JP2000232887A - コリネ型細菌のグルタミン酸ラセマーゼ遺伝子 - Google Patents
コリネ型細菌のグルタミン酸ラセマーゼ遺伝子Info
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- JP2000232887A JP2000232887A JP11038523A JP3852399A JP2000232887A JP 2000232887 A JP2000232887 A JP 2000232887A JP 11038523 A JP11038523 A JP 11038523A JP 3852399 A JP3852399 A JP 3852399A JP 2000232887 A JP2000232887 A JP 2000232887A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 コリネ型細菌のグルタミン酸ラセマーゼをコ
ードする遺伝子、及び同遺伝子が破壊されたコリネ型細
菌を提供する 【解決手段】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グル
タミン酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質。
ードする遺伝子、及び同遺伝子が破壊されたコリネ型細
菌を提供する 【解決手段】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グル
タミン酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、コリネ型細菌由来
のグルタミン酸ラセマーゼ及びそれをコードする遺伝子
に関する。同遺伝子は、医薬品、食品分野で有用なコリ
ネ型細菌の育種に利用することができる。
のグルタミン酸ラセマーゼ及びそれをコードする遺伝子
に関する。同遺伝子は、医薬品、食品分野で有用なコリ
ネ型細菌の育種に利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】グルタミン酸ラセマーゼは、グルタミン
酸のラセミ化反応を触媒する酵素であるが、グルタミン
酸はＬ体として生合成されるため、Ｌ−グルタミン酸を
Ｄ−グルタミン酸に変換する酵素として機能としてい
る。グルタミン酸ラセマーゼによって生成するＤ−グル
タミン酸は、細菌では、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン及
びグリシン等とともに、細胞壁のペプチドグリカンを構
成するＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びＮ−アセチ
ルムラミン酸からなる多糖を架橋する成分として利用さ
れている。また、Ｄ−グルタミン酸は、医薬品中間体と
して産業上利用されている。
酸のラセミ化反応を触媒する酵素であるが、グルタミン
酸はＬ体として生合成されるため、Ｌ−グルタミン酸を
Ｄ−グルタミン酸に変換する酵素として機能としてい
る。グルタミン酸ラセマーゼによって生成するＤ−グル
タミン酸は、細菌では、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニン及
びグリシン等とともに、細胞壁のペプチドグリカンを構
成するＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及びＮ−アセチ
ルムラミン酸からなる多糖を架橋する成分として利用さ
れている。また、Ｄ−グルタミン酸は、医薬品中間体と
して産業上利用されている。
【０００３】グルタミン酸ラセマーゼをコードする遺伝
子は、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brev
is）（特開平６−７１８３号公報）、ラクトバチルス・
フェルメンティ（ fermenti）（Gallo,K.A. and Knowle
s,J.R., Biochemistry 32, 3981-3990 (1993)、ペディ
オコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceu
s）（Pucci,M.J. et al., J. Bacteriol. 176 (2), 528
-530 (1994)）、バチルス・スファエリカス（Bacillus
sphaericus）（Fotheringham,I.G. et al., DDBJ/EMBL/
GenBank ACCESSION U26733）等で単離されている。
子は、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brev
is）（特開平６−７１８３号公報）、ラクトバチルス・
フェルメンティ（ fermenti）（Gallo,K.A. and Knowle
s,J.R., Biochemistry 32, 3981-3990 (1993)、ペディ
オコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceu
s）（Pucci,M.J. et al., J. Bacteriol. 176 (2), 528
-530 (1994)）、バチルス・スファエリカス（Bacillus
sphaericus）（Fotheringham,I.G. et al., DDBJ/EMBL/
GenBank ACCESSION U26733）等で単離されている。
【０００４】また、グルタミン酸ラセマーゼを利用する
技術として、同酵素を用いた酵素電極（特開平８−３３
４４８９号）、Ｄ−グルタミン酸の製造法（特開平６−
７１８３号公報）等が知られている。
技術として、同酵素を用いた酵素電極（特開平８−３３
４４８９号）、Ｄ−グルタミン酸の製造法（特開平６−
７１８３号公報）等が知られている。
【０００５】さらに、グルタミン酸ラセマーゼを欠損し
た微生物として、バチラス・ズブチリス（Bacillus sub
tilis ）に属し、グルタミン酸ラセマ−ゼが欠損してい
ることを特徴とする新規な納豆菌（特開平１０−２６２
６５５）が、Ｌ−グルタミン酸の割合が多いポリ−γ−
グルタミン酸を産生することが知られている。
た微生物として、バチラス・ズブチリス（Bacillus sub
tilis ）に属し、グルタミン酸ラセマ−ゼが欠損してい
ることを特徴とする新規な納豆菌（特開平１０−２６２
６５５）が、Ｌ−グルタミン酸の割合が多いポリ−γ−
グルタミン酸を産生することが知られている。
【０００６】しかし、コリネ型細菌由来のグルタミン酸
ラセマーゼについての知見は少なく、その遺伝子も単離
されていない。また、グルタミン酸ラセマーゼ遺伝子を
操作することによって細菌の溶解を調節するという思想
も知られていない。
ラセマーゼについての知見は少なく、その遺伝子も単離
されていない。また、グルタミン酸ラセマーゼ遺伝子を
操作することによって細菌の溶解を調節するという思想
も知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、コリネ型細
菌のグルタミン酸ラセマーゼをコードする遺伝子、及び
同遺伝子が破壊されたコリネ型細菌を提供することを課
題とする。
菌のグルタミン酸ラセマーゼをコードする遺伝子、及び
同遺伝子が破壊されたコリネ型細菌を提供することを課
題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意検討を行った結果、エシェリヒア・
コリ（Escherichia coli）のグルタミン酸ラセマーゼ遺
伝子（ｍｕｒＩ）変異株を用いてブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタムのグルタミン酸ラセマーゼ遺伝子
（以下、「ｍｕｒＩ」ともいう）を単離することに成功
し、本発明を完成するに至った。
解決するために鋭意検討を行った結果、エシェリヒア・
コリ（Escherichia coli）のグルタミン酸ラセマーゼ遺
伝子（ｍｕｒＩ）変異株を用いてブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタムのグルタミン酸ラセマーゼ遺伝子
（以下、「ｍｕｒＩ」ともいう）を単離することに成功
し、本発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）
に示すタンパク質である。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グル
タミン酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質。
に示すタンパク質である。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グル
タミン酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質。
【００１０】また本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示
すタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グル
タミン酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質。前記ＤＮ
Ａとしては、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げ
られる。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮ
Ａ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルタミ
ン酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡ。 本発明はさらに、前記グルタミン酸ラセマーゼの一部を
コードするＤＮＡ断片が、コリネ型細菌の染色体上のグ
ルタミン酸ラセマーゼ遺伝子との相同組換えにより染色
体ＤＮＡに組み込まれることによって、グルタミン酸ラ
セマーゼ遺伝子が破壊されたことを特徴とするコリネ型
細菌を提供する。
すタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グル
タミン酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質。前記ＤＮ
Ａとしては、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げ
られる。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮ
Ａ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルタミ
ン酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡ。 本発明はさらに、前記グルタミン酸ラセマーゼの一部を
コードするＤＮＡ断片が、コリネ型細菌の染色体上のグ
ルタミン酸ラセマーゼ遺伝子との相同組換えにより染色
体ＤＮＡに組み込まれることによって、グルタミン酸ラ
セマーゼ遺伝子が破壊されたことを特徴とするコリネ型
細菌を提供する。
【００１１】グルタミン酸ラセマーゼ活性とは、グルタ
ミン酸のラセミ化反応を触媒する活性をいうが、本発明
においては、少なくともＬ−グルタミン酸をＤ−グルタ
ミン酸に変換する活性を有していればよい。
ミン酸のラセミ化反応を触媒する活性をいうが、本発明
においては、少なくともＬ−グルタミン酸をＤ−グルタ
ミン酸に変換する活性を有していればよい。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】＜１＞本発明のＤＮＡ 本発明のＤＮＡは、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムの染色体ＤＮＡから次のようにして取得するこ
