JP2000046833A - アッセイ、受容体タンパク質ｎｙｋおよびリガンド - Google Patents
アッセイ、受容体タンパク質ｎｙｋおよびリガンドInfo
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＮＹＫ受容体の活性を調節することが出
来るリガンドを検出する方法を提供すること、および、
ＮＹＫ受容体タンパク質を大量調製することが本発明の
課題である。 【解決手段】 部位特異的突然変異誘発アプローチを用
いて、ＮＹＫ細胞外ドメイン- ＦＬＡＧTM融合タンパク
質を大量に精製した。この細胞外ドメインを用いること
により、ＮＹＫに対するリガンドの検出方法を開発し
た。
来るリガンドを検出する方法を提供すること、および、
ＮＹＫ受容体タンパク質を大量調製することが本発明の
課題である。 【解決手段】 部位特異的突然変異誘発アプローチを用
いて、ＮＹＫ細胞外ドメイン- ＦＬＡＧTM融合タンパク
質を大量に精製した。この細胞外ドメインを用いること
により、ＮＹＫに対するリガンドの検出方法を開発し
た。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、受容体タンパク質
ＮＹＫ受容体、該受容体の細胞外ドメインの大量調製、
およびアッセイにおける該受容体およびリガンドの検出
方法に関する。
ＮＹＫ受容体、該受容体の細胞外ドメインの大量調製、
およびアッセイにおける該受容体およびリガンドの検出
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】多細胞生物における細胞増殖および分化
は正確な協調および調節を要する。これを達成するため
に、特異的細胞表面受容体に対する、サイトカインおよ
び成長因子のごとき細胞外シグナリング分子の結合は、
主要なメカニズムを提供する。これらの受容体は細胞膜
を貫通し、それらが、それらの細胞内領域において固有
のタンパク質チロシンキナーゼドメインを有するか否か
によって分類される。チロシンキナーゼは、多くの細胞
内タンパク質におけるチロシン残基をリン酸化し、シグ
ナル伝達において重要なステップを提供する。固有のタ
ンパク質チロシンキナーゼを有する受容体は受容体チロ
シンキナーゼ（ＲＴＫ：成長因子受容体）として知られ
ている。
は正確な協調および調節を要する。これを達成するため
に、特異的細胞表面受容体に対する、サイトカインおよ
び成長因子のごとき細胞外シグナリング分子の結合は、
主要なメカニズムを提供する。これらの受容体は細胞膜
を貫通し、それらが、それらの細胞内領域において固有
のタンパク質チロシンキナーゼドメインを有するか否か
によって分類される。チロシンキナーゼは、多くの細胞
内タンパク質におけるチロシン残基をリン酸化し、シグ
ナル伝達において重要なステップを提供する。固有のタ
ンパク質チロシンキナーゼを有する受容体は受容体チロ
シンキナーゼ（ＲＴＫ：成長因子受容体）として知られ
ている。
【０００３】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の出現に
伴い、該ファミリーの多くの新規なメンバーが、それら
の触媒ドメイン内の高度に保存された構造要素を介して
同定されている。これらの受容体は共通の細胞質タンパ
ク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）ドメインを有するもの
の、それらは、それらの細胞外ドメインにおいて区別さ
れる構造要素を有する。これらの構造要素は、ＲＴＫ類
を所与のサブファミリーに分類したり、ＲＴＫファミリ
ー内に存在する構造多様性を証明するのに使用できる
（ユルリッチ(Ullrich) およびシュレシンガー(Schlesi
nger), 1990)。
伴い、該ファミリーの多くの新規なメンバーが、それら
の触媒ドメイン内の高度に保存された構造要素を介して
同定されている。これらの受容体は共通の細胞質タンパ
ク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）ドメインを有するもの
の、それらは、それらの細胞外ドメインにおいて区別さ
れる構造要素を有する。これらの構造要素は、ＲＴＫ類
を所与のサブファミリーに分類したり、ＲＴＫファミリ
ー内に存在する構造多様性を証明するのに使用できる
（ユルリッチ(Ullrich) およびシュレシンガー(Schlesi
nger), 1990)。
【０００４】ＰＣＲをベースとした技術を用いて単離さ
れた、各々ＮＹＫ（ＶＥＧＦＲ２）、ｔｉｅ２（ｔｅ
ｋ）およびＲＹＫと命名された３種のＲＴＫ類が研究さ
れている（ウィルクス(Wilks),1989）。これらの受容体
の細胞外ドメインは、ＲＴＫ類で見い出されている構造
特徴の異なった配列を示し、３つの区別されるサブ−フ
ァミリーに分類されている。胎児肝臓キナーゼ（ｆｌｋ
−１）または血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ
２）とも呼ばれている神経上皮チロシンキナーゼ（ＮＹ
Ｋ）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および恐らくは
１つの他の因子に対する受容体であり、７つのＩｇ−様
細胞外ドメインを持つクラスＩＩＩ ＲＴＫである（エ
ールリッヒス(Oelrichs)他，1993; ターマン(Terman)
他，1992）。ｔｉｅ２は、その細胞外領域が、２つのＩ
ｇ−様ドメイン、３つのＥＧＦ反復および３つのフィブ
ロネクチンＩＩＩ型反復の配列よりなるＲＴＫ類の１つ
のファミリーに属する（ランティング(Runting) 他，19
93）。ＲＹＫは、いわゆるロイシンリッチ反復を持つオ
ーファン受容体であるが、いずれの他の同定可能な構造
的モチーフも欠いている（ホーヴェンス(Hovens)他，19
92; ポール(Paul)他，1992; スタッカー(Stacker) 他，
1993）。
れた、各々ＮＹＫ（ＶＥＧＦＲ２）、ｔｉｅ２（ｔｅ
ｋ）およびＲＹＫと命名された３種のＲＴＫ類が研究さ
れている（ウィルクス(Wilks),1989）。これらの受容体
の細胞外ドメインは、ＲＴＫ類で見い出されている構造
特徴の異なった配列を示し、３つの区別されるサブ−フ
ァミリーに分類されている。胎児肝臓キナーゼ（ｆｌｋ
−１）または血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ
２）とも呼ばれている神経上皮チロシンキナーゼ（ＮＹ
Ｋ）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および恐らくは
１つの他の因子に対する受容体であり、７つのＩｇ−様
細胞外ドメインを持つクラスＩＩＩ ＲＴＫである（エ
ールリッヒス(Oelrichs)他，1993; ターマン(Terman)
他，1992）。ｔｉｅ２は、その細胞外領域が、２つのＩ
ｇ−様ドメイン、３つのＥＧＦ反復および３つのフィブ
ロネクチンＩＩＩ型反復の配列よりなるＲＴＫ類の１つ
のファミリーに属する（ランティング(Runting) 他，19
93）。ＲＹＫは、いわゆるロイシンリッチ反復を持つオ
ーファン受容体であるが、いずれの他の同定可能な構造
的モチーフも欠いている（ホーヴェンス(Hovens)他，19
92; ポール(Paul)他，1992; スタッカー(Stacker) 他，
1993）。
【０００５】血管の細胞内層（内皮）は血液と組織との
間の重要な界面である。組織または器官がそれ自体に血
液供給する必要がある場合、血管発育の新しい波（血管
新生）が起こらなければならず；これは、内皮細胞の分
裂および成長を要する。血管発育を補給できる公知のタ
ンパク質のうち、１つの特定の成長因子、血管内皮増殖
因子（ＶＥＧＦ）は、血管新生の間における内皮細胞の
分裂に対する最も重要な刺激剤の証明可能なものの１つ
である。有意な血管新生は、成人では、 ａ）月経周期の間に離脱され再確立された女性の子宮の
内膜、 ｂ）胚の着床および発達、 ｃ）創傷後の組織再構築、 ｄ）腫瘍血管新生として知られているプロセスである、
腫瘍の確立の間に補給された血管、および ｅ）盲目に導く糖尿病の主要合併症である、糖尿病網膜
症のごとき、特定の状況においてのみ起こる。
間の重要な界面である。組織または器官がそれ自体に血
液供給する必要がある場合、血管発育の新しい波（血管
新生）が起こらなければならず；これは、内皮細胞の分
裂および成長を要する。血管発育を補給できる公知のタ
ンパク質のうち、１つの特定の成長因子、血管内皮増殖
因子（ＶＥＧＦ）は、血管新生の間における内皮細胞の
分裂に対する最も重要な刺激剤の証明可能なものの１つ
である。有意な血管新生は、成人では、 ａ）月経周期の間に離脱され再確立された女性の子宮の
内膜、 ｂ）胚の着床および発達、 ｃ）創傷後の組織再構築、 ｄ）腫瘍血管新生として知られているプロセスである、
腫瘍の確立の間に補給された血管、および ｅ）盲目に導く糖尿病の主要合併症である、糖尿病網膜
症のごとき、特定の状況においてのみ起こる。
【０００６】腫瘍は実質的脈管構造なくしてはそれ自体
確立できないので、腫瘍血管新生のプロセスは抗癌剤薬
剤の開発につき標的とされてきた。事実、腫瘍血管新生
のプロセスは、すべての転移性腫瘍が共通に有する１つ
のものである。しかしながら、成人における正常内皮細
胞の代謝回転速度はかなり短く、１２−１８月である。
かくして、抗−血管新生薬物はいずれの腫瘍療法に対し
ても重要な補助剤となろう。
確立できないので、腫瘍血管新生のプロセスは抗癌剤薬
剤の開発につき標的とされてきた。事実、腫瘍血管新生
のプロセスは、すべての転移性腫瘍が共通に有する１つ
のものである。しかしながら、成人における正常内皮細
胞の代謝回転速度はかなり短く、１２−１８月である。
かくして、抗−血管新生薬物はいずれの腫瘍療法に対し
ても重要な補助剤となろう。
【０００７】ＶＥＧＦに対する少なくとも２つの受容体
が血管新生に関与しているが、ＮＹＫが主要なシグナリ
ング受容体であると考えられている。かくして、該受容
体に結合してＶＥＧＦの活性を阻害できる化合物は、広
範囲の治療適用を有するであろう。血管新生は実質的に
前記した状況にのみ関与するので、かかる阻害剤は通常
の医薬よりも主要な副作用を引き起こさないであろう。
血管新生を阻害することが知られているいくつかの薬剤
があるが、これらの公知阻害剤は、異なる受容体に対し
て、あるいは異なる経路を介して作用する。阻害剤と非
阻害剤とを区別するために、およびＶＥＧＦ受容体の阻
害の特異性を証明するために、成長因子ＶＥＧＦおよび
その受容体ＶＥＧＦＲ２（ＮＹＫ）に基づくイン・ビト
ロアッセイ系が開発されてきており、それらは、これら
の２つの分子の相互作用の阻害剤を検出することを目的
とする。これらの系に対しては、２つの用途があり；ま
ず、ＶＥＧＦとその受容体との間の相互作用の部位を確
立することで、このプロセスのアゴニストまたは阻害剤
として作用するであろう薬物の合理的設計を可能とする
のに良好のものであり；第２に、天然産物スクリーニン
グとしてのものであり、ここに、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ
２相互作用の阻害は個々の天然源における阻害剤の存在
に対しての証拠となろう。
が血管新生に関与しているが、ＮＹＫが主要なシグナリ
ング受容体であると考えられている。かくして、該受容
体に結合してＶＥＧＦの活性を阻害できる化合物は、広
範囲の治療適用を有するであろう。血管新生は実質的に
前記した状況にのみ関与するので、かかる阻害剤は通常
の医薬よりも主要な副作用を引き起こさないであろう。
血管新生を阻害することが知られているいくつかの薬剤
があるが、これらの公知阻害剤は、異なる受容体に対し
て、あるいは異なる経路を介して作用する。阻害剤と非
阻害剤とを区別するために、およびＶＥＧＦ受容体の阻
害の特異性を証明するために、成長因子ＶＥＧＦおよび
その受容体ＶＥＧＦＲ２（ＮＹＫ）に基づくイン・ビト
ロアッセイ系が開発されてきており、それらは、これら
の２つの分子の相互作用の阻害剤を検出することを目的
とする。これらの系に対しては、２つの用途があり；ま
ず、ＶＥＧＦとその受容体との間の相互作用の部位を確
立することで、このプロセスのアゴニストまたは阻害剤
として作用するであろう薬物の合理的設計を可能とする
のに良好のものであり；第２に、天然産物スクリーニン
グとしてのものであり、ここに、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ
２相互作用の阻害は個々の天然源における阻害剤の存在
に対しての証拠となろう。
【０００８】本発明の方法は、ＮＹＫタンパク質の単離
された細胞外ドメインを利用する。単離された細胞外ド
メインの生産についての特に便宜な方法を記載する。し
かしながら、本発明は他の方法によって生産された単離
ＮＹＫ細胞外ドメインを使用できることは明らかに理解
されるであろう。単離細胞外ドメインを生産するための
本明細書に記載する方法は便利で、大量のタンパク質の
生産を可能とする。受容体は、通常、非常に少量しか存
在しない。よって、我々の方法は、注目する相互作用性
リガンドを検出するためのアフィニティー試薬として作
用し、また、抗体の産生の免疫原としても作用する、こ
れらの受容体の細胞外ドメインを特定する組換えタンパ
ク質の生産を可能とする。受容体の細胞外ドメインを発
現する場合の主要な考慮のうちの１つは、種々の構造モ
チーフが正確なコンフォメーションでフォールディング
されることを保証することである。フォールディングさ
れた受容体を認識するモノクローナル抗体が発現された
タンパク質の精製のために利用できれば、細胞外ドメイ
ン／膜貫通境界にインーフレームにて停止コドンを単に
導入するような技術を効果的に使用できる。
された細胞外ドメインを利用する。単離された細胞外ド
メインの生産についての特に便宜な方法を記載する。し
かしながら、本発明は他の方法によって生産された単離
ＮＹＫ細胞外ドメインを使用できることは明らかに理解
されるであろう。単離細胞外ドメインを生産するための
本明細書に記載する方法は便利で、大量のタンパク質の
生産を可能とする。受容体は、通常、非常に少量しか存
在しない。よって、我々の方法は、注目する相互作用性
リガンドを検出するためのアフィニティー試薬として作
用し、また、抗体の産生の免疫原としても作用する、こ
れらの受容体の細胞外ドメインを特定する組換えタンパ
ク質の生産を可能とする。受容体の細胞外ドメインを発
現する場合の主要な考慮のうちの１つは、種々の構造モ
チーフが正確なコンフォメーションでフォールディング
されることを保証することである。フォールディングさ
れた受容体を認識するモノクローナル抗体が発現された
タンパク質の精製のために利用できれば、細胞外ドメイ
ン／膜貫通境界にインーフレームにて停止コドンを単に
導入するような技術を効果的に使用できる。
【０００９】しかしながら、最近、ＰＣＲクローニング
の出現は、いずれかのタンパク質データまたはモノクロ
ーナル抗体が利用できるかなり前に、完全なｃＤＮＡ配
列がしばしば得られることを意味する。これは、アルカ
リ性ホスファターゼ（フラナガン(Flanagan)およびレー
ダー(Leder),1990) 、免疫グロブリンのＦｃ領域（フラ
ンスロー(Franslow)他，1992）、グルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ（スミス(Smith) およびジョンソン(J
ohnson),1988) 、ならびにＦＬＡＧTM（米国特許第４，
７０３，００４号；ホップ(Hopp)他，1992）およびＨｉ
ｓ−Ｔａｇ（商標名）、Ｔ７−ＴａｇTM、ＨＳＶ−Ｔａ
ｇTMおよびＳ−Ｔａｇ（ノヴァーゲン(Novagen) ）のご
とき合成ペプチドのような、注目するタンパク質に連結
でき、それに対するアフィニティー試薬が利用できるマ
ーカーペプチドまたはポリペプチドの使用によって計画
できる。特に、バイオセンサーでのリガンドについての
スクリーニングのごとき適用において、これらのマーカ
ーのうちいくつかは、それらはそれら自身の結合特異性
を有し（例えば、Ｆｃ領域）、ドメインのフォールディ
ングを阻害する可能性を有し、あるいは可能なリガンド
結合部位を立体的に妨げ得るという不利な点を有する。
加えて、これらのマーカーのうちいくつかは、原核生物
発現系でのみ開発されており、それは複雑な受容体発現
には、翻訳後修飾がその活性のために必要であるために
不適当であろう。
の出現は、いずれかのタンパク質データまたはモノクロ
ーナル抗体が利用できるかなり前に、完全なｃＤＮＡ配
列がしばしば得られることを意味する。これは、アルカ
リ性ホスファターゼ（フラナガン(Flanagan)およびレー
ダー(Leder),1990) 、免疫グロブリンのＦｃ領域（フラ
ンスロー(Franslow)他，1992）、グルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ（スミス(Smith) およびジョンソン(J
ohnson),1988) 、ならびにＦＬＡＧTM（米国特許第４，
７０３，００４号；ホップ(Hopp)他，1992）およびＨｉ
ｓ−Ｔａｇ（商標名）、Ｔ７−ＴａｇTM、ＨＳＶ−Ｔａ
ｇTMおよびＳ−Ｔａｇ（ノヴァーゲン(Novagen) ）のご
とき合成ペプチドのような、注目するタンパク質に連結
でき、それに対するアフィニティー試薬が利用できるマ
ーカーペプチドまたはポリペプチドの使用によって計画
できる。特に、バイオセンサーでのリガンドについての
スクリーニングのごとき適用において、これらのマーカ
ーのうちいくつかは、それらはそれら自身の結合特異性
を有し（例えば、Ｆｃ領域）、ドメインのフォールディ
ングを阻害する可能性を有し、あるいは可能なリガンド
結合部位を立体的に妨げ得るという不利な点を有する。
加えて、これらのマーカーのうちいくつかは、原核生物
発現系でのみ開発されており、それは複雑な受容体発現
には、翻訳後修飾がその活性のために必要であるために
不適当であろう。
【００１０】ＦＬＡＧTMペプチド系は、元来、組換え細
菌タンパク質に対するＮ−末端マーカーとして記載され
てきた。それは、天然では親水性である、８つのアミノ
酸の小さい水溶性ペプチドであり、それに対して、一連
のモノクローナル抗体が作成されており、これらは商業
的に入手可能である。該ペプチドは、融合タンパク質の
外側に位置づけられるように設計され、そのサイズのた
め、実験すべきタンパク質のフォールディングに対して
最小の阻害しか供しない（ホップ（Hopp）他,1992)。今
日、ＦＬＡＧTMマーカーに関する研究の大部分は、細菌
発現系（ホップ(Hopp)他，1992; リー(Li)他，1992; ス
ー(Su)他，1992; ザン(Zhang) 他，1991）を使用してい
る。しかし、１つの最近の研究は哺乳動物発現系（ジェ
ラルド(Gerard)およびジェラルド(Gerard), 1990）を使
用している。
菌タンパク質に対するＮ−末端マーカーとして記載され
てきた。それは、天然では親水性である、８つのアミノ
酸の小さい水溶性ペプチドであり、それに対して、一連
のモノクローナル抗体が作成されており、これらは商業
的に入手可能である。該ペプチドは、融合タンパク質の
外側に位置づけられるように設計され、そのサイズのた
め、実験すべきタンパク質のフォールディングに対して
最小の阻害しか供しない（ホップ（Hopp）他,1992)。今
日、ＦＬＡＧTMマーカーに関する研究の大部分は、細菌
発現系（ホップ(Hopp)他，1992; リー(Li)他，1992; ス
ー(Su)他，1992; ザン(Zhang) 他，1991）を使用してい
る。しかし、１つの最近の研究は哺乳動物発現系（ジェ
ラルド(Gerard)およびジェラルド(Gerard), 1990）を使
用している。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】前記にて概説した問題
のいくつかを緩和する技術を提供することが本発明の目
的である。
のいくつかを緩和する技術を提供することが本発明の目
的である。
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
第１の態様において、本発明は、受容体タンパク質ＮＹ
Ｋ、その誘導体またはその機能的同等体を、推定リガン
ドに、前記推定リガンドと前記受容体、その誘導体また
はその機能的同等体との結合を可能とするのに適した条
件下で接触させ、ついで、結合が起こったか否かを測定
することを特徴とする受容体タンパク質ＮＹＫに結合で
きるリガンドを検出する方法を提供する。
第１の態様において、本発明は、受容体タンパク質ＮＹ
Ｋ、その誘導体またはその機能的同等体を、推定リガン
ドに、前記推定リガンドと前記受容体、その誘導体また
はその機能的同等体との結合を可能とするのに適した条
件下で接触させ、ついで、結合が起こったか否かを測定
することを特徴とする受容体タンパク質ＮＹＫに結合で
きるリガンドを検出する方法を提供する。
【００１３】該推定リガンドは、天然または合成起源を
問わず、ＮＹＫに結合できることが考えられるいずれの
分子であってもよい。合成分子の場合には、これらは、
組合せライブラリーのものを含めたいずれの合成分子で
あってもよい。天然分子の場合には、本発明は、雨林植
物抽出物およびサンゴおよび他の海洋生物のごとき海洋
生物からの抽出物に存在する化合物をスクリーニングす
るのに特に適した方法を提供する。また、該方法は、他
