール基である。これらのうちどれを
、二官能性アンカー分子の反応性官能基の標的として用いてもよいが、大体は、
特
にアミド結合の形成を伴うときは、アミノ基への結合を用いる。
アミド結合を形成するために、水酸基が所望の水準で物理的に受容できる場合
、広い範囲の活性カルボキシル基を二官能性アンカー分子の反応性官能基として
用いることができる。多くの異なる水酸基を用いることもできるけれども、血管
の環境で官能性の他のアルコールも使用できるが、最も便利なものは、N-ヒドロ
キシスクシンイミド及びN-ヒドロキシスルホスクシンイミドである。若干のケー
スにおいて、反応がインビボ又はインビトロであるか否か、標的、アンカーの特
異性などに依存して、ジアゾ、アジド、無水カルボジイミド、ヒドラジン又はチ
オール基などの特定の試薬を用いることが認められる。
該アンカーの２成分を結合（鎖中の酸素原子）は、従来から用いられているリ
ンカーにより結合させることができ、採用される投与量で物理的に許容でき、か
つ二官能性アンカー分子の要求を満たす。この要求とは血管系で安定であること
、関心の対象である診断薬、又は第一結合成分を有効に提供し、化学的な操作を
簡単にするなどである。該リンカーは、脂肪族、脂肪族環式、芳香族又は複素環
式、又はこれらの組み合せであり、その選択は主に便利なものの一つである。該
リンカーは、窒素、酸素、硫黄、燐を含むヘテロ原子により置換されていてもよ
い。使用することができる基は、アルキレン、アリレン、アラルキレン、シクロ
アルキレンなどである。
一般に、該鎖が炭素と先に示したヘテロ原子である場合、１〜30、通常１〜10
、さらに普通には１〜６のリンカーが該鎖にある。通常、側鎖から利益を受ける
ことはないので、ほとんどの場合、該リンカーは直鎖又は環状である。該リンカ
ーの長さは、特に関心の対象である診断薬又は第一結合成分の性質によって変化
する。その理由は、若干のケースでは、関心の対象である診断薬、又は第一結合
成分が、鎖又は官能基を伴うことができるからである。該リンカーの長さにより
、可撓性、剛性、多官能性、方向性を付与することができ、また、二官能性アン
カー分子に改善された機能をもたらす他の特性を付与することができる。また、
該リンカーは、脈官構造に存在する他の蛋白質エピトープ又は配列と比較して、
脈官構造に存在する所定の蛋白質エピトープ又は配列と優先的な結合を与える。
適当な活性化可能な又は活性化された官能基を有する、多くの、小さな合成二
官能性有機化合物を、活性化官能基を、関心が持たれている診断薬、又は特異的
結合対の第一結合成分に対し結合させるために入手することができる。具体的な
化合物には次のものがある：
アジドベンゾイルヒドラジン、N-[4-(p-アジドサリシルアミノ）ブチル]-3'-[2'
-ピリジルジチオ）プロピオンアミド、ビススルホスクシンイミジルスベレート
、ジメチルアジピミダート、ジスクシニミジルタートレート、N-Y-マレイミドブ
チリルオキシスクシンイミドエステル、N-ヒドロキシスルホスクシンイミジル-4
-アジドベンゾエイト、N-スクシンイミジル[4-アジドフィニル］-1,3'-ジチオプ
ロピオネート、N-スクシンイミジル[4-イオドアセチル］アミノベンゾエート、
グルタルアルデヒド、スクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン
-1-カルボキシレート。
活性官能基と、関心が持たれている診断薬、又は第一結合成分とを結合させる
リンカーは、天然のオリゴマーであってもよく、哺乳動物の血管構造にある他の
蛋白質と比べ、哺乳動物の血管構造にある特定の蛋白質に対し高度の非共有性親
和性を有するものである。このようなオリゴマーアンカー分子は、関心の持たれ
ている診断薬を、血管構造中の特定の標的、細胞及び／又は蛋白質に向けること
を可能にし、これにより特定の解剖学上の区画における診断に用いるシグナルを
優先的に増強することが可能になる。
使用できると見なされるオリゴマーアンカー分子は、血管系に存在する特定の
蛋白質の反応性官能基と優先的に結合する能力を有するのが好ましい。この優先
的な結合の意味は、該アンカー分子が、血管環境に存在する他の蛋白質と結合し
ないと同様に、関心が持たれている血管蛋白質に対する優先的結合を示すことを
いう。特定された蛋白質標的と結合する優先性は通常、少なくとも約1.5、好ま
しくは少なくとも約２倍であり、オリゴマーの存在しないランダム結合と比べ５
倍以上になり得る。
二官能性アンカー分子のオリゴマーリンカーとしてオリゴペプチド、オリゴヌ
クレオチド、これらの組み合せなどがある。オリゴマーリンカーにおける単量体
ユニットの数は４〜12、さらに通常は４〜８、好ましくは５〜８であるのが一般
的である。該単量体ユニットは天然又は合成のものであってよく、炭素原子数約
２〜30個、通常約２〜18個、好ましくは約２〜12個とするのが一般的である。
該リンカーがオリゴペプチドである場合、そのアミノ酸単量体は天然又は合成
でもよい。D-鏡像異性体も使用することはできるが、L-α-アミノ酸を使用する
のが便利である。
用いるアミノ酸は反応性官能基、特に、該オリゴマーリンカーと結合した、活
性化官能基又は興味を持たれている診断薬と反応するような反応性官能基がない
のが好ましい。したがって、用いるアミノ酸には、通常、反応性アミノ、グアニ
ジノ及びカルボキシル基がなく、しばしば水酸基及びチオール基がない。特に関
心が持たれているものに、炭化水素側鎖を有する天然のアミノ酸、アラニン(A),
グリシン(G) 、プロリン(P) 、バリン(V) 、フェニルアラニン(F) 、イソロイ
シン(I) 、又はメチオニン(M) のような非荷電極性アミノ酸がある。
また、オリゴマーペプチドリンカーのアミノ酸単量体は合成したものであって
よい。したがって、炭素原子数４〜30個、通常、４〜20個である何らかの非天然
又は置換アミノ酸を用いてもよい。特に関心が持たれているものに、合成アミノ
酸、β−アラニン及びY-アミノブチレート、又はO-メチル置換スレオニン(T) 、
セリン(S) 、チロシン(Y) などがある。
使用できると認められたアミノ酸は、末端炭素原子以外の部位にカルボキシル
基を有してもよく、α位以外の部位にアミノ基を有してもよく、またオキシ、チ
オ、カルボキシル、アミノ又はグアニジノ以外の基によって置換されていてもよ
い。
また、合成アミノ酸は窒素で一置換されていてもよい。使用できると認められ
るN-置換アミノ酸は、炭素原子数約１〜８個、通常、１〜６個のN-置換であり、
脂肪族、脂肪族環式、芳香族又は複素環式(ヘテロ原子は約３個よりも多くない
。)であってよく、かつ第３級又は第４級のいずれかでよく、アミノ、オキシ、
チオなどを有していてもよい。
通常、オリゴペプチドリンカーを、自動ペプチド合成装置、標準保護化学物質
（例えば、t-boc 又はf-moc 化学物質）及び樹脂（例えば、4-メチルベンズヒド
リルアミン）を使用し、標準マリフィールド(Marrifield)固相合成技術を用いて
構成する。しかし、また液相オリゴペプチド合成法のような他の合成技術を用い
ることもできる。
もし、オリゴマーリンカーがオリゴヌクレオチドであれば、天然に存在するか
、又は合成ヌクレオチド単量体が用いられる。特に、合成ヌクレオチドの場合、
ホスフェート又は糖基を修飾（変性）できる。この場合、ホスフェートは、酸素
原子をイオウ又は窒素で置換することによって置換され、ホスフェート基は、ス
ルフォネート、アミド等と置換され、リボース又はデオキシリボースは、５〜６
炭素原子の糖、例えば、アラビノース、フルクトース、グルコース等と置換され
、プリン及びピリミジンは、窒素上の置換により、アルキル又はアシルと置換さ
れ、異なる環状構造が用いられ、酸素によって窒素が置換されるか又はその逆が
起こる。
いったん合成されると、オリゴマーリンカー上の利用できる官能基は、反応が
起こるような環境で、血管蛋白質上に存在する反応性官能基に共有結合すること
ができるように活性化される。活性化した官能基は、オリゴマーリンカー上の任
意の(i) に存在し得るが、通常は、一方又は他方の末端に隣接している。便宜的
には、オリゴマーのメンバーはアスパラギン酸又はグルタミン酸残基等の上に、
活性化した官能基を有することができる。
オリゴマーリンカー上のカルボキシル基の活性化のために、多種多様の無水又
はエステル脱離基が用いられ、ここで脱離基はカルボニルと結合した酸素又はイ
オウを有することができる。例えば、in vivo においてオリゴマーアンカー分子
を用いることに興味がある場合には、生理学的に許容できる脱離基を選択するこ
とができる。
カルボキシル基を活性化するために用いられる化合物は、カルボジイミド、フ
ェノール、チオフェノール、ベンジルアルコール、Ｎ−ヒドロキシイミド等を含
む。
もし、オリゴマーリンカーが固体支持体上で合成されると、オリゴマー上の官
能基は活性化され、次いで、活性化されたオリゴマーは固体支持体から遊離され
る。また、オリゴマーが固体支持体から遊離し、それによって活性化のための利
用できる基を提供し、次いで官能基が活性化される。
２官能アンカー分子はオリゴマー又は非オリゴマーリンカーを含んでいるかい
ないかにせよ、直接的又は間接的に、哺乳動物の血管空間を診断的に造影する能
力を与える興味のある診断薬と結合する。好ましくは、診断薬は、２官能アンカ
ー分子の官能基が活性化した際に、２官能アンカー分子の活性化官能基と反応し
ないか、影響を受けないものである。従って、有用な診断薬は、反応性カルボキ
シル基及びアミノ基と通常は、反応しない。
診断薬は、２官能アンカー分子のリンカーに直接に結合することができる。こ
の場合、それは、特異的結合対の第二の結合メンバーに直接的又は間接的に、任
意の適切な部位で結合する。化学結合による直接結合もある。しかし、診断薬が
第二の結合メンバーに間接的に結合しているなら、それは結合又は適当な結合基
を通して結合してもよい。用いられる診断薬の性質に依存して、第二の結合メン
バー及び診断薬との間の結合基は、オキシ、アミノ、オキソ、カルボキシレート
等の鎖中又は側鎖基としての異種原子を有する相対的に長い親水性基を有するこ
とにより、第二の結合メンバーからの診断薬の溶液中で置換される。結合基は、
アミノ酸又は２〜６アミノ酸からなるオリゴペプチド、１〜１０単位からなるポ
