JP2000157296A - ピログルタミン酸量の測定方法 - Google Patents
ピログルタミン酸量の測定方法Info
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- JP2000157296A JP2000157296A JP10331183A JP33118398A JP2000157296A JP 2000157296 A JP2000157296 A JP 2000157296A JP 10331183 A JP10331183 A JP 10331183A JP 33118398 A JP33118398 A JP 33118398A JP 2000157296 A JP2000157296 A JP 2000157296A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ピログルタミン酸を含有する蛋白質また
はペプチドに、ピロコッカス属に属する微生物由来のピ
ログルタミン酸アミノペプチダーゼを作用させ、遊離す
るピログルタミン酸量を測定することを特徴とする、ピ
ログルタミン酸の測定方法。 【効果】 本発明の測定方法により、比較的広い範囲の
分子量を有するピログルタミン酸含有蛋白質またはペプ
チド中のピログルタミン酸量を簡便にかつ短時間で測定
することができる。
はペプチドに、ピロコッカス属に属する微生物由来のピ
ログルタミン酸アミノペプチダーゼを作用させ、遊離す
るピログルタミン酸量を測定することを特徴とする、ピ
ログルタミン酸の測定方法。 【効果】 本発明の測定方法により、比較的広い範囲の
分子量を有するピログルタミン酸含有蛋白質またはペプ
チド中のピログルタミン酸量を簡便にかつ短時間で測定
することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛋白質またはペプ
チド中のピログルタミン酸量を測定する方法に関する。
チド中のピログルタミン酸量を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】蛋白質のアミノ酸組成を調べる方法とし
ては、例えば種々の特異的ペプチダーゼを用いた加水分
解処理や、特定の部位を切断する化学試薬による切断に
よってアミノ酸を分解し、生じたアミノ酸を高速液体ク
ロマトグラフィー(以下、「ＨＰＬＣ」という)にて分析す
るのが一般的である。例えば、Association of Officia
l Agricultural Chemists (AOAC)の定める方法（"Offic
ial Methods of Analysis of AOAC International", AO
AC INternational, MA, USA）は、過ギ酸によりシスチ
ン、メチオニンをそれぞれシステイン、メチオニンスル
ホン酸とした後、塩酸で加水分解を行い、生じた遊離ア
ミノ酸をアミノ酸分析計にて分析することによりアミノ
酸の組成を調べる方法として一般的に用いられている。
ところが、こうした従来の加水分解による方法では、蛋
白質またはペプチドのＮ末端に存在するグルタミン（Gl
n）、グルタミン酸（Glu）、ピログルタミン酸（pGlu）
は全てGlu として遊離し、分析されるので、これら３種
のアミノ酸を個々に分析することはできない。
ては、例えば種々の特異的ペプチダーゼを用いた加水分
解処理や、特定の部位を切断する化学試薬による切断に
よってアミノ酸を分解し、生じたアミノ酸を高速液体ク
ロマトグラフィー(以下、「ＨＰＬＣ」という)にて分析す
るのが一般的である。例えば、Association of Officia
l Agricultural Chemists (AOAC)の定める方法（"Offic
ial Methods of Analysis of AOAC International", AO
AC INternational, MA, USA）は、過ギ酸によりシスチ
ン、メチオニンをそれぞれシステイン、メチオニンスル
ホン酸とした後、塩酸で加水分解を行い、生じた遊離ア
ミノ酸をアミノ酸分析計にて分析することによりアミノ
酸の組成を調べる方法として一般的に用いられている。
ところが、こうした従来の加水分解による方法では、蛋
白質またはペプチドのＮ末端に存在するグルタミン（Gl
n）、グルタミン酸（Glu）、ピログルタミン酸（pGlu）
は全てGlu として遊離し、分析されるので、これら３種
のアミノ酸を個々に分析することはできない。
【０００３】上記のアミノ酸のうち、Glnは、Gluと同様
に非必須アミノ酸に分類され、上記のように加水分解法
では両者いっしょに分析されていたが、その後の生理学
的な研究の進歩の結果、Glnは条件的(conditionally)必
須アミノ酸であることが明らかとなった。そこで、蛋白
質やペプチド中のGln については、温和な酸性条件下で
処理することにより生じたアンモニアを滴定してその変
化によりGln量を推定する方法、加水分解前にビス(1,1-
トリフルオロアセトキシ)ヨードベンゼンにて処理し、G
ln、Asnをそれぞれ安定な誘導体であるジアミノ酪酸、
ジアミノプロピオン酸に変換して測定する方法(Kuhn,K.
