JP2000178208A - 超音波造影剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 各種臓器の腫瘍や早期ガンなどの疾患のある
特定の領域にタイムリーに集積することが可能な超音波
造影剤を提供する。 【解決手段】 カルボン酸塩によって被覆された微小気
泡の表面にビオチン誘導体を静電結合させたことを特徴
とする超音波造影剤である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、超音波画像診断
において診断画像のコントラストを増強するために使用
される超音波造影剤に関する。さらに詳しくは、長寿命
で均一安定な気泡から成る超音波造影剤の表面にビオチ
ン誘導体を静電結合させた超音波造影剤に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】超音波は、医学的画像診断の分野で広く
利用されている。超音波を利用した医学診断画像とは、
超音波変換器より超音波を人体内に送信し、人体組織で
反射された超音波信号を再び超音波変換器で受信するこ
とによって再構成された画像を言う。つまり、超音波変
換器から得られた超音波信号のもつ情報を超音波診断装
置に送り、そこで画像作成処理を行い、診断装置のモニ
タ上に画像が出力される。この画像によって、医師等は
人体内部の組織の様子を観察することができる。

【０００３】人体は、組織によってそれぞれ異なる音速
や減衰あるいは散乱という音響特性を持っている。超音
波変換器で受信された超音波信号は、人体組織の後方散
乱特性によって生じたものであり、モニタに出力された
画像は、検査中の人体組織の音響特性を表示しているこ
とになる。

【０００４】超音波の音響特性を表す音響インピーダン
スは、異なる物質の境界面（例えば固体と液体の界面、
液体と気体の界面等）で大きく変化する。したがって、
この境界面からの超音波信号を用いれば鮮明な診断画像
を得ることができる。そのために、単純気泡、コーティ
ングされた気泡、コロイド状懸濁液、エマルジョン等の
さまざまな材料が超音波造影剤として研究されてきた
が、その中でも微小気泡超音波造影剤は、周囲の生体組
織と著しく音響インピーダンスが異なるために超音波の
散乱特性に優れ、従来の超音波診断装置では見えにくい
血流などの画像を鮮明にすることから、血流診断の精度
向上や早期ガンの発見に大きく期待されている。

【０００５】微小気泡からなる超音波造影剤としては、
例えば特開平８−３２５１６５号公報に示すように、気
泡のコーティング剤、すなわち気泡と水との界面に配向
吸着する薬剤として界面活性剤を用いることにより、長
期安定な微小気泡を作製した例が報告されている。

【０００６】一方、今までに開発された超音波造影剤の
体内への投与方法については、多くの方法が提案されて
いる。これらの方法の中で最も一般的に使われている方
法は静脈内への投与である。これは、できるだけ人体に
障害を与えない方法で心臓の疾患、例えば心筋梗塞や心
臓の血流に乱流が生じている部位などを造影することが
望まれていたからである。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、現在利
用されている超音波造影剤に対しては、診断画像のコン
トラストを増強するだけではなく、人体内の問題のある
部位、例えば各種臓器の腫瘍や早期ガンなどの疾患のあ
る特定の領域にタイムリーに微小気泡を集積することが
強く望まれている。造影剤のこのような用途を実現する
ためには、従来のように問題のある部位にただ単純に造
影剤を注入するよりも、他の手段、例えば、体内の特定
の部位を標的にすることができる機能をもった造影剤を
利用する方が著しく有利である。