リオキシアルキレン、糖等であることができ、ここで、アルキレンは２〜３炭素
原子からなる。用いられる特定の結合基は、通常、診断薬の性質及びその機能に
依存するだろう。
用途を見出す診断薬は、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＣＴ、ＭＲＩ、ＮＭＩ、エック
ス線透視法、血管撮影法等の公知の診断画像技術のプローブとして一般に供給さ
れるものを含む。興味のある診断薬は、造影剤、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ等を含む
ヨウ素(I) 、バリウム(Ba)、ガドリニウム(Gd)、99Tcを含むテクネチウム(Tc)、31
Pを含むリン(P) 、鉄(Fe)、マンガン(Mn)、タリウム(Ti)、51Crを含むクロム(
Cr)、11C を含む炭素(C) 等の分子のラジオアイソトープ、蛍光ラベルされた化
合物等を含む。
一般に、２官能アンカー分子に直接結合する興味のある診断薬を有することが
十分であり、それによって、興味のある診断薬に結合している第二の結合メンバ
ーを含む第二の化合物を投与する必要性を排除するだろう。しかし、特定の状態
において、興味のある診断薬が２官能アンカー分子（これは血管蛋白質又は蛋白
質に共有結合で結合している）に間接的に結合すること、即ち、特異的結合対の
第一の結合メンバーとその相対的な第二の結合メンバーとの間の関連を通じて結
合することが好ましい。このような状態は、２官能アンカーのin vivo における
血管蛋白質への共有結合に有用であり、次いで、血管系から明らかな少量（例え
ば、in vivo において連続的に高濃度に維持されたとき有毒である診断薬の使用
）の第二の結合メンバー／診断薬複合物が定期的に投与されることを含む。
興味のある診断薬が２官能アンカー分子に間接的に結合したとき、２官能アン
カー分子に結合している第一の結合メンバーは一般に小さい分子であり、この分
子はどのような免疫応答も最小にするらしい。従って、大体において、第一の結
合メンバーは抗体結合性であり、通常１ｋＤ未満であり、一般に約１００Ｄを越
え、好ましくは６００Ｄ未満である。好都合な相対的な第二の結合メンバーのあ
る、どのような生理学的に許容される分子も用いられる。従って、特に興味のあ
るものはビオチンであり、アビジン又はストレプトアビジンが相対的な第二の結
合メンバーであり、金属キレート、天然のエピトープ、受容体又は抗体結合部位
を模倣した分子等の他の分子も用いられ、ここでは相対的な第二の結合メンバー
は抗体又はその断片、特にＦａｂフラグメント、酵素、天然に存在する受容体等
であるかもしれない。従って、第一の結合メンバーは天然に存在する受容体のた
めのリガンド、酵素の基質、又は相対的な受容体とのハプテンであるかもしれな
い。
第一の結合メンバーは、もし少しであっても宿主血管系中に天然に低濃度で見
いだされ、もし、相対的な第二の結合メンバーに結合するための血管系中で第一
の結合メンバー及び天然に存在する化合物との間のどのような競争も小さい。第
二の結合メンバーは、宿主の血管系内で遭遇する化合物に結合すべきでないもの
である。
特異的結合対のレシプロカル（相反）第二結合メンバーは、使用する第一結合
メンバーの性質により決定される。既に述べたように、第二結合メンバーは多数
の形状をとることができ、特に免疫グロブリンまたはそのフラグメントのような
結合蛋白質、Ｆａｂ、Ｆｖなど、一価のフラグメント、表面膜蛋白質のような自
然発生レセプター、酵素、アビジンまたはストレプトアビジンなどの他の結合蛋
白質、などが挙げられる。一般に、レシプロカル第一結合メンバーに対する第二
結合メンバーの親和性（例えば、モノクローナル抗体の、特定の結合物に対する
結合において通常観察される結合親和性）は、少なくとも約１０-8であり、より
一般的には約１０-8より大きい。特に興味深いのは、アビジンおよびストレプト
アビジンであるが、特に興味深い他のレセプターとしては、ステロイド、ＬＨ、
ＴＳＨ、ＦＳＨに対するレセプターまたはそのアゴニスト、およびシアル酸およ
びウィルス性血球凝集素、並びにスーパー抗原が挙げられる。第二結合メンバー
は通常、巨大分子であり、一般に少なくとも約５ｋＤであり、より一般的には少
なくとも約１０ｋＤであり、かつ通常は約１６０ｋＤより小さく、好ましくは約
８０ｋＤより小さい。結合部位において一価または二価でもよく、通常一価であ
る。
二官能アンカー分子との反応標的として選択された、血管性蛋白質は、目的の
指示薬（indication）に依存する。このように、選択された血管性標的に依存し
て、診断薬は長期に渡り存在する（long-lived）蛋白質に結合することができ、
脈管構造全体に実質的に分散する。このケースにおいて、選択された指示薬は、
長期に渡る血管系の診断造影または血管系の特定部位への優先的局在化であり、
または特定の解剖学的区画の優先的診断造影であり、長期に渡る画像を伴ってい
ても伴っていなくもよい。標的は固定化されていてもよく、または可動性であっ
てもよい。すなわち、内皮細胞の場合には、実質的に正しい位置に固定化されて
おり、また血管系では可動性である。すなわち、長期（一般に５分を超えず、よ
り通常には１分を超えない）においては固定化位置を有さない。標的細胞および
蛋白質は、血管系内において実質的に均一であっても、様々な分布を有していて
もよく、その標的は、血管系または他の解剖学的区画と比較して、優先的に局在
化しても、特定の区画に濃縮されていてもよい。
用いる診断薬および標的化された血管性蛋白質は、長期に渡り解剖学的区画を
診断造影するかどうか、特定の細胞型または区画のみか、またはその両方を優先
的に造影したいかどうかに依存する。長期に渡る血管空間の診断造影のための、
長期に存在する血管性蛋白質への目的の診断薬への共有結合への適用は多数あり
、全哺乳動物血管系内の血流における異常を検出する能力の増強、異常な出血を
起こす内部傷害の検出、または血栓症の存在の検出が挙げられる。例えば、特定
の
治療の効果を、治療の間検出するために、長期に渡る血管空間の造影を行っても
よい。即ち、塞栓症の消失、内部出血の停止、などの検出である。
長期に渡る血管系の診断造影はまた、血管系に伴う様々な疾病、即ち、心臓内
の動脈妨害物のような疾病の検出を可能にする。このように、長期に渡る血管系
の診断造影を、心臓への一貫して減少する血流の非侵襲的検出に用いてもよい。
そのような方法はまた、長期（即ち、長時間の手術時間など）に渡り、心臓効率
および心室出力量を計量する方法を提供する。
この方法の他の応用は、哺乳動物血管系の解剖学的構造および様々な薬剤（例
えば、血管拡張剤、血管収縮剤など）の投与期間におけるこれらの解剖学的構造
への効果を非侵襲的に視覚化できるという可能性から生じる。このような方法は
、進行性の血管性異常、障害などを早期に検出せしめるであろう。
長期に渡る血管空間の診断的造影能から生じる、このような方法のさらなる適
用としては、単一測定のために核医学においてルーチン的に使用されている心血
管系の機能評価がある。
第一の化合物および、必要な場合には第二の化合物も、通常ボーラス（瞬時大
量投与）により投与されるが、調節流などを使用して注入することにより、時間
をかけてゆっくり導入してもよい。または、あまり好ましくはないが、血液をホ
ストから除去して、体外で処理を行い、ホストに戻してもよい。第一および第二
の化合物は生理学的に許容される媒体中で投与してもよい。例えば脱イオン化し
た水、リン酸バッファー生理食塩水、生理食塩水、マンニトール、水性グルコー
ス、アルコール、植物性油などが挙げられる。通常、単回投与を用いるが、必要
な場合には一回以上の投与を用いてもよい。第一および第二の化合物は、注射器
、カテーテルなどの、どのような適当な方法により投与されてもよい。特定の投
与方法は、単回ボーラス、逐次服用、または連続投与など、投与量によって変化
する。投与は血管内に行われる。導入部位は、本発明においては重要ではないが
、迅速な血流のある部位、例えば、静脈、末梢神経または中枢静脈が好ましい。
これは投与された化合物が、標的蛋白質と反応するように血管系内に効果的に分
散することを意図している。
化合物の投与量は、目的の診断薬を含有しているかどうかに依存し、そのため
、
もし存在する場合には目的の診断薬の副作用、血管系内に存在する非結合薬剤の
濃度を減少させるために必要な時間、首尾よい診断造影のために必要な投与量、
検知される指示薬、血管性成分による分解に対する診断薬の感受性、投与ルート
などに依存している。必要により、診断薬の投与量は経験的に決定されてもよい
。通常投与される投与量に対して、少量の複投与量から始めて、より大量の経験
が得られるに従い、投与量を増加させてもよい。投与量は一般に、１ng/kg〜１
０mg/kgの範囲内であり、通常、前臨床および臨床試験のために提供されるよう
な、既知の方法により経験的に決定される。
本明細書に記載された全ての刊行物および特許出願は、本発明が関係する当業
分野における当業者の技術レベルを示すものである。全ての刊行物および特許出
願は、それぞれ個々に詳細にこの明細書内に記載されているように、その内容が
含まれるものとする。
本発明を次に詳細に述べるが、添付した請求の範囲の精神または観点から離れ
ることなく、様々な変更および改良を行うことができることは当業者にとって明
