JP2000500348A - 血液凝固第▲ｖｉｉｉ▼因子および第▲ｉｘ▼因子のアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 突然変異した組織因子を利用して、第VIII因子および第IX因子を含む血液凝固因子の存在を検出するためのアッセイを開発した。野生型組織因子およびさまざまな形態の末端切断型組織因子の突然変異型を用いることができる。165位、166位、または165および166位のアミノ酸が、グルタミン、アラニン、グルタミン酸、またはこれらの組み合わせによって置換されるのが好ましい。さまざまな組織因子突然変異体は、FVIIIおよびFIXの活性化の補助において異なる強さの活性を示し、その強さは、Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶＞A¹⁶⁵A¹⁶⁶＞E¹⁶⁵E¹⁶⁶の順である。

Description

【発明の詳細な説明】 血液凝固第VIII因子および第IX因子のアッセイ 発明の属する技術分野 本発明は、血液凝固因子の検出の分野に関する。 発明の背景 最近最も広く用いられている血漿凝血因子の全体の状態を測定するための凝血 アッセイは、プロトロンビン時間試験（PT試験）および活性型部分トロンビン・ プラスチン時間試験（aPTT）である。PT試験およびaPTT試験はどちらも、未加工 の凝血活性化因子に基づくものである。組換え組織因子（TF）に基づくトロンボ プラスチン試薬でさえも、その凝血促進能力については、未加工の脳抽出物を模 倣するように作られている。最近、組換え可溶性組織因子が活性型第VII因子（ “第VIIａ因子”または“FVIIa”）を特異的に測定するためのアッセイに有用で あることがMorrisseyにより開示された。米国特許第5,472,850号。 プロトロンビン時間試験（PT試験）は、血液凝固系の臨床試験に広く使われて いる。PT試験は、典型的には、クエン酸塩を加えた血漿サンプルにトロンボプラ スチンおよびカルシウムイオン源を加えることにより行う。カルシウムイオンを 添加してから血餅の形成が検出されるまでに経過した時間を測定する。トロンボ プラスチンは、典型的には組織因子活性を含む未加工の組織抽出物（脳、肺およ び/または胎盤）を指す。さらに最近になって、組換えヒト組織因子（リン脂質 小胞中に再構成されるもの）が、未加工のトロンボプラスチン製剤の代わりとし て利用可能となった。このようなアッセイにおいて加えるトロンボプラスチンの 量は、正常な血漿サンプルが典型的には約12〜15秒で血餅を形成するように調整 される。実際の時間は、ある程度まで、使用する血餅形成検出法に依存する。PT アッセイは、凝固タンパク質の異常（遺伝的および後天的）の一般的なスクリー ニング試験として、また、経口凝固療法をモニターするために日常的に用いられ る。凝固時間の延長は凝固障害または抗凝固治療の有効性を示している と考えられる。 PT試験は、試験を行う血漿中に存在する以下の凝血因子、すなわち、第VII因 子、第Ｘ因子、第Ｖ因子、プロトロンビンおよびフィブリノーゲンに依存する。 これらのファクターのいずれかが存在しないまたは重大に不足している場合、PT は延長される。経口抗凝固療法（クマジンおよびその類似物）は、ビタミンＫの 作用を遮断し、血漿中のビタミンＫ依存性タンパク質のレベルを抑制する。PTに 影響を与えるビタミンＫ依存性タンパク質は、第VII因子、第Ｘ因子およびプロ トロンビンである。 正常な止血に必要であるがPT試験によって測定されない凝血因子がさらに二つ ある。すなわち、第VIII因子(“FVIII”)および第IX因子(“FIX”)である。トロ ンボプラスチンを高度に希釈するとPT試験における第VIII因子および第IX因子に 対する感受性がいくらか増加することが報告されているが、この方法は凝血時間 が非現実的な程長いためほとんど使用されていない。これらの因子を試験するた めに、別の通常おこなわれる凝血試験（活性型部分トロンボプラスチン時間（aP TT）として知られる）が行われる。aPTT試験は、典型的には、クエン酸塩を加え た血漿サンプルにaPTT試薬およびカルシウムイオン源を加えることにより行う。 カルシウムイオンを加えてから血餅の形成が検出されるまでに経過した時間を測 定する。典型的には、aPTT試薬はリン脂質小胞（セファリン）および凝血の接触 経路の活性化物質の混合物からなる。通常用いられる活性化物質は、カオリンま たはエラグ酸である。 aPTT試験は血漿中の以下の凝血因子、すなわち、第XI因子、第XII因子、第VII I因子、第IX因子、第Ｘ因子、第Ｖ因子、プロトロンビンおよびフィブリノーゲ ンの存在に依存する。第VIII因子および第IX因子の欠乏のスクリーニングに加え て、aPTT試験はしばしばヘパリン治療のモニターおよび狼瘡抗凝血薬のスクリー ニングに用いられる。第XI因子の欠乏はまれに出血傾向を伴うことがあるが、第 XII因子または他の接触経路の上流部分の因子のいずれかの欠乏が出血傾向を引 きおこすことは全くない。したがって、aPTTの延長は、個体が臨床的に問題とな る凝血の異常を有していることを意味することもあるし、反対に、個体が接触因 子の中の一つについて臨床的に重要でない欠乏を有していることを 意味することもある。 PTまたはaPTTのいずれかで延長がみられた場合には、それに続けて、ある一つ の因子の欠乏が原因となっているのかを決定するために特定の凝血因子のアッセ イをおこなってもよい。また、それに続けて、凝血阻害剤（たとえば、狼瘡抗凝 血薬、ヘパリン等）が原因となっているのかを決定するために特殊な試験を行う こともできる。 しかしながら、それでもまだ、正常な止血に必要であることが知られている他 の凝血因子に特異的なアッセイの必要性が存在する。具体的には、日常的なスク リーニングにおける二つまたはそれ以上の凝血アッセイ（PTおよびaPTT）の必要 性をなくすために、第VIII因子および第IX因子を直接測定するアッセイが必要で ある。直接的なアッセイにより、実際には正常な止血に関与しないいくつかの血 漿因子に対してaPTTが感受性であるという事実により生じる問題が排除されるで あろう。 また、ワルファリンまたはヘパリン治療に対するPTアッセイの感受性を変える ことも望まれている。 組織因子中の二つのリシン残基（残基165および166）のアラニンへの突然変異 が、その結果としてできる組織因子-第VIIa因子複合体の、第Ｘ因子を活性化す る能力を大きく減少させることがRoyらにより報告された。Roy，et al.，J Biol Chem 266:22063-22066(1991)。それに続いて、Rufらは同じ突然変異を行い、突 然変異体組織因子-第VIIa因子複合体の第Ｘ因子の活性化に対するkmが増加する ことを報告した。彼らは、これらの残基が第Ｘ因子に結合するか、あるいは、こ れらの残基が第VIIIa因子に結合してその第Ｘ因子への親和性に影響を与えてい るかのどちらかであると結論した。Ruf，et al.，J Biol Chem 267:6375-6381(1 992a)。Rufらによるその後の論文においては、これらの二つの残基およびそれら の周囲のいくつかの残基の両方をアラニンに突然変異させた。彼らは、この領域 におけるいくつかの異なる突然変異により、その結果得られる組織因子-第VIIa 因子複合体の第Ｘ因子の活性化能力が減少することを示した。Rufらはまた、第I X因子欠乏血漿を用いたいくつかの凝血アッセイの結果についても報告た。Ruf， et al.，J Biol Chem 267:22206-22210(1992b)。 ここで、165位および/または166位を突然変異させた遺伝的に変化させた組織 因子を用いる第VIII因子および第IX因子に対する特異的なアッセイが見いだされ た。