とができる。
メンタムの染色体ＤＮＡから次のようにして取得するこ
とができる。
【００１４】まず、ブレビバクテリウム ラクトファー
メンタム、例えばブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡライブラリー
を調製する。染色体ＤＮＡは、例えばSaitoらの方法（B
iochim. Biophys. Acta, 72,619-629 (1963)に記載）あ
るいはK. S. Kirbyの方法（Biochem.J.,64,405,(195
6)）等の方法により取得することができる。
メンタム、例えばブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡライブラリー
を調製する。染色体ＤＮＡは、例えばSaitoらの方法（B
iochim. Biophys. Acta, 72,619-629 (1963)に記載）あ
るいはK. S. Kirbyの方法（Biochem.J.,64,405,(195
6)）等の方法により取得することができる。
【００１５】次に、得られた染色体ＤＮＡからｍｕｒＩ
遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを
作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分
分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間等を調
節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素
が使用できる。例えば、Sau3AIを、温度３０℃以上、好
ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／mlで様々
な時間（１分〜２時間）染色体ＤＮＡに作用させてこれ
を消化する。尚、後記実施例では、BamHIを用いた。
遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを
作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分
分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間等を調
節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素
が使用できる。例えば、Sau3AIを、温度３０℃以上、好
ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／mlで様々
な時間（１分〜２時間）染色体ＤＮＡに作用させてこれ
を消化する。尚、後記実施例では、BamHIを用いた。
【００１６】ついで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、
エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターDN
Aに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染
色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素BamHIと相補的な末
端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばBamHIを、温
度３０℃以上、酵素濃度１〜100ユニット／mlの条件下
で１時間以上、好ましくは１〜３時間、ベクターＤＮＡ
に作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次い
で、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切
断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリ
ガーゼ、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜１
６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／mlの条件下で１時
間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えＤＮ
Ａを得る。
エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターDN
Aに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染
色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素BamHIと相補的な末
端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばBamHIを、温
度３０℃以上、酵素濃度１〜100ユニット／mlの条件下
で１時間以上、好ましくは１〜３時間、ベクターＤＮＡ
に作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次い
で、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切
断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリ
ガーゼ、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜１
６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／mlの条件下で１時
間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えＤＮ
Ａを得る。
【００１７】得られた組換えＤＮＡを用いて、エシェリ
ヒア・コリのＤ−グルタミン酸要求性変異株、例えばエ
シェリヒア・コリＷＭ３３５（J.Bacteriol., 1973, 11
4:499-506）を形質転換し、Ｄ−グルタミン酸を含まな
い寒天培地に塗布し、培養する。生じたコロニーを液体
培地に接種して培養し、得られる菌体からプラスミドを
回収すれば、ｍｕｒＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得るこ
とができる。
ヒア・コリのＤ−グルタミン酸要求性変異株、例えばエ
シェリヒア・コリＷＭ３３５（J.Bacteriol., 1973, 11
4:499-506）を形質転換し、Ｄ−グルタミン酸を含まな
い寒天培地に塗布し、培養する。生じたコロニーを液体
培地に接種して培養し、得られる菌体からプラスミドを
回収すれば、ｍｕｒＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得るこ
とができる。
【００１８】上記のようにして得られるＤＮＡ断片がｍ
ｕｒＩ遺伝子を含むことの確認は、同ＤＮＡ断片の塩基
配列を決定し、配列番号１に示す塩基配列を有するこ
と、又は制限酵素地図を作成し、図１に示す制限酵素地
図と比較することによって行うことができる。
ｕｒＩ遺伝子を含むことの確認は、同ＤＮＡ断片の塩基
配列を決定し、配列番号１に示す塩基配列を有するこ
と、又は制限酵素地図を作成し、図１に示す制限酵素地
図と比較することによって行うことができる。
【００１９】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡの切断にＢａｍＨ
Ｉを用いた場合には、ｍｕｒＩ遺伝子は約６ｋｂのＢａ
ｍＨＩ断片中にクローン化される。このＢａｍＨＩ断片
をＳａｃＩ及びＸｈｏＩで切断すると、ｍｕｒＩ遺伝子
を含む約１．６ｋｂのＤＮＡ断片が得られる。
ムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡの切断にＢａｍＨ
Ｉを用いた場合には、ｍｕｒＩ遺伝子は約６ｋｂのＢａ
ｍＨＩ断片中にクローン化される。このＢａｍＨＩ断片
をＳａｃＩ及びＸｈｏＩで切断すると、ｍｕｒＩ遺伝子
を含む約１．６ｋｂのＤＮＡ断片が得られる。
【００２０】上記と同様にして、他のコリネ型細菌から
ｍｕｒＩ遺伝子を単離することができる。また、本発明
のＤＮＡは、その塩基配列が明らかとなったので、同塩
基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライ
マーに用いるＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアク
ション）によりコリネ型細菌染色体から、又は同塩基配
列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブを
用いるハイブリダイゼーションにより、染色体ＤＮＡラ
イブラリーから単離することができる。
ｍｕｒＩ遺伝子を単離することができる。また、本発明
のＤＮＡは、その塩基配列が明らかとなったので、同塩
基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライ
マーに用いるＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアク
ション）によりコリネ型細菌染色体から、又は同塩基配
列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブを
用いるハイブリダイゼーションにより、染色体ＤＮＡラ
イブラリーから単離することができる。
【００２１】本発明においてコリネ型細菌は、従来ブレ
ビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテ
リウム属に統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bact
eriol., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属
と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。この
ようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられ
る。
ビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテ
リウム属に統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bact
eriol., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属
と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。この
ようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられ
る。
【００２２】コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ
ム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・アルカノリティカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） コリネバクテリウム・メラセコーラ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス コリネバクテリウム・ハーキュリス ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ブレビバクテリウム・アルバム ブレビバクテリウム・セリヌム ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム 具体的には、下記のような菌株を例示することができ