S.ら、J.Agric.Food.Chem., 44,1808-1811 (1996))な
ど、GlnのみをGluやpGluと区別して分析する方法が確立
されている。
に非必須アミノ酸に分類され、上記のように加水分解法
では両者いっしょに分析されていたが、その後の生理学
的な研究の進歩の結果、Glnは条件的(conditionally)必
須アミノ酸であることが明らかとなった。そこで、蛋白
質やペプチド中のGln については、温和な酸性条件下で
処理することにより生じたアンモニアを滴定してその変
化によりGln量を推定する方法、加水分解前にビス(1,1-
トリフルオロアセトキシ)ヨードベンゼンにて処理し、G
ln、Asnをそれぞれ安定な誘導体であるジアミノ酪酸、
ジアミノプロピオン酸に変換して測定する方法(Kuhn,K.
S.ら、J.Agric.Food.Chem., 44,1808-1811 (1996))な
ど、GlnのみをGluやpGluと区別して分析する方法が確立
されている。
【０００４】一方、pGluは蛋白質またはペプチドのＮ末
端がGln またはGluであった場合に、そのGlnまたはGlu
中のα−アミノ基とγ−アミド基（あるいはカルボキシ
ル基）とが縮合・環化して生じる分子内ラクタムであ
る。pGluを含有する蛋白質またはペプチドとして甲状腺
刺激ホルモン放出ホルモン(TSH releasing hormone：TR
H)やガストリン等のホルモンが知られているが、その量
は天然の蛋白質中では非常に小さく、組成としては無視
できる程度である。ところが最近になって、食品原料と
して工業的に調製されたペプチド中には比較的多量のpG
luが含有されることが明らかとなってきた (Sato, K. e
t al, J. Agric. Food. Chem, 46,3403-3405(1998))。
しかしながら、pGluについては、pGluのみをGlnやGluと
区別して分析する方法がなく、その栄養学的な価値は未
だ確定していないのが現状である。一方、このpGluに関
する酵素としては、ピログルタミン酸アミノペプチダー
ゼ(以下、「pGlu−アミノペプチダーゼ」という)が知ら
れている。
端がGln またはGluであった場合に、そのGlnまたはGlu
中のα−アミノ基とγ−アミド基（あるいはカルボキシ
ル基）とが縮合・環化して生じる分子内ラクタムであ
る。pGluを含有する蛋白質またはペプチドとして甲状腺
刺激ホルモン放出ホルモン(TSH releasing hormone：TR
H)やガストリン等のホルモンが知られているが、その量
は天然の蛋白質中では非常に小さく、組成としては無視
できる程度である。ところが最近になって、食品原料と
して工業的に調製されたペプチド中には比較的多量のpG
luが含有されることが明らかとなってきた (Sato, K. e
t al, J. Agric. Food. Chem, 46,3403-3405(1998))。
しかしながら、pGluについては、pGluのみをGlnやGluと
区別して分析する方法がなく、その栄養学的な価値は未
だ確定していないのが現状である。一方、このpGluに関
する酵素としては、ピログルタミン酸アミノペプチダー
ゼ(以下、「pGlu−アミノペプチダーゼ」という)が知ら
れている。
【０００５】pGlu−アミノペプチダーゼは動植物界に普
遍的に存在する酵素であり、動物由来、微生物由来のも
のが工業的規模で製造され販売されている。微生物の中
には生産した該酵素を培地中に分泌するものがあり、例
えば、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosu
s)、バシラス・アミロリクファシエンス(Bacillus amyl
oliquefaciens) 、シュードモナス・フローレスンス(Ps
eudomonas fluorescens)、バシラス・ズブチリス(Bacil
lus subtilis)、クレブシエラ・クロアカエ(Klebsiella
cloacae)、ストレプトコッカス・ファエキウム(Strpto
coccus faecium)等が知られている。中でもピロコッカ
ス・フリオサス、バシラス・アミロリクファシエンス由
来のpGlu−アミノペプチダーゼは動物由来の該酵素より
も空気酸化、凍結乾燥、重金属等の障害に対する安定性
に優れていることが知られている。しかしながら、この
pGlu−アミノペプチダーゼを蛋白質またはペプチド中の
pGlu量を測定する方法に用いることについては何ら検討
されていない。
遍的に存在する酵素であり、動物由来、微生物由来のも
のが工業的規模で製造され販売されている。微生物の中
には生産した該酵素を培地中に分泌するものがあり、例
えば、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosu
s)、バシラス・アミロリクファシエンス(Bacillus amyl