組織因子のリシン165および166をアラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）または グルタミン酸（Ｅ）に突然変異させると、その結果得られる組織因子-第VIIa因 子複合体の第Ｘ因子を活性化する能力は大きく減少する。各種の置換は第Ｘ因子 の活性化に対して異なる効果をもたらす。減少効果は、グルタミン酸＞アラニン ＞グルタミンの順に大きい。これらの同じ突然変異は、その結果得られる組織因 子-第VIIa因子複合体の第IX因子を活性化する能力をも同様に減少させる。しか しながら、効果の大きさは第Ｘ因子に関して報告されたものよりもはるかに小さ い。これは、特にリシン165および166がグルタミンによって置き換えられた組織 因子突然変異体（TF-Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶）において当てはまる。 さらに、野生型TFの凝血時間が正常の血漿と第VIII因子または第IX因子欠乏血 漿とでほとんど同じであるような条件下で、TF-Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶の凝血時間は第VIII因 子または第IX因子欠乏血漿中で顕著に延長される。そこで、出血傾向に関係する ことが知られている全ての凝血因子を測定するためのPTに類似した凝血アッセイ をここで開示する。 別の実施態様において、組織因子の154、159、163、164、178、180、201また は204位においてアミノ酸が置換された突然変異した組織因子試薬を開示する。 この試薬はまた第IX因子または第VIII因子のアッセイにも有用となろう。 図面の簡単な説明 図１は、第IX因子欠乏血漿を正常な血漿とさまざまな比率で混合して用いた（ X-軸に“欠乏血漿のパーセンテージ”として示した）凝血アッセイにおけるTF-Q¹⁶⁵ Q¹⁶⁶（四角形）および野生型TF（丸）の凝血時間を表す折れ線グラフである 。凝血時間は、50μlのTF溶液、50μlのクエン酸塩を加えたヒト血漿(正常な血 漿および第IX因子欠乏血漿のさまざまな割合の混合物からなる)、および50μlの 25mM塩化カルシウム溶液を混合することにより37℃で測定した。血餅形成までの 時間は塩化カルシウム溶液を加えた時間から測定した。野生型TFでは、TF溶液は 20%ホスファチジルセリンおよび80%ホスファチジルコリンからなる小胞に再構成 された14ng/mlのTFからなるものであった。TF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶では、TF溶液は20%ホス ファチジルセリンおよび80%ホスファチジルコリンからなる小胞に再構成された １μg/mlのTF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶からなるものであった。 図２は、第VIII因子欠乏血漿を正常な血漿とさまざまな比率で混合して用いた (X-軸に“欠乏血漿のパーセンテージ”として示した）凝血アッセイにおけるTF- Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶（四角形）および野生型TF（丸）の凝血時間を表す折れ線グラフである 。凝血時間は、50μlのTF溶液、50pμlのクエン酸塩を加えたヒト血漿(正常な血 漿および第VIII因子欠乏血漿のさまざまな割合の混合物からなる)、および50μl の25mM塩化カルシウム溶液を混合することにより37℃で測定した。血餅形成まで の時間は塩化カルシウム溶液を加えた時間から測定した。野生型TFでは、TF溶液 は20%ホスファチジルセリンおよび80%ホスファチジルコリンからなる小胞に再構 成された14ng/mlのTFからなるものであった。TF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶では、TF溶液は20%ホ スファチジルセリンおよび80%ホスファチジルコリンからなる小胞に再構成され た１μg/mlのTF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶からなる。 図３は、第Ｘ因子欠乏血漿を正常な血漿とさまざまな比率で混合して用いた(X -軸に“欠乏血漿のパーセンテージ”として示した)凝血アッセイにおけるTF-Q^{16 5} Q¹⁶⁶（四角形）および野生型TF（丸）の凝血時間を表す折れ線グラフである。 凝血時間は、50μlのTF溶液、50μlのクエン酸塩を加えたヒト血漿(正常な血漿 および第Ｘ因子欠乏血漿のさまざまな割合の混合物からなる)、および50μlの25 mM塩化カルシウム溶液を混合することにより37℃で測定した。血餅形成までの時 間は塩化カルシウム溶液を加えた時間から測定した。野生型TFでは、TF溶液は20 %ホスファチジルセリンおよび80%ホスファチジルコリンからなる小胞に再構成さ れた14ng/mlのTFからなるものであった。TF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶では、TF溶液は20%ホスフ ァチジルセリンおよび80%ホスファチジルコリンからなる小胞に再構成された１ μg/mlのTF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶からなるものであった。 図４は、第VII因子欠乏血漿を正常な血漿とさまざまな比率で混合して用いた( X-軸に“欠乏血漿のパーセンテージ”として示した）凝血アッセイにおけるTF-Q¹⁶⁵ Q¹⁶⁶（四角形）および野生型TF（丸）の凝血時間を表す折れ線グラフである 。凝血時間は、50μlのTF溶液、50μlのクエン酸塩を加えたヒト血漿(正常な血 漿および第VII因子欠乏血漿のさまざまな割合の混合物からなる)、および50μl の25mM塩化カルシウム溶液を混合することにより37℃で測定した。血餅形成まで の時間は塩化カルシウム溶液を加えた時間から測定した。野生型TFでは、TF溶液 は20%ホスファチジルセリンおよび80%ホスファチジルコリンからなる小胞に再構 成された14ng/mlのTFからなるものであった。TF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶では、TF溶液は20%ホ スファチジルセリンおよび80%ホスファチジルコリンからなる小胞に再構成され た１μg/mlのTF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶からなるものであった。 図５は、第Ｖ因子欠乏血漿を正常な血漿とさまざまな比率で混合して用いた(X -軸に“欠乏血漿のパーセンテージ”として示した)凝血アッセイにおけるTF-Q^{16 5} Q¹⁶⁶（四角形）および野生型TF（丸）の凝血時間を表す折れ線グラフである。 凝血時間は、50μlのTF溶液、50μlのクエン酸塩を加えたヒト血漿(正常な血漿 および第Ｖ因子欠乏血漿のさまざまな割合の混合物からなる)、および50μlの25 mM塩化カルシウム溶液を混合することにより37℃で測定した。血餅形成までの時 間は塩化カルシウム溶液を加えた時間から測定した。野生型TFでは、TF溶液は20 %ホスファチジルセリンおよび80%ホスファチジルコリンからなる小胞に再構成さ れた14ng/mlのTFからなるものであった。TF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶では、TF溶液は20%ホスフ ァチジルセリンおよび80%ホスファチジルコリンからなる小胞に再構成された１ μg/mlのTF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶からなるものであった。 図６は、TF-FVIIaによるFXの活性化を表す棒グラフである。