る。
ム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・アルカノリティカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） コリネバクテリウム・メラセコーラ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス コリネバクテリウム・ハーキュリス ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ブレビバクテリウム・アルバム ブレビバクテリウム・セリヌム ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム 具体的には、下記のような菌株を例示することができ
る。
【００２３】コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ
ム ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１
５８０６ コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２
１５１１ コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１ コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２
０、１３０３２、１３０６０ コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０ コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６
５ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３
４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９） コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６
８ ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０ ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０
６７ ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１
４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３６６５、Ａ
ＴＣＣ１３８６９、 ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５ ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１
４０６６ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２
４０ ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ＡＴＣＣ６８７１ ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１ ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２ ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１
５３５４
ム ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１
５８０６ コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２
１５１１ コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１ コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２
０、１３０３２、１３０６０ コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０ コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６
５ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３
４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９） コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６
８ ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０ ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０
６７ ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１
４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３６６５、Ａ
ＴＣＣ１３８６９、 ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５ ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１
４０６６ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２
４０ ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス） ＡＴＣＣ６８７１ ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１ ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２ ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１
５３５４
【００２４】染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブ
ラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラ
スミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転
換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定
等の方法は、上記の方法の他、当業者によく知られてい
る通常の方法を採用することができる。これらの方法
は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis,
T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second
Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press,(19
89)等に記載されている。
ラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラ
スミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転
換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定
等の方法は、上記の方法の他、当業者によく知られてい
る通常の方法を採用することができる。これらの方法
は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis,
T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second
Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press,(19
89)等に記載されている。
【００２５】上記のようにして得られるｍｕｒＩ遺伝子
の塩基配列を配列表配列番号１に示す。また、この塩基
配列によってコードされ得るタンパク質（分子量３０，
３５４）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
の塩基配列を配列表配列番号１に示す。また、この塩基
配列によってコードされ得るタンパク質（分子量３０，
３５４）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２６】本発明のＤＮＡは、コードされるグルタミ
ン酸ラセマーゼの活性が損なわれない限り、１若しくは
複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠
失、挿入、付加、又は逆位を含むグルタミン酸ラセマー
ゼをコードするものであってもよい。ここで、「数個」
とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位
置や種類によっても異なる。それは、イソロイシンとバ
リンのように、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミ
ノ酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、蛋白質の
立体構造に大きな影響を与えないことに由来する。従っ
て、グルタミン酸ラセマーゼを構成するアミノ酸配列全
体に対し、３０から５０％以上、好ましくは５０〜７０
％以上の相同性を有し、グルタミン酸ラセマーゼ活性を
有するものであってもよい。具体的には、前記「数個」
は、２〜３０個、好ましくは、２〜２０個、より好まし
くは２〜１０個である。
ン酸ラセマーゼの活性が損なわれない限り、１若しくは
複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠
失、挿入、付加、又は逆位を含むグルタミン酸ラセマー
ゼをコードするものであってもよい。ここで、「数個」
とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位
置や種類によっても異なる。それは、イソロイシンとバ
リンのように、アミノ酸によっては、類縁性の高いアミ
ノ酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、蛋白質の
立体構造に大きな影響を与えないことに由来する。従っ
て、グルタミン酸ラセマーゼを構成するアミノ酸配列全
体に対し、３０から５０％以上、好ましくは５０〜７０
％以上の相同性を有し、グルタミン酸ラセマーゼ活性を
有するものであってもよい。具体的には、前記「数個」
は、２〜３０個、好ましくは、２〜２０個、より好まし
くは２〜１０個である。
【００２７】上記のようなグルタミン酸ラセマーゼと実
質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば
部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基
が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基
配列を改変することによって得られる。また、上記のよ
うな改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理に
よっても取得され得る。変異処理としては、グルタミン
酸ラセマーゼをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン
等でインビトロ処理する方法、及びグルタミン酸ラセマ
ーゼをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシ
ェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−
ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸
等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理
する方法が挙げられる。
質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば
部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基
が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基
配列を改変することによって得られる。また、上記のよ
うな改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理に
よっても取得され得る。変異処理としては、グルタミン
酸ラセマーゼをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン
等でインビトロ処理する方法、及びグルタミン酸ラセマ
ーゼをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシ
ェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−
ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸
等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理
する方法が挙げられる。
【００２８】また、上記のような塩基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位等には、グルタミン酸ラセマーゼを
保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合な
どの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれ
る。
入、付加、又は逆位等には、グルタミン酸ラセマーゼを
保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合な
どの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含まれ
る。
【００２９】上記のような変異を有するＤＮＡを、適当
な細胞で発現させ、発現産物のグルタミン酸ラセマーゼ
活性を調べることにより、グルタミン酸ラセマーゼと実
質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られ
る。また、変異を有するグルタミン酸ラセマーゼをコー
ドするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配
列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グ
ルタミン酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡを単離することによっても、グルタミン酸ラ
セマーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮ
Ａが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」
とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特
異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条
件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せ
ば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同
性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相
同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あ
るいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条
件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好まし
くは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃
度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
な細胞で発現させ、発現産物のグルタミン酸ラセマーゼ
活性を調べることにより、グルタミン酸ラセマーゼと実
質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られ
る。また、変異を有するグルタミン酸ラセマーゼをコー
ドするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配
列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グ
ルタミン酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡを単離することによっても、グルタミン酸ラ
セマーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮ
Ａが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」
とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特
異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条
件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せ
ば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同
性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相
同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あ
るいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条
件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好まし
くは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃
度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３０】このような条件でハイブリダイズする遺伝
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、そ
れらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎグル
タミン酸ラセマーゼ活性を測定することによって容易に
取り除くことができる。
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、そ
れらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎグル
タミン酸ラセマーゼ活性を測定することによって容易に
取り除くことができる。
【００３１】＜２＞本発明のＤＮＡの利用 上記の本発明のＤＮＡを、適当な宿主−ベクター系を用
いて発現させることにより、グルタミン酸ラセマーゼを
製造することができる。
いて発現させることにより、グルタミン酸ラセマーゼを
製造することができる。
【００３２】ｍｕｒＩ遺伝子を発現させるための宿主と
しては、エシェリヒア・コリ、ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタム等のコリネ型細菌、その他の種々の
原核細胞、サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae）をはじめとする種々の真核細胞、動物細
胞、植物細胞が挙げられるが、これらの中では原核細
胞、特にエシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌が好まし
い。
しては、エシェリヒア・コリ、ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタム等のコリネ型細菌、その他の種々の
原核細胞、サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyce
s cerevisiae）をはじめとする種々の真核細胞、動物細
胞、植物細胞が挙げられるが、これらの中では原核細
胞、特にエシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌が好まし
い。
【００３３】エシェリヒア・コリにｍｕｒＩ遺伝子を導
入するためのベクターとしては、例えばpUC19、pUC18、
pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF101
0、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。
他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。また、
コリネ型細菌にｍｕｒＩ遺伝子を導入するためのベクタ
ーとしては、pAM330（特開昭５８−６７６９９号公報参
照）、pHM1519（特開昭５８−７７８９５号公報参
照）、pAJ655、pAJ611、pAJ1844（以上、特開昭５８−
１９２９００号公報参照）、pCG1（特開昭５７−１３４
５００号公報参照）、pCG2（特開昭５８−３５１９７号
公報参照）、pCG4、pCG11（以上、特開昭５７−１８３
７９９号公報参照）、pHK4（特開平５−７４９１号公報
参照）等が挙げられる。上記のベクターにｍｕｒＩ遺伝
子を連結して得られる組換えベクターで上記宿主を形質
転換することによって、ｍｕｒＩ遺伝子を導入すること
ができる。また、ｍｕｒＩ遺伝子を、トランスダクショ
ン、トランスポゾン（Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Te
chnol.,1,417(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０
９９８５号）または相同性組換え（Experiments in Mol
ecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)）を
用いた方法で宿主のゲノムに組み込んでもよい。
入するためのベクターとしては、例えばpUC19、pUC18、
pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF101
0、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。
他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。また、
コリネ型細菌にｍｕｒＩ遺伝子を導入するためのベクタ
ーとしては、pAM330（特開昭５８−６７６９９号公報参
