JP2000060559A - サテライト配列の単離方法 - Google Patents

サテライト配列の単離方法

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秀彰 高橋
Masashi Sekino
正志 關野
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 サテライト配列の効率的な単離を可能とする方法の提
供。 【解決手段】 ゲノムの切断を超音波処理等の塩基配列に依存しない切
断方法に基づいて行うことにより、より均質なライブラ
リーを得る。このライブラリーからサテライト配列を選
択することによって、単離効率が向上する。遺伝子マー
カーとして有用なマイクロサテライト配列を効率的に単
離することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、サテライト配列の単離
方法に関する。集団遺伝マーカーとして有用なサテライ
ト配列は、遺伝連鎖解析等のマーカーとなる。したがっ
て、その効率的な単離技術は、ゲノム解析における重要
な研究課題である。 【０００２】 【従来の技術】真核生物のゲノムには、類似した塩基配
列の繰り返しで構成された反復配列の存在が知られてい
た。最初に発見されたのはサテライトDNAと呼ばれる数
百−数千に及ぶ長い配列を１つの繰り返し単位とするも
のでサテライト配列(Bioscience,27:790-796,1977)と呼
ばれている。その後、より短い配列で構成された反復配
列も確認された。それらは、繰り返し単位の大きさに応
じて、2-5塩基の繰り返し単位(Nucleic Acid Res.9:593
1-5947,1981)を持つマイクロサテライト配列(Am.J.Hum.
Genet.4:397-401,1989)、そして10-64塩基の繰り返し単
位(Nature,295:31-35,1982)を持つミニサテライト配列
(Nature,314:67-73,1985)と名づけられた。マイクロサ
テライト配列は、シンプルシーケンス(Nucleic Acid Re
s.17:6463-6471,1989)、あるいはショートタンデムリピ
ート(Am.J.Hum.Genet.49:746-756)などとも呼ばれてい
る。 【０００３】マイクロサテライト配列は、発見当初はマ
ーカーとしての利用は報告されなかった。しかし、Poly
merase Chain Reaction(PCR)によって多型が確認(Am.J.
Hum.Genet.4:397-401,1989)されてからは、さまざまな
分野でマーカーとして注目されるようになった。具体的
には、人間や動植物の家系・系統判別や個体識別などへ
の応用が進んでいる。マイクロサテライト配列はゲノム
全体に散在し、しかも変異に富むことから遺伝マーカー
として優れている。またマイクロサテライトDNA多型
は、多型遺伝子座数や１遺伝子座当たりの対立遺伝子数
が多い。更にPCRに基づいていることから操作が簡単で
あること、また増幅産物は電気泳動によって１本、ある
いは２本のバンドとして検出されるので型判別が容易
で、処理能力にも優れていた。こうしてマイクロサテラ
イトDNAマーカーは、もっとも有効な集団遺伝マーカー
として広く普及した(J.Fish.Biol.,47:29-55,1995)。 【０００４】マイクロサテライトDNA多型解析を行うに
は、まず多数のマイクロサテライトDNAを基本的には解
析対象である種ごとに単離しておく必要がある。そして
マイクロサテライト多型の検出にあたっては、PCRでマ
イクロサテライトDNA領域を増幅しなければならない。P
CRには、適切なプライマーが必要である。つまり、マイ
クロサテライトDNA多型解析を行うには、その種のマイ
クロサテライトDNAの単離と、マイクロサテライト領域
を増幅することができるPCR用のプライマーの設計を効
率的に行う方法が求められる。 【０００５】マイクロサテライト多型解析が進んでいな
い家禽類について、本発明者らは効率的なマイクロサテ
ライトの単離が期待できる方法を既に報告している(Jp
n.Poult.Sci.,33,292-299,1996)。この方法は、それま
でマイクロサテライト配列の一般的な単離方法であっ
た、ゲノムの制限酵素による断片化、ベクターへの挿
入、(TG)nプライマーによる伸長反応、そしてクローニ
ングという一連の操作に基づく方法 (Proc.Natl.Acad.S
ci.USA.,89,3419-1423,1992)を改良したものである。す
なわち、形質転換効率の高いベクターの選択、Mung bea
nヌクレアーゼによる１本鎖DNAの特異的な消化、あるい
はDNaseIとRNaseAによる大腸菌由来のDNAやRNAの除去等
を行って、未知のマイクロサテライト配列の単離を達成
した。ニワトリではマイクロサテライト配列の数が少な
く、効率的なマイクロサテライト配列の単離は困難とさ
れている。この方法により、ニワトリのマイクロサテラ
イト配列の単離を試みた公知の方法(Poultry Science,7
4:1855-1874,1995)に比べ、計算上は６倍効率的な単離
を達成することができた。 【０００６】しかし、この方法を用いても、得られたマ
イクロサテライトDNAクローンの中には、なお問題を持
ったものの混入を避けられなかった。すなわち、クロー
ンの中で重複するものの割合が高く、単に効率性の問題
のみならず、偏りを生じている恐れもある。 【０００７】マイクロサテライト配列は、種毎に単離す
る必要がある。解析に必要なマイクロサテライト配列の
単離が進んでいる種は少なく、今後も多くの種からマイ
クロサテライト配列の単離を行う必要がある。しかし、
たとえばニワトリのゲノムにおいてはマイクロサテライ
ト配列の頻度が低いといったような、種に固有の問題点
は多い。したがってマイクロサテライト配列の新たな単
離技術の提供は、いろいろなアプローチの選択を可能と
するという点においても有意義である。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、単離効率に
優れたサテライト配列の単離方法の提供を課題としてい
る。本発明は、公知技術では達成することのできない、
高度に効率化された単離方法を提供するものである。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、公知技術
によるサテライト配列の単離にあたって、重複クローン
が多く生じる主な原因のひとつがゲノムの断片化操作に
あるのではないかと考えた。すなわち、制限酵素による
切断では、配列特異的な切断が行われるので、ゲノムラ
イブラリーに偏りが生じる可能性を否定できないのであ
る。 【００１０】そこで本発明者らは、塩基配列に依存しな
い、よりランダムな切断が期待できる切断方法をゲノム
の断片化に採用することを試みた。その結果、塩基配列
に依存しないDNA消化酵素や物理的な作用に基づくゲノ
ムの切断が可能なことを見出した。しかし、物理的に切
断されたゲノムはその末端がリン酸化されておらず、ベ
クターへの酵素的な組み込みを効率的に行うことができ
ない。また、物理的に切断された断片の切断部分は不規
則に一方の鎖が突出した状態にあるため、ライゲーショ
ンもできない。本発明者らはこれらの問題点を、いくつ
かの酵素処理によって克服し、より均質なゲノムライブ
ラリーを得る方法を確立した。更にこのライブラリーに
基づいてサテライト配列の効率的な単離が可能となるこ