の水系および陸系生態からの植物および動物に由来する
化合物をスクリーニングするのにも使用できる。さら
に、本発明の該方法を最初に用いて、比較的未精製の組
成物または抽出物をスクリーニングすることもでき、か
くして、試料中の１以上の推定リガンドを検出する方法
まで拡張される。かかる場合には、１以上のリガンドを
含有することが考えられる試料を受容体タンパク質ＮＹ
Ｋまたはその誘導体もしくはその機能的同等体と接触さ
せる。該試料は前記した源からのものであってよいのみ
ならず、腫瘍組織試料、血清試料等を含めた、患者から
の組織試料のごとき生物起源からの試料も含む。
問わず、ＮＹＫに結合できることが考えられるいずれの
分子であってもよい。合成分子の場合には、これらは、
組合せライブラリーのものを含めたいずれの合成分子で
あってもよい。天然分子の場合には、本発明は、雨林植
物抽出物およびサンゴおよび他の海洋生物のごとき海洋
生物からの抽出物に存在する化合物をスクリーニングす
るのに特に適した方法を提供する。また、該方法は、他
の水系および陸系生態からの植物および動物に由来する
化合物をスクリーニングするのにも使用できる。さら
に、本発明の該方法を最初に用いて、比較的未精製の組
成物または抽出物をスクリーニングすることもでき、か
くして、試料中の１以上の推定リガンドを検出する方法
まで拡張される。かかる場合には、１以上のリガンドを
含有することが考えられる試料を受容体タンパク質ＮＹ
Ｋまたはその誘導体もしくはその機能的同等体と接触さ
せる。該試料は前記した源からのものであってよいのみ
ならず、腫瘍組織試料、血清試料等を含めた、患者から
の組織試料のごとき生物起源からの試料も含む。
【００１４】「受容体タンパク質ＮＹＫ、その誘導体ま
たはその機能的同等体」なる語は、その対立遺伝子変異
体を含めた天然に生じるＮＹＫタンパク質、修飾された
天然ＮＹＫ、および合成ＮＹＫをいう。機能的同等体な
る語は、特に、ＮＹＫ受容体機能を保有するタンパク質
をいう。天然ＮＹＫの修飾は、天然分子を切断して、受
容体機能を有する細胞外部分を得ることを含む。合成に
より生成されたＮＹＫも考えられ、これは、例えばペプ
チド合成により生産されたＮＹＫを含む。同様に、組換
えＮＹＫが該用語の範囲内に含まれ、これは、受容体活
性を保有する融合タンパク質を含めた組換えにより生産
されたＮＹＫをいう。また、該用語はまた、細胞表面に
発現されるＮＹＫおよびその誘導体または機能的同等体
まで拡張される。好ましくは、かかるＮＹＫおよびその
誘導体または機能的同等体は該細胞に存在する組換えベ
クターによってコードされる。
たはその機能的同等体」なる語は、その対立遺伝子変異
体を含めた天然に生じるＮＹＫタンパク質、修飾された
天然ＮＹＫ、および合成ＮＹＫをいう。機能的同等体な
る語は、特に、ＮＹＫ受容体機能を保有するタンパク質
をいう。天然ＮＹＫの修飾は、天然分子を切断して、受
容体機能を有する細胞外部分を得ることを含む。合成に
より生成されたＮＹＫも考えられ、これは、例えばペプ
チド合成により生産されたＮＹＫを含む。同様に、組換
えＮＹＫが該用語の範囲内に含まれ、これは、受容体活
性を保有する融合タンパク質を含めた組換えにより生産
されたＮＹＫをいう。また、該用語はまた、細胞表面に
発現されるＮＹＫおよびその誘導体または機能的同等体
まで拡張される。好ましくは、かかるＮＹＫおよびその
誘導体または機能的同等体は該細胞に存在する組換えベ
クターによってコードされる。
【００１５】「前記推定リガンドと前記受容体、その誘
導体またはその機能的同等体との結合を可能とするのに
適した条件下」という用語は、適当な時間、適当なｐ
Ｈ、温度および当業者に知られた他のパラメーターのよ
うなパラメーターを含む。結合はいずれの便利な手段に
よっても測定できる。例えば、結合につきテストすべき
ＮＹＫ、そのＮＹＫ誘導体またはその機能的同等体、ま
たは推定リガンドは、放射性標識、蛍光標識、または酵
素反応により検出可能なマーカーのような検出可能なマ
ーカーで標識できる。別法として、イン・ビトロバイオ
アッセイを用いて、結合により誘導された機能をモニタ
ーすることもできる。多くの適当な検出システムが当該
分野で知られている。かくして、本発明で使用するのに
適したアッセイ系は、限定されるものではないが、固相
酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）のごときイムノアッセ
イ；被覆されたマイクロタイタープレートまたはスライ
ドを用いるものまたはアフィニティークロマトグラフィ
ーのようなアフィニティー型のアッセイ；蛍光−活性化
細胞ソーティング；バイオセンサーアッセイ；およびバ
イオアッセイを含む。結合の検出に加えて、結合の程度
を前記した１以上の技術によって測定することもでき
る。
導体またはその機能的同等体との結合を可能とするのに
適した条件下」という用語は、適当な時間、適当なｐ
Ｈ、温度および当業者に知られた他のパラメーターのよ
うなパラメーターを含む。結合はいずれの便利な手段に
よっても測定できる。例えば、結合につきテストすべき
ＮＹＫ、そのＮＹＫ誘導体またはその機能的同等体、ま
たは推定リガンドは、放射性標識、蛍光標識、または酵
素反応により検出可能なマーカーのような検出可能なマ
ーカーで標識できる。別法として、イン・ビトロバイオ
アッセイを用いて、結合により誘導された機能をモニタ
ーすることもできる。多くの適当な検出システムが当該
分野で知られている。かくして、本発明で使用するのに
適したアッセイ系は、限定されるものではないが、固相
酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）のごときイムノアッセ
イ；被覆されたマイクロタイタープレートまたはスライ
ドを用いるものまたはアフィニティークロマトグラフィ
ーのようなアフィニティー型のアッセイ；蛍光−活性化
細胞ソーティング；バイオセンサーアッセイ；およびバ
イオアッセイを含む。結合の検出に加えて、結合の程度
を前記した１以上の技術によって測定することもでき
る。
【００１６】第２の態様において、本発明は、受容体タ
ンパク質ＮＹＫ、その誘導体またはその機能的同等体を
リガンドを含有することと考えられる生物学的試料と、
試料中の前記リガンドのいずれかの前記受容体への結合
を可能とするのに適した条件下で接触させ、ついで、結
合が起こったか否かを測定することを特徴とする生物学
的試料中の受容体タンパク質ＮＹＫのリガンドを検出す
る方法を提供する。
ンパク質ＮＹＫ、その誘導体またはその機能的同等体を
リガンドを含有することと考えられる生物学的試料と、
試料中の前記リガンドのいずれかの前記受容体への結合
を可能とするのに適した条件下で接触させ、ついで、結
合が起こったか否かを測定することを特徴とする生物学
的試料中の受容体タンパク質ＮＹＫのリガンドを検出す
る方法を提供する。
【００１７】該生物学的試料は、ＮＹＫのリガンドを含
有することが考えられるいずれの生物学的試料であって
もよく、特に、腹水、血清、血液および腫瘍等のような
固体組織のごときＶＥＧＦを含有することが考えられる
いずれの試料であってもよい。ＶＥＧＦの検出は、この
分子が腫瘍および糖尿病網膜症のマーカーであるので重
要である。「受容体タンパク質ＮＹＫ、その誘導体また
はその機能的同等体」および「結合を可能とするのに適
した条件下」は前記と同一の意味を有する。結合は前記
のいずれの便利な手段によっても測定できる。また、本
発明の方法は、ＮＹＫリガンドのＮＹＫへの結合を阻害
できる薬剤の検出まで拡張される。
有することが考えられるいずれの生物学的試料であって
もよく、特に、腹水、血清、血液および腫瘍等のような
固体組織のごときＶＥＧＦを含有することが考えられる
いずれの試料であってもよい。ＶＥＧＦの検出は、この
分子が腫瘍および糖尿病網膜症のマーカーであるので重
要である。「受容体タンパク質ＮＹＫ、その誘導体また
はその機能的同等体」および「結合を可能とするのに適
した条件下」は前記と同一の意味を有する。結合は前記
のいずれの便利な手段によっても測定できる。また、本
発明の方法は、ＮＹＫリガンドのＮＹＫへの結合を阻害
できる薬剤の検出まで拡張される。
【００１８】従って、第３の態様において、本発明は、
受容体タンパク質ＮＹＫとそのリガンドとの相互作用を
阻害すると考えられる分子を、（Ｉ）受容体タンパク質
ＮＹＫ、その誘導体またはその機能的同等体、および
（ＩＩ）受容体タンパク質ＮＹＫの既知のリガンドと、
前記ＮＹＫ、その誘導体またはその機能的同等体の前記
既知のリガンドへの結合を可能とするのに適した条件下
で接触させ、ついで、結合が起こったか否かを測定する
ことを特徴とする受容体タンパク質ＮＹＫおよびそのリ
ガンドの相互作用を阻害できる分子を検出する方法を提
供する。ＮＹＫとそのリガンドとの間の相互作用のイン
・ビボでの阻害の結果、血管新生の阻害または血管透過
性の阻害が起こり得る。「受容体タンパク質ＮＹＫ、そ
の誘導体またはその機能的同等体」および「結合を可能
とするのに適した条件下」は前記と同一の意味を有す
る。
受容体タンパク質ＮＹＫとそのリガンドとの相互作用を
阻害すると考えられる分子を、（Ｉ）受容体タンパク質
ＮＹＫ、その誘導体またはその機能的同等体、および
（ＩＩ）受容体タンパク質ＮＹＫの既知のリガンドと、
前記ＮＹＫ、その誘導体またはその機能的同等体の前記
既知のリガンドへの結合を可能とするのに適した条件下
で接触させ、ついで、結合が起こったか否かを測定する
ことを特徴とする受容体タンパク質ＮＹＫおよびそのリ
ガンドの相互作用を阻害できる分子を検出する方法を提
供する。ＮＹＫとそのリガンドとの間の相互作用のイン
・ビボでの阻害の結果、血管新生の阻害または血管透過
性の阻害が起こり得る。「受容体タンパク質ＮＹＫ、そ
の誘導体またはその機能的同等体」および「結合を可能
とするのに適した条件下」は前記と同一の意味を有す
る。
【００１９】ＮＹＫリガンド相互作用の阻害剤であると
考えられる分子は、この相互作用のアンタゴニストであ
り得るいずれの分子であってもよい。かかる分子は、前
記したごとき天然または合成源に由来するものであって
よい。該方法はＮＹＫアンタゴニストにつき植物および
動物抽出物をスクリーニングするのに特に有用である。
阻害剤であると考えられる分子はＮＹＫタンパク質のい
ずれの領域に結合する分子であってよく、受容体機能を
有するタンパク質の受容体部位には必ずしも結合しない
分子であり得ることに注意するのは重要である。受容体
機能を間接的に阻害するいずれの分子も本発明の方法に
よって検出できる。かくして、ＮＹＫタンパク質、その
同等体または誘導体の性質は、本発明の方法によって同
定される阻害剤のタイプをある程度決定するであろう。
結合の測定は、前記した方法によって行うことができ
る。好ましくは、本発明で用いるＮＹＫの既知のリガン
ドは抗体、ＶＥＧＦおよびその突然変異体のいずれかで
ある。好ましくは、本発明の方法で用いるＮＹＫ誘導体
はＮＹＫの細胞外領域よりなり、より好ましくは融合タ
ンパク質の形態からなる。
考えられる分子は、この相互作用のアンタゴニストであ
り得るいずれの分子であってもよい。かかる分子は、前
記したごとき天然または合成源に由来するものであって
よい。該方法はＮＹＫアンタゴニストにつき植物および
動物抽出物をスクリーニングするのに特に有用である。
阻害剤であると考えられる分子はＮＹＫタンパク質のい
ずれの領域に結合する分子であってよく、受容体機能を
有するタンパク質の受容体部位には必ずしも結合しない
分子であり得ることに注意するのは重要である。受容体
機能を間接的に阻害するいずれの分子も本発明の方法に
よって検出できる。かくして、ＮＹＫタンパク質、その
同等体または誘導体の性質は、本発明の方法によって同
定される阻害剤のタイプをある程度決定するであろう。
結合の測定は、前記した方法によって行うことができ
る。好ましくは、本発明で用いるＮＹＫの既知のリガン
ドは抗体、ＶＥＧＦおよびその突然変異体のいずれかで
ある。好ましくは、本発明の方法で用いるＮＹＫ誘導体
はＮＹＫの細胞外領域よりなり、より好ましくは融合タ
ンパク質の形態からなる。
【００２０】第４の態様において、本発明は、ＮＹＫの
天然のリガンドと比較して、受容体タンパク質ＮＹＫの
活性を刺激する増大した能力を有する分子を検出する方
法であって、（Ｉ）前記増大した能力を有すると考えら
れる分子を、受容体タンパク質ＮＹＫ、その誘導体また
はその機能的同等体と、前記ＮＹＫ、その誘導体または
その機能的同等体と前記分子との結合を可能とするのに
適した条件下で接触させ、（ＩＩ）結合が起こったか否
かを測定し、ついで、（ＩＩＩ）（Ｉ）に記載の受容体
タンパク質ＮＹＫ、その誘導体またはその機能的同等体
と、ＮＹＫの天然リガンドとを適当な条件下で接触させ
ることからなる対照における結合の量と、（ＩＩ）に記
載の前記測定を比較すること、からなる検出方法を提供
する。
天然のリガンドと比較して、受容体タンパク質ＮＹＫの
活性を刺激する増大した能力を有する分子を検出する方
法であって、（Ｉ）前記増大した能力を有すると考えら
れる分子を、受容体タンパク質ＮＹＫ、その誘導体また
はその機能的同等体と、前記ＮＹＫ、その誘導体または
その機能的同等体と前記分子との結合を可能とするのに
適した条件下で接触させ、（ＩＩ）結合が起こったか否
かを測定し、ついで、（ＩＩＩ）（Ｉ）に記載の受容体
タンパク質ＮＹＫ、その誘導体またはその機能的同等体
と、ＮＹＫの天然リガンドとを適当な条件下で接触させ
ることからなる対照における結合の量と、（ＩＩ）に記
載の前記測定を比較すること、からなる検出方法を提供
する。
【００２１】「ＮＹＫの天然のリガンドと比較して、受
容体タンパク質ＮＹＫの活性を刺激する増大した能力を
有する分子」という用語は、天然リガンドと比較して受
容体に対して増強された効果を起こすことができるいず
れの分子をもいう。そのような増強された効果は、通
常、天然リガンドＶＥＧＦよりもバイオアッセイで良好
な血管新生応答を引き起こす分子の能力で表される。別
法として、増強された能力は、血管透過性を誘導する能
力に関するものであってもよい。かかる分子は、創傷治
癒等のごとき血管新生が必要な医薬適用で有用であるこ
とが期待される。該分子は一般にタンパク質である。好
ましくは、該分子は増強された血管新生活性を持つ野生
型ＶＥＧＦの突然変異体である。より好ましくは、該分
子は本明細書に記載する野生型ＶＥＧＦの突然変異体で
ある、Ｋ１０６*２である。他の用語は前記したのと同
一の意味を有する。
容体タンパク質ＮＹＫの活性を刺激する増大した能力を
有する分子」という用語は、天然リガンドと比較して受
容体に対して増強された効果を起こすことができるいず
れの分子をもいう。そのような増強された効果は、通
常、天然リガンドＶＥＧＦよりもバイオアッセイで良好
な血管新生応答を引き起こす分子の能力で表される。別
法として、増強された能力は、血管透過性を誘導する能
力に関するものであってもよい。かかる分子は、創傷治
癒等のごとき血管新生が必要な医薬適用で有用であるこ
とが期待される。該分子は一般にタンパク質である。好
ましくは、該分子は増強された血管新生活性を持つ野生
型ＶＥＧＦの突然変異体である。より好ましくは、該分
子は本明細書に記載する野生型ＶＥＧＦの突然変異体で
ある、Ｋ１０６*２である。他の用語は前記したのと同
一の意味を有する。
【００２２】第５の態様において、本発明は、ＮＹＫま
たはその変異体を含有すると考えられる試料をＮＹＫの
既知のリガンドと、前記ＮＹＫまたはその変異体と前記
既知のリガンドとの間で結合が起こることを可能とする
のに適した条件下で接触させ、ついで、結合が起こった
か否かを測定することを特徴とする試料中の受容体タン
パク質ＮＹＫまたはその変異体を検出する方法を提供す
る。「その変異体」なる語は、ＮＹＫの天然に生じる対
立遺伝子および突然変異体、およびＮＹＫの合成により
生成されたＮＹＫの変異体をいう。かかる変異体は天然
受容体の機能的活性を保有するものである。他の用語は
前記したのと同一の意味を有する。試料は前記したもの
のごときいずれの試料であってもよい。既知のリガンド
はＮＹＫのいずれかのリガンドであってよく、好ましく
は抗体、より好ましくはモノクローナル抗体である。他
の好ましい既知のリガンドはＶＥＧＦである。結合を測
定する方法は、前記したもののごときいずれの方法であ
ってもよい。好ましい具体例においては、既知のリガン
ドをバイオセンサーチップにカップリングさせる。これ
は、受容体またはその変異体に対して非常に感度の高い
アッセイを提供する。
たはその変異体を含有すると考えられる試料をＮＹＫの
既知のリガンドと、前記ＮＹＫまたはその変異体と前記
既知のリガンドとの間で結合が起こることを可能とする
のに適した条件下で接触させ、ついで、結合が起こった
か否かを測定することを特徴とする試料中の受容体タン
パク質ＮＹＫまたはその変異体を検出する方法を提供す
る。「その変異体」なる語は、ＮＹＫの天然に生じる対
立遺伝子および突然変異体、およびＮＹＫの合成により
生成されたＮＹＫの変異体をいう。かかる変異体は天然
受容体の機能的活性を保有するものである。他の用語は
前記したのと同一の意味を有する。試料は前記したもの
のごときいずれの試料であってもよい。既知のリガンド
はＮＹＫのいずれかのリガンドであってよく、好ましく
は抗体、より好ましくはモノクローナル抗体である。他
の好ましい既知のリガンドはＶＥＧＦである。結合を測
定する方法は、前記したもののごときいずれの方法であ
ってもよい。好ましい具体例においては、既知のリガン
ドをバイオセンサーチップにカップリングさせる。これ
は、受容体またはその変異体に対して非常に感度の高い
アッセイを提供する。
【００２３】本発明の第１、第２、第３、第４および第
５の態様のための１つの特に迅速で便利なテスト系は、
ＢＩＡｃｏｒｅTM（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala,
スウェーデン）のごとき光学バイオセンサーを用い、こ
れは、センサーチップに固定化したタンパク質またはペ
プチドの使用を可能とする。該バイオセンサーアッセイ
は、高い特異性を有しつつ、非常に簡便で再現性があっ
て迅速である。該バイオセンサーアッセイは試料の処理
量を非常に高くすることを可能とし、自動化できる。従
って、これは、ＮＹＫタンパク質への結合を阻害する能
力につき、あるいはＶＥＧＦのアゴニストとしての能力
につき、天然物をスクリーニングするのに適する。しか
しながら、非常に広範囲の構造のテスト化合物を、この
方法を用いてテストできると考えられる。
５の態様のための１つの特に迅速で便利なテスト系は、
ＢＩＡｃｏｒｅTM（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala,
スウェーデン）のごとき光学バイオセンサーを用い、こ
れは、センサーチップに固定化したタンパク質またはペ
プチドの使用を可能とする。該バイオセンサーアッセイ
は、高い特異性を有しつつ、非常に簡便で再現性があっ
て迅速である。該バイオセンサーアッセイは試料の処理
量を非常に高くすることを可能とし、自動化できる。従
って、これは、ＮＹＫタンパク質への結合を阻害する能
力につき、あるいはＶＥＧＦのアゴニストとしての能力
につき、天然物をスクリーニングするのに適する。しか
しながら、非常に広範囲の構造のテスト化合物を、この
方法を用いてテストできると考えられる。
【００２４】特に好ましい具体例において、本発明の第
１、第２、第３および第４の態様の方法は、ＮＹＫの細
胞外ドメインを光学バイオセンサーチップに固定化し、
各々、固定化ＮＹＫタンパク質に結合するリガンド化合
物の、または既知のリガンドの結合を阻害する推定阻害
剤の能力を測定することによって結合を検出する工程を
含む。別の好ましい具体例において、本発明の第１、第
２、第３および第４の態様の方法は、サイトカイン受容
体と共に、融合タンパク質としての、ＮＹＫ細胞外ドメ
インを発現する細胞を、該ＮＹＫ細胞外ドメインに結合
できるリガンドに暴露し、次いで、結合が起こったか否
かを測定する工程を含むバイオアッセイを用いる。
１、第２、第３および第４の態様の方法は、ＮＹＫの細
胞外ドメインを光学バイオセンサーチップに固定化し、
各々、固定化ＮＹＫタンパク質に結合するリガンド化合
物の、または既知のリガンドの結合を阻害する推定阻害
剤の能力を測定することによって結合を検出する工程を
含む。別の好ましい具体例において、本発明の第１、第
２、第３および第４の態様の方法は、サイトカイン受容
体と共に、融合タンパク質としての、ＮＹＫ細胞外ドメ
インを発現する細胞を、該ＮＹＫ細胞外ドメインに結合
できるリガンドに暴露し、次いで、結合が起こったか否
かを測定する工程を含むバイオアッセイを用いる。
【００２５】第６の態様により、本発明は、神経上皮チ
ロシンキナーゼＮＹＫの細胞外ドメインの生物学的活性
を有する組み換えタンパク質の生産方法であって、以下
の工程、 ａ）タンパク質をコードする核酸において、受容体の細
胞外および予測される膜貫通ドメインの結合点（ｊｕｎ
ｃｔｉｏｎ）に制限酵素切断部位を生じさせ、ここで、
前記制限酵素切断部位は（工程ｂ）で生産される）コン
ストラクトに対してユニークとなるように選択され、 ｂ）工程ａ）で生成した核酸に、マーカーペプチドをコ
ードするオリゴヌクレオチド配列およびイン−フレーム
停止コドンを、所望により該核酸の３‘末端のさらなる
ユニークな制限酵素切断部位とともに連結させ、 ｃ）工程ｂ）で生成したコンストラクトを培養中の哺乳