らかである。FIELD OF THE INVENTION The field of the invention relates to non-invasive diagnostic imaging of mammalian vascular space. TECHNICAL BACKGROUND Non-invasive imaging of mammalian vascular space is often used to detect abnormalities in blood flow, measure cardiac function, or visualize the anatomy of the circulatory system. That is desirable. For example, in the case of certain diseases of the vasculature affecting blood flow or certain disorders of the vasculature, it may be desirable to detect or visualize the presence of abnormal bleeding or thrombosis. It may also be desirable to measure the effect of certain vascular injuries on cardiac efficiency or ventricular output. In addition, non-invasive diagnostic imaging of the anatomy of the mammalian vasculature may allow early detection of developing abnormalities or various lesions associated with the vasculature, such as cancer. Current methods of noninvasive imaging of mammalian vasculature include positron emission tomography (PET), computed tomography (CT), single photon emission computed tomography (SPECT), magnetic resonance imaging Method (MRI), nuclear magnetic imaging (NMI), X-ray fluoroscopy (fluoroscopy), ultrasonic method and the like. However, while these techniques are very useful for a variety of different applications, they particularly favor only a single or limited number of specific cell types or anatomy associated with the mammalian vascular space. Often the desired utility of these techniques is much less when it is desired to image the blood vessel or to image the vessel space over time. Thus, there is provided a novel method for preferentially imaging a particular cell type or compartment of a mammalian vascular space and for enhancing the ability to diagnostically image a mammalian vascular space over time. There is an important interest in that. SUMMARY OF THE INVENTION Non-invasive imaging of anatomical compartments by using bifunctional reagents that can covalently bind proteins present on circulating blood cell membranes or in plasma of mammalian vasculature Methods and compositions are provided. These methods allow long term monitoring of mammalian vascular compartments. The reagent composition of the present invention is a bifunctional anchor (anchoring) molecule having a functional group that can be activated, which, when activated, reacts on a target protein present in the mammalian vasculature. It forms a covalent bond with the functionality, thus "anchoring" the molecule to its target protein. The bifunctional anchor molecules of the present invention also conjugate, directly or indirectly, to diagnostic agents of interest that provide the ability to diagnostically and non-invasively image mammalian compartments. Applications for the present invention include MRI, CT, PET, SPECT imaging, detection of blood flow, abnormal bleeding, thrombosis and vascular inflammation, vessel imaging, cardiac efficiency measurement and / or anatomy of the circulatory system. There is a visualization. DESCRIPTION OF SPECIFIC EMBODIMENTS Methods and compositions are provided for non-invasive imaging and diagnosis of anatomical compartments, particularly vascular compartments. The method involves covalently linking a diagnostic agent of interest to a protein present in the mammalian vasculature, which binds to long-lived proteins present in the vascular system. Enable diagnostic imaging of long-term mammalian compartment spaces, and / or diagnostic agents preferentially bind to specific proteins or a limited number of proteins present in the vasculature to provide specific compartmentalization. Enhance your ability to diagnostically image only. A covalent bond is formed by administering one or two compounds to a mammalian host, at least a first of which is capable of forming a covalent bond with a reactive functionality on a vascular protein. A bifunctional anchor molecule having an activated functional group, wherein the first compound binds to either a diagnostic agent of interest or a first binding member of a specific binding partner. By administering a first compound to the vasculature of a mammalian host, the activated functional groups are covalently linked to reactive functionalities on proteins present in the vasculature, thereby providing a group of functionalizations. Formed vascular proteins. If the first compound contains a bifunctional anchor molecule linked to a first binding member of a specific binding partner, it contains a relative second binding member linked to the diagnostic agent of interest. A second compound is administered to the vasculature at any time throughout the life of the functionalized vascular protein. After administration, the second binding member binds to the first binding member and the predetermined diagnostic agent is anchored to the functionalized vascular protein. The first binding member may also be a complex of the binding compound and