とを確認して本発明を完成した。なお本発明においてサ
テライト配列とは、特に断りの無い場合にはマイクロサ
テライト配列やミニサテライト配列を含む反復配列全般
を意味する。なお本発明において、マイクロサテライト
配列とは、2-5bpの、またミニサテライト配列は10-64bp
の繰り返し単位からなる繰り返し配列を意味する。すな
わち本発明は、以下のとおりである。 【００１１】（１）次のステップａ）−ｂ）を含むサテ
ライト配列の単離方法であって、塩基配列に依存しない
方法に基づいてゲノムを切断するサテライト配列の単離
方法。 ａ）ゲノムをランダムに切断した断片を得る工程、およ
び ｂ）工程ａ）の断片から、サテライト配列を含む断片を
選択する工程、 （２）塩基配列に依存しない方法が、物理的な切断方
法、または酵素的な切断方法である（１のサテライト配
列の単離方法。 （３）物理的な切断方法が超音波処理である（２）のサ
テライト配列の単離方法。 （４）超音波処理によって断片化されたゲノムの切断面
を平滑末端とする請求項３のサテライト配列の単離方
法。 （５）前記平滑末端処理をMung beanヌクレア-ゼ処理お
よびT4DNAポリメラーゼ処理により実施する（４）のサ
テライト配列の単離方法。 （６）酵素的な切断方法が、塩基配列に依存しないエン
ドヌクレアーゼによるものである（２）のサテライト配
列の単離方法。 （７）塩基配列に依存しないエンドヌクレアーゼが、DN
aseIである（６）のサテライト配列の単離方法。 （８）サテライト配列が、マイクロサテライト配列であ
る（１）のサテライト配列の単離方法。 【００１２】 【発明の実施の形態】本発明では、塩基配列に依存しな
いランダムな断片を与える切断方法に基づいてゲノムの
切断を行うことが重要な要件である。塩基配列に依存し
ない方法に基づくゲノムの切断とは、構造的な性質（す
なわち塩基配列）に依存せずDNAの切断を行うことを意
味する。したがって、塩基配列に依存してDNAを切断す
る化学的な反応や制限酵素による消化は、本発明におけ
る切断方法を構成しない。これらの作用による処理を加
えるゲノムは、公知の方法により調整することができ
る。すなわち、細胞をプロテアーゼで酵素的に分解し、
適当な溶媒でDNAを抽出する。 【００１３】塩基配列に依存しない方法に基づくゲノム
の切断には、たとえば物理的な作用に基づく切断や、塩
基配列を認識しないDNA消化酵素の作用に基づく切断方
法を示すことができる。物理的な作用とは、超音波処理
や撹拌等の作用を示すことができる。他方、塩基配列を
認識しないDNA消化酵素としては、DNaseIなどが知られ
ている。これらの作用は、いずれも本発明に応用するこ
とができる。しかし中でも超音波による処理は、再現性
にも優れた望ましい操作のひとつである。超音波処理に
よれば、簡単な作業によって、短時間で均一な長さの断
片を多量に得ることができる。これに対してDNaseIによ
るゲノムの部分消化では、均一な長さの断片を再現性良
く得るには、厳密な条件設定が求められる。また操作性
の点においても、煩雑なものとなりやすい。 【００１４】ゲノムの切断処理の程度は、目的とするサ
テライト配列に応じたサイズを持つ断片が効率的に得ら
れる条件を経験的に設定すれば良い。たとえばマイクロ
サテライト配列の単離を目的とする場合には、ライブラ
リーとして300-900bp、の断片を与える処理条件を選択
する。切断断片をベクターにライゲーションする操作を
考慮すると、300-500bp、あるいは500-800bpの断片を多
く生成する条件が望ましい。なぜならば、小さい断片の
整数倍の大きさを持つ断片を含む場合、断片が互いにラ
イゲーションしたものとの区別ができなくなってしまう
からである。超音波処理を例に取ると、氷冷下で20kHz
振幅10の超音波処理を行う場合、1分間の処理を1-5回程
度とすれば300-500bp bpの断片を効率的に得ることがで
きる。超音波処理を長時間行うと試料の発熱を招き、DN
Aの変性をもたらす可能性があるので、短時間の処理を
繰り返すようにするのが望ましい。 【００１５】超音波処理等の物理的な作用によって切断
したゲノムは、ライゲーション効率が悪く、このままで
はベクターへの組み込みを能率的に行うことができな
い。そのため、望ましくは末端の平滑化を行う。本発明
においては、Mung beanヌクレア-ゼ処理およびT4DNAポ
リメラーゼを利用した平滑末端処理が有用である。Mung
beanヌクレア-ゼは１本鎖特異的エンドヌクレアーゼ
で、DNAの１本鎖部分を消化することによって平滑化を
達成する。更にT4DNAポリメラーゼの作用により平滑化
を確実にする。T4DNAポリメラーゼは、強力な3'→5'エ
クソヌクレアーゼ活性を持ち3'突出末端を消化するとと
もに、3'陥没末端に対しては相補鎖を合成することによ
って平滑末端を与える。ただT4DNAポリメラーゼは3'陥
没末端がリン酸基を持つ場合には平滑化できないので、
Mung beanヌクレア-ゼの併用が望ましい。このとき、Mu
ng beanヌクレア-ゼ処理は末端の平滑化とともに、超音
波処理によって生じた２本鎖DNAのギャップ部分を切断
する。その結果、目的の長さよりも短い断片を生じてし
まう可能性がある。短い断片を含まないライブラリーを
得るには、Mung beanヌクレア-ゼ処理の後に目的の長さ
の断片を分離するステップを設けると良い。アガロース
電気泳動やゲルろ過により、目的の長さの断片を分離す
ることができる。平滑末端処理したゲノムの断片は、こ
のままベクターへのライゲーションを行うことができ
る。あるいは、効率良くライゲーションを行うためにそ
の5'末端をリン酸化することもできる。リン酸化にはT4
ポリヌクレオチドキナーゼを利用する。 【００１６】5'末端をリン酸化したゲノム断片は、ベク
ターへのライゲーションにあたっては断片同士のライゲ
ーションを起こす。これを避けるために、断片の濃度を
低めにする一方、ベクターを過剰量で用いてベクターへ
のライゲーションの機会を増やすようにすると良い。ラ
イゲーションにはT4DNAリガーゼをライゲーションバッ
ファー中で作用させるが、このときにベクターの切断を
行う制限酵素を共存させることによってライゲーション
を効率的に進めることができる。たとえばpCR-ScriptSK
(+)をベクターとして用いるとき、制限酵素SrfIの共存
によりベクターを常に開環した状態に維持することがで
きる。インサートとライゲーションしたベクターにはSr
fIは作用しないので、ライゲーション効率の向上が期待
できる。 【００１７】本発明においては、物理的な作用による切
断のみならず、塩基配列に依存しないDNA消化酵素によ
る断片化も可能である。このような酵素には、たとえば
DNaseI等が知られている。DNaseIによる酵素処理にあた
っては、ゲノム全体に酵素が均等に作用するような条件
を与え、更に期待する大きさの断片を効率的に得ること
ができる条件を経験的に設定する。たとえば、酵素作用
の均一性を維持するためには、核タンパク質を取り除い
てゲノムはできるだけ高純度なものを用いるようにする
と良い。また、酵素反応は、小さな断片を多量に生じな
いように迅速な処理を心がける。また、再現性を高度に
維持するには、反応時間や温度といった条件も正確に管
理する必要がある。酵素反応終了後は、加熱などによっ
て反応を停止し、核酸成分を回収し、更に必要に応じて
特定の断片を抽出した後、上記のようなベクターへの組
み込みを行う。酵素消化したゲノムの断片は、平滑末端
となっており、リン酸化された状態にあるので、そのま