80%ホスファチジ ルコリンおよび20%ホスファチジルセリンの混合物（PCPS）の小胞に再脂溶化 されたTFを用いたアッセイ（塗りつぶした棒）では、反応条件は、150nMのFX、1 nMのTFを10-14μMのPCPSに混合したもの、10pMのFVIIaである。純粋なホスファ チジルコリン（“PC”）小胞に再脂溶化されたTFを用いたアッセイ（斜線をつけ た棒）では、反応条件は、１μMのFX、1nMのTFを9-13μMのPCに混合したもの、1 00pMのFVIIaである。値は、FX活性化の平均の初速度を表し、野生型TFにおいて 観察される速度に標準化されたものである(PCPSおよびPC中の野生型TFに対して それぞれ、100%＝319±7M/分/Mおよび100%＝41±0.7M/分/M)。誤差の線は三つの 独立した実験について計算したSEMを示す。 図７は、TF-FVIIaによるFIXの活性化を表す棒グラフである。反応条件は、150 nMのFIX、1nMのTFを10-14μMのPCPS中に混合したもの、50pMのFVIIaである。値 は、FIX活性化の平均初速度を表し、野生型TFにおいて観察される速度に標準化 されたものである(100%＝127±7M/分/M).。誤差の棒は三つの独立した実験につ いて計算したSEMを示す。 図8a-図8cは、野生型TFの配列表である。 詳細な説明 本明細書において、第VIII因子および/または第IX因子の欠乏を測定するのに 適したアッセイについて報告する。 発明の実施に際して、組織因子（TF）の型は、突然変異させたもの（“突然変 異組織因子”）を用い、なかでも、165および166位において突然変異させたもの （以後はTF^165,166と呼ぶ）が好ましい。天然の、または野生型の、TF（核酸配 列、配列番号１；アミノ酸配列、配列番号２）は、これらの位置にアミノ酸リシ ン（LysまたはＫ）を含む。発明を実施する場合、TFのK¹⁶⁵およびＫ¹⁶⁶の両方の 残基のアラニン(AlaまたはA)、グルタミン酸（GluまたはＥ）またはグルタミン （GlnまたはＱ）への突然変異（K¹⁶⁵からQ¹⁶⁵＝配列番号３；K¹⁶⁵からA¹⁶⁵＝配 列番号４； K¹⁶⁵からE¹⁶⁵＝配列番号５； K¹⁶⁶からQ¹⁶⁶＝配列番号６； K¹⁶⁶か らA¹⁶⁶＝配列番号７； K¹⁶⁶からE¹⁶⁶＝配列番号８； K¹⁶⁵K¹⁶⁶からQ¹⁶⁵Q¹⁶⁶＝配 列番号； K¹⁶⁵K¹⁶⁶からQ¹⁶⁵A¹⁶⁶＝配列番号10； K¹⁶⁵K¹⁶⁶からA¹⁶⁵Q¹⁶⁶＝配列番 号11； K¹⁶⁵K¹⁶⁶からQ¹⁶⁵E¹⁶⁶＝配列番号12； K¹⁶⁵K¹⁶⁶からE¹⁶⁵Q¹⁶⁶＝配列番号 13； K¹⁶⁵K¹⁶⁶ からA¹⁶⁵A¹⁶⁶＝配列番号14； K¹⁶⁵K¹⁶⁶からA¹⁶5E¹⁶⁶＝配列番号15； K¹⁶⁵K¹⁶⁶か らE¹⁶⁵A¹⁶⁶＝配列番号16； およびK¹⁶⁵K¹⁶⁶からE¹⁶⁵E¹⁶⁶＝配列番号17）は、FVI Iaに仲介されるFXおよび第IX因子（FIX）の活性化の補助に対して効果的である 。それぞれのTF突然変異体は、FVIIaへの結合およびFVIIaのアミド分解活性の促 進に関してはどちらも野生型TFと同等の効果を有するが、FIXおよびFXの活性化 の補助に関しては著しく劣っている。特に、Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶、A¹⁶⁵A¹⁶⁶およびE¹⁶⁵E¹⁶⁶ に関しては、これら三つの突然変異体は全てFIXおよびFXの活性化の補助におい て著しく劣っており、とりわけ、FXの活性化速度はFIXの活性化速度よりも大き く減少することが示された。どちらの反応においても、TF突然変異体は異なる程 度の活性：Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶＞A¹⁶⁵A¹⁶⁶＞E¹⁶⁵E¹⁶⁶を示す。TF^165,166は、実施例１の方 法で作ることができる。 TFは、内在性タンパク質であって、血漿セリンプロテアーゼ、FVIIaの必須の タンパク質補因子である。TFとFVIIaとの細胞表面複合体（TF-FVIIa）は、凝血 カスケードの最初の酵素であり、正常な止血および血栓疾患のいずれにおいても 血液凝固の開始に関与している。Carson，S.D．and Brozna，J.P.，Blood Coag Fibrinol 4:281-292(1993)。TF-FVIIa複合体に対する天然の基質は、セリンプロ テアーゼチモーゲン、FVII、FIX、およびFXである。 本発明の、改変した、または“突然変異させた組織因子”は、突然変異させた 全長組織因子または突然変異させた末端切断型組織因子を突然変異させたもので あってもよい。報告された末端切断型組織因子には、野生型組織因子の膜貫通ド メイン全体を含まないもの、および野生型組織因子の細胞質ドメイン全体を含ま ないものが含まれる。膜に拡がったドメインは、以前に、拡がった(spanning)ア ミノ酸は220-242として同定されている。Morrisseyら、「Molecular cloning of the cDNA for tissue factor，the cellular receptor for the initiation of the coagulation protease cascade」、Cell 50:129-135(1987)。Morrisseyらは 、Blood 81(3):734-744において、アミノ酸1-219を有する可溶性組織因子（核酸 配列、配列番号18およびアミノ酸配列、配列番号19）を、活性化された第VII因 子のアッセイに利用した。アミノ酸1-243を有し、細胞質側末端部分を欠く組換 え組織因子について、Paborskyらが、J Biol Chem 266:21911-16（1991）に記載 し ている。突然変異組織因子の長さは重要であるとは考えられず、本文献に記載さ れるような末端切断型の組織因子で、さらに165位、166位、または好ましくはそ の両方のいずれかの位置に突然変異を有するものが、本発明のアッセイにおいて 機能すると予想される。たとえば、配列番号18の可溶性組織因子の、K¹⁶⁵または K¹⁶⁶、またはその両方の位置がＱ、Ａ、またはＥに突然変異したものである（K^{1 65} からQ¹⁶⁵＝配列番号20； K¹⁶⁵からA¹⁶⁵＝配列番号21； K¹⁶⁵からE¹⁶⁵＝配列番 号22； K¹⁶⁵からQ¹⁶⁶＝配列番号23； K¹⁶⁶からA¹⁶⁶＝配列番号24； K¹⁶⁶からE^{16 6} ＝配列番号25； K¹⁶5K¹⁶⁶からQ¹⁶⁵Q¹⁶6＝配列番号26； K¹⁶⁵K¹⁶⁶からQ¹⁶⁵A¹⁶⁶ ＝配列番号27； K¹⁶⁵K¹⁶⁶からA¹⁶⁵Q¹⁶⁶＝配列番号28： K¹⁶⁵K¹⁶⁶からQ¹⁶⁵E¹⁶⁶＝ 配列番号29： K¹⁶⁵K¹⁶⁶からE¹⁶⁵Q¹⁶⁶＝配列番号30； K¹⁶⁵K¹⁶⁶からA¹⁶⁵A¹⁶⁶＝配 列番号31； K¹⁶⁵K¹⁶⁶からA¹⁶⁵E¹⁶⁶＝配列番号32； K¹⁶⁵K¹⁶⁶からE¹⁶5A¹⁶⁶＝配列 番号33；K¹⁶⁵K¹⁶⁶からE¹⁶⁵E¹⁶⁶＝配列番号34）。さらに、本文献に記載される末 端切断型から長さを少し変えても（２〜５のアミノ酸を加えるか減じるかしても ）活性に影響を与えないと予想される。たとえば、末端切断型突然変異組織因子 では、配列は、配列番号１の約-5から約５のアミノ酸から開始、約214から約248 で終結して良い。同様に、野生型組織因子では、配列は、配列番号１の約-5から 約５のアミノ酸から開始し、約258から約268で終結して良い。好適な長さは、対 照用の血漿を用いた標準的な凝血アッセイを使い、凝血が容易に測定できる時間 の範囲内、好ましくは10から30秒で起こるように決定することにより、容易に試 験することができる。 選択された組織因子配列の突然変異は、165位または166位、または好ましくは 165位および166位の両方の位置で行うことができる。元のアミノ酸、リシン（Ly sまたはＫ）の他のいかなるアミノ酸への置換によっても、通常凝血アッセイに 用いられるトロンボプラスチン試薬よりも優れた試薬が製造されると考えられる 。