JP2000325088A - ユーカリ属の樹種判別方法及びユーカリ属の樹種判別用プライマーセット - Google Patents
ユーカリ属の樹種判別方法及びユーカリ属の樹種判別用プライマーセットInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＤＮＡの自己消化や微生物由来のＤＮＡの混
入によっても影響されることのない、ＤＮＡの塩基配列
情報に基づいた、ユーカリ属の樹種判別方法を提供す
る。また、パルプや紙の製造において、木材片の状態と
なった原料についてもその樹種を判別することのでき
る、ユーカリ属の樹種判別方法を提供する。 【解決手段】 配列番号１〜６に示す塩基配列をそれぞ
れ有する６つのプライマーより選ばれ、かつ、互いに異
なる塩基配列を有する２つのプライマーからなるプライ
マーセットを２種以上用い、ユーカリ属に属する樹木の
組織より抽出したＤＮＡについてＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ−
ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分析を繰返し、その結
果を利用する。
入によっても影響されることのない、ＤＮＡの塩基配列
情報に基づいた、ユーカリ属の樹種判別方法を提供す
る。また、パルプや紙の製造において、木材片の状態と
なった原料についてもその樹種を判別することのでき
る、ユーカリ属の樹種判別方法を提供する。 【解決手段】 配列番号１〜６に示す塩基配列をそれぞ
れ有する６つのプライマーより選ばれ、かつ、互いに異
なる塩基配列を有する２つのプライマーからなるプライ
マーセットを２種以上用い、ユーカリ属に属する樹木の
組織より抽出したＤＮＡについてＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ−
ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分析を繰返し、その結
果を利用する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡに基づくユ
ーカリ属樹種の分類方法に関する。
ーカリ属樹種の分類方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ユーカリ属は、オーストラリアを原産地
とする高木の常緑木本植物であり、主として建築、パル
プ、薪炭用材として世界各地で植林が行なわれている。
このユーカリ属には、約６００の種や亜種が存在する
が、これらの種や亜種は、他の植物と同様、葉や葯の形
態、樹皮の形質等の外部形態を指標として判別されてき
た（Ｉ．Ｂｒｏｏｋｅｒ、Ｄ．Ｋｌｅｉｎｉｇ、１９９
０、Ｆｉｅｌｄ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｅｕｃａｌｙｐｔ
ｕｓ、ｖｏｌ．１−３）。
とする高木の常緑木本植物であり、主として建築、パル
プ、薪炭用材として世界各地で植林が行なわれている。
このユーカリ属には、約６００の種や亜種が存在する
が、これらの種や亜種は、他の植物と同様、葉や葯の形
態、樹皮の形質等の外部形態を指標として判別されてき
た（Ｉ．Ｂｒｏｏｋｅｒ、Ｄ．Ｋｌｅｉｎｉｇ、１９９
０、Ｆｉｅｌｄ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｅｕｃａｌｙｐｔ
ｕｓ、ｖｏｌ．１−３）。
【０００３】もっとも、外部形態を指標として種の判別
ができるのは、その形態が保持されている場合に限られ
る。例えば、パルプや紙の製造においては、多くの場
合、その原料となる木材は、木材片（小さいものをチッ
プと呼ぶ。）の状態で購入され、管理される。パルプや
紙の製造において、原料としてどの樹種を用いるかとい
うことは、その製造条件を決定し、収率の変動を把握す
るために、非常に重要な問題である（Ｔ．ｔａｎａｂ
ｅ、１９９５、５３−６４、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆ ｔｈｅ Ｊｏｉｎｔ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ／Ｊ
ａｐａｎｅｓｅ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ）が、こうした木材
片について、その外部形態から樹種を判別するのは殆ど
不可能に近い。そこで、このような木材片の状態となっ
た原料についても、その樹種を判別することのできる方
法が必要とされていた。
ができるのは、その形態が保持されている場合に限られ
る。例えば、パルプや紙の製造においては、多くの場
合、その原料となる木材は、木材片（小さいものをチッ
プと呼ぶ。）の状態で購入され、管理される。パルプや
紙の製造において、原料としてどの樹種を用いるかとい
うことは、その製造条件を決定し、収率の変動を把握す
るために、非常に重要な問題である（Ｔ．ｔａｎａｂ
ｅ、１９９５、５３−６４、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆ ｔｈｅ Ｊｏｉｎｔ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ／Ｊ
ａｐａｎｅｓｅ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ）が、こうした木材
片について、その外部形態から樹種を判別するのは殆ど
不可能に近い。そこで、このような木材片の状態となっ
た原料についても、その樹種を判別することのできる方
法が必要とされていた。
【０００４】かかる判別方法として、生化学的あるいは
分子生物学的技術を利用した手法が考えられる。例えば
アイソザイム分析や、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐ
ｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）法も
しくはＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍ
ｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍ）法
等のＤＮＡの塩基配列情報に基づく分析によれば、植物
の外部形態によらずにその種を判別することができる
（Ｍ．Ｍ．Ｓａｌｅ、Ｂ．Ｍ．Ｐｏｔｔｓ、１９９３、
Ａｕｓｔ．ＳｙＳｔ．Ｂｏｔ．６、１２７−１３８、
Ｌ．Ｈ．Ｒｉｅｓｅｂｅｒｇ、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｃｋｓｔｒ
ｏｍ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、１９９１、Ｓｙｓｔｅｍａ
ｔｉｃ Ｂｏｔａｎｙ、１６（１）、５０−７６）。
分子生物学的技術を利用した手法が考えられる。例えば
アイソザイム分析や、ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐ
ｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）法も
しくはＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍ
ｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍ）法
等のＤＮＡの塩基配列情報に基づく分析によれば、植物
の外部形態によらずにその種を判別することができる
（Ｍ．Ｍ．Ｓａｌｅ、Ｂ．Ｍ．Ｐｏｔｔｓ、１９９３、
Ａｕｓｔ．ＳｙＳｔ．Ｂｏｔ．６、１２７−１３８、
Ｌ．Ｈ．Ｒｉｅｓｅｂｅｒｇ、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｃｋｓｔｒ
ｏｍ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、１９９１、Ｓｙｓｔｅｍａ
ｔｉｃ Ｂｏｔａｎｙ、１６（１）、５０−７６）。
【０００５】しかし、パルプや紙の原料となる木材片
は、そのもともとの立木が伐採され、こうした形状に加
工されてから相当な時間が経過している。従って、その
組織中の酵素の活性は失われており、ＤＮＡの自己消化
も起こっている。このため、このような木材片はアイソ
ザイム分析、ＲＡＰＤ法やＲＦＬＰ法による分析の対象
としては適さない。また、このような木材片にはバクテ
リアやカビ等の微生物が繁殖しており、ＲＡＰＤ法やＲ
ＦＬＰ法においては、木材片から抽出されたＤＮＡ中に
微生物由来のＤＮＡが混入する、という問題も発生す
る。
は、そのもともとの立木が伐採され、こうした形状に加
工されてから相当な時間が経過している。従って、その
組織中の酵素の活性は失われており、ＤＮＡの自己消化
も起こっている。このため、このような木材片はアイソ
ザイム分析、ＲＡＰＤ法やＲＦＬＰ法による分析の対象
としては適さない。また、このような木材片にはバクテ
リアやカビ等の微生物が繁殖しており、ＲＡＰＤ法やＲ
ＦＬＰ法においては、木材片から抽出されたＤＮＡ中に
微生物由来のＤＮＡが混入する、という問題も発生す
る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＤＮＡの自
己消化や微生物由来のＤＮＡの混入によっても影響され
ることのない、ＤＮＡの塩基配列情報に基づいた、ユー
カリ属の樹種判別方法を提供することを目的とする。
己消化や微生物由来のＤＮＡの混入によっても影響され
ることのない、ＤＮＡの塩基配列情報に基づいた、ユー
カリ属の樹種判別方法を提供することを目的とする。
【０００７】また、本発明は、パルプや紙の製造におい
て、木材片の状態となった原料についてもその樹種を判
別することのできる、ユーカリ属の樹種判別方法を提供
することを目的とする。
て、木材片の状態となった原料についてもその樹種を判
別することのできる、ユーカリ属の樹種判別方法を提供
することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、特定の塩基配列を有するプライマーを用いてＰ
ＣＲ−ＳＳＣＰ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏ
ｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分
析を繰返すことにより、上記目的が達成されることを見
出し、本発明を完成した。
の結果、特定の塩基配列を有するプライマーを用いてＰ
ＣＲ−ＳＳＣＰ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏ
ｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分
析を繰返すことにより、上記目的が達成されることを見
出し、本発明を完成した。
【０００９】即ち、上記課題は、配列番号１〜６に示す
塩基配列をそれぞれ有する６つのプライマーより選ば
れ、かつ、互いに異なる塩基配列を有する２つのプライ
マーからなるプライマーセットを２種以上用い、ユーカ
リ属に属する樹木の組織より抽出したＤＮＡについてＰ
ＣＲ−ＳＳＣＰ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎｒ
ｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分析を
繰返し、その結果を利用することにより達成される。
塩基配列をそれぞれ有する６つのプライマーより選ば
れ、かつ、互いに異なる塩基配列を有する２つのプライ
マーからなるプライマーセットを２種以上用い、ユーカ
リ属に属する樹木の組織より抽出したＤＮＡについてＰ
ＣＲ−ＳＳＣＰ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎｒ
ｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分析を
繰返し、その結果を利用することにより達成される。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明において使用するプライマ
ーは、配列番号１〜６に示す塩基配列を有する。本願に
おいては、これらのプライマーをそれぞれｒｂｃＬ１〜
ｒｂｃＬ６と呼ぶ。即ち、ｒｂｃＬ１の塩基配列は配列
番号１に、ｒｂｃＬ２の塩基配列は配列番号２に、ｒｂ
ｃＬ３の塩基配列は配列番号３に、ｒｂｃＬ４の塩基配
列は配列番号４に、ｒｂｃＬ５の塩基配列は配列番号５
に、また、ｒｂｃＬ６の塩基配列は配列番号６にそれぞ
れ表示される。かかるプライマーは、市販されているＤ
ＮＡシンセサイザーを用いて容易に合成することができ
る。もっとも、本発明においては、これらのプライマー
が配列番号１〜６で示したもののうちいずれかの塩基配
列を有することが重要であって、いかなる機器あるいは
方法によってこのプライマーが合成されたかは問題とな
らず、その機器・方法等の相違によって本発明の目的と
する効果が左右されることはない。
ーは、配列番号１〜６に示す塩基配列を有する。本願に
おいては、これらのプライマーをそれぞれｒｂｃＬ１〜
ｒｂｃＬ６と呼ぶ。即ち、ｒｂｃＬ１の塩基配列は配列
番号１に、ｒｂｃＬ２の塩基配列は配列番号２に、ｒｂ
ｃＬ３の塩基配列は配列番号３に、ｒｂｃＬ４の塩基配
列は配列番号４に、ｒｂｃＬ５の塩基配列は配列番号５
に、また、ｒｂｃＬ６の塩基配列は配列番号６にそれぞ
れ表示される。かかるプライマーは、市販されているＤ
ＮＡシンセサイザーを用いて容易に合成することができ
る。もっとも、本発明においては、これらのプライマー
が配列番号１〜６で示したもののうちいずれかの塩基配
列を有することが重要であって、いかなる機器あるいは
方法によってこのプライマーが合成されたかは問題とな
らず、その機器・方法等の相違によって本発明の目的と
する効果が左右されることはない。
【００１１】本発明においては、上記６つのプライマー
ｒｂｃＬ１〜ｒｂｃＬ６から、異なる２つのプライマー
（以下、これを単にプライマーセットとも言う。）を選
択し、これを用いて、ユーカリ属に属する樹木の組織よ
り抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ない、次い
で、このＰＣＲにより増幅したＤＮＡについてＳＳＣＰ
分析を行なう。プライマーセットを構成するプライマー
の選択に当っては、これらのプライマーが結合するＤＮ
Ａ上の位置を考慮し、ＰＣＲに供されるＤＮＡを少なく
とも部分的に増幅できる組合せを選択すればよい。本発
明のプライマーｒｂｃＬ１〜ｒｂｃＬ６から、このよう
に選択されたプライマーセットであれば、いずれも、Ｐ
ＣＲにおいてユーカリ属のリブロースビスリン酸カルボ
キシラーゼ大サブユニット遺伝子（ｒｂｃＬ遺伝子）を
部分的に増幅することができ、この結果より、ユーカリ
属の樹種の判別が可能となる。このｒｂｃＬ遺伝子上で
これらのプライマーｒｂｃＬ１〜ｒｂｃＬ６が結合する
位置を、模式的に図５に示す。
ｒｂｃＬ１〜ｒｂｃＬ６から、異なる２つのプライマー
（以下、これを単にプライマーセットとも言う。）を選
択し、これを用いて、ユーカリ属に属する樹木の組織よ
り抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ない、次い
で、このＰＣＲにより増幅したＤＮＡについてＳＳＣＰ
分析を行なう。プライマーセットを構成するプライマー
の選択に当っては、これらのプライマーが結合するＤＮ
Ａ上の位置を考慮し、ＰＣＲに供されるＤＮＡを少なく
とも部分的に増幅できる組合せを選択すればよい。本発
明のプライマーｒｂｃＬ１〜ｒｂｃＬ６から、このよう
に選択されたプライマーセットであれば、いずれも、Ｐ
ＣＲにおいてユーカリ属のリブロースビスリン酸カルボ
キシラーゼ大サブユニット遺伝子（ｒｂｃＬ遺伝子）を
部分的に増幅することができ、この結果より、ユーカリ
属の樹種の判別が可能となる。このｒｂｃＬ遺伝子上で
これらのプライマーｒｂｃＬ１〜ｒｂｃＬ６が結合する
位置を、模式的に図５に示す。
【００１２】ユーカリ属樹木の組織からのＤＮＡ抽出
は、ＣＴＡＢ法やＳＤＳ法等の定法、又はこれらの方法
を適宜改良した方法によりすることができる。例えば、
ＣＴＡＢ法を用いてユーカリ属樹木の木材片から全ＤＮ
Ａを抽出する場合には、約１００ｍｇ以上の木材片が試
料としてあれば、続いてＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を行なう
だけのＤＮＡを得ることができる。
は、ＣＴＡＢ法やＳＤＳ法等の定法、又はこれらの方法
を適宜改良した方法によりすることができる。例えば、
ＣＴＡＢ法を用いてユーカリ属樹木の木材片から全ＤＮ
Ａを抽出する場合には、約１００ｍｇ以上の木材片が試
料としてあれば、続いてＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を行なう
だけのＤＮＡを得ることができる。
【００１３】ＰＣＲは、こうして得られたＤＮＡを、Ｐ
ＣＲ反応用緩衝液中で、前記のようにして選択されたプ
ライマーセット、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＣＴＰの総称。）及びＤＮＡポリメラーゼと混
合し、この混合物を適当な温度サイクルで繰返し反応さ
せることにより行なえばよい。
ＣＲ反応用緩衝液中で、前記のようにして選択されたプ
ライマーセット、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＣＴＰの総称。）及びＤＮＡポリメラーゼと混
合し、この混合物を適当な温度サイクルで繰返し反応さ
せることにより行なえばよい。
【００１４】なお、このときのＰＣＲ条件は、次いで行
なうＳＳＣＰ分析において良好な結果が得られるよう、
即ち、ここで増幅したＤＮＡについてＳＳＣＰ分析を行
なった場合に、最もクリアな電気泳動パターンが得られ
るよう、適宜設定すればよい。通常は、ＤＮＡ２５〜５
０ｎｇ、１０×ＰＣＲ反応用緩衝液２．５〜１０μｌ、
プライマーをそれぞれ０．２〜０．５μＭ、ｄＮＴＰ２
０〜２００μＭ、ＤＮＡポリメラーゼ１〜２．５Ｕを混
合した後、全液量が２５〜１００μｌとなるように希釈
したものについて、次に示すような温度サイクルで反応
させた場合に、良好な結果を得ることができる。１０×
ＰＣＲ反応用緩衝液、ｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼ
については市販されているので、これを用いることがで
きる。
なうＳＳＣＰ分析において良好な結果が得られるよう、
即ち、ここで増幅したＤＮＡについてＳＳＣＰ分析を行
なった場合に、最もクリアな電気泳動パターンが得られ
るよう、適宜設定すればよい。通常は、ＤＮＡ２５〜５
０ｎｇ、１０×ＰＣＲ反応用緩衝液２．５〜１０μｌ、
プライマーをそれぞれ０．２〜０．５μＭ、ｄＮＴＰ２
０〜２００μＭ、ＤＮＡポリメラーゼ１〜２．５Ｕを混
合した後、全液量が２５〜１００μｌとなるように希釈
したものについて、次に示すような温度サイクルで反応
させた場合に、良好な結果を得ることができる。１０×
ＰＣＲ反応用緩衝液、ｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼ
については市販されているので、これを用いることがで
きる。
【００１５】ＰＣＲにおける温度条件 ステップ１： ９４〜９６℃約 ７分→５５〜５８℃約０．５〜 １分
→７０〜７４℃約１〜 ２分 １サイクル ステップ２： ９４〜９６℃約 １分→５５〜５８℃約０．５〜 １分
→７０〜７４℃約１〜 ２分 ２８サイクル ステップ３： ９４〜９６℃約 １分→５５〜５８℃約０．５〜 １分
→７０〜７４℃約５〜１０分 １サイクル
→７０〜７４℃約１〜 ２分 １サイクル ステップ２： ９４〜９６℃約 １分→５５〜５８℃約０．５〜 １分
→７０〜７４℃約１〜 ２分 ２８サイクル ステップ３： ９４〜９６℃約 １分→５５〜５８℃約０．５〜 １分
→７０〜７４℃約５〜１０分 １サイクル
【００１６】ＳＳＣＰ分析は、ＰＣＲ増幅後のＤＮＡに
