JP2000350534A - 白血病抑制因子を用いる胚の増強移植、増殖及び維持 - Google Patents
白血病抑制因子を用いる胚の増強移植、増殖及び維持Info
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
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-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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-
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-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/806—Fertility tests
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 胚又は前胚の生存性保護剤を提供すること。
【解決手段】 白血病抑制因子(ＬＩＦ)を有効成分とし
て使用する。
て使用する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、動物又は哺乳動物
胚の増殖及び維持の増強での白血病抑制因子(ＬＩＦ)の
用途並びに受胎を増強するための同じものの用途に関す
る。ＬＩＦは、これまでにイー・コリ及び酵母細胞から
組換え形に大量にクローンされ、生成されそして精製さ
れた蛋白である(国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ８８／
０００９３)。ＬＩＦは、以下の性質を含む因子として
定義されて来た。
胚の増殖及び維持の増強での白血病抑制因子(ＬＩＦ)の
用途並びに受胎を増強するための同じものの用途に関す
る。ＬＩＦは、これまでにイー・コリ及び酵母細胞から
組換え形に大量にクローンされ、生成されそして精製さ
れた蛋白である(国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ８８／
０００９３)。ＬＩＦは、以下の性質を含む因子として
定義されて来た。
【０００２】１．白血病細胞の結合分化と共に、骨髄性
白血病細胞、例えばＭ１細胞の増殖を抑制する能力、及
び
白血病細胞、例えばＭ１細胞の増殖を抑制する能力、及
び
【０００３】２．Ｍ１細胞或いはネズミ又はヒトマクロ
ファージの特異的細胞レセプターに結合するためのネズ
ミＬＩＦ又はヒトＬＩＦ(国際特許出願番号ＰＣＴ／Ａ
Ｕ８８／０００９３で定義された)特定の配列を有する
分子と競合する能力
ファージの特異的細胞レセプターに結合するためのネズ
ミＬＩＦ又はヒトＬＩＦ(国際特許出願番号ＰＣＴ／Ａ
Ｕ８８／０００９３で定義された)特定の配列を有する
分子と競合する能力
【０００４】現在のインビボ受精(ＬＶＦ)及び胚移植
(ＥＴ)プログラム、特にヒトに於て、に関連する主な困
難は、受精胚の移植に「達成される」低成功率である。現
在、ヒトＩＶＦプログラムで、移植率は１０％と低く、
交替で時々多生児に導く各処理で４受精胎まで用いる現
実施に導く。従ってヒトＩＶＦプログラムで移植率を改
良する必要がある。同様に家畜、例えばヒツジ、ウシ、
ブタ及びヤギでのＩＶＦ及びＥＴ処理で、失われた受精
胚及びなされた不成功の処理方法の数を減ずるため出来
るだけ高い移植率をもつことが経済的理由から望まれ
る。さらに、ヒトＩＶＦ方法で、妊娠を確実にするた
め、１以上の胚のレシピエント動物への移植の実施は希
望しない多生児となる。
(ＥＴ)プログラム、特にヒトに於て、に関連する主な困
難は、受精胚の移植に「達成される」低成功率である。現
在、ヒトＩＶＦプログラムで、移植率は１０％と低く、
交替で時々多生児に導く各処理で４受精胎まで用いる現
実施に導く。従ってヒトＩＶＦプログラムで移植率を改
良する必要がある。同様に家畜、例えばヒツジ、ウシ、
ブタ及びヤギでのＩＶＦ及びＥＴ処理で、失われた受精
胚及びなされた不成功の処理方法の数を減ずるため出来
るだけ高い移植率をもつことが経済的理由から望まれ
る。さらに、ヒトＩＶＦ方法で、妊娠を確実にするた
め、１以上の胚のレシピエント動物への移植の実施は希
望しない多生児となる。
【０００５】胚移植に関して一つの大きな抑制は、胚を
培養培地中に、比較的短期間、多分移植前数時間又は顕
微操作後、数日のより長い期間、保持することが必要な
ことである。
培養培地中に、比較的短期間、多分移植前数時間又は顕
微操作後、数日のより長い期間、保持することが必要な
ことである。
【０００６】哺乳動物胚の増殖において、受精卵は桑実
胚及び胚盤胞段階を含む数多くの段階を通過する。胚盤
胞段階で、細胞は、栄養外胚葉(これは胎盤の前駆体で
ある)として知られる外細胞層及び内細胞塊(これから全
ての好ましい胚が誘導される)を形成する。胚盤胞は透
明帯により囲まれ、それは胚盤胞がかえると、続いて失
われる。次いで栄養外胚葉の細胞は移植段階で子宮壁と
密に接触するようになる。原腸形成による内細胞塊によ
る好ましい胚の形成の前に、全細胞塊は「前胚」として引
用しうる。
胚及び胚盤胞段階を含む数多くの段階を通過する。胚盤
胞段階で、細胞は、栄養外胚葉(これは胎盤の前駆体で
ある)として知られる外細胞層及び内細胞塊(これから全
ての好ましい胚が誘導される)を形成する。胚盤胞は透
明帯により囲まれ、それは胚盤胞がかえると、続いて失
われる。次いで栄養外胚葉の細胞は移植段階で子宮壁と
密に接触するようになる。原腸形成による内細胞塊によ
る好ましい胚の形成の前に、全細胞塊は「前胚」として引
用しうる。
【０００７】胚死亡率は透明帯から胚盤胞の不完全ふ化
及び／又は子宮壁への胚の不成功な移植に、多分、移植
前の培養でのそれらの期間に胚幹細胞(ＥＳ)の自然分化
に帰されて来た。
及び／又は子宮壁への胚の不成功な移植に、多分、移植
前の培養でのそれらの期間に胚幹細胞(ＥＳ)の自然分化
に帰されて来た。
【０００８】本発明によりＬＩＦがインビトロ胚培養培
地に含まれるとき、ふ化工程が増強され移植に関連する
発育変化を受けることにより、増殖段階を完全にする多
数の胚に導くことが判った。従ってＬＩＦは胚防御剤で
ある。結果としてＩＶＦ及びＥＴプログラムについての
移植率は、インビトロ胚培養培地中、ＬＩＦの使用によ
り有意に改良でき、又、改良される。
地に含まれるとき、ふ化工程が増強され移植に関連する
発育変化を受けることにより、増殖段階を完全にする多
数の胚に導くことが判った。従ってＬＩＦは胚防御剤で
ある。結果としてＩＶＦ及びＥＴプログラムについての
移植率は、インビトロ胚培養培地中、ＬＩＦの使用によ
り有意に改良でき、又、改良される。
【０００９】さらにＬＩＦ含有培地は、胚の生存率が低
い、卵母細胞／胚、たとえばインビトロ受精、胚分裂及
び核移植で早く操作できる方法に使用するのに適する。
ＬＩＦは、又、冷却又は凍冷胚／精液の輸送に用いられ
た培地への封入にクローニング用全能幹細胞系の生育に
重要な適用性を有する。
い、卵母細胞／胚、たとえばインビトロ受精、胚分裂及
び核移植で早く操作できる方法に使用するのに適する。
ＬＩＦは、又、冷却又は凍冷胚／精液の輸送に用いられ
た培地への封入にクローニング用全能幹細胞系の生育に
重要な適用性を有する。
【００１０】特に指定しない限り、明細書中での「ＬＩ
Ｆ」の使用は、合成組換え体又は天然に発生するヒト、
ネズミ及び／又は家畜類又は反芻動物ＬＩＦ、例えばヒ
ツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、ロバ及びウマからの、及び他
の動物、例えばイヌ、ネコ又はトリ(例えばニワトリ)か
らの、及びその誘導体又は部分をいう。その誘導体又は
部分は、上記ＬＩＦ分子のいずれか１つに含まれる１又
はそれ以上の連続的系列のアミノ酸を含み、又、天然又
は合成ＬＩＦ分子への又は中での単一又は多重アミノ酸
置換、削除及び／又は付加を含む。組換えＬＩＦを調製
