JP2000503115A - 細胞サンプルの試験方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明において、細胞の透過性の測定値は、変更した環境に応答して、サンプル細胞膜を横切る流体の体積の測定値を得ることにより決定される。細胞膜に流体を横切らせ、それにより、細胞体積の変化を生じさせるために崩壊剤を用いることができる。サンプル懸濁液が連続の浸透圧勾配に付される、サンプル懸濁液の重量オスモル濃度の変更は好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞サンプルの試験方法 技術分野 本発明は細胞膜の透過性を測定するための方法に関し、そして、赤血球、白血 球、血小板、繊維芽細胞、組織細胞、アメーバ、菌類、バクテリア、全ての真核 細胞および原核細胞、並びに合成細胞またはパーティクルを含む、全てのタイプ の細胞に応用できる。 背景技術 透過性は、流体または気体状態の物質が通常には固体状態の別の材料を通る通 過性であり、それは、標準温度および圧力で単位表面積当たりに単位時間当たり に膜を横切って移動する速度または全体積として測定される。生物学的に、多く の膜、特に細胞膜は選択的に透過性であり、その為、細胞は栄養素、ホルモン、 気体、糖類、タンパク質または水をその膜を通して輸送することができる。この 輸送は膜のいずれかの側における物質の分圧または濃度のみに依存する受動性で あるか、または、既存の濃度に対抗するためにエネルギーを必要とする能動性で あることができる。異なる細胞は細胞の機能に密接に関係した、異なる分子に特 有の透過速度を有する。 赤血球の透過性の現在の試験は透過性についての単一の値を与え、その値は、 通常、細胞（または細胞群）の中またはその周囲の中にある放射線標識分子（し ばしば、水）の濃度の変化を測定することにより得られる。 発明の開示 本発明によると、液体媒質中に懸濁した細胞サンプルであって、液体媒質の性 質と明確に異なる少なくとも１種以上の測定可能な性質を有する細胞サンプルが 、細胞サンプルの細胞透過性の測定値を決定するための分析に付される、新規の 方法であって、この方法は、 （ａ）サンプル細胞の懸濁液の第一アリコートをセンサーに通過させること、 （ｂ）細胞の懸濁液の前記少なくとも１種の性質を測定すること、 （ｃ）細胞の第一アリコートの前記性質の測定値を記録すること、 （ｄ）細胞膜を横切って流体の流れを生じさせることができる、細胞環境の少な くとも１種のパラメータを、サンプル細胞の懸濁液の第二アリコートにおいて変 更し、それにより、細胞の前記少なくとも１種の性質を変えること、 （ｅ）前記第二アリコートをセンサーに通過させること、 （ｆ）この変更した環境下において、細胞懸濁液の前記少なくとも１種の性質を 測定すること、 （ｇ）細胞の第二アリコートについての前記少なくとも１種の性質の測定値を記 録すること、 （ｈ）工程（ｃ）および（ｇ）から得られたデータを、細胞環境の前記パラメー タの前記変更の程度および前記少なくとも１種の性質について記録した測定値の 変化の関数として比較し、サンプルの細胞透過性の測定値を決定すること、 の工程を含む。 血液細胞は１分間に体全体にわたって移動し、気体および代謝物を絶えず輸送 する。血液細胞は、また、メッセンジャーとして作用し、またはホルモンの代わ りをして、体中に情報を伝達する。この巡回的な存在により、血液細胞は離れた 異常個所に信号を送ること ができることが判っている。例えば、脳が死んだときに、肢体に血液供給が閉ざ されたときに、または、腎臓が重大な毒素を除去できなくなったときに、血液細 胞膜の透過性は変わる。細胞膜の透過性はルーチンで測定されたことがなく、そ して実験的に稀に測定されるのみである。現在までのところ、このような測定を 行う、速くまたは信頼できる方法はない。赤血球の透過性は複雑であり、分子が 細胞膜を横切るときに、例えば、細胞の形状および構造並びに膜ポンプ活性によ って動的に変化することも判っている。本発明の方法は、既存の透過性測定を行 うが、より有用なことには、サンプル調製を行わずに、60秒以内に、細胞透過性 の、より敏感で、正確で且つ詳細な測定を行う。 好ましくは、液体媒体と異なる細胞の性質は細胞の体積に直接的に関係がある 性質である。このような性質は電気抵抗またはインピーダンスであり、Coulter Instruments Inc.によりCoulter Counter の商品名で市販されている装置のよう な従来のパーティクルカウンターを用いて測定されうる。好ましくは、細胞を検 知し、そして細胞の性質の変化を測定するために用いられるセンサーは我々の同 時係属の国際出願（代理人参照番号62/2681/03）に記載されるものである。この 装置において、細胞懸濁液は開口部を通して流され、それが電界を変える。細胞 の透過に対する電界の応答は一連の電圧パルスとして記録され、各パルスの大き さは細胞のサイズに比例する。 本発明の好ましい方法において、細胞透過性の測定値は、変更した環境に応答 してサンプル細胞膜を横切る流体の体積の測定値を得ることにより決定される。 本方法において変更する環境パラメータは細胞の測定可能な性質が変えられるこ とになる変更のいずれかである。好ましくは、細胞膜を横切って流体を輸送し、 それにより、 細胞体積の変化を起こすために崩壊剤(lytic agent)は用いられる。それ故、好 ましくは、環境パラメータの変化は重量オスモル濃度(osmolality)の変更、最も 好ましくは重量オスモル濃度の減少である。通常、第一のアリコートの環境は等 張であり、そしてこの為、第二のアリコートは低張になる。他の適切な崩壊剤は 、石鹸、アルコール、毒素、塩および印加される剪断応力を含む。 この効果を達成するために、サンプル懸濁液の１つのみのアリコートに重量オ スモル濃度の１回以上の変更を与えることが可能であるが、同一のサンプル懸濁 液の２種以上の異なるアリコートを用いることが好ましい。最も好ましくは、サ ンプル懸濁液は連続の浸透圧勾配に付され、そして特に、我々の同時係属の国際 出願（代理人参照番号80/4936/03）の方法により生じる浸透圧勾配に付される。 我々の同時係属の国際出願（代理人参照番号62/2734/03）の好ましい方法にお いて、特定の細胞パラメータの幾つかの測定は一連の連続した重量オスモル濃度 にわたって行われ、その測定値は細胞体積および細胞表面積を含み、それは装置 を検量するために一般に用いられる球形パーティクルからの細胞の偏差を考慮す る。インビボの細胞の形状の評価は、全ての形状の細胞体積および細胞表面積の 正確な測定値を得るために行われる。