JP2000329770A - トロンビン/アンチトロンビン系の機能性を評価するための包括的試験 - Google Patents
トロンビン/アンチトロンビン系の機能性を評価するための包括的試験Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 血栓閉塞のあり得る出現を評価できる新規な
分析法を提供することを目的とする。 【解決手段】 (a)分析する血漿のサンプルを、アン
チトロンビンの阻害活性を促進する物質と混合し;
(b)II因子活性化物質を(a)段階で生成した混合
物に添加し;(c)(b)段階で生成した混合物のフィ
ブリノーゲンをフィブリンに変換するのにかかる時間t
aを測定する段階を含む、トロンビン/アンチトロンビ
ン系の機能性を評価する分析法を提供する。
分析法を提供することを目的とする。 【解決手段】 (a)分析する血漿のサンプルを、アン
チトロンビンの阻害活性を促進する物質と混合し;
(b)II因子活性化物質を(a)段階で生成した混合
物に添加し;(c)(b)段階で生成した混合物のフィ
ブリノーゲンをフィブリンに変換するのにかかる時間t
aを測定する段階を含む、トロンビン/アンチトロンビ
ン系の機能性を評価する分析法を提供する。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、トロンビン/アン
チトロンビン系の機能性を評価するための分析試験に関
する。
チトロンビン系の機能性を評価するための分析試験に関
する。
【0002】
【従来の技術】止血系は、簡潔には、凝固能Pcと抗凝
固能Pantの間の平衡と見なし得る。この平衡の変化
は必然的に病理学的状態をもたらし、特にPantの減
少は、血栓発現状態をもたらし得、一方、Pcの減少
は、出血の危険性を引き起こす。
固能Pantの間の平衡と見なし得る。この平衡の変化
は必然的に病理学的状態をもたらし、特にPantの減
少は、血栓発現状態をもたらし得、一方、Pcの減少
は、出血の危険性を引き起こす。
【0003】トロンビン/アンチトロンビン系は、凝固
生化学、特に定量的にみて重要な役割を果たしている。
事実、トロンビン(活性化II因子)は以下の機能を遂
行する: −フィブリノーゲンを(AおよびBフィブリノペプチド
の脱離により)、フィブリンモノマー(これはその後重
合してフィブリンとなる)に変換; −XIII因子(その機能はフィブリンポリマー鎖間の
結合を確立することである)の活性化; −フィードバック機構によるV因子およびVIII因子
の直接的活性化(これは系のPcをかなり増加させ
る); −プロテインCの活性化(この活性化形は、補因子プロ
テインSと共に、天然抗凝固系の基本酵素である)。
生化学、特に定量的にみて重要な役割を果たしている。
事実、トロンビン(活性化II因子)は以下の機能を遂
行する: −フィブリノーゲンを(AおよびBフィブリノペプチド
の脱離により)、フィブリンモノマー(これはその後重
合してフィブリンとなる)に変換; −XIII因子(その機能はフィブリンポリマー鎖間の
結合を確立することである)の活性化; −フィードバック機構によるV因子およびVIII因子
の直接的活性化(これは系のPcをかなり増加させ
る); −プロテインCの活性化(この活性化形は、補因子プロ
テインSと共に、天然抗凝固系の基本酵素である)。
【0004】トロンビン活性は、基本的に、アンチトロ
ンビン(AT)、および一部、ヘパリン補因子II(H
C II)の阻害作用により調節される。これらの天然
の抗凝固物質によるトロンビン阻害速度は、ヘパリンお
よび/またはグリコサミノグリカン(例えば、デルマタ
ン硫酸)の存在下でかなり増加することが知られてい
る。
ンビン(AT)、および一部、ヘパリン補因子II(H
C II)の阻害作用により調節される。これらの天然
の抗凝固物質によるトロンビン阻害速度は、ヘパリンお
よび/またはグリコサミノグリカン(例えば、デルマタ
ン硫酸)の存在下でかなり増加することが知られてい
る。
【0005】トロンビンとII因子の活性化は、中間体
として知られるメイゾトロンビンによって生理学的に起
こる(J.Rosingら、Thromb Haemo
stas、60(3)、355−360、1988)。
この物質はまた、ある蛇の毒の作用によりインビトロで
も産生できる。メイゾトロンビンはまた、トロンビンと
似た酵素活性を有するが、フィブリノーゲンとの反応速
度およびATによる阻害速度はいずれも、トロンビンの
それとはかなり異なる。
として知られるメイゾトロンビンによって生理学的に起
こる(J.Rosingら、Thromb Haemo
