JP2000159668A - サイトカイン抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 サイトカイン抑制剤を提供する。 【解決手段】α−リノレン酸を３５重量％以上を含有す
る油脂を用いることを特徴とするインターロイキン−１
β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−６またはインターフェロン−
γ（ＩＦＮ−γ）であるサイトカインの抑制剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、α−リノレン酸を
３５重量％以上を含有する油脂を用いるサイトカインの
抑制剤に関する。更に詳しくは、α−リノレン酸を３５
重量％以上を含有する油脂を用いるインターロイキン−
１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−
６）またはインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）である
サイトカインの抑制剤に関する。さらには、前記のサイ
トカインの抑制剤を有効成分とする抗アレルギー性薬剤
に関する。

【０００２】

【従来の技術】アレルギーは現代病といわれている。例
えば、アレルギーには、スギ花粉、ソバ、卵などの食物
アレルギー、住宅内の化学物質過敏症、喘息、アトピー
性皮膚炎などがあり、今日社会問題にもなっている。ま
た、小学校就学児童のおよそ１／３が何らかのアレルギ
ー症状を経験したという報告もある。このような症状の
改善・治療には各症状や疾患毎の対処的な治療が行われ
ているが、必ずしも多くの人に良好な治療がなされてい
るとは言い難い。近頃では高い薬理効果が期待できる副
腎皮質ホルモンなどの薬剤が用いられている。しかしホ
ルモン剤は副作用が問題となっている。患者はホルモン
剤を使用すると常に副作用の危険にさらされている。例
えば、このようなホルモン剤の使用停止後に増悪するリ
バウンドの悲惨さは衆人の知るところである。また非ス
テロイド性の抗炎症剤や抗ヒスタミン剤なども使用され
ているが、それらの効果は十分とはいえない。これらの
薬剤はいずれも外用が主であり、経口による摂取ではそ
の副作用が深刻である。

【０００３】一方、α−リノレン酸（以下、ＡＬＡと略
す）、エイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡと略す）や
ドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡと略す）等のｎ−３
系高度不飽和脂肪酸が経口で摂取してもほとんど副作用
がなく抗アレルギー作用を呈することが知られている。
これまで、このような高度不飽和脂肪酸を経口的に摂取
してアレルギーを治療した報告について以下に記す。特
開昭５９−１５２３２４号公報ではｎ−３高度不飽和脂
肪酸とｎ−６高度不飽和脂肪酸の適切な組み合わせがア
レルギー性鼻炎やアトピーなどの治療に有効であること
を示している。

【０００４】伊藤ら〔日本小児アレルギー学会誌 Ｖｏ
ｌ．６，ｐｐ８７−９１（１９９２）〕は、ＡＬＡを豊
富に含むエゴマ油を小児アトピー性皮膚炎患者に投与し
て改善効果をあげている。河原ら〔臨床栄養Ｖｏｌ．８
７，ｐｐ１８５−１８９（１９９５）〕及び菊池ら〔日
本小児アレルギー学会誌 Ｖｏｌ．８，ｐｐ１８−２６
（１９９４）〕、新宅ら〔アレルギーの臨床 Ｖｏｌ．
１４，ｐｐ２９６−３０５（１９９４）〕は、ＡＬＡを
含むエゴマ油とＥＰＡ、ＤＨＡを含む精製魚油の両者を
粉末油脂とし、アトピー性皮膚炎患者に投与して改善効
果を観察している。 田上ら〔皮膚科紀要 Ｖｏｌ．９
１，ｐｐ１２９−１３７（１９９６）〕は、ＥＰＡ、Ｄ
ＨＡを含む魚油を乾癬患者に投与して改善効果を報告し
ている。杉本ら〔アレルギーの臨床Ｖｏｌ．６，ｐｐ２
１０−２１２（１９８６）〕は難治性喘息患者に魚油を
投与した改善例を報告している。以上の報告ではいずれ
もＡＬＡ、ＥＰＡ、ＤＨＡを１０−５０％程度含有する
油脂を投与した例である。