the diagnostic. The diagnostic agent present in the host vasculature can then be imaged. The bifunctional anchor molecule is a reactive functional group on a long-lived protein, an active functional group capable of covalently binding to a diagnostic agent or a first binding member of a specific binding partner, and a linker binding to the above site in a mammalian vasculature. And The in vivo half-life of the longevity vascular protein has at least about 12 hours, preferably at least about 48 hours, more preferably at least about 5 days. As such, when a bifunctional anchor molecule binds to such a protein, it can image the vascular space for as long as at least about 6 hours, preferably at least about 24 hours, and more preferably about 3 days. Examples of long-lived proteins present in the vasculature of mammals include, for example, serum albumin, ferritin, immunoglobulin, α 1 -Microglobulin, α Two Macroglobulins, α, β or γ-globulins, thyroxine binding proteins, steroid binding proteins. Specific protein targets include, as part of the cell, erythrocyte surface membrane proteins, particularly glycophorin A and C, T or B cell surface proteins such as CD3, CD4, CD5, CD8, CD28, CD34, B7, p28, CTLA-4, Thy1, LFA1, slgE, slgM, IIb / IIIA, etc., leukocyte surface membrane protein, IL-2 receptor, integrin, serum albumin, immunoglobulin, especially IgG and IgM, apolipoprotein, for example , LDL, HDL and VLDL, endothelial cell surface proteins such as integrins, adhesion proteins and the like. Reactive functional groups on vascular proteins that form covalent bonds with bifunctional anchor molecules are primary amino groups, carboxyl groups, and thiol groups. Any of these may be used as a target for the reactive functional group of the bifunctional anchor molecule, but mostly uses a bond to an amino group, especially when it involves the formation of an amide bond. A wide range of active carboxyl groups can be used as the reactive functional group of the bifunctional anchor molecule if the hydroxyl groups are physically acceptable at the desired level to form an amide bond. The most convenient are N-hydroxysuccinimide and N-hydroxysulfosuccinimide, although many different hydroxyl groups can be used, but other alcohols that are functional in the vascular environment can also be used. In some cases, depending on whether the reaction is in vivo or in vitro, the specificity of the target, anchor, etc., it will be appreciated to use certain reagents such as diazo, azide, anhydrous carbodiimide, hydrazine or thiol groups. . The linking of the two components of the anchor (oxygen atom in the chain) can be linked by conventional linkers, and is physically acceptable at the dosages employed, and requires a bifunctional anchor molecule. Meet. The requirements include stability in the vasculature, effective provision of the diagnostic agent of interest, or the first binding component, and simplification of the chemical manipulation. The linker is aliphatic, aliphatic cyclic, aromatic or heterocyclic, or a combination thereof, the choice of which is mainly one of convenience. The linker may be substituted by a heteroatom including nitrogen, oxygen, sulfur, phosphorus. Groups that can be used are alkylene, arylene, aralkylene, cycloalkylene and the like. Generally, where the chain is carbon and the heteroatoms indicated above, there will be from 1 to 30, usually 1 to 10, and more usually 1 to 6 linkers on the chain. In most cases, the linker will be linear or cyclic since no benefit is usually gained from the side chains. The length of the linker will vary depending on the nature of the diagnostic agent or first binding component of particular interest. The reason for this is that in some cases, the diagnostic agent of interest, or the first binding moiety, can be associated with a chain or a functional group. The length of the linker can provide flexibility, stiffness, multifunctionality, orientation, and other properties that provide improved functionality to the bifunctional anchor molecule. The linker also provides preferential binding to a given protein epitope or sequence present in the vasculature as compared to other protein epitopes or sequences present in the vasculature. Many small, synthetic bifunctional organic compounds having suitable activatable or activated functional groups can be substituted for the activating functional group, the diagnostic agent of interest, or the second member of a specific binding pair. It can be obtained for binding to one binding