まライゲーションに使うことができる。 【００１８】本発明に用いられるベクターは特に限定さ
れない。具体的には、pCR-ScriptSK(+)、pBluescriptKS
(+)（いずれもStratagene社製）やpUC18等の公知のベク
ターを利用すれば良い。インサートを含むベクターによ
って適当な宿主を形質転換し、増殖させた後にDNAを回
収してゲノムライブラリーとする。pCR-ScriptSK(+)に
よる形質転換には、大腸菌（コンピテントセル）XLI-Bl
ue MRF'や、XL2-Blue MRF'、あるいはTG1（いずれもStr
atagene社製）のような形質転換効率に優れたものを利
用すると有利である。こうして構築したゲノムライブラ
リーをもとに、目的とするサテライト配列を含むものを
クローニングする。サテライト配列のスクリーニング
は、サテライト配列用のプローブを使ったコロニーハイ
ブリダイゼーション(Can.J.Fish.Biol.,51:1959-1996,1
994)や、プライマーエクステンション(Proc. Natl.Aca
d.Sci.USA.,89,3419-1423,1992)に基づいて行うことが
できる。コロニーハイブリダイゼーションでは、前記形
質転換細胞のコロニーをフィルターに転写し、たとえば
(GT)nという繰り返し配列を持ったプローブとハイブリ
ダイズさせる。なお、プローブを構成するオリゴヌクレ
オチドの塩基配列は、目的とするサテライト配列に応じ
て適宜設定する。陽性コロニーを分離することにより、
サテライト配列を含むクローンの単離を進める。 【００１９】一方プライマーエクステンションでは、ゲ
ノムライブラリーを1本鎖DNAとして回収する。たとえば
pCR-ScriptSK(+)をベクターとして用いたとき、形質転
換した大腸菌にヘルパーファージVCS-M13等を感染させ
て、組換えファージとしてインサートを1本鎖の形で回
収することができる。ファージにパッケージングされた
DNAには酵素作用が及ばないので、回収時に大腸菌に由
来するRNAやDNAを酵素的に分解することができ、より効
率的なクローニングを行うことができる。 【００２０】ファージから抽出した1本鎖プラスミドDNA
にサテライト配列特異プライマーをアニールさせてDNA
ポリメラーゼを作用させる。たとえば哺乳類のマイクロ
サテライト配列においては、(dA.dT)nの繰り返し配列が
一般的である（全ゲノムの0.3%）。またヒトでは、(dC
A.dTG)n、あるいは(dCT.dAG)nといった組み合わせも多
く見られる。こういった情報を元に、これらの配列に相
補的な塩基配列を持たせれば、サテライト配列にアニー
ルするプライマーを設計することができる。このときプ
ライマーの5'末端は、ライゲーションに備えて予めリン
酸化しておくと良い。マイクロサテライト配列を含むベ
クターは、この部分でプライマーを得て2本鎖合成が進
むが、プライマーがアニールしないベクターは1本鎖の
ままである。DNAポリメラーゼによる相補鎖合成の後に
ライゲーションを行って完全に2本鎖環状化し、Mung be
anヌクレア-ゼ等によって1本鎖DNAを分解すればサテラ
イト配列を含むベクターが残る。これを回収して再び形
質転換し、クローニングを行うことができる。クローニ
ングされたサテライト配列を含むベクターを増殖させ、
DNAを回収してその配列を決定すれば、サテライト配列
の単離が完了する。 【００２１】サテライト配列が周辺領域を含む形で単離
されれば、PCRのためのプライマーを設計することがで
きる。PCRプライマーの設計は、市販されている塩基配
列の解析用ソフトウエアパッケージを利用すると便利で
ある。たとえば以下に述べる実施例においては、プライ
マー設計ソフトPrimer Premier, Premier （BiosoftInt
ernational製)を利用している。単離されたマイクロサ
テライト配列やミニサテライト配列は、種内のフィンガ
ープリントマーカーとして、あるいは家系（系統）のマ
ーカーとして有用である。以下、実施例により本発明を
更に具体的に説明する。 【００２２】 【実施例】（１）クロアワビDNA断片の調製 クロアワビ(Haliotis discus discus)DNAの抽出は、足
部筋肉からTNES-Urea法(Fisheries Sci.,62,723-726,19
96)に準じて行った。ただし今回は4M 尿素を使用した。
20μg/ml濃度のゲノムDNA溶液550μlを冷却しながら超
音波処理して(20 kHz, Amplitude 10、1分間、5回.)、D
NAを断片化した。10μg相当の基質DNA、30mM CH3COONa
(pH4.6)、50mM NaCl、1mM (CH3COO)2Zn、5% グリセロー
ルおよび60unitsのMung bean ヌクレアーゼ（東洋紡績
製）を含む52μlの反応液を、37℃、1時間インキュベー
トして、DNA断片のギャップ部分の切断と末端を平滑化
した。1.2%アガロースゲルで電気泳動を行って300-500b
p.に当たるDNA断片を回収した。回収した基質DNA、20μ
M dNTP、50mM Tris/HCl(pH8.5)、7mM MgCl2、15mM (N
H4) 2SO4、10mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM EDTAお
よび10unitsのT4 DNA ポリメラーゼ（東洋紡績製）を含
む100μlの反応液を、37℃、1時間インキュベートし
て、DNA断片の突出末端を平滑化した。さらに基質DNA、
0.2mMrATP、50mM Tris/HCl(pH7.6)、10mM MgCl2、10mM
2-メルカプトエタノールおよび10unitsのT4 ポリヌクレ
オチドキナーゼ（東洋紡績製）を含む50μlの反応液
を、37℃、1時間インキュベートして、DNA断片5'末端を
リン酸化した。 【００２３】（２）ゲノムDNA断片のプラスミドベクタ
ーへの連結 1μg相当のpCR-Script SK(+)ベクター（Stratagene
製)、25mM Tris/Acetate(pH7.6)、100mM KOAc、10mM Mg
OAc、0.5mM 2-メルカプトエタノール、10μg/ml BSAお
よび10unitsの制限酵素SrfI（Stratagene製）を含む10
μlの反応液を、37℃、1時間以上インキュベートして、
ベクターのSrfIサイトを切断した。調整したベクター溶
液と、3μg相当の基質DNA、10unitsのSrfI、0.5mMrAT
P、66mM Tris/HCl(pH7.6)、6.6mM MgCl2、10mM ジチオ
スレイトールおよび20unitsのT4 DNAリガーゼ（東洋紡
績製）を含む50μlの反応液を、24℃、一晩インキュベ
ートしてDNA断片をベクターへ連結した。65℃、15分間
加熱処理して、DNAリガーゼを失活させた後、SrfIをさ
らに10units加え、37℃、1時間インキュベートして、セ
ルフライゲーションしたベクターを消化した。 【００２４】（３）１本鎖DNA(1本鎖DNA)の調整 ５本の培養チューブに、XL2-Blue MRF' ultracompetent
cells (Epicurian coli ultracompetent cells,Strat
agene製)を100μlづつ入れ、各チューブに200ng相当の
ライゲーションしたベクターを加えて、添付解説書に従
って形質転換した。各チューブに900μlのNZY培地(Mani