サンプル懸濁液は溶液中に連続的にフィー ドされ、その重量オスモル濃度は連続の濃度勾配が生じるように連続的に変化さ れる。赤血球細胞の周囲の溶液の重量オスモル濃度を臨界レベル未満に減少させ ると、最初に細胞は膨潤し、その後、破壊して、殆ど全部がヘモグロビンである その内容分を周囲の媒質中にゆっくりと開放するゴースト細胞を生成する。細胞 環境の重量オスモル濃度の減少による細胞体積の増加時に、各細胞の表面積は実 質的に変化しない。というのは、細胞膜は実質的に非弾性であるからである。各 アリコートの環境の変化の開始から検知 ゾーンを通る細胞の通過までの時間は一定に保たれ、それにより、時間は細胞の 透過性の計算にファクターにならない。連続的に変化している重量オスモル濃度 勾配に試験下でサンプルをフィードすることの効果は、その連続的に変化してい る勾配をもって、ある特定の細胞サンプルを処理することと同一の測定値が得ら れることである。 好ましくは、測定値は我々の同時係属の国際出願（代理人参照番号62/2734/03 ）の方法により、細胞毎に記録される。各アリコート中の計数される血液細胞の 数は、通常、少なくとも1000個であり、そして細胞毎のデータは、その後、細胞 透過性の正確な頻度分布を得るために用いられる。適切には、この濃度は、天気 予報において用いられるレーダー降雨ピクチャーに見られるのと同様の３ 次元 効果を与える異なる色を用いることによってより視覚的に示されることができる 。または、いずれかの張力の単一の溶液について、測定されるパラメータの変化 は、同一の変化を示す幾つかの個々の細胞に対して示されることができる。この ようにして、与えられた重量オスモル濃度における細胞の透過性の分布を得るこ とができる。 上記の通り、我々の同時係属の出願は、サンプル中の個々の細胞について、連 続の浸透圧勾配にわたって、細胞体積または細胞体積に関係した他の細胞パラメ ータおよび細胞表面積の正確な評価を提供することができる。重量オスモル濃度 に対する細胞体積の変化のプロットは、特徴的な曲線を示し、それは重量オスモ ル濃度の減少に伴い、細胞体積がどのように変化するかを示し、そして膜を横切 る流れの最大速度および最小速度を示し、そして流速は特定の浸透圧または一連 の浸透圧に起因する。 浸透圧（Ｐ_osm）、細胞体積、表面積（ＳＡ）および他の関連環境ファクター の測定値を得て、細胞の透過性の幾つかの測定値を得 ることができる。 １）Ｃｐ速度 透過性のこの係数は、特定の圧力に応答して、１平方メートル当たりに横切る 流体の流れの速度を測定する。全ての正の速度は細胞中に入る正味の流れを示し 、全ての負の速度は細胞から出てくる正味の流れである。速度は、 Ｃｐ速度＝Δ細胞体積／ΔＰ_osm ／ＳＡ（Ｓ．Ｔ．Ｐ） により決定される。 ２）透過係数ｐｋｎ このセットの透過性測定値は正味の透過速度が０である各圧力を記載するもの であり、そしてｐｋ₀ ，ｐｋ₁・・・ｐｋ_n と番号付けされる。 （ｉ）ｐｋ₀ は細胞が一体性を失うことなく受けることができる最小絶対圧（低 張）と一致する。ｐｋ₀ で１／１０ミリオスモル／ｋｇの圧力変化（０．０００ １気圧）は１桁〜２桁の透過性の変化を生じ、この為、ｐｋ₀ は明らかであり、 非常に再現性が高い測定値である。 （ｉｉ）ｐｋ₁ は若干の低張圧で体積的に調節することができる細胞の能力の測 定値である。特定の圧力の後に、細胞は浸透力を打ち消すことができなくなり、 細胞の体積が変化する。ｐｋ₁ はこの調節を行うことができる細胞の能力の測定 値であり、それにより、細胞の最大ポンプ輸送能力を測定することができる。 （ｉｉｉ）ｐｋ₂ は、ｐｋ₁ から必然的に得られるものであり、高張圧において 体積的に調節することができる細胞の能力の測定値であり、インビボ静圧におけ る通常の細胞と比較したときに、低い差圧で起こる。 透過性係数ｐｋ_n は次の等式により記載される。 Ｐｋ_n ＝ΔＰ_osm ／ＳＡ （Ｓ．Ｔ．Ｐ） ｐｋ₀ を計算するときに、ΔＰ_osm ＝（等張圧）−（正味流量が０である圧力 ）である。 ｐｋ₁ を計算するときに、ΔＰ_osm ＝（等張圧）−（正味の正の流量が始まる ときの第一の低張圧）である。ｐｋ₂ の計算はｐｋ₁と同一であるが、ΔＰ_osm は正味の正の流量が０でない第一の高張圧を測定する。 ３）ＣｐΔ この無次元の値は２つのＣｐ速度の比較であり、そして２つの崩壊剤濃度の間 の細胞膜を横切る流体の正味の量として表現される。それは、体積に無関係であ り、そして圧力に関係する透過速度の比較を提供する。この測定は数分から数カ 月の間にわたる、同一の個体の透過速度の変化を比較するために用いうる。 ４）ＣＰ_max これは細胞膜を横切る流れの最大速度である。殆ど全ての細胞に関して、２つ の最大値があり、１つは正（細胞中への正味の流れ）であり、１つは負（細胞か らの正味の流れ）であり、ｐｋ₀ のいずれかの側にある。ＣＰ_max は重量オスモ ル濃度に対する細胞体積の変化の連続曲線の最大の正の勾配および負の勾配を検 知することにより決定される。 ５）膜構造抵抗（ＭＳＲ） これは水の内側への流れまたは外側への流れに抵抗する細胞の内部の構造的な 力の測定値である。それは、細胞中への全ての他のゼロでない流速に対するＣＰ_max の比により決定される。膜は、全ての圧力において理論的に等しく透過性で あるので、ｐｋ₁ からｐｋ₂ の範囲外の最大流速からの変化は機械力によるもの である。Ｃｐ_rateが０に近づくときに、ＭＳＲは∞に近づき、それにより、膜が 耐えられるよりも大きな歪みを生じるので、ｐｋ₀ は細胞に対する全体としての 機械的限界であることが明らかである。 ＭＳＲ＝ＣＰ_max ／Ｃｐ_rate ｘ １００％ ６）Ｃｐｍ１ これは組織または血液の単位体積当たりの個体に、または、全体の組織または 全体の体に与えられる生理的透過性の測定であり、以下の通りに計算される。 ＣＰｍ１＝Δ細胞体積／ΔＰ_osm ／ｍ³ ／全血液ｍｌ 本発明の方法は広い範囲の用途を有し、特に、 １．すべてのタイプの細胞の透過性および透過速度を測定するための手段 ２．正常膜および異常膜の透過性を検知、差別化し、そしてその原因を検知する ための手段 ３．新薬についてのインビボの動物試験または人体実験に代わるインビトロ試験 、または毒物実験、特に神経剤、麻酔薬、医薬、放射線および化学兵器薬剤のよ うな未知の物質が膜透過性に与える効果の実験 ４．膜の研究 ５．分類技術。種々の種は、知られているが、分類技術の基礎として用いられて いない、種々の膜透過性を有する。 ６．他の細胞のためのモデル、特に、神経細胞インパルス増殖のための膜ポンプ による神経細胞のためのモデル。 ７．血液バンクのための医術。現在の献血ユニットは、貯蔵寿命が３週間に限定 されている。