たとえば、野生型の組織因子に関しては、配列番号35におけるK¹⁶⁵の置換、配 列番号36におけるK¹⁶⁶の置換、配列番号37におけるK¹⁶⁵K¹⁶⁶の置換；そして、末 端切断型組織因子に関しては、配列番号38におけるK¹⁶⁵の置換、配列番号39にお けるK¹⁶⁶の置換、配列番号40におけるK¹⁶⁵K¹⁶⁶の置換である。好ましくは、一方 または両方の位置が、グルタミン(glnまたはＱ)、アラニン（ala またはＡ）またはグルタミン酸（gluまたはＥ）により置換される。最も好まし い置換はアミノ酸グルタミン（glnまたはＱと略記する）によるものである。165 および166位の置換は相加的であると考えられるので、両方の位置がＱで置換さ れる(すなわち、QQ)のが最も好ましいが、たとえば、QA、AQ、QE、EQ、AA、AE、 EA、EEような組み合わせ、およびＱ、Ａ、またはＥ以外のアミノ酸との組み合わ せも同様に好ましいと考えられる。 組織因子の他の位置における突然変異によっても、凝血アッセイにおける第IX 因子への依存性が増加した組織因子を得ることができると考えられる。これらは 、154位のスレオニン、159位のリシン、163位のセリン、164位のグリシン、178 位のアスパラギン酸、180位のアスパラギン酸、201位のリシンおよび204位のア スパラギン酸である。これらの位置においては元のアミノ酸をいかなるアミノ酸 置換により変えても良いが、Ｑ、ＡまたはＥが好ましく、たとえば、配列番号１ の野生型組織因子では配列番号41および配列番号18の末端切断型可溶性組織因子 では配列番号42が挙げられる。これらの突然変異を行うために用いる方法論は、 実施例１の基本的なプロトコールにより、別の位置の突然変異を行うために、当 業者が容易になし得る範囲の修正を加えたものである。 本発明に有用な突然変異組織因子試薬は、凝血アッセイにおいて、粗抽出物、 または再脂溶化した組換え組織因子のいずれかからのトロンボプラスチン試薬に 代わる試薬として採用することができる。突然変異組織因子試薬をその代わりに 使用することが可能な、商業的に入手可能なトロンボプラスチン試薬は、Thombo rel S（Behringwerke AG，Marburg、ドイツ）のようなヒト・トロンボプラスチ ン；Recombiplastin（Ortho Diagnostic System）またはInnovin（Baxter）のよ うなヒト・トロンボプラスチン(組換え)、トロンボプラスチン、カタログ＃ T-0 263(Sigma Chemical Co.，St．Louis MO.)のようなウサギ・トロンボプラスチン である。PTおよびaPTTおよびその改変のような凝血アッセイの手順は、当業界で は周知である。この試薬はまた、終了点として凝血の代わりにクロモゲンまたは フルオロゲン基質の加水分解を用いた凝血のアッセイにも有用であろう。このよ うなアッセイに突然変異組織因子試薬を用いることにより、そのアッセイによっ て第VIII因子および/または第IX因子の欠乏を検出することが可能とな る。膜固定型の突然変異組織因子は、使用前にリン脂質小胞に再構成されるのが 好ましい。可溶型の突然変異組織因子は、使用前にリン脂質小胞と混合されるの が好ましい。 アッセイに用いる突然変異組織因子の量は、自動または手動のPTアッセイにお いて、正常な血漿を容易に測定できる時間内に凝血させるのに有効な量である。 好ましくは、クエン酸塩を加えた正常なヒト血漿の凝血の時間は約２分未満であ り、好ましくは約７秒から約２分、最も好ましくは、10から30秒である。未知の 血漿サンプルに対して使用する試薬の量を簡単に決定するために、正常な対照血 漿を用いて用量-反応曲線を作製し、正常の血漿を所望の時間の範囲内に凝血さ せる量の突然変異組織因子を使用してもよい。 使用する突然変異組織因子試薬の範囲を数値で表すと、約0.1から約50μg/ml で、さらに好ましくは１から約20μg/ml、最も好ましくは約15μg/mlである。濃 度は、上の段落中の対照血漿について所望の範囲の凝血時間を得る方法の記載に 従って調節することができる。 遊離のFVIIaは限られた酵素活性しかもたないが、TFと結合するとその触媒活 性は大きく、可逆的に増加し、これはトリペプチジルアミド基質および高分子基 質を用いて検出できる。Komiyama，et al.，Biochemistry 29:9418-9425(1990) ；Bom，V.J．and Bertina，R.M.，Biochem J 265:327-336（1990）；Zur，M．an d Nemerson，Y.，J Biol Chem 253:2203-2209（1978）；Ruf，et al.，J Biol C hem 266:2158-2166（1991）およびJ Biol Chem 266:16256(1991)における訂正； Higashi，et al.，J Biol Chem 267:17990-17996(1992)；およびLawson，et al. ，J Biol Chem 267:4834-4843(1992)。TFによるFVIIａの（あるいは、いずれか の血液凝固セリンプロテアーゼの、その同属のタンパク質補因子による）アロス テリック活性化の性質についてはよくわかっていない。FVIIaによる小分子量の アミドおよびエステル基質の開裂速度を増大させるTFの能力は、TFがFVIIaの触 媒中心の中または近くに変化をもたらすことを示している。しかしながら、TFは また、はるかに大きい高分子基質を認識するための拡張された基質結合部位の形 成にも寄与していると思われる。事実、トロンボモジュリンがトロンビンによる タンパク質Ｃの活性化に同様の機能を与え るのに対して、第Va因子はその同属のプロテアーゼである活性型第Ｘ因子(“FXa ”)にこの機能を与えるといわれている。Mann，et al.，Ann Rev Biochem 57:91 5-956(1988)。 最近、TFが高分子基質と直接相互作用するのではないかという説を支持する証 拠が得られた。最初の研究は、TF上の二つのリシン残基K¹⁶⁵およびK¹⁶⁶の化学的 な修飾またはアラニン突然変異誘発により、その結果できるTF-FVIIａ複合体のF Xを活性化する能力が大きく減少することを報告した。Roy，et al.，J Biol Che m 266:22063-22066(1991)。K¹⁶⁵またはK¹⁶⁵における突然変異は相加的な効果を 有し、K¹⁶⁵K¹⁶⁶→A¹⁶⁵A¹⁶⁶の二重の突然変異体は、どちらか一方のみの突然変異 体に比べてFX活性化がより大きく低下した。興味深いことに、突然変異はFVIIa のTFに対する親和性に効果を及ぼさず、または、TFによるFVIIaのアミド分解活 性の増加をもたらさない。どちらか一方の部位における単一の突然変異によるFX 活性化の低下は、TFを再構成する小胞のホスファチジルセリン（“PS”）含有量 を増加することにより部分的に克服できたので、これらの研究者らは、二つのリ シン残基は負の電荷をもつリン脂質の頭部の基との相互作用を通じてFX活性化に 間接的に影響を及ぼしているのではないかという説を出した。その後の別のグル ープによる研究では、これらの二つの残基をアラニンに突然変異させると、FX活 性化に対する見かけ上のKmが増加することが示された。Ruf，et al.，J Biol Ch em 267:6375-6381（1992a）。さらに、彼らは、FVIIaと可溶性TFの複合体を用い た場合にもこの現象が観察されたので、FX活性化の低下はTFとリン脂質の頭部の 基との間の相互作用を必要としないことを示した。そこで、K¹⁶⁵およびK¹⁶⁶が、 FXと結合することにより直接的に、またはFVIIaと結合してアロステリックに酵 素を活性化することにより間接的に、FXを基質として認識することに関与してい るのではないかと提案された。