するための条件は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ８８／
０００９３及びＰＣＴ／ＡＵ９０／００００１に開示さ
れるが、これらの条件の変更及び／又は修飾は用いる宿
主細胞により変りうる。これらの変更及び／又は修飾も
主題発明の範囲内にある。宿主細胞は真核生物(例えば
酵母、哺乳動物、昆虫、植物等)又は原核生物(例えばエ
セリキア・コリ、バチルス・スピシーズ、シュードモナ
ス・スピシーズ等)細胞でありうる。
Ｆ」の使用は、合成組換え体又は天然に発生するヒト、
ネズミ及び／又は家畜類又は反芻動物ＬＩＦ、例えばヒ
ツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、ロバ及びウマからの、及び他
の動物、例えばイヌ、ネコ又はトリ(例えばニワトリ)か
らの、及びその誘導体又は部分をいう。その誘導体又は
部分は、上記ＬＩＦ分子のいずれか１つに含まれる１又
はそれ以上の連続的系列のアミノ酸を含み、又、天然又
は合成ＬＩＦ分子への又は中での単一又は多重アミノ酸
置換、削除及び／又は付加を含む。組換えＬＩＦを調製
するための条件は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ８８／
０００９３及びＰＣＴ／ＡＵ９０／００００１に開示さ
れるが、これらの条件の変更及び／又は修飾は用いる宿
主細胞により変りうる。これらの変更及び／又は修飾も
主題発明の範囲内にある。宿主細胞は真核生物(例えば
酵母、哺乳動物、昆虫、植物等)又は原核生物(例えばエ
セリキア・コリ、バチルス・スピシーズ、シュードモナ
ス・スピシーズ等)細胞でありうる。
【００１１】従って、本発明の一局面は、一又はそれ以
上の胚を有する動物の妊娠率を増強する方法を意図し、
該方法は、有効量の白血病抑制因子(ＬＩＦ)を含む培地
中、十分時間、適当な条件下、胚を維持及び／又は分化
させること、次いで胚を動物中に移植することを含む。
上の胚を有する動物の妊娠率を増強する方法を意図し、
該方法は、有効量の白血病抑制因子(ＬＩＦ)を含む培地
中、十分時間、適当な条件下、胚を維持及び／又は分化
させること、次いで胚を動物中に移植することを含む。
【００１２】「妊娠」は、成功した移植及び受精胚インビ
ボの続く増殖の率を意味する。
ボの続く増殖の率を意味する。
【００１３】本発明の他の局面は、胚又は前胚をインビ
トロ培養中維持し、一方、胚移植、ＩＶＦ及び／又は遺
伝的操作での使用のため生存度を維持する方法を意図
し、その方法は有効量のＬＩＦを含む培地中、十分時
間、適当な条件下、該胚を培養することを含む。
トロ培養中維持し、一方、胚移植、ＩＶＦ及び／又は遺
伝的操作での使用のため生存度を維持する方法を意図
し、その方法は有効量のＬＩＦを含む培地中、十分時
間、適当な条件下、該胚を培養することを含む。
【００１４】培養中、胚の生存度を維持するこの方法
は、全胚の遺伝的操作を行わせる可能性を有する。この
ような成功した操作は、現在、生きている胚への実験を
実施するのに利用できる限られた量の時間に限定され
る。
は、全胚の遺伝的操作を行わせる可能性を有する。この
ような成功した操作は、現在、生きている胚への実験を
実施するのに利用できる限られた量の時間に限定され
る。
【００１５】方法は、又、現在行なわれている技術に比
べて輸送条件下、胚の生存度を維持するのに優れてお
り、胚の保存に有利である。
べて輸送条件下、胚の生存度を維持するのに優れてお
り、胚の保存に有利である。
【００１６】本発明の他の局面は、哺乳動物胚のインビ
トロ増殖を移植段階に上昇する方法に関し、その方法
は、有効量の哺乳動物ＬＩＦを含む培養培地中、インビ
トロで胚を培養する段階を含む。
トロ増殖を移植段階に上昇する方法に関し、その方法
は、有効量の哺乳動物ＬＩＦを含む培養培地中、インビ
トロで胚を培養する段階を含む。
【００１７】以下に示すように、胚盤胞の形成前、又は
胚盤胞形成前及び後、培養培地中ＬＩＦの封入も、移植
と関連した増殖変化を受けることにより増殖段階を含む
前胚の数をも増加する。ＬＩＦの添加は、又、培養中、
退歩する前胚の数を減ずる。結果として、ＩＶＦ及びＥ
Ｔプログラムに対する移植率はインビトロ培養培地中、
ＬＩＦの使用により有意に改良できる。
胚盤胞形成前及び後、培養培地中ＬＩＦの封入も、移植
と関連した増殖変化を受けることにより増殖段階を含む
前胚の数をも増加する。ＬＩＦの添加は、又、培養中、
退歩する前胚の数を減ずる。結果として、ＩＶＦ及びＥ
Ｔプログラムに対する移植率はインビトロ培養培地中、
ＬＩＦの使用により有意に改良できる。
【００１８】「動物胚」は、哺乳動物、例えばヒト、反芻
動物及び他の家畜動物及び他の動物、例えば鳥及び魚か
らの胚を含む最も広い意味で用いられる。主題発明は、
インビトロ移植ヒツジ胚により本明細書で例証される一
方、本発明は、ヒト、反芻動物及び、例えばウシ、ウ
マ、ロバ、ヤギ等の動物を含む他の動物又は哺乳動物種
の胚の移植でのＬＩＦの使用に及ぶ。
動物及び他の家畜動物及び他の動物、例えば鳥及び魚か
らの胚を含む最も広い意味で用いられる。主題発明は、
インビトロ移植ヒツジ胚により本明細書で例証される一
方、本発明は、ヒト、反芻動物及び、例えばウシ、ウ
マ、ロバ、ヤギ等の動物を含む他の動物又は哺乳動物種
の胚の移植でのＬＩＦの使用に及ぶ。
【００１９】又、本発明は、インビトロでの受精及び続
く哺乳動物胚の移植に及び、それは、胚を動物又は哺乳
動物宿主(ここに「宿主」は適当に受容する雌動物又は哺
乳動物として定義される)に移植する前、有効量の哺乳
動物ＬＩＦを含む培養培地中、インビトロで培養するこ
とを特徴とする。
く哺乳動物胚の移植に及び、それは、胚を動物又は哺乳
動物宿主(ここに「宿主」は適当に受容する雌動物又は哺
乳動物として定義される)に移植する前、有効量の哺乳
動物ＬＩＦを含む培養培地中、インビトロで培養するこ
とを特徴とする。
【００２０】本発明のそのうえの局面は、ＬＩＦ含有培
養培地中、インビトロで保持されたＥＳ細胞を用いる公
知技術により作られた、非ヒト動物、特にキメラ非ヒト
動物又は該動物の遺伝子導入子孫に関する。本発明のこ
の局面により、ＥＳ細胞は、該ＥＳ細胞が、挿入された
付加遺伝物質を有するＬＩＦ含有培養培地中で継代され
た動物胚から誘導される。意図する遺伝子導入動物は非
ヒト哺乳動物、例えば家畜動物及び反芻動物及び家畜を
含む。
養培地中、インビトロで保持されたＥＳ細胞を用いる公
知技術により作られた、非ヒト動物、特にキメラ非ヒト
動物又は該動物の遺伝子導入子孫に関する。本発明のこ
の局面により、ＥＳ細胞は、該ＥＳ細胞が、挿入された
付加遺伝物質を有するＬＩＦ含有培養培地中で継代され
た動物胚から誘導される。意図する遺伝子導入動物は非
ヒト哺乳動物、例えば家畜動物及び反芻動物及び家畜を
含む。
【００２１】本発明により、「同種」又は「異種」系は、Ｌ
ＩＦが誘導された動物が胚が分離された同じ動物(同種)
か又は異なる動物(異種)である意味に用いうる。ＬＩＦ
は自然発生でありうるが好ましくは組換え又は合成ＬＩ
Ｆである。ＬＩＦは、ＬＩＦが望ましい効果を有するな
らば如何なる起原、例えばヒト、マウス又は家畜動物
(反芻動物を含む)ＬＩＦでありうる。例えば、１つの動
物からのＬＩＦは他の動物からのＬＩＦと同じように活
性でないこともありうる。適当な動物から適切なＬＩＦ
を容易にスクリーンすることは受取人の技量内にある。
組換えＬＩＦが用いられる場合は、真核又は原核細胞で
生成されうる。
ＩＦが誘導された動物が胚が分離された同じ動物(同種)
か又は異なる動物(異種)である意味に用いうる。ＬＩＦ
は自然発生でありうるが好ましくは組換え又は合成ＬＩ
Ｆである。ＬＩＦは、ＬＩＦが望ましい効果を有するな
らば如何なる起原、例えばヒト、マウス又は家畜動物
(反芻動物を含む)ＬＩＦでありうる。例えば、１つの動
物からのＬＩＦは他の動物からのＬＩＦと同じように活
性でないこともありうる。適当な動物から適切なＬＩＦ