stas、60(3)、355−360、1988)。
この物質はまた、ある蛇の毒の作用によりインビトロで
も産生できる。メイゾトロンビンはまた、トロンビンと
似た酵素活性を有するが、フィブリノーゲンとの反応速
度およびATによる阻害速度はいずれも、トロンビンの
それとはかなり異なる。
【0006】明らかに、循環中のトロンビン活性の増加
が、適切な抗凝固活性により平衡が保たれない場合、P
cが増加すると血栓閉塞の危険性が高まる。
が、適切な抗凝固活性により平衡が保たれない場合、P
cが増加すると血栓閉塞の危険性が高まる。
【0007】プロテインC/プロテインS系の機能性お
よび血漿凝固能の両方を評価する包括的および特異的な
試験が既に使用されているが、これらの方法は、多くの
血栓閉塞の生化学的な説明を提供するには不適当である
ことが判明した。別の言葉でいえば、前の血栓症に罹患
する多くの患者は、上記の試験では完全に正常なパラメ
ーターを示すことが判明した。
よび血漿凝固能の両方を評価する包括的および特異的な
試験が既に使用されているが、これらの方法は、多くの
血栓閉塞の生化学的な説明を提供するには不適当である
ことが判明した。別の言葉でいえば、前の血栓症に罹患
する多くの患者は、上記の試験では完全に正常なパラメ
ーターを示すことが判明した。
【0008】最近文献に報告された提唱されている生化
学的試験(P.E.Makrisら、Blood Co
agulation and Fibrinolysi
s1988、9:665−666)は、ヒトアンチトロ
ンビンとヘパリンの複合体を患者の血漿に添加すること
を基本とする。
学的試験(P.E.Makrisら、Blood Co
agulation and Fibrinolysi
s1988、9:665−666)は、ヒトアンチトロ
ンビンとヘパリンの複合体を患者の血漿に添加すること
を基本とする。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】著者は、この試験を用
いて、血栓症のあり得る原因と考えられる、IIa因子
の阻害に対して異常な耐性を有する患者を同定すること
ができると主張する。
いて、血栓症のあり得る原因と考えられる、IIa因子
の阻害に対して異常な耐性を有する患者を同定すること
ができると主張する。
【0010】従って、現存の方法と並んで、全ての場合
とはいわないまでも、少なくとも高い割合で、血栓閉塞
のあり得る出現を評価できる新規な分析法を提供する必
要が大いにある。
とはいわないまでも、少なくとも高い割合で、血栓閉塞
のあり得る出現を評価できる新規な分析法を提供する必
要が大いにある。
【0011】
【発明を解決するための手段】この課題は、以下のトロ
ンビン/アンチトロンビン系の機能性の決定法により解
決される。
ンビン/アンチトロンビン系の機能性の決定法により解
決される。
【0012】本発明は、(a)分析する血漿のサンプル
を、アンチトロンビンの阻害活性を促進する物質と混合
し;(b)II因子活性化物質を(a)段階で生成した
混合物に添加し;(c)(b)段階で生成した混合物の
フィブリノーゲンをフィブリンに変換するのにかかる時
間taを測定する段階を含む、トロンビン/アンチトロ
ンビン系の機能性を評価する分析法を提供する。
を、アンチトロンビンの阻害活性を促進する物質と混合
し;(b)II因子活性化物質を(a)段階で生成した
混合物に添加し;(c)(b)段階で生成した混合物の
フィブリノーゲンをフィブリンに変換するのにかかる時
間taを測定する段階を含む、トロンビン/アンチトロ
ンビン系の機能性を評価する分析法を提供する。
【0013】さらに、本発明は、(d)(a)項目と同
じ血漿サンプルを、アンチトロンビンの阻害活性を促進
する物質を含まない適切な緩衝液と混合し;(e)II
因子活性化物質を、(d)項目で生成した混合物に添加
し;(f)(d)項目で生成した混合物のフィブリノー
ゲンを、フィブリンに変換するのにかかる時間t0を測
定する段階をさらに含む方法を提供する。
じ血漿サンプルを、アンチトロンビンの阻害活性を促進
する物質を含まない適切な緩衝液と混合し;(e)II
因子活性化物質を、(d)項目で生成した混合物に添加
し;(f)(d)項目で生成した混合物のフィブリノー
ゲンを、フィブリンに変換するのにかかる時間t0を測
定する段階をさらに含む方法を提供する。
【0014】さらに、本発明は、(g)Δサンプル=t
a−t0を計算し;(h)対照血漿について一連の段階
(a)−(g)を反復し;(i)規格化値ΔN=Δ
サンプル/Δ対照を計算し、比R=(t0)サンプル/