ホルムアミドを加え、加熱変性して一本鎖とし、これを
電気泳動に供して移動度の相違から、そのＤＮＡの塩基
配列の違いを検出する方法である。通常、ホルムアミド
はホルムアミド色素液（９５％ ホルムアミド、１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）、０．０５％ ブロムフェ
ノールブルー、キシレンシアノール５０ｍｇ）として添
加し、加熱は８５〜９５℃の範囲内で行なう。ホルムア
ミド色素液の添加量は、変性させるＤＮＡ量に応じて決
定する。例えば、本願実施例においては、上記の条件で
ＰＣＲを行ない、増幅させた後のＤＮＡ試料４μｌに対
し、ホルムアミド色素液１６μｌを添加して良好な結果
を得た。
ホルムアミドを加え、加熱変性して一本鎖とし、これを
電気泳動に供して移動度の相違から、そのＤＮＡの塩基
配列の違いを検出する方法である。通常、ホルムアミド
はホルムアミド色素液（９５％ ホルムアミド、１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）、０．０５％ ブロムフェ
ノールブルー、キシレンシアノール５０ｍｇ）として添
加し、加熱は８５〜９５℃の範囲内で行なう。ホルムア
ミド色素液の添加量は、変性させるＤＮＡ量に応じて決
定する。例えば、本願実施例においては、上記の条件で
ＰＣＲを行ない、増幅させた後のＤＮＡ試料４μｌに対
し、ホルムアミド色素液１６μｌを添加して良好な結果
を得た。
【００１７】また、電気泳動は、担体として非変性ポリ
アクリルアミドゲルを用いて行なう。このとき、ゲル濃
度は５〜１０ｗ／ｖ％、温度４〜１０℃の下、電圧６０
〜１００Ｖで泳動を行なうのが好ましい。かかる条件で
変性ＤＮＡ試料の電気泳動を行なった場合、緩衝液とし
て０．５×ＴＢＥ緩衝液（４５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
１、４５ｍＭ ホウ酸、１ｍＭ ＥＤＴＡを用いること
により、試料間の移動度の相違が大きく、クリアな電気
泳動パターンを得ることができるが、場合によっては、
この緩衝液に１０ｗ／ｖ％までのグリセロールを添加す
ることにより、さらに試料間の分離を良くすることもで
きる。
アクリルアミドゲルを用いて行なう。このとき、ゲル濃
度は５〜１０ｗ／ｖ％、温度４〜１０℃の下、電圧６０
〜１００Ｖで泳動を行なうのが好ましい。かかる条件で
変性ＤＮＡ試料の電気泳動を行なった場合、緩衝液とし
て０．５×ＴＢＥ緩衝液（４５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
１、４５ｍＭ ホウ酸、１ｍＭ ＥＤＴＡを用いること
により、試料間の移動度の相違が大きく、クリアな電気
泳動パターンを得ることができるが、場合によっては、
この緩衝液に１０ｗ／ｖ％までのグリセロールを添加す
ることにより、さらに試料間の分離を良くすることもで
きる。
【００１８】なお、このようにして行なった電気泳動の
結果は、エチジウムブロマイド法等の定法を用いて知る
ことができる。即ち、かかる定法により、電気泳動後の
ポリアクリルアミドゲルを処理し、移動した一本鎖ＤＮ
Ａのバンドを検出することによって、その移動度を知る
ことができる。
結果は、エチジウムブロマイド法等の定法を用いて知る
ことができる。即ち、かかる定法により、電気泳動後の
ポリアクリルアミドゲルを処理し、移動した一本鎖ＤＮ
Ａのバンドを検出することによって、その移動度を知る
ことができる。
【００１９】本発明による樹種の判別は、同一種類のユ
ーカリより抽出されたＤＮＡに対し、このＰＣＲ−ＳＳ
ＣＰ分析を繰返すことによって行なわれる。ＰＣＲに用
いるプライマーセットは、この繰返し毎に異なるものを
用いる。例えば、最初にＰＣＲ用プライマーセットとし
てｒｂｃＬ１とｒｂｃＬ２を用いた場合は、次回以降
は、このｒｂｃＬ１とｒｂｃＬ２以外のプライマーセッ
トを用いてＰＣＲを行なわなければならない。もっとも
この場合は、この２つのプライマーをプライマーセット
として使用するものでなければ差し支えない。つまり、
次回以降のＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析には、ｒｂｃＬ１とｒ
ｂｃＬ３も用いることができる。
ーカリより抽出されたＤＮＡに対し、このＰＣＲ−ＳＳ
ＣＰ分析を繰返すことによって行なわれる。ＰＣＲに用
いるプライマーセットは、この繰返し毎に異なるものを
用いる。例えば、最初にＰＣＲ用プライマーセットとし
てｒｂｃＬ１とｒｂｃＬ２を用いた場合は、次回以降
は、このｒｂｃＬ１とｒｂｃＬ２以外のプライマーセッ
トを用いてＰＣＲを行なわなければならない。もっとも
この場合は、この２つのプライマーをプライマーセット
として使用するものでなければ差し支えない。つまり、
次回以降のＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析には、ｒｂｃＬ１とｒ
ｂｃＬ３も用いることができる。
【００２０】前記したように、本発明のｒｂｃＬ１〜ｒ
ｂｃＬ６より選ばれたプライマーセットは、これを用い
てＰＣＲを行なった場合、ｒｂｃＬ遺伝子を部分的に増
幅するが、その増幅される部分は、各プライマーセット
毎に異なっている。従って、同一種に属するユーカリの
組織より抽出されたＤＮＡであっても、プライマーセッ
トが異なれば、ＰＣＲにより増幅されるＤＮＡは異なっ
てくる。一方、異なる種に属するユーカリの組織より抽
出されたＤＮＡに対しては、同じプライマーセットを用
いても、ＰＣＲにより増幅されるＤＮＡは、塩基の数や
配列が互いに異なる場合が生じ、ＳＳＣＰ分析におい
て、移動度の相違により幾つかのグループに分けられる
ようになる。そこで、本発明のプライマーセットを用い
れば、上記のようにして行なわれるＰＣＲ−ＳＳＣＰ分
析において、ユーカリ属各種は、ＰＣＲで用いた各プラ
イマーセット毎に、これにより増幅されたＤＮＡが示す
電気泳動後の移動度に従って、異なるパターンでグルー
プ分けされる。樹種の判別は、こうしたプライマーセッ
ト毎の挙動の相違を指標として行なうことができる。
ｂｃＬ６より選ばれたプライマーセットは、これを用い
てＰＣＲを行なった場合、ｒｂｃＬ遺伝子を部分的に増
幅するが、その増幅される部分は、各プライマーセット
毎に異なっている。従って、同一種に属するユーカリの
組織より抽出されたＤＮＡであっても、プライマーセッ
トが異なれば、ＰＣＲにより増幅されるＤＮＡは異なっ
てくる。一方、異なる種に属するユーカリの組織より抽
出されたＤＮＡに対しては、同じプライマーセットを用
いても、ＰＣＲにより増幅されるＤＮＡは、塩基の数や
配列が互いに異なる場合が生じ、ＳＳＣＰ分析におい
て、移動度の相違により幾つかのグループに分けられる
ようになる。そこで、本発明のプライマーセットを用い
れば、上記のようにして行なわれるＰＣＲ−ＳＳＣＰ分
析において、ユーカリ属各種は、ＰＣＲで用いた各プラ
イマーセット毎に、これにより増幅されたＤＮＡが示す
電気泳動後の移動度に従って、異なるパターンでグルー
プ分けされる。樹種の判別は、こうしたプライマーセッ
ト毎の挙動の相違を指標として行なうことができる。
【００２１】本発明は、ユーカリプタス・ビコスタータ
（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｂｉｃｏｓｔａｔａ）、ユー
カリプタス・カマルドレンシス（Ｅ．ｃａｍａｌｄｕｌ
ｅｎｓｉｓ）、ユーカリプタス・シトリオドーラ（Ｅ．
ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）、ユーカリプタス・グロブラス
（Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓ）、ユーカリプタス・グランデ
ィス（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓ）、ユーカリプタス・マイデ
ニー（Ｅ．ｍａｉｄｅｎｉｉ）、ユーカリプタス・ニテ
ンス（Ｅ．ｎｉｔｅｎｓ）、ユーカリプタス・ユーロフ
ィラ（Ｅ．ｕｒｏｐｈｙｌｌａ）等のユーカリ属に対し
て適用することができる。これらは生木であっても伐採
された材であっても構わない。また、本発明において、
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析に供されるＤＮＡは、これらのい
ずれの組織から抽出されたものであっても構わない。
（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｂｉｃｏｓｔａｔａ）、ユー
カリプタス・カマルドレンシス（Ｅ．ｃａｍａｌｄｕｌ
ｅｎｓｉｓ）、ユーカリプタス・シトリオドーラ（Ｅ．
ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）、ユーカリプタス・グロブラス
（Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓ）、ユーカリプタス・グランデ
ィス（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓ）、ユーカリプタス・マイデ
ニー（Ｅ．ｍａｉｄｅｎｉｉ）、ユーカリプタス・ニテ
ンス（Ｅ．ｎｉｔｅｎｓ）、ユーカリプタス・ユーロフ
ィラ（Ｅ．ｕｒｏｐｈｙｌｌａ）等のユーカリ属に対し
て適用することができる。これらは生木であっても伐採
された材であっても構わない。また、本発明において、
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析に供されるＤＮＡは、これらのい
ずれの組織から抽出されたものであっても構わない。
【００２２】
【作用】配列番号１〜６に示すプライマーｒｂｃＬ１〜
ｒｂｃＬ６は、これらから選ばれるプライマーセットを
用いてＰＣＲを行なった場合、ユーカリ属のｒｂｃＬ遺
伝子のいずれかの部分を増幅するように設計されてい
る。ｒｂｃＬ遺伝子は、光合成過程において炭酸固定を
司っており、葉緑体ＤＮＡ上に存在する。バクテリアや
カビ等は、かかる遺伝子を有していないので、ＰＣＲに