を容易にスクリーンすることは受取人の技量内にある。
組換えＬＩＦが用いられる場合は、真核又は原核細胞で
生成されうる。
【００２２】本発明は又、有効量のＬＩＦを、動物(例
えば哺乳動物)胚を維持する媒体と組合せて含む組成物
に向けられる。本発明は、又、１又はそれ以上のヒツジ
栄養膜蛋白、インターロイキン１及び／又は２、マクロ
ファージコロニー刺激因子、マウス線維芽細胞３Ｔ３系
における因子及び／又はプラスミノーゲンと組合せてＬ
ＩＦを含む胚栄養及び／又は胚防御性質を有する組成物
を提供する。上記組成物は、又胚維持培地と組合せう
る。
えば哺乳動物)胚を維持する媒体と組合せて含む組成物
に向けられる。本発明は、又、１又はそれ以上のヒツジ
栄養膜蛋白、インターロイキン１及び／又は２、マクロ
ファージコロニー刺激因子、マウス線維芽細胞３Ｔ３系
における因子及び／又はプラスミノーゲンと組合せてＬ
ＩＦを含む胚栄養及び／又は胚防御性質を有する組成物
を提供する。上記組成物は、又胚維持培地と組合せう
る。
【００２３】本明細書で意図する胚維持媒体はＳＯＦ及
び／又はＭ２を含むがこれに限定されない。
び／又はＭ２を含むがこれに限定されない。
【００２４】本発明により用いられるＬＩＦの量は、胚
を維持及び／又は分化し、及び／又は受精を増強するの
に要するものであり、１００単位／mlないし１０,００
０単位／ml、好ましくは５００単位／mlないし５,００
０単位／mlで最も好ましくは１,０００単位／mlないし
５,０００単位／mlの範囲である。ＬＩＦの単位はＰＣ
Ｔ／ＡＵ８８／０００９３に定義される。
を維持及び／又は分化し、及び／又は受精を増強するの
に要するものであり、１００単位／mlないし１０,００
０単位／ml、好ましくは５００単位／mlないし５,００
０単位／mlで最も好ましくは１,０００単位／mlないし
５,０００単位／mlの範囲である。ＬＩＦの単位はＰＣ
Ｔ／ＡＵ８８／０００９３に定義される。
【００２５】
【発明の実施の形態】さらに本非限定実施例で本発明を
示す。
示す。
【００２６】実施例１ 材料及び方法 胚収集 ４０匹の成熟メリノ雌羊を１４日間０．３gプロゲステ
ロン(リベリナ・アーティフィシャル・ブリーダース、
ＮＳＷ)を含むＣＩＤＲで処置し、ＣＩＤＲ使用中止４
８時間前、５mgの脳下垂体卵胞刺激ホルモンＦＳＨ−Ｐ
(インターベット・オーストラリア・プティ,リミテッ
ド、シドニィ、ＮＳＷ)及び２００国際単位のＰＭＳＧ
(筋肉内)(プレグネコール;ヘリオット・アグベット・プ
ティ、リミテッド、メルボルン、Ｖic)の注射(筋肉
内)、次いで各１２時間後、減量していく投与量のＦ８
Ｈ−Ｐ(４、３、３、２及び１mg)の注射により過排卵し
た。排卵はＣＩＤＲ使用中止２４時間後ゴナドトロピン
−放出ホルモン(ＧnＲＨ;アウスペップ・プリティ、リ
ミテッド、メルボルン、Ｖic)の５０μg注射(筋肉内)に
より確実にし、それは、ほとんどの雌羊が標識クレヨン
と適合した去精雄羊により発情期に検出される時間と一
致した。雌羊は、発情８−１２時間後、腹腔鏡により約
１００×１０6の新鮮な動き得る精子を各子宮角に注入
した。精液を４稔性雄羊から集め、リン酸緩衝食塩水
(フロウ・ラボラトリーズ、ノース・ライド、ＮＳＷ)中
に１に希釈し、媒精前、外界温度に保った。発情６日
後、雌羊をバルビツール酸ナトリウムチオペントン(イ
ントラバル;メイ・アンド・ベーカー、フットスクレ
イ、Ｖic)の注射(筋肉内)により麻酔し、ハロタン(メイ
・アンド・ベイカー)及び酸素の混合物により一般的麻
酔下に維持した。子宮を中央腹開腹により外部に出し、
各角を分岐約１cm下でホレイカテーテル(プロメデイカ
・モーラビン、Ｖic)でカニューレした。洗浄媒体を満
した２０ml管に付着した２０g針を、子宮卵管接合部に
近い子宮の管腔に通した。子宮の各角を洗浄し、媒体プ
ラス胚をホレイカテーテルを経てガラス容器に集めた。
胚を４mg／mlマイルスＢＳＡ(ペンテックス・クリスタ
リン;マイルス・ダイアグノスティックス、カナキー、
イリノイズ、ＵＳＡ)を含むＭ２保持培地に集め、処置
群に配分前、増殖の健康及び段階に従って、等級づけし
た。 胚の培養
ロン(リベリナ・アーティフィシャル・ブリーダース、
ＮＳＷ)を含むＣＩＤＲで処置し、ＣＩＤＲ使用中止４
８時間前、５mgの脳下垂体卵胞刺激ホルモンＦＳＨ−Ｐ
(インターベット・オーストラリア・プティ,リミテッ
ド、シドニィ、ＮＳＷ)及び２００国際単位のＰＭＳＧ
(筋肉内)(プレグネコール;ヘリオット・アグベット・プ
ティ、リミテッド、メルボルン、Ｖic)の注射(筋肉
内)、次いで各１２時間後、減量していく投与量のＦ８
Ｈ−Ｐ(４、３、３、２及び１mg)の注射により過排卵し
た。排卵はＣＩＤＲ使用中止２４時間後ゴナドトロピン
−放出ホルモン(ＧnＲＨ;アウスペップ・プリティ、リ
ミテッド、メルボルン、Ｖic)の５０μg注射(筋肉内)に
より確実にし、それは、ほとんどの雌羊が標識クレヨン
と適合した去精雄羊により発情期に検出される時間と一
致した。雌羊は、発情８−１２時間後、腹腔鏡により約
１００×１０6の新鮮な動き得る精子を各子宮角に注入
した。精液を４稔性雄羊から集め、リン酸緩衝食塩水
(フロウ・ラボラトリーズ、ノース・ライド、ＮＳＷ)中
に１に希釈し、媒精前、外界温度に保った。発情６日
後、雌羊をバルビツール酸ナトリウムチオペントン(イ
ントラバル;メイ・アンド・ベーカー、フットスクレ
イ、Ｖic)の注射(筋肉内)により麻酔し、ハロタン(メイ
・アンド・ベイカー)及び酸素の混合物により一般的麻
酔下に維持した。子宮を中央腹開腹により外部に出し、
各角を分岐約１cm下でホレイカテーテル(プロメデイカ
・モーラビン、Ｖic)でカニューレした。洗浄媒体を満
した２０ml管に付着した２０g針を、子宮卵管接合部に
近い子宮の管腔に通した。子宮の各角を洗浄し、媒体プ
ラス胚をホレイカテーテルを経てガラス容器に集めた。
胚を４mg／mlマイルスＢＳＡ(ペンテックス・クリスタ
リン;マイルス・ダイアグノスティックス、カナキー、
イリノイズ、ＵＳＡ)を含むＭ２保持培地に集め、処置
群に配分前、増殖の健康及び段階に従って、等級づけし
た。 胚の培養
【００２７】胚(健康と評価された１６６及び低品質と
された１７)を無差別に３つの処理群の１つに配分し
た。処理１の胚(桑実胚又は初期胚盤胞段階で８０健康
及び５低品質胚)は、対として(グループ１:n＝３８)又
は単一で(グループ２:n＝４７)発情サイクルの６日にレ
シピエント雌羊に移植する前に５mlのＭ２保持培地中、
１−２時間、１０のロットで培養した。グループ３胚
(桑実胚又は初期胚盤胞段階で４４健康及び６低品質胚)
は移植４８時間前、ＳＯＦ培地中、別々に培養した。Ｓ
ＯＦ培養培地の３分割１００μl小滴を３５×１０mmプ
ラスチックペトリ皿に置き、２．５mlパラフィン油(ラ
ブケム、アジャクス・ケミカルズ、アウバーン、ＮＳ
Ｗ)で覆った。次いで１つの胚を各小滴中に置き、ペト
リ皿を水ジャケットをつけたインキュベーター中に置
き、２０％Ｏ5、５％ＣＯ2及び７５％Ｎ2を含むガス体
中、３９℃に保った。グループ４胚(桑実胚又は初期胚
盤胞で４４健康及び６低品質)は、ヒト組換ＬＩＦを１
０００単位１mの割合で培地に加えた以外、グループ３
と同様にＳＯＦ培養培地中、４８時間培養した。
された１７)を無差別に３つの処理群の１つに配分し
た。処理１の胚(桑実胚又は初期胚盤胞段階で８０健康
及び５低品質胚)は、対として(グループ１:n＝３８)又
は単一で(グループ２:n＝４７)発情サイクルの６日にレ
シピエント雌羊に移植する前に５mlのＭ２保持培地中、
１−２時間、１０のロットで培養した。グループ３胚
(桑実胚又は初期胚盤胞段階で４４健康及び６低品質胚)
は移植４８時間前、ＳＯＦ培地中、別々に培養した。Ｓ
ＯＦ培養培地の３分割１００μl小滴を３５×１０mmプ
ラスチックペトリ皿に置き、２．５mlパラフィン油(ラ
ブケム、アジャクス・ケミカルズ、アウバーン、ＮＳ
Ｗ)で覆った。次いで１つの胚を各小滴中に置き、ペト
リ皿を水ジャケットをつけたインキュベーター中に置