これは、幾つかの献血ユニットは貯蔵時にこれより長く生き残らな いからである。しかし、多くのユニットは何週間も生存することができるが、病 院は輸血のために生存していないユニットを用いる危険をおかさない。本発明の 透過性測定は 、血液の生存可能性を決定する手段を提供し、ユニットが死んでいるかどうかを 決定するための素早く且つ安価な方法が可能である。３週間の期限の前に、ユニ ットをいつ廃棄すべきであるかを決めるためのベースとして用いることもでき、 それにより、悪い輸血の危険を低減し、そして毎年、何百万のユニットを節約す ることが可能になる。 ８．病気の検知、病気の診断、診断の確認、病気の予後のモニタリング、処置効 果のモニタリングおよび人間および他の種の症状緩和のモニタリングの手段。 ９．全ての種の病理を調査するための手段。以前に知られていなかった、細胞膜 透過性を変更することが判った病気が多く存在する。例えば、神経性食欲不振の ときのように赤血球に結合したインシュリンが増加したとき、呼吸不全もしくは 先天性横隔膜ヘルニアにより誘発されるか、または、不明の機構による中間型サ ラセミアにおける酸素欠乏のときに、透過性は変更される。これまで、細胞膜は 肢体への血流をモニターするために用いられたことはなかった。１つの新しく、 予期できない発見は、大腿動脈バイパスを必要とするために下肢に十分に血流を 閉塞させると、血液細胞膜の透過性が常にそして大きく変化することである。 １０．死の検知および確認のための手段。死んだときに、細胞膜の透過性の変更 があり、それはＥＥＣよりも素早く且つ安価に測定する。 １１．病気の指標としての異常性のためのルーチンサンプルのスクリーニング。 図面の簡単な説明 本発明は、ここで、添付の図面を参照して詳細に説明される。 図１は血液細胞を採取し、そして試験するために用いられる装置の略図を示す 。 図２は図１の装置の勾配発生機セクションの流体輸送シリンジからの流体の吐 出についての速度プロファイルを示す。 図３は図１の装置において用いられるデータ処理工程を示すブロックダイアグ ラムを示す。 図４は本発明により分析される血液サンプルの細胞について測定される電圧に 対する重量オスモル濃度の三次元プロットの例を示す。 図５はある間隔での血液細胞の頻度分布を例示する、測定される電圧に対する 重量オスモル濃度の三次元プロットの別の例を示す。 図６は１時間間隔で試験したサンプルの一連の三次元プロットを示す。 図７および８は装置の検量ルーチンの一部としての球状ラテックス粒子の結果 を示す。 図９は測定される電圧および真の体積、それぞれに対する重量オスモル濃度（ ｘ−軸）の重ね書きプロットを示す。 図１０ａ〜１０ｄは健康な個体の試験から得られた結果を示す。 図１１は図１０ａ〜１０ｄに示した結果のプライス−ジョーンズ(Price-Jones )曲線を示す。 図１２は細胞体積に対する重量オスモル濃度のグラフを示し、そして細胞の透 過性の幾つかの異なる測定値を示す。 図１３は正味の流体流量に対する重量オスモル濃度のグラフである。そして、 図１４は異常な個体についての三次元頻度分布プロットおよび細胞パラメータ を示す。 詳細な説明 図１は本発明の方法において使用するための血液サンプラーの略図を示す。血 液サンプラーはサンプル調製セクション１および勾配発生機セクション２および センサーセクション３を含む。 サンプル容器５の中に含まれた全血液サンプル４はサンプルプローブ６のため のサンプルリザーバーとして作用する。サンプルプローブ６はＰＴＦＥ流体ライ ン２６に沿って、マルチポジション分配バルブ８およびマルチポジション分配バ ルブ９を介して、希釈ポンプ７に連結されている。希釈ポンプ７はマルチポジシ ョン分配バルブ９のポート＃１を介してリザーバー（示していない）から塩水溶 液を引き込む。下記において詳細に説明されるように、希釈ポンプ７はサンプリ ングプロセスにおける第一希釈工程の一部として、一定体積の塩水とともに血液 のサンプルを第一ウェル１０へ吐出するように制御される。 第二の希釈工程において、希釈ポンプ７は第一ウェル１０からの血液の希釈サ ンプルを、マルチポジション分配バルブ１１を介してＰＴＦＥ流体ライン１２に 送り、そしてこのサンプルを、更なる体積の塩水とともに第二ウェル１３へと吐 出する。第二ウェル１３は下記に示すような勾配発生機セクション２のための希 釈サンプル源を提供する。 全血液を用いる代わりに、サンプル容器１５中の血液の予備希釈サンプル１４ を用いてもよい。この場合には、サンプルプローブ１６はＰＴＦＥ流体ライン３ ０、マルチポジション分配バルブ１１、ＰＴＦＥ流体ライン１２およびマルチポ ジション分配バルブ９に沿って、希釈ポンプ７に連結されている。第二の希釈工 程において、希釈ポンプ７はサンプル容器１５から、流体ライン３０およびマル チポジション分配バルブ１１を介して、一定体積の予備希釈された サンプル１４を流体ライン１２中に引き込み、そして更なる体積の塩水とともに サンプルを第二ウェル１３中に吐出し、勾配発生機セクション２のための希釈サ ンプル源を提供する。 勾配発生機セクション２は第一流体輸送シリンジ１７を含み、それはマルチポ ジション分配バルブ１８を介してサプライから水を引き込み、ＰＴＦＥ流体ライ ン２０に沿って、ミキシングチャンバー１９へ水を吐出する。勾配発生機セクシ ョン２は、また、第二流体輸送シリンジ２１をも含み、それはマルチポジション 分配バルブ２２を介してサンプル調製セクション１における第二ウェル１３から 、希釈された血液のサンプルを引き込み、そしてこれをＰＴＦＥ流体ライン２３ に沿ってミキシングチャンバー１９に吐出し、ここで、それは第一流体輸送シリ ンジ１７からの水と混合される。下記に詳細に説明するように、ミキシングチャ ンバーへの第一流体輸送シリンジ１７からの水の吐出速度および第二流体輸送シ リンジ２１からの希釈血液サンプルの吐出速度は、ＰＴＦＥ流体ライン２４に沿 ってミキシングチャンバー１９を出てくるサンプル懸濁液の予め決められた濃度 プロファイルを生じるように制御される。流体ライン２４は、通常、３メートル 長さまでのものである。適切な勾配発生機は本願の出願人の同日出願の同時係属 国際出願（代理人参照番号６２／２６８４／０３）に詳細に記載されている。 下記にも詳細に説明するように、サンプル懸濁液は流体ライン２４に沿ってミ キシングチャンバー１９を出て、そしてセンサーセクション３に入り、ここで、 それは検知ゾーン２５を通過し、検知ゾーンはサンプル懸濁液中の個々の細胞を 検知し、その後、サンプルは幾つかの廃棄アウトレットを介して廃棄される。 ルーチン試験において、全装置は最初にフラッシュされ、そして適切に塩水を 装填して装置を洗浄し、エアおよび破片のポケットを なくし、そして残存物を減らす。 