TFの線状配列におけるこれらの残基をとりまく領 域(残基157-167)のアラニン置換スキャニング突然変異法による研究によっても 、TFのこの領域は高分子基質の認識に重要であることが示された。Ruf，et al. ，J Biol Chem 267:22206-22210(1992b)。最近、TF上のこれらの二つの同じ残基 は、FXaと組織因子経路阻害剤の複合体のTF-FVIIa複合体への結合の速度に関す る役割を担っていることが報告された。Rao，L.V.M．and Ruf，W.， Biochemistry 34:10867-10871（1995）。 上に引用した突然変異誘発の研究に続いて、単離されたTFの細胞外領域のＸ線 結晶構造が報告された。Harlos，et al.，Nature 370:662-666（1994）；Muller ，et al.，Biochemistry 33:10864-10870(1994)。このタンパク質はサイトカイ ン/成長因子受容体ファミリーのメンバーであり、二つのフィブロネクチンIII型 のモジュールがおよそ125°の角度で互いに連結して構成されている。アラニン 置換スキャニング突然変異法により同定されたTF上の推定FVIIa結合部位は、両 方のモジュール上に位置する側鎖からなり、インターフェイス領域がそれら二つ を連結している。Martin，et al.，FASEB J 9:852-859(1995)。残基K¹⁶⁵およびK¹⁶⁶ は溶媒にさらされており、モジュール２の末端近く、予想されるリン脂質表 面の近くに位置している。興味深いことに、これらの残基は、推定FVIIa結合領 域に対してTFの反対側に位置している。この配置は、FVIIａとTFの細胞外ドメイ ンの複合体のＸ線結晶構造についての最近の予備報告により立証された。Banner ，et al.，Thromb Haemost 73:1183(1995)。 TFの結晶構造におけるK¹⁶⁵およびK¹⁶⁶の位置に基づいて、本発明者らは、K¹⁶⁵ およびK¹⁶⁶はFXのGla-ドメインと直接相互作用するような位置にあり、この相互 作用はTF-FVIIa複合体によるFXの基質としての能率的な利用に重要な役割を果た しているという仮説を立てた。この研究において、本発明者らは、TF残基K¹⁶⁵お よびK¹⁶⁶が完全なFXの活性化に寄与するが、Gla-ドメインのないFXの活性化には 寄与しない証拠を報告する。さらに、FXのGla-ドメインとTFのこの領域との間の 相互作用は、FVIIaのGla-ドメインによって促進されると思われる。 下記の実施例においては、以下の材料を使用する：Chromozym t-PA（酢酸N-メ チルスルホニル-D-フェニルアラニル-グリシル-アルギニル-4-ニトロアニリド） は、Boehringer Mannheimから入手した。Spectrozyme FXa（酢酸MeO-CO-D-シク ロヘキシルグリシル-グリシル-アルギニル-4-ニトロアニリド）は、American Di agnostica(Greenwich，CF)から入手した。また、S-2222（塩酸N-ベンゾイル-イ ソロイシル-グルタミル-グリシル-アルキニル-4-ニトロアニリド）は、Chromoge nixから入手した。ポリ(L-リシン)、トリス塩基、Lubrol-PX EDTA、Antifoam C 、およびTricine（N-トリス-(ヒドロキシメチル)メチルグリシン） は、Sigmaから入手した。BSA(ウシ血清アルブミン、Ｖ画分、脂肪酸を含有しな い)、Mes(2(N-モルフォリノ)-エタンスルホン酸)、Hepes、およびオクチル-o-D- グルコピラノシドは、Calbiochemから入手した。PCおよびPSは、Avanti Polar L ipids(Pelham，AL)から入手した。滅菌していない、未処理の96-ウェルマイクロ プレートは、Corning(Corning，NY)から入手した。 実施例１ タンパク質の精製。組換えヒトTF（野生型および突然変異体）を大腸菌で発現 させ、本来は可溶性TFのために記載された方法(Rezaie，et al.，Protein Expre ss Purif 3:453-460(1992))に従い、先に記載された膜固定TFを製造するための 修正（Neuenschwander，et al.，Biochemistry 34:13988-13993(1995)）を加え て精製した。この研究において使われる膜固定TFの形態は、細胞質ドメインの大 部分が除去されたもので、先に使用した番号の振り方に従えば１から244のアミ ノ酸からなる。Morrissey，et al.，Cell 50:129-135(1987)。TFの細胞質ドメイ ンは、活性に不必要で、E．coli中での生産およびE．coliからの精製を妨げるの で、通常組換えTFから除かれる。Paborsky，et al.，Biochemistry 28:8072-807 7(1989)。精製された突然変異体TFタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気 泳動を行うと、野生型TFと同様にMr＝30,000の単一のバンドとして移動した(デ ータは示さない)。野生型および突然変異体TFタンパク質の折りたたみが総体的 に正しいことは、記載されたようなFVIIaのアミド分解活性の補助(Neuenschwand er，et al.，Thromb Haemost 70:970-977(1993))、および記載されたようなFVII aに対する結合親和性を試験することにより証明された。Neuenschwander，P.F． and Morrissey J.H.，J Biol Chem 269:8007-8013（1994）およびJ Biol Chem 2 69:16983における訂正。TFは、本来TFに適用された方法である、オクチル-β-D- グルコピラノシド透析法(Mimms，et al.，Biochemistry 20:833-840(1981))によ って再脂溶化された。Bach，et al.，Biochemistry 25:4007-4020(1986)。典型 的には、TFは、PCまたはPCPSから調製したリン脂質小胞に、TFの総リン脂質に対 するモル比が約１：8000となるように混合された。同様の方法で、TFを加えずに ブランクのリン脂質小胞を調製 した。小胞の外側にある利用可能なTFの量は、記載されたとおりに定量された。 Neuenschwander，P.F．and Morrissey，J.H．J Biol Chem 269:8007-8013（1994 ）およびJ Biol Chem 269:16983(1994)における訂正。他のタンパク質は下記の ように記載された通りに精製された。ヒト血漿からのFX(Le Bonniec，et al.，J Biol Chem 267:6970-6976(1992))、ヒト血漿からのFVIIa(Neuenschwander，P.F ．and Morrissey，J.H.，J Biol Chem 267:14477-14482(1992))、組換えGla-ド メインのないFX（“GDF”）(Rezaie，et al.，J Biol Chem 268:8176-8180(1993 ))、およびヒト血漿からのFIX(Thompson，A.R.，J Clin Invest 59:900-910(197 7))。 TFの突然変異誘発。上に参照した構築体をコードした膜固定TF(Neuenschwande r，et al.，Biochemistry 34:13988-13993(1995))を、TF突然変異体の製造に使 用した。残基K¹⁶⁵およびK¹⁶⁶を、適当なフランキングプライマーおよびそれに続 く突然変異原性のプライマーの対を用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づ く突然変異誘発によって(Horton，et al.