oliquefaciens) 、シュードモナス・フローレスンス(Ps
eudomonas fluorescens)、バシラス・ズブチリス(Bacil
lus subtilis)、クレブシエラ・クロアカエ(Klebsiella
cloacae)、ストレプトコッカス・ファエキウム(Strpto
coccus faecium)等が知られている。中でもピロコッカ
ス・フリオサス、バシラス・アミロリクファシエンス由
来のpGlu−アミノペプチダーゼは動物由来の該酵素より
も空気酸化、凍結乾燥、重金属等の障害に対する安定性
に優れていることが知られている。しかしながら、この
pGlu−アミノペプチダーゼを蛋白質またはペプチド中の
pGlu量を測定する方法に用いることについては何ら検討
されていない。
【０００６】従って、pGluの栄養学的な価値をはじめと
する諸機能を解明する上で、蛋白質またはペプチド中の
pGlu 量のみをGluやGlnと区別して簡便に測定する方法
が望まれるところである。
する諸機能を解明する上で、蛋白質またはペプチド中の
pGlu 量のみをGluやGlnと区別して簡便に測定する方法
が望まれるところである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、蛋白質またはペプチド中のpGlu量を測定する方法を
提供することである。
は、蛋白質またはペプチド中のpGlu量を測定する方法を
提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、ピロコッカス
属に属する微生物由来のpGlu−アミノペプチダーゼが広
い分子量範囲の蛋白質またはペプチドに対して安定した
活性を示すことに着目し、これを利用して高分子量で複
雑な組成を持った蛋白質またはペプチド中のＮ末端に存
在するpGluの量のみを簡便に測定する方法を開発するに
至った。すなわち、本発明は、pGluを含有する蛋白質ま
たはペプチドに、ピロコッカス属に属する微生物由来の
pGlu−アミノペプチダーゼを作用させ、遊離するpGlu量
を測定することを特徴とする、ピログルタミン酸量の測
定方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
に鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、ピロコッカス
属に属する微生物由来のpGlu−アミノペプチダーゼが広
い分子量範囲の蛋白質またはペプチドに対して安定した
活性を示すことに着目し、これを利用して高分子量で複
雑な組成を持った蛋白質またはペプチド中のＮ末端に存
在するpGluの量のみを簡便に測定する方法を開発するに
至った。すなわち、本発明は、pGluを含有する蛋白質ま
たはペプチドに、ピロコッカス属に属する微生物由来の
pGlu−アミノペプチダーゼを作用させ、遊離するpGlu量
を測定することを特徴とする、ピログルタミン酸量の測
定方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の測定対象であるpGluを含
有をする蛋白質またはペプチド（pGlu含有試料）として
は、そのN末端にpGluを有し、かつその分子量が5,000以
下である蛋白質またはペプチドであればいかなるもので
もよく、例えば、ボンベシン、ガストリン、黄体形成ホ
ルモン放出ホルモン(LH−RH)、甲状腺刺激ホルモン放出
ホルモン(TRH)等のホルモンペプチドの他、食品、飼
料、医薬品等に使用される蛋白質またはペプチドでもよ
い。
有をする蛋白質またはペプチド（pGlu含有試料）として
は、そのN末端にpGluを有し、かつその分子量が5,000以
下である蛋白質またはペプチドであればいかなるもので
もよく、例えば、ボンベシン、ガストリン、黄体形成ホ
ルモン放出ホルモン(LH−RH)、甲状腺刺激ホルモン放出
ホルモン(TRH)等のホルモンペプチドの他、食品、飼
料、医薬品等に使用される蛋白質またはペプチドでもよ
い。
【００１０】本発明において、上記pGlu含有試料に作用
させるpGlu−アミノペプチダーゼは、ピロコッカス属に
属する微生物由来のものであれば限定されないが、特に
ピロコッカス・フリオサス由来のpGlu−アミノペプチダ
ーゼを使用することが好ましい。ピロコッカス・フリオ
サス由来のpGluアミノペプチダーゼは、具体的には、商
品名「Pfu ピログルタメートアミノペプチダーゼ(Code.
7334)」(寶酒造製）等の市販品を用いることができる。
させるpGlu−アミノペプチダーゼは、ピロコッカス属に
属する微生物由来のものであれば限定されないが、特に
ピロコッカス・フリオサス由来のpGlu−アミノペプチダ
ーゼを使用することが好ましい。ピロコッカス・フリオ
サス由来のpGluアミノペプチダーゼは、具体的には、商
品名「Pfu ピログルタメートアミノペプチダーゼ(Code.