atis:Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd e
d.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,19
89.)を加え、37℃、1時間振とう培養した後、アンピシ
リン（終濃度50μg/ml)を加え、更に37℃、1時間振とう
培養して、形質転換された大腸菌を選択した。各チュー
ブに1010pfu相当のVCS-M13 helper phageを加え、37
℃、20分間静置後、カナマイシン(終濃度70μg/ml)を加
えて37℃、1時間振とう培養して、ヘルパーファージが
感染した大腸菌を選択した。各培養液をまとめて、アン
ピシリンおよびカナマイシンを含む100mlのTerrific培
地(Maniatis:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,
2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New Y
ork,1989.)に入れ、37℃、14時間振とう培養した。培養
したTerrific培地を、0℃、14,000rpmで10分間遠心して
上澄みを回収し、45μmフィルターを用いた濾過を2回行
った。常法（村松正實:ラボマニュアル遺伝子工学,第3
版,丸善,東京,1996,pp.51-55.）に従ってPEG沈澱を2回
行った後、公知の方法(Jpn.Poult.Sci.,33,292.299,199
6)に従って大腸菌に由来するDNAとRNAを消化した。この
後、PEG沈澱、フェノール抽出、エタノール沈殿を行
い、１本鎖DNAを精製した。 【００２５】（４）(CA)ｎ陽性プラスミドの選別 (CA)12オリゴヌクレオチドを用いてプライマーエクステ
ンションを行い、(TG/CA)リピートを持つDNA断片が挿入
されたプラスミドDNAを選別した。3μg相当の１本鎖DN
A、0.2mM dNTP、20mM Tris/HCl(pH8.8)、10mM KCl、10m
M (NH4)2SO4、2mMMgSO4、100μg/ml BSA、0.1% Triton
X-100および100pmolの(CA)12オリゴヌクレオチドを含む
98μlの溶液を、72℃、10分間プレヒーティングした。
この溶液に5unitsのPfu DNA ポリメラーゼ（Stratagene
製）を加え、ミネラルオイルで重層し、72℃、30分間イ
ンキュベートした後、フェノール抽出、エタノール沈殿
を行って、生成した二本鎖DNAを回収し、10μlの滅菌水
に溶解した。ライゲーションキット(Ligation high、東
洋紡績製)を用いて二本鎖DNAを閉環させた後、加熱処理
(65℃、15分間)によってDNAリガーゼを失活させた。こ
の溶液と、30mM CH3COONa(pH4.6)、50mM NaCl、1mM (CH
3COO)2Zn、5% グリセロールおよび30unitsのMung bean
ヌクレアーゼを含む100μlの反応液を、37℃、２時間以
上インキュベートし、プライマーエクステンションされ
なかった1本鎖DNAを消化した。フェノール／クロロホル
ム抽出、エタノール沈殿によってDNAを回収し、60μlの
TE Bufferに溶解した。 【００２６】回収されたDNA(1本鎖DNA100ng相当)をXL2-
Blue MRF' Ultracompetent cellsへ形質転換した後、ア
ンピシリン50μg/mlを含む2×YT寒天培地(Maniatis: M
olecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold
Spring Harbor Laboratory Press,New York,1989.)に展
開し、37℃、一晩培養した。培養プレート上で、無作為
にシングルコロニーをピックアップし、アンピシリン
(終濃度50μg/ml）を含む2×YT培地(Maniatis: Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press,New York,1989.)2ml中で、
37℃、一晩振とう培養した後、常法（ラボマニュアル遺
伝子工学,第3版,丸善,東京,1996,pp. 51-55.）に従っ
て、アルカリ法によるプラスミド抽出を行い、50μlのT
E Bufferに溶解した。 【００２７】精製したプラスミドDNA(1本鎖DNA 4ng相
当)を0.5N NaOHでアルカリ変性し、ナイロンメンブレン
（No.1209299,Boehringer Mannheim)に浸透させ、120℃
で30分間ベークした。(CA)10オリゴヌクレオチドをDIG
オリゴヌクレオチド標識キット(DIG Oligonucleotide T
ailing Kit,Boehringer Mannheim、商品名)でジゴキシ
ゲニン標識したプローブと、DIG核酸検出キット(DIG Nu
cleic Acid Detection Kit, Boehringer Mannheim)を使
用して、指示書にしたがって(CA)n陽性クローンの検出
を行った。結果の一部を図１に示した。 【００２８】（５）サイクルシークエンス (CA)n陽性クローンについて、サイクルシ−クエンス法
を用いて、塩基配列を決定した。シークエンス反応に
は、5'末端をCy5ラベルしたKSプライマーおよびReverse
primerとシークエンスキット(ThermoSequence fluores
cent labeled primer cycle sequencing kit with 7-de
aza-dGPT,Amersham)を使用し、シークエンスには蛍光DN
Aシークエンサー(ALFexpress, Pharmacia)を使用した。
得られた塩基配列のデータから、プライマー設計ソフト
(Primer Premier, Premier Biosoft International製)
によって、CAリピートを挟む領域で、最適なプライマー
を設計した。以下に、単離したクロアワビのマイクロサ
テライト配列の塩基配列を示す。なお繰り返し単位がわ
かりやすいように、繰り返し単位を（）でまとめて記載
した。実際の塩基配列は配列表に記載したとおりである
（番号が配列番号に対応する）。1-24までの領域につい
ては、全てPCRのためのプライマーの設計が可能であ
り、このうち9の領域(1,3,8,10,13,15,16,19,24)につい
ては多型を確認することができた。 【００２９】1.(CA)41 2.(GACT)2(CTCA)7(CA)2CT(CA)9 3.C5CAC2(CA)12TA(CA)8 4.(CA)7 5.(CA)16 6.(GA)2CAGA(CA)5 7.CA3GA2C3A3(CA)5 8.(CGCA)9TGCAC2(CA)2 9.(CT)3(CA2)3(CA)5 10.(CA)25 11.CACT(CA)16TACA 12.CA3(CA)2T(CA)4 13.(CA)30 14.CA2GCA2C(CA)25 15.(CA)2CT(CA)13(CGCA)11(CA)6 16.(CA)8(CG)4 【００３０】 17.(CA)6(CG)4 18.(CA)5 19.(CA)26 20.TACATA(CA)12 21.(CA)2CA3(CA)6 22.(CA)2AC(CA)3AC(CAC)2(CA)5 23.(CA)8(TGCA)2 24.(CA)34 25.(CA)7(CGCA)2CGA2(CGCA)2A2(CA)2(CG)2 26.(CA)8 27.CAC8(CA)9C4 28.(CA)6(GA)2 29.(CA)26 30.(CA)25 31.CAG(CA)5TACA 32.(CA3)3(CA)4CA3(CA)12G2CA(CG2)3 【００３１】超音波を使って配列に依存しない切断方法