，BioTechniques 8:528-535(1990))、 突然変異させた（突然変異に下線をつけた）：5’-TCA AGT TCA GGA GCG GCG AC A GCC AAA ACA-3'（配列番号43）および5'-CGC CGC TCC TGA ACT TGA AGA TTT C C-3'（配列番号44）(A¹⁶⁵A¹⁶⁶突然変異体)；5'-TCA AGT TCA GGA GAA GAA ACA G CC AAAA CA-3'（配列番号45）および5'-GT TTC TTC TCC TGA ACT TGA AGA TTTCC -3'（配列番号46）(E¹⁶⁵E¹⁶⁶突然変異体)；および5'-TCA AGT TCA GGA CAG CAGA CA GCC AAAACA-3'（配列番号47）および5'-T CTG CTG TCC TGA ACT TGA AGA TTT CC-3'（配列番号48）(Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶突然変異体)。PCRはAmpliwax（Perkin-Elmer Cet us）を用いて高温で開始し、サイクルあたり95℃で30秒、50℃で１分、および72 ℃で30秒を用いて25サイクル増幅した。すべてのTFのcDNA構築体のコード配列は 、DNA配列決定により証明した。 実施例２ 活性のアッセイ。さまざまなTF-FVIIa複合体によるFXの活性化を、基本的に先 に記載した方法(Fiore，et al.，Blood 80:3127-3134(1992))の通りであるが、 いくらかの修正を加えた二段階の非連続的なクロモゲンアッセイを用いて定量し た。簡単に述べると、第一段階では、リン脂質小胞中のTFをHBSA(20mM Hepes-NaOH pH7.5、100mM NaCl、5mM CaCl₂、0.1%ウシ血清アルブミン)中で、FV IIaとともに37℃で５分間インキュベートした。次いで、あらかじめ温めた基質 溶液（FX）を混合物に加えて反応を開始し、その後、時間ごとに20μlのサンプ ルを取り出して25μlの終止緩衝液（20mM Mes-NaOH pH5.8、2OmM EDTA、８%Lubr ol-PX、0.01% Antifoam Ｃ）に入れ、氷上で維持した。第二段階では、冷却した サンプルに2M Tricine pH8.4を10μl加えてpHを8.3に調節し、次いで、50μlのS pectrozyme FXaを最終的な基質濃度が0.48mMになるように加えて、それぞれのサ ンプル中に存在するFXaを周囲温度で定量した。Vmax Microplate Reader（Molec ular Devices Corp，Menlo Park，CA）を用いて、405nmにおける吸光度の変化を 10分間にわたってモニターし、初速度を決定した(mOD min-1)。次いで、これら の値を、精製ヒトFxa用に作成した標準曲線と比較することによって、nM FXaに 変換した。溶液でのアッセイについては、FX活性化の速度は、TFがリン脂質小胞 に再構成されていない点と、すべての溶液が0.1%Tritonを含む点以外は上記と同 様にして測定した。 TF-FVIIa複合体によるFIXの活性化は、記載された方法(Fiore，et al.，Blood 80:3127-3134(1992))に従い、以下のような修正を加えて、アッセイされた。第 一段階では、10-14μMのPCPSに再脂溶化された１nMのTFを、HBSA中で、50pMのFV IIaとともに37℃で５分間インキュベートした後、FIXを最終的な濃度が150nMに なるように加えた。一定の時間のサンプル（10μl）を40μlの終止緩衝液（0.5m M Tris-HCl、pH7.0、１mM EDTA、0.2%Lubrol PX、0.1%ウシ血清アルブミン、0.0 1%Antifoam Ｃ）に加え、氷上で維持した。第二段階では、それぞれの冷却した サンプルを10μlずつ、40μlのFX（150nM）(20mMのHepes-NaOH、pH7.5中)、57.5 mMのNaCl、５mMのCaCl₂、0.1%ウシ血清アルブミンに加えたものが入った別々の マイクロプレートのウェルに加えた。FXaの生成とFXaによるクロモゲン基質の加 水分解は、最終的な濃度がそれぞれ0.5mMおよび10nMとなるように50μlのS-2222 とポリ（L-リシン）との混合物を加えることにより同時に開始した。反応溶液に 高レベルの添加物が含まれるためにおこる散乱を修正するために405nmと490nmの 両方の吸光度を40分にわたってモニターした。次いで、その結果得られた吸光度 -差違(difference)プロフィルを用いて、先に記載 された方法(Fiore，et al.，Blood 80:3127-3134(1992))に従って活性型第IX因 子（“FIXa”）の生成の初速度を計算した。対照実験により、第一段階から持ち 越されたFVIIaは、アッセイの第二段階では無視できるほどの活性しかもたない ことが示された。 実施例３ 凝固のアッセイ。突然変異体または野生型TFの血漿が凝血するのを補助する能 力を、ST4型のコアギュロメーター（American Bioproducts Co.，Parsippany，N J）を用いて測定した。TF溶液は、HBSA（20mM Hepes水酸化ナトリウム、pH7.5、 100mM塩化ナトリウム、５mM塩化カルシウム、および0.1%ウシ血清アルブミン） に溶かしたリン脂質小胞（典型的には、20%ホスファチジルセリンおよび80%ホス ファチジルコリン）中のさまざまな濃度の野生型または突然変異体TFのいずれか を用いて調製した。ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリンおよび/また はホスファチジルエタノールアミンの組み合わせが特に望ましいことが見いださ れた。正常ヒト血漿と特定の因子が欠乏した血漿をさまざまな比率で混合するこ とにより、クエン酸塩を加えた血漿混合物を調製した。さまざまな因子-欠乏血 漿は先天的に因子が欠乏した個体に由来するもので、George King Bio-Medical ，Inc．（Overland Park，KS）より購入した。これらの欠乏血漿は、指示された 因子が正常な量の１%末満しか含まれていないことが供給者により保証されてい る。塩化カルシウム溶液は、水に溶解した25mMのCaCl₂からなるものであった。 アッセイは、ST4コアギュロメーターのキュベットの中で、50μlのTF溶液（野生 型または突然変異型）を50μlの所望のクエン酸塩を加えた血漿混合物と混合す ることによりおこなった。混合物を37℃に温めた後、50μlのあらかじめ温めた 塩化カルシウム溶液を加えて血餅が形成するまでの時間を記録した。 結果 アミド分解活性およびFVIIa結合。TFの165および166位の二つの隣接したＫ残 基のＡへの突然変異は、その結果できるTF-FVIIa複合体のFXを活性化する能力を 大きく減少させることが以前報告された。Roy，et al.，J Biol Chem 266:22063-22066(1991)。しかしながら、これらの突然変異はFVIIaに対する親和 性を減少させず、突然変異体は正常なFVIIaのアミド分解活性の増強を示す。こ の研究において本発明者らは、これらの側鎖の末端を切断することまたはその電 荷を反転することの効果を調べるためにこれらの二つの残基をＡまたはＥに突然 変異させることにした。これに加えて、ほぼ類似した形であるが電荷の反転を伴 わないＥ変異に対する対照として、Ｑ置換も含めた。これ以前の研究で、K¹⁶⁵お よびK¹⁶⁶の両方を突然変異させた場合の効果は、それぞれを別個に突然変異させ た場合の効果は相加的なものであることが示されているので、本研究においては 本発明者らは165および166位の両方が突然変異した突然変異体のみについて研究 をおこなった。