希釈ポンプ７はステッパーモータ（示していない）により駆動される流体輸送 シリンジを含み、そして、通常、最初に、塩水リザーバー（示していない）から マルチポジション分配バルブ９のポート＃１を介して５〜１０ｍｌの塩水をシリ ンジボディーに送るような配置になっている。適切な流体輸送シリンジおよびス テッパーモータの配置は本願の出願人の同日出願の同時係属国際出願（代理人参 照番号８０／４９３６／０３）に詳細に記載されている。マルチポジション分配 バルブ９のポート＃１をその後に閉止し、そしてマルチポジション分配バルブ９ およびマルチポジション分配バルブ８の両方のポート＃０を開放する。通常、１ ００μｌの全血液はサンプル容器５から引き込まれ、そして流体ライン２６中の デッドスペースを満たす。マルチポジション分配バルブ８のポート＃０を、その 後に閉止し、そして流体ライン２７へ引き込まれた全血液サンプル４の血液を希 釈ポンプ７により吐出して、マルチポジション分配バルブ８のポート＃１を介し て廃棄する。 第一の希釈工程において、マルチポジション分配バルブ８のポート＃０を開放 し、希釈ポンプ７は既知の体積、通常には１〜２０μｌの全血液をＰＴＦＥ流体 ライン２７中に引き込む。その後、ポート＃０を閉止し、ポート＃２を開放し、 そして希釈ポンプ７は流体ライン２７中の血液サンプルを、流体ライン２７中の 既知の体積、通常には０．１〜２ｍｌの塩水とともに第一ウェル１０へ吐出する 。マルチポジション分配バルブ８のポート＃２およびマルチポジション分配バル ブ９のポート＃０を、その後に閉止する。 これに続き、マルチポジション分配バルブ１１のポート＃０およびマルチポジ ション分配バルブ９のポート＃３を開放して、希釈ポンプ７に第一ウェル１０中 にある第一サンプル希釈液を引き込ませ 、ＰＴＦＥ流体ライン２８中のデッドスペースを満たす。マルチポジション分配 バルブ１１のポート＃０を、その後に閉止し、ポート＃１を開放して、希釈ポン プ７が、流体ライン１２に引き込まれた第一のサンプル希釈液をポート＃１を介 して廃棄できるようにする。 第二の希釈工程において、マルチポジション分配バルブ１１のポート＃０を再 開放し、そして希釈ポンプ７は既知の体積、通常には１〜２０μｌの第一希釈液 を流体ライン１２中に引き込む。流体ライン１２はサンプルが希釈ポンプ７を汚 染しないためのリザーバーを提供するための遅れコイル２９を含む。マルチポジ ション分配バルブ１１のポート＃０を、その後に閉止し、ポート＃３を開放し、 そしてその後、希釈ポンプ７は流体ライン１２中の第一サンプル希釈液を、既知 の体積、通常には０．１〜２０ｍｌの塩水とともに第二ウェル１３へ吐出する。 マルチポジション分配バルブ１１のポート＃３を、その後に閉止する。この段階 で、全血液サンプルを、通常には１００００：１の比率で希釈する。下記により 詳細に説明するように、装置は、試験ルーチンの最初に予め決められた許容値の 範囲内の予め決められた細胞計数を得るためにサンプル懸濁液の希釈度を変える ように第二希釈工程を自動的に制御するようになっている。 勾配発生機セクション２において、第一流体輸送シリンジ１７を水リザーバー からの水により満たす。マルチポジション分配バルブ２２のポート＃３を開放し 、そして第二流体輸送シリンジは一定体積の希釈血液サンプルを第二ウェル１３ からシリンジボディーに送る。マルチポジション分配バルブ２２のポート＃３を 閉止し、マルチポジション分配バルブ１８およびマルチポジション分配バルブ２ ２のポート＃２を開放し、そして、水および希釈血液サンプルを同 時にミキシングチャンバー１９へ制御しながら吐出する。 図２は、流体ライン２４に沿ってミキシングチャンバー１９を出るサンプル懸 濁液の重量オスモル濃度の予め決められた連続勾配を得るために、第一流体輸送 シリンジおよび第二流体輸送シリンジの各々から吐出される流体の速度が時間と ともにどのように変化するかを示す。サンプル懸濁液の流速は、通常、２００μ ｌｓ- ¹ の範囲であり、それは測定が行われている間は一定に保たれる。この特 徴については、本願出願人の同時係属出願（代理人参照番号６２／２６８４／０ １）に詳細に記載されている。図２に示すように、流体輸送シリンジ２１を動か すカムに連結されたカムプロファイルはシリンジプランジャーを加速し、サンプ ルを速度Ｖ₁ で吐出し、その間、流体輸送シリンジ１７を動かすカムに連結され たカムプロファイルは連結されたシリンジプランジャーを加速し、より低い速度 Ｖ₂ で流体を吐出する。各輸送シリンジからの一定の流速が時刻Ｔ₀ で達成され たら、時刻Ｔ₁ では、流体輸送シリンジ２１と連結されたカムプロファイルは時 間Ｔ₂ −Ｔ₁ の間にわたって速度Ｖ₂ にまで直線的に減速するようなサンプル吐 出速度を生じ、その間、同時に、流体輸送シリンジ１７に連結されたカムプロフ ァイルは速度Ｖ₁ にまで直線的に加速するような流体吐出速度を生じる。この間 、２つのシリンジの合計流速は約２００μｌｓ- ¹ で実質的に一定に保たれる。 最後に、２つのシリンジは時間Ｔ₃ −Ｔ₂ にわたってフラッシュされる。 一度、第一流体輸送シリンジ１７および第二流体輸送シリンジ２１の両方がそ の内容物を吐出したときに、第一輸送シリンジは次の試験のための準備において 水が再充填される。もし、異なる対象からの血液サンプルを用いようとするなら ば、第二の流体輸送シリンジ２１はマルチポジション分配バルブ２２のポート＃ １を介して送 られる塩水サプライからの塩水によりフラッシュされ、汚染されたシリンジのボ ディーは洗浄される。 ミキシングチャンバー１９から出てくるサンプル懸濁液は流体ライン２４に沿 ってセンサーセクション３に通過する。適切なセンサーセクションは本願出願人 の同日出願の同時係属出願（代理人参照番号６２／２６８１／０３）に詳細に記 載されている。サンプル懸濁液はサンプル懸濁液の個々の細胞が通過しなければ ならない開口部付近に生じる電界を備える検知ゾーン２５を通過する。サンプル 懸濁液の個々の血液細胞が開口部を通過するときに、各々の個々の細胞の電気抵 抗に対する電界の応答は電圧パルスとして記録される。特定の遮断時間、通常に は０．２秒間の電圧パルスの合計数とともに各電圧パルスの大きさも記録し、同 時に測定されるその瞬間のサンプル懸濁液の重量オスモル濃度との比較を含む、 次の分析のために保存する。サンプル懸濁液の重量オスモル濃度は、また、勾配 発生機セクション２により生じる、予め決められた連続浸透圧勾配の知識から、 測定することなく決定されてもよい。下記に記載されるように、重量オスモル濃 度（圧力）は細胞パラメータを決定するためには必要ない。 図３はデータがどのようにして収集され、そして処理されるかを示す。