動物宿主細胞で発現させてタンパク質を得、 ｄ）前記マーカーペプチドに特異的なアフィニティー試
薬を用いることによって前記タンパク質を単離し、次い
で、所望により ｅ）該タンパク質をさらなる精製工程に付す工程を含
む、神経上皮チロシンキナーゼＮＹＫの細胞外ドメイン
の生物学的活性を有する組み換えタンパク質の生産方法
を提供する。
ロシンキナーゼＮＹＫの細胞外ドメインの生物学的活性
を有する組み換えタンパク質の生産方法であって、以下
の工程、 ａ）タンパク質をコードする核酸において、受容体の細
胞外および予測される膜貫通ドメインの結合点（ｊｕｎ
ｃｔｉｏｎ）に制限酵素切断部位を生じさせ、ここで、
前記制限酵素切断部位は（工程ｂ）で生産される）コン
ストラクトに対してユニークとなるように選択され、 ｂ）工程ａ）で生成した核酸に、マーカーペプチドをコ
ードするオリゴヌクレオチド配列およびイン−フレーム
停止コドンを、所望により該核酸の３‘末端のさらなる
ユニークな制限酵素切断部位とともに連結させ、 ｃ）工程ｂ）で生成したコンストラクトを培養中の哺乳
動物宿主細胞で発現させてタンパク質を得、 ｄ）前記マーカーペプチドに特異的なアフィニティー試
薬を用いることによって前記タンパク質を単離し、次い
で、所望により ｅ）該タンパク質をさらなる精製工程に付す工程を含
む、神経上皮チロシンキナーゼＮＹＫの細胞外ドメイン
の生物学的活性を有する組み換えタンパク質の生産方法
を提供する。
【００２６】好ましくは、工程ｄ）は、正確なコンスト
ラクトおよび宿主系に依存して、タンパク質の精製を行
う他の方法もあるが、宿主細胞によってコンディショニ
ングされた培地を精製に付すことからなる。好ましく
は、マーカーペプチドはＦＬＡＧTMである；しかしなが
ら、他の小さいマーカーペプチドは当該分野で公知であ
る。また、好ましくは、マーカーペプチドは細胞外ドメ
インのＣ末端に挿入される。好ましくは、宿主細胞はチ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であるが、種
々の他の便利な宿主細胞も当該分野で公知である。好ま
しくは、アフィニティー精製工程は、アフィニティーク
ロマトグラフィーにより行われ、より好ましくは抗−Ｆ
ＬＡＧTMアフィニティーゲルおよび遊離ＦＬＡＧTMペプ
チドにての穏やかな溶出を用いて行う。
ラクトおよび宿主系に依存して、タンパク質の精製を行
う他の方法もあるが、宿主細胞によってコンディショニ
ングされた培地を精製に付すことからなる。好ましく
は、マーカーペプチドはＦＬＡＧTMである；しかしなが
ら、他の小さいマーカーペプチドは当該分野で公知であ
る。また、好ましくは、マーカーペプチドは細胞外ドメ
インのＣ末端に挿入される。好ましくは、宿主細胞はチ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であるが、種
々の他の便利な宿主細胞も当該分野で公知である。好ま
しくは、アフィニティー精製工程は、アフィニティーク
ロマトグラフィーにより行われ、より好ましくは抗−Ｆ
ＬＡＧTMアフィニティーゲルおよび遊離ＦＬＡＧTMペプ
チドにての穏やかな溶出を用いて行う。
【００２７】ドメインの結合点における制限酵素切断部
位は、部位特異的突然変異誘発を用いて、またはＰＣＲ
反応を介して導入することができ；制限酵素切断部位の
性質は、受容体ｃＤＮＡの特異的配列に依存するであろ
うが、便宜には、ＢｇｌＩＩまたはＢａｍＨＩのごとき
制限酵素のための部位である。組換えタンパク質の選択
における便宜のために、ＣｌａＩのようなユニークな制
限酵素切断部位を、マーカータンパク質をコードするオ
リゴヌクレオチドの３’末端に挿入することができる。
位は、部位特異的突然変異誘発を用いて、またはＰＣＲ
反応を介して導入することができ；制限酵素切断部位の
性質は、受容体ｃＤＮＡの特異的配列に依存するであろ
うが、便宜には、ＢｇｌＩＩまたはＢａｍＨＩのごとき
制限酵素のための部位である。組換えタンパク質の選択
における便宜のために、ＣｌａＩのようなユニークな制
限酵素切断部位を、マーカータンパク質をコードするオ
リゴヌクレオチドの３’末端に挿入することができる。
【００２８】本発明の第６の態様において、部位特異的
突然変異誘発アプローチを用いて、細胞外および予測さ
れる膜貫通ドメインの結合点において制限酵素切断部位
を生じさせ、マーカーペプチドの受容体のリガンド結合
領域へのイン−フレーム連結を容易とした。本研究で
は、小さいＦＬＡＧTMマーカーペプチドおよびＣＨＯ細
胞発現系を、大規模なタンパク質生産のために使用し
た。商業的に入手可能な抗−ＦＬＡＧTMアフィニティー
ゲル、および遊離ペプチドでの穏やかな溶出を用いて、
可溶性融合タンパク質を細胞上清から精製した。このア
プローチにより哺乳動物源から純粋で機能を有する受容
体細胞外ドメインが生成された。ＦＬＡＧTMにつき特別
に言及したが、同一の部位特異的突然変異誘発およびイ
ン−フレーム連結方法を用い、他の小さいマーカーペプ
チドを使用できるのは明らかに理解されるであろう。い
くつかのかかるペプチドに対するモノクローナル抗体は
商業的に入手可能である。
突然変異誘発アプローチを用いて、細胞外および予測さ
れる膜貫通ドメインの結合点において制限酵素切断部位
を生じさせ、マーカーペプチドの受容体のリガンド結合
領域へのイン−フレーム連結を容易とした。本研究で
は、小さいＦＬＡＧTMマーカーペプチドおよびＣＨＯ細
胞発現系を、大規模なタンパク質生産のために使用し
た。商業的に入手可能な抗−ＦＬＡＧTMアフィニティー
ゲル、および遊離ペプチドでの穏やかな溶出を用いて、
可溶性融合タンパク質を細胞上清から精製した。このア
プローチにより哺乳動物源から純粋で機能を有する受容
体細胞外ドメインが生成された。ＦＬＡＧTMにつき特別
に言及したが、同一の部位特異的突然変異誘発およびイ
ン−フレーム連結方法を用い、他の小さいマーカーペプ
チドを使用できるのは明らかに理解されるであろう。い
くつかのかかるペプチドに対するモノクローナル抗体は
商業的に入手可能である。
【００２９】単一の部位特異的突然変異誘発工程を使用
することによって、我々は、受容体ｃＤＮＡに制限酵素
切断部位を作成して、ＦＬＡＧTMオクタペプチドをコー
ドするオリゴヌクレオチドリンカーの対の連結を可能と
した。これは、５’末端にしばしば高ＧＣ含量の領域を
有するｃＤＮＡ（１−３ｋｂ）の大きな領域に対するＰ
ＣＲの使用を回避する。ＦＬＡＧTMオクタペプチドマー
カーは細胞外ドメインのＣ−末端に位置させ、それによ
り、リガンド結合に頻繁に関与する領域である受容体の
Ｎ−末端領域を未修飾のままとする。このアプローチを
用いて、ＮＹＫ（ＶＥＧＦＲ２）をはじめとする、３つ
のＲＴＫ類でＦＬＡＧTM−融合タンパク質を構築した。
ＣＨＯ細胞発現系で発現された組換え融合タンパク質
を、抗−ＦＬＡＧTM抗体アフィニティークロマトグラフ
ィーを用いて精製した。可能な変性剤への暴露を最小と
した、遊離ＦＬＡＧTMペプチドとの競合によって、タン
パク質をアフィニティーカラムから溶出させた。この方
法は、一般に、よく特徴付けされたマーカーペプチドを
用いての、細胞表面受容体の機能を有する細胞外ドメイ
ンの発現および精製に適用できる。この方法は、機能的
物質を要するモノクローナル抗体産生のごとき研究、イ
ムノアッセイのごときアッセイ、バイオセンサー実験ま
たはリガンド単離研究に特に有用である。
することによって、我々は、受容体ｃＤＮＡに制限酵素
切断部位を作成して、ＦＬＡＧTMオクタペプチドをコー
ドするオリゴヌクレオチドリンカーの対の連結を可能と
した。これは、５’末端にしばしば高ＧＣ含量の領域を
有するｃＤＮＡ（１−３ｋｂ）の大きな領域に対するＰ
ＣＲの使用を回避する。ＦＬＡＧTMオクタペプチドマー
カーは細胞外ドメインのＣ−末端に位置させ、それによ
り、リガンド結合に頻繁に関与する領域である受容体の
Ｎ−末端領域を未修飾のままとする。このアプローチを
用いて、ＮＹＫ（ＶＥＧＦＲ２）をはじめとする、３つ
のＲＴＫ類でＦＬＡＧTM−融合タンパク質を構築した。
ＣＨＯ細胞発現系で発現された組換え融合タンパク質
を、抗−ＦＬＡＧTM抗体アフィニティークロマトグラフ
ィーを用いて精製した。可能な変性剤への暴露を最小と
した、遊離ＦＬＡＧTMペプチドとの競合によって、タン
パク質をアフィニティーカラムから溶出させた。この方
法は、一般に、よく特徴付けされたマーカーペプチドを
用いての、細胞表面受容体の機能を有する細胞外ドメイ
ンの発現および精製に適用できる。この方法は、機能的
物質を要するモノクローナル抗体産生のごとき研究、イ
ムノアッセイのごときアッセイ、バイオセンサー実験ま
たはリガンド単離研究に特に有用である。
【００３０】
【実施例】以下の記載は、ＮＹＫタンパク質の細胞外ド
メインを利用する。これは、その細胞外ドメインのＣ末
端において、マーカーペプチドＦＬＡＧTM（ホップ(Hop
p)他，1992) に連結した融合タンパク質として、ＣＨＯ
細胞で生産され、アフィニティークロマトグラフィーに
よって精製されたものである。ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧ
TMと命名されたこれらの融合タンパク質の生産は実施例
７ないし９に記載する。しかしながら、本発明はＮＹＫ
−ＥＸ−ＦＬＡＧTM、に限定されず、ＮＹＫ、特に他の
方法によって生産されたその細胞外ドメインが本発明の
範囲内のものであることは明らかに理解されるべきであ
る。
メインを利用する。これは、その細胞外ドメインのＣ末
端において、マーカーペプチドＦＬＡＧTM（ホップ(Hop
p)他，1992) に連結した融合タンパク質として、ＣＨＯ
細胞で生産され、アフィニティークロマトグラフィーに
よって精製されたものである。ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧ
TMと命名されたこれらの融合タンパク質の生産は実施例
７ないし９に記載する。しかしながら、本発明はＮＹＫ
−ＥＸ−ＦＬＡＧTM、に限定されず、ＮＹＫ、特に他の
方法によって生産されたその細胞外ドメインが本発明の
範囲内のものであることは明らかに理解されるべきであ
る。
【００３１】［実施例１ 結合実験］ＮＹＫ−ＥＸ−Ｆ
ＬＡＧTM融合タンパク質を、既知のリガンド、血管内皮
増殖因子（ＶＥＧＦ）（ミローア(Millauer)他，1993）
に結合するその能力につきテストした。結合実験は、Ｃ
Ｍ５センサーチップ（Pharmacia)に固定化したタンパク
質を用い、光学バイオセンサー（BIAcoreTM、Pharmacia
Biosensor AB, Uppsala,スウェーデン）で行った。Ｎ
ＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMの固定化は、従前に記載されて
いるごとくに標準的なＮＨＳ／ＥＤＣ化学を用いて行っ
た（ナイス(Nice)他，1994）。ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧ
TMのほぼ１５ｎｇ／ｍｍ2（１５，０００ＲＵ）をＢＩ
ＡｃｏｒｅTM分析によって測定してバイオセンサーチッ
プにカップリングさせた。ＶＥＧＦ−ｐＣＤＭ８でトラ
ンスフェクトしたＣＨＯ細胞、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡ
ＧTMでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞および緩衝液単
独でコンディショニングした培地に対するＢＩＡｃｏｒ
ｅTM応答を比較することによって、固定化タンパク質の
完全性を調べた。各サイクルの間で、誘導体化したセン
サー表面を５０ｍＭジエチルアミド、ｐＨ１２．０、
０．１％トリトンＸ−１００で再生した。対照実験で
は、この処理がＶＥＧＦに対する固定化受容体の結合能
力に影響を有しないことを確認した。
ＬＡＧTM融合タンパク質を、既知のリガンド、血管内皮
増殖因子（ＶＥＧＦ）（ミローア(Millauer)他，1993）
に結合するその能力につきテストした。結合実験は、Ｃ
Ｍ５センサーチップ（Pharmacia)に固定化したタンパク
質を用い、光学バイオセンサー（BIAcoreTM、Pharmacia
Biosensor AB, Uppsala,スウェーデン）で行った。Ｎ
ＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMの固定化は、従前に記載されて
いるごとくに標準的なＮＨＳ／ＥＤＣ化学を用いて行っ
た（ナイス(Nice)他，1994）。ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧ
TMのほぼ１５ｎｇ／ｍｍ2（１５，０００ＲＵ）をＢＩ
ＡｃｏｒｅTM分析によって測定してバイオセンサーチッ
プにカップリングさせた。ＶＥＧＦ−ｐＣＤＭ８でトラ
ンスフェクトしたＣＨＯ細胞、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡ
ＧTMでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞および緩衝液単
独でコンディショニングした培地に対するＢＩＡｃｏｒ
ｅTM応答を比較することによって、固定化タンパク質の
完全性を調べた。各サイクルの間で、誘導体化したセン
サー表面を５０ｍＭジエチルアミド、ｐＨ１２．０、
０．１％トリトンＸ−１００で再生した。対照実験で
は、この処理がＶＥＧＦに対する固定化受容体の結合能
力に影響を有しないことを確認した。
【００３２】図１はＢＩＡｃｏｒｅTMを用いる、固定化
ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMへのＶＥＧＦの結合の分析結
果を示す。精製したＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMを本明細
書に記載するごとくにＣＭ５センサーチップにカップリ
ングさせた。次いで、以下の溶液をＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬ
ＡＧTMへのそれらの結合につき分析した；ＶＥＧＦを含
有するＣＨＯ細胞培地、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMを
含有するＣＨＯ細胞培地（対照１）または緩衝液単独
（対照２）。図は、秒単位で測定した、実験の時間にわ
たっての前記試料の注入後において観察された相対的応
答ユニット（ＲＵ）を表す３つのセンサーグラムのオー
バーレイを表す。ＲＵはリガンド結合に関連するバイオ
センサーチップの表面における質量変化に関する。点Ａ
はテスト試料の添加に先立ってのベースラインを表し、
Ｂはテスト試料を注入した時点であり、点Ｃは試料をＢ
ＩＡｃｏｒｅTM緩衝液で置き換えた注入相の最後を表
し、点ＤはＶＥＧＦの特異的結合によるベースラインの
総変化を表す。
ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMへのＶＥＧＦの結合の分析結
果を示す。精製したＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMを本明細
書に記載するごとくにＣＭ５センサーチップにカップリ
ングさせた。次いで、以下の溶液をＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬ
ＡＧTMへのそれらの結合につき分析した；ＶＥＧＦを含
有するＣＨＯ細胞培地、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMを
含有するＣＨＯ細胞培地（対照１）または緩衝液単独
（対照２）。図は、秒単位で測定した、実験の時間にわ
たっての前記試料の注入後において観察された相対的応
答ユニット（ＲＵ）を表す３つのセンサーグラムのオー
バーレイを表す。ＲＵはリガンド結合に関連するバイオ
センサーチップの表面における質量変化に関する。点Ａ
はテスト試料の添加に先立ってのベースラインを表し、
Ｂはテスト試料を注入した時点であり、点Ｃは試料をＢ
ＩＡｃｏｒｅTM緩衝液で置き換えた注入相の最後を表
し、点ＤはＶＥＧＦの特異的結合によるベースラインの
総変化を表す。
【００３３】図１に記載したセンサーグラムは、ＮＹＫ
−ＥＸ−ＦＬＡＧTMで誘導体化したセンサーチップが、
ＣＨＯ細胞上清に含有されるＶＥＧＦの注入に際して、
１４６ＲＵの相対的応答を生起したことを示す；Ａない
しＤを比較されたい。比較として、もう１つのＲＴＫタ
ンパク質、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTM（対照１）を発
現する細胞からの対照ＣＨＯ細胞上清または緩衝液単独
（対照２）からのシグナルは２０ＲＵ未満であった。ま
た、ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMへのＶＥＧＦの結合のＢ
ＩＡｃｏｒｅTMセンサーグラム（ｔ＝１００−５２０
秒、Ｂ−Ｃ）で観察された応答ユニットの上昇も、特異
的リガンドの結合と一致する。これは、この期間にわた
って増加を示さなかった対照１および２で観察されたセ
ンサーグラムとは対照的である。また、天然ＮＹＫおよ
びｔｉｅ２を認識するモノクローナル抗体のパネル（１
９９５年２月９日に出願された我々の国際出願ＰＣＴ／
ＵＳ９５／０１７４３に記載）は、各々、ＮＹＫ−ＥＸ
−ＦＬＡＧTMおよびｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMで誘導
体化したバイオセンサーチップに対する特異的応答を生
じた。
−ＥＸ−ＦＬＡＧTMで誘導体化したセンサーチップが、
ＣＨＯ細胞上清に含有されるＶＥＧＦの注入に際して、
１４６ＲＵの相対的応答を生起したことを示す；Ａない
しＤを比較されたい。比較として、もう１つのＲＴＫタ
ンパク質、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTM（対照１）を発
現する細胞からの対照ＣＨＯ細胞上清または緩衝液単独
（対照２）からのシグナルは２０ＲＵ未満であった。ま
た、ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMへのＶＥＧＦの結合のＢ
ＩＡｃｏｒｅTMセンサーグラム（ｔ＝１００−５２０
秒、Ｂ−Ｃ）で観察された応答ユニットの上昇も、特異
的リガンドの結合と一致する。これは、この期間にわた
って増加を示さなかった対照１および２で観察されたセ
ンサーグラムとは対照的である。また、天然ＮＹＫおよ
びｔｉｅ２を認識するモノクローナル抗体のパネル（１
９９５年２月９日に出願された我々の国際出願ＰＣＴ／
ＵＳ９５／０１７４３に記載）は、各々、ＮＹＫ−ＥＸ
−ＦＬＡＧTMおよびｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMで誘導
体化したバイオセンサーチップに対する特異的応答を生
じた。
【００３４】表１は、各々、３Ｂ６、３Ｃ８および４Ｈ
３（１９９５年２月９日に出願された国際出願ＰＣＴ／
ＵＳ９５／０１７２７に記載）と命名された３種の異な
るモノクローナル抗体の、センサーチップに固定化され
たＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMへの結合の結果を示す。１
０−２０μｇ／ｍｌの濃度で該モノクローナル抗体を含
有する条件培地をセンサーチップにアプライし、相対的
応答を、緩衝液単独を用いて示されたものと比較した。
該センサーチップをアプライの間に高ｐＨ洗液で再生し
た。
３（１９９５年２月９日に出願された国際出願ＰＣＴ／
ＵＳ９５／０１７２７に記載）と命名された３種の異な
るモノクローナル抗体の、センサーチップに固定化され
たＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMへの結合の結果を示す。１
０−２０μｇ／ｍｌの濃度で該モノクローナル抗体を含
有する条件培地をセンサーチップにアプライし、相対的
応答を、緩衝液単独を用いて示されたものと比較した。
該センサーチップをアプライの間に高ｐＨ洗液で再生し
た。
【００３５】
【表１】
【００３６】各々、ｌｅｌ１、３ｇ１および４ｇ８と命
名された、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMに向けられた３
種の異なるモノクローナル抗体を、センサーチップに固
定化したｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMに結合するそれら
の能力につきテストした。抗体結合に対するｔｉｅ２−
ＥＸ−ＦＬＡＧTMタンパク質の変性の効果を調べるため
に、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMをＢＩＡｃｏｒｅTMチ
ップに固定化した。結果を図９に示す。図９は、ＢＩＡ
ｃｏｒｅTMを用いてのｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMに対
するモノクローナル抗体の、天然および変性ｔｉｅ２−
ＥＸ−ＦＬＡＧTMへの結合の分析の結果を示すものであ
る。天然形態のｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMについて
の、各々同一濃度における、３種の精製した抗体に対す