供する試料中にそのＤＮＡが混在していたとしても、本
発明のプライマーセットを使用する限り、これがＰＣＲ
で増幅されることはなく、ＳＳＣＰ分析結果にも何ら影
響を与えない。従って、本発明は、バクテリアやカビ等
が繁殖している木材片等についても適用ができ、こうし
た微生物の影響を考慮することなく、ＤＮＡの塩基配列
情報に基づきユーカリ属の樹種を判定することができ
る。
ｒｂｃＬ６は、これらから選ばれるプライマーセットを
用いてＰＣＲを行なった場合、ユーカリ属のｒｂｃＬ遺
伝子のいずれかの部分を増幅するように設計されてい
る。ｒｂｃＬ遺伝子は、光合成過程において炭酸固定を
司っており、葉緑体ＤＮＡ上に存在する。バクテリアや
カビ等は、かかる遺伝子を有していないので、ＰＣＲに
供する試料中にそのＤＮＡが混在していたとしても、本
発明のプライマーセットを使用する限り、これがＰＣＲ
で増幅されることはなく、ＳＳＣＰ分析結果にも何ら影
響を与えない。従って、本発明は、バクテリアやカビ等
が繁殖している木材片等についても適用ができ、こうし
た微生物の影響を考慮することなく、ＤＮＡの塩基配列
情報に基づきユーカリ属の樹種を判定することができ
る。
【００２３】また、本発明で使用するＰＣＲ−ＳＳＣＰ
分析によれば、比較的短いＤＮＡの、わずかな塩基配列
の相違を検出することができる。この分析法では、ＰＣ
Ｒにより増幅されたＤＮＡを一本鎖として電気泳動に供
するが、一本鎖ＤＮＡは、その塩基配列に依存して異な
る高次構造をとるため、わずかな塩基配列の相違によっ
ても、比較的大きな移動度の相違となって電気泳動によ
り検出されるからである。従って、ＲＡＰＤ法やＲＦＬ
Ｐ法を使用して種の判別を行なう場合に問題となるＤＮ
Ａの自己消化は、本発明の方法では問題とならない。ま
た、おそらくは、それほど大きな差異はないと考えられ
る、ユーカリ属の種によるｒｂｃＬ遺伝子の塩基配列の
相違も、本発明の方法では検出することができる。
分析によれば、比較的短いＤＮＡの、わずかな塩基配列
の相違を検出することができる。この分析法では、ＰＣ
Ｒにより増幅されたＤＮＡを一本鎖として電気泳動に供
するが、一本鎖ＤＮＡは、その塩基配列に依存して異な
る高次構造をとるため、わずかな塩基配列の相違によっ
ても、比較的大きな移動度の相違となって電気泳動によ
り検出されるからである。従って、ＲＡＰＤ法やＲＦＬ
Ｐ法を使用して種の判別を行なう場合に問題となるＤＮ
Ａの自己消化は、本発明の方法では問題とならない。ま
た、おそらくは、それほど大きな差異はないと考えられ
る、ユーカリ属の種によるｒｂｃＬ遺伝子の塩基配列の
相違も、本発明の方法では検出することができる。
【００２４】一方、ユーカリ属のｒｂｃＬ遺伝子を部分
的に増幅するために使用できるプライマーは、数限りな
く考えられる。また、こうしたプライマーであって、ユ
ーカリ属に共通して適用可能であり、しかも、その種に
よってある程度の相違が存在する部位を増幅できるプラ
イマー、即ち、ユーカリ属の種の判別に使用できると考
えられるプライマーも、１０数個が考えられる。しかし
ながら、本発明者らの実験によれば、かかる１０数個の
プライマーであっても、その全てがユーカリ属の種の判
別に使用できるとは限らない。即ち、これらのプライマ
ーから選ばれたプライマーセットを用い、ユーカリ属各
種より抽出したＤＮＡに対しＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を行
なっても、それぞれのＤＮＡ試料による移動度の相違を
検出することができるのは、配列番号１〜６に示すプラ
イマーｒｂｃＬ１〜ｒｂｃＬ６から選ばれたプライマー
セットを使用したときのみであり、しかも、驚くべきこ
とに、ユーカリ属は、このようにわずか６つのプライマ
ーより選ばれるプライマーセットのみを用いてＰＣＲ−
ＳＳＣＰ分析を繰返すことで、その種を判別することが
可能であった。
的に増幅するために使用できるプライマーは、数限りな
く考えられる。また、こうしたプライマーであって、ユ
ーカリ属に共通して適用可能であり、しかも、その種に
よってある程度の相違が存在する部位を増幅できるプラ
イマー、即ち、ユーカリ属の種の判別に使用できると考
えられるプライマーも、１０数個が考えられる。しかし
ながら、本発明者らの実験によれば、かかる１０数個の
プライマーであっても、その全てがユーカリ属の種の判
別に使用できるとは限らない。即ち、これらのプライマ
ーから選ばれたプライマーセットを用い、ユーカリ属各
種より抽出したＤＮＡに対しＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を行
なっても、それぞれのＤＮＡ試料による移動度の相違を
検出することができるのは、配列番号１〜６に示すプラ
イマーｒｂｃＬ１〜ｒｂｃＬ６から選ばれたプライマー
セットを使用したときのみであり、しかも、驚くべきこ
とに、ユーカリ属は、このようにわずか６つのプライマ
ーより選ばれるプライマーセットのみを用いてＰＣＲ−
ＳＳＣＰ分析を繰返すことで、その種を判別することが
可能であった。
【００２５】
【実施例】以下に、本発明を実施例に基づいて説明す
る。
る。
【００２６】［実施例１］Ｉ．ユーカリ属の各樹種からの全ＤＮＡの抽出 ユーカリプタス・ビコスタータ（以下、Ｅ．ビコスター
タと言う。）、ユーカリプタス・シトリオドーラ（以
下、Ｅ．シトリオドーラと言う。）、ユーカリプタス・
グロブラス（以下、Ｅ．グロブラスと言う。）、ユーカ
リプタス・グランディス（以下、Ｅ．グランディスと言
う。）、ユーカリプタス・マイデニー（以下、Ｅ．マイ
デニーと言う。）、ユーカリプタス・ニテンス（以下、
Ｅ．ニテンスと言う。）及びユーカリプタス・ユーロフ
ィラ（以下、Ｅ．ユーロフィラと言う。）のそれぞれよ
り、ＣＴＡＢ法にて全ＤＮＡの抽出を行なった。
タと言う。）、ユーカリプタス・シトリオドーラ（以
下、Ｅ．シトリオドーラと言う。）、ユーカリプタス・
グロブラス（以下、Ｅ．グロブラスと言う。）、ユーカ
リプタス・グランディス（以下、Ｅ．グランディスと言
う。）、ユーカリプタス・マイデニー（以下、Ｅ．マイ
デニーと言う。）、ユーカリプタス・ニテンス（以下、
Ｅ．ニテンスと言う。）及びユーカリプタス・ユーロフ
ィラ（以下、Ｅ．ユーロフィラと言う。）のそれぞれよ
り、ＣＴＡＢ法にて全ＤＮＡの抽出を行なった。
【００２７】即ち、これらの生葉１００ｍｇを液体窒素
で凍結させて粉砕した後、ＣＴＡＢ溶液（２ｗ／ｖ％
臭化セチルトリメチルアンモニウム、１．４Ｍ 塩化ナ
トリウム、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、０．２ｖ／ｖ％２−メルカプトエタノール）
０．７５ｍｌに加え、６０℃で３０分間加温した。次い
で、等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２
４：１）混液を添加し、ゆっくりと混和してから遠心
（１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分間）して上清を回収
し、この上清に０．５ｍｌのイソプロピルアルコールを
加えて混和し、室温で２時間、静置することによりＤＮ
Ａ及びＲＮＡの混合物を析出させた。析出させた混合物
は再び遠心（１５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間）して
ペレットとして分離し、これをＴＥ緩衝液（１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐ
Ｈ８．０））０．２ｍｌに溶解して１０ｍｇ／ｍｌのリ
ボヌクレアーゼ（和光純薬（株）製）１μｌを加え、３
７℃で３０分間加温してＲＮＡを分解させた後、７．７
Ｍ 酢酸アンモニウム０．１ｍｌ、エタノール０．７５
ｍｌを添加して全ＤＮＡを析出させた。析出させた全Ｄ
ＮＡは、遠心（１５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間）し
て得られたペレットにＴＥ緩衝液０．１ｍｌを加えて溶
解し、以後の操作に供した。
で凍結させて粉砕した後、ＣＴＡＢ溶液（２ｗ／ｖ％
臭化セチルトリメチルアンモニウム、１．４Ｍ 塩化ナ
トリウム、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ、０．２ｖ／ｖ％２−メルカプトエタノール）
０．７５ｍｌに加え、６０℃で３０分間加温した。次い
で、等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２
４：１）混液を添加し、ゆっくりと混和してから遠心
（１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分間）して上清を回収
し、この上清に０．５ｍｌのイソプロピルアルコールを
加えて混和し、室温で２時間、静置することによりＤＮ
Ａ及びＲＮＡの混合物を析出させた。析出させた混合物
は再び遠心（１５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間）して
ペレットとして分離し、これをＴＥ緩衝液（１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐ
Ｈ８．０））０．２ｍｌに溶解して１０ｍｇ／ｍｌのリ
ボヌクレアーゼ（和光純薬（株）製）１μｌを加え、３
７℃で３０分間加温してＲＮＡを分解させた後、７．７
Ｍ 酢酸アンモニウム０．１ｍｌ、エタノール０．７５
ｍｌを添加して全ＤＮＡを析出させた。析出させた全Ｄ
ＮＡは、遠心（１５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間）し
て得られたペレットにＴＥ緩衝液０．１ｍｌを加えて溶
解し、以後の操作に供した。
【００２８】このとき得られた全ＤＮＡの量は、ＴＥ緩
衝液１μｌ当り、Ｅ．ビコスタータが１５ｎｇ／μｌ、
Ｅ．シトリオドーラが８６ｎｇ／μｌ、Ｅ．グロブラス
が１５５．５ｎｇ／μｌ、Ｅ．グランディスが４４．５
ｎｇ／μｌ、Ｅ．マイデニーが１０５ｎｇ／μｌ、Ｅ．
ニテンスが１７．５ｎｇ／μｌ、Ｅ．ユーロフィラが１