7334)」(寶酒造製）等の市販品を用いることができる。
【００１１】また、pGlu含有試料に作用させるpGlu−ア
ミノペプチダーゼの量は、該試料中に含まれるpGlu含有
量、酵素反応条件等により適宜選択されるが、例えば通
常は、pGluアミノペプチダーゼを最終濃度 0.5〜50 mＵ
／mlとなるように添加する。以下に、本発明の、pGlu−
アミノペプチダーゼを用いて蛋白質またはペプチド中の
pGlu量を測定する好適な方法を具体的に説明する。
ミノペプチダーゼの量は、該試料中に含まれるpGlu含有
量、酵素反応条件等により適宜選択されるが、例えば通
常は、pGluアミノペプチダーゼを最終濃度 0.5〜50 mＵ
／mlとなるように添加する。以下に、本発明の、pGlu−
アミノペプチダーゼを用いて蛋白質またはペプチド中の
pGlu量を測定する好適な方法を具体的に説明する。
【００１２】基質となる蛋白質またはペプチドの溶液と
水、及び緩衝液を混合し、これを500μl容のPCRチュー
ブに入れ、pGlu−アミノペプチダーゼを 0.5〜50 mＵ／
ml、好ましくは1.0〜10 mＵ／mlとなるように添加した
後、直ちにサーマルサイクラーを用いてpH 5.0〜9.0、3
5〜75℃で 10〜240分間酵素反応させる。反応終了後PCR
チューブを氷上にて10℃まで冷却し、該チューブに1.5
％の5-スルホサリチル酸を加えよく混和して蛋白質を凝
固させ、0.22μmのメンブランフィルターで凝固した蛋
白質をろ過することにより除蛋白操作を行なう。これに
より得られるろ液(サンプル液)中のpGlu量をＨＰＬＣに
より分析する。この時、該ろ液(サンプル液)は測定直前
まで−80℃で凍結保存しておく。
水、及び緩衝液を混合し、これを500μl容のPCRチュー
ブに入れ、pGlu−アミノペプチダーゼを 0.5〜50 mＵ／
ml、好ましくは1.0〜10 mＵ／mlとなるように添加した
後、直ちにサーマルサイクラーを用いてpH 5.0〜9.0、3
5〜75℃で 10〜240分間酵素反応させる。反応終了後PCR
チューブを氷上にて10℃まで冷却し、該チューブに1.5
％の5-スルホサリチル酸を加えよく混和して蛋白質を凝
固させ、0.22μmのメンブランフィルターで凝固した蛋
白質をろ過することにより除蛋白操作を行なう。これに
より得られるろ液(サンプル液)中のpGlu量をＨＰＬＣに
より分析する。この時、該ろ液(サンプル液)は測定直前
まで−80℃で凍結保存しておく。
【００１３】本発明の方法において遊離pGlu量を分析す
るためのＨＰＬＣは、通常の同一の移動相を用いるＨＰ
ＬＣ(以下、単に「通常のＨＰＬＣ」という)でもよい
が、不要な成分の溶出時間を省いて1サンプルあたりの
分析時間を短縮する観点から、以下に説明する改良ＨＰ
ＬＣで行なうことが好ましい。本発明において改良ＨＰ
ＬＣとは、カラムスイッチ法を応用した方法で、インジ
ェクターより導入された試料を予備カラムにて分離し、
予備カラムの下流に設置されたスイッチにより流路を変
更することによりpGluを含むフラクションのみを分析カ
ラムに導入して精密に分離するという方法をいう。
るためのＨＰＬＣは、通常の同一の移動相を用いるＨＰ
ＬＣ(以下、単に「通常のＨＰＬＣ」という)でもよい
が、不要な成分の溶出時間を省いて1サンプルあたりの
分析時間を短縮する観点から、以下に説明する改良ＨＰ
ＬＣで行なうことが好ましい。本発明において改良ＨＰ
ＬＣとは、カラムスイッチ法を応用した方法で、インジ
ェクターより導入された試料を予備カラムにて分離し、
予備カラムの下流に設置されたスイッチにより流路を変
更することによりpGluを含むフラクションのみを分析カ
ラムに導入して精密に分離するという方法をいう。
【００１４】
【実施例】以下、参考例、実施例及び比較例により本発
明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ
れるものではない。 〔参考例１〕 (Glu、GlnからpGluへの変換)酵素反応に
使用する緩衝液中でのGlu、GlnのpGluへの変換率を調べ
た。緩衝液は10mM 2-メルカプトエタノール、5mM EDTA
／50mM Tris・HCl［(pH7.5；トリズマ塩基（トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン；シグマ社製）121.1gを
純水に溶解し、塩酸を用いてpHを7.5に調製した後、純
水を加えて全量を1リットルとしたもの)］の水溶液と