表Ｉに示されるように、三つのTF突然変異体はすべて、FVIIaの アミド分解活性に対する補因子機能に関して、野生型と同等のレベルを示した。 また、突然変異体は、少なくとも野生型TFのFVIIａへの親和性と同等の強さのFV IIaへの親和性を示した(表Ｉ)。 TF-FVIIaによるFXおよびFIXの活性化。図６に示されるように、K¹⁶⁵K¹⁶⁶をA^{16 5} A¹⁶⁶に突然変異させると、TF-FVIIa複合体によるFXの活性化が大きく低下した 。さらに、比較的保存的な突然変異（Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶）ではFXの活性化の低下はそれほ ど大きくなかったのに対して、電荷を反転する突然変異（E¹⁶⁵E¹⁶⁶）はFXの活性 化をより大きく低下させた。TFが純粋なPC小胞に再脂溶化された場合に突然変異 体がより大きなFX活性化の低下を示すことから、FX活性化の低下は小胞中のPSに 依存しない。FX活性化と同様に、K¹⁶⁵K¹⁶⁶をA¹⁶⁵A¹⁶⁶に突然変異させると、FIX の活性化が低下した(図７)。この場合も、より保存的な突然変異（Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶）に よるFIX活性化の低下はそれほど大きくなかったのに対して、電荷を反転するよ うな突然変異（E¹⁶⁵E¹⁶⁶）はより大きくFIX活性化を低下させた。しかしながら これらのTF突然変異体のFIX活性化の補助の相対的減少（野生型の14-26%）は、F X活性化の補助に対するもの（野生型の3.9-17%）に比べてその強度において顕著 に小さい。そして驚くべきことに、165および166位に置換を含むTF突然変異体は 、第IX因子の活性化の補助において、第Ｘ因子の活性化の補助におけるようりも 顕著に大きい活性を保持していた。さらに、165および166位におけるリシンのグ ルタミンへの置換を行ってTF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶を得ることにより、凝血を基礎とするヒ ト血漿のアッセイへの使用が十分に可能な活性を保持したTF突然変異体がもたら された。 TFのK¹⁶⁵K¹⁶⁶のA¹⁶⁵A¹⁶⁶への突然変異は、TFのFVIIaに対する親和性またはFVI Iaのアミド分解活性の増大には影響を与えないが、その結果形成されるTF-FVIIa 複合体のFXを活性化する能力を実質的に減少させる。この結果は以前の報告の結 果を裏付けるものである。Roy，et al.，J Biol Chem 266:22063-22066(1991)； Ruf，et al.，J Biol Chem 267:6375-6381(1992a)；Ruf，et al.，J Biol Chem 267:22206-22210(1992b)。さらに、これらの結果に加えて、より保存的な置換（ Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶）はA¹⁶⁵A¹⁶⁶突然変異体で観察されたものと比べていくらか高いレベル のFX活性化を補助したのに対して、これらの残基の電位を反転するような突然変 異（E¹⁶⁵E¹⁶⁶）はFX活性化をより大きく低下させることを示した。A¹⁶⁵A¹⁶⁶突然 変異体と同様に、E¹⁶⁵E¹⁶⁶およびQ¹⁶⁵Q¹⁶⁶突然変異体はFVIIaに対して正常な親 和性を有し、またFVIIaのアミド分解活性の正常な増強を示した。K¹⁶⁵およびK^{16 6} を突然変異させることでFIXの活性化も大きく低下することから、以上の結果は 、これらの残基が突然変異されたときに高分子基質の認識が一般的に低下すると いう説をも支持するものである。驚くべきことに、これらの突然変異体が示すFI X活性化の低下は、FX活性化で観察されたものと比較して顕著に少なかった。し たがって、TFのK¹⁶⁵およびK¹⁶⁶残基は、FIX活性化よりもFX活性化の増強におい てより重要であると思われる。 因子欠乏血漿を用いた凝血時間。上記の実験により、驚くべきことに、165お よび166位にアミノ酸置換を含むTF突然変異体は、第Ｘ因子の活性化の場合より も第IX因子の活性化の方がその抑制効果が小さいことが証明された。これらの結 果から、これらのTF突然変異体は血漿全体の中で第IX因子に対する基質選択性を 示すことがわかる。これは、血漿全体の中で第Ｘ因子にきわだった基質選択性を 示す野生型のTFとは対照的である。最も好ましい突然変異体は、165および166位 のリシン残基をグルタミンで置換した結果得られたもので、これにより得られる タンパク質（TF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶）は全般的に最良の活性を示し、そのため一般的に望 ましいことに、凝血時間を短縮することができる。TF A¹⁶⁵A¹⁶⁶およびTF E¹⁶⁵E^{1 66} も同様に好ましい活性を示すが、TF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶を用いた場合よりも凝血時間が 長くなることが観察された。図１から図５に示すように、凝血に基づくアッセイ におけるさまざまな凝血因子に対するTF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶の感受性を試験した。これら の実験において、野生型または突然変異体TFの濃度は、クエン酸塩を加えた正常 なヒト血漿の凝血時間がおよそ25から30秒となるように調節された。図１には、 TF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶は、野生型TFと比較して血漿中のFIXに対して非常に増大した感受性 をもつことが示されている。このことは、０%FIX欠乏血漿（すなわち、100%正常 な血漿）では凝血時間がほぼ等しいのに対して、FIX欠乏血漿のパーセンテージ が上がるにつれてTF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶を用いた場合の凝血時間が大きく延長されるとい う観察から理解できる。このように、野生型TFの凝血時間は100%FIX欠乏血漿中 でごくわずかしか延長されなかったが、TF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶の凝血時間は100%FIX欠乏血 漿中で顕著に延長された。同様の差違は、50%、75%、および90%FIX欠乏血漿にお ける凝血時間の延長でも容易に見て取れる。 図２には、TF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶は、野生型TFと比較して血漿中のFVIIIに対する感受性 がはるかに大きいことが示されている。このことは、０%FVIII欠乏血漿（すなわ ち、100%正常な血漿）では凝血時間が等しいのに対して、FVIII欠乏血漿のパー センテージが上がるにつれてTF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶を用いた場合の凝血時間が大きく延長 されるという観察から理解できる。このように、野生型TFの凝血時間は100%FVII I欠乏血漿中でごくわずかしか延長されなかったのに対して、TF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶の凝血 時間は100%FVIII欠乏血漿中で顕著に延長された。同様の差違は、50%、75%、お よび90%FVIII欠乏血漿における凝血時間の延長でも容易に見て取れる。図３は、 野生型TFとTF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶は血漿中のFXに対して本質的に等しい感受性を有するこ とを示している。