JP2000086701A - リポポリサッカライドの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】従来法によるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）
の精製は、超高速遠心分離工程、毒性の強い薬品の使
用、引火性溶媒の加熱下での使用等を含み、工業的規模
での実施が困難であった。 【解決手段】本発明においては、粗製ＬＰＳを界面活性
剤を含むｐＨ５〜８の緩衝液に溶解させ、ポリミキシン
Ｂなどのポリペプチド系抗生物質、ヒスチジンまたはポ
リエチレンイミンを吸着剤として固定化した不溶性担体
と接触させ、ｐＨ２〜６の緩衝液、蛋白質変性剤又はカ
オトロピック塩溶液等の溶離液でＬＰＳを溶離させるこ
とにより、工業的規模で効率よくＬＰＳを精製すること
ができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はリポポリサッカライ
ド（ＬＰＳ）のアフィニティークロマトグラフィーを利
用した精製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＬＰＳは、グラム陰性細菌表層のポリペ
プチドグリカンを取り囲んで存在する外膜の重要構成成
分で、細胞１個当たり約３×１０⁵分子（表面の２０〜
３０％）存在するといわれている。このＬＰＳはリピッ
ドＡと呼ばれる脂質とこれに共有結合した各種の中性糖
から成り、非還元末端の糖鎖が外界に向けて存在する。
ＬＰＳの活性は多彩であり、生体レベルでは毒性活性
（エンドトキシンショック）、発熱性（パイロジェ
ン）、シュワルツマン反応など、細胞レベルではマクロ
ファージの活性化、Ｂ細胞の活性化、血小板の凝集、顆
粒球の機能の変化などの生物活性作用を引き起こすこと
が報告されている。このような作用面からＬＰＳは、エ
ンドトキシンとも呼ばれている。臨床面では、多数の患
者が敗血症（その半数はグラム陰性菌が原因）にかか
り、アメリカ合衆国の統計では患者の３５％（年間約１
７万５千人）が死亡することから、ＬＰＳに起因したエ
ンドトキシン血症やエンドトキシンショックの病態生理
の解明やその診断、治療および予防の改善が強く求めら
れている。

【０００３】人体に用いる医薬品およびバイオテクノロ
ジーに用いる試薬は、ＬＰＳ含有量の管理が求められて
おり、その管理のためにエンドトキシン試験と発熱性物
質試験が「日本薬局方」に義務づけられている。ＬＰＳ
の微量定量法としては、ウサギ発熱性試験および鶏胚致
死試験、ラジオイムノアッセイなどがあるが、リムルス
テスト（Limulus test）が敏感かつ簡便、迅速な検定法
として注目され、今日では医薬品の製造工程および輸
液、注射用放射性医薬品などの管理予備テストとして確
立されている（「エンドトキシン 新しい治療・診断・
検査」１３９頁、１９９７年）。同様に、ＬＰＳが細胞
に多様な作用を引き起こすため、遺伝子操作、細胞融
合、組織培養などのバイオテクノロジーで用いる試薬、
水や器具のＬＰＳによる汚染を防止することが必須とな
っている（「ＪＩＳハンドブック試薬１３」Ｋ ８００
８、１５１９頁、１９９６年、財団法人日本規格協
会）。

【０００４】試薬類のＬＰＳ含有試験法としては、リム
ルステストのゲル化法、比濁法および発色合成基質法が
あり、それぞれ試験試薬が市販されている（「ＪＩＳハ
ンドブック試薬１３」Ｋ８００８、１５２０頁、１９９
６年、財団法人日本規格協会）。このように、医薬品や
バイオテクノロジーに用いる試薬に含まれているＬＰＳ
量を制御、管理することは、薬品製造において非常に重
要な事項になっている。製造環境からのＬＰＳ除去は最
も重要であるが、製造の工程管理や品質検査で行われる
ＬＰＳ含有試験において、試験結果の判定を確実に行う
ことも重要である。すなわち、適正な試験方法を用いて
正しい試験結果を導き出すためには、検出対象となるＬ
ＰＳ精製物を標準品として用い、試験方法の選択や精度
管理を行うことが必要である。ＬＰＳの精製法として
は、温フェノール水抽出法〔メソッド イン カルボハ
イドレート ケミストリー（Method in Carbohydrate C
hemistry Vol.5, p83,（1965））〕と、フェノール・ク
ロロホルム・石油エーテル（ＰＣＰ）法〔ヨーロピアン
ジャーナル バイオケミストリー（ European Journ
al BiochemistryVol.9，p245（1969）)〕が常法として
知られている。