き、２０％Ｏ5、５％ＣＯ2及び７５％Ｎ2を含むガス体
中、３９℃に保った。グループ４胚(桑実胚又は初期胚
盤胞で４４健康及び６低品質)は、ヒト組換ＬＩＦを１
０００単位１mの割合で培地に加えた以外、グループ３
と同様にＳＯＦ培養培地中、４８時間培養した。
【００２８】健康又は低品質(退化)胚、桑実胚、胚盤胞
又は移植の孵化胚盤胞段階に達しているものの数を、胚
収集、各１２時間後及び発情後８日にレシピエント雌羊
に移植する直前の時間に記録した。 培養培地
又は移植の孵化胚盤胞段階に達しているものの数を、胚
収集、各１２時間後及び発情後８日にレシピエント雌羊
に移植する直前の時間に記録した。 培養培地
【００２９】用いた新鮮な培地は１０％(v／v)ウシ胎仔
血清、ペニシリンＧカリウム塩(０．０６０g／l)及びス
トレプトマイシン硫酸塩(０．０５０g／l)を含む、トル
ベッコリン酸緩衝食塩水であった。
血清、ペニシリンＧカリウム塩(０．０６０g／l)及びス
トレプトマイシン硫酸塩(０．０５０g／l)を含む、トル
ベッコリン酸緩衝食塩水であった。
【００３０】Ｍ２培養培地(キィン等１９８２)はヘペス
緩衝液で置き換え幾らかの重炭酸塩を含む修飾クレープ
スーリンガー溶液であった。成分は、ヘペス緩衝液
(４．９６９g／l)、ＮaＣl(５．５３３g／l)、ＫＣl
(０．３５６g／l)、ＣaＣl2・２Ｈ2Ｏ(０．２５２g／
l)、ＫＨ2ＰＯ4(０．１６２g／l)、ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
(０．２９３g／l)、ＮaＨＣＯ3(０．３４９g／l)、ペニ
シリンＧカリウム塩(０．０６０g／l)ストレプトマイシ
ンリン酸塩(０．０５０g／l)、ミリポアＨ2Ｏで１リッ
トルとするであった。
緩衝液で置き換え幾らかの重炭酸塩を含む修飾クレープ
スーリンガー溶液であった。成分は、ヘペス緩衝液
(４．９６９g／l)、ＮaＣl(５．５３３g／l)、ＫＣl
(０．３５６g／l)、ＣaＣl2・２Ｈ2Ｏ(０．２５２g／
l)、ＫＨ2ＰＯ4(０．１６２g／l)、ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
(０．２９３g／l)、ＮaＨＣＯ3(０．３４９g／l)、ペニ
シリンＧカリウム塩(０．０６０g／l)ストレプトマイシ
ンリン酸塩(０．０５０g／l)、ミリポアＨ2Ｏで１リッ
トルとするであった。
【００３１】ＳＯＦ培養培地(テルビット等、１９７２)
はＮaＣl(６．９５g／l)、ＫＣl(０．５３４g／l)、Ｋ
Ｈ2ＰＯ4(０．１６２g／l)、ＣaＣl2２Ｈ2Ｏ(０．２５
２g／l)、ＭgＣl2６Ｈ2Ｏ(０．１０g／l)、ＮaＨＣＯ
3(２,１０６g／l)、乳酸Ｎa(０．６１６g／l)、ピルビ
ン酸Ｎa(０．０３６２g／l)グルコース(０．２７０g／
l)、ＢＳＡ(３２．０g／l)、ペニシリンＧカリウム塩
(０．０６０g／l)、ストレプトマイシン硫酸塩(０．０
５０g／l)ミリポアＨ2Ｏで１リットルとする、よりな
る。
はＮaＣl(６．９５g／l)、ＫＣl(０．５３４g／l)、Ｋ
Ｈ2ＰＯ4(０．１６２g／l)、ＣaＣl2２Ｈ2Ｏ(０．２５
２g／l)、ＭgＣl2６Ｈ2Ｏ(０．１０g／l)、ＮaＨＣＯ
3(２,１０６g／l)、乳酸Ｎa(０．６１６g／l)、ピルビ
ン酸Ｎa(０．０３６２g／l)グルコース(０．２７０g／
l)、ＢＳＡ(３２．０g／l)、ペニシリンＧカリウム塩
(０．０６０g／l)、ストレプトマイシン硫酸塩(０．０
５０g／l)ミリポアＨ2Ｏで１リットルとする、よりな
る。
【００３２】全ての培地は０．２μmフィルター(ミリポ
ア・プティ、リミテッド、リッチモンド、Ｖic)を通し
て無菌とした。
ア・プティ、リミテッド、リッチモンド、Ｖic)を通し
て無菌とした。
【００３３】胚移植 ２００匹の３令雌メリノ羊は１４日ＣＩＤＲ処置で同時
性を持たせたそれらの発情周期を有した。４００国際単
位ＰＭＳＧの注射をＣＩＤＲ使用中止の時に与えた。引
き具及びクレヨンを取り付けた去精した羊を雌羊と共に
置き発情期を検定した。発情期に観察した雌羊は無作為
に４つのレシピエントグループの一つに配分した。レシ
ピエント雌羊を局所麻酔剤(リグノカイン、リパード・
ケミカルズ、ブライトン、Ｖic)で処置し、腹腔鏡を用
いて、各卵巣上の黄体の数を記録した。子宮を位置決定
し、排卵卵巣と同側の子宮角の先端は２cm中央腹切り口
を経て体外に出した。子宮を先端から約４cm穿刺し、Ｍ
Ｓ保持培地中に置いた胚は、１ml管に付着したトムカッ
トカテーテル(サイズ３．５ＦＲ、リパード・ケミカル
ズ、ブライトン、Ｖic)を経て保管した。子宮角は腹腔
にもどし切り口を縫合した。
性を持たせたそれらの発情周期を有した。４００国際単
位ＰＭＳＧの注射をＣＩＤＲ使用中止の時に与えた。引
き具及びクレヨンを取り付けた去精した羊を雌羊と共に
置き発情期を検定した。発情期に観察した雌羊は無作為
に４つのレシピエントグループの一つに配分した。レシ
ピエント雌羊を局所麻酔剤(リグノカイン、リパード・
ケミカルズ、ブライトン、Ｖic)で処置し、腹腔鏡を用
いて、各卵巣上の黄体の数を記録した。子宮を位置決定
し、排卵卵巣と同側の子宮角の先端は２cm中央腹切り口
を経て体外に出した。子宮を先端から約４cm穿刺し、Ｍ
Ｓ保持培地中に置いた胚は、１ml管に付着したトムカッ
トカテーテル(サイズ３．５ＦＲ、リパード・ケミカル
ズ、ブライトン、Ｖic)を経て保管した。子宮角は腹腔
にもどし切り口を縫合した。
【００３４】全てのレシピエント雌羊を引き具を付けた
去精雄羊と共に２１日間放牧して移植前又は移植時に胚
消失を評価した(エディ、１９６７)。妊娠の７０日に超
音波を用いて走査し健康な胎児の数を測定した。
去精雄羊と共に２１日間放牧して移植前又は移植時に胚
消失を評価した(エディ、１９６７)。妊娠の７０日に超
音波を用いて走査し健康な胎児の数を測定した。
【００３５】分析 グループ間の差はカイ二乗分析により測定した。
【００３６】実施例２ 羊胚の孵化後状態へのインビトロ増殖に対するＬＩＦの
効果
効果
【００３７】胚培養 ＳＯＦ培養培地への１,０００単位／mlのヒト組換えＬ
ＩＦの添加は、４８時間インビトロ培養した健康な桑実
胚及び胚盤胞胚の増殖(より桑実胚孵化及び退化少ない)
を有意に改良した(表１)。
ＩＦの添加は、４８時間インビトロ培養した健康な桑実
胚及び胚盤胞胚の増殖(より桑実胚孵化及び退化少ない)
を有意に改良した(表１)。
【００３８】処理グループは共に、胚回収の時に貧弱と
して初めに分類された６胚を有した。処理期間を越え
て、それらの健康は改良されず、それらは廃棄され、レ
シピエント雌羊に移植しなかった。
して初めに分類された６胚を有した。処理期間を越え
て、それらの健康は改良されず、それらは廃棄され、レ
シピエント雌羊に移植しなかった。
【００３９】移植率 培養胚をレシピエント雌羊に個々に移植したとき、ＳＯ
Ｆ＋ＬＩＦで培養した(グループ４)胚を受ける雌羊の２
１日非復帰率(移植率のインディケーター)はＳＯＦのみ
で胚培養を受ける雌羊(グループ３、表２)のそれより有
意に高い。さらにグループ４雌羊の移植率は、２時間の
収集以内に単一胚を受けたレシピエント雌(グループ２)
と同様であったが、両グループの非復帰率は収集後直ち
に移植した２つの胚を有するレシピエント雌(グループ
１)のそれより低かった。
Ｆ＋ＬＩＦで培養した(グループ４)胚を受ける雌羊の２
１日非復帰率(移植率のインディケーター)はＳＯＦのみ
で胚培養を受ける雌羊(グループ３、表２)のそれより有
意に高い。さらにグループ４雌羊の移植率は、２時間の
収集以内に単一胚を受けたレシピエント雌(グループ２)
と同様であったが、両グループの非復帰率は収集後直ち
に移植した２つの胚を有するレシピエント雌(グループ
１)のそれより低かった。
【００４０】妊娠の７０日での実時間超音波走査により
測定した真の妊娠率は表３に示す。
測定した真の妊娠率は表３に示す。
【００４１】上で得られた結果は、ヒト組換えＬＩＦの
培養培地への添加は透明体から「孵化する」羊胚盤胞の数