(t0)対照を計算する段階をさらに含む方法を提供す
る。
a−t0を計算し;(h)対照血漿について一連の段階
(a)−(g)を反復し;(i)規格化値ΔN=Δ
サンプル/Δ対照を計算し、比R=(t0)サンプル/
(t0)対照を計算する段階をさらに含む方法を提供す
る。
【0015】さらに、本発明は、アンチトロンビンの阻
害活性を促進する物質は、非塩化形またはナトリウム、
カルシウムまたはリチウム塩の非分画ヘパリン、非塩化
形またはナトリウム、カルシウムまたはリチウム塩のL
WMヘパリン、およびデルマタン硫酸、または好ましく
はこれらの混合物からなる群から選択される方法を提供
する。
害活性を促進する物質は、非塩化形またはナトリウム、
カルシウムまたはリチウム塩の非分画ヘパリン、非塩化
形またはナトリウム、カルシウムまたはリチウム塩のL
WMヘパリン、およびデルマタン硫酸、または好ましく
はこれらの混合物からなる群から選択される方法を提供
する。
【0016】さらに、本発明は、非分画ヘパリンおよび
/またはLMWヘパリンの水溶液中の濃度は、4ないし
8U/mlであり、デルマタン硫酸の濃度は15ないし
25μg/mlである方法を提供する。
/またはLMWヘパリンの水溶液中の濃度は、4ないし
8U/mlであり、デルマタン硫酸の濃度は15ないし
25μg/mlである方法を提供する。
【0017】さらに、本発明は、II因子活性化物質
は、Echis Carinatus毒またはその精製
画分、好ましくは0.5および2μg/mlの濃度の水
溶液である方法を提供する。
は、Echis Carinatus毒またはその精製
画分、好ましくは0.5および2μg/mlの濃度の水
溶液である方法を提供する。
【0018】さらに、本発明は、(a)段階で使用した
試薬を、1−20mmol/lの濃度のCa2+または
Mg2+塩および50−200mmol/lの濃度のN
a+またはK+塩を含む水溶液中に前以て加えておく方
法を提供する。
試薬を、1−20mmol/lの濃度のCa2+または
Mg2+塩および50−200mmol/lの濃度のN
a+またはK+塩を含む水溶液中に前以て加えておく方
法を提供する。
【0019】さらに、本発明は、アンチトロンビンの阻
害活性を促進する物質およびII因子活性化物質を、溶
液または固体形で前以て混合する方法を提供する。
害活性を促進する物質およびII因子活性化物質を、溶
液または固体形で前以て混合する方法を提供する。
【0020】さらに、本発明は、固体形は凍結乾燥形で
ある方法を提供する。
ある方法を提供する。
【0021】さらに、本発明は、(d)段階で使用した
緩衝液は、1−20mmol/lの濃度のCa2+また
はMg2+塩および50−200mmol/lの濃度の
Na +またはK+塩を含む水溶液である方法を提供す
る。
緩衝液は、1−20mmol/lの濃度のCa2+また
はMg2+塩および50−200mmol/lの濃度の
Na +またはK+塩を含む水溶液である方法を提供す
る。
【0022】さらに、本発明は、アンチトロンビンの阻
害活性を促進する物質およびII因子活性化物質を、別
々の形でまたは混合物として、溶液または固体形で含
む、トロンビン/アンチトロンビン系の機能性を決定す
るキットを提供する。
害活性を促進する物質およびII因子活性化物質を、別
々の形でまたは混合物として、溶液または固体形で含
む、トロンビン/アンチトロンビン系の機能性を決定す
るキットを提供する。
【0023】さらに、本発明は、アンチトロンビンの阻
害活性を促進する物質を、非塩化形またはナトリウム、
カルシウムまたはリチウム塩の非分画ヘパリン、非塩化
形またはナトリウム、カルシウムまたはリチウム塩のL
WMヘパリン、およびデルマタン硫酸、または好ましく
はその混合物からなる群から選択されるキットを提供す
る。
害活性を促進する物質を、非塩化形またはナトリウム、
カルシウムまたはリチウム塩の非分画ヘパリン、非塩化
形またはナトリウム、カルシウムまたはリチウム塩のL
WMヘパリン、およびデルマタン硫酸、または好ましく
はその混合物からなる群から選択されるキットを提供す
る。
【0024】さらに、本発明は、II因子活性化物質
は、Echis Carinatus毒またはその精製
画分であるキットを提供する。
は、Echis Carinatus毒またはその精製
画分であるキットを提供する。
【0025】さらに、本発明は、非塩化形またはナトリ
ウム、カルシウムまたはリチウム塩の非分画ヘパリン、
非塩化形またはナトリウム、カルシウムまたはリチウム
塩のLWMヘパリン、および/またはデルマタン硫酸、