【０００５】これらの温フェノール水抽出法とＰＣＰ法
は、ＬＰＳを得るための優れた精製方法ではあるが、精
製過程において長時間超高速遠心分離を行う工程を含ん
でいること、フェノールという毒性の強い薬品を使用し
なければならないこと、石油エーテルという引火性の溶
剤を加熱する必要があること等の理由から製造の大規模
化ができないという欠点を有している。そこで、薬品の
加熱工程を含まず、毒性が低く比較的取り扱いが容易な
薬品を用いる糖脂質の抽出法として、イソプロピルアル
コール・ヘキサン・水の混合液を用いる中性糖脂質の抽
出精製法「新生化学実験講座４ 脂質III 糖脂質」（2
45頁、1990年）が提案された。しかしこの抽出精製法
は、タンパク質などの糖脂質以外の物質も抽出液中に混
入してくるため、ＬＰＳ精製物は得られない。そこでＬ
ＰＳ精製物を得るためには、更なる精製工程の追加が必
要となる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ＬＰＳが、穏和な条件
下で、ポリミキシンＢと特異的に結合することはしられ
ている〔イムノケミストリー（ Immunochemistry, Vol.
13, p813(1976))〕。このポリミキシンＢの性質を利用
して、ＬＰＳ含有水溶液をポリミキシンＢ固定化不溶性
担体と接触させてＬＰＳを除去し、次いで、ＬＰＳが結
合したポリミキシンＢ固定化不溶性担体を強アルカリ
（好ましくはｐＨ１２以上）水溶液と接触させ、ＬＰＳ
をポリミキシンＢ不溶性担体から除去する方法が提案さ
れている（特開昭６１−１３５６７４号）。しかしこれ
はＬＰＳが強アルカリ条件下で分解されることを利用し
たもので、ＬＰＳの精製物を得る方法ではない。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、強力なア
フィニティー結合能により結合しているＬＰＳとポリペ
プチド系抗生物質、ヒスチジンまたはポリエチレンイミ
ンを、ＬＰＳが分解しない条件下で切り離す方法につい
て鋭意検討を行った結果、本発明のＬＰＳの精製方法に
到達した。すなわち本発明は、（１）粗製ＬＰＳを界面
活性剤を含有するｐＨ５〜８の緩衝液に溶解する工程
（ａ）、工程（ａ）で得られた粗製ＬＰＳ溶液をポリペ
プチド系抗生物質、ヒスチジンまたはポリエチレンイミ
ンを固定化した不溶性担体と接触させる工程（ｂ）およ
び工程（ｂ）で得られた不溶性担体にｐＨ２〜６の溶離
液を接触させてＬＰＳを不溶性担体から溶離させる工程
（ｃ）を含むＬＰＳの精製法、（２）溶離液がｐＨ２〜
６の緩衝液、ｐＨ２〜６の蛋白質変性剤含有水溶液また
はｐＨ２〜６のカオトロピック塩含有溶液である前記
（１）ＬＰＳ精製法、および（３）工程（ｃ）を、不溶
性担体にｐＨ２〜６の緩衝液を接触させ、ついでｐＨ２
〜６の蛋白質変性剤含有水溶液またはｐＨ２〜６のカオ
トロピック塩含有水溶液を接触させることにより行う前
記（１）記載のＬＰＳの精製法、である。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明においてはまず、粗製ＬＰ
Ｓを界面活性剤を含有するｐＨ５〜８の緩衝液に溶解す
る工程（ａ）を実施する。この粗製ＬＰＳはグラム陰性
菌の菌体から溶媒抽出により得ることができる。グラム
陰性菌の種類は、特に限定する必要は無く、例えば、エ
セリチア コリ（Escherichia coli）、クレブシェラ
ニュモニア（Klebsiella pneumoniae）、セラチア マ
ルセッセンス（Serratia marcescens）、シュードモナ
ス アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、ビブリ
オ コレラ（Vibrio cholerae）、サルモネラ ミネソ
タ（Salmonella minnesota）等を用いることができる。
該菌体の取り扱いに際しては、生化学分野で用いられて
いる汎用的な分離方法、例えば遠心分離法、濾過分離法
等で分離したのち、培養液の水分を凍結乾燥法、減圧乾
燥法等により除去して用いればよい。なお、作業者の微
生物感染を回避する目的で、高圧蒸気滅菌法、乾熱滅菌
法等で死菌とした後処理することもできる。