る応答を左側に示す。抗体結合に続いての応答ユニット
の降下によって示されるごとく、結合抗体を、高ｐＨ洗
液での洗浄によって除去した。図９の右欄に示すごと
く、次いで、グアニジウム塩酸塩および２−メルカプト
エタノールを用いてｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMを変性
させ、抗体の結合能力を再度テストした。ｌｅｌ１抗体
は、応答ユニットの増加の不存在によって示されるごと
く、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMの変性後にはもはや結
合しない；右の最上欄参照。他の２つの抗体３ｇ１およ
び４ｇ８は、低レベルにおけるにも拘わらず、ｔｉｅ２
−ＥＸ−ＦＬＡＧTMの変性後においても結合を依然示
し、これは、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧ TMのコンフォメ
ーションが変化しても依然チップに結合したままである
ことを示す。
名された、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMに向けられた３
種の異なるモノクローナル抗体を、センサーチップに固
定化したｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMに結合するそれら
の能力につきテストした。抗体結合に対するｔｉｅ２−
ＥＸ−ＦＬＡＧTMタンパク質の変性の効果を調べるため
に、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMをＢＩＡｃｏｒｅTMチ
ップに固定化した。結果を図９に示す。図９は、ＢＩＡ
ｃｏｒｅTMを用いてのｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMに対
するモノクローナル抗体の、天然および変性ｔｉｅ２−
ＥＸ−ＦＬＡＧTMへの結合の分析の結果を示すものであ
る。天然形態のｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMについて
の、各々同一濃度における、３種の精製した抗体に対す
る応答を左側に示す。抗体結合に続いての応答ユニット
の降下によって示されるごとく、結合抗体を、高ｐＨ洗
液での洗浄によって除去した。図９の右欄に示すごと
く、次いで、グアニジウム塩酸塩および２−メルカプト
エタノールを用いてｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMを変性
させ、抗体の結合能力を再度テストした。ｌｅｌ１抗体
は、応答ユニットの増加の不存在によって示されるごと
く、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMの変性後にはもはや結
合しない；右の最上欄参照。他の２つの抗体３ｇ１およ
び４ｇ８は、低レベルにおけるにも拘わらず、ｔｉｅ２
−ＥＸ−ＦＬＡＧTMの変性後においても結合を依然示
し、これは、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧ TMのコンフォメ
ーションが変化しても依然チップに結合したままである
ことを示す。
【００３７】Ｃ−末端におけるＦＬＡＧTMペプチドの位
置は、ＢＩＡｃｏｒｅTMまたは受容体に対するＭＡｂ生
産についての実験いずれに対しても悪影響しなかった。
精製されたＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMはリガンドＶＥＧ
Ｆに特異的に結合した。また、アルカリ性ホスファター
ゼ−融合タンパク質での我々の観察とは対照的に、培地
に含有される血清からの見掛けの結合はなかった。アル
カリ性ホスファターゼまたは免疫グロブリンのＦｃ部分
のごとき他のマーカーと比較して、タンパク質相互作用
におけるＦＬＡＧTMペプチドの見掛けの不活性は、偽陽
性を回避するので、この系をバイオセンサーをベースと
する適用で理想的とする。
置は、ＢＩＡｃｏｒｅTMまたは受容体に対するＭＡｂ生
産についての実験いずれに対しても悪影響しなかった。
精製されたＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMはリガンドＶＥＧ
Ｆに特異的に結合した。また、アルカリ性ホスファター
ゼ−融合タンパク質での我々の観察とは対照的に、培地
に含有される血清からの見掛けの結合はなかった。アル
カリ性ホスファターゼまたは免疫グロブリンのＦｃ部分
のごとき他のマーカーと比較して、タンパク質相互作用
におけるＦＬＡＧTMペプチドの見掛けの不活性は、偽陽
性を回避するので、この系をバイオセンサーをベースと
する適用で理想的とする。
【００３８】［実施例２ 血清におけるＶＥＧＦの検
出］１×１０6Ｃ６グリオーマ細胞または１×１０6Ｕ９
３７細胞でマウスを皮下的に免疫化し、腫瘍をほぼ０．
５−１．０ｃｍ3まで発育させた。この時点で、血液試
料を動物から採取し、引き続いて血清を収集した。該血
清をＮＹＫ−ＦＬＡＧ誘導体化チップへの結合について
検定し、組換えヒトＶＥＧＦ（Preprogen）を用いて作
成した標準曲線との比較によって存在するＶＥＧＦの量
を見積もった。結果を以下の表２に示す。
出］１×１０6Ｃ６グリオーマ細胞または１×１０6Ｕ９
３７細胞でマウスを皮下的に免疫化し、腫瘍をほぼ０．
５−１．０ｃｍ3まで発育させた。この時点で、血液試
料を動物から採取し、引き続いて血清を収集した。該血
清をＮＹＫ−ＦＬＡＧ誘導体化チップへの結合について
検定し、組換えヒトＶＥＧＦ（Preprogen）を用いて作
成した標準曲線との比較によって存在するＶＥＧＦの量
を見積もった。結果を以下の表２に示す。
【００３９】
【表２】
【００４０】［実施例３ 組換えＶＥＧＦの検出］組換
えＶＥＧＦ（５μｌ）を２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ
４．５／０．０２％Tween 20 に再懸濁し、標準的なＢ
ＩＡｃｏｒｅチップに固定化した。条件培地を該チップ
上に流し、結合した物質を１０ｍＭ ＨＣｌで脱着させ
た。これらの結果を以下に表３に示す。
えＶＥＧＦ（５μｌ）を２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ
４．５／０．０２％Tween 20 に再懸濁し、標準的なＢ
ＩＡｃｏｒｅチップに固定化した。条件培地を該チップ
上に流し、結合した物質を１０ｍＭ ＨＣｌで脱着させ
た。これらの結果を以下に表３に示す。
【００４１】
【表３】
【００４２】［実施例４ 固定化ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡ
Ｇへのモノクローナル抗体４Ｈ３および３Ｂ６結合の検
出］ＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインに向けられたモノク
ローナル抗体を用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ上の固定化ＮＹ
Ｋ−ＥＸ−ＦＬＡＧを検出した。抗体（１０μｌ／ｍ
ｌ）をチップにアプライし、相対的応答を測定した。結
果を以下の表４に示す。
Ｇへのモノクローナル抗体４Ｈ３および３Ｂ６結合の検
出］ＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメインに向けられたモノク
ローナル抗体を用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ上の固定化ＮＹ
Ｋ−ＥＸ−ＦＬＡＧを検出した。抗体（１０μｌ／ｍ
ｌ）をチップにアプライし、相対的応答を測定した。結
果を以下の表４に示す。
【００４３】
【表４】
【００４４】［実施例５ ＮＹＫ−エリスロポエチン受
容体融合タンパク質を用いるＮＹＫについてのバイオア
ッセイ］PacificiおよびThomason(1994)による最近の研
究は、ＦＤＣＰ−１およびＢＡ／Ｆ３のごとき因子依存
性細胞系へトランスフェクトした場合に、ほとんどのＲ
ＴＫ類はリガンドに対する有意な増殖応答を生じないこ
とを示している。しかしながら、もしＲＴＫの細胞外ド
メインおよびエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）から
のサイトカイン受容体の膜貫通および細胞質ドメインか
らなるキメラ分子を用いると、達成される増殖のレベル
は野生型サイトカイン受容体によって与えられるものと
同様である。これは、受容体細胞質ドメインの会合は生
じさせるべきいくらかの増殖応答に十分であることを意
味する。図２は、ＩＬ−３、エリスロポエチン（Ｅｐ
ｏ）に対する受容体のような、サイトカイン受容体、Ｒ
ＴＫ、およびＲＴＫ−Ｅｐｏキメラによるシグナル伝達
のメカニズムを示す。
容体融合タンパク質を用いるＮＹＫについてのバイオア
ッセイ］PacificiおよびThomason(1994)による最近の研
究は、ＦＤＣＰ−１およびＢＡ／Ｆ３のごとき因子依存
性細胞系へトランスフェクトした場合に、ほとんどのＲ
ＴＫ類はリガンドに対する有意な増殖応答を生じないこ
とを示している。しかしながら、もしＲＴＫの細胞外ド
メインおよびエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）から
のサイトカイン受容体の膜貫通および細胞質ドメインか
らなるキメラ分子を用いると、達成される増殖のレベル
は野生型サイトカイン受容体によって与えられるものと
同様である。これは、受容体細胞質ドメインの会合は生
じさせるべきいくらかの増殖応答に十分であることを意
味する。図２は、ＩＬ−３、エリスロポエチン（Ｅｐ
ｏ）に対する受容体のような、サイトカイン受容体、Ｒ
ＴＫ、およびＲＴＫ−Ｅｐｏキメラによるシグナル伝達
のメカニズムを示す。
【００４５】部位特異的突然変異誘発を用い、ＥｐｏＲ
細胞質ドメインにおけるサイレント突然変異を行って、
マウスＥｐｏ受容体の公表されたヌクレオチド配列（ダ
ンドレア(D'Andrea)他，1989）の位置８６６のＢｇｌＩ
Ｉ制限酵素切断部位を除去した。次いで、ＥｐｏＲの細
胞外ドメインおよび推定膜貫通ドメインの結合点にもう
１つのＢｇｌＩＩ部位を導入した。Ｅｐｏ受容体の細胞
質および膜貫通ドメインを、次いで、実施例７ないし９
に記載したＢｇｌＩＩ部位を介して、ＮＹＫ受容体の細
胞外ドメインにインフレーム連結させた。次いで、イン
サートをＸｂａＩを介してｐＢＯＳ発現ベクターにサブ
クローニングした。このコンストラクトをｐＢＯＳ−Ｎ
ＹＫ／Ｅｐｏと命名する。
細胞質ドメインにおけるサイレント突然変異を行って、
マウスＥｐｏ受容体の公表されたヌクレオチド配列（ダ
ンドレア(D'Andrea)他，1989）の位置８６６のＢｇｌＩ
Ｉ制限酵素切断部位を除去した。次いで、ＥｐｏＲの細
胞外ドメインおよび推定膜貫通ドメインの結合点にもう
１つのＢｇｌＩＩ部位を導入した。Ｅｐｏ受容体の細胞
質および膜貫通ドメインを、次いで、実施例７ないし９
に記載したＢｇｌＩＩ部位を介して、ＮＹＫ受容体の細
胞外ドメインにインフレーム連結させた。次いで、イン
サートをＸｂａＩを介してｐＢＯＳ発現ベクターにサブ
クローニングした。このコンストラクトをｐＢＯＳ−Ｎ
ＹＫ／Ｅｐｏと命名する。
【００４６】次いで、ｐＢＯＳ−ＮＹＫ／Ｅｐｏを、ネ
オマイシン耐性プラスミドで、因子依存性プレＢ−細胞
系ＢＡ／Ｆ３に共トランスフェクトした。該ＢＡ／Ｆ３
細胞系は増殖につきＩＬ−３／ＧＭ−ＣＳＦの存在に依
存し；これらの因子の除去の結果、２４−４８時間以内
に迅速な細胞死滅となる。ＤＥＭＥ、１０％ ＨＩＦＣ
Ｓ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、２０μｌ／ｍｌ
Ｌ−グルタミン、１．２ｍｇ／ｍｌＧ４１８成長培地中
で細胞を選抜した。７−１４日後に増殖する個々のクロ
ーンを拾い、液体培地中で増殖させた。 ＮＹＫ／Ｅｐｏを発現するコロニーは、２つの手法： （ｉ）（１９９５年２月９日に出願された我々の同時係
属国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１７４３に記載されて
いるごとくに調製した）抗−ＮＹＫ ＭＡｂでの 35Ｓ−
Ｍｅｔ／Ｃｙｓ−標識受容体の免疫沈降およびＳＤＳ−
ＰＡＧＥの分析； （ｉｉ）ＶＥＧＦでの細胞系の刺激； によって選択した。
オマイシン耐性プラスミドで、因子依存性プレＢ−細胞
系ＢＡ／Ｆ３に共トランスフェクトした。該ＢＡ／Ｆ３
細胞系は増殖につきＩＬ−３／ＧＭ−ＣＳＦの存在に依
存し；これらの因子の除去の結果、２４−４８時間以内
に迅速な細胞死滅となる。ＤＥＭＥ、１０％ ＨＩＦＣ
Ｓ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、２０μｌ／ｍｌ
Ｌ−グルタミン、１．２ｍｇ／ｍｌＧ４１８成長培地中
で細胞を選抜した。７−１４日後に増殖する個々のクロ
ーンを拾い、液体培地中で増殖させた。 ＮＹＫ／Ｅｐｏを発現するコロニーは、２つの手法： （ｉ）（１９９５年２月９日に出願された我々の同時係
属国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１７４３に記載されて
いるごとくに調製した）抗−ＮＹＫ ＭＡｂでの 35Ｓ−
Ｍｅｔ／Ｃｙｓ−標識受容体の免疫沈降およびＳＤＳ−
ＰＡＧＥの分析； （ｉｉ）ＶＥＧＦでの細胞系の刺激； によって選択した。
【００４７】１０００のＮＹＫ／Ｅｐｏ−ＢＡ／Ｆ３細
胞または非発現対照ＢＡ／Ｆ３細胞を、ｐＣＤＭ８−Ｖ
ＥＧＦ１６５でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の増殖
によってコンディショニングした１０％培地を含有する
増殖培地の１５μｌ容量中に再懸濁した。細胞の刺激
は、対照集団と比較した場合に２−１４日の期間にわた
って判断した。
胞または非発現対照ＢＡ／Ｆ３細胞を、ｐＣＤＭ８−Ｖ
ＥＧＦ１６５でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の増殖
によってコンディショニングした１０％培地を含有する
増殖培地の１５μｌ容量中に再懸濁した。細胞の刺激
は、対照集団と比較した場合に２−１４日の期間にわた
って判断した。
【００４８】３種の細胞系は、表５に要約し、フローサ
イトメトリー（図３）によって示すごとく、ＶＥＧＦに
応答し、ＮＹＫ−Ｅｐｏキメラを発現することが示され
た。ＢＡ／Ｆ３細胞の表面におけるＶＥＧＦＲ２−Ｅｐ
ｏＲ発現のフローサイトメトリー分析は以下のごとくに
行った。ＮＹＫ−ＥｐｏＲコンストラクトでトランスフ
ェクトしたＢＡ／Ｆ３細胞（５×１０5）（ＢＡ／Ｆ３
−ＮＹＫ−ＥｐｏＲ番号１８）またはベクター単独でト
ランスフェクトした細胞（１１５）を、ＮＹＫ受容体の
細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体（４Ｈ３；
ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１７２７に記載）またはｔｉｅ２
受容体に向けられた対照抗体（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１
７４３）と反応させた。洗浄後、細胞をヤギ抗−ラット
−ＦＩＴＣ抗体と共にインキュベートし、引き続いて洗
浄し、ＦＡＣＳｃａｎTMおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔTMソ
フトウェア（Becton Dickinson) を用い、フローサイト
メトリーによって細胞を分析した。図３は、モノクロー
ナル抗体４Ｈ３および対照抗体４ｇ８を用いるＢＡ／Ｆ
３細胞の表面でのＶＥＧＦＲ２−ＥｐｏＲ発現のフロー
サイトメトリー分析の結果を示す。トレースは、抗体４
Ｈ３で染色された対照細胞系１１５（−−−）および４
Ｈ３（太線）または対照抗体４ｇ８（−）いずれかで染
色したＢＡ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲ細胞系である。
イトメトリー（図３）によって示すごとく、ＶＥＧＦに
応答し、ＮＹＫ−Ｅｐｏキメラを発現することが示され
た。ＢＡ／Ｆ３細胞の表面におけるＶＥＧＦＲ２−Ｅｐ
ｏＲ発現のフローサイトメトリー分析は以下のごとくに
行った。ＮＹＫ−ＥｐｏＲコンストラクトでトランスフ
ェクトしたＢＡ／Ｆ３細胞（５×１０5）（ＢＡ／Ｆ３
−ＮＹＫ−ＥｐｏＲ番号１８）またはベクター単独でト
ランスフェクトした細胞（１１５）を、ＮＹＫ受容体の
細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体（４Ｈ３；
ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１７２７に記載）またはｔｉｅ２
受容体に向けられた対照抗体（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１
７４３）と反応させた。洗浄後、細胞をヤギ抗−ラット
−ＦＩＴＣ抗体と共にインキュベートし、引き続いて洗
浄し、ＦＡＣＳｃａｎTMおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔTMソ
フトウェア（Becton Dickinson) を用い、フローサイト
メトリーによって細胞を分析した。図３は、モノクロー
ナル抗体４Ｈ３および対照抗体４ｇ８を用いるＢＡ／Ｆ
３細胞の表面でのＶＥＧＦＲ２−ＥｐｏＲ発現のフロー
サイトメトリー分析の結果を示す。トレースは、抗体４
Ｈ３で染色された対照細胞系１１５（−−−）および４
Ｈ３（太線）または対照抗体４ｇ８（−）いずれかで染
色したＢＡ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲ細胞系である。
【００４９】また、これらの細胞系は、ＮＹＫ受容体の
細胞外ドメインに向けられた１０−２０μｇ／ｍｌのＭ
Ａｂと一緒でのインキュベーションによって特異的に刺
激されて増殖することが示された。これは、細胞表面に
おける受容体の架橋の結果であり、これは受容体のリガ
ンド誘導二量体化を模倣する。従って、該アッセイは、
ＮＹＫ細胞外ドメインおよびそのリガンドＶＥＧＦの相
互作用を特異的に検出し、従って、この相互作用を調節
し得る物質の検出および評価、またはかかる調節性物質
の阻害剤の検出および評価に有用である。
細胞外ドメインに向けられた１０−２０μｇ／ｍｌのＭ
Ａｂと一緒でのインキュベーションによって特異的に刺
激されて増殖することが示された。これは、細胞表面に
おける受容体の架橋の結果であり、これは受容体のリガ
ンド誘導二量体化を模倣する。従って、該アッセイは、
ＮＹＫ細胞外ドメインおよびそのリガンドＶＥＧＦの相
互作用を特異的に検出し、従って、この相互作用を調節
し得る物質の検出および評価、またはかかる調節性物質
の阻害剤の検出および評価に有用である。
【００５０】
【表５】
【００５１】トランスフェクトしたまたは未トランスフ
ェクトＢＡ／Ｆ３細胞を、ＷＥＨＩ３Ｄ条件培地から取
り出し、ＰＢＳ中で３ないし４回洗浄し、５ｎｇ／ｍｌ
のＶＥＧＦ１６５を含有する培地に再懸濁した。増殖
は、培養の目視的観察によってＶＥＧＦ存在下において
２および４日の間に測定した。
ェクトＢＡ／Ｆ３細胞を、ＷＥＨＩ３Ｄ条件培地から取
り出し、ＰＢＳ中で３ないし４回洗浄し、５ｎｇ／ｍｌ
のＶＥＧＦ１６５を含有する培地に再懸濁した。増殖
は、培養の目視的観察によってＶＥＧＦ存在下において
２および４日の間に測定した。
【００５２】［実施例６ 突然変異体ＶＥＧＦの検出］
ｐＣＤＮＡ−１ Ａｍｐ発現ベクターで突然変異体を生
成させた。これらは、既に記載した技術によるオリゴヌ
クレオチド指向性突然変異誘発を用いることによって生
成させた。突然変異は野生型ＶＥＧＦにおける単一また
は複数のアミノ酸置換であった。図４は、ＮＹＫ受容体
の機能のモジュレーターのアミノ酸配列を示す。対応す
るヌクレオチド配列は当業者によく知られているであろ
う。これらの突然変異体の基礎として用いた野生型ＶＥ
ＧＦのアミノ酸配列は、該野生型が位置７３においてリ
シン（Ｋ）を有する以外は、図４に示したＫ７３Ｓの配
列と同一である。また、野生型リーダー配列は図４に示
した突然変異体にも含まれる。突然変異はシークエンシ
ングによって確認した。突然変異体の配列を表６に示
す。
ｐＣＤＮＡ−１ Ａｍｐ発現ベクターで突然変異体を生
成させた。これらは、既に記載した技術によるオリゴヌ
クレオチド指向性突然変異誘発を用いることによって生
成させた。突然変異は野生型ＶＥＧＦにおける単一また
は複数のアミノ酸置換であった。図４は、ＮＹＫ受容体
の機能のモジュレーターのアミノ酸配列を示す。対応す
るヌクレオチド配列は当業者によく知られているであろ
う。これらの突然変異体の基礎として用いた野生型ＶＥ
ＧＦのアミノ酸配列は、該野生型が位置７３においてリ
シン（Ｋ）を有する以外は、図４に示したＫ７３Ｓの配
列と同一である。また、野生型リーダー配列は図４に示
した突然変異体にも含まれる。突然変異はシークエンシ
ングによって確認した。突然変異体の配列を表６に示
す。
【００５３】