【０００８】例えば、特定の部位を標的にすることがで
きる機能をもった造影剤であれば、問題のある部位に造
影剤を選択的に集めることができるので、医師等はより
正確に疾患を超音波で観察し、診断することができる。
いずれにしても、今までの典型的な超音波造影剤は、静
脈とかリンパ系のように、問題のある領域に直接的に単
純に注入されていた。超音波造影剤に特定の部位を標的
にすることができる機能をもたせるには、標的機能を可
能にするメカニズムを確立することが必要である。本発
明は、上記従来の欠点を解決するためになされたもの
で、その目的は、体内の特定部位を標的にすることがで
きる機能をもった超音波造影剤を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明による超音波造影
剤は、カルボン酸塩によって被覆された微小気泡の表面
にビオチン誘導体を静電結合させた構造から成る。該微
小気泡の被覆に使われるカルボン酸塩は、ラウリン酸ナ
トリウム、ミリスチン酸ナトリウム、パルミチン酸ナト
リウム、ステアリン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウ
ムであり、これらのカルボン酸塩は単独で又は混合物の
形で使用する。

【００１０】また、該微小気泡の表面に静電結合させる
ビオチン誘導体としては、式Ｉに示すＮ−（２−アミノ
エチル）ビオチンアミド塩酸塩（Ｎ−（２−Ａｍｉｎｏ
ｅｔｈｙｌ）ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌ
ｏｒｉｄｅ）がある。

【００１１】ビオチンは、水溶性ビタミンＢ群の一つで
あり、カルボキシル化反応に関与する酵素の補酵素であ
る。このビオチンはアビジンという強塩基性糖タンパク
質との間にきわめて高い親和性を有している。アビジン
は数種の抗菌性タンパク質（リゾチーム、コンブルアミ
ン）を含む卵白から単離することができる等電点１０．
５の強塩基性糖タンパク質であり、ｐＨおよび温度とも
に広い範囲にわたり安定である。

【００１２】アビジン−ビオチン系はエンザイムイムノ
アッセイの重要な手法として急速に発展してきている。
その理由の一つとして、前述したようにアビジンはビオ
チンに対してきわめて高い親和性を有していることがあ
げられる。また、ビオチンはその活性を消失することな
く抗体や多数の酵素に容易に結合させることができるこ
とも理由の一つである。さらに、アビジンは非常に安定
で、数個の結合部位を有し、したがって、ビオチン化さ
れた２分子間の架橋分子として用いることができること
もあげられる。アビジン−ビオチン複合体は熱にもタン
パク質分解酵素にもきわめて安定であり、またアビジン
−ビオチン系を用いるとエンザイムイムノアッセイにお
ける検出能が向上し、バックグラウンドのレベルを低下
させることができる。

【００１３】一般に、前記カルボン酸塩で被覆された微
小気泡は、負の電荷を持つ親水基が表面に現れるために
静電的に負に帯電している。したがって、使用するビオ
チン誘導体が水溶液中で電離して正に帯電していれば、
その静電結合によって微小気泡の表面にビオチン誘導体
が結合したビオチン化微小気泡造影剤が作製できる。

【００１４】図１に本発明によるビオチン化微小気泡造
影剤の構造を示す。気体１と水２との界面にカルボン酸
塩３が配向吸着することによって気体１をコーティング
している。カルボン酸塩３は疎水基４を気体１の方に向
け、親水基５を水２の方に向けて配向している。負の電
荷を持つ親水基５が微小気泡の表面に現れているため
に、微小気泡の表面は負に帯電している。一方、ビオチ
ン誘導体であるＮ−（２−アミノエチル）ビオチンアミ
ド塩酸塩６は水２の中で電離して正に帯電しているの
で、微小気泡の表面と静電結合することができる。

【００１５】ビオチン化微小気泡造影剤を各種臓器の腫
瘍やガンに選択的に集める手順としては、まず第１段階
として腫瘍やガン細胞を認識する抗体にビオチン誘導体
を結合させたビオチン化抗体を作製し、体内に投与す
る。生体において起こる各種相互作用のなかでも、抗原
−抗体間の相互作用はきわめて特異的な親和性をもって
いる。したがって、上記のビオチン化抗体は、抗原−抗
体反応により標的となる腫瘍やガン細胞の表面に集積す
る。最近は細胞融合技術を利用してモノクローナル抗体
が容易に調整できるようになったことから、それを利用
したビオチン化抗体も容易に調整できる。