【０００９】本発明に用いる粗製ＬＰＳは、その製法を
限定する必要は無く、例えば、イソプロピルアルコール
・ヘキサン・水などの抽出溶媒に懸濁し、固液分離して
得られる液層又は、さらにその液層を水置換したものが
好ましく用いられる。本発明に用いる界面活性剤は、種
類を限定する必要はなく、生化学分野で汎用されている
デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、ラウリル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）等の陰イオン性界面活性剤、塩化
ベザルコニウム、塩化ヘキサメトニウム等の陽イオン性
界面活性剤、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメ
チルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡ
ＰＳ）等の両イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレン
グリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、
ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキ
シエチレンソルビタンモノラウレート等の非イオン性界
面活性剤を用いることができる。それらの中で好ましい
ものは非イオン性界面活性剤である。また、界面活性剤
の濃度は０.００５〜１.０重量％が好ましく、より好ま
しくは０.５〜１.０重量％である。ＬＰＳ粗製物を溶解
するｐＨ５〜８の緩衝液は、緩衝塩の種類を特に限定す
る必要はなく、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等の生化
学分野で汎用されているｐＨ緩衝剤を用いればよく、好
ましいものはリン酸塩である。緩衝液のより好ましいｐ
Ｈ範囲はｐＨ６〜７である。

【００１０】次に（ａ）工程で得られた粗製ＬＰＳ水溶
液をポリペプチド系抗生物質、ヒスチジンまたはポリエ
チレンイミンを固定化した不溶性担体と接触させる工程
（ｂ）を実施する。ポリペプチド系抗生物質の代表的な
ものは、ポリミキシンＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ及びコリスチンで
あるが、特にポリミキシンＢが好ましい。ポリミキシン
Ａ〜Ｄは、バチルス ポリミキサ（Bacillus Polimyx
a）により産生され、グラム陰性桿菌、緑膿菌に殺菌的
に作用する塩基性ポリペプチド系抗生物質（「生化学辞
典」第2版、1419頁、（1990年））である。コリスチン
も、バチルス ポリミキサ（Bacillus Polimyxa）から
得られる環状ポリポリペプチド抗生物質の混合物で、ポ
リミキシン類に分類される。ヒスチジンは、イミダゾー
ル環をもつ塩基性アミノ酸の一つ（「生化学辞典」第2
版、1039頁、（1990年））である。また、ポリエチレン
イミンは、イミノ基を有するエチレン鎖の繰り返し構造
を持つ高分子化合物であり、分子量600〜70,000の重合
物である。固定化不溶性担体の形状としては特に限定す
る必要はなく、使用目的に応じた適宜の形状を選定すれ
ばよい。例えば、ビーズ状、テストプレート状、チュー
ブ状、ディスク状、スティック状、ラテックス状等のも
のを用いることができる。担体の素材としては、通常の
アフィニティークロマトグラフィーの担体として用いら
れるもの、例えば、ガラス、多糖類（セルロース、デキ
ストラン、デンプン、デキストリン等）またはその誘導
体、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物、各
種合成樹脂（例えば、プロピレン、塩化ビニル、酢酸ビ
ニル、プロピオン酸ビニル、アクリル酸、アクリル酸エ
ステル、メタクリル酸、メタクリル酸エステル、スチレ
ン、メチルスチレン、ブタジエン、イソプレン、アクリ
ルアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリルなど
の重合物もしくは共重合物）、またはこれらに公知の手
段によりスルホン基、アミノ基などの反応性官能基を導
入したものなどが挙げられる。好ましいものはアガロー
スである。