component. Specific compounds include: azidobenzoylhydrazine, N- [4- (p-azidosalysylamino) butyl] -3 '-[2'-pyridyldithio) propionamide, bissulfosuccinimi Jilssuberate, dimethyl adipimidate, disuccinimidyl tartrate, NY-maleimidobutyryloxysuccinimide ester, N-hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidobenzoate, N-succinimidyl [4-azidofinyl]- 1,3'-dithiopropionate, N-succinimidyl [4-iodoacetyl] aminobenzoate, glutaraldehyde, succinimidyl 4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate. The linker linking the active functional group to the diagnostic agent of interest or the first binding moiety may be a natural oligomer, and may be a mammalian oligomer compared to other proteins in the mammalian vasculature. It has a high non-covalent affinity for a specific protein in the vasculature. Such oligomeric anchoring molecules allow the diagnostic agent of interest to be directed to specific targets, cells and / or proteins in the vasculature, thereby providing diagnostics in specific anatomical compartments. The signal used can be preferentially enhanced. Oligomeric anchor molecules that are deemed useable preferably have the ability to bind preferentially to reactive functional groups of certain proteins present in the vasculature. The meaning of this preferential binding means that the anchor molecule exhibits preferential binding to the vascular protein of interest, as well as not to other proteins present in the vascular environment. The preference for binding the identified protein target is usually at least about 1.5, preferably at least about 2-fold, and may be 5-fold or more relative to random binding without oligomers. Oligopeptides of the bifunctional anchor molecule include oligopeptides, oligonucleotides, and combinations thereof. The number of monomer units in the oligomer linker is generally from 4 to 12, more usually from 4 to 8, and preferably from 5 to 8. The monomer unit may be natural or synthetic, and generally has about 2 to 30, usually about 2 to 18, preferably about 2 to 12 carbon atoms. When the linker is an oligopeptide, the amino acid monomer may be natural or synthetic. Although the D-enantiomer can be used, it is convenient to use L-α-amino acids. Preferably, the amino acids used are free of reactive functional groups, in particular activating functional groups attached to the oligomer linker or reactive functional groups that react with the diagnostic agent of interest. Thus, the amino acids used are usually free of reactive amino, guanidino and carboxyl groups, and often free of hydroxyl and thiol groups. Of particular interest are natural amino acids with hydrocarbon side chains, alanine (A), glycine (G), proline (P), valine (V), phenylalanine (F), isoleucine (I), Or uncharged polar amino acids such as methionine (M). Further, the amino acid monomer of the oligomer peptide linker may be synthesized. Thus, any unnatural or substituted amino acid having 4 to 30, usually 4 to 20, carbon atoms may be used. Of particular interest are synthetic amino acids, β-alanine and Y-aminobutyrate, or O-methyl substituted threonine (T), serine (S), tyrosine (Y), and the like. Amino acids recognized as usable may have a carboxyl group at a site other than the terminal carbon atom, may have an amino group at a site other than the α-position, and may be oxy, thio, carboxyl, amino or guanidino. May be substituted by a group other than The synthetic amino acids may be monosubstituted with nitrogen. N-substituted amino acids recognized as usable can be N-substituted, having from about 1 to 8 carbon atoms, usually from 1 to 6 carbon atoms, aliphatic, aliphatic, aromatic or heterocyclic (heteroatoms). Is not more than about 3.) and may be either tertiary or quaternary and may have amino, oxy, thio, and the like. Typically, oligopeptide linkers are used with an automated peptide synthesizer, standard protected chemicals (eg, t-boc or f-moc chemicals) and resins (eg, 4-methylbenzhydrylamine), and standard Marifield ) Construct using solid phase synthesis technology. However, other synthetic techniques can also be used, such as liquid phase oligopeptide synthesis. If the oligomer linker is an oligonucleotide, a naturally occurring or synthetic nucleotide monomer is used. In particular, in the case of synthetic nucleotides, the phosphate or sugar group can be modified (denatured). In this case, the phosphate is replaced by replacing the oxygen atom with sulfur or nitrogen, the phosphate group is replaced with a sulfonate, an