図４は、TF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶は、血漿中のFVIIレベルに対して野生型T Fよりもいくらか高い感受性をもつことを示している。図５は、野生型TFとTF Q^{1 65} Q¹⁶⁶は、血漿中のFVに対する感受性が本質的に等しいことを示している。 要約すると、165および166位にアミノ酸置換を含む突然変異体TFは、FVIIIお よびFIXに対する凝血活性にかなりの感受性を示す。予想されるように、野生型 のTFは血漿中のFVIIIまたはFIXのレベルには本質的に非感受性であった。このこ とは、FVIIIまたはFIXが欠乏している個体は、凝血がTF Q¹⁶⁵Q¹⁶⁶により開始さ れる場合には長い凝血時間を有するが、凝血が野生型TFにより開始される場合に は正常な凝血時間を有することを意味する。 つまり、TFの165および166位の突然変異は、第VIII因子および第IX因子の測定 に有用な新しい試薬をもたらす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．患者の血漿サンプル中の凝血第VIII因子または第IX因子の濃度を測定する方 法であって、 (a) 一定量の血漿サンプルを突然変異組織因子試薬と混合して第１の混 合物を形成し（但し、前記突然変異組織因子試薬は、第VIIa因子と結合し、かつ 第VIIa因子のアミド分解活性を促進することが可能であるが、第IX因子および第 Ｘ因子の活性を補助しないアミノ酸配列を含む）、 (b) 前記第一の混合物に有効量のカルシウムイオンを加えて凝血を開始 し、 (c) 前記カルシウムイオンの添加から血餅の形成までの時間を測定する ことによって血漿サンプルの凝血時間を決定し、そして (d) 前記血漿サンプルの凝血時間を、既知の濃度の前記凝血因子につい て求めた標準凝血時間と比較する 各工程を含んでなる前記方法。 ２．前記組織因子配列が、アミノ酸約-5〜約５から始まり約258〜約263で終わる 配列番号：１の野生型組織因子の少なくとも一部を含む、請求項１記載の方法。 ３．前記組織因子配列が、アミノ酸約-5〜約５から始まり約214〜約248で終わる 配列番号：１の少なくとも一部を含む、請求項１記載の方法。 ４．前記配列が、少なくとも一つの位置で置換アミノ酸により置換されており、 前記位置が154、159、163、164、165、166、178、180、201または204位である、 請求項２記載の方法。 ５．前記配列が、少なくとも一つの位置で置換アミノ酸により置換されており、 前記位置が154、159、163、164、165、166、178、180、201または204位である、 請求項３記載の方法。 ６．前記置換アミノ酸が、グルタミン、アラニンおよびグルタミン酸およびこれ らの組み合わせからなる群から選択される、請求項４記載の方法。 ７．前記置換アミノ酸が、グルタミン、アラニンおよびグルタミン酸およびこれ らの組み合わせからなる群から選択される、請求項５記載の方法。 ８．前記配列が、165位において置換されている、請求項２記載の方法。 ９．前記配列が、165位において置換されている、請求項３記載の方法。 10．前記配列が、166位において置換されている、請求項２記載の方法。 11．前記配列が、166位において置換されている、請求項３記載の方法。 12．前記配列が、165および166位において置換されている、請求項２記載の方法 。 13．前記配列が、165および166位において置換されている、請求項３記載の方法 。 14．前記配列が、グルタミン、アラニンおよびグルタミン酸およびこれらの組み 合わせからなる群から選択される置換アミノ酸により置換されている、請求項８ 、９、10、11、12または13のいずれか１項に記載の方法。 15．前記組織因子配列が配列番号：３である、請求項２記載の方法。 16．前記組織因子配列が配列番号：６である、請求項２記載の方法。 17．前記組織因子配列が配列番号：９である、請求項２記載の方法。 18．前記組織因子配列が配列番号：４である、請求項２記載の方法。 19．前記組織因子配列が配列番号：７である、請求項２記載の方法。 20．前記組織因子配列が配列番号：14である、請求項２記載の方法。 21．前記組織因子配列が配列番号：５である、請求項２記載の方法。 22．前記組織因子配列が配列番号：８である、請求項２記載の方法。 23．前記組織因子配列が配列番号：17である、請求項２記載の方法。 24．前記組織因子が配列番号：20である、請求項３記載の方法。 25．前記組織因子配列が配列番号：23である、請求項３記載の方法。 26．前記組織因子配列が配列番号：26である、請求項３記載の方法。 27．前記組織因子配列が配列番号：21である、請求項３記載の方法。 28．前記組織因子配列が配列番号：24である、請求項３記載の方法。 29．前記組織因子配列が配列番号：31である、請求項３記載の方法。 30．前記組織因子配列が配列番号：22である、請求項３記載の方法。 31．前記組織因子配列が配列番号：25である、請求項３記載の方法。 32．前記組織因子配列が配列番号：34である、請求項３記載の方法。 33．前記混合の工程が、前記血漿サンプルにさらにリン脂質組成物を混合する ことを含む、請求項１、２または３のいずれか１項に記載の方法。 34．前記リン脂質がホスファチジルコリンとホスファチジルセリンの組み合わせ を含む、請求項33記載の方法。 35．前記リン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホス ファチジルエタノールアミンを含む、請求項33記載の方法。 36．前記リン脂質組成物を、前記試薬と共に前記サンプルに加える、請求項33記 載の方法。 37．前記カルシウムイオンを、前記試薬と同時に前記サンプルに加える、請求項 １記載の方法。 38．前記カルシウムイオンを、前記試薬の後に前記サンプルに加える、請求項１ 記載の方法。 39．反応体としてトロンボプラスチンを用いる凝血アッセイにおいて、改善が、 前記トロンボプラスチンに代えて突然変異組織因子試薬を用いることを含み、こ れにより前記アッセイを第VIII因子または第IX因子の濃度を直接測定するのに好 適なものとする、改良されたアッセイ。 40．前記突然変異組織因子試薬が配列番号：35である、請求項39記載のアッセイ 。 41．配列番号：35におけるXaaが、グルタミン、アラニン、およびグルタミン酸 からなる群から選択される、請求項40記載のアッセイ。 42．前記突然変異した組織因子試薬が配列番号：36である、請求項39記載のアッ セイ。 43．配列番号：36におけるXaaが、グルタミン、アラニン、およびグルタミン酸 からなる群から選択される、請求項42記載のアッセイ。 44．前記突然変異した組織因子試薬が配列番号：37である、請求項39記載のアッ セイ。 45．配列番号：37におけるXaaが、グルタミン、アラニン、およびグルタミン酸 およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項44記載のアッセイ 。 46．前記突然変異した組織因子試薬が配列番号：38である、請求項39記載の アッセイ。 47．配列番号：38におけるXaaが、グルタミン、アラニン、およびグルタミン酸 からなる群から選択される、請求項46記載のアッセイ。 48．前記突然変異した組織因子試薬が配列番号：39である、請求項39記載のアッ セイ。 49．配列番号：38（訳者注：配列番号：39の誤りと思われる）におけるXaaが、 グルタミン、アラニン、およびグルタミン酸からなる群から選択される、請求項 48記載のアッセイ。 50．前記突然変異した組織因子試薬が配列番号：40である、請求項39記載のアッ セイ。 51．配列番号：40におけるXaaが、グルタミン、アラニン、およびグルタミン酸 からなる群から選択される、請求項49記載のアッセイ。