を４倍増加することを示し、又、２０％Ｏ2、５％ＣＯ2
及び７５％Ｎ2のふん囲気でＳＯＦ中４８時間培養の間
変性する胚の数を減ずる。事実、ＳＯＦ＋ＬＩＦで培養
した胚の６４％は、発情期後８日までに孵化し、それは
インビボで見られたものと類似する(ロウソン及びモア
ー、１９６６、ビンドン、１９７１)。ＬＩＦは逆条件
下に胚の健康を維持する役割を有しうる。さらに、この
培養の間、ＬＩＦ含有培地中、４８時間培養した胚の移
植後、レシピエント雌羊の妊娠率は、収集後直ちに胚を
受けている雌羊のそれに少くとも等しかった。
培養培地への添加は透明体から「孵化する」羊胚盤胞の数
を４倍増加することを示し、又、２０％Ｏ2、５％ＣＯ2
及び７５％Ｎ2のふん囲気でＳＯＦ中４８時間培養の間
変性する胚の数を減ずる。事実、ＳＯＦ＋ＬＩＦで培養
した胚の６４％は、発情期後８日までに孵化し、それは
インビボで見られたものと類似する(ロウソン及びモア
ー、１９６６、ビンドン、１９７１)。ＬＩＦは逆条件
下に胚の健康を維持する役割を有しうる。さらに、この
培養の間、ＬＩＦ含有培地中、４８時間培養した胚の移
植後、レシピエント雌羊の妊娠率は、収集後直ちに胚を
受けている雌羊のそれに少くとも等しかった。
【００４２】胚上のＬＩＦのこの安定役割は、４日ネズ
ミ胚上のＬＩＦレセプターの、及び４日妊娠及び偽妊娠
マウスの及び子宮内膜腺に強く表われているネズミＬＩ
Ｆの局在の最近の報告に一致する。これは、ＬＩＦが胚
の存在に対するよりも妊娠に対する受身応答として生成
されることを示唆する。従ってＬＩＦは、胚が卵管から
子宮に入っている時に生じているように見える。ここで
の結果は、ほぼこの時点で報告された胚死亡率の幾つか
はＬＩＦの胚への適切な供給により防ぐことができるこ
とを示唆する。最近、ヒト及び家畜動物でのほとんどの
胚移植プログラムで、一つの胚が各レシピエントに移植
し生存妊娠を確実にする。我々の研究は、２胚が各雌羊
に移植されるとき、約５０％損失の胚が存在しても(こ
れらの雌の５２％は双子を有し、３７％は１匹で１１％
は妊娠しなかった)妊娠率がほとんど４０％高いことを
示す。従って、ＬＩＦはこの胚損失の幾らかを防ぎ単一
胚の各レシピエント実施の移植を有効になす可能性があ
る。
ミ胚上のＬＩＦレセプターの、及び４日妊娠及び偽妊娠
マウスの及び子宮内膜腺に強く表われているネズミＬＩ
Ｆの局在の最近の報告に一致する。これは、ＬＩＦが胚
の存在に対するよりも妊娠に対する受身応答として生成
されることを示唆する。従ってＬＩＦは、胚が卵管から
子宮に入っている時に生じているように見える。ここで
の結果は、ほぼこの時点で報告された胚死亡率の幾つか
はＬＩＦの胚への適切な供給により防ぐことができるこ
とを示唆する。最近、ヒト及び家畜動物でのほとんどの
胚移植プログラムで、一つの胚が各レシピエントに移植
し生存妊娠を確実にする。我々の研究は、２胚が各雌羊
に移植されるとき、約５０％損失の胚が存在しても(こ
れらの雌の５２％は双子を有し、３７％は１匹で１１％
は妊娠しなかった)妊娠率がほとんど４０％高いことを
示す。従って、ＬＩＦはこの胚損失の幾らかを防ぎ単一
胚の各レシピエント実施の移植を有効になす可能性があ
る。
【００４３】
【表１】 ＳＯＦ(n＝４２)又はＳＯＦ＋１０００単位／mlＬＩＦ(n＝４４)培地での４８時 間培養の間、孵化又は変性する健康な胚の数及びパーセント 培養 孵化胚 変性胚 時間 ＳＯＦ ＳＯＦ＋ＬＩＦ ＳＯＦ ＳＯＦ＋ＬＩＦ ０時間 ０ ０％ ０ ０％ ０ ０％ ０ ０％ １２時間 ０ ０％ ３ ７％ ２ ５％ ０ ０％ ２４時間 １ ２％ １０＊ ２３％ ２ ５％ １ ２％ ３６時間 ６ １４％ １９＊ ４３％ ５ １１％ １ ２％ 40−46時間 ７ １６％ ２８＊ ６４％ １３＊ ２７％ ４ ９％ ＊ はＳＯＦ及びＳＯＦ＋ＬＩＦ処理グループ間の有意差 Ｐ＜０．０５を示す
【００４４】
【表２】 表２ 発情期後２１日に種付けを受けている雌羊 グループ１ グループ２ グループ３ グループ４ M2中1時間1胚 M2中2時間2胚 SOF中48時間1胚 SOF+LIF中4時間1胚 種付けした ０ １３ ２６ １５ 種付けせず １９ ２８ １８ ２７ 計 １９ ４１ ４４ ４２ ％受けなかった 100a ６８b ４１c ６４b 異なる上付き文字は有意差(Ｐ＜０．０５)を示す
【００４５】
【表３】 表３ 発情期後７０日でのレシピエント雌妊娠の数 グループ１ グループ２ グループ３ グループ４ M2中3時間1胚 M2中3時間2胚 SOF中48時間1胚 SOF+LIF中4時間1胚 非妊娠 ２ ２０ ３７ ２１ 妊娠 １７ ２２ ７ ２１ 計 １９ ４２ ４４ ４２ ％妊娠 ８９a ５２b １６c ５０b 異なる上付き文字は有意差(Ｐ＜０．０５)を示す
【００４６】実施例３ 胚培養及び移植でのＬＩＦの用途 羊胚を上述したように発情期後６日にメリノ雌羊から集
めた。しかしながら今回はＳＯＦ、ＳＯＦ＋ネズミＬＩ
Ｆ又はＳＯＦ＋ヒトＬＩＦで１０日間個々にそして毎日
課した発達で培養した。意図はＬＩＦ含有培地で孵化後
発達した胚があるか及びどの程度か、例えばインビボ約
１０−１２日で起きる発達の拡大胚盤胚又は栄養膜段階
に達したかどうかを見ることであった。第二に、培養し
た羊胚の発達に対するネズミＬＩＦの効果も調べた。
めた。しかしながら今回はＳＯＦ、ＳＯＦ＋ネズミＬＩ
Ｆ又はＳＯＦ＋ヒトＬＩＦで１０日間個々にそして毎日
課した発達で培養した。意図はＬＩＦ含有培地で孵化後
発達した胚があるか及びどの程度か、例えばインビボ約
１０−１２日で起きる発達の拡大胚盤胚又は栄養膜段階
に達したかどうかを見ることであった。第二に、培養し
た羊胚の発達に対するネズミＬＩＦの効果も調べた。
【００４７】胚は実施例１におけると正確に同じ方法で
メリノ雌羊から集めた。唯一の違いは、胚が、ＦＳＨが
オバーゲンを生成するか水平再生成により供給されたＲ
ＦＳＨ−５０を生成するかにより過剰排卵したことであ
る。処理は以下の通りであった。 グループ１(n＝１９);ＳＯＦのみで個々に培養した胚。 グループ２(n＝１８);ＳＯＦ＋ネズミＬＩＦで個々に培
養した胚。 mＬＩＦはマウス幹細胞バイオアッセーにより３５００
単位／mlが加え、それはＭ１細胞バイオアッセーを用い
約８０００単位／mlに当る。 グループ３(n＝２０);ＳＯＦ＋ヒトＬＩＦ(hＬＩＦ)で
個々に培養した胚。hＬＩＦはＭ１細胞バイオアッセー
により５０００単位／mlが加えた。
メリノ雌羊から集めた。唯一の違いは、胚が、ＦＳＨが
オバーゲンを生成するか水平再生成により供給されたＲ
ＦＳＨ−５０を生成するかにより過剰排卵したことであ
る。処理は以下の通りであった。 グループ１(n＝１９);ＳＯＦのみで個々に培養した胚。 グループ２(n＝１８);ＳＯＦ＋ネズミＬＩＦで個々に培
養した胚。 mＬＩＦはマウス幹細胞バイオアッセーにより３５００
単位／mlが加え、それはＭ１細胞バイオアッセーを用い
約８０００単位／mlに当る。 グループ３(n＝２０);ＳＯＦ＋ヒトＬＩＦ(hＬＩＦ)で
個々に培養した胚。hＬＩＦはＭ１細胞バイオアッセー
により５０００単位／mlが加えた。
【００４８】培養条件は、胚発達が日に２回であるより
も毎日評価する点を除き上例と同一であった。大気条件
は上記したように即ち２０％Ｏ2、５％ＣＯ2及び７５％
Ｎ2であった。
も毎日評価する点を除き上例と同一であった。大気条件
は上記したように即ち２０％Ｏ2、５％ＣＯ2及び７５％
Ｎ2であった。
【００４９】結果は表４に示す。
【表４】 処理 培養日 ０ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ SOF 10B 19B 13B 11B 1HB 1HB 19D 9M 6D 8D 9B 5B 9D 13D SOF+ 9B 4M 18B 15B 14B 11B 20D mLIF 9M 14B 3D 4D 7D SOF+ 10B 4HB 4FB 12FB 14FB 14FB 14FB 14FB 12FB 11FB 20D hLIF 10M 16B 9HB 7HB 4HB 2HB 1B 1B 8D 9D 5B 2B 1B 1B 5D 5D 8D 9D 2D 2D 3D 3D 凡例: Ｍ＝桑実胚 Ｂ＝胚盤胞 ＨＢ＝孵化胚盤胞 ＦＢ＝透明帯から自由の胚盤胞 Ｄ＝変性胚