に基づいて作製した(TG/CA)n濃縮ライブラリー（48クロ
ーン）のうち、約85%（41クローン）が(CA)n陽性クロー
ンであった（図１）。このうち、無作為に選んだ32個の
(CA)n陽性クローンのシークエンスを行った結果、24ク
ローン(72%)でPCRプライマーの設計が可能であった。残
りの9クローンでは、リピート領域がベクターとの連結
点に隣接していること、リピートの途中でベクターと連
結していること、あるいはDNA断片中にリピートが散在
していることなどから、プライマーの設計は不可能であ
った。 【００３２】 【発明の効果】本発明によれば、マイクロサテライト配
列をはじめとするサテライト配列を効率的に単離するこ
とができる。本発明はゲノムの断片化に塩基配列に依存
しない切断方法を利用するので、塩基配列による影響を
受けず、偏りの無いライブラリーを得ることができる。
偏りの無いライブラリーから単離されたサテライト配列
には重複が少なく、効率的な単離を行えるのである。 【００３３】たとえばこれまでマイクロサテライト配列
が単離されていなかったクロアワビにおいて、１度の操
作で３２クローンからなる(TG/CA)n濃縮ライブラリーを
実現した。このライブラリーから得られたクローンには
重複が無く、本発明者らがニワトリで試みた方法で重複
が多かったことと比較すると、高度に効率化されている
ということができる。単に重複が少ないことのみなら
ず、単離されるクローンがPCR用のプライマーを設計し
うるものであることも特筆すべき効果である。たとえば
実施例に示した例では、計算上培養プレート上の60%以
上（0.85×24/32）のクローンからPCR用プライマーの設
計が可能である。これらの成績により、本発明に基づく
マイクロサテライト配列の単離方法は、汎用性を備えた
優れた方法であることが明らかである。 【００３４】 【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Research Institute of Agrobiological Resources <120> Methods for Isolation of satellite Sequence. <130> microsatellite <140> <141> <160> 32 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 82 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 1 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 60 cacacacaca cacacacaca ca 82 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 2 gactgactct cactcactca ctcactcact cactcacaca ctcacacaca cacacacaca 60 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 3 ccccccaccc acacacacac acacacacac acatacacac acacacacac a 51 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 4 cacacacaca caca 14 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 5 cacacacaca cacacacaca cacacacaca ca 32 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 6 gagacagaca cacacaca 18 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 7 caaagaaccc aaacacacac aca 23 <210> 8 <211> 46 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 8 cgcacgcacg cacgcacgca cgcacgcacg cacgcatgca cccaca 46 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 9 ctctctcaac aacaacacac acaca 25 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 10 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 50 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 11 cactcacaca cacacacaca cacacacaca cacataca 38 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 12 caaacacatc acacaca 17 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 13 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 60 <210> 14 <211> 58 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 14 caagcaacca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacaca 58 <211> 88 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 15 cacactcaca cacacacaca cacacacaca cacgcacgca cgcacgcacg cacgcacgca 60 cgcacgcacg cacgcacaca cacacaca 88 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 16 cacacacaca cacacacgcg cgcg 24 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 17 cacacacaca cacgcgcgcg 20 <210> 18 <211> 10 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 18 cacacacaca 10 <210> 19 <211> 52 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 19 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca ca 52 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 20 tacatacaca cacacacaca cacacacaca 30 