し、この10倍濃度のもの（以下、「10×緩衝液」とい
う）を調製して使用した。
明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ
れるものではない。 〔参考例１〕 (Glu、GlnからpGluへの変換)酵素反応に
使用する緩衝液中でのGlu、GlnのpGluへの変換率を調べ
た。緩衝液は10mM 2-メルカプトエタノール、5mM EDTA
／50mM Tris・HCl［(pH7.5；トリズマ塩基（トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン；シグマ社製）121.1gを
純水に溶解し、塩酸を用いてpHを7.5に調製した後、純
水を加えて全量を1リットルとしたもの)］の水溶液と
し、この10倍濃度のもの（以下、「10×緩衝液」とい
う）を調製して使用した。
【００１５】500μl容PCRチューブに10×緩衝液 25μ
l、水 100μl、100 mMのGln（シグマ社製）またはGlu
(関東化学製) 125μlを入れ、表１に示す反応条件下で
各々処理した後、溶液中のpGlu量を下記の通常のＨＰＬ
Ｃの測定条件にて測定し、理論値に対する変換率を求め
た。結果を表１および図１に示す。
l、水 100μl、100 mMのGln（シグマ社製）またはGlu
(関東化学製) 125μlを入れ、表１に示す反応条件下で
各々処理した後、溶液中のpGlu量を下記の通常のＨＰＬ
Ｃの測定条件にて測定し、理論値に対する変換率を求め
た。結果を表１および図１に示す。
【００１６】通常のＨＰＬＣの測定条件 分析カラム： Shodex Rspack C-811 溶出液： 3 mM HClO4 流量： 1 ml／分 検出波長： 220 nm
【００１７】
【表１】
【００１８】図１より、Glnは温度・時間依存的に水溶
液中で閉環し、pGluへ変換されることがわかる。また表
１より、121℃、30分処理した場合には、Gln、GluのpGl
uへの変換率はそれぞれ93.8％、1.2％であることがわか
る。
液中で閉環し、pGluへ変換されることがわかる。また表
１より、121℃、30分処理した場合には、Gln、GluのpGl
uへの変換率はそれぞれ93.8％、1.2％であることがわか
る。
【００１９】〔実施例１〕（ピロコッカス・フリオサス
由来のpGlu−アミノペプチダーゼを用いたpGlu量の測
定） （１）酵素反応 緩衝液は参考例１と同様のものを使用した。基質となる
ペプチドはヒトLH-RH（分子量1182.3；0.805 nmole/ m
l）(シグマ社製)またはボンベシン（分子量 1619.9；
0.576 nmole/ ml）(シグマ社製)を用い、酵素はピロコ
ッカス・フリオサス由来のpGlu−アミノペプチダーゼ
（商品名「Pfu ピログルタメートアミノペプチダーゼ(C
ode.7334)」；寶酒造製）0.5 mUを用いた。
由来のpGlu−アミノペプチダーゼを用いたpGlu量の測
定） （１）酵素反応 緩衝液は参考例１と同様のものを使用した。基質となる
ペプチドはヒトLH-RH（分子量1182.3；0.805 nmole/ m
l）(シグマ社製)またはボンベシン（分子量 1619.9；
0.576 nmole/ ml）(シグマ社製)を用い、酵素はピロコ
ッカス・フリオサス由来のpGlu−アミノペプチダーゼ
（商品名「Pfu ピログルタメートアミノペプチダーゼ(C
ode.7334)」；寶酒造製）0.5 mUを用いた。
【００２０】500 μl容のPCRチューブに各溶液(10×緩
衝液 10 μl、水 30 μl、基質溶液50 μl：計 90 μl)
を入れ、Pfu pGlu−アミノペプチダーゼ 10 μlを添加
後直ちにサーマルサイクラーを用いて、50℃で30, 60,
90, 120分間反応させた。反応終了後PCRチューブを氷上
にて5分間冷却し、10μlの1.5% 5-スルホサリチル酸を
加え20分間よく混和して蛋白質を凝固させ、これを0.22
μmのメンブランフィルターで濾過することにより除蛋
白操作を行った。
衝液 10 μl、水 30 μl、基質溶液50 μl：計 90 μl)
を入れ、Pfu pGlu−アミノペプチダーゼ 10 μlを添加
後直ちにサーマルサイクラーを用いて、50℃で30, 60,
90, 120分間反応させた。反応終了後PCRチューブを氷上
にて5分間冷却し、10μlの1.5% 5-スルホサリチル酸を
加え20分間よく混和して蛋白質を凝固させ、これを0.22
μmのメンブランフィルターで濾過することにより除蛋