【００１１】ポリペプチド系抗生物質、ヒスチジンまた
はポリエチレンイミンの吸着物質を不溶性担体に固定す
る方法は、アフィニティークロマトグラフィーで汎用さ
れている方法を用いればよく、活性化した不溶性担体と
吸着物質のアミノ基を介して固定する方法を用いること
ができる。不溶性担体を活性化する物質として臭化シア
ン、スルホニルクロリド等が用いられており、活性化さ
れた不溶性担体が市販されている。粗製ＬＰＳ水溶液を
吸着物質固定化不溶性担体と接触させる方法には、たと
えば担体を充填したカラムに粗製ＬＰＳ水溶液を通液す
るいわゆる連続法、ＬＰＳを結合させるに充分量の担体
を粗製ＬＰＳ水溶液に浸漬する、いわゆるバッチ法など
があるが、カラムを用いる連続法がより便宜である。Ｌ
ＰＳと結合した固定化不溶性担体はＬＰＳ含有水溶液か
ら分離される。このようにして得られたＬＰＳ結合不溶
性担体に溶離液を接触させて、ＬＰＳを担体から溶離す
る工程（ｃ）を実施する。この溶離液としては、ｐＨ２
〜６の緩衝液、ｐＨ２〜６の蛋白質変性剤溶液、ｐＨ２
〜６のカオトロピック塩溶液を用いることができ、特に
ｐＨ２〜６、より好ましくはｐＨ２〜４の緩衝液を用い
た後さらにｐＨ２〜６の蛋白質変性剤溶液あるいは、ｐ
Ｈ２〜６のカオトロピック塩溶液の順序で用いるのが良
い。緩衝液は、緩衝塩の種類を特に限定する必要は無
く、たとえばクエン酸塩、酢酸塩等の生化学分野で汎用
されているｐＨ緩衝剤を用いれば良く、好ましいものは
クエン酸塩である。また、ｐＨ範囲は２〜６の弱酸性領
域であれば良く、好ましくはｐＨ２〜４、より好ましく
はｐＨ２〜３である。

【００１２】蛋白質変性剤溶液は、生化学分野で汎用さ
れている尿素水溶液、グアニジン塩酸塩等を用いること
ができ、濃度範囲は汎用されている６〜８ｍｏｌ／リッ
トルが適当である。また、この蛋白質変性剤溶液のｐＨ
範囲も２〜６であればよく、好ましくはｐＨ２〜４、よ
り好ましくはｐＨ２〜３である。カオトロピック塩とし
ては、たとえばチオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリ
ウム等のカオトロピック塩をあげることができる。濃度
範囲は汎用されている２〜４ｍｏｌ／リットルで用いる
ことができる。また、ｐＨ範囲は、２〜６であればよ
く、好ましくはｐＨ２〜４、さらに好ましくはｐＨ２〜
３である。本発明のＬＰＳの精製方法で得られたＬＰＳ
精製物は、そのままでも用いることができるが、さらに
適当な緩衝塩を添加したり、中性ｐＨ緩衝水溶液にて透
析したりすることにより、中性ｐＨ領域の液性としてお
くことが好ましい。また、常法により凍結乾燥をするこ
ともできる。

【００１３】

【実施例】以下に実施例および比較例をあげて本発明を
より詳細に説明するが、本発明はこれらよって限定され
るものではない。 実施例１ （１）２００ｍｌビーカーにエセリチア コリ（Escher
ichia coli）Ｏ５５：Ｂ５の乾燥菌体７ｇとイソプロパ
ノール−ヘキサン−水混液（容量比５５：２０：２５）
７０ｍｌを加え、室温で２時間充分に撹拌し、吸引濾過
により菌体と液層を分離した。得られた菌体残渣に新た
なイソプロパノール−ヘキサン−水混液（容量比５５：
２０：２５）７０ｍｌを加えて同様の操作を行った。イ
ソプロパノール−ヘキサン−水混液層を合し、減圧条件
下でイソプロパノールとヘキサンを除去することによ
り、粗製ＬＰＳ約２．５ｇを得た。 （２）臭化シアン活性化アガロース担体（セファロース
４Ｂ ファルマシア社製）１５ｇにポリミキシンＢ
（硫酸ポリミキシンＢ末 ファイザー製薬社製）０.２
ｇの水溶液を添加し、２５℃で２時間振盪した後、リン
酸水溶液５００ｍｌで充分洗浄することにより、ポリミ
キシンＢ固定化不溶性担体を調製した。該不溶性担体５
ｍｌを、１０ｍｌ容量のガラス製カラムに充填し、０.
５％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔ
ｗｅｅｎ ２０）含有リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.
８）５０ｍｌを流し込んだ。