メイン マイクロプロセッサーが各装置の内部にあり、それは装置に指示を与え、そして 制御する役割を担っており、内部ハードウェアまたは低コストの埋め込みコント ローラは装置内の特定のジョブ、例えば、希釈機、バルブおよびステッパーモー タを操作したり、または、パルスをデジタル化し、そしてバッファーメモリーに 転送するジョブをこなす役割を担っている。装置を運転するソフトウェアはＣお よびアセンブリコードで記載されており、そして３２Ｋより若干小さい。 サンプルを試験するときに、センサーにより生じる各電圧パルスの大きさおよ び長さは１２ビット精度にデジタル化され、そして試験されたパルスの大きさの 合計、長さの合計および数とともに２つの１６Ｋバッファーのうちの１つに保存 される。装置はセンサーのデータを収集している間に、１つのバッファーはデジ タル化された値を入れ、一方、メインマイクロプロセッサーはいっぱいのバッフ ァーをからにして、処理する。この処理は要らないパルスをフィルターアウトし 、装置の制御変更のためのデータを分析し、そして最後に、データを圧縮し、そ の後に、複合分析のためにパーソナルコンピュータに送ることからなる。 装置により行われる任意の処理はフィルタリングを改良し、ピーク検知の精度 を上げ、そしてパルスの形状およびサイズに関するより多くの情報を提供するた めの、各センサーパルスのデジタル信号処理を含む。このようなデジタル信号処 理は細胞１つあたりに約２５個の１６ビット値を生じ、１試験当たりに約２５メ ガバイトのデータを生じる。 パーソナルコンピュータにおけるデータ処理はＣおよびパスカルで記載された カスタム４００Ｋプログラムからなる。ＰＣはリアルタイムでデータを表示し、 そして分析し、ユーザーインターフェース（ウィンドウズ、メニュ−等）を制御 し、そして各サンプルを保存し、そしてプリントする。 ソフトウェアは、また、試験される各サンプルのデータベースを保持し、以前 に試験したサンプルの速い比較を可能にする。更に、ソフトウェアは装置の運転 をモニターし、低い流体レベル、システムクラッシュまたは使用者の装置のつけ 忘れのような誤作動および誤りを検知する。 サンプル懸濁液の各細胞が検知ゾーン２５の開口部を通過すると きに、各細胞により生じる電圧パルスは、測定された電圧に対する重量オスモル 濃度のプロットとしてＰＣのＶＤＵ上にグラフとして表示される。サンプル懸濁 液はセンサーセクションを２００μｌｓ^{- 1} の速度で通過する。第二希釈工程は 、試験の最初に測定して約５００細胞／秒の初期細胞計数を達成するように制御 され、それにより、０．２０秒間の遮断時間に、約１０００個細胞が検知され、 そして測定される。これは、第二希釈工程において、流体ライン１２から希釈ポ ンプ７により吐出される塩水の体積を自動的に変えることにより行われる。４０ 秒間の試験時間にわたって、合計で２００回の遮断時間ができ、そしてこれは特 定の重量オスモル濃度で測定される電圧の頻度分布を例示する三次元形態の連続 曲線として表示され、その例を図４および５に示す。 個々の細胞をベースとして保存されそして回復された、測定された細胞の電圧 を、その電圧変化を生じさせる溶液の重量オスモル濃度に対する電圧のプロット で示す。各々の個々の細胞について測定されたパラメータ変化を示すための個々 のドットを用いると、重量オスモル濃度勾配によりカバーされる溶液の全範囲に ついて、集合体の電圧およびその為、体積により細胞の分布が示される表示とな る。全体の結果は、変えられたパラメータ、この場合には溶液の重量オスモル濃 度に対する測定された電圧パルスの大きさについての測定された性質変化として 示される三次元表示であり、細胞が特定の重量オスモル濃度にさらされ、そして 集合体中の特定のサイズの分布または濃度の細胞が特定の重量オスモル濃度にさ らされる。結果は等高線地図に類似した表示を生じ、それは最大強度のエリアを 示すために色を用いることにより強調することができる。 分解を起こす臨界重量オスモル濃度よりもわずかに低い重量オスモル濃度にお いて、広い範囲の低張液中で溶血衝撃に付した特定の 細胞の集合体の細胞サイズの分布に対して完全なデータが入手されたときに、集 合体中のギャップが見られる。図４に示すように、ゴースト細胞は三次元プロッ ト中に完全に見ることができまたは確認することができ、そして破壊していない 細胞は明らかに確認できるが、比較的に少数の個体が見られる重量オスモル濃度 および細胞体積により画定される領域はその間にある。我々が「ゴーストギャッ プ」と呼ぶ、この減少の存在は以前には認識されていないものである。 全体の一連の工程を初期サンプルの更なるアリコートで時間測定された間隔で 繰り返し、そして得られる測定電圧を重量オスモル濃度、時間および頻度分布に 対してプロットするならば、四次元表示は天気図における変化のようなものとし て得られる。時間の動きが第四の次元である、この動いている三次元表示は特定 の血液サンプルに更なるパターン特性を与える。これを図６中の一連の画像にお いて示す。図６に示す画像は３７℃の温度で１時間間隔で行った試験の結果であ る。測定はあまり正確でないので、繰り返しの値をコンピュータのシーケンス技 術を用いて重ねる。 示すように、細胞は時間の経過とともにゆっくりと機能する能力を失っている が、それは予期しないように変化する。血液サンプル中の細胞のサイズおよび形 状は、複雑で直線的でないが、再現性をもって変化し、何日にもわたってそして 連続して行う試験においてある特徴的なパターンを繰り返す。経時とともに現れ るパターンは同様のサンプルでは類似性があり、そしてしばしば、特徴的な波状 の動きを示す。変化のパターンは、健康状態を反映して個体間で異なり、または 、パターンはサンプルの中で異なることがある。このため、最初に試験したとき に均質であるサンプルは時間とともに２つまたは幾つかの小集合体に分けられ、 そしてその存在は広い範囲 の異なる張度をサンプルに付し、そして記載されたように電圧パルスを記録する ことにより検知できる。図６に示すように、細胞は初期サンプル中でだんだんと 球形になる最初の何時間かの後に、それは数時間の間に、より平坦になり、その 後、また、より球形になって、限界に達し、そして、その後、より薄くなり、最 後に再び膨潤することができる。観測される変化が起こる速度はｐＨ、温度、得 られるエネルギーおよび他のファクターにより影響を受けることが判った。 三次元パターンは、特定の細胞が球形になるときである最大体積に達するとき の正確な重量オスモル濃度を同定することができるデータを提供する。下記に詳 細に記載される適切な検量を行い、そして電圧パルスの大きさを用いると、この ような細胞の実体積を精密且つ正確に特定し、そして、臨床上注目される多くの 他の細胞パラメータを引き出すことが可能である。 