【０００５】また、高純度のＥＰＡエチルエステルを小
泉ら〔日皮会誌Ｖｏｌ．１０１，ｐｐ１７１３−１７１
６（１９９１）〕は、乾癬患者に、また、笹本ら〔日本
小児アレルギー学会誌Ｖｏｌ．３，ｐｐ１４０−１４
５，（１９８９）〕は、アトピー性皮膚炎患者にそれぞ
れ投与して改善効果を報告している。特開平２−３２０
１７号公報には、γ−リノレン酸とＤＨＡを併用して経
口投与した場合に、炎症性皮膚疾患に効果があることが
開示されている。特開平７−２６７８５６号公報には、
９５％以上の純度を持つＤＨＡのエチルエステル、リン
脂質、トリグリセリドが経口免疫抑制剤としての機能を
有し、アトピー性皮膚炎や膠原病などの自己免疫疾患の
治療に効果があることが開示されている。また、特開平
２−４５４２４号公報には、グリセリンの１−位にオレ
イン酸、２−位にＤＨＡを有する特定の構造をもつフォ
スファチジルコリンが抗アレルギー性に効果があること
が開示されている。

【０００６】また、ＡＬＡ、ＥＰＡ、ＤＨＡなどを軟膏
やクリーム、化粧料に配合して抗アレルギー性の効果を
示した報告も見られる。たとえば、特開平３−９００２
２号公報ではＥＰＡまたはそのエチルエステルが、特開
平５−２７９２４０号公報、特開平５−２７９２４１号
公報、特開平５−２８６８４５号公報、特開平６−６５
０５０号公報などには、ＤＨＡもしくはこれを含む油脂
とコラーゲン、オウゴン抽出物、センブリエキス、ヒア
ルロン酸などを配合した皮膚外用剤が、特開平６−４０
８８７号公報、特開平６−１３６３９３号公報にはＤＨ
Ａ及びその誘導体を配合した洗浄剤が、特開平８−１０
９１２８号公報にはＤＨＡ及びこの誘導体を配合した外
用剤が、特開平９−１４３０６７号公報には９５％以上
に精製したＤＨＡ及びその塩、エステルが、アトピー性
皮膚炎や乾癬などアレルギー性皮膚疾患に塗布された場
合に治療効果があることが開示されている。

【０００７】一方、生体中でサイトカインとして各種の
ものが知られるようになってきた。サイトカインには、
インターロイキン１〜１５（ＩＬ−１〜１５）、コロニ
ー刺激因子（ＴＮＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、
ケモカイン等が知られている。これらのサイトカインの
機能は多様性と重複性を有しており、これらの受容体サ
ブユニットの共有やシグナル伝達分子の共通性などが解
明されつつある。炎症反応においては、Ｔリンパ球やマ
クロファージを中心に各種のサイトカインが継時的に産
生され、インデューサー細胞相互間やエフェクター細胞
に対して活性化および抑制を行い、全体として炎症反応
の惹起、継続および収束を行っている。とりわけ、アレ
ルギー反応おいては、ＴＨ1、ＴＨ2の機能的に異なる細
胞群に亜分類されるヘルパーＴ細胞が相互に他を制御す
るサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０）を産生し、
ＴＨ1はマクロファージや細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）
などを活性化して体液性免疫反応を惹起する機序が提唱
されている｛（株）化学同人、松村 正ら編「分子細胞
生物学辞典」第８８３頁（１９９７年）｝。概略の関係
図を図１および図２に示した。