【００１４】（３）前記（１）で得た粗製ＬＰＳ約１０
０ｍｇを０．５％ポリオキシエチレンソルビタンモノラ
ウレート含有０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．８）２５ｍｌに溶解し、（２）で準備したポリミキ
シンＢ固定化不溶性担体５ｍｌを充填したカラムに添加
した。そして０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．８）５０ｍｌで洗い流した後、０．２Ｍクエン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ２．０）２５ｍｌ、３Ｍチオシア
ン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．８）２５ｍｌおよび３
Ｍチオシアン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ２．０）２５ｍ
ｌの順序で各溶液を該カラムに添加し、溶出液計７５ｍ
ｌを分取した。分取した該カラム溶出液は、１Ｍ水酸化
ナトリウム水溶液により液性をｐＨ７．０に調整した。 （４）前記（３）で得た精製ＬＰＳの精製程度を、従来
の精製方法である温フェノール水抽出法で得られたＬＰ
Ｓと比較した。すなわち、各ＬＰＳ試料液をＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動用の試料緩衝液（２−メ
ルカプトエタノール無添加）と容量比１：１で混合し、
泳動用試料とした。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動は、１５％濃度ポリアクリルアミドゲルを用いる
定法に従って実施した。泳動終了後の該泳動ゲルは、Ｌ
ＰＳの銀染色法〔アナリティカル バイオケミストリ
（ Analytical Biochemistry Vo1.119, p115-119, (198
2)）〕に従って、蛋白質用銀染色溶液調製品（シルベス
トステイン ナカライテスク社製）を用いて染色して泳
動像を確認した。すなわち、泳動後の該ゲルを、エタノ
ール：酢酸：水混液（容量比５０：２０：３０）に３０
分間浸漬し、ついで過ヨウ素酸：エタノール：酸：水混
液（容量比０.７：２０：５：７４.３）に１０分間浸漬
した後充分量の水で洗浄した。つづいて、銀溶液・Ａ
液：銀溶液・Ｂ液：水（容量比１０：１０：８０）混液
に１０分間浸漬した後充分量の水で洗浄した。洗浄後、
該ゲルを現像液（ホルムアルデヒド溶液）：水（容量比
５：９５）にて染色し、５％酢酸水溶液で現像を停止し
て充分量の水で洗浄した。（３）で得られた精製ＬＰＳ
の泳動像は、温フェノール水抽出法で精製したＬＰＳ以
上にＬＰＳ以外の蛋白質等の不純物が除去されていた。