白操作を行った。
【００２１】(２)改良ＨＰＬＣによる測定 （１）で得られたろ過液(以後、サンプル液という)を測
定直前まで-80℃で凍結して保存した後、分析カラムの
前に予備カラム(分析カラムと同じ充填剤を充填した予
備カラム)２本を直列に繋ぎ、更に予備カラムと分析カ
ラムの間にインジェクターを設けた改良ＨＰＬＣ（図
２）に供した。サンプルを注入後、必要なピーク（pGl
u）が予備カラムから溶出する3.0〜4.5分までの溶出液
を、インジェクターにより流路をスイッチし、分析カラ
ムへ送った。下記に示す改良ＨＰＬＣの測定条件にてサ
ンプル中のpGlu量を測定し、理論値に対する回収率を求
めた。
定直前まで-80℃で凍結して保存した後、分析カラムの
前に予備カラム(分析カラムと同じ充填剤を充填した予
備カラム)２本を直列に繋ぎ、更に予備カラムと分析カ
ラムの間にインジェクターを設けた改良ＨＰＬＣ（図
２）に供した。サンプルを注入後、必要なピーク（pGl
u）が予備カラムから溶出する3.0〜4.5分までの溶出液
を、インジェクターにより流路をスイッチし、分析カラ
ムへ送った。下記に示す改良ＨＰＬＣの測定条件にてサ
ンプル中のpGlu量を測定し、理論値に対する回収率を求
めた。
【００２２】改良ＨＰＬＣの測定条件 予備カラム： Shodex Rspack KC-LG（昭和電工）×２本 分析カラム： Shodex Rspack C-811（昭和電工） 流路スイッチ：インジェクター（Rheodyne社） 溶出液： 3 mM HClO4 流量：ポンプ１、ポンプ２とも1 ml/mim 検出波長： 220 nm
【００２３】（３）バシラス・アミロリクファシエンス
由来のpGlu−アミノペプチダーゼを用いたpGlu量の測定 酵素としてバシラス・アミロリクファシエンス由来のpG
lu−アミノペプチダーゼ（商品名「ピログルタメートア
ミノペプチダーゼ」；シグマ社製）10Ｕを用いる以外は
上記（１）に従って酵素反応を行った後、上記（２）と
同様に改良ＨＰＬＣにてペプチド中のpGlu量を測定し、
その回収率を算出した。以上の結果をあわせて表２及び
図３に示す。
由来のpGlu−アミノペプチダーゼを用いたpGlu量の測定 酵素としてバシラス・アミロリクファシエンス由来のpG
lu−アミノペプチダーゼ（商品名「ピログルタメートア
ミノペプチダーゼ」；シグマ社製）10Ｕを用いる以外は
上記（１）に従って酵素反応を行った後、上記（２）と
同様に改良ＨＰＬＣにてペプチド中のpGlu量を測定し、
その回収率を算出した。以上の結果をあわせて表２及び
図３に示す。
【００２４】
【表２】
【００２５】表２及び図３に示されるように、ピロコッ
カス・フリオサス由来のpGlu−アミノペプチダーゼを用
いた場合は、反応時間が60分以上の場合では、LH-RH、
ボンベシンのどちらを基質にした場合でも回収率が85%
以上であった。更にボンベシンについては、60分以降に
pGluが更に上昇し120分では回収率は125％であった。こ
れは、ボンベシンの場合、そのＮ末端のアミノ酸配列が
「pGlu-Gln-.....」であるため、酵素によってpGluを切
り出した後に新たにGlnがＮ末に生じてしまい、それがp
Gluに変化して更に酵素によって切り出されているため
と考えられる。
カス・フリオサス由来のpGlu−アミノペプチダーゼを用
いた場合は、反応時間が60分以上の場合では、LH-RH、
ボンベシンのどちらを基質にした場合でも回収率が85%
以上であった。更にボンベシンについては、60分以降に
pGluが更に上昇し120分では回収率は125％であった。こ
れは、ボンベシンの場合、そのＮ末端のアミノ酸配列が
「pGlu-Gln-.....」であるため、酵素によってpGluを切
り出した後に新たにGlnがＮ末に生じてしまい、それがp
Gluに変化して更に酵素によって切り出されているため
と考えられる。
【００２６】以上の結果から、回収率が85%以上という
高率が達成され、更にＮ末端から２番目のアミノ酸がGl
nであってもその影響を受けないということから、ピロ
コッカス・フリオサス由来の pGlu−アミノペプチダー
ゼを用いるpGlu量測定方法において充分な結果の得られ
る反応時間は60分であることがわかる。また、図３よ
り、バシラス・アミロリクファシエンス由来のpGlu−ア
ミノペプチダーゼを用いた場合は、60分間反応させた時
点では、LH-RHの場合には回収率64.0%のpGluを切り出す
ものの、ボンベシンの場合には回収率は22.2%しかなか