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 21 cacacaaaca cacacacaca 20 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 22 cacaaccaca caaccaccac cacacacaca 30 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 23 cacacacaca cacacatgca tgca 24 <210> 24 <211> 68 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 24 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 60 cacacaca 68 <210> 25 <211> 44 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 25 cacacacaca cacacgcacg cacgaacgca cgcaaacaca cgcg 44 <210> 26 <211> 16 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 26 cacacacaca cacaca 16 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 27 cacccccccc cacacacaca cacacacacc cc 32 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 28 cacacacaca cagaga 16 <210> 29 <211> 52 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 29 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca ca 52 <210> 30 <211> 50 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 30 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 50 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 31 cagcacacac acataca 17 <210> 32 <211> 55 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 32 caaacaaaca aacacacaca caaacacaca cacacacaca cacacacagg cacggcggcg 60 g 61
【図面の簡単な説明】
【図１】マイクロサテライト配列特異プローブ（(CA)10
オリゴヌクレオチド）によるドットブロットアッセイの
結果を示す発色像。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年２月１日（１９９９．２．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】（１）次のステップａ）−ｂ）を含むサテ
ライト配列の単離方法であって、塩基配列に依存しない
方法に基づいてゲノムを切断するサテライト配列の単離
方法。 ａ）ゲノムをランダムに切断した断片を得る工程、およ
び ｂ）工程ａ）の断片から、サテライト配列を含む断片を
選択する工程、 （２）塩基配列に依存しない方法が、物理的な切断方
法、または酵素的な切断方法である（１のサテライト配
列の単離方法。 （３）物理的な切断方法が超音波処理である（２）のサ
テライト配列の単離方法。 （４）超音波処理によって断片化されたゲノムの切断面
を平滑末端とする請求項３のサテライト配列の単離方
法。 （５）前記平滑末端処理をMung beanヌクレアーゼ処理
およびT4DNAポリメラーゼ処理により実施する（４）の
サテライト配列の単離方法。 （６）酵素的な切断方法が、塩基配列に依存しないエン
ドヌクレアーゼによるものである（２）のサテライト配
列の単離方法。 （７）塩基配列に依存しないエンドヌクレアーゼが、DN
aseIである（６）のサテライト配列の単離方法。 （８）サテライト配列が、マイクロサテライト配列であ
る（１）のサテライト配列の単離方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明では、塩基配列に依存しな
いランダムな断片を与える切断方法に基づいてゲノムの
切断を行うことが重要な要件である。塩基配列に依存し
ない方法に基づくゲノムの切断とは、構造的な性質（す
なわち塩基配列）に依存せずDNAの切断を行うことを意
味する。したがって、塩基配列に依存してDNAを切断す
る化学的な反応や制限酵素による消化は、本発明におけ
る切断方法を構成しない。これらの作用による処理を加
えるゲノムは、公知の方法により調製することができ
る。すなわち、細胞をプロテアーゼで酵素的に分解し、
適当な溶媒でDNAを抽出する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】超音波処理等の物理的な作用によって切断
したゲノムは、ライゲーション効率が悪く、このままで
はベクターへの組み込みを能率的に行うことができな
い。そのため、望ましくは末端の平滑化を行う。本発明
においては、Mung beanヌクレアーゼ処理およびT4DNAポ
リメラーゼを利用した平滑末端処理が有用である。Mung
beanヌクレアーゼは１本鎖特異的エンドヌクレアーゼ
で、DNAの１本鎖部分を消化することによって平滑化を
達成する。更にT4DNAポリメラーゼの作用により平滑化
を確実にする。T4DNAポリメラーゼは、強力な3'→5'エ
クソヌクレアーゼ活性を持ち3'突出末端を消化するとと
もに、3'陥没末端に対しては相補鎖を合成することによ
って平滑末端を与える。ただT4DNAポリメラーゼは3'陥
没末端がリン酸基を持つ場合には平滑化できないので、
Mung beanヌクレアーゼの併用が望ましい。このとき、M
ung beanヌクレアーゼ処理は末端の平滑化とともに、超
音波処理によって生じた２本鎖DNAのギャップ部分を切
断する。その結果、目的の長さよりも短い断片を生じて
しまう可能性がある。短い断片を含まないライブラリー
を得るには、Mung beanヌクレアーゼ処理の後に目的の
長さの断片を分離するステップを設けると良い。アガロ
ース電気泳動やゲルろ過により、目的の長さの断片を分
離することができる。平滑末端処理したゲノムの断片
は、このままベクターへのライゲーションを行うことが
できる。あるいは、効率良くライゲーションを行うため
にその5'末端をリン酸化することもできる。リン酸化に
はT4ポリヌクレオチドキナーゼを利用する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２０】ファージから抽出した1本鎖プラスミドDNA
にサテライト配列特異プライマーをアニールさせてDNA
ポリメラーゼを作用させる。たとえば哺乳類のマイクロ
サテライト配列においては、(dA.dT)nの繰り返し配列が
一般的である（全ゲノムの0.3%）。またヒトでは、(dC
A.dTG)n、あるいは(dCT.dAG)nといった組み合わせも多