【００５０】培養３日後、胚は、ＳＯＦ＋hＬＩＦに置
いたとき(グループ３)ＳＯＦ(グループ１)又はＳＯＦ＋
mＬＩＦ(グループ２)の胚より、有意に発達して孵化す
るか、透明体から完全に孵化した(Ｐ＜０．０１、カイ
二乗)。さらに培養６日後、より少く有意に変性した(Ｐ
＜０．０１、カイ二乗)。胚の発達又は生存へのmＬＩＦ
の有意な効果はなかった。透明体から孵化した胚盤胞
は、変性前伸長を開始しなかった。
いたとき(グループ３)ＳＯＦ(グループ１)又はＳＯＦ＋
mＬＩＦ(グループ２)の胚より、有意に発達して孵化す
るか、透明体から完全に孵化した(Ｐ＜０．０１、カイ
二乗)。さらに培養６日後、より少く有意に変性した(Ｐ
＜０．０１、カイ二乗)。胚の発達又は生存へのmＬＩＦ
の有意な効果はなかった。透明体から孵化した胚盤胞
は、変性前伸長を開始しなかった。
【００５１】実施例４ 本実施例は各第２日に胚を新鮮な培地に置き孵化胚盤胞
をさらに発達させるように試みる以外実施例２を繰り返
す。処理は以下の通りで結果は表５に示す。
をさらに発達させるように試みる以外実施例２を繰り返
す。処理は以下の通りで結果は表５に示す。
【００５２】
【表５】 処理:コントロール−ＳＯＦ グループ１−ＳＯＦ＋マウスＬＩＦ(５０００単位／ml Ｍ１バイオ アッ セーによる) グループ２−ＳＯＦ＋ヒトＬＩＦ(５０００単位／ml Ｍ１バイオア ッセーによる) 表 ５ 処理 培養日 ０ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ＳＯＦ ２Ｂ ２Ｂ ２Ｂ ８Ｄ n＝８ ６Ｍ ６Ｍ ５Ｍ １Ｄ ＳＯＦ＋ ３Ｂ ８Ｂ １ＨＢ ８Ｄ mＬＩＦ ５Ｍ ５Ｄ n＝８ ３Ｄ ＳＯＦ＋ ３Ｂ １ＨＢ ２ＦＢ ５ＦＢ ６ＦＢ ６ＦＢ ６ＦＢ ８Ｄ hＬＩＦ ５Ｍ ５Ｂ ３ＨＢ １ＨＢ ２Ｄ ２Ｄ ２Ｄ n＝８ ２Ｍ １Ｂ ２Ｄ １Ｍ １Ｄ 本実験例もhＬＩＦが培養に保持された桑実胚及び胚盤
胞の健康を改良したことを示す。孵化胚盤胞は約１mmか
ら２mm成長したが、それらは伸長を開始しなかった。
胞の健康を改良したことを示す。孵化胚盤胞は約１mmか
ら２mm成長したが、それらは伸長を開始しなかった。
【００５３】実施例５ 本実施例の目的は、ＳＯＦ培養培地へのＬＩＦの添加が
非常に早い段階の胚を改良するかどうかを調べることで
あった。
非常に早い段階の胚を改良するかどうかを調べることで
あった。
【００５４】本実験例では、胚は、発情期後、種々の時
間でドナー雌羊から取り、ＳＯＦ又はＳＯＦ＋hＬＩＦ
(１０００単位／ml)に特定時間培養し、それらの発達は
細胞のそれらの数を数えることにより評価した。全ての
胚(グループ５のものを除く)は低Ｏ2圧力(７％)の外気
条件で培養し、最も速い段階の胚を通過させて８／１６
細胞ブロックとした。胚健康は、スライド上に細胞を塗
布し、細胞数を数えることにより評価した。 処理: グループ１、２−４細胞胚を発情期後２日に集め、ＳＯ
Ｆ(n＝１０)又はＳＯＦ＋hＬＩＦ(n＝１４)に６日培養
した。 グループ２、２−４細胞胚を発情期後２日に集め、ＳＯ
Ｆ(n＝１５)又はＳＯＦ＋hＬＩＦ(n＝１８)に２.５日培
養した。 グループ３、８／１６細胞胚を発情期後４日に集め、Ｓ
ＯＦ(n＝１１)又はＳＯＦ＋hＬＩＦ(n＝９)に２日培養
した。 グループ４、桑実胚／胚盤胞を発情期後６日に集め、Ｓ
ＯＦ(n＝１９)又はＳＯＦ＋hＬＩＦ(n＝２０)に培養し
た。 これらの全ての胚は７％Ｏ2、５％ＣＯ2、８８％Ｎ2の
特異的大気中で培養した。 グループ５、桑実胚／胚盤胞を発情期後６日に集め、Ｓ
ＯＦ(n＝１９)又はＳＯＦ＋hＬＩＦ(n＝１８)に２日培
養した。 これらの胚は２０％Ｏ2、５％ＣＯ2、７５％Ｎ2の大気
中で培養した。云い換えればこのグループは、実施例
２、３及び４で培養した胚の繰り返しである。
間でドナー雌羊から取り、ＳＯＦ又はＳＯＦ＋hＬＩＦ
(１０００単位／ml)に特定時間培養し、それらの発達は
細胞のそれらの数を数えることにより評価した。全ての
胚(グループ５のものを除く)は低Ｏ2圧力(７％)の外気
条件で培養し、最も速い段階の胚を通過させて８／１６
細胞ブロックとした。胚健康は、スライド上に細胞を塗
布し、細胞数を数えることにより評価した。 処理: グループ１、２−４細胞胚を発情期後２日に集め、ＳＯ
Ｆ(n＝１０)又はＳＯＦ＋hＬＩＦ(n＝１４)に６日培養
した。 グループ２、２−４細胞胚を発情期後２日に集め、ＳＯ
Ｆ(n＝１５)又はＳＯＦ＋hＬＩＦ(n＝１８)に２.５日培
養した。 グループ３、８／１６細胞胚を発情期後４日に集め、Ｓ
ＯＦ(n＝１１)又はＳＯＦ＋hＬＩＦ(n＝９)に２日培養
した。 グループ４、桑実胚／胚盤胞を発情期後６日に集め、Ｓ
ＯＦ(n＝１９)又はＳＯＦ＋hＬＩＦ(n＝２０)に培養し
た。 これらの全ての胚は７％Ｏ2、５％ＣＯ2、８８％Ｎ2の
特異的大気中で培養した。 グループ５、桑実胚／胚盤胞を発情期後６日に集め、Ｓ
ＯＦ(n＝１９)又はＳＯＦ＋hＬＩＦ(n＝１８)に２日培
養した。 これらの胚は２０％Ｏ2、５％ＣＯ2、７５％Ｎ2の大気
中で培養した。云い換えればこのグループは、実施例
２、３及び４で培養した胚の繰り返しである。
【００５５】
【表６】 結果は表６に示す。 処理 平均細胞数(±sem) ＳＯＦ ＳＯＦ＋hＬＩＦ グループ１ ４１.２± ３.９４ ６９.１＊± ８.４２ グループ２ ７.４± ０.５２ ８.５ ± ０.６０ グループ３ １７.７± １.９４ ２４.９ ± ５.２０ グループ４ ７５.７±１０.４０ ８２.７ ±１１.４９ グループ５ ５６.２± ５.９０ ６２.６＊± ８.４２ ＊は、グループ間列内(Ｐ＜０．０５)スチュデントt試験、有意差を示す。 要するに、本実験例は培養培地へのhＬＩＦの添加が、
それらを最適以下の条件、即ち理想大気条件以下(グル
ープ)又は、改良された大気条件下長時間(グループ１)
保持したとき、健康を改良することを示す。
それらを最適以下の条件、即ち理想大気条件以下(グル
ープ)又は、改良された大気条件下長時間(グループ１)
保持したとき、健康を改良することを示す。
【００５６】実施例６ 本実施例の目的は、転移培地へのhＬＩＦの添加がレシ
ピエント雌羊の続く移植率を改良するかどうかを測定す
ることである。
ピエント雌羊の続く移植率を改良するかどうかを測定す
ることである。
【００５７】本実験例では胚は、発情期後６日、過剰排
卵したメリノ雌羊から集めた。それらをＳＯＦ又はＳＯ
Ｆ＋hＬＩＦ(５０００単位／ml)に置き、採収の１時間
以内又は、３９℃で培地中６−８の間保持したのち、レ
シピエント雌羊に個々の内移植した。胚を培養培地に移
植した。妊娠率は、発情期後６５日に超音波走査により
確認した。
卵したメリノ雌羊から集めた。それらをＳＯＦ又はＳＯ
Ｆ＋hＬＩＦ(５０００単位／ml)に置き、採収の１時間
以内又は、３９℃で培地中６−８の間保持したのち、レ
シピエント雌羊に個々の内移植した。胚を培養培地に移
植した。妊娠率は、発情期後６５日に超音波走査により
確認した。
【００５８】結果は表７に示す。
【表７】 グループ 培 地 培養時間 妊 娠 非妊娠 １ ＳＯＦ ＜１時間 ２１(５８％a) １５ ２ ＳＯＦ＋ＬＩＦ ＜１時間 ２１(５１％a) ２０ ３ ＳＯＦ ６−８時間 ８(２１％b) ３０ ４ ＳＯＦ＋ＬＩＦ ６−８時間 ２１(５３％a) １９ 異なる上付き文字は有意差(Ｐ＜０．０１、カイ二乗)を
示す。
示す。
【００５９】本実験例は、胚が収集後直ちに移植された
場合、hＬＩＦが移植率に少し効果を有することを示
す。しかしながら、胚が移植前６−８時間培地に保持さ
れた場合、それは、極めてしばしばフィールドでの状態
である。培地へのhＬＩＦの添加は、さもなければ変性
したかもしれない生存胚を維持する。
場合、hＬＩＦが移植率に少し効果を有することを示
す。しかしながら、胚が移植前６−８時間培地に保持さ