照）、pHM1519（特開昭５８−７７８９５号公報参
照）、pAJ655、pAJ611、pAJ1844（以上、特開昭５８−
１９２９００号公報参照）、pCG1（特開昭５７−１３４
５００号公報参照）、pCG2（特開昭５８−３５１９７号
公報参照）、pCG4、pCG11（以上、特開昭５７−１８３
７９９号公報参照）、pHK4（特開平５−７４９１号公報
参照）等が挙げられる。上記のベクターにｍｕｒＩ遺伝
子を連結して得られる組換えベクターで上記宿主を形質
転換することによって、ｍｕｒＩ遺伝子を導入すること
ができる。また、ｍｕｒＩ遺伝子を、トランスダクショ
ン、トランスポゾン（Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Te
chnol.,1,417(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０
９９８５号）または相同性組換え（Experiments in Mol
ecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)）を
用いた方法で宿主のゲノムに組み込んでもよい。
【００３４】上記のようにしてｍｕｒＩ遺伝子を導入さ
れた細胞を培地で培養し、グルタミン酸ラセマーゼを培
養物中に生成蓄積させ、該培養物よりグルタミン酸ラセ
マーゼを採取することにより、グルタミン酸ラセマーゼ
を製造することができる。培養に用いる培地は、用いる
宿主に応じて適宜選択すればよい。
れた細胞を培地で培養し、グルタミン酸ラセマーゼを培
養物中に生成蓄積させ、該培養物よりグルタミン酸ラセ
マーゼを採取することにより、グルタミン酸ラセマーゼ
を製造することができる。培養に用いる培地は、用いる
宿主に応じて適宜選択すればよい。
【００３５】上記のようにして製造されるグルタミン酸
ラセマーゼは、必要に応じて、菌体抽出液又は培地から
イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ
フィー、吸着クロマトグラフィー、溶媒沈殿等、通常の
酵素の精製法を用いて精製することができる。
ラセマーゼは、必要に応じて、菌体抽出液又は培地から
イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ
フィー、吸着クロマトグラフィー、溶媒沈殿等、通常の
酵素の精製法を用いて精製することができる。
【００３６】また、本発明のＤＮＡを利用して、細胞中
のグルタミン酸ラセマーゼ活性が野生株よりも高い微生
物、細胞中のグルタミン酸ラセマーゼ活性が野生株より
も低い微生物、又はグルタミン酸ラセマーゼを欠損した
微生物を作製することができる。細胞中のグルタミン酸
ラセマーゼ活性が野生株よりも高い微生物は、ｍｕｒＩ
遺伝子を発現可能な形態で含むベクターで微生物を形質
転換することによって得ることができる。また、細胞中
のグルタミン酸ラセマーゼ活性が野生株よりも低い微生
物又はグルタミン酸ラセマーゼを欠損した微生物は、例
えば、グルタミン酸ラセマーゼの一部をコードするＤＮ
Ａ断片を、微生物の染色体上のｍｕｒＩ遺伝子との相同
組換えにより染色体ＤＮＡに組み込むことによって、得
ることができる。
のグルタミン酸ラセマーゼ活性が野生株よりも高い微生
物、細胞中のグルタミン酸ラセマーゼ活性が野生株より
も低い微生物、又はグルタミン酸ラセマーゼを欠損した
微生物を作製することができる。細胞中のグルタミン酸
ラセマーゼ活性が野生株よりも高い微生物は、ｍｕｒＩ
遺伝子を発現可能な形態で含むベクターで微生物を形質
転換することによって得ることができる。また、細胞中
のグルタミン酸ラセマーゼ活性が野生株よりも低い微生
物又はグルタミン酸ラセマーゼを欠損した微生物は、例
えば、グルタミン酸ラセマーゼの一部をコードするＤＮ
Ａ断片を、微生物の染色体上のｍｕｒＩ遺伝子との相同
組換えにより染色体ＤＮＡに組み込むことによって、得
ることができる。
【００３７】具体的には、例えば、ｍｕｒＩ遺伝子の
５’末端部及び３’末端部を欠失し、正常に機能するグ
ルタミン酸ラセマーゼを産生しないように改変したｍｕ
ｒＩ遺伝子（欠失型ｍｕｒＩ遺伝子）を含むＤＮＡでコ
リネ型細菌等の微生物を形質転換し、欠失型ｍｕｒＩ遺
伝子と染色体上のｍｕｒＩ遺伝子との間で組換えを起こ
させることにより、染色体上のｍｕｒＩ遺伝子を破壊す
ることができる。このような相同組換えによる遺伝子破
壊は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度
感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などによ
っても遺伝子破壊を行うことができる。以下にコリネ型
細菌の温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方
法を説明する。
５’末端部及び３’末端部を欠失し、正常に機能するグ
ルタミン酸ラセマーゼを産生しないように改変したｍｕ
ｒＩ遺伝子（欠失型ｍｕｒＩ遺伝子）を含むＤＮＡでコ
リネ型細菌等の微生物を形質転換し、欠失型ｍｕｒＩ遺
伝子と染色体上のｍｕｒＩ遺伝子との間で組換えを起こ
させることにより、染色体上のｍｕｒＩ遺伝子を破壊す
ることができる。このような相同組換えによる遺伝子破
壊は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度
感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などによ
っても遺伝子破壊を行うことができる。以下にコリネ型
細菌の温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方
法を説明する。
【００３８】ｍｕｒＩ遺伝子の内部を欠失し、正常に機
能するグルタミン酸ラセマーゼを産生しないように改変
したｍｕｒＩ遺伝子（欠失型ｍｕｒＩ遺伝子）を含むＤ
ＮＡを作製する。この欠失型ｍｕｒＩ遺伝子を、宿主染
色体上のｍｕｒＩ遺伝子と置換するには以下のようにす
ればよい。すなわち、温度感受性複製起点と変異型ｍｕ
ｒＩ遺伝子とクロラムフェニコール等の薬剤に耐性を示
すマーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮＡを調製し、
この組換えＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、温度感
受性複製起点が機能しない温度で形質転換株を培養し、
続いてこれを薬剤を含む培地で培養することにより、組
換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換株が
得られる。
能するグルタミン酸ラセマーゼを産生しないように改変
したｍｕｒＩ遺伝子（欠失型ｍｕｒＩ遺伝子）を含むＤ
ＮＡを作製する。この欠失型ｍｕｒＩ遺伝子を、宿主染
色体上のｍｕｒＩ遺伝子と置換するには以下のようにす
ればよい。すなわち、温度感受性複製起点と変異型ｍｕ
ｒＩ遺伝子とクロラムフェニコール等の薬剤に耐性を示
すマーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮＡを調製し、
この組換えＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、温度感
受性複製起点が機能しない温度で形質転換株を培養し、
続いてこれを薬剤を含む培地で培養することにより、組
換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換株が
得られる。
【００３９】こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込ま
れた株は、染色体上にもともと存在するｍｕｒＩ遺伝子
配列との組換えを起こし、染色体ｍｕｒＩ遺伝子と欠失
型ｍｕｒＩ遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの
他の部分（ベクター部分、温度感受性複製起点及び薬剤
耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体に挿入されてい
る。したがって、この状態では正常なｍｕｒＩ遺伝子が
優性であるので、形質転換株はｍｕｒＩを発現し、Ｄ−
グルタミン酸を生成することができる。
れた株は、染色体上にもともと存在するｍｕｒＩ遺伝子
配列との組換えを起こし、染色体ｍｕｒＩ遺伝子と欠失
型ｍｕｒＩ遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの
他の部分（ベクター部分、温度感受性複製起点及び薬剤
耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体に挿入されてい
る。したがって、この状態では正常なｍｕｒＩ遺伝子が
優性であるので、形質転換株はｍｕｒＩを発現し、Ｄ−
グルタミン酸を生成することができる。
【００４０】次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型ｍｕｒＩ遺
伝子のみを残すために、２個のｍｕｒＩ遺伝子の組換え
により１コピーのｍｕｒＩ遺伝子を、ベクター部分（温
度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカーを含む）ととも
に染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、正常なｍｕｒ
Ｉ遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、欠失型ｍｕｒＩ遺
伝子が切り出される場合と、反対に欠失型ｍｕｒＩ遺伝
子が染色体ＤＮＡ上に残され、正常なｍｕｒＩ遺伝子が
切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性
複製起点が機能する温度で培養すれば、切り出されたＤ
ＮＡはプラスミド状で細胞内に保持される。次に、温度
感受性複製起点が機能しない温度で培養すると、欠失型
ｍｕｒＩ遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残された場合は、正
常なｍｕｒＩ遺伝子を含むプラスミドが細胞から脱落す
るためＤ−グルタミン酸を生成できないが、正常なｍｕ
ｒＩ遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残された場合はＤ−グル
タミン酸を生成することができる。したがって、温度感
受性複製起点が機能する温度でＤ−グルタミン酸を生成
することができ、温度感受性複製起点が機能しない温度
でＤ−グルタミン酸を生成できない株を選択することに
よって、染色体ＤＮＡ上のｍｕｒＩ遺伝子が破壊され、
正常なｍｕｒＩ遺伝子をプラスミド上に保持する株を得
ることができる。
伝子のみを残すために、２個のｍｕｒＩ遺伝子の組換え
により１コピーのｍｕｒＩ遺伝子を、ベクター部分（温
度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカーを含む）ととも
に染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、正常なｍｕｒ
Ｉ遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、欠失型ｍｕｒＩ遺
伝子が切り出される場合と、反対に欠失型ｍｕｒＩ遺伝
子が染色体ＤＮＡ上に残され、正常なｍｕｒＩ遺伝子が
切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性
複製起点が機能する温度で培養すれば、切り出されたＤ
ＮＡはプラスミド状で細胞内に保持される。次に、温度
感受性複製起点が機能しない温度で培養すると、欠失型
ｍｕｒＩ遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残された場合は、正