および凍結乾燥形のEchis Carinatus毒
またはその精製画分の混合物を含む組成物を提供する。
ウム、カルシウムまたはリチウム塩の非分画ヘパリン、
非塩化形またはナトリウム、カルシウムまたはリチウム
塩のLWMヘパリン、および/またはデルマタン硫酸、
および凍結乾燥形のEchis Carinatus毒
またはその精製画分の混合物を含む組成物を提供する。
【0026】
【発明の実施の形態】本発明の分析法は、以下の段階か
らなる: (a)分析する血漿のサンプルを、アンチトロンビンの
阻害活性を促進する物質と混合し; (b)II因子活性化物質を(a)段階で生成した混合
物に添加し; (c)(b)段階で生成した混合物のフィブリノーゲン
を、フィブリンに変換するのにかかる時間taを測定す
る。
らなる: (a)分析する血漿のサンプルを、アンチトロンビンの
阻害活性を促進する物質と混合し; (b)II因子活性化物質を(a)段階で生成した混合
物に添加し; (c)(b)段階で生成した混合物のフィブリノーゲン
を、フィブリンに変換するのにかかる時間taを測定す
る。
【0027】測定した時間taは、試験下、血漿のPc
およびPantの両方に依存する。
およびPantの両方に依存する。
【0028】次いでこの方法は以下の段階へと続く: (d)(a)項目と同じ血漿サンプルを、アンチトロン
ビンの阻害活性を促進する物質を含まない適切な緩衝液
と混合し; (e)II因子活性化物質を、(d)項目で生成した混
合物に添加し; (f)(d)項目で生成した混合物のフィブリノーゲン
を、フィブリンに変換するのにかかる時間t0を測定す
る。
ビンの阻害活性を促進する物質を含まない適切な緩衝液
と混合し; (e)II因子活性化物質を、(d)項目で生成した混
合物に添加し; (f)(d)項目で生成した混合物のフィブリノーゲン
を、フィブリンに変換するのにかかる時間t0を測定す
る。
【0029】測定した時間t0は、試験下、血漿のPc
にのみ依存する。
にのみ依存する。
【0030】次いで、Δサンプル=ta−t0を計算す
る。
る。
【0031】かくして得たΔサンプル値を、対照血漿
(正常な患者の血漿混合物)を(a)−(f)段階の方
法で処理し、再度、対照差(ta−t0)対照を計算す
ることにより得たΔ対照と関連づけることにより、規格
化することが有利であり得る。規格化した値は以下のよ
うに計算する: ΔN=Δサンプル/Δ対照 (a)項目で提供されるアンチトロンビンの阻害活性を
促進する物質は、非塩化形またはナトリウム、カルシウ
ムまたはリチウム塩の非分画ヘパリン(分子量1000
−15000ドルトン)、非塩化形またはナトリウム、
カルシウムまたはリチウム塩の低分子量ヘパリン(分子
量<5000ドルトンのLMWヘパリン)およびデルマ
タン硫酸塩からなる群から選択する。
(正常な患者の血漿混合物)を(a)−(f)段階の方
法で処理し、再度、対照差(ta−t0)対照を計算す
ることにより得たΔ対照と関連づけることにより、規格
化することが有利であり得る。規格化した値は以下のよ
うに計算する: ΔN=Δサンプル/Δ対照 (a)項目で提供されるアンチトロンビンの阻害活性を
促進する物質は、非塩化形またはナトリウム、カルシウ
ムまたはリチウム塩の非分画ヘパリン(分子量1000
−15000ドルトン)、非塩化形またはナトリウム、
カルシウムまたはリチウム塩の低分子量ヘパリン(分子
量<5000ドルトンのLMWヘパリン)およびデルマ
タン硫酸塩からなる群から選択する。
【0032】適切な希釈剤、例えば水または適切に緩衝
した水に溶解した促進剤の濃度は、非分画ヘパリンおよ
びLMWヘパリンの両方において、好ましくは、4ない
し8U/mlであり、デルマタン硫酸においては15な
いし25μg/mlである。
した水に溶解した促進剤の濃度は、非分画ヘパリンおよ
びLMWヘパリンの両方において、好ましくは、4ない
し8U/mlであり、デルマタン硫酸においては15な
いし25μg/mlである。
【0033】好ましくは、全成分の混合物を使用する。
事実非分画ヘパリンは、FIIaおよびFXa因子に関
連してその作用を遂行するが、LWMヘパリンは、選択
的にFXa因子にのみ作用する。デルマタン硫酸の作用
は、アンチトロンビンおよびヘパリン補因子IIの両方
により、専らFIIa因子に向けられる。HCIIの阻
害速度は、ATのそれよりも大きい。
事実非分画ヘパリンは、FIIaおよびFXa因子に関
連してその作用を遂行するが、LWMヘパリンは、選択
的にFXa因子にのみ作用する。デルマタン硫酸の作用
は、アンチトロンビンおよびヘパリン補因子IIの両方