amide, etc., and ribose or deoxyribose is a sugar of 5-6 carbon atoms, such as arabinose, Substituted with fructose, glucose, etc., purines and pyrimidines are substituted with alkyl or acyl by substitution on the nitrogen, different ring structures are used, and the nitrogen is substituted by oxygen or vice versa. Once synthesized, the available functional groups on the oligomer linker are activated such that they can be covalently linked to reactive functional groups present on the vascular protein in an environment in which the reaction takes place. The activated functional group can be present at any (i) on the oligomer linker, but is usually adjacent to one or the other end. Conveniently, the oligomer members may have activated functional groups, such as on aspartic or glutamic acid residues. A wide variety of anhydride or ester leaving groups are used for activation of the carboxyl group on the oligomer linker, where the leaving group can have oxygen or sulfur attached to the carbonyl. For example, if one is interested in using an oligomer anchor molecule in vivo, one can select a physiologically acceptable leaving group. Compounds used to activate the carboxyl group include carbodiimide, phenol, thiophenol, benzyl alcohol, N-hydroxyimide, and the like. If the oligomer linker is synthesized on a solid support, the functional groups on the oligomer are activated, and the activated oligomer is then released from the solid support. Also, the oligomers are released from the solid support, thereby providing available groups for activation, and the functional groups are then activated. The bifunctional anchor molecule, whether or not containing an oligomer or non-oligomer linker, directly or indirectly associates with a diagnostic agent of interest that confers the ability to diagnostically image the vascular space of a mammal. Preferably, the diagnostic agent does not react with or be unaffected by the activated functional group of the bifunctional anchor molecule when the functional group of the bifunctional anchor molecule is activated. Thus, useful diagnostic agents do not usually react with reactive carboxyl and amino groups. The diagnostic agent can be attached directly to the linker of the bifunctional anchor molecule. In this case, it binds directly or indirectly to the second binding member of the specific binding pair at any suitable site. There are also direct bonds by chemical bonds. However, if the diagnostic agent is indirectly linked to the second binding member, it may be linked through a bond or a suitable linking group. Depending on the nature of the diagnostic agent used, the linking group between the second binding member and the diagnostic agent may be a relative group having a heteroatom in the chain such as oxy, amino, oxo, carboxylate or as a side chain group. By having a relatively long hydrophilic group, it is displaced in the solution of the diagnostic agent from the second binding member. The linking group can be an amino acid or an oligopeptide consisting of 2 to 6 amino acids, a polyoxyalkylene consisting of 1 to 10 units, a sugar, etc., wherein the alkylene consists of 2 to 3 carbon atoms. The particular linking group used will usually depend on the nature of the diagnostic agent and its function. Diagnostic agents that find use include those commonly provided as probes for known diagnostic imaging techniques such as PET, SPECT, CT, MRI, NMI, X-ray fluoroscopy, angiography, and the like. Diagnostics of interest include contrast agents, one two Three I, 125 I, 131 Iodine (I), barium (Ba), gadolinium (Gd), 99 Technetium (Tc), including Tc 31 Phosphorus containing P (P), iron (Fe), manganese (Mn), thallium (Ti), 51 Chromium containing Cr (Cr), 11 Includes radioisotopes of molecules such as carbon (C) containing C, fluorescently labeled compounds, and the like. In general, it is sufficient to have a diagnostic agent of interest that binds directly to a bifunctional anchor molecule, thereby administering a second compound that includes a second binding member that binds to the diagnostic agent of interest. Will eliminate the need. However, in certain situations, the diagnostic agent of interest binds indirectly to a bifunctional anchor molecule, which is covalently linked to a vascular protein or protein, ie, the first of a specific binding pair. Preferably, the binding is through an association between the binding member of the and its relative second binding member. Such conditions are useful for the covalent attachment of bifunctional