【０００８】しかしながら、前記の高度不飽和脂肪酸を
多く含有するα−リノレン酸を３５重量％以上を含有す
る油脂を経口で摂取した際のアレルギー反応を抑制する
機序については、殆ど知られていない。これまで、α−
リノレン酸を３５重量％以上を含有する油脂の特にＩＬ
−１β、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γのサイトカインに関する
抑制効果は知られていない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ほと
んど副作用を有しないα−リノレン酸を３５重量％以上
を含有する油脂を用いるインターロイキン−１β（ＩＬ
−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）またはイ
ンターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）であるサイトカイン
の抑制剤を提供することにある。またさらに、前記のサ
イトカインの抑制剤を用いる抗アレルギー性薬剤を提供
することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の問
題点に鑑み、薬剤を種々検討した結果、ほとんど副作用
を有しないα−リノレン酸を３５重量％以上を含有する
油脂を用いるとインターロイキン−１β（ＩＬ−１
β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）またはインタ
ーフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）であるサイトカインの抑
制剤として優れた効果を有することの知見を得て、本発
明を完成した。即ち、本発明は次の（１）および（２）
である。 （１）α−リノレン酸を３５重量％以上を含有する油脂
を用いることを特徴とするインターロイキン−１β（Ｉ
Ｌ−１β）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）または
インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）であるサイトカイ
ンの抑制剤。 （２）前記のサイトカインの抑制剤を有効成分とする抗
アレルギー性薬剤。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明において用いられるα−リ
ノレン酸を３５重量％以上を含有する油脂は、通常、シ
ソ科の植物の葉、茎、根等から抽出したものが挙げられ
る。特に、シソの実や、エゴマ、亜麻、アマニなどの種
子を絞って得ることができる。特にシソの実や、エゴマ
を圧搾や抽出したシソ油、エノ油（Ｐｅｒｉｌｌａ ｏ
ｉｌ）が好ましく使用できる。なお、表１中には、α−
リノレン酸は、炭素数１８；不飽和基３個の脂肪酸とし
て１８：３として示した。またさらに、α−リノレン酸
とグリセリンとからエステル化して得られる油脂、ある
いはα−リノレン酸エチルエステル、メチルエステルと
グリセリンとからエステル交換して得られる油脂も利用
できる。本発明に用いるα−リノレン酸を３５重量％以
上を含有する油脂は、得られたシソ油を精製分離して用
いてもよい。

【００１２】本発明で目的とするサイトカインとして
は、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インター
ロイキン−６（ＩＬ−６）またはインターフェロン−γ
（ＩＦＮ−γ）が挙げられる。インターロイキン−１の
ファミリーにはＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ
等がある。このうちのインターロイキン−１βが好まし
い対照として挙げられる。

【００１３】本発明で用いるしそ油は、圧搾や溶剤抽出
により通常グリセリンエステルの混合された状態で使用
されるが、その配合方法や配合比率については、特に必
要量が摂取できれば限定されない。通常、全体の摂取量
を少なくするためには、α−リノレン酸を３５重量％以
上を含有する油脂の含量が多いものが好ましく挙げられ
る。

【００１４】本発明の抗アレルギー性薬剤は、経口投与
することによって抗アレルギー作用を発現することがで
きる。用法としては、通常成人換算で、６００ｍｇ／日
〜１０ｇ／日である。より好ましくは、１ｇ／日〜５ｇ
／日である。

【００１５】抗アレルギー性薬剤として用いるα−リノ
レン酸を３５重量％以上を含有する油脂を経口投与する
際には、形状を、カプセル状、顆粒状、粉末状、錠剤、
糖衣錠剤等の固形状にしたり、あるいは乳化・分散の液
状として投与することができる。またさらに、経口投与
の方法の一例としては、パンや菓子、その他あらゆる食
品の素材として使用して投与することが可能である。ま
た、α−リノレン酸を３５重量％以上を含有する油脂を
用いて容易に乳化液を作成できるので、飲料などへの形
状で摂取することも容易である。以上のように健康食品
的な補助として、あるいはドリンク剤等として、全体量
として多量に摂取できる場合は、α−リノレン酸を３５
重量％以上を含有する油脂を希釈した含量が少ないもの
を使用してもよい。