常なｍｕｒＩ遺伝子を含むプラスミドが細胞から脱落す
るためＤ−グルタミン酸を生成できないが、正常なｍｕ
ｒＩ遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残された場合はＤ−グル
タミン酸を生成することができる。したがって、温度感
受性複製起点が機能する温度でＤ−グルタミン酸を生成
することができ、温度感受性複製起点が機能しない温度
でＤ−グルタミン酸を生成できない株を選択することに
よって、染色体ＤＮＡ上のｍｕｒＩ遺伝子が破壊され、
正常なｍｕｒＩ遺伝子をプラスミド上に保持する株を得
ることができる。
【００４１】上記のようにして得られるｍｕｒＩ遺伝子
破壊株は、温度感受性複製起点が機能する温度（例えば
低温）で培養すればｍｕｒＩ遺伝子を細胞内に保持し、
温度感受性複製起点が機能しない温度（例えば高温）で
培養すればｍｕｒＩ遺伝子を欠損する。
破壊株は、温度感受性複製起点が機能する温度（例えば
低温）で培養すればｍｕｒＩ遺伝子を細胞内に保持し、
温度感受性複製起点が機能しない温度（例えば高温）で
培養すればｍｕｒＩ遺伝子を欠損する。
【００４２】尚、上記のようにしてｍｕｒＩ遺伝子を破
壊した後は、遺伝子破壊株にｒｅｃＡ-を導入しておく
と、低温で培養中にプラスミド上のｍｕｒＩ遺伝子が染
色体へ再び組み込まれるのを防ぐことができる点で好ま
しい。
壊した後は、遺伝子破壊株にｒｅｃＡ-を導入しておく
と、低温で培養中にプラスミド上のｍｕｒＩ遺伝子が染
色体へ再び組み込まれるのを防ぐことができる点で好ま
しい。
【００４３】コリネ型細菌細胞内で機能する温度感受性
複製起点を有するプラスミドとしては、ｐＨＳ４、ｐＨ
Ｓ２２、ｐＨＳ２３が挙げられる。また、ｐＨＳ４から
切り出したコリネ型細菌由来の複製起点を含むＤＮＡ断
片を、エシェリヒア・コリ用のベクターであるｐＨＳＧ
３９８に接続して得られたプラスミドｐＨＳＣ４も、同
様に温度感受性プラスミドとして本発明に使用すること
ができる。ｐＨＳＣ４は、コリネ型細菌、及びエシェリ
ヒア・コリ中で自律増殖して、宿主にクロラムフェニコ
ール耐性を付与する。ｐＨＳＣ４を保持するエシェリヒ
ア・コリＡＪ１２５７１は、１９９０年１０月１１日に
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１１７６３として寄託され、１９９１
年８月２６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管
され、ＦＥＲＭ ＢＰ−３５２４の受託番号で寄託され
ている。
複製起点を有するプラスミドとしては、ｐＨＳ４、ｐＨ
Ｓ２２、ｐＨＳ２３が挙げられる。また、ｐＨＳ４から
切り出したコリネ型細菌由来の複製起点を含むＤＮＡ断
片を、エシェリヒア・コリ用のベクターであるｐＨＳＧ
３９８に接続して得られたプラスミドｐＨＳＣ４も、同
様に温度感受性プラスミドとして本発明に使用すること
ができる。ｐＨＳＣ４は、コリネ型細菌、及びエシェリ
ヒア・コリ中で自律増殖して、宿主にクロラムフェニコ
ール耐性を付与する。ｐＨＳＣ４を保持するエシェリヒ
ア・コリＡＪ１２５７１は、１９９０年１０月１１日に
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１１７６３として寄託され、１９９１
年８月２６日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管
され、ＦＥＲＭ ＢＰ−３５２４の受託番号で寄託され
ている。
【００４４】これらの温度感受性プラスミドはコリネ型
細菌細胞中において、約１０〜３２℃では自律増殖でき
るが、約３４℃以上では自律増殖できない。温度感受性
複製起点を有するＤＮＡ断片は、例えば上記ｐＨＳＣ４
をＢａｍＨＩとＫｐｎＩで切り出すことによって得られ
る。
細菌細胞中において、約１０〜３２℃では自律増殖でき
るが、約３４℃以上では自律増殖できない。温度感受性
複製起点を有するＤＮＡ断片は、例えば上記ｐＨＳＣ４
をＢａｍＨＩとＫｐｎＩで切り出すことによって得られ
る。
【００４５】尚、上記の各々のプラスミドの構築及びそ
の温度感受性複製起点を含む領域の塩基配列は、特公平
７−１０８２２８号公報に記載されている。上記のよう
にして得られるｍｕｒＩ遺伝子が破壊された微生物は、
Ｄ−グルタミン酸を生成できないので、正常なペプチド
グリカンが合成されず、溶菌しやすい。また、温度感受
性プラスミドを用いてｍｕｒＩ遺伝子が破壊された株
は、培養温度によってＤ−グルタミン酸の生成を調節す
ることができる。
の温度感受性複製起点を含む領域の塩基配列は、特公平
７−１０８２２８号公報に記載されている。上記のよう
にして得られるｍｕｒＩ遺伝子が破壊された微生物は、
Ｄ−グルタミン酸を生成できないので、正常なペプチド
グリカンが合成されず、溶菌しやすい。また、温度感受
性プラスミドを用いてｍｕｒＩ遺伝子が破壊された株
は、培養温度によってＤ−グルタミン酸の生成を調節す
ることができる。
【００４６】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００４７】＜１＞ブレビバクテリウム ラクトファー
メンタム ＡＴＣＣ１３８６９のｍｕｒＩ遺伝子のクロ
ーニング （１）ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム Ａ
ＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡの調製 ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ
１３８６９株を、１０ｍｌのＬ培地（１％ポリペプト
ン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．１％
グルコース、［ｐＨ７．２］）にて一晩培養後、集菌し
た。菌体を５０ｍＭトリス塩酸、５０ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０）緩衝液により洗浄した後、菌体を８００
μｌの同緩衝液に懸濁した。
メンタム ＡＴＣＣ１３８６９のｍｕｒＩ遺伝子のクロ
ーニング （１）ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム Ａ
ＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡの調製 ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ
１３８６９株を、１０ｍｌのＬ培地（１％ポリペプト
ン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．１％
グルコース、［ｐＨ７．２］）にて一晩培養後、集菌し
た。菌体を５０ｍＭトリス塩酸、５０ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０）緩衝液により洗浄した後、菌体を８００
μｌの同緩衝液に懸濁した。
【００４８】上記の菌体懸濁液に、５０ｍｌ／ｍｌリゾ
チーム溶液を４０μｌ、および１０ｍｇ／ｍｌリボヌク
レアーゼ溶液を２０μｌ添加し、３７℃で１時間インキ
ュベートした。これに、２０％ＳＤＳ溶液を２０μｌ添
加し、７０℃で１時間インキュベートした。続いて、２
０ｍｇ／ｍｌプロテナーゼＫ溶液を２４μｌ添加し、５
０℃で１時間インキュベートした後、さらにプロテナー
ゼＫ溶液を２４μｌ添加して１時間インキュベートし
た。
チーム溶液を４０μｌ、および１０ｍｇ／ｍｌリボヌク
レアーゼ溶液を２０μｌ添加し、３７℃で１時間インキ
ュベートした。これに、２０％ＳＤＳ溶液を２０μｌ添
加し、７０℃で１時間インキュベートした。続いて、２
０ｍｇ／ｍｌプロテナーゼＫ溶液を２４μｌ添加し、５
０℃で１時間インキュベートした後、さらにプロテナー
ゼＫ溶液を２４μｌ添加して１時間インキュベートし
た。
【００４９】上記のようにして得られた溶菌液に、等量
のフェノールを加えて撹拌した後、４℃で一晩、放置
し、遠心分離して水層を回収した。この水層を、さらに
フェノール／クロロホルムにて２時間、クロロホルム／
イソアミルアルコールにて３０分間抽出した。抽出は、
撹拌後指定時間放置した後、遠心分離して水層を回収す
ることにより行った。得られた抽出液からエタノール沈
殿によりＤＮＡを回収した。ＤＮＡの沈殿は、３００μ
ｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ
［ｐＨ８．０］）に溶解した。
のフェノールを加えて撹拌した後、４℃で一晩、放置
し、遠心分離して水層を回収した。この水層を、さらに
フェノール／クロロホルムにて２時間、クロロホルム／
イソアミルアルコールにて３０分間抽出した。抽出は、
撹拌後指定時間放置した後、遠心分離して水層を回収す
ることにより行った。得られた抽出液からエタノール沈
殿によりＤＮＡを回収した。ＤＮＡの沈殿は、３００μ
ｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ
［ｐＨ８．０］）に溶解した。
【００５０】（２）ブレビバクテリウム ラクトファー
メンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡライブラ
リーの作製 上記のようにして得られたブレビバクテリウム ラクト
ファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ及
びエシェリヒア・コリの低コピーベクターｐＭＷ１１８
（ニッポンジーン）を、制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造
（株））で切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合
し、Takara DNA Ligation Kit ver.2（宝酒造（株））
を用いて連結し、ブレビバクテリウム ラクトファーメ
ンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡライブラリ
ーを構築した。
メンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡライブラ
リーの作製 上記のようにして得られたブレビバクテリウム ラクト
ファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ及
びエシェリヒア・コリの低コピーベクターｐＭＷ１１８
（ニッポンジーン）を、制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造
（株））で切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合
し、Takara DNA Ligation Kit ver.2（宝酒造（株））
を用いて連結し、ブレビバクテリウム ラクトファーメ
ンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡライブラリ
ーを構築した。
【００５１】（３）ｍｕｒＩ遺伝子クローンの選択 上記のようにして得られたブレビバクテリウム ラクト
ファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡラ
イブラリーで、エシェリヒア・コリのｍｕｒＩ変異株Ｗ
Ｍ３３５（Ｄ−グルタミン酸要求性、J.Bacteriol., 19
73, 114:499-506）を形質転換し、２５μg／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬ寒天培地（１．５％アガーを含むＬ培
地）にて、３０℃で一晩培養した。
ファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡラ
イブラリーで、エシェリヒア・コリのｍｕｒＩ変異株Ｗ
Ｍ３３５（Ｄ−グルタミン酸要求性、J.Bacteriol., 19