anchors to vascular proteins in vivo, and are then toxic and evident from the vasculature (eg, when maintained in continuous high concentrations in vivo). Use of a certain diagnostic agent) is periodically administered. When the diagnostic agent of interest is indirectly attached to a bifunctional anchor molecule, the first binding member attached to the bifunctional anchor molecule is generally a small molecule, which minimizes any immune response. It seems to do. Thus, to a large extent, the first binding member is antibody binding, usually less than 1 kD, generally greater than about 100D, and preferably less than 600D. Any physiologically acceptable molecule with a convenient relative second binding member may be used. Thus, of particular interest is biotin, where avidin or streptavidin is the relative second binding member and other molecules such as metal chelates, molecules that mimic natural epitopes, receptors or antibody binding sites. Wherein the relative second binding member may be an antibody or fragment thereof, especially a Fab fragment, an enzyme, a naturally occurring receptor, and the like. Thus, the first binding member may be a ligand for a naturally occurring receptor, a substrate for an enzyme, or a hapten with a relative receptor. The first binding member is naturally found in the host vasculature, if at all, at a low concentration, if at all, if the first binding member is found in the vasculature to bind to the relative second binding member. And any competition between naturally occurring compounds is small. The second binding member is one that should not bind to compounds encountered in the host vasculature. The reciprocal (reciprocal) second binding member of a specific binding pair is determined by the nature of the first binding member used. As already mentioned, the second binding member can take many forms, particularly binding proteins such as immunoglobulins or fragments thereof, monovalent fragments such as Fab, Fv, naturally occurring such as surface membrane proteins. Other binding proteins such as receptors, enzymes, avidin or streptavidin, and the like. Generally, the affinity of a second binding member for a reciprocal first binding member (eg, the binding affinity normally observed for binding of a monoclonal antibody to a particular binder) is at least about 10 -8 And more generally about 10 -8 Greater than. Of particular interest are avidin and streptavidin, but other receptors of particular interest include steroids, receptors for LH, TSH, FSH or agonists thereof, and sialic acid and viral hemagglutinin, and superantigens . The second binding member is typically a macromolecule, generally at least about 5 kD, more usually at least about 10 kD, and usually less than about 160 kD, preferably less than about 80 kD. It may be monovalent or divalent at the binding site and is usually monovalent. The vascular protein selected as a target for reaction with the bifunctional anchor molecule depends on the indication of interest. Thus, depending on the selected vascular target, the diagnostic agent can bind to long-lived proteins and is substantially dispersed throughout the vasculature. In this case, the indicator selected is a long-term diagnostic imaging of the vasculature or preferential localization of a particular site of the vasculature, or a preferential diagnostic imaging of a particular anatomical compartment, It may or may not accompany the image. The target may be immobilized or mobile. That is, in the case of endothelial cells, it is immobilized in a substantially correct position, and is mobile in the vascular system. That is, in the long term (generally not more than 5 minutes, more usually not more than 1 minute) it has no immobilization position. Target cells and proteins may be substantially homogeneous or have a variable distribution within the vasculature, and their targets are preferentially compared to the vasculature or other anatomical compartments. Or concentrated in a particular compartment. The diagnostic agent used and the targeted vascular protein depend on whether long-term diagnostic imaging of the anatomical compartment, preferential imaging of specific cell types and / or compartments, or both . There are many applications for long-term diagnostic imaging of the vascular space to covalently link long-term vascular proteins to the desired diagnostic agent, detecting abnormalities in blood flow in the entire mammalian vasculature Increasing capacity, detecting internal injury that