【００１５】（５）前記（１）で得た粗製ＬＰＳ、前記
（３）で得た精製ＬＰＳおよび従来の精製方法である温
フェノール水抽出法で得たＬＰＳのそれぞれについてリ
ムルステスト、（エンドスペーシー ＥＳ−６、生化学
工業社製）によるＬＰＳの定量を行った。操作手順は、
エンドトキシンフリー，β−グルカンフリーの９６穴マ
イクロプレート（トキシペットプレート９６Ｆ、 生化
学工業社製）に試料５０μｌを添加し、合成基質溶液５
０μｌ加え、３７℃で３０分間放置した後、０.６Ｍ酢
酸水溶液０.２ｍｌを加え、波長４０５ｎｍの吸光度を
測定した。その結果、粗製ＬＰＳ中のＬＰＳ濃度は０．
３８ｍｇ／ｍｌ、精製ＬＰＳ中のＬＰＳ濃度は１９.６
ｍｇ／ｍｌ、温フェノール水抽出法による精製ＬＰＳ中
のＬＰＳ濃度は、１７．６ｍｇ／ｍｌであった。 （６）前記（１）で得た粗製ＬＰＳ、前記（３）で得た
精製ＬＰＳおよび従来の精製方法である温フェノール水
抽出法で得たＬＰＳのそれぞれについて蛋白質定量を行
った。方法は、フェノール試薬法（Lowry法）（J．Bio
l. Chem.，193,265, (1951)）により蛋白質定量 Lowry
キット調整品（プロテインアッセイ Lowry キット ナ
カライテスク社製）を用いて測定した。蛋白質濃度は牛
血清アルブミン(ＢＳＡ)換算した。操作手順は、試料
０.２ｍｌにアルカリ性銅溶液１ｍｌを加え混和し、室
温で１０分以上放置した後、１Ｎフェノール試薬０.１
ｍｌを加え、直ちに混和した。室温で３０分放置した
後、７５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、（１）
で得た粗製ＬＰＳに含まれる蛋白質濃度は、約２７ｍｇ
／ｍｌ、（３）で得た精製ＬＰＳに含まれる蛋白質濃度
は約０.０３ｍｇ／ｍｌであり、温フェノール水抽出法
による精製ＬＰＳに含まれる蛋白質濃度は０．２５ｍｇ
／ｍｌであった。 （７）前記（５）で精製したＬＰＳ中のＬＰＳ濃度が１
９.６ｍｇ／ｍｌであったことと、前記（６）で精製し
たＬＰＳに含まれる蛋白質濃度が０.０３ｍｇ／ｍｌで
あったことから、精製ＬＰＳの蛋白質含有率は約０.２
％であった。一方、温フェノール水抽出法により精製し
たＬＰＳ中のＬＰＳ濃度が１７．６ｍｇ／ｍｌであった
ことと、温フェノール水抽出法で精製したＬＰＳに含ま
れる蛋白質濃度が０．２５ｍｇ／ｍｌであったことか
ら、精製したＬＰＳの蛋白質含有率は約１．４％であっ
た。

【００１６】実施例２ 実施例１（１）で得た粗製ＬＰＳ２０ｍｇを０.５％ポ
リオキシエチレンソルビタンモノラウレート含有０.０
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.８）５ｍｌで溶
解した後、実施例１（２）のポリミキシンＢ固定化不溶
性担体１ｍｌを充填したカラムに添加した。そして、
０.０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.８）１０ｍ
ｌで洗い流した後、０.２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液
のｐＨ４.０とｐＨ３.０の各緩衝溶液１０ｍｌ、６Ｍ濃
度尿素水溶液（ｐＨ５.８）１０ｍｌの順番で各溶液を
該カラムに添加し、各カラムからの溶出液計２０ｍｌを
分取した。分取した各カラム溶出液は、１Ｍ水酸化ナト
リウム水溶液によりｐＨ７.０に調整した。実施例１
（４）と同様の電気泳動法とＬＰＳ銀染色法を行った結
果、ｐＨ３.０の緩衝溶液の泳動像染色度は、ｐＨ４.０
の緩衝溶液の泳動像より濃かった。また、実施例１
（５）と同様の操作により、ｐＨ３．０の緩衝液による
精製ＬＰＳとｐＨ４．０の緩衝液による精製ＬＰＳの定
量を行った結果、ｐＨ３．０の緩衝液による精製ＬＰＳ
中のＬＰＳ濃度は、３．８ｍｇ／ｍｌであり、ｐＨ４．
０の緩衝液による精製ＬＰＳ中のＬＰＳ濃度は、２．３
ｍｇ／ｍｌであった。

【００１７】比較例１ 実施例１（１）で得た粗製ＬＰＳ２０ｍｇを０.５％ポ
リオキシエチレンソルビタンモノラウレート含有０.０
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.８）５ｍｌで溶
解した後、実施例１（２）のポリミキシンＢ固定化不溶
性担体カラム１ｍｌに添加した。そして、０.０１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.８）１０ｍｌで洗浄
後、６Ｍ尿素水溶液（ｐＨ６.５）５０ｍｌを該カラム
に添加し、６Ｍ尿素水溶液のカラム溶出液を分取した。
分取した該カラム溶出液は、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶
液の適量を加えることにより液性をｐＨ７.０に調整し
た。得られた溶液を実施例１（４）で行ったと同様の電
気泳動法とＬＰＳ銀染色法により染色したが、ＬＰＳの
泳動像を確認できなかった。また実施例１（５）と同様
の操作により、ＬＰＳの定量を行った結果、得られた溶
液のＬＰＳ濃度は３．６μｇ／ｍｌであった。