【表６】 生成された突然変異体の配列 下線部は突然変異体を生じるアミノ酸置換を示す 突然変異体 アミノ酸配列および 突然変異体を 名称 対応するヌクレオチド配列 生じる変化 K73S I E Y I F S P S C V P L K → S ATA GAG TAC ATC TTC AGC CCC AGC TGT GTG CCG CTG （配列番号１、および配列番号１３） H111G R I K P G Q S Q H I G H → G CGG ATC AAA CCT GGC CAA AGC CAG CAC ATA GGA （配列番号２、および配列番号１４） G117V Q S Q H I V E M S F L Q G → V CAA AGC CAG CAC ATA GTA GAG ATG AGC TTC CTG CAG （配列番号３、および配列番号１５） K106*2 L Q H S R C E C R P W "停止" K → W CTA CAG CAC AGC CGA TGT GAA TGC AGA CCA TGG TAA W →停止 （配列番号４、および配列番号１６） VEGFO R I R S G D R P S I G E K → R CGG ATC AGA TCT GGC GAT AGA CCG TCC ATA GGA GAG P → S （配列番号５、および配列番号１７） H → G Q → D S → R Q → P H → S
【００５４】ＤＥＡＥ−デキストラン方法によってコン
ストラクトをＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、条件培
地をトランスフェクションの７日後に収集した。条件培
地を、ＢＡ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲまたは受容体を発
現しないＢａ／Ｆ３細胞の存在下で、従前に記載したご
とくにバイオアッセイ緩衝液中に１０％まで希釈した。
４８−７２時間後、増殖の量につきアッセイを評価し、
０＝目に見える細胞無し、１＝ウェルの２５％未満が被
覆、２＝ウェルの２５−５０％が被覆、３＝ウェルの５
０−７５％が被覆、および４＝ウェルの７５％を越えて
被覆としてスコア取りした。ＮＴ＝テストせず。ＶＥＧ
Ｆ突然変異体の発現レベルは、ＶＥＧＦに対する抗血清
を含む培地でコンディショニングした35Ｓ−Ｍｅｔ／Ｃ
ｙｓ標識ＣＯＳ細胞の免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ
による分析によって評価した。結果を表７に示す。
ストラクトをＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、条件培
地をトランスフェクションの７日後に収集した。条件培
地を、ＢＡ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲまたは受容体を発
現しないＢａ／Ｆ３細胞の存在下で、従前に記載したご
とくにバイオアッセイ緩衝液中に１０％まで希釈した。
４８−７２時間後、増殖の量につきアッセイを評価し、
０＝目に見える細胞無し、１＝ウェルの２５％未満が被
覆、２＝ウェルの２５−５０％が被覆、３＝ウェルの５
０−７５％が被覆、および４＝ウェルの７５％を越えて
被覆としてスコア取りした。ＮＴ＝テストせず。ＶＥＧ
Ｆ突然変異体の発現レベルは、ＶＥＧＦに対する抗血清
を含む培地でコンディショニングした35Ｓ−Ｍｅｔ／Ｃ
ｙｓ標識ＣＯＳ細胞の免疫沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ
による分析によって評価した。結果を表７に示す。
【００５５】
【表７】
【００５６】前記突然変異体を、適当な対照を用いるマ
イルズ(Miles)アッセイによって、血管透過性を誘導す
るまたは阻害するそれらの能力につきテストした。この
アッセイは、青色色素を動物に投与し、これは動物の血
管に分布され、次いで、該動物に突然変異体を皮内注射
し、血管透過性に対する効果を観察することを含む。
イルズ(Miles)アッセイによって、血管透過性を誘導す
るまたは阻害するそれらの能力につきテストした。この
アッセイは、青色色素を動物に投与し、これは動物の血
管に分布され、次いで、該動物に突然変異体を皮内注射
し、血管透過性に対する効果を観察することを含む。
【００５７】以下の実施例７ないし実施例９は前記アッ
セイで用いる組換え受容体の生産に関する。実施例７な
いし実施例９に用いる試薬は以下の通りである。ＦＬＡ
ＧTMオクタペプチド上の内部エピトープを認識する精製
Ｍ２モノクローナル抗体（カタログ番号ＩＢ１３０２
５）、Ｍ２−ゲル（ＩＢ１３０２１）および遊離ＦＬＡ
ＧTMペプチド（ＩＢ１３０７０）はInternational Biot
echnologies, New Haven, CTから入手した。ＶＥＧＦ
（１６５アミノ酸形態）をコードするｃＤＮＡクローン
は、逆転写されたマウス結腸ｍＲＮＡからＰＣＲによっ
て単離した。該ＶＥＧＦ ｃＤＮＡを配列決定し、公知
の配列（ブライアー(Breier)他，1992）と同一であるこ
とが判明した。ＶＥＧＦをコードする断片をｐＥＥ６ベ
クターにサブクローニングし、後記するごとくにＣＨＯ
細胞にトランスフェクトした。安定にトランスフェクト
されたＣＨＯ細胞からの上清を収集し、ＮＹＫ−ＥＸ−
ＦＬＡＧTM結合実験に使用した（後記参照）。このよう
にして生じたＶＥＧＦの生物活性をMilesの血管透過性
アッセイ（Miles およびMiles,1952) で評価し、ＶＥＧ
Ｆは機能的であることが判明した。
セイで用いる組換え受容体の生産に関する。実施例７な
いし実施例９に用いる試薬は以下の通りである。ＦＬＡ
ＧTMオクタペプチド上の内部エピトープを認識する精製
Ｍ２モノクローナル抗体（カタログ番号ＩＢ１３０２
５）、Ｍ２−ゲル（ＩＢ１３０２１）および遊離ＦＬＡ
ＧTMペプチド（ＩＢ１３０７０）はInternational Biot
echnologies, New Haven, CTから入手した。ＶＥＧＦ
（１６５アミノ酸形態）をコードするｃＤＮＡクローン
は、逆転写されたマウス結腸ｍＲＮＡからＰＣＲによっ
て単離した。該ＶＥＧＦ ｃＤＮＡを配列決定し、公知
の配列（ブライアー(Breier)他，1992）と同一であるこ
とが判明した。ＶＥＧＦをコードする断片をｐＥＥ６ベ
クターにサブクローニングし、後記するごとくにＣＨＯ
細胞にトランスフェクトした。安定にトランスフェクト
されたＣＨＯ細胞からの上清を収集し、ＮＹＫ−ＥＸ−
ＦＬＡＧTM結合実験に使用した（後記参照）。このよう
にして生じたＶＥＧＦの生物活性をMilesの血管透過性
アッセイ（Miles およびMiles,1952) で評価し、ＶＥＧ
Ｆは機能的であることが判明した。
【００５８】実施例７ないし実施例９に用いるオリゴヌ
クレオチドは以下の通りである。全てのオリゴヌクレオ
チドは、Ludwig Institute for Cancer ResearchのJoin
t Protein Structure Laboratoryおよび The Walter an
d Eliza Hall Instituteによって合成された。ＦＬＡＧ
TMリンカーオリゴヌクレオチドは３５ヌクレオチドにわ
たって相補的な２本の３９量体として合成され、これ
は、ＢｇｌＩＩ粘着末端に対応する４塩基突出を生じる
（図５）。
クレオチドは以下の通りである。全てのオリゴヌクレオ
チドは、Ludwig Institute for Cancer ResearchのJoin
t Protein Structure Laboratoryおよび The Walter an
d Eliza Hall Instituteによって合成された。ＦＬＡＧ
TMリンカーオリゴヌクレオチドは３５ヌクレオチドにわ
たって相補的な２本の３９量体として合成され、これ
は、ＢｇｌＩＩ粘着末端に対応する４塩基突出を生じる
（図５）。
【００５９】図５は、ＦＬＡＧTMリンカーオリゴヌクレ
オチドの配列を示す。該リンカー配列はイン−フレーム
停止コドンを含めた、ＦＬＡＧTMオクタペプチドをコー
ドする。ＢｇｌＩＩ適合突出が両末端に存在して、Ｂｇ
ｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、ＮｄｅＩＩまたはＸｈ
ｏＩＩで切断したＤＮＡへの連結を可能とする。内部Ｃ
ｌａＩ部位は連結反応における組換体の同定を可能とす
る。該オリゴヌクレオチドは、ＦＬＡＧTMオクタペプチ
ドのアミノ酸配列、インーフレーム停止コドンおよび組
換体の選抜用のＣｌａＩ制限酵素切断部位をコードし
た。オリゴヌクレオチドリンカーを、従前に記載されて
いるように（サムブルック(Sambrook)他，1989）、常法
を用いてポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、連結
に先立って３７℃で１時間アニーリングした。ＢｇｌＩ
ＩまたはＢａｍＨＩ部位を導入した突然変異誘発性オリ
ゴヌクレオチド（２７−３５量体）を、疎水性プロット
によって規定される、受容体細胞外／膜貫通境界におけ
る配列に対して作成した。
オチドの配列を示す。該リンカー配列はイン−フレーム
停止コドンを含めた、ＦＬＡＧTMオクタペプチドをコー
ドする。ＢｇｌＩＩ適合突出が両末端に存在して、Ｂｇ
ｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、ＮｄｅＩＩまたはＸｈ
ｏＩＩで切断したＤＮＡへの連結を可能とする。内部Ｃ
ｌａＩ部位は連結反応における組換体の同定を可能とす
る。該オリゴヌクレオチドは、ＦＬＡＧTMオクタペプチ
ドのアミノ酸配列、インーフレーム停止コドンおよび組
換体の選抜用のＣｌａＩ制限酵素切断部位をコードし
た。オリゴヌクレオチドリンカーを、従前に記載されて
いるように（サムブルック(Sambrook)他，1989）、常法
を用いてポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、連結
に先立って３７℃で１時間アニーリングした。ＢｇｌＩ
ＩまたはＢａｍＨＩ部位を導入した突然変異誘発性オリ
ゴヌクレオチド（２７−３５量体）を、疎水性プロット
によって規定される、受容体細胞外／膜貫通境界におけ
る配列に対して作成した。
【００６０】［実施例７ 部位特異的突然変異誘発およ
びリンカー配列の連結］ＮＹＫ、ｔｉｅ２およびＲＹＫ
の細胞外ドメインを単離するために開発したストラテジ
ーを図６にまとめる。図６は、増殖因子受容体細胞外ド
メイン−ＦＬＡＧTM融合タンパク質を作成するのに使用
した方法を模式的に示す。要約すると、突然変異体受容
体をＢｇｌＩＩまたはＢａｍＨＩで切断した後、ＦＬＡ
ＧTMリンカーオリゴヌクレオチドを一緒に連結し、細胞
外ドメイン配列とインフレームであるＦＬＡＧTM配列を
含有する組換体を選択した。まず、ＣＯＳ細胞における
一過性発現によってＦＬＡＧTM−融合タンパク質が発現
される能力をアッセイし、次いで、インサートを、Ｘｂ
ａＩを用いてＣＨＯ細胞発現ベクターに移した。
びリンカー配列の連結］ＮＹＫ、ｔｉｅ２およびＲＹＫ
の細胞外ドメインを単離するために開発したストラテジ
ーを図６にまとめる。図６は、増殖因子受容体細胞外ド
メイン−ＦＬＡＧTM融合タンパク質を作成するのに使用
した方法を模式的に示す。要約すると、突然変異体受容
体をＢｇｌＩＩまたはＢａｍＨＩで切断した後、ＦＬＡ
ＧTMリンカーオリゴヌクレオチドを一緒に連結し、細胞
外ドメイン配列とインフレームであるＦＬＡＧTM配列を
含有する組換体を選択した。まず、ＣＯＳ細胞における
一過性発現によってＦＬＡＧTM−融合タンパク質が発現
される能力をアッセイし、次いで、インサートを、Ｘｂ
ａＩを用いてＣＨＯ細胞発現ベクターに移した。
【００６１】以下にこのストラテジーについて詳述す
る。部位特異的突然変異誘発を用いて、ｃＤＮＡの突然
変異形態を生じさせ、オリゴヌクレオチドの組（図５）
においてコードされるＦＬＡＧTM配列がインーフレーム
にて位置するのを可能とし、それにより、適切な細胞外
ドメイン−ＦＬＡＧTM融合タンパク質が生じた。最初
に、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを用い、部位特
異的突然変異誘発を増殖因子受容体の一本鎖ＤＮＡに対
して行って、ＢｇｌＩＩまたはＢａｍＨＩ部位いずれか
を細胞外領域および膜貫通領域の境界に導入した。Ｂｇ
ｌＩＩ酵素部位はＮＹＫおよびＲＹＫｃＤＮＡに導入
し、他方、ＢａｍＨＩ部位は、存在するＢｇｌＩＩ部位
のため、ｔｉｅ２ｃＤＮＡに導入した。
る。部位特異的突然変異誘発を用いて、ｃＤＮＡの突然
変異形態を生じさせ、オリゴヌクレオチドの組（図５）
においてコードされるＦＬＡＧTM配列がインーフレーム
にて位置するのを可能とし、それにより、適切な細胞外
ドメイン−ＦＬＡＧTM融合タンパク質が生じた。最初
に、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを用い、部位特
異的突然変異誘発を増殖因子受容体の一本鎖ＤＮＡに対
して行って、ＢｇｌＩＩまたはＢａｍＨＩ部位いずれか
を細胞外領域および膜貫通領域の境界に導入した。Ｂｇ
ｌＩＩ酵素部位はＮＹＫおよびＲＹＫｃＤＮＡに導入
し、他方、ＢａｍＨＩ部位は、存在するＢｇｌＩＩ部位
のため、ｔｉｅ２ｃＤＮＡに導入した。
【００６２】マウスＮＹＫ／ＦＬＫ−１／ＶＥＧＦＲ２
受容体、マウスｔｉｅ２受容体およびヒトＲＹＫ受容体
をコードする全長ｃＤＮＡクローンを、ＢｓｔＸＩ制限
酵素切断部位およびＢｓｔＸＩリンカーを用いて、哺乳
動物発現ベクターｐＣＤＭ８（Invitrogen）にサブクロ
ーニングした。一本鎖ＵＴＰ−含有ＤＮＡ（クンケル(K
unkel), 1985）が生じ、所要の制限酵素切断部位をコー
ドしたＮＹＫ、ｔｉｅ２およびＲＹＫ ｃＤＮＡの突然
変異体を作成するための鋳型として用いた。（DNA STAR
TMソフトウェアを用いて、疎水性プロット（カイト(Kyt
e)およびドゥーリトル(Dolittle), 1982）によって判断
して）それらの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインの
境界部分にＢｇｌＩＩまたはＢａｍＨＩ部位を含有する
突然変異体受容体ｃＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、
脱リン酸化し、ＦＬＡＧTMマーカーペプチドをコードす
るオリゴヌクレオチドリンカー配列（ＩＢＩ）；5' GATCTGACTACAAGGACGACGACGATGACAAGTGAATCGATA3', （Ｎ）Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-末端（Ｃ） と連結した。ユニークＣｌａ部位をオリゴヌクレオチド
の３’末端に備えさせ、組換体をＣｌａＩ制限酵素切断
によって選抜した。全てのクローンをシークエンシング
して、他の突然変異が導入されておらず、ＦＬＡＧTM配
列が正しい向きであることを保証した。該ＦＬＡＧTM融
合タンパク質を、各々、ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM、ｔ
ｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMおよびＲＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡ
ＧTMと命名した。
受容体、マウスｔｉｅ２受容体およびヒトＲＹＫ受容体
をコードする全長ｃＤＮＡクローンを、ＢｓｔＸＩ制限
酵素切断部位およびＢｓｔＸＩリンカーを用いて、哺乳
動物発現ベクターｐＣＤＭ８（Invitrogen）にサブクロ
ーニングした。一本鎖ＵＴＰ−含有ＤＮＡ（クンケル(K
unkel), 1985）が生じ、所要の制限酵素切断部位をコー
ドしたＮＹＫ、ｔｉｅ２およびＲＹＫ ｃＤＮＡの突然
変異体を作成するための鋳型として用いた。（DNA STAR
TMソフトウェアを用いて、疎水性プロット（カイト(Kyt
e)およびドゥーリトル(Dolittle), 1982）によって判断
して）それらの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインの
境界部分にＢｇｌＩＩまたはＢａｍＨＩ部位を含有する
突然変異体受容体ｃＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、
脱リン酸化し、ＦＬＡＧTMマーカーペプチドをコードす
るオリゴヌクレオチドリンカー配列（ＩＢＩ）；5' GATCTGACTACAAGGACGACGACGATGACAAGTGAATCGATA3', （Ｎ）Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-末端（Ｃ） と連結した。ユニークＣｌａ部位をオリゴヌクレオチド
の３’末端に備えさせ、組換体をＣｌａＩ制限酵素切断
によって選抜した。全てのクローンをシークエンシング
して、他の突然変異が導入されておらず、ＦＬＡＧTM配
列が正しい向きであることを保証した。該ＦＬＡＧTM融
合タンパク質を、各々、ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM、ｔ
ｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMおよびＲＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡ
ＧTMと命名した。
【００６３】切断したベクター断片に容易に連結された
小さなリン酸化ＦＬＡＧTMリンカーオリゴヌクレオチド
（３９量体）、および組換体を、内部ＣｌａＩ部位を使
用することによって、正確に検出した。
小さなリン酸化ＦＬＡＧTMリンカーオリゴヌクレオチド
（３９量体）、および組換体を、内部ＣｌａＩ部位を使
用することによって、正確に検出した。
【００６４】［実施例８ 細胞培養］３７℃および５％
ＣＯ2にて、１０％ＦＣＳおよび５０μｇ／ｍｌゲンタ
マイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地にＣＯＳ細胞を
維持した。従前に記載されているごとくに（アルッフォ
(Aruffo)およびシード(Seed), 1987）、ＤＥＡＥデキス
トラン方法によってＣＯＳ細胞をトランスフェクトし
た。ｐＥＥ６−ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM、ｐＥＥ６−
ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMおよびｐＥＥ６−ＲＹＫ−
ＥＸ−ＦＬＡＧTMコンストラクトをリン酸カルシウム沈
殿によってＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトし、１
０％胎児ウシ血清、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、非
必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよび２５ｍＭメ
チオニンスルホキシド（ＭＳＸ）を補足した、グラスゴ
ウ修飾イーグル培地（Ｌ−グルタミンを含まず、ＮａＨ
ＣＯ3を含まない、Cytocystems, Castle Hill, N.S.
W.）中で選抜した。２ｍＭ酪酸ナトリウムの存在下、ロ
ーラーボトル中、Cytodex-3 ビーズ（Pharmacia,Uppsal
a,スウェーデン）上で細胞を培養することによって、タ
ンパク質のバルク生産を達成した。細胞は約８０−９０
％密集に到達するまで増殖させた。条件培地は新鮮な培
地と交換することにより、毎週採取した。接種から１６
−２０日後に、上清をローラーボトルから回収し、プロ
テアーゼ阻害剤の以下の混合物を添加した：０．０２％
ＮａＮ3、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２ＴＩＵ／ｍｌア
プロチニン、１０μｇ／ｍｌペプスタチンおよび０．５
ｍＭ ＥＤＴＡ。上清を直接使用するか、あるいは使用
に先立って−７０℃で保存した。
ＣＯ2にて、１０％ＦＣＳおよび５０μｇ／ｍｌゲンタ
マイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地にＣＯＳ細胞を
維持した。従前に記載されているごとくに（アルッフォ
(Aruffo)およびシード(Seed), 1987）、ＤＥＡＥデキス
トラン方法によってＣＯＳ細胞をトランスフェクトし
た。ｐＥＥ６−ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM、ｐＥＥ６−
ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMおよびｐＥＥ６−ＲＹＫ−
ＥＸ−ＦＬＡＧTMコンストラクトをリン酸カルシウム沈
殿によってＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトし、１
０％胎児ウシ血清、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、非
必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよび２５ｍＭメ
チオニンスルホキシド（ＭＳＸ）を補足した、グラスゴ
ウ修飾イーグル培地（Ｌ−グルタミンを含まず、ＮａＨ
ＣＯ3を含まない、Cytocystems, Castle Hill, N.S.