１．５ｎｇ／μｌであった。
衝液１μｌ当り、Ｅ．ビコスタータが１５ｎｇ／μｌ、
Ｅ．シトリオドーラが８６ｎｇ／μｌ、Ｅ．グロブラス
が１５５．５ｎｇ／μｌ、Ｅ．グランディスが４４．５
ｎｇ／μｌ、Ｅ．マイデニーが１０５ｎｇ／μｌ、Ｅ．
ニテンスが１７．５ｎｇ／μｌ、Ｅ．ユーロフィラが１
１．５ｎｇ／μｌであった。
【００２９】ＩＩ．ｒｂｃＬ遺伝子の単離及びそのシー
ケンスの決定 Ｉで得られたユーカリ属各種の全ＤＮＡ、それぞれ５０
ｎｇに、公知のｒｂｃＬ遺伝子増幅用プライマーＰｒＬ
１：５′−ＧＴＣＣＧＡＴＴＣＡＡＡＧＣＴＧＧＴＧＴ
−３′及びＰｒＬ２：５′−ＴＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡ
ＧＣＴＡＧＴＴＣ−３′各０．５μＭ、１０×ＰＣＲ反
応用緩衝液（宝酒造（株）製）５μｌ、ｄＮＴＰ各２０
０μＭ、ＤＮＡポリメラーゼ（『ＴａＫａＲａ ＥＸ
Ｔａｑ』宝酒造（株）製）１．５Ｕを加え、滅菌蒸留水
で全液量を５０μｌとした後、以下の温度サイクルにて
ＰＣＲを行なった。
ケンスの決定 Ｉで得られたユーカリ属各種の全ＤＮＡ、それぞれ５０
ｎｇに、公知のｒｂｃＬ遺伝子増幅用プライマーＰｒＬ
１：５′−ＧＴＣＣＧＡＴＴＣＡＡＡＧＣＴＧＧＴＧＴ
−３′及びＰｒＬ２：５′−ＴＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡ
ＧＣＴＡＧＴＴＣ−３′各０．５μＭ、１０×ＰＣＲ反
応用緩衝液（宝酒造（株）製）５μｌ、ｄＮＴＰ各２０
０μＭ、ＤＮＡポリメラーゼ（『ＴａＫａＲａ ＥＸ
Ｔａｑ』宝酒造（株）製）１．５Ｕを加え、滅菌蒸留水
で全液量を５０μｌとした後、以下の温度サイクルにて
ＰＣＲを行なった。
【００３０】 ＰＣＲ温度条件 ステップ１：９４℃ ７分→５５℃ １分→７２℃ ２分 １サイクル ステップ２：９４℃ １分→５５℃ １分→７２℃ ２分 ２８サイクル ステップ３：９４℃ １分→５５℃ １分→７２℃１０分 １サイクル
【００３１】増幅されたＤＮＡは、得られたＰＣＲ産物
について電気泳動（緩衝液：０．５×ＴＢＥ緩衝液、担
体：３％アガロースゲル）を行ない、分離した１．３ｋ
ｂｐ付近のバンドをアガロースゲルごと切出し、これを
市販の核酸精製キット（『ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＳＰＩ
Ｎ ＫＩＴ』フナコシ（株）製）にて精製することによ
り、単離した。なお、ここで行なった電気泳動では、そ
の由来するユーカリ属の樹種の相違に関わらず、上記Ｐ
ＣＲで増幅されたＤＮＡは全て同じ移動度を示した。単
離したＤＮＡフラグメントの塩基配列は、シークエンス
プライマーとしてＰｒＬ１とＰｒＬ２を用い、ジデオキ
シ法により決定した。
について電気泳動（緩衝液：０．５×ＴＢＥ緩衝液、担
体：３％アガロースゲル）を行ない、分離した１．３ｋ
ｂｐ付近のバンドをアガロースゲルごと切出し、これを
市販の核酸精製キット（『ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＳＰＩ
Ｎ ＫＩＴ』フナコシ（株）製）にて精製することによ
り、単離した。なお、ここで行なった電気泳動では、そ
の由来するユーカリ属の樹種の相違に関わらず、上記Ｐ
ＣＲで増幅されたＤＮＡは全て同じ移動度を示した。単
離したＤＮＡフラグメントの塩基配列は、シークエンス
プライマーとしてＰｒＬ１とＰｒＬ２を用い、ジデオキ
シ法により決定した。
【００３２】次いで、このようにして明らかとなったＤ
ＮＡフラグメントの塩基配列を解析して、ユーカリ属各
種に共通する配列を求め、この共通配列と同じ配列を有
するプライマーｒｂｃＬＡ：５′−ＴＧＴＡＴＴＴＧＧ
ＧＴＴＣＡＡＡＧＣＣＣ−３′及びｒｂｃＬＢ：５′−
ＧＡＡＴＡＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＧＡＣ−３′を設
計して、再度、Ｉで得られたユーカリ属各種の全ＤＮＡ
それぞれを鋳型として、上記と同様にＰＣＲを行なっ
た。
ＮＡフラグメントの塩基配列を解析して、ユーカリ属各
種に共通する配列を求め、この共通配列と同じ配列を有
するプライマーｒｂｃＬＡ：５′−ＴＧＴＡＴＴＴＧＧ
ＧＴＴＣＡＡＡＧＣＣＣ−３′及びｒｂｃＬＢ：５′−
ＧＡＡＴＡＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＧＡＣ−３′を設
計して、再度、Ｉで得られたユーカリ属各種の全ＤＮＡ
それぞれを鋳型として、上記と同様にＰＣＲを行なっ
た。
【００３３】ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡは、やはり
上記と同様にして電気泳動を行ない、分離した６００ｂ
ｐ付近のバンドをアガロースゲルごと切出して、核酸精
製キットにて精製することにより単離し、その塩基配列
をジデオキシ法により決定した。シークエンスプライマ
ーとしては、ｒｂｃＬＡとｒｂｃＬＢとを使用した。な
お、ここで行なった電気泳動でも、ＰＣＲで増幅された
ＤＮＡは、その由来する樹種の相違に関わらず、全て同
じ移動度を示した。
上記と同様にして電気泳動を行ない、分離した６００ｂ
ｐ付近のバンドをアガロースゲルごと切出して、核酸精
製キットにて精製することにより単離し、その塩基配列
をジデオキシ法により決定した。シークエンスプライマ
ーとしては、ｒｂｃＬＡとｒｂｃＬＢとを使用した。な
お、ここで行なった電気泳動でも、ＰＣＲで増幅された
ＤＮＡは、その由来する樹種の相違に関わらず、全て同
じ移動度を示した。
【００３４】ＩＩＩ．プライマーｒｂｃＬ１〜ｒｂｃＬ
６の設計 ＩＩで最終的に明らかとなったＤＮＡフラグメントの塩
基配列を解析して、ユーカリ属各種に共通する塩基配列
と同じ配列を有し、かつ、これらユーカリ属の種間で塩
基配列に実質上の相違がある部分を増幅できるプライマ
ー１１個を設計し、ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成
した。そして、これらのプライマーを用いて、ユーカリ
属各種の木材片から抽出したＤＮＡについてＰＣＲ−Ｓ
ＳＣＰ分析を行ない、本発明の目的を達成し得るプライ
マーとして、配列番号１〜６に示す塩基配列を有するプ
ライマーｒｂｃＬ１〜ｒｂｃＬ６を選択し、以下に示す
ユーカリ属の樹種の判定に使用した。
６の設計 ＩＩで最終的に明らかとなったＤＮＡフラグメントの塩
基配列を解析して、ユーカリ属各種に共通する塩基配列
と同じ配列を有し、かつ、これらユーカリ属の種間で塩
基配列に実質上の相違がある部分を増幅できるプライマ
ー１１個を設計し、ＤＮＡシンセサイザーを用いて合成
した。そして、これらのプライマーを用いて、ユーカリ
属各種の木材片から抽出したＤＮＡについてＰＣＲ−Ｓ
ＳＣＰ分析を行ない、本発明の目的を達成し得るプライ
マーとして、配列番号１〜６に示す塩基配列を有するプ
ライマーｒｂｃＬ１〜ｒｂｃＬ６を選択し、以下に示す
ユーカリ属の樹種の判定に使用した。
【００３５】なお、ＩＩより明らかなように、これらの
プライマーはいずれも、ユーカリ属のｒｂｃＬ遺伝子の
いずれかの部分を増幅するように設計されている。ま
た、ｒｂｃＬ１は上記ｒｂｃＬＢと同じものである。
プライマーはいずれも、ユーカリ属のｒｂｃＬ遺伝子の
いずれかの部分を増幅するように設計されている。ま
た、ｒｂｃＬ１は上記ｒｂｃＬＢと同じものである。
【００３６】ＩＶ．ユーカリ属樹種の判定 （１）ユーカリ属各種の木材片からの全ＤＮＡの抽出 Ｅ．ビコスタータ、ユーカリプタス・カマルドレンシス
（以下、Ｅ．カマルドレンシスと言う。）、Ｅ．シトリ
オドーラ、Ｅ．グロブラス、Ｅ．グランディス、Ｅ．マ
イデニー、Ｅ．ニテンス及びＥ．ユーロフィラの木材片
（チップ片）約１００ｍｇをナイフで薄く削り、液体窒
素で凍結させた後、Ｉと同様にして全ＤＮＡを抽出し
た。
（以下、Ｅ．カマルドレンシスと言う。）、Ｅ．シトリ
オドーラ、Ｅ．グロブラス、Ｅ．グランディス、Ｅ．マ
イデニー、Ｅ．ニテンス及びＥ．ユーロフィラの木材片
（チップ片）約１００ｍｇをナイフで薄く削り、液体窒
素で凍結させた後、Ｉと同様にして全ＤＮＡを抽出し
た。
【００３７】なお、木材から抽出した全ＤＮＡは、その
ままでは多くの不純物質を含んでいるため、この全ＤＮ
Ａは核酸精製キットにて精製し、以下のＰＣＲ−ＳＳＣ
Ｐ分析に供した。
ままでは多くの不純物質を含んでいるため、この全ＤＮ
Ａは核酸精製キットにて精製し、以下のＰＣＲ−ＳＳＣ
Ｐ分析に供した。
【００３８】（２）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析 （１）にて抽出されたＥ．ビコスタータ、Ｅ．シトリ
オドーラ、Ｅ．グロブラス、Ｅ．グランディス、Ｅ．マ
イデニー、Ｅ．ニテンス及びＥ．ユーロフィラの全ＤＮ
Ａ、それぞれ５０ｎｇに、プライマーとしてｒｂｃＬ２
及びｒｂｃＬ５各０．５μＭ、１０×ＰＣＲ反応用緩衝
液５μｌ、ｄＮＴＰ各２００μＭ、ＤＮＡポリメラーゼ
１．５Ｕを加え、滅菌蒸留水で全液量を５０μｌとした
後、以下の温度サイクルにてＰＣＲを行なった。
オドーラ、Ｅ．グロブラス、Ｅ．グランディス、Ｅ．マ
イデニー、Ｅ．ニテンス及びＥ．ユーロフィラの全ＤＮ
Ａ、それぞれ５０ｎｇに、プライマーとしてｒｂｃＬ２
及びｒｂｃＬ５各０．５μＭ、１０×ＰＣＲ反応用緩衝
液５μｌ、ｄＮＴＰ各２００μＭ、ＤＮＡポリメラーゼ
１．５Ｕを加え、滅菌蒸留水で全液量を５０μｌとした
後、以下の温度サイクルにてＰＣＲを行なった。
【００３９】 ステップ１：９４℃ ７分→５５℃ １分→７２℃ ２分 １サイクル ステップ２：９４℃ １分→５５℃ １分→７２℃ ２分 ２８サイクル ステップ３：９４℃ １分→５５℃ １分→７２℃１０分 １サイクル
【００４０】ＳＳＣＰ分析は、こうして得られたＰＣＲ
反応産物４μｌにホルムアミド色素液１６μｌを添加
し、９５℃に過熱して変性させた後、０．５×ＴＢＥ緩
衝液を用い、５ｗ／ｖ％の非変性ポリアクリルアミドゲ
ルを担体とし、温度４℃で１００Ｖ、３．５時間電気泳
動をすることにより行なった。また、電気泳動後は、エ
チジウムブロマイドを加えた０．５×ＴＢＥ緩衝液２０