れた場合、それは、極めてしばしばフィールドでの状態
である。培地へのhＬＩＦの添加は、さもなければ変性
したかもしれない生存胚を維持する。
【００６０】実施例７ 市販ＥＴプログラムで、２４８レシピエントメリノ又は
交配種の雌羊はそれぞれ、Ｍ２又はＭ２＋hＬＩＦ(５０
００単位／ml)に保持した２胚を受けた。培養時間は約
１から約６−８時間まで変化した。ドナー雌羊はメリノ
であった。結果を表８に示す。
交配種の雌羊はそれぞれ、Ｍ２又はＭ２＋hＬＩＦ(５０
００単位／ml)に保持した２胚を受けた。培養時間は約
１から約６−８時間まで変化した。ドナー雌羊はメリノ
であった。結果を表８に示す。
【００６１】
【表８】 Ｎ ２胚 １胚 非妊娠 Ｍ２ メリノ １４８ ４４ ４０ ６４ 交配種 ２０ １０ ４ ６ 計 １６８ ５４(３２％) ４４(２６％) ７０(４２％) Ｍ２＋ＬＩＦ メリノ ５６ ２４ １２ ２０ 交配種 ４４ ２４ ７ １３ 計 １００ ４８(４８％) １９(１９％) ３３(３３％) 胚死亡率 Ｍ２＝５５％ Ｍ２＋ＬＩＦ＝４３％
【００６２】Ｍ２培地へのＬＩＦの添加は、移植率を有
意に増加した(Ｐ＜０．０５:カイ二乗)。これはＬＩＦ
がＥＴプログラムに用いた培地に加えたとき、胚保護剤
として、潜在性を有することを示す。この分野の当業者
は、本明細書に記載された発明が特に記載されたもの以
外に変形及び修飾を受けられることを理解しうるであろ
う。本発明がかかる変形及び修飾を全て含むことを理解
すべきである。本発明は又、本明細書において引用し、
又は示した全ての段階、特徴、組成物及び化合物を個々
に又はまとめて、又、該段階又は特徴の全ての２又はそ
れ以上のいかなる、そして全ての組合せをも含む。
意に増加した(Ｐ＜０．０５:カイ二乗)。これはＬＩＦ
がＥＴプログラムに用いた培地に加えたとき、胚保護剤
として、潜在性を有することを示す。この分野の当業者
は、本明細書に記載された発明が特に記載されたもの以
外に変形及び修飾を受けられることを理解しうるであろ
う。本発明がかかる変形及び修飾を全て含むことを理解
すべきである。本発明は又、本明細書において引用し、
又は示した全ての段階、特徴、組成物及び化合物を個々
に又はまとめて、又、該段階又は特徴の全ての２又はそ
れ以上のいかなる、そして全ての組合せをも含む。
【００６３】引例 ビンドン、ビー．エム(１９７１)羊における妊娠の前移
植段階の組織的研究、オーストラリアン・ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・サイエンシズ２４:１３１−１
４７、エディ、(１９６７)ジャーナル・オブ・レプロダ
クション・アンド・ファーティリティ、１３;４３７−
４４３、キン．ピー．バロス．シー．及びヴィッテイン
グトン．ディ．ジー．(１９８２)ヒト精子の受精能力を
検定するためのハムスター卵母細胞の保存、ジャーナル
・オブ・レプロダクション・アンド・ファーティリテ
ィ、６６;１６１−１６８。ローソン．エル．イー．エ
イ．及びモア．アール．エム．(１９６６)最初の１４日
間のヒツジ胎児の発達ジャーナル・オブ・アナトミィ、
１００;７７７−７８５タービット．エイチ．アール．
ウイッテイントン．ディ．ジー．及びローソン．エル．
イー．エイ．(１９７２)ヒツジ及びウシ卵のインビトロ
成功培養、ジャーナル・オブ・レプロダクション・アン
ド・ファーティリティ、３０;４９３−４９６
植段階の組織的研究、オーストラリアン・ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・サイエンシズ２４:１３１−１
４７、エディ、(１９６７)ジャーナル・オブ・レプロダ
クション・アンド・ファーティリティ、１３;４３７−
４４３、キン．ピー．バロス．シー．及びヴィッテイン
グトン．ディ．ジー．(１９８２)ヒト精子の受精能力を
検定するためのハムスター卵母細胞の保存、ジャーナル
・オブ・レプロダクション・アンド・ファーティリテ
ィ、６６;１６１−１６８。ローソン．エル．イー．エ
イ．及びモア．アール．エム．(１９６６)最初の１４日
間のヒツジ胎児の発達ジャーナル・オブ・アナトミィ、
１００;７７７−７８５タービット．エイチ．アール．
ウイッテイントン．ディ．ジー．及びローソン．エル．
イー．エイ．(１９７２)ヒツジ及びウシ卵のインビトロ
成功培養、ジャーナル・オブ・レプロダクション・アン
ド・ファーティリティ、３０;４９３−４９６
Claims (19)
- 【請求項１】 胚または前胚を移植、イン・ビボ受精お
よび／または遺伝子操作で使用するに先立ってイン・ビ
トロ培養する培地に添加することにより使用される、Ｌ
ＩＦを有効成分とする、胚又は前胚の生存性保護剤。 - 【請求項２】 胚が哺乳動物、鳥または魚起原のもので
ある、請求項２の剤。 - 【請求項３】 哺乳動物がヒトまたは家畜動物である、
請求項３の剤。 - 【請求項４】 家畜動物が反芻動物である、請求項４の
剤。 - 【請求項５】 ＬＩＦがヒト、ネズミまたは家畜起原の
ものである、請求項５の剤。 - 【請求項６】 ＬＩＦが反芻動物起原のものである、請
求項５の剤。 - 【請求項７】 ＬＩＦが組換えまたは合成ＬＩＦであ
る、請求項５または６の剤。 - 【請求項８】 ＬＩＦが真核細胞で産生されたものであ
る、請求項７の剤。 - 【請求項９】 ＬＩＦが原核細胞で産生されたものであ
る、請求項７の剤。 - 【請求項１０】 ＬＩＦの添加量が約１００単位／mlか
ら約１０,０００単位／mlである、請求項１ないし２３
のいずれかの剤。 - 【請求項１１】 ＬＩＦの添加量が約５００単位／mlか
ら約５,０００単位／mlである、請求項１０の剤。 - 【請求項１２】 ＬＩＦの添加量が約１,０００単位／m
lから約５,０００単位／mlである、請求項１２の剤。 - 【請求項１３】 胚を培養する培地がＳＯＦおよび／ま
たはＭ２培地である、請求項１の剤。 - 【請求項１４】 ＬＩＦの添加量が約１００単位／mlか
ら約１０,０００単位／mlである、イン・ビトロで動物
胚を保持及び／または発育させるための培地用組成物。 - 【請求項１５】 ＬＩＦがヒト、ネズミまたは家畜動物
起原のものである、請求項１４の組成物。 - 【請求項１６】 ＬＩＦが反芻動物起原のものである、
請求項１５の組成物。 - 【請求項１７】 ＬＩＦが組換え又は合成ＬＩＦであ
る、請求項１４ないし１６のいずれかの組成物。 - 【請求項１８】 組換えＬＩＦが真核細胞で産生された
ものである、請求項１７の組成物。 - 【請求項１９】 組換えＬＩＦが原核細胞で産生された
ものである、請求項１７の組成物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| DE69028514T2 (de) * | 1989-01-10 | 1997-02-20 | Amrad Corp Ltd | Leukämiehemmender faktor aus vieharten und seine verwendung zur verbesserung der implantation und der entwicklung von embryonalen zellen |
| KR950700403A (ko) * | 1992-03-04 | 1995-01-16 | 죤 제이. 쉬바르츠 | 조혈 간세포의 배양 및 그것의 유전공학(culturing of hematopoietic stem cells and their genetic engineering) |
| US5496720A (en) * | 1993-02-10 | 1996-03-05 | Susko-Parrish; Joan L. | Parthenogenic oocyte activation |
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| US6432711B1 (en) * | 1993-11-03 | 2002-08-13 | Diacrin, Inc. | Embryonic stem cells capable of differentiating into desired cell lines |