【００１６】

【発明の効果】本発明のα−リノレン酸を３５重量％以
上を含有する油脂は、主成分がほとんど副作用を有しな
いものであり、副作用も殆どなく、また、優れたサイト
カインの発現を抑制する抑制剤として作用する。またこ
のサイトカイン抑制剤を用いる、抗アレルギー作用にも
優れた効果を発揮する。

【００１７】

【実施例】以下、具体例に基づいて、本発明を更に詳細
に説明する。次に分析方法、効果の評価方法について説
明する。 分析方法； 〔１〕脂肪酸の測定方法 約５００ｍｇの試料を冷却管を付けたエステル化用の５
０ｍｌ容共栓付きナス型フラスコに採り、１／２Ｎの水
酸化ナトリウム−メタノール溶液６ｍｌを添加する。油
滴が消失して均一な溶液になるまで約７分間水浴上で加
熱する。次に三フッ化ほう素−メタノール試薬７ｍｌを
添加して２分間沸騰後、冷却管頭頂部よりヘキサン５ｍ
ｌを加え、さらに１分間沸騰させる。加熱を止め、ヘキ
サン溶液がフラスコの首まで到達するまで精製水を加
え、ヘキサン溶液を採った。このヘキサン溶液に精製水
約１０ｍｌを加え、撹拌後静置し、分層する。水槽を除
去後、同じ操作を３回繰り返す。この洗浄操作の後にヘ
キサン溶液に硫酸ナトリウムを加えて脱水した後、硫酸
ナトリウムを濾別してガスクロマトグラフィー用の試料
とした。この試料をガスクロマトグラフィー（ヒューレ
ットパッカード社５８９０）にＤＢ−ＷＡＸキャピラリ
ーカラム（Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製カラム
で、厚さ０．２５μｍのポリエチレングリコールを固定
相液体とする。内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍ）を装着
し、注入口、検出器の各温度を２５０℃、２５０℃と
し、カラム温度は１４０℃から２１０℃まで５℃／分で
昇温した。検出は水素炎イオン化検出器を用い、キャリ
アガスはヘリウムガスとした。α−リノレン酸をはじ
め、各脂肪酸は、メチルエステル化したもののピーク面
積％をそれぞれの脂肪酸の重量％とした。

【００１８】〔２〕サイトカインの抑制効果測定方法； ２−１；動物試験方法：以下の方法によりモデル動物を
用いて本発明の評価を行った。 〔試験動物〕；４週齢のｄｄＹマウス（チャールスリバ
ー）を購入後、１週間の馴化飼育を行った。その後に、
実験開始時の体重のばらつきが各群で揃うように１群を
４匹とし、１ケージに１匹ずつ飼育した。 〔飼育方法〕；毎日５ｇ／匹となるようにエサを粉末給
餌器にて与え、食べ残しのエサは廃棄し、粉末給餌器は
洗浄し、毎日新しいエサを与え、不飽和脂肪酸の過酸化
の影響を極力避けるように心がけた。おおむね２回／週
の割合で体重測定を行い、床敷きの交換は週１回とし
た。 〔給餌試料〕；各群のマウスのエサは脂肪無添加の精製
飼料（日本クレア社）に紅花油１．２重量％を添加した
ものをベースとし、被験油脂として表１に示した各種原
料油脂を４．８重量％添加した。対照群には被験油脂の
代わりにコーン油を用い、１．２重量％を添加した。配
合組成を表２に示した。

【００１９】

【表１】

【００２０】注、α−リノレン酸を脂肪酸組成の１８：
３で示した。

【００２１】

【表２】

【００２２】なお、試料に混合使用したものはつぎのと
おり。 ［イ］コーン油；味の素株式会社製、市販品 ［ロ］シソ油（Perilla）；日本油脂（株）社製、シソ
油（Perilla）、 ［ハ］紅花油；味の素株式会社製、市販品