により、専らFIIa因子に向けられる。HCIIの阻
害速度は、ATのそれよりも大きい。
【0034】例えば、LMWヘパリンのみの添加は、F
IIa因子またはヘパリン補因子IIに関連した機能的
異常を示さないことが判明した。
IIa因子またはヘパリン補因子IIに関連した機能的
異常を示さないことが判明した。
【0035】II因子活性化物質は、好ましくは、Ec
his Carinatusの毒またはその精製画分で
ある。この試薬を使用する利点は、Echis Car
inatusの毒がFIIを直接的および選択的に活性
化することである。
his Carinatusの毒またはその精製画分で
ある。この試薬を使用する利点は、Echis Car
inatusの毒がFIIを直接的および選択的に活性
化することである。
【0036】水などの適切な溶媒に溶解した、II因子
活性化物質の濃度は、好ましくは、0.5ないし2μg
/mlである。
活性化物質の濃度は、好ましくは、0.5ないし2μg
/mlである。
【0037】(a)項目および(b)項目、および
(e)項目で使用した試薬は、それぞれ、一般的に、分
析する血漿と混合する前に、1−20mmol/lの濃
度のCa 2+またはMg2+塩および50−200mm
ol/lの濃度のNa+またはK +塩を含む水溶液に添
加する。この水溶液はまた、(d)段階で使用した緩衝
液も構成する。
(e)項目で使用した試薬は、それぞれ、一般的に、分
析する血漿と混合する前に、1−20mmol/lの濃
度のCa 2+またはMg2+塩および50−200mm
ol/lの濃度のNa+またはK +塩を含む水溶液に添
加する。この水溶液はまた、(d)段階で使用した緩衝
液も構成する。
【0038】本発明の方法の好ましい実施形態におい
て、アンチトロンビンの阻害を促進する物質およびII
因子活性化物質を上記で指示した量で前以て混合し、次
いでこの混合物を分析する血漿サンプルに添加する。こ
の変法において、このように(a)および(b)段階を
単一の操作段階に合わせる。同様に、(d)および
(e)段階を、単一の操作段階に合わせる。事実、その
後にFII因子を活性化する物質を添加する前に、ヘパ
リンと共に血漿サンプルを前以てインキュベートするこ
とは厳密に必要ではないことが判明している。
て、アンチトロンビンの阻害を促進する物質およびII
因子活性化物質を上記で指示した量で前以て混合し、次
いでこの混合物を分析する血漿サンプルに添加する。こ
の変法において、このように(a)および(b)段階を
単一の操作段階に合わせる。同様に、(d)および
(e)段階を、単一の操作段階に合わせる。事実、その
後にFII因子を活性化する物質を添加する前に、ヘパ
リンと共に血漿サンプルを前以てインキュベートするこ
とは厳密に必要ではないことが判明している。
【0039】本法に使用した試薬は、好ましくは凍結乾
燥形で使用する。
燥形で使用する。
【0040】本発明の分析法は、以下の実施例によりさ
らに説明される。
らに説明される。
【0041】実施例1 100μlの血漿(これはプロセスを通じて37℃に維
持した)に、4.0U/mlのナトリウムヘパリン、
5.0mmol/lのCa2+塩および150mmol
/lのNa+塩の水溶液100μlを補足した。次い
で、1.0μg/mlの濃度のEchis Carin
atus毒の水溶液100μlを添加した。血漿の凝固
に必要な時間taを記録した。
持した)に、4.0U/mlのナトリウムヘパリン、
5.0mmol/lのCa2+塩および150mmol
/lのNa+塩の水溶液100μlを補足した。次い
で、1.0μg/mlの濃度のEchis Carin
atus毒の水溶液100μlを添加した。血漿の凝固
に必要な時間taを記録した。
【0042】100μlの同血漿に、再び37℃で、
5.0mmol/lのCa2+塩および150mmol
/lのNa+塩を含む水溶液100μlおよび、その
後、1.0μg/mlの濃度のEchis Carin
atus毒の100μl水溶液を補足した。血漿の凝固
に必要な時間t0を記録した。
5.0mmol/lのCa2+塩および150mmol
/lのNa+塩を含む水溶液100μlおよび、その
後、1.0μg/mlの濃度のEchis Carin
atus毒の100μl水溶液を補足した。血漿の凝固
に必要な時間t0を記録した。
【0043】次いで差 Δサンプル=(ta−t0)サンプル を計算した。対照血漿について上記した段階を反復する
ことにより、値 Δ対照=(ta−t0)対照 を得た。以下のパラメーター: R=(t0)サンプル/(t0)対照 および次いで ΔN=Δサンプル/Δ対照 を計算した。