０ｍｌ（最終エチジウムブロマイド濃度０．５μｌ／ｍ
ｌ）に電気泳動を終えたゲルを浸漬して５〜１０分間振
とうした後、このゲルに紫外線を照射して、泳動により
移動したＤＮＡを検出した。その結果を表１及び図１に
示す。
反応産物４μｌにホルムアミド色素液１６μｌを添加
し、９５℃に過熱して変性させた後、０．５×ＴＢＥ緩
衝液を用い、５ｗ／ｖ％の非変性ポリアクリルアミドゲ
ルを担体とし、温度４℃で１００Ｖ、３．５時間電気泳
動をすることにより行なった。また、電気泳動後は、エ
チジウムブロマイドを加えた０．５×ＴＢＥ緩衝液２０
０ｍｌ（最終エチジウムブロマイド濃度０．５μｌ／ｍ
ｌ）に電気泳動を終えたゲルを浸漬して５〜１０分間振
とうした後、このゲルに紫外線を照射して、泳動により
移動したＤＮＡを検出した。その結果を表１及び図１に
示す。
【００４１】図１より明らかなように、Ｅ．ビコスター
タ、Ｅ．シトリオドーラ、Ｅ．グロブラス、Ｅ．グラン
ディス、Ｅ．マイデニー、Ｅ．ニテンス及びＥ．ユーロ
フィラより抽出されたＤＮＡを、ＰＣＲ用プライマーと
してｒｂｃＬ２及びｒｂｃＬ５を用いて増幅した場合、
増幅されたＤＮＡはＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析において、そ
の移動度により３つのグループに分けることができる。
そこで、表１には、これらのグループを便宜的にＡ、
Ｂ、Ｃと名付けて記載した。即ち、ＡグループにはＥ．
シトリオドーラが、ＢグループにはＥ．グロブラスが、
ＣグループにはＥ．ビコスタータ、Ｅ．グランディス、
Ｅ．マイデニー、Ｅ．ニテンス及びＥ．ユーロフィラ
が、それぞれ属している。
タ、Ｅ．シトリオドーラ、Ｅ．グロブラス、Ｅ．グラン
ディス、Ｅ．マイデニー、Ｅ．ニテンス及びＥ．ユーロ
フィラより抽出されたＤＮＡを、ＰＣＲ用プライマーと
してｒｂｃＬ２及びｒｂｃＬ５を用いて増幅した場合、
増幅されたＤＮＡはＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析において、そ
の移動度により３つのグループに分けることができる。
そこで、表１には、これらのグループを便宜的にＡ、
Ｂ、Ｃと名付けて記載した。即ち、ＡグループにはＥ．
シトリオドーラが、ＢグループにはＥ．グロブラスが、
ＣグループにはＥ．ビコスタータ、Ｅ．グランディス、
Ｅ．マイデニー、Ｅ．ニテンス及びＥ．ユーロフィラ
が、それぞれ属している。
【００４２】なお、このとき、上記ＰＣＲ産物につい
て、加熱変性を行なわずに電気泳動（緩衝液：０．５×
ＴＢＥ緩衝液、担体：３％アガロースゲル）を行なった
ところ、これらの樹種の相違による移動度の差は見出せ
なかった。
て、加熱変性を行なわずに電気泳動（緩衝液：０．５×
ＴＢＥ緩衝液、担体：３％アガロースゲル）を行なった
ところ、これらの樹種の相違による移動度の差は見出せ
なかった。
【００４３】（１）にて抽出されたＥ．ビコスター
タ、Ｅ．シトリオドーラ、Ｅ．グロブラス、Ｅ．グラン
ディス、Ｅ．マイデニー、Ｅ．ニテンス及びＥ．ユーロ
フィラの全ＤＮＡ、それぞれ５０ｎｇについて、ＰＣＲ
用プライマーとしてｒｂｃＬ３及びｒｂｃＬ６各０．５
μＭを用い、と同様にしてＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を行
なった（但し、担体として用いた５ｗ／ｖ％ポリアクリ
ルアミドゲルには、グリセロール１０ｗ／ｖ％を添加。
泳動時間は４時間。）。その結果を表１及び図２に示
す。
タ、Ｅ．シトリオドーラ、Ｅ．グロブラス、Ｅ．グラン
ディス、Ｅ．マイデニー、Ｅ．ニテンス及びＥ．ユーロ
フィラの全ＤＮＡ、それぞれ５０ｎｇについて、ＰＣＲ
用プライマーとしてｒｂｃＬ３及びｒｂｃＬ６各０．５
μＭを用い、と同様にしてＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を行
なった（但し、担体として用いた５ｗ／ｖ％ポリアクリ
ルアミドゲルには、グリセロール１０ｗ／ｖ％を添加。
泳動時間は４時間。）。その結果を表１及び図２に示
す。
【００４４】図２より明らかなように、の場合と同じ
ユーカリ属の樹種から抽出されたＤＮＡであっても、Ｐ
ＣＲ用プライマーとしてｒｂｃＬ３とｒｂｃＬ６を用い
て増幅した場合は、増幅されたＤＮＡはＰＣＲ−ＳＳＣ
Ｐ分析において、の場合とは異なる移動度を示す２つ
のグループに分けられた。そこで、表１には、これらの
グループを便宜的にＡ、Ｂと名付けて記載した。このグ
ループ名は、で用いたグループ名と何ら対応するもの
ではない。ここでは、Ｅ．ビコスタータ、Ｅ．グロブラ
ス及びＥ．ニテンスがＡグループに、Ｅ．シトリオドー
ラ、Ｅ．グランディス、Ｅ．マイデニー及びＥ．ユーロ
フィラがＢグループに属している。
ユーカリ属の樹種から抽出されたＤＮＡであっても、Ｐ
ＣＲ用プライマーとしてｒｂｃＬ３とｒｂｃＬ６を用い
て増幅した場合は、増幅されたＤＮＡはＰＣＲ−ＳＳＣ
Ｐ分析において、の場合とは異なる移動度を示す２つ
のグループに分けられた。そこで、表１には、これらの
グループを便宜的にＡ、Ｂと名付けて記載した。このグ
ループ名は、で用いたグループ名と何ら対応するもの
ではない。ここでは、Ｅ．ビコスタータ、Ｅ．グロブラ
ス及びＥ．ニテンスがＡグループに、Ｅ．シトリオドー
ラ、Ｅ．グランディス、Ｅ．マイデニー及びＥ．ユーロ
フィラがＢグループに属している。
【００４５】なお、このときも、上記ＰＣＲ産物につい
て、加熱変性を行なわずに電気泳動（緩衝液：０．５×
ＴＢＥ緩衝液、担体：３％アガロースゲル）を行なった
が、これらの樹種の相違による移動度の差は、やはり見
出せなかった。
て、加熱変性を行なわずに電気泳動（緩衝液：０．５×
ＴＢＥ緩衝液、担体：３％アガロースゲル）を行なった
が、これらの樹種の相違による移動度の差は、やはり見
出せなかった。
【００４６】（１）にて抽出されたＥ．ビコスター
タ、Ｅ．カマルドレンシス、Ｅ．グロブラス、Ｅ．グラ
ンディス、Ｅ．マイデニー及びＥ．ニテンスの全ＤＮ
Ａ、それぞれ５０ｎｇについて、ＰＣＲ用プライマーと
してｒｂｃＬ１及びｒｂｃＬ４各０．５μＭを用い、
と同様にしてＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を行なった（但し、
泳動時間は５時間。）。その結果を表１及び図３に示
す。
タ、Ｅ．カマルドレンシス、Ｅ．グロブラス、Ｅ．グラ
ンディス、Ｅ．マイデニー及びＥ．ニテンスの全ＤＮ
Ａ、それぞれ５０ｎｇについて、ＰＣＲ用プライマーと
してｒｂｃＬ１及びｒｂｃＬ４各０．５μＭを用い、
と同様にしてＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を行なった（但し、
泳動時間は５時間。）。その結果を表１及び図３に示
す。
【００４７】図３より明らかなように、Ｅ．ビコスター
タ、Ｅ．カマルドレンシス、Ｅ．グロブラス、Ｅ．グラ
ンディス、Ｅ．マイデニー及びＥ．ニテンスより抽出さ
れたＤＮＡを、ＰＣＲ用プライマーとしてｒｂｃＬ１と
ｒｂｃＬ４を用いて増幅した場合、増幅されたＤＮＡは
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析において、その移動度により、
やの場合とは異なる移動度を示す４つのグループに分
けられた。そこで、表１には、これらのグループを便宜
的にＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄと名付けて記載したが、ここでもこ
のグループ名は、及びで用いたグループ名と何ら対
応するものではない。ここでは、ＡグループにはＥ．ビ
コスタータが、ＢグループにはＥ．カマルドレンシス及
びＥ．グランディスが、ＣグループにはＥ．グロブラス
及びＥ．マイデニーが、ＤグループにはＥ．ニテンス
が、それぞれ属している。
タ、Ｅ．カマルドレンシス、Ｅ．グロブラス、Ｅ．グラ
ンディス、Ｅ．マイデニー及びＥ．ニテンスより抽出さ
れたＤＮＡを、ＰＣＲ用プライマーとしてｒｂｃＬ１と
ｒｂｃＬ４を用いて増幅した場合、増幅されたＤＮＡは
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析において、その移動度により、
やの場合とは異なる移動度を示す４つのグループに分
けられた。そこで、表１には、これらのグループを便宜
的にＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄと名付けて記載したが、ここでもこ
のグループ名は、及びで用いたグループ名と何ら対
応するものではない。ここでは、ＡグループにはＥ．ビ
コスタータが、ＢグループにはＥ．カマルドレンシス及
びＥ．グランディスが、ＣグループにはＥ．グロブラス
及びＥ．マイデニーが、ＤグループにはＥ．ニテンス
が、それぞれ属している。
【００４８】なお、このときも、上記ＰＣＲ産物につい
て、加熱変性を行なわずに電気泳動（緩衝液：０．５×
ＴＢＥ緩衝液、担体：３％アガロースゲル）を行なった
が、これらの樹種の相違による移動度の差はやはり見出
せなかった。
て、加熱変性を行なわずに電気泳動（緩衝液：０．５×
ＴＢＥ緩衝液、担体：３％アガロースゲル）を行なった
が、これらの樹種の相違による移動度の差はやはり見出
せなかった。
【００４９】（１）にて抽出されたＥ．グロブラス、
Ｅ．グランディス、Ｅ．マイデニー、Ｅ．ニテンス及び
Ｅ．ユーロフィラの全ＤＮＡ、それぞれ５０ｎｇについ
て、ＰＣＲ用プライマーとしてｒｂｃＬ４及びｒｂｃＬ
６各０．５μＭを用い、と同様にしてＰＣＲ−ＳＳＣ
Ｐ分析を行なった（但し、担体として用いた５ｗ／ｖ％
ポリアクリルアミドゲルには、グリセロール１０ｗ／ｖ
％を添加。泳動時間は４時間。）。その結果を表１及び
図４に示す。
Ｅ．グランディス、Ｅ．マイデニー、Ｅ．ニテンス及び
Ｅ．ユーロフィラの全ＤＮＡ、それぞれ５０ｎｇについ
て、ＰＣＲ用プライマーとしてｒｂｃＬ４及びｒｂｃＬ
６各０．５μＭを用い、と同様にしてＰＣＲ−ＳＳＣ
Ｐ分析を行なった（但し、担体として用いた５ｗ／ｖ％
ポリアクリルアミドゲルには、グリセロール１０ｗ／ｖ
％を添加。泳動時間は４時間。）。その結果を表１及び