【００２３】２−２〔抗アレルギー性の試験方法〕；各
種の給餌試料を投与開始した後、第２３日にマウスの背
部を剃毛した。翌日に剃毛部に０．５％ジニトロフルオ
ロベンゼン（＝ＤＮＦＢ、アセトン；オリーブ油＝４：
１に溶かしたもの））１００μｌを塗布した（Inductio
n）。第２９日に各マウスの耳介厚をシックネスメータ
ーで測定した（０ｈとする）。測定後、０．２％ＤＮＦ
Ｂ（アセトン；オリーブ油＝４：１に溶かしたもの）を
耳介に２０μｌ塗布し（Challenge）、６時間後（６
ｈ）、２４時間後（２４ｈ）に耳介厚を０ｈと同様に測
定して０ｈとの耳介厚の差から各種の給餌試料の抗アレ
ルギー性を判定した。耳介浮腫を抑え、０ｈとの差が小
さいほど抗アレルギー性があるものとした。

【００２４】２−３〔ＰＣＲ法を用いたサイトカイン発
現の確認試験方法〕 それぞれの飼料投与したマウスよりＤＮＦＢを塗布した
耳介（challenge２４時間後）を採取し、それよりＲＮ
Ａを抽出した。このＲＮＡのうちｍＲＮＡを逆転写酵素
によりｃＤＮＡに合成し、さらに免疫に関するサイトカ
インのプライマーを添加しＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反
応）キットで増幅させて電気泳動によってそれぞれのｍ
ＲＮＡの発現を確認した。なお、耳介からのＲＮＡ抽出
は次の方法に従った。 ＜耳介からのｍＲＮＡ抽出方法＞耳介を切り取り、細か
く切断し、１ｍｌの４Ｍ−グアニジンチオシアネート緩
衝液（日本ジーン社製）に溶かし、ホモジナイズドして
５分間室温に放置した。その後、０．２ｍｌもクロロホ
ルムを添加し１５秒かき混ぜ、３分間静置した。１２，
０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。沈殿物に１ｍｌ
の７５％（Ｖ／Ｖ）エタノール水を加えて溶解し、再度
１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。液層をと
り、０．５ｍｌのイソプロパノールを加え、１０分間静
置後、１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。沈殿物をジ
エチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水に溶解し
て、ＲＮＡ試料とした。

【００２５】＜ＰＣＲによるＤＮＡの増殖方法＞ＲＴ−
ＰＣＲ（reverse transcriptase−polymerase chain
reaction）ｂｅａｄｓキット（アマシャムファルマシ
アバイオテック社製）のチューブに４０μｌのＤＥＰＣ
水を加え、前記で得られたＲＮＡ試料を２μｇ、５’−
プライマー、３’−プライマー、ｐｄ（Ｎ）6（ランダ
ムプライマー）をそれぞれ２μｌづつ添加して反応を行
った。反応は４２℃（３０分）、９５℃（５分）にした
後、９５℃（１分）、５５℃（１分）、７２℃（１分）
を３５回繰り返した。その後、７２℃で１０分間保温し
た後、４℃に冷却してＲＮＡの増幅反応を終了をした。
反応終了後、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、そ
れぞれのサイトカインの発現を確認した。なお、耳介の
試料としては、対照群（コントロール群＝紅花油＋コー
ン油）、シソ油（紅花油＋シソ油）投与、紅花油（紅花
油）群のマウスのものを用いた。また、サイトカインは
ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γの各３’−，５’−
のプライマーと内部コントロールとして、Ｇ３ＰＤＨ
（グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）
の３’−，５’−のプライマーを用いた。