ことにより、値 Δ対照=(ta−t0)対照 を得た。以下のパラメーター: R=(t0)サンプル/(t0)対照 および次いで ΔN=Δサンプル/Δ対照 を計算した。
【0044】実施例2 100μlの血漿(これはプロセスを通じて37℃に維
持した)に、2.0U/mlのナトリウムヘパリン、
0.5μg/mlのEchis Carinatus
毒、2.5mmol/lのCa2+塩および75mmo
l/lのNa+塩の水溶液200μlを補足した。血漿
の凝固に必要な時間taを記録した。
持した)に、2.0U/mlのナトリウムヘパリン、
0.5μg/mlのEchis Carinatus
毒、2.5mmol/lのCa2+塩および75mmo
l/lのNa+塩の水溶液200μlを補足した。血漿
の凝固に必要な時間taを記録した。
【0045】100μlの同血漿に、再び37℃で、
0.5μg/mlのEchis Carinatus
毒、2.5mmol/lのCa2+塩および75mmo
l/lのNa+塩を含む水溶液200μlを補足した。
血漿の凝固に必要な時間t0を記録した。差 Δサンプル=(ta−t0)サンプル を次いで計算した。対照血漿について上記した段階を反
復することにより、値 Δ対照=(ta−t0)対照 を得た。以下のパラメーター: R=(t0)サンプル/(t0)対照および次いで ΔN=Δサンプル/Δ対照 を計算した。
0.5μg/mlのEchis Carinatus
毒、2.5mmol/lのCa2+塩および75mmo
l/lのNa+塩を含む水溶液200μlを補足した。
血漿の凝固に必要な時間t0を記録した。差 Δサンプル=(ta−t0)サンプル を次いで計算した。対照血漿について上記した段階を反
復することにより、値 Δ対照=(ta−t0)対照 を得た。以下のパラメーター: R=(t0)サンプル/(t0)対照および次いで ΔN=Δサンプル/Δ対照 を計算した。
【0046】実施例1および2の方法に従って得られた
結果は以下のように解釈し得る:
結果は以下のように解釈し得る:
【表1】 ----------------------------------------------------------------------- 結果 有意 あり得る原因 ----------------------------------------------------------------------- R>1.25 凝固活性減少 −II因子活性減少 −フィブリン血症障害 R<0.90 凝固活性増加 −II因子活性増加 (生理学的または20210GA変異) ΔN<0.75 FIIaの阻害に −AT活性減少 対する耐性の増加 (後天性または先天性) −HCII活性減少 (後天性または先天性) −II因子活性増加 −フィブリノーゲン含量増加 −II因子の機能異常 −X因子の機能異常 ----------------------------------------------------------------------- 表2は、トロンビン/アンチトロンビン系に生来いくつ
かの異常を有する患者の血症の分析により得た結果を示
す。この場合でも、実施例1および2の方法を行った。
かの異常を有する患者の血症の分析により得た結果を示
す。この場合でも、実施例1および2の方法を行った。
【0047】
【表2】 ----------------------------------------------------------------------- 欠陥または異常 t0(秒) ta(秒) R ΔN ----------------------------------------------------------------------- フィブリン血症障害 90 300 2.50 2.50 フィブリノーゲン (>700mg/dl) 45 130 0.80 0.60 AT欠損 50 150 1.00 0.70 HCII欠損 50 150 1.00 0.70 II因子(>120%) 生理学的含蓄 45 140 0.80 0.60 20210GA変異 45 140 0.80 0.60 II因子(>150%) 90 300 2.50 2.50 正常対照 50 190 1.00 1.00 全く不明 50 150 1.00 0.70 全く不明 45 150 0.80 0.70 ----------------------------------------------------------------------- 従って、前記並びに表1および2から、本発明の分析法
は、トロンビン/アンチトロンビン系の機能性の完全な