【００１６】次に、第２段階としてアビジンを体内に投
与する。アビジンは既に説明したようにビオチンとの間
にきわめて高い親和性を持っているので、第１段階にお
いて腫瘍やガンの表面に抗原−抗体反応で結合している
ビオチン化抗体のビオチン部分と強く結合する。

【００１７】第３段階としてビオチン化微小気泡造影剤
を体内に投与する。このビオチン化微小気泡造影剤が腫
瘍やガンの表面にビオチン化抗体を介して結合している
アビジンと結合することで、微小気泡造影剤を腫瘍やガ
ンに選択的に集積させることができる。つまり、各種臓
器の腫瘍や早期ガンを発見するために、疾患のある特定
の領域にタイムリーに微小気泡を選択的に集積すること
ができるので、それによって医師等はより正確に疾患を
超音波で観察し、診断することができるようになる。

【００１８】ビオチン化微小気泡造影剤の作製方法とし
ては、まずカルボン酸塩を含有する水溶液と気体とを撹
拌装置によって撹拌することによって、カルボン酸塩で
被覆された微小気泡を作製する。次に、作製した微小気
泡含有乳化液の中に正に帯電したビオチン誘導体を入れ
て、撹拌装置を使って低動力で撹拌しながら微小気泡の
表面にビオチン誘導体を静電結合させることによって、
表面にビオチン誘導体が結合した微小気泡からなる超音
波造影剤を作製することができる。

【００１９】

【発明の実施の形態】以下、図面を参照して本発明の実
施例を説明するが、本発明を限定するものではない。

【００２０】乾燥粉末状のステアリン酸ナトリウム１５
０ｍｇを１５０ｍｌの蒸留水に添加した。その後、ホモ
ジナイザー（日立製作所製のＨＧ３０型）を用いてこの
水溶液を３０秒間低撹拌した。この時のホモジナイザー
の撹拌パワーレベルは、「１」（５，０００ｒｐｍ）で
ある。そして、３０秒の撹拌の後、２分間撹拌を停止し
て水溶液を放置した。その後、再度上記撹拌、すなわち
３０秒間撹拌パワーレベル「１」（５，０００ｒｐｍ）
で、この水溶液を撹拌した。次に、ホモジナイザーの撹
拌パワーレベルを「５」（１５，０００ｒｐｍ）に上
げ、この水溶液を更に３分間撹拌した。尚、上記ホモジ
ナイザーの撹拌パワーレベルは、１〜１０段階まであ
る。

【００２１】尚、蒸留水の量は１５０ｍｌに限るもので
はなく、発泡状態に応じて適宜水溶液の容積を増加させ
てもよい。

【００２２】上記の低動力で所定時間撹拌する低撹拌工
程と、大動力で撹拌する高撹拌工程との２段階の撹拌工
程からなる段階撹拌工程は、既に特開平８−３２５１６
５号公報で報告されている。血管内に注入され、血流に
よって肺に運ばれても、肺の中の微細な血管を通過する
ことができる直径（１〜１０μｍ）の微小気泡を多く含
有する乳化液を、この方法により効率よく大量に生成さ
せることができる。

【００２３】尚、上記微小気泡の製造方法では、一例と
してステアリン酸ナトリウムを用いたが、他のカルボン
酸塩として、ラウリン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナト
リウム、パルミチン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウ
ムが挙げられ、これらのカルボン酸塩は単独で又は混合
物の形で使用しても良い。

【００２４】次に、作製した微小気泡含有乳化液を５０
ｍｌのビュレットに取り、吸引口を下にした状態で１時
間放置した。放置しておくとビュレットの内部で気泡は
水よりも比重が軽いので、吸引口先端と反対側の上層に
浮上し、その結果、微小気泡含有乳化液は、微小気泡部
分と液体部分に分離する。