【００１８】実施例３ 実施例１（２）と同様に、ヒスチジン０.２ｇの水溶液
を臭化シアン活性化アガロース不溶性担体１５ｇに固定
化して、ヒスチジン固定化不溶性担体を調製した。該不
溶性担体５ｍｌを、１０ｍｌ容量のガラス製カラムに充
填し、０.５％塩化ベンザルコニウム含有リン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６.８）５０ｍｌを流し込んだ。実施
例１（１）と同様の操作によりセラチア マルセッセン
ス（Serratia marcescens）菌体から得られた粗製ＬＰ
Ｓ１００ｍｇを０.５％塩化ベンザルコニウム含有０.０
１濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.８）２５ｍ
ｌに溶解した。この粗製ＬＰＳ溶液をヒスチジン固定化
不溶性担体カラムに添加した。０.０１Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６.８）５０ｍｌで洗浄後、０.２Ｍク
エン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ２.０）２５ｍｌ、８Ｍ
グアニジン塩酸水溶液（ｐＨ５.８）２５ｍｌ、８Ｍグ
アニジン塩酸水溶液（ｐＨ２.０）２５ｍｌの順番で各
溶液を該カラムに添加し、合計７５ｍｌの溶出液を分取
した。分取した該カラム溶出液は、１ｍｏｌ濃度の水酸
化ナトリウム水溶液の適量を加えることにより液性をｐ
Ｈ７.０に調整した。実施例１（４）で行ったと同様の
電気泳動法とＬＰＳ銀染色法により、純度の確認をし
た。その結果このヒスチジン固定化不溶性担体カラムに
よっても、実施例１と同様にＬＰＳが精製された。ま
た、実施例１（５）および（６）と同様の操作を行った
結果、得られた精製ＬＰＳ中のＬＰＳ濃度は、２２．５
ｍｇ／ｍｌであり、蛋白質濃度は、０．１１ｍｇ／ｍｌ
であった。このことから精製ＬＰＳの蛋白質含有率は約
０．５％であった。

【００１９】実施例４ 実施例１（２）と同様に、ポリエチレンイミン固定化不
溶性担体を調製した。該不溶性担体５ｍｌを１０ｍｌ容
量のガラス製カラムに充填し、０.００５％デオキシコ
ール酸ナトリウム含有リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６.８）５０ｍｌを流し込んだ。実施例１（１）と同様
の操作によりシュウドモナス アエルギノサ（Pseudomo
nas aeruginosa）菌体から得られた粗製ＬＰＳ１００ｍ
ｇを０.００５％デオキシコール酸ナトリウム含有０.０
１濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.８）２５ｍ
ｌに溶解した後、ポリエチレンイミン固定化不溶性担体
カラム５ｍｌに添加した。そして０.０１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６.８）２５ｍｌで洗浄後、３Ｍヨ
ウ化ナトリウム水溶液（ｐＨ２.０）２５ｍｌを添加
し、３Ｍヨウ化ナトリウム水溶液（ｐＨ２.０）の溶出
液を分取した。分取した該カラム溶出液は、１Ｍ水酸化
ナトリウム水溶液の適量を加えることにより液性をｐＨ
７.０に調整した。実施例１（４）で行ったと同様の電
気泳動法とＬＰＳ銀染色法により、このポリエチレンイ
ミンの固定化不溶性担体カラムにおいても、実施例１と
同様にＬＰＳが精製された。また、実施例１（５）およ
び（６）と同様の操作によりＬＰＳの定量と蛋白質量を
測定した結果、精製ＬＰＳ中のＬＰＳ濃度は、２４ｍｇ
／ｍｌであり、精製ＬＰＳ蛋白質濃度は、０．１２ｍｇ
／ｍｌであった。このことから精製ＬＰＳの蛋白質含有
率は約０．５％であった。