個々の細胞が電界を通過するときにセンサー２５により生じる電圧パルスの大 きさは各細胞の体積に比例する。しかし、細胞体積の測定値の変換を行うことが できる前に、装置は検量を必要とする。これは、既知の体積の球形ラテックス粒 子を用い、そして従来の技術を用いて、測定される細胞の体積との比較により行 われる。 実験結果は市販のラテックス粒子の球形体積に対して測定した電圧のマッピン グは線形関数であることを示した。従って、正確な変換係数を決定するために１ つサイズの球形ラテックス粒子しか使用する必要がない。最初の検量工程におい て、Bangs Laboratories Inc．により製造されたラテックス粒子を含むサンプル であって、５．０６μｍの直径を有し、即ち、６７．８３４ｍ³ の体積を有する ものを装置によりサンプリングした。ラテックス粒子のための三次元プロットを 図７に示し、図８に平均電圧に対する重量オスモル濃 度のプロットを示す。この特定の試験において、装置は６９１．９７ｍＶの平均 電圧を生じた。球形体積は下記の等式により与えられる。 球形体積＝測定された電圧 × Ｋ_volt （式中、Ｋ_voltは電圧変換係数である）。 この等式を変形すると、 Ｋ_volt＝球形体積／測定された電圧 となり、この場合、Ｋ_volt＝６７．８３４／６９１．９７＝０．０９８０である 。 このＫ_volt値は試験した特定の装置のみに有効であり、装置のメモリー内に保 存される。 第二の検量工程において、平均の個体中の平均の血液細胞は両凹型形状を有す るという事実を考慮するために形状補正係数が決定される。上記の電圧変換係数 Ｋ_voltを応用すると、ラテックス粒子のように、血液細胞は球形であり、そして それ故、球形以外の細胞形状については不正確な細胞体積を与えるということが 仮定される。 本発明において、可変形状補正関数は、分解を起こす臨界重量オスモル濃度まで のいずれかの重量オスモル濃度で、血液細胞の平均体積が非常に正確に計算され うるように決定される。 これを例示するために、特定数の正確に知られていれる重量オスモル濃度、お よび、標準参照法のパックド細胞体積を用いて測定された血液細胞の体積で、サ ンプルを試験した。また、同一サンプルの一部分を図１の装置を用いて本発明の 方法により試験し、対応する重量オスモル濃度での個々の細胞からの電圧パルス を測定した。これらの手順の結果を表１に示し、そして、それぞれ測定した電圧 および真の体積に対する重量オスモル濃度（ｘ−軸）の２つの重ねたグラフとし て図９にプロットした。 ２９０ｍｏｓｍの等張の重量オスモル濃度において、パックド細胞体積技術に より決定した真の体積は９２．０ｆｌであり、測定した平均の電圧は６７０ｍＶ であった。 細胞の真の等張体積は下記式により与えられる。 体積_iso ＝電圧_iso × Ｋ_volt × Ｋ_shape （式中、電圧_iso は測定された電圧であり、そしてＫ_shape は形状補正係数であ る）。 変形すると、 Ｋ_shape ＝体積_iso ／（電圧_iso × Ｋ_volt） であり、この場合には、 Ｋ_shape ＝９２．０／（６７０×０．０９８０）＝１．４ である。 表１は他のアリコートの各々の形状補正係数Ｋ_shape を示し、そして各サンプ ルに適用されるべき係数は異なり、最大の形状補正は等張の重量オスモル濃度で 行われ、ここで、血液細胞は球形でなく両凹型形状であることを示す。注目のい ずれかの重量オスモル濃度でのＫ_shape の計算を自動化するために、形状補正関 数が必要である。次の一般関数は２つのセンサー読み値、即ち、測定される電圧 をベースとする形状補正係数を記載する。 ｆ（Ｋ_shape ）＝ｆ（ＳＲ１，ＳＲ２） （式中、ＳＲ１は既知の形状、通常には球形でのセンサー読み値（測定電圧）で あり、そしてＳＲ２は注目の重量オスモル濃度、通常には等張でのセンサー読み 値（測定電圧）である）。 分析は、これが線形関数であることを示す。 ｆ（Ｋ_shape ）＝１ ＋ 〔（ＳＲ１−ＳＲ２）／（ＳＲ１）〕× Ｋ_a （式中、Ｋ_a は装置による定数である）。Ｋ_a は次のように決定さ れる。 ２９０ｍｏｓｍの重量オスモル濃度でのＫ_shape 既知であり（上記参照）、Ｓ Ｒ１＝１４３２ｍＶ、ＳＲ２＝６７０ｍＶおよびＫ_shape ＝１．４を上記式に入 れると、 １．４＝１＋〔（１４３２−６７０）／１４３２）×Ｋ_a であり、変形すると、 Ｋ_a ＝０．７５１８である。 このＫ_a 値はこの装置において一定である。 血液サンプルの真の等張体積は、注目の等張体積の測定電圧を、ある既知また は同定可能な形状で、同一の血液サンプルの細胞の測定電圧と比較することによ り決定される。最も便利には、採用される細胞は球形であり、ここで、 体積_iso ＝電圧_iso × Ｋ_volt × ｆ（Ｋ_shape ） ＝ＳＲ２ × ０．０９８０ ×〔１ ＋〔（ＳＲ１−ＳＲ２）／ＳＲ １〕×０．７５１８〕 である。 本発明において、血液細胞が予め決められた連続浸透圧勾配に付されるときに 球形になる点は、非常に正確に決定できる。図１０ａ〜１０ｄは健康な個体から の正常血液サンプルについての結果を示す。図１０ａは重量オスモル濃度に対し て測定される電圧の三次元プロットを示し、図１０ｂはサンプルの一連の試験に ついて測定される電圧の％変化に対する重量オスモル濃度のグラフを示し、図１ ０ｃは表の形での結果を示し、図１０ｄは重量オスモル濃度に対する、平均電圧 および試験の細胞計数の重ね書きのグラフである。示すように、最初は、試験の 開始時に５０００細胞／秒である細胞計数は勾配発生機セクション２中のサンプ ルの希釈によって試験を通して減少する。平均電圧は臨界重量オスモル濃度で最 大となるまで 上昇し、ここで、血液細胞は球形になり、その後、減少する。標準的な統計技術 を用いて、図１０ｂの曲線の最大値および最大値での平均電圧は決定できる。こ の点での平均電圧は上記等式のためのＳＲ１値を与える。その後、注目の重量オ スモル濃度およびその測定電圧ＳＲ２を選択し、そしてその重量オスモル濃度で の細胞の真の体積を計算することができる。通常、等張の重量オスモル濃度を選 択し、約２９０ｍｏｓｍである。 上記試験において、２９０ｍｏｓｍにおいて、ＳＲ１＝１４３２ｍＶおよびＳ Ｒ２＝６７０ｍＶである。従って、 ｆ（Ｋ_shape ）₂₉₀ ＝１ ＋ 〔（１４３２−６７０）／１４３２〕ｘ０．７５ １８であり、 Ｋ_{shape 290} ＝１．４０ であり、それ故、 体積_iso ＝ＳＲ２×Ｋ_volt×Ｋ_shape ＝６７０×０．０９８０×１．４０ ＝９１．９２ｆｌであり、 体積_sph ＝ＳＲ１×Ｋ_volt×Ｋ_shape ＝１４３２×０．０９８×１．