W.）中で選抜した。２ｍＭ酪酸ナトリウムの存在下、ロ
ーラーボトル中、Cytodex-3 ビーズ（Pharmacia,Uppsal
a,スウェーデン）上で細胞を培養することによって、タ
ンパク質のバルク生産を達成した。細胞は約８０−９０
％密集に到達するまで増殖させた。条件培地は新鮮な培
地と交換することにより、毎週採取した。接種から１６
−２０日後に、上清をローラーボトルから回収し、プロ
テアーゼ阻害剤の以下の混合物を添加した：０．０２％
ＮａＮ3、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．２ＴＩＵ／ｍｌア
プロチニン、１０μｇ／ｍｌペプスタチンおよび０．５
ｍＭ ＥＤＴＡ。上清を直接使用するか、あるいは使用
に先立って−７０℃で保存した。
【００６５】該コンストラクトおよび対照をＣＯＳ細胞
にトランスフェクトし、トランスフェクションの３日後
に上清を融合タンパク質につき分析した。図７は、ＣＯ
Ｓ細胞へのコンストラクトの一過性トランスフェクショ
ンおよび免疫沈降による検出の結果を示す。パネル
（Ａ）はＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM−ＣＤＭ８を示す；
パネル（Ｂ）はｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTM−ＣＤＭ８
を示す；各場合、ＣＤＭ８単独を対照として用いる。Ｎ
ＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM−ＣＤＭ８（Ａ）、ｔｉｅ２−
ＥＸ−ＦＬＡＧTM−ＣＤＭ８（Ｂ）およびＣＤＭ８単独
（ＡおよびＢ）を、ＤＥＡＥデキストラン方法によって
ＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。細胞を 35Ｓ−シス
テイン／メチオニンで生合成的に１６時間標識し、上清
をＭ２−ゲルで免疫沈降させた。洗浄したビーズをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって分析した。該ゲルを乾燥し、標識したタンパク
質を、貯蔵リンスクリーニングに暴露し、４００シリー
ズのPhosphorimagerおよびImagequant v.3.0ソフトウェ
ア(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) を用いて分析
することによって検出した。
にトランスフェクトし、トランスフェクションの３日後
に上清を融合タンパク質につき分析した。図７は、ＣＯ
Ｓ細胞へのコンストラクトの一過性トランスフェクショ
ンおよび免疫沈降による検出の結果を示す。パネル
（Ａ）はＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM−ＣＤＭ８を示す；
パネル（Ｂ）はｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTM−ＣＤＭ８
を示す；各場合、ＣＤＭ８単独を対照として用いる。Ｎ
ＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM−ＣＤＭ８（Ａ）、ｔｉｅ２−
ＥＸ−ＦＬＡＧTM−ＣＤＭ８（Ｂ）およびＣＤＭ８単独
（ＡおよびＢ）を、ＤＥＡＥデキストラン方法によって
ＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。細胞を 35Ｓ−シス
テイン／メチオニンで生合成的に１６時間標識し、上清
をＭ２−ゲルで免疫沈降させた。洗浄したビーズをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ試料緩衝液で溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって分析した。該ゲルを乾燥し、標識したタンパク
質を、貯蔵リンスクリーニングに暴露し、４００シリー
ズのPhosphorimagerおよびImagequant v.3.0ソフトウェ
ア(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) を用いて分析
することによって検出した。
【００６６】細胞の生合成標識、Ｍ２−ゲルでの免疫沈
降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、図７に示すごとく予
測されたサイズの生成物を示した。ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬ
ＡＧ TMについての１２０−１３０ｋＤ（図７Ａ）、およ
びｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧ TMについての１００−１１
０−ｋＤ（図７Ｂ）の範囲における散漫なバンドがＭ２
−ゲルで特異的に免疫沈降した。成熟細胞表面受容体の
免疫沈降から予測される（ランティング(Runting) 他，
1993; スタッカー(Stacker) 他，1993）、Ｎ−結合糖鎖
付加の寄与を含めた、ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM、ｔｉ
ｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMおよびＲＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧ
TM融合タンパク質についての予測されるサイズは、各
々、１２５，０００ダルトン、９５，０００ダルトンお
よび３８，０００ダルトンである。ＣＯＳ細胞における
これらの初期実験は、（ｉ）ＦＬＡＧTMペプチドは受容
体細胞外ドメインのＣ−末端に発現させることができ
る、（ｉｉ）ＦＬＡＧTM−融合タンパク質は細胞によっ
て分泌される、および（ｉｉｉ）ＦＬＡＧTM−融合タン
パク質はＭ２抗体によって効果的に認識され得ることを
示した。
降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、図７に示すごとく予
測されたサイズの生成物を示した。ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬ
ＡＧ TMについての１２０−１３０ｋＤ（図７Ａ）、およ
びｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧ TMについての１００−１１
０−ｋＤ（図７Ｂ）の範囲における散漫なバンドがＭ２
−ゲルで特異的に免疫沈降した。成熟細胞表面受容体の
免疫沈降から予測される（ランティング(Runting) 他，
1993; スタッカー(Stacker) 他，1993）、Ｎ−結合糖鎖
付加の寄与を含めた、ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM、ｔｉ
ｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMおよびＲＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧ
TM融合タンパク質についての予測されるサイズは、各
々、１２５，０００ダルトン、９５，０００ダルトンお
よび３８，０００ダルトンである。ＣＯＳ細胞における
これらの初期実験は、（ｉ）ＦＬＡＧTMペプチドは受容
体細胞外ドメインのＣ−末端に発現させることができ
る、（ｉｉ）ＦＬＡＧTM−融合タンパク質は細胞によっ
て分泌される、および（ｉｉｉ）ＦＬＡＧTM−融合タン
パク質はＭ２抗体によって効果的に認識され得ることを
示した。
【００６７】次いで、コンストラクトをＣＨＯ細胞発現
ベクターｐＥＥ６にサブクローニングし、ＣＨＯ細胞に
トランスフェクトした。安定にトランスフェクトされた
ＣＨＯ細胞の上清を、生合成標識に続く免疫沈降によっ
て融合タンパク質の発現につきスクリーニングした。予
測されるサイズの融合タンパク質を生成するクローンを
選抜し、分泌タンパク質の大規模生産を試みた。２５ｍ
Ｍ ＭＳＸにおけるトランスフェクトＣＨＯ細胞の発現
レベルは十分であり（０．５−１．０μｇ／ｍｌ）、従
って、大量のＭＳＸにおける選抜は試みなかった。ＣＨ
Ｏ細胞をローラーボトル中、Cytodex-3 ビーズ上で増殖
させ、消費された組織培養上清のｍｌ当たり１μｇの融
合タンパク質の範囲で生産された。
ベクターｐＥＥ６にサブクローニングし、ＣＨＯ細胞に
トランスフェクトした。安定にトランスフェクトされた
ＣＨＯ細胞の上清を、生合成標識に続く免疫沈降によっ
て融合タンパク質の発現につきスクリーニングした。予
測されるサイズの融合タンパク質を生成するクローンを
選抜し、分泌タンパク質の大規模生産を試みた。２５ｍ
Ｍ ＭＳＸにおけるトランスフェクトＣＨＯ細胞の発現
レベルは十分であり（０．５−１．０μｇ／ｍｌ）、従
って、大量のＭＳＸにおける選抜は試みなかった。ＣＨ
Ｏ細胞をローラーボトル中、Cytodex-3 ビーズ上で増殖
させ、消費された組織培養上清のｍｌ当たり１μｇの融
合タンパク質の範囲で生産された。
【００６８】［実施例９ 融合タンパク質の精製］ＮＹ
Ｋ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMお
よびＲＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMを、Ｍ２（抗−ＦＬＡＧ
TM）ゲル（ＩＢＩ）のアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いて、トランスフェクトＣＨＯ細胞によりコンデ
ィショニングした培地から精製した。別のカラムを各受
容体コンストラクト用に使用した。上清（１００−２０
０ｍｌ）をＭ２−ゲルの１−２ｍｌカラムに通し、これ
を引き続いて１０容量の１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Tween 2
0 ；１０容量の５０ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）ｐ
Ｈ１０．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Tween
20 および再度１０容量の１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Tween
20 で洗浄した。要求されるタンパク質の収率および純
度に依存して、この工程は必要ではない。（１／１０容
量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．６中で中和し
た）１００ｍＭグリシン−ＨＣｌ ｐＨ３．０、０．０
２％ Tween、または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Tween 20
中の２５−５０μｇ／ｍｌ ＦＬＡＧTMペプチド（Ｎ−
Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｐ−Ｌｙｓ−Ｃ）いずれかで結合した物質を溶出させ
た。カラムを１ｍｌずつの画分にて溶出させ、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥによって、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液
１０μｌと混合した１０μｌ試料を分析し、銀染色によ
ってタンパク質を検出した。遊離ペプチドでの脱着に続
き、アフィニティー樹脂を０．１ＭグリシンｐＨ３．０
で処理して、次の精製サイクルに先立って結合ペプチド
を除去した。センサーチップへのカップリングおよび遊
離ＦＬＡＧTMペプチドの除去のために、融合タンパク質
を、μMonoQ PC 1.615アニオン交換カラム（Pharmacia)
の、無トリス緩衝液系（ナイス(Nice)他，1994）にての
高性能液体クロマトグラフィーによってさらに精製し
て、ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬ
ＡＧTMおよびＲＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMいずれかに対応
する単一の均一種を得た。
Ｋ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMお
よびＲＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMを、Ｍ２（抗−ＦＬＡＧ
TM）ゲル（ＩＢＩ）のアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いて、トランスフェクトＣＨＯ細胞によりコンデ
ィショニングした培地から精製した。別のカラムを各受
容体コンストラクト用に使用した。上清（１００−２０
０ｍｌ）をＭ２−ゲルの１−２ｍｌカラムに通し、これ
を引き続いて１０容量の１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Tween 2
0 ；１０容量の５０ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）ｐ
Ｈ１０．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Tween
20 および再度１０容量の１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Tween
20 で洗浄した。要求されるタンパク質の収率および純
度に依存して、この工程は必要ではない。（１／１０容
量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．６中で中和し
た）１００ｍＭグリシン−ＨＣｌ ｐＨ３．０、０．０
２％ Tween、または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Tween 20
中の２５−５０μｇ／ｍｌ ＦＬＡＧTMペプチド（Ｎ−
Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｐ−Ｌｙｓ−Ｃ）いずれかで結合した物質を溶出させ
た。カラムを１ｍｌずつの画分にて溶出させ、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥによって、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液
１０μｌと混合した１０μｌ試料を分析し、銀染色によ
ってタンパク質を検出した。遊離ペプチドでの脱着に続
き、アフィニティー樹脂を０．１ＭグリシンｐＨ３．０
で処理して、次の精製サイクルに先立って結合ペプチド
を除去した。センサーチップへのカップリングおよび遊
離ＦＬＡＧTMペプチドの除去のために、融合タンパク質
を、μMonoQ PC 1.615アニオン交換カラム（Pharmacia)
の、無トリス緩衝液系（ナイス(Nice)他，1994）にての
高性能液体クロマトグラフィーによってさらに精製し
て、ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM、ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬ
ＡＧTMおよびＲＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMいずれかに対応
する単一の均一種を得た。
【００６９】トランスフェクトしたＣＨＯ細胞でコンデ
ィショニングした培地からの融合タンパク質の精製のた
めに開発したストラテジーは、Ｍ２−抗体カラム上の単
一のイムノアフィニティークロマトグラフィー工程（Ｃ
ＨＯ細胞上清１００ｍｌ当たりに２ｍｌの充填ビーズ）
を含むものであった。過剰の遊離ＦＬＡＧTMペプチドで
タンパク質をカラムから溶出させ、微細孔アニオン交換
ＨＰＬＣによって均一にするためのさらなる精製を達成
した。また、これにより過剰の遊離ＦＬＡＧTMペプチド
の除去を可能とした。非特異的タンパク質の脱着は、各
々、ｐＨ８．０およびｐＨ１０．０の緩衝液を含む２工
程洗浄方法によって達成した。このプロトコールは、図
８に示した、精製画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって
判断して、コンタミナントの大部分を除去するのに十分
であった。
ィショニングした培地からの融合タンパク質の精製のた
めに開発したストラテジーは、Ｍ２−抗体カラム上の単
一のイムノアフィニティークロマトグラフィー工程（Ｃ
ＨＯ細胞上清１００ｍｌ当たりに２ｍｌの充填ビーズ）
を含むものであった。過剰の遊離ＦＬＡＧTMペプチドで
タンパク質をカラムから溶出させ、微細孔アニオン交換
ＨＰＬＣによって均一にするためのさらなる精製を達成
した。また、これにより過剰の遊離ＦＬＡＧTMペプチド
の除去を可能とした。非特異的タンパク質の脱着は、各
々、ｐＨ８．０およびｐＨ１０．０の緩衝液を含む２工
程洗浄方法によって達成した。このプロトコールは、図
８に示した、精製画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって
判断して、コンタミナントの大部分を除去するのに十分
であった。
【００７０】図８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色に
よるアフィニティー−精製した融合タンパク質の分析の
結果を示す。（Ａ）ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM（レーン
１−５、２５μｇ／ｍｌのＦＬＡＧTMペプチドで溶出、
レーン６−８、グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０で溶
出）、（Ｂ）ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTM（レーン１−
３、２５μｇ／ｍｌＦＬＡＧTMペプチドで溶出、レーン
４および５、５０μｇ／ｍｌペプチドで溶出、およびレ
ーン６−９、グリシン−ＨＣｌｐＨ３．０で溶出）、お
よび（Ｃ）ＲＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM（２５μｇ／ｍｌ
の遊離ＦＬＡＧTMペプチドで溶出、レーン１−４、レー
ン１＝ボイド容量）を発現するＣＨＯ細胞系からの消費
された組織培養上清を独立したＭ２−ゲルアフィニティ
ーカラムに通し、前記したごとくに洗浄した。溶出は、
遊離ＦＬＡＧTMペプチド（２５−５０μｇ／ｍｌ）、ま
たは０．０２％ Tween 20 を含有する０．１Ｍグリシン
ｐＨ３．０で行った。溶出したタンパク質を還元条件下
でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、銀染色によって検
出した。分子量マーカーを示す。
よるアフィニティー−精製した融合タンパク質の分析の
結果を示す。（Ａ）ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM（レーン
１−５、２５μｇ／ｍｌのＦＬＡＧTMペプチドで溶出、
レーン６−８、グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．０で溶
出）、（Ｂ）ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTM（レーン１−
３、２５μｇ／ｍｌＦＬＡＧTMペプチドで溶出、レーン
４および５、５０μｇ／ｍｌペプチドで溶出、およびレ
ーン６−９、グリシン−ＨＣｌｐＨ３．０で溶出）、お
よび（Ｃ）ＲＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTM（２５μｇ／ｍｌ
の遊離ＦＬＡＧTMペプチドで溶出、レーン１−４、レー
ン１＝ボイド容量）を発現するＣＨＯ細胞系からの消費
された組織培養上清を独立したＭ２−ゲルアフィニティ
ーカラムに通し、前記したごとくに洗浄した。溶出は、
遊離ＦＬＡＧTMペプチド（２５−５０μｇ／ｍｌ）、ま
たは０．０２％ Tween 20 を含有する０．１Ｍグリシン
ｐＨ３．０で行った。溶出したタンパク質を還元条件下
でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、銀染色によって検
出した。分子量マーカーを示す。
【００７１】ＮＹＫ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMおよびｔｉｅ２
−ＥＸ−ＦＬＡＧTMの精製により、各々、１２０−１３
０ｋＤおよび１００−１１０ｋＤのサイズ範囲に圧倒的
なバンドを生じた（図８Ａおよび８Ｂ）。ＲＹＫ−ＥＸ
−ＦＬＡＧTMの精製および分析により、予測される３５
−４０ｋＤ種に加えて、一定範囲の他の高分子量タンパ
ク質が生じた（図８Ｃ）。これらは全てのＲＹＫ−ＥＸ
−ＦＬＡＧTM精製物に常に存在し、融合タンパク質のオ
リゴマー化形態を表し得る。２５−５０μｇ／ｍｌのＦ
ＬＡＧTMペプチドとの競合は、０．１Ｍグリシン−ＨＣ
ｌ ｐＨ３．０でのカラムのさらなる溶出は融合タンパ
ク質をあるとしてもほとんど生じなかったので、結合し
た細胞外ドメイン−ＦＬＡＧTMを除去するのに十分であ
った（図８Ａ−Ｃ）。興味深いことに、低ｐＨでの溶出
では、ＦＬＡＧTMペプチド単独での溶出よりも試料中の
コンタミナントタンパク質をより多く生じた。図８Ｂ
（レーン６−９）は、ペプチド溶出物質では観察されな
かった低ｐＨ溶出物における一定範囲のコンタミナント
を示す。我々は、ＦＬＡＧTMペプチドがＦＬＡＧTM−Ｍ
２相互作用のみを溶出させるその能力において比較的特
異的であり、ほとんどの他の非特異的相互作用を解離さ
せないと結論する。我々は、ｐＨ３．０処理後において
カラムから溶出する少量の高分子量物質、恐らくは免疫
グロブリンを検出した；これは、ｐＨ８．０においてペ
プチドでは溶出されなかった。μmonoQカラムでのＭ２
−アフィニティー溶出物の分画により、遊離ＦＬＡＧTM
ペプチドが効果的に除去され、これは、さらなる使用で
リサイクルできるだろう。ＣＨＯ細胞でコンディショニ
ングした培地からのＨＰＬＣ精製細胞外ドメインの我々
の総じての収率は１００ｍｌ当たり８０μｇのタンパク
質のオーダーであると計算された。
−ＥＸ−ＦＬＡＧTMの精製により、各々、１２０−１３
０ｋＤおよび１００−１１０ｋＤのサイズ範囲に圧倒的
なバンドを生じた（図８Ａおよび８Ｂ）。ＲＹＫ−ＥＸ
−ＦＬＡＧTMの精製および分析により、予測される３５
−４０ｋＤ種に加えて、一定範囲の他の高分子量タンパ
ク質が生じた（図８Ｃ）。これらは全てのＲＹＫ−ＥＸ
−ＦＬＡＧTM精製物に常に存在し、融合タンパク質のオ
リゴマー化形態を表し得る。２５−５０μｇ／ｍｌのＦ
ＬＡＧTMペプチドとの競合は、０．１Ｍグリシン−ＨＣ
ｌ ｐＨ３．０でのカラムのさらなる溶出は融合タンパ
ク質をあるとしてもほとんど生じなかったので、結合し
た細胞外ドメイン−ＦＬＡＧTMを除去するのに十分であ
った（図８Ａ−Ｃ）。興味深いことに、低ｐＨでの溶出
では、ＦＬＡＧTMペプチド単独での溶出よりも試料中の
コンタミナントタンパク質をより多く生じた。図８Ｂ
（レーン６−９）は、ペプチド溶出物質では観察されな
かった低ｐＨ溶出物における一定範囲のコンタミナント
を示す。我々は、ＦＬＡＧTMペプチドがＦＬＡＧTM−Ｍ
２相互作用のみを溶出させるその能力において比較的特
異的であり、ほとんどの他の非特異的相互作用を解離さ
せないと結論する。我々は、ｐＨ３．０処理後において
カラムから溶出する少量の高分子量物質、恐らくは免疫
グロブリンを検出した；これは、ｐＨ８．０においてペ
プチドでは溶出されなかった。μmonoQカラムでのＭ２
−アフィニティー溶出物の分画により、遊離ＦＬＡＧTM
ペプチドが効果的に除去され、これは、さらなる使用で
リサイクルできるだろう。ＣＨＯ細胞でコンディショニ
ングした培地からのＨＰＬＣ精製細胞外ドメインの我々
の総じての収率は１００ｍｌ当たり８０μｇのタンパク
質のオーダーであると計算された。
【００７２】Ｍ２アフィニティーカラムから溶出する物
質が天然のコンフォメーションであることを確認するた
めに、実施例１に記載したごとくに、ＮＹＫ−ＥＸ−Ｆ
ＬＡＧTM融合タンパク質を、公知のリガンド、血管内皮
増殖因子（ＶＥＧＦ）（ミローア（Millauer）他，199
3）に結合するその能力につきテストした。
質が天然のコンフォメーションであることを確認するた
めに、実施例１に記載したごとくに、ＮＹＫ−ＥＸ−Ｆ
ＬＡＧTM融合タンパク質を、公知のリガンド、血管内皮
増殖因子（ＶＥＧＦ）（ミローア（Millauer）他，199
3）に結合するその能力につきテストした。
【００７３】
【発明の効果】本発明により、受容体タンパク質ＮＹＫ
に結合できるリガンド、および生物学的試料中の受容体
タンパク質ＮＹＫのリガンド、さらに受容体タンパク質
ＮＹＫの活性を阻害または増大させる能力のある分子
を、非常に高感度で検出するアッセイを提供することが
出来た。検出されたＮＹＫリガンドであるＶＥＧＦは、
この分子が腫瘍および糖尿病網膜症のマーカーであるの
で重要である。また、ＮＹＫとそのリガンドとの相互作
用を阻害できる分子は血管新生を阻害できるため、腫瘍
療法などに有用であると考えられる。また、ＮＹＫの天
然のリガンドと比較して、受容体タンパク質ＮＹＫの活
性を刺激する能力が増大した分子は、創傷治癒などのよ
うな血管新生が必要な医薬適用で有用であることが期待
される。
に結合できるリガンド、および生物学的試料中の受容体
タンパク質ＮＹＫのリガンド、さらに受容体タンパク質
ＮＹＫの活性を阻害または増大させる能力のある分子
を、非常に高感度で検出するアッセイを提供することが
出来た。検出されたＮＹＫリガンドであるＶＥＧＦは、
この分子が腫瘍および糖尿病網膜症のマーカーであるの
で重要である。また、ＮＹＫとそのリガンドとの相互作
用を阻害できる分子は血管新生を阻害できるため、腫瘍
療法などに有用であると考えられる。また、ＮＹＫの天
然のリガンドと比較して、受容体タンパク質ＮＹＫの活
性を刺激する能力が増大した分子は、創傷治癒などのよ
うな血管新生が必要な医薬適用で有用であることが期待
される。
【００７４】さらに、本発明により、我々は、部位特異
的突然変異誘発、ＦＬＡＧTMペプチド系およびＣＨＯ細
胞発現の組合せを用いて、受容体チロシンキナーゼの機
能的細胞外ドメインを単離するプロトコールを記載し
た。この方法を開発する我々の必要性は、最初、受容体
タンパク質ＮＹＫを特徴付けるための試薬の完全な欠如
によって促進された。我々のプロトコールの利点は、そ