【００２０】実施例５ 実施例１（２）と同様に、コリスチン固定化不溶性担体
を調製した。該不溶性担体５ｍｌを１０ｍｌ容量のガラ
ス製カラムに充填し、０.５％ポリオキシエチレンノニ
ルフェニルエーテル含有リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６.８）５０ｍｌを流し込んだ。実施例１（１）と同様
の操作でビブリオ コレラ（Vibrio cholerae）菌体か
ら得られた粗製ＬＰＳ１００ｍｇを０．５％ポリオキシ
エチレンノニルフェニルエーテル含有０.０１濃度のリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.８）２５ｍｌに溶解し
た後、コリスチン固定化不溶性担体カラム５ｍｌに添加
した。そして０.０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６.８）５０ｍｌで洗浄後、０.２Ｍクエン酸ナトリウム
水溶液（ｐＨ２.０）２５ｍｌ、３Ｍチオシアン酸ナト
リウム水溶液（ｐＨ５.８）２５ｍｌを添加し、３Ｍチ
オシアン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ２.０）２５ｍｌの
順番で各溶液を該カラムに添加し、合計７５ｍｌの溶出
液を分取した。分取した該カラム溶出液は、１Ｍ水酸化
ナトリウム水溶液の適量を加えることにより液性をｐＨ
７.０に調整した。実施例１（４）の電気泳動法とＬＰ
Ｓ銀染色法により、コリスチン固定化不溶性担体カラム
においても、実施例１と同様にＬＰＳが精製された。ま
た、実施例１（５）および（６）と同様の操作によりＬ
ＰＳの定量および蛋白質量を測定した結果、精製ＬＰＳ
中のＬＰＳ濃度は、１８．２ｍｇ／ｍｌであり、精製Ｌ
ＰＳに含まれる蛋白質濃度は、０．０９ｍｇ／ｍｌであ
った。このことから精製ＬＰＳの蛋白質含有率は約０．
５％であった。

【００２１】

【発明の効果】本発明のＬＰＳの精製方法は、従来法で
は工業的製造の障害要因となっていた精製過程における
超高速遠心分離の工程、フェノールのような毒性の強い
薬品の使用、石油エーテルのような引火性薬品の加熱工
程を含んでいないので、安全に製造規模拡大を実施する
ことができる。また、本発明の精製方法で得られたＬＰ
Ｓの精製純度は、従来の精製方法と同等以上である。す
なわち、従来から有用性が報告されていたＬＰＳは、本
発明の精製法により初めて、工業的規模での製造が可能
になった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三宅 剛博 大阪府高槻市西冠１−25−16−405 (72)発明者 寺野 由剛 大阪府池田市旭丘３−４−17 Ｆターム(参考） 4C090 AA03 BA76 BC20 CA06 CA12 CA13 DA09 DA21 DA22

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】粗製リポポリサッカライド（Lipopolysacc
   haride, 以下ＬＰＳと略記する。）を界面活性剤を含有
   するｐＨ５〜８の緩衝液に溶解する工程（ａ）、工程
   （ａ）で得られた粗製ＬＰＳ溶液をポリペプチド系抗生
   物質、ヒスチジンまたはポリエチレンイミンを固定化し
   た不溶性担体と接触させる工程（ｂ）および工程（ｂ）
   で得られた不溶性担体にｐＨ２〜６の溶離液を接触させ
   てＬＰＳを不溶性担体から溶離させる工程（ｃ）を含む
   ＬＰＳの精製法。
2. 【請求項２】溶離液がｐＨ２〜６の緩衝液、ｐＨ２〜６
   の蛋白質変性剤含有水溶液またはｐＨ２〜６のカオトロ
   ピック塩含有溶液である請求項１記載のＬＰＳ精製法。
3. 【請求項３】工程（ｃ）を、不溶性担体にｐＨ２〜６の
   緩衝液を接触させ、ついでｐＨ２〜６の蛋白質変性剤含
   有水溶液またはｐＨ２〜６のカオトロピック塩含有水溶
   液を接触させることにより行う請求項１記載のＬＰＳの
   精製法。