73, 114:499-506）を形質転換し、２５μg／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬ寒天培地（１．５％アガーを含むＬ培
地）にて、３０℃で一晩培養した。
【００５２】生じたコロニーをＬ液体培地に接種して培
養し、得られた菌体からプラスミドを回収したところ、
約６ｋｂのＢａｍＨＩ断片がクローン化されており、プ
ラスミドをｐＩ１と命名した。クローン化されたＤＮＡ
断片の制限酵素地図を作製した（図１）。また、クロー
ン化されたＤＮＡ断片を、図１の制限酵素地図に示す種
々の制限酵素で切断し、５’末端側もしくは３’末端側
又はその両方を欠失させた断片をサブクローニングし、
得られたプラスミドを用いてエシェリヒア・コリＷＭ３
３５株のｍｕｒＩ変異（Ｄ−グルタミン酸要求性）の相
補性試験を行った（図１）。
養し、得られた菌体からプラスミドを回収したところ、
約６ｋｂのＢａｍＨＩ断片がクローン化されており、プ
ラスミドをｐＩ１と命名した。クローン化されたＤＮＡ
断片の制限酵素地図を作製した（図１）。また、クロー
ン化されたＤＮＡ断片を、図１の制限酵素地図に示す種
々の制限酵素で切断し、５’末端側もしくは３’末端側
又はその両方を欠失させた断片をサブクローニングし、
得られたプラスミドを用いてエシェリヒア・コリＷＭ３
３５株のｍｕｒＩ変異（Ｄ−グルタミン酸要求性）の相
補性試験を行った（図１）。
【００５３】その結果、ｍｕｒＩ変異を相補する最も短
い断片は、ＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片（約１．６ｋｂ）で
あった（図１下から２つ目）。
い断片は、ＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片（約１．６ｋｂ）で
あった（図１下から２つ目）。
【００５４】（４）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基
配列の決定。 ｐＩ１中のＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片について、Thermo S
equenase fluorescentlabelled primer cycle sequenci
ng kit with 7-deaza-dGTP（アマシャムファルマシアバ
イオテック社）を用いたダイデオキシ反応を行い、ＤＮ
ＡシークエンサーＤＳＱ-１０００Ｌ（島津製作所）を
用いた塩基配列を決定した。決定された塩基配列には２
８４アミノ酸をコードするオープンリーディングフレー
ム（８５２ｂｐ）が見い出された。その塩基配列を配列
表配列番号１に示す。また、この塩基配列によってコー
ドされ得るタンパク質（分子量３０，３５４）のアミノ
酸配列を配列番号２に示す。このアミノ酸配列は、様々
な微生物のグルタミン酸ラセマーゼ（ｍｕｒＩ遺伝子産
物）と相同性を有し、ｍｕｒＩ遺伝子であると同定され
た。
配列の決定。 ｐＩ１中のＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片について、Thermo S
equenase fluorescentlabelled primer cycle sequenci
ng kit with 7-deaza-dGTP（アマシャムファルマシアバ
イオテック社）を用いたダイデオキシ反応を行い、ＤＮ
ＡシークエンサーＤＳＱ-１０００Ｌ（島津製作所）を
用いた塩基配列を決定した。決定された塩基配列には２
８４アミノ酸をコードするオープンリーディングフレー
ム（８５２ｂｐ）が見い出された。その塩基配列を配列
表配列番号１に示す。また、この塩基配列によってコー
ドされ得るタンパク質（分子量３０，３５４）のアミノ
酸配列を配列番号２に示す。このアミノ酸配列は、様々
な微生物のグルタミン酸ラセマーゼ（ｍｕｒＩ遺伝子産
物）と相同性を有し、ｍｕｒＩ遺伝子であると同定され
た。
【００５５】（５）ｍｕｒＩ遺伝子産物の同定 エシェリヒア・コリのＳ３０抽出液（Promega）と、Ｌ-
［3Ｈ］ロイシン（アマシャム社）を用い、前記Ｓａｃ
Ｉ−ＸｈｏＩ断片を保持するプラスミドを鋳型として転
写、翻訳を行った。標識されたタンパク質を、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２．５％）にて分
離後、フルオログラフィーにて検出した。その結果、約
３０ｋＤａのタンパク質が検出された。
［3Ｈ］ロイシン（アマシャム社）を用い、前記Ｓａｃ
Ｉ−ＸｈｏＩ断片を保持するプラスミドを鋳型として転
写、翻訳を行った。標識されたタンパク質を、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２．５％）にて分
離後、フルオログラフィーにて検出した。その結果、約
３０ｋＤａのタンパク質が検出された。
【００５６】＜２＞ブレビバクテリウム ラクトファー
メンタム ＡＴＣＣ１３８６９のｍｕｒＩ遺伝子破壊株
の構築 ＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片を保持するプラスミドをＣｌａ
Ｉ及びＥｃｏＴ２２１で切断し、ｍｕｒＩ遺伝子の５’
末端領域および３’末端領域をともに欠失した遺伝子断
片（約０．６ｋｂ）を得た。この断片を、ＡｃｃＩ及び
ＰｓｔＩで切断したプラスミドベクターｐＨＳＧ２９８
（宝酒造（株））に挿入した（図２）。
メンタム ＡＴＣＣ１３８６９のｍｕｒＩ遺伝子破壊株
の構築 ＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片を保持するプラスミドをＣｌａ
Ｉ及びＥｃｏＴ２２１で切断し、ｍｕｒＩ遺伝子の５’
末端領域および３’末端領域をともに欠失した遺伝子断
片（約０．６ｋｂ）を得た。この断片を、ＡｃｃＩ及び
ＰｓｔＩで切断したプラスミドベクターｐＨＳＧ２９８
（宝酒造（株））に挿入した（図２）。
【００５７】得られたプラスミドで、野生株であるブレ
ビバクテリウム ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８
６９を形質転換し、５μg／ｍｌカナマイシン、５０μg
／ｍｌのＤ−グルタミン酸を含むＬ寒天培地上で２日間
培養する。生じたコロニーより染色体ＤＮＡを回収しＰ
ＣＲを行い、相同的組み換えによりｍｕｒＩ遺伝子が破
壊されていることを確認する。
ビバクテリウム ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８
６９を形質転換し、５μg／ｍｌカナマイシン、５０μg
／ｍｌのＤ−グルタミン酸を含むＬ寒天培地上で２日間
培養する。生じたコロニーより染色体ＤＮＡを回収しＰ
ＣＲを行い、相同的組み換えによりｍｕｒＩ遺伝子が破
壊されていることを確認する。
【００５８】
【発明の効果】本発明により、ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタム由来のグルタミン酸ラセマーゼをコ
ードするｍｕｒＩ遺伝子が提供される。同遺伝子を用い
てグルタミン酸ラセマーゼの発現量を調節することによ
って、コリネ型細菌の溶菌を調節することができる。
クトファーメンタム由来のグルタミン酸ラセマーゼをコ
ードするｍｕｒＩ遺伝子が提供される。同遺伝子を用い
てグルタミン酸ラセマーゼの発現量を調節することによ
って、コリネ型細菌の溶菌を調節することができる。
【００５９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Ltd） <120> コリネ型細菌のグルタミン酸ラセマーゼ遺伝子（Glutamate racemase gen e of coryneform bacterium） <130> P-6042 <141> 1999-02-17 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0
【００６０】 <210> 1 <211> 1605 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum <220> <221> CDS <222> (262)..(1113) <400> 1 ctcgaggaat tatttggtgc aagaggctgt tgaacaacaa gacaaacgca atcacgatga 60 tggccaccaa gatcaagatc aacccaatga gactgccttt gggtgaacgt ttcgcgggcg 120 ccacagctgt aggagagcca atagtctccg aagttgctcg caccgcagcg aatcgtctgg 180 tttcttgatc aggtgaatca gccattgcca tattgtgaca catcttggac ggataaaaag 240 ggaagcaacg cgaggtagct t atg atg gca acc gtg act gat ttc agt gga 291 Met Met Ala Thr Val Thr Asp Phe Ser Gly 1 5 10 tct atg att gaa cgc ccc gtg cca ggt gct gat gcg ccg att gga att 339 Ser Met Ile Glu Arg Pro Val Pro Gly Ala Asp Ala Pro Ile Gly Ile 15 20 25 ttt gat tct gga gtt ggc gga tta acc gta gct cgc aca atc atc gat 387 Phe Asp Ser Gly Val Gly Gly Leu Thr Val Ala Arg Thr Ile Ile Asp 30 35 40 caa ttg cca cat gaa tca gtt att tat atc ggt gat act gcc aat ggc 435 Gln Leu Pro His Glu Ser Val Ile Tyr Ile Gly Asp Thr Ala Asn Gly 45 50 55 cct tat ggt ccg ttg cct atc gct aag gtc cgt gag cac gcc atc cgc 483 Pro Tyr Gly Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Arg Glu His Ala Ile Arg 60 65 70 att gcc gat gag ttg gtg gaa cgc gga tgc aag atg att gtc att gcc 531 Ile Ala Asp Glu Leu Val Glu Arg Gly Cys Lys Met Ile Val Ile Ala 75 80 85 90 tgt aac act gcg tcc gct gcg ttt ctc cga gat gcc cgt gaa cga tac 579 Cys Asn Thr Ala Ser Ala Ala Phe Leu Arg Asp Ala Arg Glu Arg Tyr 95 100 105 agt gtg cca gtc gtg gaa gtt att ctt ccc gca gta agg cgt gcg gtg 627 Ser Val Pro Val Val Glu Val Ile Leu Pro Ala Val Arg Arg Ala Val 110 115 120 gca tcc acc cgc aat ggc aaa gtg ggc gtg atc ggc aca gtg gga acc 675 Ala Ser Thr Arg Asn Gly Lys Val Gly Val Ile Gly Thr Val Gly Thr 125 130 135 att aac tcc ggt gcg tac cag gat ctt ttc tct gca agc ccc tcc att 723 Ile Asn Ser Gly Ala Tyr Gln Asp Leu Phe