れが、指定された受容体の細胞外ドメインおよび予測さ
れた膜貫通ドメインの結合点におけるＦＬＡＧTM配列の
正確な位置決定を可能とすることである。それらの相互
の適合性、および実験すべきｃＤＮＡクローンにおいて
これら（ＢｇｌＩＩまたはＢａｍＨＩ）のうちの少なく
とも１つが存在しないことのため、ＢｇｌＩＩ／Ｂａｍ
ＨＩ制限酵素切断部位を用いて、ＦＬＡＧTM配列を導入
した。さらに、そのストラテジーは、それにより受容体
細胞外ドメインを注目する他のタンパク質に連結できる
普遍的アダプターサイトを提供する。例えば、分泌アル
カリフォスファターゼとの融合タンパク質の発現のため
に、細胞外ドメインをベクターＡｐ−ｔａｇ−１（フラ
ナガン(Flanagan)およびレーダー（Leder), 1990) に連
結できるであろうし、インフレームにて適合する制限酵
素切断部位がくみこまれた他のタンパク質のドメインと
細胞外ドメインを連結できるであろう。例えば、ＮＹＫ
タンパク質の細胞外ドメインがエリスロポエチン受容体
の細胞質および膜貫通ドメインに連結された融合タンパ
ク質は、本出願に記載されている。
的突然変異誘発、ＦＬＡＧTMペプチド系およびＣＨＯ細
胞発現の組合せを用いて、受容体チロシンキナーゼの機
能的細胞外ドメインを単離するプロトコールを記載し
た。この方法を開発する我々の必要性は、最初、受容体
タンパク質ＮＹＫを特徴付けるための試薬の完全な欠如
によって促進された。我々のプロトコールの利点は、そ
れが、指定された受容体の細胞外ドメインおよび予測さ
れた膜貫通ドメインの結合点におけるＦＬＡＧTM配列の
正確な位置決定を可能とすることである。それらの相互
の適合性、および実験すべきｃＤＮＡクローンにおいて
これら（ＢｇｌＩＩまたはＢａｍＨＩ）のうちの少なく
とも１つが存在しないことのため、ＢｇｌＩＩ／Ｂａｍ
ＨＩ制限酵素切断部位を用いて、ＦＬＡＧTM配列を導入
した。さらに、そのストラテジーは、それにより受容体
細胞外ドメインを注目する他のタンパク質に連結できる
普遍的アダプターサイトを提供する。例えば、分泌アル
カリフォスファターゼとの融合タンパク質の発現のため
に、細胞外ドメインをベクターＡｐ−ｔａｇ−１（フラ
ナガン(Flanagan)およびレーダー（Leder), 1990) に連
結できるであろうし、インフレームにて適合する制限酵
素切断部位がくみこまれた他のタンパク質のドメインと
細胞外ドメインを連結できるであろう。例えば、ＮＹＫ
タンパク質の細胞外ドメインがエリスロポエチン受容体
の細胞質および膜貫通ドメインに連結された融合タンパ
ク質は、本出願に記載されている。
【００７５】ｐＣＤＭ８ベクターを我々の技術のための
基礎ベクターとして用いた。というのは、部位特異的突
然変異誘発のための、ならびにＣＯＳ細胞における一過
性発現のための一本鎖ＤＮＡを生じさせるのに用いるこ
とができるからである。これは、大規模生産への進行前
に、融合タンパク質の発現用コンストラクトを迅速にテ
ストすることを可能とする。また、最終コンストラクト
のＣＨＯ細胞発現ベクターｐＥＥ６へのサブクローニン
グも、ｐＣＤＭ８およびｐＥＥ６ポリリンカーに存在す
る適合ＸｂａＩ部位のため簡便である。我々は部位特異
的突然変異誘発を用いて、細胞外および膜貫通ドメイン
の結合点に必要な制限酵素切断部位を導入した。この技
術は、特に、大きな断片を生成させることを試みる場
合、または、ＲＴＫ類をコードするｃＤＮＡの５’領域
でしばしば起こるように（コザック(Kozak), 1991)オリ
ゴヌクレオチドプライマーがＧＣ−リッチ領域を有する
配列に由来する場合に、ＰＣＲよりもいくつかの有利な
点を有する。別法として、ＰＣＲを用いてＢｇｌＩＩ／
ＢａｍＨＩ部位をコードするより小さな断片を生成さ
せ、次いで、適当な制限酵素切断部位を介して細胞外ド
メインｃＤＮＡに連結することができよう。
基礎ベクターとして用いた。というのは、部位特異的突
然変異誘発のための、ならびにＣＯＳ細胞における一過
性発現のための一本鎖ＤＮＡを生じさせるのに用いるこ
とができるからである。これは、大規模生産への進行前
に、融合タンパク質の発現用コンストラクトを迅速にテ
ストすることを可能とする。また、最終コンストラクト
のＣＨＯ細胞発現ベクターｐＥＥ６へのサブクローニン
グも、ｐＣＤＭ８およびｐＥＥ６ポリリンカーに存在す
る適合ＸｂａＩ部位のため簡便である。我々は部位特異
的突然変異誘発を用いて、細胞外および膜貫通ドメイン
の結合点に必要な制限酵素切断部位を導入した。この技
術は、特に、大きな断片を生成させることを試みる場
合、または、ＲＴＫ類をコードするｃＤＮＡの５’領域
でしばしば起こるように（コザック(Kozak), 1991)オリ
ゴヌクレオチドプライマーがＧＣ−リッチ領域を有する
配列に由来する場合に、ＰＣＲよりもいくつかの有利な
点を有する。別法として、ＰＣＲを用いてＢｇｌＩＩ／
ＢａｍＨＩ部位をコードするより小さな断片を生成さ
せ、次いで、適当な制限酵素切断部位を介して細胞外ド
メインｃＤＮＡに連結することができよう。
【００７６】この系の主要な利点は、ＦＬＡＧTM系成分
の商業的入手可能性、および１０％胎児ウシ血清を含有
する出発物質からの１工程手法での比較的純粋な融合タ
ンパク質調製物の効果的な取得である。遊離ＦＬＡＧTM
ペプチドで溶出する能力もまた主要な利点であり、極端
なｐＨまたはカオトロピック剤への暴露の必要性を回避
することによって天然受容体細胞外ドメインが得られる
確率を最大化する。我々は、穏やかな溶出のためにＭ１
Ｍａｂの二価カチオン依存性性質を利用できなかっ
た。というのは、このＭＡｂは認識に遊離ＦＬＡＧTMの
Ｎ−末端を要するからであり；従って、Ｍ２抗体を利用
した。全リガンド結合部位は容易に評価できないので、
穏やかな溶出は、特徴付けられていないリガンドを有す
る受容体を取り扱う場合に重要である。
の商業的入手可能性、および１０％胎児ウシ血清を含有
する出発物質からの１工程手法での比較的純粋な融合タ
ンパク質調製物の効果的な取得である。遊離ＦＬＡＧTM
ペプチドで溶出する能力もまた主要な利点であり、極端
なｐＨまたはカオトロピック剤への暴露の必要性を回避
することによって天然受容体細胞外ドメインが得られる
確率を最大化する。我々は、穏やかな溶出のためにＭ１
Ｍａｂの二価カチオン依存性性質を利用できなかっ
た。というのは、このＭＡｂは認識に遊離ＦＬＡＧTMの
Ｎ−末端を要するからであり；従って、Ｍ２抗体を利用
した。全リガンド結合部位は容易に評価できないので、
穏やかな溶出は、特徴付けられていないリガンドを有す
る受容体を取り扱う場合に重要である。
【００７７】Ｃ−末端におけるＦＬＡＧTMペプチドの位
置は、受容体に対するＢＩＡｃｏｒｅTMまたはＭＡｂ生
産についての実験に悪影響しなかった。精製されたＮＹ
Ｋ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMはリガンドＶＥＧＦに特異的に結
合した。また、アルカリ性ホスファターゼ−融合タンパ
ク質での我々の観察とは対照的に、血清含有培地からの
見掛けの結合はなかった。アルカリ性ホスファターゼま
たは免疫グロブリンのＦｃ部分のような他のマーカーと
比較して、タンパク質相互作用におけるＦＬＡＧTMペプ
チドの見掛けの不活性は、それが偽陽性を回避するの
で、この系をバイオセンサーをベースとする適用で理想
的とする。
置は、受容体に対するＢＩＡｃｏｒｅTMまたはＭＡｂ生
産についての実験に悪影響しなかった。精製されたＮＹ
Ｋ−ＥＸ−ＦＬＡＧTMはリガンドＶＥＧＦに特異的に結
合した。また、アルカリ性ホスファターゼ−融合タンパ
ク質での我々の観察とは対照的に、血清含有培地からの
見掛けの結合はなかった。アルカリ性ホスファターゼま
たは免疫グロブリンのＦｃ部分のような他のマーカーと
比較して、タンパク質相互作用におけるＦＬＡＧTMペプ
チドの見掛けの不活性は、それが偽陽性を回避するの
で、この系をバイオセンサーをベースとする適用で理想
的とする。
【００７８】我々の方法は、哺乳動物発現系を用いて
の、精製された機能的受容体細胞外ドメイン−ＦＬＡＧ
TM融合タンパク質の単離を可能とする。かかる系の利用
は、糖鎖付加およびタンパク質フォールディングが天然
状態に非常によく似ているようであることを意味する。
よく特徴付けされているマーカーペプチドの連結は、試
薬が合理的量の融合タンパク質をアフィニティー精製す
るのに利用できることを意味し、これはさらなる実験を
容易とする。ＦＬＡＧTMペプチドのサイズおよびＣ−末
端位置は、実験すべきタンパク質に対する影響が最小化
されることを意味する。他の研究者はＦＬＡＧTM（Ｎ−
末端）−ヒト血小板活性化受容体融合タンパク質を哺乳
動物細胞（ＣＯＳ−７）で首尾よく発現させて、膜にお
けるそのトポロジーを示しているが、受容体の機能を調
べる実験は行われていない（ジェラルド(Gerard)および
ジェラルド(Gerard), 1990）。これは哺乳動物発現系に
おけるＣ−末端マーカーとしてのＦＬＡＧTMペプチドの
最初の報告である。ＦＬＡＧ TMは、元来、所望のタンパ
ク質のＮ−末端に連結されるように設計され、このＮ−
末端からの容易な切断を可能とする構造を有する（米国
特許第４，７０３，００４号）。
の、精製された機能的受容体細胞外ドメイン−ＦＬＡＧ
TM融合タンパク質の単離を可能とする。かかる系の利用
は、糖鎖付加およびタンパク質フォールディングが天然
状態に非常によく似ているようであることを意味する。
よく特徴付けされているマーカーペプチドの連結は、試
薬が合理的量の融合タンパク質をアフィニティー精製す
るのに利用できることを意味し、これはさらなる実験を
容易とする。ＦＬＡＧTMペプチドのサイズおよびＣ−末
端位置は、実験すべきタンパク質に対する影響が最小化
されることを意味する。他の研究者はＦＬＡＧTM（Ｎ−
末端）−ヒト血小板活性化受容体融合タンパク質を哺乳
動物細胞（ＣＯＳ−７）で首尾よく発現させて、膜にお
けるそのトポロジーを示しているが、受容体の機能を調
べる実験は行われていない（ジェラルド(Gerard)および
ジェラルド(Gerard), 1990）。これは哺乳動物発現系に
おけるＣ−末端マーカーとしてのＦＬＡＧTMペプチドの
最初の報告である。ＦＬＡＧ TMは、元来、所望のタンパ
ク質のＮ−末端に連結されるように設計され、このＮ−
末端からの容易な切断を可能とする構造を有する（米国
特許第４，７０３，００４号）。
【００７９】このタイプのアプローチは、一般に、特に
これらの受容体の同族のリガンドを単離しようとする研
究者にとって、細胞表面受容体の調査に適用できる。Ｆ
ＬＡＧTM系自体は高価ではないが、挑戦しようとする溶
出条件の問題を有する、特異的ＭＡｂアフィニティーカ
ラムの開発コストと比較して有利である。本技術のタイ
ムスケールは、細胞外ドメインをコードするクローンの
単離から、精製された融合タンパク質のマイクログラム
−ミリグラム量を有するまでに、約２ないし４カ月であ
る。この方法は機能的物質を要するモノクローナル抗体
産生のごとき研究、イムノアッセイのごときアッセイ、
バイオセンサー実験、またはリガンド単離研究に特に有
用である。
これらの受容体の同族のリガンドを単離しようとする研
究者にとって、細胞表面受容体の調査に適用できる。Ｆ
ＬＡＧTM系自体は高価ではないが、挑戦しようとする溶
出条件の問題を有する、特異的ＭＡｂアフィニティーカ
ラムの開発コストと比較して有利である。本技術のタイ
ムスケールは、細胞外ドメインをコードするクローンの
単離から、精製された融合タンパク質のマイクログラム
−ミリグラム量を有するまでに、約２ないし４カ月であ
る。この方法は機能的物質を要するモノクローナル抗体
産生のごとき研究、イムノアッセイのごときアッセイ、
バイオセンサー実験、またはリガンド単離研究に特に有
用である。
【００８０】明確性および理解の目的で本発明をいくら
か詳細に記載してきたが、本明細書に開示した発明概念
の範囲を逸脱することなく、本明細書に記載した具体例
および方法に対して種々の修飾および変形を施すことが
できるのは当業者に明らかであろう。 本明細書で用いた略語は以下の通りである： ｆｌｋ−１ 胎児肝臓キナーゼ−１ ＭＡｂ モノクローナル抗体 ＭＳＸ メチオニンスルホキシド ＮＹＫ 神経上皮チロシンキナーゼ ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応 ＲＴＫ 受容体チロシンキナーゼ ＲＹＫ チロシンキナーゼに関するもの ｔｉｅ２ Ｉｇ−様ドメインおよびＥＧＦ反復を
持つチロシンキナーゼ ＶＥＧＦ 血管内皮増殖因子 ＶＥＧＦＲ２ 血管内皮増殖因子受容体２
か詳細に記載してきたが、本明細書に開示した発明概念
の範囲を逸脱することなく、本明細書に記載した具体例
および方法に対して種々の修飾および変形を施すことが
できるのは当業者に明らかであろう。 本明細書で用いた略語は以下の通りである： ｆｌｋ−１ 胎児肝臓キナーゼ−１ ＭＡｂ モノクローナル抗体 ＭＳＸ メチオニンスルホキシド ＮＹＫ 神経上皮チロシンキナーゼ ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応 ＲＴＫ 受容体チロシンキナーゼ ＲＹＫ チロシンキナーゼに関するもの ｔｉｅ２ Ｉｇ−様ドメインおよびＥＧＦ反復を
持つチロシンキナーゼ ＶＥＧＦ 血管内皮増殖因子 ＶＥＧＦＲ２ 血管内皮増殖因子受容体２
【００８１】また、本明細書で引用した引用文献は以下
の通りである。 アルッフォ，エイ(Aruffo A.) およびビー，シード(B.
Seed) "Molecular cloning of a CD28 cDNA by a high-effici
ency COS cell expression system" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1987 84 8573-8577 ブライアー，ジー(Breier G.) ，ユー，アルブレヒト
(U. Albrecht) ，エス，ステラー(S. Sterrer)およびダ
ブリュ，リソー(W. Risau) "Expression of vascular endothelial growth factor
during embryonic angiogenesis and endothelial cell
differentiation" Development, 1992 114 521-532 ファンスロウ，ダブリュ・シー(Fanslow W.C.)，ディ，
アンダーソン(D. Anderson) ，ケイ・エイチ，グラブス
タイン(K.H. Grabstein)，イー・エイ，クラーク(E.A.
Clark) ，ディ，コスマン(D. Cosman) およびアール・
ジェイ，アルミテイジ(R.J. Armitage) "Soluble forms of CD40 inhibit biological response
s of human B cells" J. Immunol., 1992 149 655-660 フラナガン，ジェイ・ジー(Flanagan J.G.) およびピ
ー，レーダー(P. Leder) "The kit ligand: a cell surface molecule altered i
n steel mutant fibroblasts" Cell, 1990 63 185-194 ジェラルド, エヌ・ピー(Gerard N.P.) およびシー，ジ
ェラルド(C. Gerard) "Construction and expression of a novel recombinan
t anaphylatoxin, C5a-N19, as a probe for the human
C5a receptor" Biochemistry, 1990 29 9274-9281 ダンドレア，エイ・ディ(D'Andrea, A.D.)，エイチ・エ
フ，ロディッシュ (H.F.Lodisch) およびジー・ジー，
ウォン(G.G. Wong) "Expression cloning of the murine erythropoietin r
eceptor" Cell, 1989 57 277-285 ホップ，ティ・ピー(Hopp T.P.) ，ケイ・エス，プリケ
ット(K.S. Prickett) ，ヴィ・エル，プライス (V.L. P
rice) ，アール・ティ，リビー (R.T. Libby) ，シー・
ジェイ，マーチ(C.J. March)，ディ・ピー，チェレッテ
ィ (D.P. Cerretti)，ディ・エル，アーダル(D.L. Urda
l)およびピー・ジェイ，コンロン(P.J. Conlon) "A short polypeptide marker sequence useful for re
combinant protein identification and purification" Biotechnology, 1992 6 1204-1210 ホーヴェンス，シー・エム(Hovens C.M.) ，エス・エ
イ，スタッカー(S.A. Stacker)，エイ，アンドレス (A.
Andres)，エイ・ジー，ハーパー (A.G. Harpur)，エ
イ，ズィーミーキ(A. Ziemiecki)およびエイ・エフ，ウ
ィルクス(A.F. Wilks) "RYK, a receptor tyrosine kinase-related molecule
with unusual kinase domain motifs" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992 89 11818-11822 コザック，エム(Kozak M.) "An Analysis of Vertebrate mRNA Sequences: Intimat
ions of TranslationalControl" J. Cell Biol., 1991 115 887-903 クンケル，ティ・エイ(Kunkel T.A.) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis wit
hout phenotypic selection" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1985 82 488-492 カイト，ジェイ(Kyte J.) およびアール・エフ，ドゥー
リトル(R.F. Doolittle)"A simple method for display
ing the hydropathic character of a protein"Jorunal
of Molecuilar Biology, 1982 157 105-132 リー，エム(Li M.) ，ワイ・エヌ，ジャン(Y.N. Jan)お
よびエル・ワイ，ジャン(L.Y. Jan) "Specification of subunit assembly by the hydropho
bic amino-terminal domain of the shaker potassium
channel" Science, 1992 257 1225-1230 マイルズ，エイ・エイ(Miles A.A.)およびイー・エム，
マイルズ(E.M. Miles) "Vascular reactions to histamine, histamine-libera
tor and leukotaxine inthe skin of guinea-pigs" Journal of Physiology (London), 1952 118 228-257 ミローア，ビー(Milauer B.)，エス，ウィズィッグマン
‐ヴォース(S. Wizigmann-Voos) ，エイチ，シュナーチ
(H. Schnurch) ，アール，マルチネス(R. Martinez) ，
エヌ・ピー・エイチ，モラー(N.P.H. Moller) ，ダブリ
ュ・リソー(W. Risau)およびエイ・ユルリッチ(A. Ullr
ich) "High affinity VEGF binding and developmental expr
ession suggest Flk-1 as a major regulator of vascu
logenesis and angiogenesis" Cell, 1993 72 835-846 ナイス，イー(Nice E.) ，エム，ラックマン(M. Lackma
nn) ，エフ，スミス(F.Smyth)，エル，ファブリ (L. Fa
bri) およびエイ・ダブリュ，バージェス(A.W.Burgess) "Synergies between micropreparative high-performan
ce liquid chromatography and an instrumental optic
al biosensor" Journal of Chromatography, 1994 660 169-185 エールリッヒス，アール・ビー(Oelrichs R.B.) ，エイ
チ・エイチ，ライド(H.H. Reid) ，オー，バーナード
(O. Bernard)，エイ，ズィーミーキ (A. Ziemiecki) お
よびエイ・エフ，ウィルクス(A.F. Wilks) "NYK/FLK-1: A putative receptor protein tyrosine k
inase isolated from E10 embryonic neuroepitheium i
s expressed in endothelial cells of the developing
embryo" Oncogene, 1993 8 11-18 パシフィッキ，アール・イー(Pacifici R.E.) およびエ
イ・アール，トマソン(A.R. Thomason) "Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmi
t mitogenic signals inresponse to ligand" J. Biol. Chem., 1994 269 1571-1574 ポール，エス・アール(Paul S.R.) ，ディ，マーバーグ
(D. Merberg)，エイチ，フィナーティ (H. Finnerty)，
ジ・イー，モリス (G.E. Morris)，ジェイ・シー，モリ
ス(J.C. Morris) ，エス・エス，ジョーンズ(S.S. Jone
s)，アール，クリッツ (R. Kriz)，ケイ・ジェイ，ター
ナー(K.J. Turner) およびシー・アール，ウッド(C.R.
Wood) "Molecular cloning of the cDNA encoding a receptor
tyrosine kinase-related molecule with a catalytic
region homologous to c-met. International Journal
of Cell" Cloning, 1992 10 309-314 ランティング，エイ・エス(Runting A.S.)，エス・エ
イ，スタッカー (S.A. Stacker) およびエイ・エフ，ウ
ィルクス(A.F. Wilks) "tie2, a putative protein tyrosine kinase from a n
ew class of cell surface receptor" Growth Factors, 1993 9 99-105 サムブルック, ジェイ(Sambrook J.) ，イー・エフ，フ
リッチュ(E.F. Fritsch)およびティ，マニアティス(T.
Maniatis). "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 スミス，ディ・ビー(Smith D.B.)およびケイ・エス，ジ
ョンソン(K.S. Johnson)"Single-step purification of
polypeptides expressed in E.coli as fusionswith g
lutathione S-transferase" Gene, 1988 67 31-40 スタッカー，エス・エイ(Stacker S.A.)，シー・エム，
ホーヴェンス (C.M. Hovens)，エイ，ヴィタリ (A. Vit
ali)，エム・エイ，プリチャード (M.A. Pritchard) ，
イー，ベイカー(E. Baker)，ジー・アール，サザーラン
ド (G.R. Sutherland)およびエイ・エフ，ウィルクス
(A.F. Wilks) "Molecular cloning and chromosomal localisation of
the human homologue of a receptor related to tyro
sine kinases (ryk)" Oncogene, 1993 8 1347-1356 スー，エックス(Su X.) ，エイ・ケイ，プレストウッド
(A.K. Prestwood)およびアール・エイ，マックグロー
(R.A. McGraw) "Production of recombinant porcine tumour necrosis
factor alpha in a novel E.coli expression system" Biotechniques, 1992 13 756-762 ターマン, ビー・アイ(Terman B.I.) ，エム，ダッファ
ー・ヴァーマゼン(M. Dougher Vermazen) ，エム・イ
ー，キャリオン(M.E. Carrion)，ディ，ディミトロフ
(D. Dimitrov) ，ディ・シー，アルメッリーノ(D.C. Ar
mellino)，ディ，ゴスポダロヴィッツ (D. Gospodarowi
cz) およびピー，ボーレン(P. Bohlen) "Identification of the KDR tyrosine kinase as a re
ceptor for vascular endothelial cell growth facto
r" Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992 187 1579-1586 ユルリッチ，エイ(Ullrich A.)およびジェイ，シュレシ
ンガー(J. Schlessinger) "Signal transduction by receptors with tyrosine ki
nase activity" Cell, 1990 61 203-212 ウィルクス，エイ・エフ(Wilks A.F.) "Two putative protein-tyrosine kinases identified
by application of thepolymerase chain reaction" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1989 86 1603-1607 ザン，エックス(Zhang X.)，ケイ・エヌ，ウィルス (K.