考察を提供できることは明らかである。
は、トロンビン/アンチトロンビン系の機能性の完全な
考察を提供できることは明らかである。
【0048】本発明の方法に使用した試薬、特にATの
阻害活性を促進する物質およびFII因子活性化物質
は、それらが別々または混合形、溶液または固体状態、
好ましくは凍結乾燥形で存在し得るキットで提供され得
る。
阻害活性を促進する物質およびFII因子活性化物質
は、それらが別々または混合形、溶液または固体状態、
好ましくは凍結乾燥形で存在し得るキットで提供され得
る。
【0049】
【発明の効果】本願発明によると、高い割合で、血栓閉
塞のあり得る出現を評価することを可能とする。
塞のあり得る出現を評価することを可能とする。
【0050】また、本願発明に方法によると、簡易に、
血栓閉塞の出現を評価することを可能とする。
血栓閉塞の出現を評価することを可能とする。
【0051】さらに、本願発明のキットによると、簡易
に、トロンビン/アンチトロンビン系の機能性を決定す
ることを可能とする。
に、トロンビン/アンチトロンビン系の機能性を決定す
ることを可能とする。
Claims (14)
- 【請求項1】 (a)分析する血漿のサンプルを、アン
チトロンビンの阻害活性を促進する物質と混合し; (b)II因子活性化物質を前記(a)段階で生成した
混合物に添加し; (c)前記(b)段階で生成した混合物のフィブリノー
ゲンをフィブリンに変換するのにかかる時間taを測定
する段階を含む、トロンビン/アンチトロンビン系の機
能性を評価する分析法。 - 【請求項2】 (d)前記(a)項目と同じ血漿サンプ
ルを、アンチトロンビンの阻害活性を促進する物質を含
まない適切な緩衝液と混合し; (e)II因子活性化物質を前記(d)項目で生成した
混合物に添加し; (f)前記(d)項目で生成した混合物のフィブリノー
ゲンを、フィブリンに変換するのにかかる時間t0を測
定する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 (g)前記ta及びt0から、Δ
サンプル=ta−t0を計算し; (h)対照血漿について一連の段階(a)−(g)を反
復し; (i)規格化値ΔN=Δサンプル/Δ対照を計算し、比
R=(t0)サンプル/(t0)対照を計算する段階を
さらに含む、請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】 前記アンチトロンビンの阻害活性を促進
する物質は、非塩化形またはナトリウム、カルシウムま
たはリチウム塩の非分画ヘパリン、非塩化形またはナト
リウム、カルシウムまたはリチウム塩のLWMヘパリ
ン、およびデルマタン硫酸、またはこれら混合物からな
る群から選択される、請求項1ないし3のいずれか1項
に記載の方法。 - 【請求項5】 非分画ヘパリンおよび/またはLMWヘ
パリンの水溶液中の濃度は、4ないし8U/mlであ
り、デルマタン硫酸の濃度は15ないし25μg/ml
である、請求項4に記載の方法。 - 【請求項6】 II因子活性化物質は、Echis C
arinatus毒またはその精製画分、好ましくは
0.5および2μg/mlの濃度の水溶液である、請求
項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項7】 前記(a)段階で使用した試薬を、1−
20mmol/lの濃度のCa2+またはMg2+塩お
よび50−200mmol/lの濃度のNa +またはK
+塩を含む水溶液中に前以て加えておく、請求項1ない
し6のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項8】 前記アンチトロンビンの阻害活性を促進
する物質および前記II因子活性化物質を、溶液または
固体形で前以て混合する、請求項1ないし7のいずれか
1項に記載の方法。 - 【請求項9】 前記固体形は凍結乾燥形である、請求項
8に記載の方法。 - 【請求項10】 前記(d)段階で使用した緩衝液は、
1−20mmol/lの濃度のCa2+またはMg2+
塩および50−200mmol/lの濃度のNa+また
はK+塩を含む水溶液である、請求項1ないし9のいず
れか1項に記載の方法。 - 【請求項11】 前記アンチトロンビンの阻害活性を促
進する物質および前記II因子活性化物質を、別々の形
でまたは混合物として、溶液または固体形で含む、トロ
ンビン/アンチトロンビン系の機能性を決定するキッ
ト。 - 【請求項12】 前記アンチトロンビンの阻害活性を促
進する物質を、非塩化形またはナトリウム、カルシウム