causes abnormal bleeding, or detecting the presence of thrombosis. For example, long-term imaging of the vascular space may be performed to detect the effect of a particular treatment during the treatment. That is, detection of embolism disappearance, internal bleeding cessation, and the like. Long-term diagnostic imaging of the vasculature also allows for the detection of various diseases associated with the vasculature, ie, diseases such as arterial obstructions in the heart. Thus, long-term diagnostic imaging of the vasculature may be used for non-invasive detection of consistently decreasing blood flow to the heart. Such methods also provide a way to measure cardiac efficiency and ventricular output over an extended period of time (ie, long operating times, etc.). Other applications of this method include non-invasive effects on the anatomy of the mammalian vasculature and their effects during administration of various agents (eg, vasodilators, vasoconstrictors, etc.). Resulting from the possibility of visualizing Such a method would allow early detection of progressive vascular abnormalities, disorders, etc. A further application of such a method, resulting from the long term diagnostic ability of the vascular space, is the functional assessment of the cardiovascular system, which is routinely used in nuclear medicine for single measurements. The first compound and, if necessary, the second compound are also usually administered by bolus (instantaneous bolus dose), but are slowly introduced over time by infusion using a controlled flow or the like. Is also good. Alternatively, but less preferably, blood may be removed from the host, processed outside the body, and returned to the host. The first and second compounds may be administered in a physiologically acceptable medium. For example, deionized water, phosphate buffered saline, physiological saline, mannitol, aqueous glucose, alcohol, vegetable oil and the like can be mentioned. Usually, a single dose will be used, but more than one dose may be used if necessary. The first and second compounds may be administered by any suitable method, such as by syringe, catheter, and the like. The particular mode of administration will vary with dosage, such as a single bolus, sequential dosing, or continuous administration. Administration is intravascular. The site of introduction is not critical in the present invention, but is preferably a site with rapid blood flow, such as a vein, peripheral nerve or central vein. This is intended to effectively distribute the administered compound within the vasculature to react with the target protein. The dosage of the compound will depend on whether or not it contains the diagnostic agent of interest, and therefore, if present, to reduce the side effects of the diagnostic agent of interest and the concentration of unbound drug present in the vasculature. Time, the dose required for successful diagnostic imaging, the indicator detected, the sensitivity of the diagnostic to degradation by vascular components, and the route of administration. If necessary, the dose of the diagnostic agent may be determined empirically. For normally administered doses, one may start with small multiple doses and increase the dose as more experience is gained. Dosages generally range from 1 ng / kg to 10 mg / kg and are usually determined empirically by known methods, such as those provided for preclinical and clinical trials. All publications and patent applications mentioned in this specification are indicative of the level of skill of those skilled in the art to which the invention pertains. All publications and patent applications are incorporated by reference as if individually set forth in detail in this specification. While the invention will be described in detail below, it will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications can be made without departing from the spirit or viewpoint of the appended claims.
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(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
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(72)発明者 クランツ アーレン
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
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ク ドライヴ 350 アパートメント デ
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(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L
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(72) Inventor Kranz Arlen
United States California
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