【００２５】更に直径の大きな気泡は比重が小さいの
で、ビュレットの上方に短時間で浮上する一方、直径の
小さい気泡は大きな気泡に比べ比重が大きいので、浮上
するのに時間を要する。そのため、ビュレット上方の微
小気泡部分は気泡の大きさに応じて分離していることに
なる。

【００２６】１時間経過後、まずビュレット吸引口先端
付近の微小気泡の含まれていない液体部分だけを放出す
る。その結果、ビュレット内部には微小気泡と若干のカ
ルボン酸塩水溶液だけが残っていることになる。次に、
ビュレット吸引口先端付近の直径の小さい微小気泡のみ
を先端から別容器に放出すれば、所望の大きさの微小気
泡（例えば１〜１０μｍ）が得られる。すなわち、ビュ
レット内での微小気泡含有乳化液の放置時間と、ビュレ
ットからの微小気泡の放出割合によって、自在に微小気
泡の大きさを制御することができる。

【００２７】上記の気泡と水との比重差及び気泡サイズ
による比重差を利用して気泡の大きさを分離する浮力分
離工程については、特開平８−３２５１６５号公報に示
されている。

【００２８】微小気泡の表面に静電結合させるビオチン
誘導体としては、Ｎ−（２−アミノエチル）ビオチンア
ミド塩酸塩（ＶＥＣＴＯＲ社製の製品名がＮＥＵＲＯ−
ＢＩＯＴＩＮ ＴＲＡＣＥＲ）を用いた。このビオチン
誘導体は神経細胞の細胞内ビオチン標識用に開発された
もので、可溶性で細胞内に長期に残存し、無毒である。
蒸留水に溶解すると、式ＩＩ

【化２】 に示すように、ビオチンを含んだ正の電荷を持つ陽イオ
ンと負の電荷を持つ陰イオンに電離する。乾燥粉末状の
Ｎ−（２−アミノエチル）ビオチンアミド塩酸塩８ｍｇ
を１ｍｌの蒸留水に添加し、十分に溶解させる。尚、蒸
留水の量は１ｍｌに限るものではなく、表面に静電結合
させる微小気泡の量に応じて適宜水溶液の容積を増加さ
せてもよい。

【００２９】浮力分離工程によって取り出した平均粒径
約１〜１０μｍの微小気泡含有乳化液１０ｍｌに、作製
したビオチン誘導体水溶液１ｍｌを混入し、シーソー回
転式ローター（井内盛栄堂製のＶＭＲ−５型）を用いて
ゆっくり３０分間撹拌しながら、負に帯電した微小気泡
の表面に正に帯電したビオチン誘導体を静電結合させる
ことによって、ビオチン化微小気泡造影剤を作製した。

【００３０】作製したビオチン化微小気泡造影剤を評価
する方法として、表面にストレプトアビジンが結合して
いる磁性体の酸化鉄（Ｆｅ_２Ｏ_３）（日本パーセプティ
ブ製の製品名がＢｉｏＭＡＧ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉ
ｎ）とビオチン化微小気泡造影剤をアビジン−ビオチン
結合させ、その複合体に外部から磁場を印加し、磁場で
誘導できるかどうかによってビオチン化微小気泡造影剤
の評価を行った。使用した磁性体である酸化鉄の直径は
平均約１μｍで、粒子表面はシランでコーティングされ
ている。このコーティング表面にストレプトアビジンが
固定されている。ストレプトマイセス アビジン（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）から得られ
るアビジンに類似したタンパク質のストレプトアビジン
はまだあまり使用されていないが、バックグラウンドの
呈色はアビジンより低く優れている。

【００３１】表面に磁性体である酸化鉄をアビジン−ビ
オチン結合させたビオチン化微小気泡を外部磁場で誘導
し、評価するための実験システムを図２に示す。グレー
スケールファントム７内の円柱型の測定用穴８に蒸留水
又は生理食塩水をいれ、その中に前記製造方法で作成し
た微小気泡を適量注入した。そして、グレースケールフ
ァントム７の横に設置した電磁石９に直流安定化電源１
０から直流電流を流すことによって微小気泡の入ってい
る測定穴に外部磁場を印加した。実験では電磁石９に１
０Ａの直流電流を流すことによって約１００ガウスの磁
場を印加した。