く見られる。こういった情報を元に、これらの配列に相
補的な塩基配列を持たせれば、サテライト配列にアニー
ルするプライマーを設計することができる。このときプ
ライマーの5'末端は、ライゲーションに備えて予めリン
酸化しておくと良い。マイクロサテライト配列を含むベ
クターは、この部分でプライマーを得て2本鎖合成が進
むが、プライマーがアニールしないベクターは1本鎖の
ままである。DNAポリメラーゼによる相補鎖合成の後に
ライゲーションを行って完全に2本鎖環状化し、Mung be
anヌクレアーゼ等によって1本鎖DNAを分解すればサテラ
イト配列を含むベクターが残る。これを回収して再び形
質転換し、クローニングを行うことができる。クローニ
ングされたサテライト配列を含むベクターを増殖させ、
DNAを回収してその配列を決定すれば、サテライト配列
の単離が完了する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】（２）ゲノムDNA断片のプラスミドベクタ
ーへの連結 1μg相当のpCR-Script SK(+)ベクター（Stratagene
製)、25mM Tris/Acetate(pH7.6)、100mM KOAc、10mM Mg
OAc、0.5mM 2-メルカプトエタノール、10μg/ml BSAお
よび10unitsの制限酵素SrfI（Stratagene製）を含む10
μlの反応液を、37℃、1時間以上インキュベートして、
ベクターのSrfIサイトを切断した。調製したベクター溶
液と、3μg相当の基質DNA、10unitsのSrfI、0.5mMrAT
P、66mM Tris/HCl(pH7.6)、6.6mM MgCl2、10mM ジチオ
スレイトールおよび20unitsのT4 DNAリガーゼ（東洋紡
績製）を含む50μlの反応液を、24℃、一晩インキュベ
ートしてDNA断片をベクターへ連結した。65℃、15分間
加熱処理して、DNAリガーゼを失活させた後、SrfIをさ
らに10units加え、37℃、1時間インキュベートして、セ
ルフライゲーションしたベクターを消化した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】（３）１本鎖DNA(1本鎖DNA)の調製 ５本の培養チューブに、XL2-Blue MRF' ultracompetent
cells (Epicurian coli ultracompetent cells,Strat
agene製)を100μlづつ入れ、各チューブに200ng相当の
ライゲーションしたベクターを加えて、添付解説書に従
って形質転換した。各チューブに900μlのNZY培地(Mani
atis:Molecular Cloning:ALaboratory Manual, 2nd e
d.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,19
89.)を加え、37℃、1時間振とう培養した後、アンピシ
リン（終濃度50μg/ml)を加え、更に37℃、1時間振とう
培養して、形質転換された大腸菌を選択した。各チュー
ブに101 0pfu相当のVCS-M13 helper phageを加え、37
℃、20分間静置後、カナマイシン(終濃度70μg/ml)を加
えて37℃、1時間振とう培養して、ヘルパーファージが
感染した大腸菌を選択した。各培養液をまとめて、アン
ピシリンおよびカナマイシンを含む100mlのTerrific培
地(Maniatis:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,
2nd ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,New Yo
rk,1989.)に入れ、37℃、14時間振とう培養した。培養
したTerrific培地を、0℃、14,000rpmで10分間遠心して
上澄みを回収し、45μmフィルターを用いた濾過を2回行
った。常法（村松正實:ラボマニュアル遺伝子工学,第3
版,丸善,東京,1996,pp.51-55.）に従ってPEG沈澱を2回
行った後、公知の方法(Jpn.Poult.Sci.,33,292.299,199
6)に従って大腸菌に由来するDNAとRNAを消化した。この
後、PEG沈澱、フェノール抽出、エタノール沈殿を行
い、１本鎖DNAを精製した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Research Institute of Agrobiological Resources <120> Methods for Isolation of satellite Sequence. <130> microsatellite <140> <141> <160> 32 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 82 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 1 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 60 cacacacaca cacacacaca ca 82 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 2 gactgactct cactcactca ctcactcact cactcacaca ctcacacaca cacacacaca 60 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 3 ccccccaccc acacacacac acacacacac acatacacac acacacacac a 51 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 4 cacacacaca caca 14 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 5 cacacacaca cacacacaca cacacacaca ca 32 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 6 gagacagaca cacacaca 18 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 7 caaagaaccc aaacacacac aca 23 <210> 8 <211> 46 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 8 cgcacgcacg cacgcacgca cgcacgcacg cacgcatgca cccaca 46 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 9 ctctctcaac aacaacacac acaca 25 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 10 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 50 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 11cactcacaca cacacacaca cacacacaca