った。また、反応時間を120分とした場合でも、LH-RH、
ボンベシンの回収率はそれぞれ78.4%、35.2%であった。
高率が達成され、更にＮ末端から２番目のアミノ酸がGl
nであってもその影響を受けないということから、ピロ
コッカス・フリオサス由来の pGlu−アミノペプチダー
ゼを用いるpGlu量測定方法において充分な結果の得られ
る反応時間は60分であることがわかる。また、図３よ
り、バシラス・アミロリクファシエンス由来のpGlu−ア
ミノペプチダーゼを用いた場合は、60分間反応させた時
点では、LH-RHの場合には回収率64.0%のpGluを切り出す
ものの、ボンベシンの場合には回収率は22.2%しかなか
った。また、反応時間を120分とした場合でも、LH-RH、
ボンベシンの回収率はそれぞれ78.4%、35.2%であった。
【００２７】このことから、バシラス・アミロリクファ
シエンス由来のpGlu−アミノペプチダーゼの反応性は、
基質となるペプチドの分子量によって大きく異なること
が明らかとなった。よってピロコッカス・フリオサス由
来のpGlu−アミノペプチダーゼを使用することが好まし
いことがわかる。 〔実施例２〕（ピロコッカス・フリオサス由来の pGlu
−アミノペプチダーゼの作用特性） 基質として以下の
表３に示す６種のペプチド溶液を用いる以外は実施例1
と同様の操作を行ない、種々の分子量を有する各ペプチ
ドからのpGlu量を測定して、理論値に対する回収率(％)
を算出した。結果を表４に示す。
シエンス由来のpGlu−アミノペプチダーゼの反応性は、
基質となるペプチドの分子量によって大きく異なること
が明らかとなった。よってピロコッカス・フリオサス由
来のpGlu−アミノペプチダーゼを使用することが好まし
いことがわかる。 〔実施例２〕（ピロコッカス・フリオサス由来の pGlu
−アミノペプチダーゼの作用特性） 基質として以下の
表３に示す６種のペプチド溶液を用いる以外は実施例1
と同様の操作を行ない、種々の分子量を有する各ペプチ
ドからのpGlu量を測定して、理論値に対する回収率(％)
を算出した。結果を表４に示す。
【００２８】
【表３】
【００２９】
【表４】
【００３０】この結果から、ピロコッカス・フリオサス
由来の pGlu−アミノペプチダーゼの作用により、いず
れの基質の場合でも回収率が85%以上であることが明ら
かである。 〔参考例２〕（改良ＨＰＬＣと通常のＨＰＬＣによる測
定結果の比較） 予めピロコッカス・フリオサス由来のpGlu−アミノペプ
チダーゼにより遊離させたpGluを含むモデルサンプル液
(10×緩衝液 10μl、水30μl、10 mM pGlu 50μl、1.5
％ 5−アミノサリチル酸 10μl；計110μl)を用いる以
外は実施例１と同様に改良ＨＰＬＣにてサンプル中のpG
lu測定を行った。遊離pGluのチャートを図４に示す。
由来の pGlu−アミノペプチダーゼの作用により、いず
れの基質の場合でも回収率が85%以上であることが明ら
かである。 〔参考例２〕（改良ＨＰＬＣと通常のＨＰＬＣによる測
定結果の比較） 予めピロコッカス・フリオサス由来のpGlu−アミノペプ
チダーゼにより遊離させたpGluを含むモデルサンプル液
(10×緩衝液 10μl、水30μl、10 mM pGlu 50μl、1.5
％ 5−アミノサリチル酸 10μl；計110μl)を用いる以
外は実施例１と同様に改良ＨＰＬＣにてサンプル中のpG
lu測定を行った。遊離pGluのチャートを図４に示す。
【００３１】図４より、pGluは保持時間約21.5分のピー
クとして観測され、１サンプルの分析時間は26分で充分
であることがわかった。比較として、通常のＨＰＬＣ測
定条件（参考例１に記載）にて上記のモデルサンプル液
の測定を行った場合の遊離pGluのチャートを図５に示
す。図５より、pGluは保持時間約18.6分のピークとして
観測されるが、その後105分まで無関係のピークが出現
し続け、１サンプルの分析には120分を要することがわ
かった。
クとして観測され、１サンプルの分析時間は26分で充分
であることがわかった。比較として、通常のＨＰＬＣ測
定条件（参考例１に記載）にて上記のモデルサンプル液
の測定を行った場合の遊離pGluのチャートを図５に示
す。図５より、pGluは保持時間約18.6分のピークとして
観測されるが、その後105分まで無関係のピークが出現
し続け、１サンプルの分析には120分を要することがわ
かった。
【００３２】
【発明の効果】本発明の測定方法により、比較的広い範