またはリチウム塩の非分画ヘパリン、非塩化形またはナ
トリウム、カルシウムまたはリチウム塩のLWMヘパリ
ン、およびデルマタン硫酸、または好ましくはその混合
物からなる群から選択する、請求項11に記載のキッ
ト。 - 【請求項13】 前記II因子活性化物質は、Echi
s Carinatus毒またはその精製画分である、
請求項11または請求項12に記載のキット。 - 【請求項14】 非塩化形またはナトリウム、カルシウ
ムまたはリチウム塩の非分画ヘパリン、非塩化形または
ナトリウム、カルシウムまたはリチウム塩のLWMヘパ
リン、および/またはデルマタン硫酸、および凍結乾燥
形のEchis Carinatus毒またはその精製
画分の混合物を含む組成物。
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EP99830209.5 | 1999-04-12 | ||
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Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1045250A1 (ja) |
JP (1) | JP2000329770A (ja) |
CA (1) | CA2305085A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016512893A (ja) * | 2013-03-18 | 2016-05-09 | イリイチ・エプシテイン オレグ | 医薬の調節効力の程度を測定する方法 |
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---|---|---|---|---|
KR0158845B1 (ko) * | 1995-07-28 | 1999-02-18 | 배순훈 | 리튬건전지의 과부하 방지구조 |
CN117741166B (zh) * | 2024-02-19 | 2024-04-26 | 北京水木济衡生物技术有限公司 | 一种多项目复合凝血质控品及其制备方法 |
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WO1993007491A1 (en) * | 1991-10-04 | 1993-04-15 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | A soluble thrombomodulin-based one-stage assay for vitamin k-dependent coagulation-inhibiting proteins |
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US5972681A (en) * | 1995-03-03 | 1999-10-26 | Eisai Co., Ltd. | Calcium-requiring prothrombin activator |
US5780255A (en) * | 1995-06-09 | 1998-07-14 | Instrumentation Laboratory, S.P.A. | Protein C pathway screening test |
-
1999
- 1999-04-12 EP EP99830209A patent/EP1045250A1/en not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-04-12 JP JP2000110639A patent/JP2000329770A/ja active Pending
- 2000-04-12 CA CA 2305085 patent/CA2305085A1/en not_active Abandoned
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2016512893A (ja) * | 2013-03-18 | 2016-05-09 | イリイチ・エプシテイン オレグ | 医薬の調節効力の程度を測定する方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2305085A1 (en) | 2000-10-12 |
EP1045250A1 (en) | 2000-10-18 |
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