cacacataca 40 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 12 caaacacatc acacaca 17 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 13 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 60 <210> 14 <211> 58 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 14 caagcaacca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacaca 58 <210> 15 <211> 88 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 15 cacactcaca cacacacaca cacacacaca cacgcacgca cgcacgcacg cacgcacgca 60 cgcacgcacg cacgcacaca cacacaca 88 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 16 cacacacaca cacacacgcg cgcg 24 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 17 cacacacaca cacgcgcgcg 20 <210> 18 <211> 10 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 18 cacacacaca 10 <210> 19 <211> 52 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 19 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca ca 52 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 20 tacatacaca cacacacaca cacacacaca 30 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 21 cacacaaaca cacacacaca 20 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 22 cacaaccaca caaccaccac cacacacaca 30 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 23 cacacacaca cacacatgca tgca 24 <210> 24 <211> 68 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 24 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 60 cacacaca 68 <210> 25 <211> 44 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 25 cacacacaca cacacgcacg cacgaacgca cgcaaacaca cgcg 44 <210> 26 <211> 16 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 26 cacacacaca cacaca 16 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 27 cacccccccc cacacacaca cacacacacc cc 32 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 28 cacacacaca cagaga 16 <210> 29 <211> 52 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 29 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca ca 52 <210> 30 <211> 50 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 30 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 50 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 31 cagcacacac acataca 17 <210> 32 <211> 55 <212> DNA <213> Haliotis discus discus <400> 32 caaacaaaca aacacacaca caaacacaca cacacacaca cacacacagg cacggcggcg 60 g 61 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年９月２０日（１９９９．９．２
０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA03 CA09 CA20 DA06 EA04 HA12 HA19 4B063 QA01 QA12 QA13 QA20 QQ42 QQ57 QR08 QR14 QR22 QR25 QR33 QR56 QR62 QS03 QS16 QS25 QS34 QS39 QX02

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次のステップａ）−ｂ）を含むサテライ
    ト配列の単離方法であって、塩基配列に依存しない方法
    に基づいてゲノムを切断するサテライト配列の単離方
    法。 ａ）ゲノムをランダムに切断した断片を得る工程、およ
    び ｂ）工程ａ）の断片から、サテライト配列を含む断片を
    選択する工程、
  2. 【請求項２】塩基配列に依存しない方法が、物理的な切
    断方法、または酵素的な切断方法である請求項１のサテ
    ライト配列の単離方法。
  3. 【請求項３】物理的な切断方法が超音波処理である請求
    項２のサテライト配列の単離方法。
  4. 【請求項４】超音波処理によって断片化されたゲノムの
    切断面を平滑末端とする請求項３のサテライト配列の単
    離方法。
  5. 【請求項５】前記平滑末端処理をMung beanヌクレア-ゼ
    処理およびT4DNAポリメラーゼ処理により実施する請求
    項４のサテライト配列の単離方法。
  6. 【請求項６】酵素的な切断方法が、塩基配列に依存しな
    いエンドヌクレアーゼによるものである請求項２のサテ
    ライト配列の単離方法。
  7. 【請求項７】塩基配列に依存しないエンドヌクレアーゼ
    が、DNaseIである請求項６のサテライト配列の単離方
    法。
  8. 【請求項８】サテライト配列が、マイクロサテライト配
    列である請求項１のサテライト配列の単離方法。
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