図４に示す。
【００５０】図４より明らかなように、Ｅ．グロブラ
ス、Ｅ．グランディス、Ｅ．マイデニー、Ｅ．ニテンス
及びＥ．ユーロフィラより抽出されたＤＮＡを、ＰＣＲ
用プライマーとしてｒｂｃＬ１とｒｂｃＬ６を用いて増
幅した場合、増幅されたＤＮＡはＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析
において、その移動度により、ややの場合とは異
なる移動度を示す３つのグループに分けられた。そこ
で、表１には、これらのグループを便宜的にＡ、Ｂ、Ｃ
と名付けて記載したが、ここでもこのグループ名は、
、及びで用いたグループ名と何ら対応するもので
はない。ここでは、ＡグループにはＥ．グロブラス及び
Ｅ．ニテンスが、ＢグループにはＥ．グランディス及び
Ｅ．マイデニーが、ＣグループにはＥ．ユーロフィラ
が、それぞれ属している。
ス、Ｅ．グランディス、Ｅ．マイデニー、Ｅ．ニテンス
及びＥ．ユーロフィラより抽出されたＤＮＡを、ＰＣＲ
用プライマーとしてｒｂｃＬ１とｒｂｃＬ６を用いて増
幅した場合、増幅されたＤＮＡはＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析
において、その移動度により、ややの場合とは異
なる移動度を示す３つのグループに分けられた。そこ
で、表１には、これらのグループを便宜的にＡ、Ｂ、Ｃ
と名付けて記載したが、ここでもこのグループ名は、
、及びで用いたグループ名と何ら対応するもので
はない。ここでは、ＡグループにはＥ．グロブラス及び
Ｅ．ニテンスが、ＢグループにはＥ．グランディス及び
Ｅ．マイデニーが、ＣグループにはＥ．ユーロフィラ
が、それぞれ属している。
【００５１】なお、このときも、上記ＰＣＲ産物につい
て、加熱変性を行なわずに電気泳動（緩衝液：０．５×
ＴＢＥ緩衝液、担体：３％アガロースゲル）を行なった
が、これらの樹種の相違による移動度の差はやはり見出
せなかった。
て、加熱変性を行なわずに電気泳動（緩衝液：０．５×
ＴＢＥ緩衝液、担体：３％アガロースゲル）を行なった
が、これらの樹種の相違による移動度の差はやはり見出
せなかった。
【００５２】
【表１】
【００５３】（３）樹種の判別 表１は（２）で行なったＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析の結果を
まとめたものである。これによれば、例えばプライマー
セットｒｂｃＬ２とｒｂｃＬ５のみを用いてＰＣＲ−Ｓ
ＳＣＰ分析を行なった場合、Ｅ．シトリオドーラとＥ．
グロブラスは、このプライマーセットにより増幅される
ＤＮＡの移動度の違いにより判別できるが、Ｅ．ビコス
タータ、Ｅ．グランディス、Ｅ．マイデニー、Ｅ．ニテ
ンス、Ｅ．ユーロフィラは判別できない。しかし、プラ
イマーセットｒｂｃＬ２とｒｂｃＬ５、同じくｒｂｃＬ
３とｒｂｃＬ６、同じくｒｂｃＬ１とｒｂｃＬ４を用い
てＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を繰返した場合、これらそれぞ
れのプライマーセットにより増幅されるＤＮＡの移動度
を比較し、その結果を総合的に把握することにより、
Ｅ．ビコスタータ、Ｅ．グランディス、Ｅ．マイデニ
ー、Ｅ．ニテンスの判別が可能となる。これらのプライ
マーセットを用いて増幅した場合、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分
析において、Ｅ．ビコスタータのＤＮＡの移動度はＣ、
Ａ、Ａと把握され、同じくＥ．グランディスはＣ、Ｂ、
Ｂと、Ｅ．マイデニーはＣ、Ｂ、Ｃと、そしてＥ．ニテ
ンスはＣ、Ａ、Ｄと把握されるからである。一方、同様
にして、Ｅ．ユーロフィラは、プライマーセットｒｂｃ
Ｌ２とｒｂｃＬ５、同じくｒｂｃＬ３とｒｂｃＬ６、同
じくｒｂｃＬ４とｒｂｃＬ６を用いてＰＣＲ−ＳＳＣＰ
分析を繰返した場合に、Ｅ．グランディス又はＥ．マイ
デニーと判別可能である。従って、結局、Ｅ．ビコスタ
ータ、Ｅ．シトリオドーラ、Ｅ．グロブラス、Ｅ．グラ
ンディス、Ｅ．マイデニー、Ｅ．ニテンス、Ｅ．ユーロ
フィラは、プライマーセットｒｂｃＬ２とｒｂｃＬ５、
同じくｒｂｃＬ３とｒｂｃＬ６、同じくｒｂｃＬ１とｒ
ｂｃＬ４、そして同じくｒｂｃＬ４とｒｂｃＬ６を用い
て、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を繰返すことにより判別する
ことができることとなる。
まとめたものである。これによれば、例えばプライマー
セットｒｂｃＬ２とｒｂｃＬ５のみを用いてＰＣＲ−Ｓ
ＳＣＰ分析を行なった場合、Ｅ．シトリオドーラとＥ．
グロブラスは、このプライマーセットにより増幅される
ＤＮＡの移動度の違いにより判別できるが、Ｅ．ビコス
タータ、Ｅ．グランディス、Ｅ．マイデニー、Ｅ．ニテ
ンス、Ｅ．ユーロフィラは判別できない。しかし、プラ
イマーセットｒｂｃＬ２とｒｂｃＬ５、同じくｒｂｃＬ
３とｒｂｃＬ６、同じくｒｂｃＬ１とｒｂｃＬ４を用い
てＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を繰返した場合、これらそれぞ
れのプライマーセットにより増幅されるＤＮＡの移動度
を比較し、その結果を総合的に把握することにより、
Ｅ．ビコスタータ、Ｅ．グランディス、Ｅ．マイデニ
ー、Ｅ．ニテンスの判別が可能となる。これらのプライ
マーセットを用いて増幅した場合、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分
析において、Ｅ．ビコスタータのＤＮＡの移動度はＣ、
Ａ、Ａと把握され、同じくＥ．グランディスはＣ、Ｂ、
Ｂと、Ｅ．マイデニーはＣ、Ｂ、Ｃと、そしてＥ．ニテ
ンスはＣ、Ａ、Ｄと把握されるからである。一方、同様
にして、Ｅ．ユーロフィラは、プライマーセットｒｂｃ
Ｌ２とｒｂｃＬ５、同じくｒｂｃＬ３とｒｂｃＬ６、同
じくｒｂｃＬ４とｒｂｃＬ６を用いてＰＣＲ−ＳＳＣＰ
分析を繰返した場合に、Ｅ．グランディス又はＥ．マイ
デニーと判別可能である。従って、結局、Ｅ．ビコスタ
ータ、Ｅ．シトリオドーラ、Ｅ．グロブラス、Ｅ．グラ
ンディス、Ｅ．マイデニー、Ｅ．ニテンス、Ｅ．ユーロ
フィラは、プライマーセットｒｂｃＬ２とｒｂｃＬ５、
同じくｒｂｃＬ３とｒｂｃＬ６、同じくｒｂｃＬ１とｒ
ｂｃＬ４、そして同じくｒｂｃＬ４とｒｂｃＬ６を用い
て、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を繰返すことにより判別する
ことができることとなる。
【００５４】以上は、ユーカリ属の一部の種を代表例と
して取上げ、本発明の効果について説明したが、本発明
がこれら以外のユーカリ属の種にも適用できることは、
容易に推測できることである。しかも、上記実施例で使
用されたプライマーセットはごく限られたものであった
が、本発明においてはこれらのプライマーセットに限ら
れず、ｒｂｃＬ１〜ｒｂｃＬ６から選択される他のプラ
イマーセットをも用いることにより、実際に、ユーカリ
属の様々な種の判別に対応することができる。それ故、
本発明の適用は、この実施例で取上げた樹種に限られな
い。本発明は、ユーカリ属各種に適用することができ、
そのＤＮＡの塩基配列情報に基づいた判別を可能とする
ものである。
して取上げ、本発明の効果について説明したが、本発明
がこれら以外のユーカリ属の種にも適用できることは、
容易に推測できることである。しかも、上記実施例で使
用されたプライマーセットはごく限られたものであった
が、本発明においてはこれらのプライマーセットに限ら
れず、ｒｂｃＬ１〜ｒｂｃＬ６から選択される他のプラ
イマーセットをも用いることにより、実際に、ユーカリ
属の様々な種の判別に対応することができる。それ故、
本発明の適用は、この実施例で取上げた樹種に限られな
い。本発明は、ユーカリ属各種に適用することができ、
そのＤＮＡの塩基配列情報に基づいた判別を可能とする
ものである。
【００５５】
【発明の効果】本発明によれば、ＤＮＡの自己消化や微
生物由来のＤＮＡの混入に影響されることなく、ＤＮＡ
の塩基配列情報に基づき、ユーカリ属の樹種の判別が可
能となる。
生物由来のＤＮＡの混入に影響されることなく、ＤＮＡ
の塩基配列情報に基づき、ユーカリ属の樹種の判別が可
能となる。
【００５６】そのため、本発明によれば、ユーカリ属の
樹木が木材片の状態となっており、伐採後、相当な時間
が経過していても、その樹種を判別することが可能とな
る。
樹木が木材片の状態となっており、伐採後、相当な時間
が経過していても、その樹種を判別することが可能とな
る。
【００５７】従って、本発明は、ユーカリ属の樹木を利
用する紙パルプ産業、その他の林産業において、効率的
な原料管理等に応用することができる。
用する紙パルプ産業、その他の林産業において、効率的
な原料管理等に応用することができる。
【配列表】
【図１】プライマーとしてｒｂｃＬ２及びｒｂｃＬ５を
用いてＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を行なった場合に、増幅さ
れたユーカリ属各種ＤＮＡの電気泳動後の移動度を示す
図である。
用いてＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を行なった場合に、増幅さ
れたユーカリ属各種ＤＮＡの電気泳動後の移動度を示す
図である。
【図２】プライマーとしてｒｂｃＬ３及びｒｂｃＬ６を
用いてＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を行なった場合に、増幅さ
れたユーカリ属各種ＤＮＡの電気泳動後の移動度を示す
図である。
用いてＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を行なった場合に、増幅さ
れたユーカリ属各種ＤＮＡの電気泳動後の移動度を示す
図である。
【図３】プライマーとしてｒｂｃＬ１及びｒｂｃＬ４を
用いてＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を行なった場合に、増幅さ
れたユーカリ属各種ＤＮＡの電気泳動後の移動度を示す