【００２６】〔３〕耳介の組織染色標本の作成と評価方
法 各個体の耳介の凍結標本切片を作成し、ヘマトキシリン
−エオジン染色（ＨＥ染色）を行った。炎症部への炎症
性細胞の浸潤などを写真より評価して数値化して各群を
比較した。なお、写真は図６に対照群（ａ）とシソ油
（ｂ）のもののみを示した。写真判定の評価基準はつぎ
のとおりである。 １．炎症細胞の浸潤の程度 ２．浮腫の程度 ３．前記１．２．の評価判定は１点；Very slight、２
点；slight、３点；Mild、４点；Severe、５点；Very
Severeの評点として、各固体を評価した後、平均値で示
した。

【００２７】試験例１：抗アレルギー性作用試験 表２に示したように精製飼料に各々の油脂配合してマウ
スのエサとして与えて、前記の飼育条件で飼育した後、
前記の２−２〔抗アレルギー性の試験方法〕の通り処置
して耳介厚を測定した。６時間（即時型）および２４時
間後（遅延型）と処置前と耳介の差を測定し表３に示し
た。図３および４に抗アレルギー性作用として、前記の
６時間および２４時間後と処置前と耳介の差を測定した
結果を示した。その結果、６、２４時間いずれの場合も
シソ油群は対照群より有意に浮腫を抑制していた。

【００２８】

【表３】

【００２９】なお、表中数値は平均値±標準偏差で示
す。また、ａは対照群と比べて有意差（Ｐ＜０．０５）
ありを示す。

【００３０】試験例２；前記と同様に表２に示した飼料
をマウスのエサとして与えて、前記の飼育条件で飼育し
た後、前記の２−３〔ＰＣＲ法を用いたサイトカイン発
現の確認試験方法〕の通り処理し、ＩＬ−１β、ＩＬ−
６およびＩＦＮ−γのｍＲＭＡの発現量（相対値）を調
べた。その結果を図５のａ、ｂ、ｃに示した。ａはＩＬ
−１βの発現量の図、ｂはＩＬ−６の発現量の図、ｃは
ＩＦＮ−γの発現量の図である。

【００３１】試験例３：前記と同様に表２に示した飼料
をマウスのエサとして与えて、前記の飼育条件で飼育し
た後、前記の〔３〕耳介の組織染色標本の作成と評価方
法の通り処理し、耳介の組織切片の写真を図６に示し
た。なお、結果を数値化したものを表４に示した。

【００３２】

【表４】

【００３３】以上の結果から、本発明のα−リノレン酸
を３５重量％以上を含有する油脂がサイトカイン（ＩＬ
−１β、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ）の抑制効果があり、そ
れらのｍＲＮＡの量が少ないことがわかる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は炎症作用に関与するサイトカインネット
ワークの図である。

【図２】図２はアレルギー反応に関与するサイトカイン
ネットワークの図である。

【図３】図３は各飼料を与えて生育した後、ＤＮＦＢ塗
布後６時間した時の抗アレルギー性試験の図である。

【図４】図４は各飼料を与えて生育した後、ＤＮＦＢ塗
布後２４時間した時の抗アレルギー性試験の図である。

【図５】図５ａ、５ｂ、５ｃは各飼料を与えて生育した
後、ＤＮＦＢ塗布後２４時間した時耳介より抽出し、増
幅したｍＲＮＡの相対比較試験の図である。図５ａはＩ
Ｌ−１βｍＲＮＡの図である。

【図６】図５ｂはＩＬ−６ｍＲＮＡの図である。

【図７】図５ｃはＩＦＮ−γｍＲＮＡの図である。

【図８】図６は耳介の組織染色標本の写真である。６ａ
は対照群、６ｂはシソ油（Ｐｅｒｉｌｌａ）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4C206 AA01 AA02 DA05 MA01 MA04 NA14 ZB08 ZB13

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】α−リノレン酸を３５重量％以上を含有す
   る油脂を用いることを特徴とするインターロイキン−１
   β、インターロイキン−６またはインターフェロン−γ
   であるサイトカインの抑制剤。
2. 【請求項２】請求項１記載のサイトカインの抑制剤を有
   効成分とする抗アレルギー性薬剤。