Ser Ala Ser Pro Ser Ile 140 145 150 gag gtc aac gca gtg gca tgc cca cgg ttt gtg gat ttc gtg gaa cgc 771 Glu Val Asn Ala Val Ala Cys Pro Arg Phe Val Asp Phe Val Glu Arg 155 160 165 170 gga att acc agc ggc agg cag atc ctc aac att gcg cag gat tat tta 819 Gly Ile Thr Ser Gly Arg Gln Ile Leu Asn Ile Ala Gln Asp Tyr Leu 175 180 185 gag cct ctg caa gca gaa ggg gtg gac act ctt gtg ctt gga tgc acc 867 Glu Pro Leu Gln Ala Glu Gly Val Asp Thr Leu Val Leu Gly Cys Thr 190 195 200 cac tat cca ctg ctc tcc ggt gtc att cag ttg gca atg ggg gac cac 915 His Tyr Pro Leu Leu Ser Gly Val Ile Gln Leu Ala Met Gly Asp His 205 210 215 gta agt ttg gtc tct agc gcg gaa gaa act gcg aaa gac gtg ctg aga 963 Val Ser Leu Val Ser Ser Ala Glu Glu Thr Ala Lys Asp Val Leu Arg 220 225 230 atc ttg agc cag caa gat ctt tta gcc gat ccg gac atg cat cct gag 1011 Ile Leu Ser Gln Gln Asp Leu Leu Ala Asp Pro Asp Met His Pro Glu 235 240 245 250 cca agt tat agc ttt gaa tca aca ggc gat ccg gaa atc ttt gca caa 1059 Pro Ser Tyr Ser Phe Glu Ser Thr Gly Asp Pro Glu Ile Phe Ala Gln 255 260 265 tta agc cgc cga ttc ctt gga cca att gtt tcc cta gtg aga caa aac 1107 Leu Ser Arg Arg Phe Leu Gly Pro Ile Val Ser Leu Val Arg Gln Asn 270 275 280 gag gga taaccccagg tgtgtgttct acctctgaaa ggggaggggt agttagaaat 1163 Glu Gly tcacattttg gcctaaaagt tcacgcgatc ttcaattgca tggcacagta tccttatgag 1223 actgaccatc cttggaagct ctggtagcgt gcccgctcca ggtaaccccg catccggata 1283 tctgttaact tctccggacg cccctgccgt gattatggac atgggcccag gtgtccttgc 1343 agcagttcaa gaaattcaag atcctgctga tgcgcatgtt attttctccc atttgcacac 1403 cgatcactgc gctgattttg cgtccttgat ggtgtggcgc aggttccacc caacgctggc 1463 cgccaagagc cgcaatcttt tgtttggacc tgaagatacc cccaacaggc ttggtcgttt 1523 gggctccgat gagcctgatg gtgttgatga tatgtcagat acttttgctt tcgacgcctg 1583 ggaagagcgc aagccagagc tc 1605
【００６１】 <210> 2 <211> 284 <212> PRT <213> Brevibacillus laterosporus <400> 2 Met Met Ala Thr Val Thr Asp Phe Ser Gly Ser Met Ile Glu Arg Pro 1 5 10 15 Val Pro Gly Ala Asp Ala Pro Ile Gly Ile Phe Asp Ser Gly Val Gly 20 25 30 Gly Leu Thr Val Ala Arg Thr Ile Ile Asp Gln Leu Pro His Glu Ser 35 40 45 Val Ile Tyr Ile Gly Asp Thr Ala Asn Gly Pro Tyr Gly Pro Leu Pro 50 55 60 Ile Ala Lys Val Arg Glu His Ala Ile Arg Ile Ala Asp Glu Leu Val 65 70 75 80 Glu Arg Gly Cys Lys Met Ile Val Ile Ala Cys Asn Thr Ala Ser Ala 85 90 95 Ala Phe Leu Arg Asp Ala Arg Glu Arg Tyr Ser Val Pro Val Val Glu 100 105 110 Val Ile Leu Pro Ala Val Arg Arg Ala Val Ala Ser Thr Arg Asn Gly 115 120 125 Lys Val Gly Val Ile Gly Thr Val Gly Thr Ile Asn Ser Gly Ala Tyr 130 135 140 Gln Asp Leu Phe Ser Ala Ser Pro Ser Ile Glu Val Asn Ala Val Ala 145 150 155 160 Cys Pro Arg Phe Val Asp Phe Val Glu Arg Gly Ile Thr Ser Gly Arg 165 170 175 Gln Ile Leu Asn Ile Ala Gln Asp Tyr Leu Glu Pro Leu Gln Ala Glu 180 185 190 Gly Val Asp Thr Leu Val Leu Gly Cys Thr His Tyr Pro Leu Leu Ser 195 200 205 Gly Val Ile Gln Leu Ala Met Gly Asp His Val Ser Leu Val Ser Ser 210 215 220 Ala Glu Glu Thr Ala Lys Asp Val Leu Arg Ile Leu Ser Gln Gln Asp 225 230 235 240 Leu Leu Ala Asp Pro Asp Met His Pro Glu Pro Ser Tyr Ser Phe Glu 245 250 255 Ser Thr Gly Asp Pro Glu Ile Phe Ala Gln Leu Ser Arg Arg Phe Leu 260 265 270 Gly Pro Ile Val Ser Leu Val Arg Gln Asn Glu Gly 275 280
【図１】 ｍｕｒＩ遺伝子を含む約６ｋｂのＢａｍＨＩ
断片の制限酵素地図及びサブクローニング断片によるｍ
ｕｒＩ変異株の相補性試験の結果を示す図。図中の制限
酵素名の略称は以下のとおりである。Ｂ：BamHI、Ａ：A
ccI、Ｓｃ：SacI、Ｓｐ：SphI、Ｘｈ：XhoI、Ｅ：EcoRI
断片の制限酵素地図及びサブクローニング断片によるｍ
ｕｒＩ変異株の相補性試験の結果を示す図。図中の制限
酵素名の略称は以下のとおりである。Ｂ：BamHI、Ａ：A
ccI、Ｓｃ：SacI、Ｓｐ：SphI、Ｘｈ：XhoI、Ｅ：EcoRI
【図２】 ｍｕｒＩ遺伝子破壊用プラスミドの構造及び
遺伝子破壊を模式的に示す図。
遺伝子破壊を模式的に示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA07 CA04 DA05 DA06 GA11 HA01 4B050 CC03 DD02 LL02 4B063 QA01 QQ06 QQ43 QR19 QR33 QR62 QS32 4B065 AA22Y AA26X AB01 BA02 CA27
Claims (4)
- 【請求項１】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク
質。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グル
タミン酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質。 - 【請求項２】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グル
タミン酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質。 - 【請求項３】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
る請求項２記載のＤＮＡ。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮ
Ａ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルタミ
ン酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡ。 - 【請求項４】 請求項１記載のタンパク質の一部をコー
ドするＤＮＡ断片が、コリネ型細菌の染色体上のグルタ
ミン酸ラセマーゼ遺伝子との相同組換えにより染色体Ｄ
ＮＡに組み込まれることによって、グルタミン酸ラセマ
ーゼ遺伝子が破壊されたことを特徴とするコリネ型細
菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11038523A JP2000232887A (ja) | 1999-02-17 | 1999-02-17 | コリネ型細菌のグルタミン酸ラセマーゼ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11038523A JP2000232887A (ja) | 1999-02-17 | 1999-02-17 | コリネ型細菌のグルタミン酸ラセマーゼ遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000232887A true JP2000232887A (ja) | 2000-08-29 |
Family
ID=12527645
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11038523A Pending JP2000232887A (ja) | 1999-02-17 | 1999-02-17 | コリネ型細菌のグルタミン酸ラセマーゼ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000232887A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014207891A (ja) * | 2013-03-26 | 2014-11-06 | 福山黒酢株式会社 | 食酢、及び、食酢の製造方法 |
-
1999
- 1999-02-17 JP JP11038523A patent/JP2000232887A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014207891A (ja) * | 2013-03-26 | 2014-11-06 | 福山黒酢株式会社 | 食酢、及び、食酢の製造方法 |
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