０ ＝１４０．３４ｆｌ である。 球形細胞の平均体積の知識により、球の半径を次のように計算することができ る。 体積_sph ＝４πｒ³／３ であり、球の半径は ｒ＝〔３ × 体積_sph ／４π〕^1/3 ｒ＝〔３ × １４０．３４／４π〕^1/3 ＝３．２２μｍ である。 体積_iso 体積_sph よび球状細胞半径を決定すると、多くの他のパラメータを計 算することができる。 １．表面積（ＳＡ） 細胞膜は特に球形から等張の範囲で非弾性であり、表面積は全ての重量オスモ ル濃度で実質的に不変であるから、表面積ＳＡはｒを下記式に代入することによ り計算されうる。 ＳＡ＝４πｒ² ＝４π（３．２２）² ＝１３０．２９μｍ² ２．体積に対する表面積の比（ＳＡＶＲ） 赤血球の壁はその表面積を変えることなく変形しうると仮定すると、いずれか の特定の形状の細胞または細胞群の表面積ＳＡが判ると、他のいずれの形状の表 面積も判り、この為、表面積の体積に対する比ＳＡＶＲはいずれの体積について も計算されうる。ＳＡＶＲは下記式により与えられる。 ＳＡＶＲ＝４πｒ ²／体積_iso ＝ＳＡ／体積_iso ＝１３０．２９／９１．９９ ＝１．４２ ３．球形指数（ＳＩ） 本発明は広く引用されているが、これまで、稀にしか測定されていない細胞の 形状の指標であるＳＡＶＲを容易に測定することができる。球形の細胞では、そ れは３／ｒの値であるが、同一の形状であるが、異なるサイズの細胞は異なるＳ ＡＶＲ値を有しうるので、細胞サイズに無関係の無次元の球形指数を用いること が望ましく、それは下記式により示される。 ＳＩ＝ＳＡＶＲ × ｒ／３ ＝１．５２ ＝１．４２ ×３．２２／３ ４．細胞直径（Ｄ） 正常な細胞が等張の重量オスモル濃度で両凹型ディスクの形態であるときに、 この両凹型ディスクの半径に対する球の半径の比は０．８１５５であることが判 っている。これを基礎として、それ故、両凹型ディスクの形態の細胞の直径Ｄは 下記式により与えられる。 Ｄ＝２ｒ／０．８１５５ ＝２×３．２２／０．８１５５ ＝８．１９μｍ 同一のパラメータは全ての他の重量オスモル濃度について決定されうる。細胞 直径の頻度分布は、分散統計および頻度分布プロットの両方として与えられる。 本発明はプライス−ジョーンズ曲線として知られている等張の細胞直径の頻度分 布のプロットの既知のマニュアル手順の自動バージョンを提供する。本発明は、 いずれかの形状、特に、等張の細胞、球形の細胞およびゴースト細胞（いずれか の重量オスモル濃度で）についての細胞直径のプライス−ジョーンズ曲線を作る ことができ、そして、通常、２５０，０００個の細胞をベースとする。これを図 １０に示す。 ５．細胞厚さ（ＣＴ） 細胞が両凹型ディスクの形態であるときに、細胞厚さの適切な測定値は断面積 および体積から誘導されうるものである。断面積は、勿論、球形の形態の細胞の 半径から得ることができる。細胞の厚さは、それ故、次の通りに計算されうる。 ＣＴ＝体積_iso ／πｒ² ＝９１．９２／π３．２２² ＝２．８２μｍ ６．１ミリリットル当たりの表面積（ＳＡｍｌ） 表面積（ＳＡ）と細胞計数（ＲＢＣ）との積は生理的交換のために得られる１ ミリリットル当たりの表面積（ＳＡｍｌ）である。体液の酸−塩基調節を担う近 位腎臓管の全表面積は５ｍ² である。酸−塩基バランスの調節においても重要な 役割を担う赤血球細胞の総表面積は４５７２ｍ² であり、ほぼ３桁大きい。ＲＢ Ｃは希釈された血液サンプルの流速、各サンプルの細胞計数および初期の全血液 サンプルの希釈度の知識から内部的に計算される。通常、ＲＢＣは約４．２９× １０⁹ 赤血球細胞／ｍｌである。 ＳＡｍｌ＝ＳＡ × ＲＢＣ（ｍｌ当たり） ＝１３０．２９μｍ² ×４．２９×１０⁹ ＝０．５６ｍ2 ｍｌ^{- 1} ７．細胞透過性（Ｃｐ） 図１２の重量オスモル濃度に対する細胞体積のプロットは、重量オスモル濃度 が減少するにつれて細胞体積がどのように変化するかを示す特性曲線を示し、そ して膜を横切る最大流速および最小流速および特定のまたは一連の浸透圧に帰因 した流速を示す。多くの細胞の透過性測定は、主として、異なる圧力での細胞の 体積の変化によるものである。表２は本発明の方法により得られた体積測定およ び各ｍｏｓｍでの体積の変化を示す。このような表は連続関数から自動的に計算 され、そして通常、ユーザーは見ることがない。結果は、図１３の浸透圧に対す る正味の流体交換のグラフとしてプロットされて示される。 浸透圧（Ｐ_osm ）、細胞体積、表面積（ＳＡ）および他の関連環境ファクター の測定値を得ると、多くの細胞の透過性の測定値を得ることができる。 ａ）Ｃｐ速度 透過性のこの係数は、特定の圧力に応答して１平方メートルの膜を横切る流体 の速度を測定する。全ての正の速度は細胞中への正味の流れを示し、全ての負の 速度は細胞からの正味の流れを示す。速度は以下の通りに決定される。 Ｃｐ速度＝Δ細胞体積／ΔＰ_osm ／ＳＡ （Ｓ．Ｔ．Ｐ） 表２および図１３からの個別の値を用いて、２００〜１４１ｍｏｓｍの間のＣ ｐ速度は以下のように与えられる。 Ｃｐ速度_290.141 ＝（１３９．９４−９３．９８）／（１４１−２９０）／１３ ０．２９μｍ² ＝４５．９６ｆｌ／１４９ｍｏｓｍ／１３０．２９ ＝２．３６×１０^{- 3} ｆｌ／ｍｏｓｍ／μｍ² ＝２．３６×１０⁹ ｆｌ／ｍｏｓｍ／ｍ² ＝２．３６ｍｌ／ｍｏｓｍ／ｍ² ｂ）透過性定数ｐｋ_n 透過性測定値のこのセットは正味の透過速度が０である各圧力を記載するもの であり、ｐｋ₀ 、ｐｋ₁ 、・・・ｐｋ_n と番号付けされる。 （ｉ）ｐｋ₀ は細胞が一体性を失うことなく受けることができる最小の絶対圧（ 低張圧）と一致し、図１２に示している。ｐｋ₀ での１ミリオスモル／ｋｇの１ ／１０（０．０００１気圧）での圧力変化は１〜２桁の大きさの透過性の変化を 生じ、ｐｋ₀ は明らかであり、非常に再現性のある測定値である。 （ｉｉ）ｐｋ₁ は若干低張圧で体積的に調節することができる細胞の能力の測定 値であり、これも図１２に示す。特定の圧力に後に、細胞は浸透圧力に抗するこ とができず、細胞の体積の変化をもたらす。ｐｋ₁ はこの調節を行うことができ る細胞の能力の測定値を提供し、それにより、細胞の最大ポンプ輸送能を測定す る。 （ｉｉｉ）ｐｋ₂ はｐｋ₁ から得られるものであり、高張圧において体積調節す ることができる細胞の能力の測定値であり、インビボの静圧における通常の細胞 （示していない）と比較して、低い差圧で起こる。 透過性定数ｐｋ_n は下記式により記載される。 Ｐｋ_n ＝ΔＰ_osm ／ＳＡ （Ｓ．Ｔ．Ｐ） ｐｋ₀ を計算するときに、ΔＰ_osm ＝（等張圧）−（正味の流量が０である圧 力）である。 