図である。
用いてＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を行なった場合に、増幅さ
れたユーカリ属各種ＤＮＡの電気泳動後の移動度を示す
図である。
【図４】プライマーとしてｒｂｃＬ４及びｒｂｃＬ６を
用いてＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を行なった場合に、増幅さ
れたユーカリ属各種ＤＮＡの電気泳動後の移動度を示す
図である。
用いてＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析を行なった場合に、増幅さ
れたユーカリ属各種ＤＮＡの電気泳動後の移動度を示す
図である。
【図５】ユーカリ属ｒｂｃＬ遺伝子に対するプライマー
ｒｂｃＬ１〜ｒｂｃＬ６の結合位置を模式的に示す図で
ある。
ｒｂｃＬ１〜ｒｂｃＬ６の結合位置を模式的に示す図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松田 学 山口県岩国市飯田町２丁目８番１号 日本 製紙株式会社岩国技術研究所内 (72)発明者 村上 邦睦 山口県岩国市飯田町２丁目８番１号 日本 製紙株式会社岩国技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA07 AA11 BA07 CA03 HA14 HA19 4B063 QA13 QA18 QQ04 QQ44 QR08 QR32 QR38 QR62 QS14 QS25 QX01 QX04
Claims (4)
- 【請求項１】 配列番号１〜６に示す塩基配列をそれぞ
れ有する６つのプライマーより選ばれ、かつ、互いに異
なる塩基配列を有する２つのプライマーからなるプライ
マーセットを２種以上用い、ユーカリ属に属する樹木の
組織より抽出したＤＮＡについてＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ−
ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分析を繰返し、その結
果よりユーカリ属の樹種を判定することを特徴とする、
ユーカリ属の樹種判別方法。 - 【請求項２】 ユーカリプタス・ビコスタータ（Ｅｕｃ
ａｌｙｐｔｕｓ ｂｉｃｏｓｔａｔａ）、ユーカリプタ
ス・カマルドレンシス（Ｅ．ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉ
ｓ）、ユーカリプタス・シトリオドーラ（Ｅ．ｃｉｔｒ
ｉｏｄｏｒａ）、ユーカリプタス・グロブラス（Ｅ．ｇ
ｌｏｂｕｌｕｓ）、ユーカリプタス・グランディス
（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓ）、ユーカリプタス・マイデニー
（Ｅ．ｍａｉｄｅｎｉｉ）、ユーカリプタス・ニテンス
（Ｅ．ｎｉｔｅｎｓ）又はユーカリプタス・ユーロフィ
ラ（Ｅ．ｕｒｏｐｈｙｌｌａ）の樹種の判別に適用され
る、請求項１に記載のユーカリ属の樹種判別方法。 - 【請求項３】 配列番号１〜６に示す塩基配列をそれぞ
れ有する６つのプライマーより選ばれ、かつ、互いに異
なる塩基配列を有する２つのプライマーからなる、ＰＣ
Ｒにおいてユーカリ属のリブロースビスリン酸カルボキ
シラーゼ大サブユニット遺伝子（ｒｂｃＬ遺伝子）を部
分的に増幅することのできるプライマーセット。 - 【請求項４】 配列番号１〜６に示す塩基配列をそれぞ
れ有する６つのプライマーより選ばれ、かつ、互いに異
なる塩基配列を有する２つのプライマーからなる、ＰＣ
Ｒにおいてユーカリ属のリブロースビスリン酸カルボキ
シラーゼ大サブユニット遺伝子（ｒｂｃＬ遺伝子）を部
分的に増幅することのできるプライマーセットの２種以
上の組合せ。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17881099A JP3528169B2 (ja) | 1999-05-21 | 1999-05-21 | ユーカリ属の樹種判別方法及びユーカリ属の樹種判別用プライマーセット |
| ZA200002494A ZA200002494B (en) | 1999-05-21 | 2000-05-19 | Method for identifying species of the genus Eucalyptus and primer set therefor. |
| AU36337/00A AU777676B2 (en) | 1999-05-21 | 2000-05-22 | Method for identifying species of the genus eucalyptus and primer set therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17881099A JP3528169B2 (ja) | 1999-05-21 | 1999-05-21 | ユーカリ属の樹種判別方法及びユーカリ属の樹種判別用プライマーセット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000325088A true JP2000325088A (ja) | 2000-11-28 |
| JP3528169B2 JP3528169B2 (ja) | 2004-05-17 |
Family
ID=16055063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17881099A Expired - Lifetime JP3528169B2 (ja) | 1999-05-21 | 1999-05-21 | ユーカリ属の樹種判別方法及びユーカリ属の樹種判別用プライマーセット |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3528169B2 (ja) |
| AU (1) | AU777676B2 (ja) |
| ZA (1) | ZA200002494B (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002101090A2 (fr) * | 2001-06-13 | 2002-12-19 | Centre National De La Recherche Scientifique | Procede de determination de l'existence de melanges d'origines animales ou vegetales dans des substrats organiques |
| JPWO2011059066A1 (ja) * | 2009-11-13 | 2013-04-04 | 王子ホールディングス株式会社 | 植物代謝産物を利用した植物の種、雑種及び雑種両親種同定方法、並びにその方法により同定された植物の植栽方法 |
| CN110093436A (zh) * | 2019-03-27 | 2019-08-06 | 中国林业科学研究院热带林业研究所 | 用于鉴定桉树无性系的snp位点多色荧光检测引物、试剂盒、检测方法及其应用 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109706265B (zh) * | 2019-03-11 | 2022-04-01 | 中国林业科学研究院热带林业研究所 | 一种snp组合及其在桉树无性系鉴定中的应用 |
-
1999
- 1999-05-21 JP JP17881099A patent/JP3528169B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-05-19 ZA ZA200002494A patent/ZA200002494B/xx unknown
- 2000-05-22 AU AU36337/00A patent/AU777676B2/en not_active Ceased
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002101090A2 (fr) * | 2001-06-13 | 2002-12-19 | Centre National De La Recherche Scientifique | Procede de determination de l'existence de melanges d'origines animales ou vegetales dans des substrats organiques |
| WO2002101090A3 (fr) * | 2001-06-13 | 2004-04-22 | Centre Nat Rech Scient | Procede de determination de l'existence de melanges d'origines animales ou vegetales dans des substrats organiques |
| JPWO2011059066A1 (ja) * | 2009-11-13 | 2013-04-04 | 王子ホールディングス株式会社 | 植物代謝産物を利用した植物の種、雑種及び雑種両親種同定方法、並びにその方法により同定された植物の植栽方法 |
| CN110093436A (zh) * | 2019-03-27 | 2019-08-06 | 中国林业科学研究院热带林业研究所 | 用于鉴定桉树无性系的snp位点多色荧光检测引物、试剂盒、检测方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU777676B2 (en) | 2004-10-28 |
| JP3528169B2 (ja) | 2004-05-17 |
| ZA200002494B (en) | 2000-11-20 |
| AU3633700A (en) | 2000-11-23 |
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