| US5456360A (en) * | 1994-09-30 | 1995-10-10 | The Perkin-Elmer Corporation | Holder assembly for reaction tubes |
| US5824548A (en) * | 1996-05-29 | 1998-10-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of increasing survival of cultured primate embryos in medium containing exogenous gonadotrophin releasor hormone |
| US20020194637A1 (en) * | 2001-06-06 | 2002-12-19 | University Of Massachussetts | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross species nuclear transplantation |
| US7696404B2 (en) * | 1996-08-19 | 2010-04-13 | Advanced Cell Technology, Inc. | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross species nuclear transplantation and methods for enhancing embryonic development by genetic alteration of donor cells or by tissue culture conditions |
| JP4323571B2 (ja) | 1997-01-31 | 2009-09-02 | エックスワイ， インコーポレイテッド | 光学装置 |
| US6149867A (en) | 1997-12-31 | 2000-11-21 | Xy, Inc. | Sheath fluids and collection systems for sex-specific cytometer sorting of sperm |
| US20040082062A1 (en) * | 1998-06-19 | 2004-04-29 | Sarah Robertson | Method and medium for in vitro culture of human embryos |
| CA2333307A1 (en) * | 1998-07-06 | 2000-01-13 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Sec Retary, Department Of Health And Human Services | Compositions and methods for in vitro fertilization |
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| NZ545311A (en) | 2000-05-09 | 2008-03-28 | Xy Inc | Flow cytometer for high purity X-chromosome bearing and Y-chromosome bearing populations of spermatozoa |
| NZ524523A (en) * | 2000-08-03 | 2006-02-24 | Therapeutic Human Polyclonals | Production of humanized antibodies in transgenic animals |
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| CA2822983C (en) | 2000-11-29 | 2017-05-09 | Xy, Llc | System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations |
| BRPI0313163B1 (pt) | 2002-08-01 | 2015-11-17 | Univ Colorado State | sistema de separação de células espermáticas a baixa pressão |
| US8486618B2 (en) | 2002-08-01 | 2013-07-16 | Xy, Llc | Heterogeneous inseminate system |
| AU2003265471B2 (en) | 2002-08-15 | 2009-08-06 | Xy, Llc. | High resolution flow cytometer |
| US7169548B2 (en) | 2002-09-13 | 2007-01-30 | Xy, Inc. | Sperm cell processing and preservation systems |
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| US10105417B2 (en) * | 2003-03-04 | 2018-10-23 | Aspenbio Pharma, Inc. | Methods and kits for maintaining pregnancy, treating follicular cysts, and synchronizing ovulation using luteinizing hormone |
| DK2305173T3 (en) | 2003-03-28 | 2016-08-22 | Inguran Llc | Apparatus and method for providing sorted particles |
| US20060263829A1 (en) | 2003-05-15 | 2006-11-23 | Evans Kenneth M | Efficient haploid cell sorting flow cytometer systems |
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| US7833147B2 (en) | 2004-07-22 | 2010-11-16 | Inguran, LLC. | Process for enriching a population of sperm cells |
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| AU2019247490A1 (en) | 2018-04-06 | 2020-10-22 | Children's Medical Center Corporation | Compositions and methods for somatic cell reprogramming and modulating imprinting |
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|---|---|---|---|---|
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-
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-
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-
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