【００３２】超音波診断装置１１を使って、微小気泡を
注入した測定用穴８の超音波診断画像を観察した。図３
は、表面に磁性体粒子がアビジン−ビオチン結合してい
る微小気泡に右方向から磁場を印加したときの超音波画
像を表している。図３を見ると磁場を印加してから３０
秒後では、微小気泡の後方散乱により生じる輝度の明る
い部分が、特に磁場によって移動している様子が見られ
ないが、磁場を印加してから２分後では、輝度の明るい
部分が電磁石の方向に引き寄せられている様子が観察で
き、微小気泡が磁場によって誘導されている様子がわか
る。

【００３３】次に比較のために表面にビオチン誘導体を
静電結合させていない通常の微小気泡造影剤と、表面に
ストレプトアビジンが結合している磁性体である酸化鉄
を混合し、それに外部磁場を印加したときの様子を図４
に示す。この場合は前述した結果とは異なり、印加後２
分を経過しても特に磁場によって誘導されている様子は
観察できなかった。これは、微小気泡と磁性体が結合し
ていないためであると考えられる。このことから、本発
明による微小気泡造影剤が表面にビオチン誘導体が静電
結合している微小気泡超音波造影剤であることが確認で
きた。

【００３４】

【発明の効果】本発明は、以上説明したような形態で実
施され、以下に記載されるような効果を奏する。

【００３５】本発明のカルボン酸塩によって被覆された
微小気泡の表面にビオチン誘導体を静電結合させた超音
波造影剤は、生体において起こる各種相互作用のなかで
も、きわめて特異的な親和性をもっている抗原−抗体反
応とアビジン−ビオチン結合を利用して、人体内の問題
のある部位、例えば各種臓器の腫瘍や早期ガンなどの特
定の領域にタイムリーに微小気泡を集積することができ
る。これによって、医師等はより正確に疾患を超音波で
観察し、診断することが可能になる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施の形態に係るビオチン化微小気泡
造影剤の構造図である。

【図２】本発明の実施の形態に係るビオチン化微小気泡
造影剤の表面に磁性体をアビジン−ビオチン結合させた
複合体の磁場による誘導を評価するための実験システム
図である。

【図３】表面に磁性体をアビジン−ビオチン結合させた
ビオチン化微小気泡造影剤に磁場を印加したときのＢモ
ード超音波診断画像である。

【図４】表面にビオチン誘導体を静電結合させていない
通常の微小気泡造影剤と磁性体の混合物に磁場を印加し
たときのＢモード超音波診断画像である。

【符号の説明】

１ 気体 ２ 水 ３ カルボン酸塩 ４ 疎水基 ５ 親水基 ６ Ｎ−（２−アミノエチル）ビオチンアミド塩酸塩 ７ グレースケールファントム ８ 測定用穴 ９ 電磁石 １０ 直流安定化電源 １１ 超音波診断装置 １２ プローブ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】カルボン酸塩によって被覆された微小気泡
   の表面にビオチン誘導体を静電結合させたことを特徴と
   する超音波造影剤。
2. 【請求項２】請求項１記載の超音波造影剤において、前
   記カルボン酸塩は、ラウリン酸ナトリウム、ミリスチン
   酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸
   ナトリウム、オレイン酸ナトリウムであり、これらのカ
   ルボン酸塩を単独で又は混合物の形で使用することを特
   徴とする超音波造影剤。
3. 【請求項３】請求項１記載の超音波造影剤において、前
   記ビオチン誘導体が式Ｉ 【化１】 で示されるＮ−（２−アミノエチル）ビオチンアミド塩
   酸塩であることを特徴とする超音波造影剤。