ｐｋ₁ を計算するときに、ΔＰ_osm ＝（等張圧）−（正味の正の流速が始まる 最初の低張圧）である。ｐｋ₂ の計算（示していない）はｐｋ₁ と同一であるが 、但し、ΔＰ_osm は正味の正の流量が０でない最初の低張圧である。 表２および図１３の別個の値を用いて、 ｐｋ₀ ＝１４１．５ｍｏｓｍｋｇ^{- 1} ／１３０−２９μｍ² ＝１．０８６ ｃ）ＣＰΔ この無次元の値はいずれかの２つのＣｐ速度の比較であり、そして２つの圧力 の間で細胞膜を横切る流体の正味の量として記載される。それは体積に独立であ り、そして圧力に関係する透過速度の比較を提供する。この測定値は数分から数 カ月にわたる同一の個体における透過性の変化を比較するために用いることがで きる。 上記のＣｐ速度から、Ｃｐ速度_290.141 ２．４１ｍｌ／ｍｏｓｍ／ｍ² と決定 した。 ＣｐΔ＝（Ｃｐ速度１−Ｃｐ速度２／Ｃｐ速度２） ×１００ ＣｐΔ＝（２．４１−２．３６）／２．３６ ×１００ ＝２．０７％変化 ｄ）Ｃｐ_max これは細胞膜を横切る流れの最大流速である。殆どの場合、２つの最大値があ り、１つは正（細胞中へ流れる正味の流れ）および１つは負（細胞から出てくる 正味の流れ）であり、ｐｋ₀ の両側にある。Ｃｐ_max は重量オスモル濃度に対す る細胞体積の変化の連続曲線の正および負の最大の傾きを検知することにより決 定される。結果から細胞中に入るＣｐ_max は＋０．６７０ｆｌ／ｍｏｓｍであり 、そして細胞から出るＣｐ_max は−０．７２２ｆｌ／ｍｏｓｍである。 ｅ）膜構造抵抗（ＭＳＲ） これは水の中に向かう流れまたは外に向かう流れに抗する細胞内の構造力の測 定値である。それは、Ｃｐ_max の、全ての他の０でない細胞内への流速に対する 比により決定される。膜は全ての圧力において理論的に等しく透過性であるので 、ｐｋ₁ 〜ｐｋ₂ の圧力範囲外の最大の流速からの変化は機械力によるものであ る。Ｃｐ_rateが０に近づくときに、ＭＳＲは∞に近づき、その為、膜が耐えられ る異常の歪みを生じるから、ｐｋ₀ は細胞膜の全体の機械限界であることが明ら かである。 ＭＳＲ＝ＣＰ_max ／ＣＰ_rate×１００％ ｆ）Ｃｐｍｌ これは全組織もしくは全体の体、または組織もしくは血液の単位体積当たりの 個体に与えられる生理学的透過性の測定値であり、以下の通りに計算される。 ＣＰｍｌ＝Δ細胞体積／ΔＰ_osm ／ｍ³ ／全血液ｍｌ 上記の計算から、１ｍｌ中、１３０．２９μｍ² の表面積およびＳＡｍｌ＝０ ．５６ｍ²ｍｌ^{- 1} で４．２９×１０⁹ 個の赤血球細胞がある。 例えば、Ｃｐ_max において、細胞中に入る流速は０．６７７ｆｌ ／１３０．２９μｍ² ＝５．２０×１０^{- 3} ｆｌ／μｍ² であった。 このように、１ｍｌの全血液では、膜を横切る流体の正味の体積は＝５．２０ ×１０^{- 3} ｆｌ／μｍ² ×０．５５９×１０¹²μｍ²／ｍｌ＝２．９１ｍｌ／全 血液ｍｌ ｈ）Ｃｐ_net Ｃｐ_net は単位時間にわたって標準温度および圧力で単位面積の膜を流体が横 切ることができる速度として規定され、そして透過性係数の圧力に無関係の測定 値であり、下記等式により与えられる。 ＣＰ_net ＝（体積_sph −体積_iso ）／ＳＡ ＝（１４０．３４−９１．９２）／１３０．２９ ＝０．３７２ ＝３．７２ｍｌｍ^{- 2} である。 図１４はＨｂＣＣの病気の患者からのサンプルの三次元頻度分布を示す。示す ように、プロットは非常に異常である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 シャイン，イアン バジル アメリカ合衆国，ニューヨーク 10025, ニューヨーク，セントラル パーク ウエ スト 444

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．液体媒質中に懸濁した細胞サンプルの試験方法であって、前記細胞は液体 媒質の性質とは明確に異なる少なくとも１つの測定可能な性質を有し、前記サン プルは細胞サンプルの細胞透過性の測定値を決定するための分析に付され、 （ａ）サンプル細胞の懸濁液の第一アリコートをセンサーに通すこと、 （ｂ）細胞の懸濁液の第一アリコートについての前記少なくとも１つの性質を測 定すること、 （ｃ）細胞の第一アリコートについての前記性質の測定値を記録すること、 （ｄ）サンプル細胞の懸濁液の第二アリコートに対して、細胞膜を横切る流体の 流れを生じさせることができる、細胞環境の少なくとも１つのパラメータを変更 して、それにより、細胞の少なくとも１つの性質を変えること、 （ｅ）前記第二アリコートをセンサーに通すこと、 （ｆ）変更した環境下において、細胞の懸濁液の前記少なくとも１つの性質を測 定すること、 （ｇ）細胞の第二アリコートについての前記少なくとも１つの性質の測定値を記 録すること、 （ｈ）工程（ｃ）および（ｇ）から得られたデータを、細胞環境の前記変更の程 度および前記少なくとも１つの性質の記録された測定値の変化の関数として比較 し、サンプルの細胞透過性の測定値を決定すること、 の工程を含む、方法。 ２．液体媒質の性質とは異なる細胞の性質は、細胞の体積に関係 する性質であり、細胞の透過性の測定値は、変更した環境に応答して、サンプル 細胞膜を横切る流体の体積の測定値を得ることにより決定される、請求項１記載 の方法。 ３．流体に細胞膜を横切らせ、それにより、細胞体積の変化を生じさせるため に崩壊剤が用いられる、請求項１または２記載の方法。 ４．サンプル懸濁液を連続の浸透圧勾配に付す、請求項１〜３のいずれか１項 記載の方法。 ５．測定値が細胞毎に記録される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。 ６．Ｃｐ速度が細胞透過性の測定値として決定される、請求項１〜５のいずれ か１項記載の方法。 ７．透過性係数ｐｋ_n が細胞透過性の測定値として決定され、ｎは正の整数で ある、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。 ８．ＣｐΔが細胞透過性の測定値として決定される、請求項１〜５のいずれか １項記載の方法。 ９．ＣＰ_max が細胞透過性の測定値として決定される、請求項１〜５のいずれ か１項記載の方法。 １０．膜構造抵抗ＭＳＲが細胞透過性の測定値として決定される、請求項１〜 ５のいずれか１項記載の方法。 １１．Ｃｐｍ１が細胞透過性の測定値として決定される、請求項１〜５のいず れか１項記載の方法。 １２．請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法により、血液サンプルを試験 する工程を含む、血液バンクに保存された血液の生存性を決定するための方法。