囲の分子量を有するpGlu含有蛋白質またはペプチド中の
pGlu量を簡便にかつ短時間で測定することができる。
囲の分子量を有するpGlu含有蛋白質またはペプチド中の
pGlu量を簡便にかつ短時間で測定することができる。
【図１】Gln、GluからpGluへの変換率の経時変化を示
す。
す。
【図２】改良ＨＰＬＣの概略図を示す。
【図３】２種の酵素(ピロコッカス・フリオサス由来のp
Glu−アミノペプチダーゼおよびバシラス・アミロリク
ファシエンス由来のpGlu−アミノペプチダーゼ)を用い
た場合のペプチドからのpGlu回収率を示す。
Glu−アミノペプチダーゼおよびバシラス・アミロリク
ファシエンス由来のpGlu−アミノペプチダーゼ)を用い
た場合のペプチドからのpGlu回収率を示す。
【図４】改良ＨＰＬＣによる遊離pGluのチャートを示
す。
す。
【図５】通常のＨＰＬＣによる遊離pGluのチャートを示
す。
す。
Claims (2)
- 【請求項１】 ピログルタミン酸を含有する蛋白質また
はペプチドに、ピロコッカス属に属する微生物由来のピ
ログルタミン酸アミノペプチダーゼを作用させ、遊離す
るピログルタミン酸量を測定することを特徴とする、ピ
ログルタミン酸量の測定方法。 - 【請求項２】 ピロコッカス属に属する微生物が耐熱性
細菌ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)
である、請求項１に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33118398A JP4163796B2 (ja) | 1998-11-20 | 1998-11-20 | ピログルタミン酸量の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33118398A JP4163796B2 (ja) | 1998-11-20 | 1998-11-20 | ピログルタミン酸量の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000157296A true JP2000157296A (ja) | 2000-06-13 |
| JP4163796B2 JP4163796B2 (ja) | 2008-10-08 |
Family
ID=18240827
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33118398A Expired - Fee Related JP4163796B2 (ja) | 1998-11-20 | 1998-11-20 | ピログルタミン酸量の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4163796B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110563718A (zh) * | 2019-09-09 | 2019-12-13 | 四川大学华西医院 | 一种检测焦谷氨酸氨肽酶的生物发光探针的制备方法及其应用 |
| CN112526141A (zh) * | 2020-11-23 | 2021-03-19 | 福建傲农生物科技集团股份有限公司 | 一种谷氨酰胺以及同时测定样品中谷氨酰胺和天冬酰胺的方法 |
-
1998
- 1998-11-20 JP JP33118398A patent/JP4163796B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110563718A (zh) * | 2019-09-09 | 2019-12-13 | 四川大学华西医院 | 一种检测焦谷氨酸氨肽酶的生物发光探针的制备方法及其应用 |
| CN110563718B (zh) * | 2019-09-09 | 2022-04-15 | 四川大学华西医院 | 一种检测焦谷氨酸氨肽酶的生物发光探针的制备方法及其应用 |
| CN112526141A (zh) * | 2020-11-23 | 2021-03-19 | 福建傲农生物科技集团股份有限公司 | 一种谷氨酰胺以及同时测定样品中谷氨酰胺和天冬酰胺的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4163796B2 (ja) | 2008-10-08 |
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