N. Wills) ，エム，フスマン(M. Husmann)，ティ，ハー
マン (T. Hermann) およびエム，プファール(M.Pfahl) "Novel pathway for thyroid hormone receptor action
through interaction with jun and fos oncogene act
ivities" Mol. Cell Biol., 1991 11 6016-6025
の通りである。 アルッフォ，エイ(Aruffo A.) およびビー，シード(B.
Seed) "Molecular cloning of a CD28 cDNA by a high-effici
ency COS cell expression system" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1987 84 8573-8577 ブライアー，ジー(Breier G.) ，ユー，アルブレヒト
(U. Albrecht) ，エス，ステラー(S. Sterrer)およびダ
ブリュ，リソー(W. Risau) "Expression of vascular endothelial growth factor
during embryonic angiogenesis and endothelial cell
differentiation" Development, 1992 114 521-532 ファンスロウ，ダブリュ・シー(Fanslow W.C.)，ディ，
アンダーソン(D. Anderson) ，ケイ・エイチ，グラブス
タイン(K.H. Grabstein)，イー・エイ，クラーク(E.A.
Clark) ，ディ，コスマン(D. Cosman) およびアール・
ジェイ，アルミテイジ(R.J. Armitage) "Soluble forms of CD40 inhibit biological response
s of human B cells" J. Immunol., 1992 149 655-660 フラナガン，ジェイ・ジー(Flanagan J.G.) およびピ
ー，レーダー(P. Leder) "The kit ligand: a cell surface molecule altered i
n steel mutant fibroblasts" Cell, 1990 63 185-194 ジェラルド, エヌ・ピー(Gerard N.P.) およびシー，ジ
ェラルド(C. Gerard) "Construction and expression of a novel recombinan
t anaphylatoxin, C5a-N19, as a probe for the human
C5a receptor" Biochemistry, 1990 29 9274-9281 ダンドレア，エイ・ディ(D'Andrea, A.D.)，エイチ・エ
フ，ロディッシュ (H.F.Lodisch) およびジー・ジー，
ウォン(G.G. Wong) "Expression cloning of the murine erythropoietin r
eceptor" Cell, 1989 57 277-285 ホップ，ティ・ピー(Hopp T.P.) ，ケイ・エス，プリケ
ット(K.S. Prickett) ，ヴィ・エル，プライス (V.L. P
rice) ，アール・ティ，リビー (R.T. Libby) ，シー・
ジェイ，マーチ(C.J. March)，ディ・ピー，チェレッテ
ィ (D.P. Cerretti)，ディ・エル，アーダル(D.L. Urda
l)およびピー・ジェイ，コンロン(P.J. Conlon) "A short polypeptide marker sequence useful for re
combinant protein identification and purification" Biotechnology, 1992 6 1204-1210 ホーヴェンス，シー・エム(Hovens C.M.) ，エス・エ
イ，スタッカー(S.A. Stacker)，エイ，アンドレス (A.
Andres)，エイ・ジー，ハーパー (A.G. Harpur)，エ
イ，ズィーミーキ(A. Ziemiecki)およびエイ・エフ，ウ
ィルクス(A.F. Wilks) "RYK, a receptor tyrosine kinase-related molecule
with unusual kinase domain motifs" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992 89 11818-11822 コザック，エム(Kozak M.) "An Analysis of Vertebrate mRNA Sequences: Intimat
ions of TranslationalControl" J. Cell Biol., 1991 115 887-903 クンケル，ティ・エイ(Kunkel T.A.) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis wit
hout phenotypic selection" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1985 82 488-492 カイト，ジェイ(Kyte J.) およびアール・エフ，ドゥー
リトル(R.F. Doolittle)"A simple method for display
ing the hydropathic character of a protein"Jorunal
of Molecuilar Biology, 1982 157 105-132 リー，エム(Li M.) ，ワイ・エヌ，ジャン(Y.N. Jan)お
よびエル・ワイ，ジャン(L.Y. Jan) "Specification of subunit assembly by the hydropho
bic amino-terminal domain of the shaker potassium
channel" Science, 1992 257 1225-1230 マイルズ，エイ・エイ(Miles A.A.)およびイー・エム，
マイルズ(E.M. Miles) "Vascular reactions to histamine, histamine-libera
tor and leukotaxine inthe skin of guinea-pigs" Journal of Physiology (London), 1952 118 228-257 ミローア，ビー(Milauer B.)，エス，ウィズィッグマン
‐ヴォース(S. Wizigmann-Voos) ，エイチ，シュナーチ
(H. Schnurch) ，アール，マルチネス(R. Martinez) ，
エヌ・ピー・エイチ，モラー(N.P.H. Moller) ，ダブリ
ュ・リソー(W. Risau)およびエイ・ユルリッチ(A. Ullr
ich) "High affinity VEGF binding and developmental expr
ession suggest Flk-1 as a major regulator of vascu
logenesis and angiogenesis" Cell, 1993 72 835-846 ナイス，イー(Nice E.) ，エム，ラックマン(M. Lackma
nn) ，エフ，スミス(F.Smyth)，エル，ファブリ (L. Fa
bri) およびエイ・ダブリュ，バージェス(A.W.Burgess) "Synergies between micropreparative high-performan
ce liquid chromatography and an instrumental optic
al biosensor" Journal of Chromatography, 1994 660 169-185 エールリッヒス，アール・ビー(Oelrichs R.B.) ，エイ
チ・エイチ，ライド(H.H. Reid) ，オー，バーナード
(O. Bernard)，エイ，ズィーミーキ (A. Ziemiecki) お
よびエイ・エフ，ウィルクス(A.F. Wilks) "NYK/FLK-1: A putative receptor protein tyrosine k
inase isolated from E10 embryonic neuroepitheium i
s expressed in endothelial cells of the developing
embryo" Oncogene, 1993 8 11-18 パシフィッキ，アール・イー(Pacifici R.E.) およびエ
イ・アール，トマソン(A.R. Thomason) "Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmi
t mitogenic signals inresponse to ligand" J. Biol. Chem., 1994 269 1571-1574 ポール，エス・アール(Paul S.R.) ，ディ，マーバーグ
(D. Merberg)，エイチ，フィナーティ (H. Finnerty)，
ジ・イー，モリス (G.E. Morris)，ジェイ・シー，モリ
ス(J.C. Morris) ，エス・エス，ジョーンズ(S.S. Jone
s)，アール，クリッツ (R. Kriz)，ケイ・ジェイ，ター
ナー(K.J. Turner) およびシー・アール，ウッド(C.R.
Wood) "Molecular cloning of the cDNA encoding a receptor
tyrosine kinase-related molecule with a catalytic
region homologous to c-met. International Journal
of Cell" Cloning, 1992 10 309-314 ランティング，エイ・エス(Runting A.S.)，エス・エ
イ，スタッカー (S.A. Stacker) およびエイ・エフ，ウ
ィルクス(A.F. Wilks) "tie2, a putative protein tyrosine kinase from a n
ew class of cell surface receptor" Growth Factors, 1993 9 99-105 サムブルック, ジェイ(Sambrook J.) ，イー・エフ，フ
リッチュ(E.F. Fritsch)およびティ，マニアティス(T.
Maniatis). "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 スミス，ディ・ビー(Smith D.B.)およびケイ・エス，ジ
ョンソン(K.S. Johnson)"Single-step purification of
polypeptides expressed in E.coli as fusionswith g
lutathione S-transferase" Gene, 1988 67 31-40 スタッカー，エス・エイ(Stacker S.A.)，シー・エム，
ホーヴェンス (C.M. Hovens)，エイ，ヴィタリ (A. Vit
ali)，エム・エイ，プリチャード (M.A. Pritchard) ，
イー，ベイカー(E. Baker)，ジー・アール，サザーラン
ド (G.R. Sutherland)およびエイ・エフ，ウィルクス
(A.F. Wilks) "Molecular cloning and chromosomal localisation of
the human homologue of a receptor related to tyro
sine kinases (ryk)" Oncogene, 1993 8 1347-1356 スー，エックス(Su X.) ，エイ・ケイ，プレストウッド
(A.K. Prestwood)およびアール・エイ，マックグロー
(R.A. McGraw) "Production of recombinant porcine tumour necrosis
factor alpha in a novel E.coli expression system" Biotechniques, 1992 13 756-762 ターマン, ビー・アイ(Terman B.I.) ，エム，ダッファ
ー・ヴァーマゼン(M. Dougher Vermazen) ，エム・イ
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mellino)，ディ，ゴスポダロヴィッツ (D. Gospodarowi
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【００８２】「配列表フリーテキスト」
【００８３】配列番号１１のフリーテキストの内容：FL
AGTM octapeptide.
AGTM octapeptide.
【００８４】配列番号１２のフリーテキストの内容：Th
e synthesized linker oligonucleotide encoding the
FLAGTM octapeptide and a stop codon. A portion of
a unique restriction site is added at the 5'-end a
nd a portion of a further unique restriction site
is added at the 3'-end of the oligonucleotide.
e synthesized linker oligonucleotide encoding the
FLAGTM octapeptide and a stop codon. A portion of
a unique restriction site is added at the 5'-end a
nd a portion of a further unique restriction site
is added at the 3'-end of the oligonucleotide.
【００８５】配列番号１８のフリーテキストの内容：Th
e synthesized linker oligonucleotide.
e synthesized linker oligonucleotide.
【００８６】
【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH <120> ASSAY, RECEPTOR PROTEIN NYK AND LIGANDS <130> T098 <150> AU PN 0300 <151> 1994-12-23 <150> AU PN 0301 <151> 1994-12-23 <160> 18 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 ata gag tac atc ttc agc ccc agc tgt gtg ccg ctg 36 Ile Glu Tyr Ile Phe Ser Pro Ser Cys Val Pro Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 cgg atc aaa cct ggc caa agc cag cac ata gga 33 Arg Ile Lys Pro Gly Gln Ser Gln His Ile Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 caa agc cag cac ata gta gag atg agc ttc ctg cag 36 Gln Ser Gln His Ile Val Glu Met Ser Phe Leu Gln 1 5 10 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 cta cag cac agc cga tgt gaa tgc aga cca tgg taa 36 Leu Gln His Ser Arg Cys Glu Cys Arg Pro Trp 1 5 10 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 cgg atc aga tct ggc gat aga ccg tcc ata gga gag 36 Arg Ile Arg Ser Gly Asp Arg Pro Ser Ile Gly Glu 1 5 10 <210> 6 <211> 190 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Thr Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Thr Thr Glu Gly 20 25 30 Glu Gln Lys Ser His Glu Val Ile Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg 35 40 45 Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr 50 55 60 Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Ser Pro Ser Cys Val Pro Leu Met 65 70 75 80 Arg Cys Arg Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ala Leu Glu Cys Val Pro Thr 85 90 95 Ser Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln 100 105 110 Ser Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Ser Arg Cys Glu 115 120 125 Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro Glu Asn His Cys Glu Pro 130 135 140 Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys 145 150 155 160 Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu 165 170 175 Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asn Leu Pro Arg Arg 180 185 190 <210> 7 <211> 190 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Thr Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Thr Thr Glu Gly 20 25 30 Glu Gln Lys Ser His Glu Val Ile Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg 35 40 45 Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr 50 55 60 Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met 65 70 75 80 Arg Cys Ala Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ala Leu Glu Cys Val Pro Thr 85 90 95 Ser Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro Gly Gln 100 105 110 Ser Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Ser Arg Cys Glu 115 120 125 Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro Glu Asn His Cys Glu Pro 130 135 140 Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys 145 150 155 160 Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu 165 170 175 Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asn Leu Pro Arg Arg 180 185 190 <210> 8 <211> 190 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Thr Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Thr Thr Glu Gly 20 25 30 Glu Gln Lys Ser His Glu Val Ile Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg 35 40 45 Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr 50 55 60 Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met 65 70 75 80 Arg Cys Ala Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ala Leu Glu Cys Val Pro Thr 85 90 95 Ser Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln 100 105 110 Ser Gln His Ile Val Glu Met Ser Phe Leu Gln His Ser Arg Cys Glu 115 120 125 Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro Glu Asn His Cys Glu Pro 130 135 140 Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys 145 150 155 160 Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu 165 170 175 Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asn Leu Pro Arg Arg 180 185 190 <210> 9 <211> 133 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Thr Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Thr Thr Glu Gly 20 25 30 Glu Gln Lys Ser His Glu Val Ile Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg 35 40 45 Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr 50 55 60 Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met 65 70 75 80 Arg Cys Ala Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ala Leu Glu Cys Val Pro Thr 85 90 95 Ser Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln 100 105 110 Ser Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Ser Arg Cys Glu 115 120 125 Cys Arg Pro Lys Trp 130 <210> 10 <211> 190 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Thr Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Thr Thr Glu Gly 20 25 30 Glu Gln Lys Ser His Glu Val Ile Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg 35 40 45 Ser Tyr Cys Arg Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr 50 55 60 Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met 65 70 75 80 Arg Cys Ala Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ala Leu Glu Cys Val Pro Thr 85 90 95 Ser Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Arg Ser Gly Asp 100 105 110 Arg Pro Ser Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Ser Arg Cys Glu 115 120 125 Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Thr Lys Pro Glu Asn His Cys Glu Pro 130 135 140 Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys 145 150 155 160 Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu 165 170 175 Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asn Leu Pro Arg Arg 180 185 190 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAGTM octapeptide. <400> 11 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The synthesized linker oligonucleotide encoding the FLAGTM octapeptide and a stop codon. A portion of a unique restriction site is added at the 5'-end and a portion of a further unique restriction site is added at the 3'-end of the oligonucleotide. <400> 12 gatctgacta caaggacgac gatgacaagt gaatcgata 39 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Ile Glu Tyr Ile Phe Ser Pro Ser Cys Val Pro Leu 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Arg Ile Lys Pro Gly Gln Ser Gln His Ile Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Gln Ser Gln His Ile Val Glu Met Ser Phe Leu Gln 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Leu Gln His Ser Arg Cys Glu Cys Arg Pro Trp <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Arg Ile Arg Ser Gly Asp Arg Pro Ser Ile Gly Glu 1 5 10 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The synthesized linker oligonucleotide. <400> 18 actgatgttc ctgctgctac tgttcactta gctatctag 39
【図１】ＢＩＡｃｏｒｅTMを用いた、固定化ＮＹＫ−Ｅ
Ｘ−ＦＬＡＧTMへのＶＥＧＦの結合の分析結果
Ｘ−ＦＬＡＧTMへのＶＥＧＦの結合の分析結果
【図２】ＩＬ−３、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）に対す
る受容体のような、サイトカイン受容体、ＲＴＫ、およ
びＲＴＫ−Ｅｐｏキメラによるシグナル伝達のメカニズ
ムの模式図
る受容体のような、サイトカイン受容体、ＲＴＫ、およ
びＲＴＫ−Ｅｐｏキメラによるシグナル伝達のメカニズ
ムの模式図
【図３】モノクローナル抗体４Ｈ３および対照抗体４ｇ
８を用いたＢＡ／Ｆ３細胞の表面でのＶＥＧＦＲ２−Ｅ
ｐｏＲ発現のフローサイトメトリー分析の結果
８を用いたＢＡ／Ｆ３細胞の表面でのＶＥＧＦＲ２−Ｅ
ｐｏＲ発現のフローサイトメトリー分析の結果
【図４】ＮＹＫ受容体の機能のモジュレーターのアミノ
酸配列
酸配列
【図５】ＦＬＡＧTMリンカーオリゴヌクレオチドの配列
【図６】増殖因子受容体細胞外ドメイン−ＦＬＡＧTM融
合タンパク質を作成するのに使用した方法の模式図
合タンパク質を作成するのに使用した方法の模式図
【図７】ＣＯＳ細胞へのコンストラクトの一過性トラン
スフェクションおよび免疫沈降による検出の結果
スフェクションおよび免疫沈降による検出の結果
【図８】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によるアフィニ
ティー−精製した融合タンパク質の分析の結果
ティー−精製した融合タンパク質の分析の結果
【図９】ＢＩＡｃｏｒｅTMを用いてのｔｉｅ２−ＥＸ−
ＦＬＡＧTMに対するモノクローナル抗体の、天然および
変性ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMへの結合の分析の結果
ＦＬＡＧTMに対するモノクローナル抗体の、天然および
変性ｔｉｅ２−ＥＸ−ＦＬＡＧTMへの結合の分析の結果
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/715 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 15/02 33/50 Ｚ 15/09 ＺＮＡ 33/531 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/543 ５９３ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 37/54 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/531 15/00 Ｃ 33/543 ５９３ ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 594011992 605 ＴＨＩＲＤ ＡＶＥＮＵＥ，ＮＥＷ ＹＯＲＫ，ＮＥＷ ＹＯＲＫ 10158, ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭ ＥＲＩＣＡ (72)発明者 スタッカー，スティーヴン，アラン オーストラリア ヴィクトリア 3050 パ ークヴィル ロイヤル・パレード（無番 地） ロイヤル・メルボルン・ホスピタル メルボルン・チューマー・バイオロジ ー・ブランチ ルードヴィッヒ・インステ ィテュート・フォア・キャンサー・リサー チ (72)発明者 ウィルクス，アンドリュー，フレデリック オーストラリア ヴィクトリア 3050 パ ークヴィル ロイヤル・パレード（無番 地） ロイヤル・メルボルン・ホスピタル メルボルン・チューマー・バイオロジ ー・ブランチ ルードヴィッヒ・インステ ィテュート・フォア・キャンサー・リサー チ
Claims (31)
- 【請求項１】 受容体タンパク質ＮＹＫ、その誘導体ま
たはその機能的同等体を、推定リガンドに、前記推定リ
ガンドと前記受容体、その誘導体またはその機能的同等
体との結合を可能とするのに適した条件下で接触させ、
ついで、結合が起こったか否かを測定することを特徴と
する受容体タンパク質ＮＹＫに結合できるリガンドを検
出する方法。 - 【請求項２】 前記ＮＹＫ誘導体が前記ＮＹＫタンパク
質の細胞外ドメインからなる請求項１記載の検出方法。 - 【請求項３】 前記ＮＹＫ誘導体またはその機能的同等
体が融合タンパク質である請求項１記載の検出方法。 - 【請求項４】 前記ＮＹＫ、その誘導体、その機能的同
等体、または推定リガンドを検出可能なマーカーで標識
する請求項１記載の検出方法。 - 【請求項５】 結合の測定を、イムノアッセイ、アフィ
ニティー型アッセイ、アフィニティークロマトグラフィ
ー、蛍光活性化細胞ソーティング、バイオセンサーおよ
びバイオアッセイよりなる群から選択される検出系を用
いることによって達成する請求項１記載の検出方法。 - 【請求項６】 受容体タンパク質ＮＹＫ、その誘導体ま
たはその機能的同等体をリガンドを含有することと考え
られる生物学的試料と、試料中の前記リガンドのいずれ
かの前記受容体への結合を可能とするのに適した条件下
で接触させ、ついで、結合が起こったか否かを測定する
ことを特徴とする生物学的試料中の受容体タンパク質Ｎ
ＹＫのリガンドを検出する方法。 - 【請求項７】 前記ＮＹＫ誘導体が前記ＮＹＫタンパク
質の細胞外ドメインからなる請求項６記載の検出方法。 - 【請求項８】 前記ＮＹＫ、その誘導体またはその機能
的同等体が融合タンパク質である請求項７記載の検出方
法。 - 【請求項９】 前記ＮＹＫ、その誘導体またはその機能
的同等体のうち１つを、検出可能なマーカーで標識する
請求項６記載の検出方法。 - 【請求項１０】 結合の測定を、イムノアッセイ、アフ
ィニティー型アッセイ、アフィニティークロマトグラフ
ィー、蛍光活性化細胞ソーティング、バイオセンサーお
よびバイオアッセイよりなる群から選択される検出系を
用いることによって達成する請求項６記載の検出方法。 - 【請求項１１】 受容体タンパク質ＮＹＫとそのリガン
ドとの相互作用を阻害すると考えられる分子を、（Ｉ）
受容体タンパク質ＮＹＫ、その誘導体またはその機能的
同等体、および（ＩＩ）受容体タンパク質ＮＹＫの既知
のリガンドと、前記ＮＹＫ、その誘導体またはその機能
的同等体の前記既知のリガンドへの結合を可能とするの
に適した条件下で接触させ、ついで、結合が起こったか
否かを測定することを特徴とする受容体タンパク質ＮＹ
Ｋおよびそのリガンドの相互作用を阻害できる分子を検
出する方法。 - 【請求項１２】 前記ＮＹＫ誘導体が前記ＮＹＫタンパ
ク質の細胞外ドメインからなる請求項１１記載の検出方
法。 - 【請求項１３】 前記ＮＹＫ、その誘導体またはその機
能的同等体が融合タンパク質である請求項１１記載の検
出方法。 - 【請求項１４】 前記ＮＹＫ、その誘導体、その機能的
同等体またはその既知のリガンドのうち１つを、検出可
能なマーカーで標識する請求項１１記載の検出方法。 - 【請求項１５】 結合の測定を、イムノアッセイ、アフ
ィニティー型アッセイ、アフィニティークロマトグラフ
ィー、蛍光活性化細胞ソーティング、バイオセンサーお
よびバイオアッセイよりなる群から選択される検出系を
用いることによって達成する請求項１１記載の検出方
法。 - 【請求項１６】 前記既知のリガンドが抗体、ＶＥＧＦ
およびその突然変異体よりなる群から選択される請求項
１１記載の検出方法。 - 【請求項１７】 ＮＹＫの天然のリガンドと比較して、
受容体タンパク質ＮＹＫの活性を刺激する増大した能力
を有する分子を検出する方法であって、（Ｉ）前記増大
した能力を有すると考えられる分子を、受容体タンパク
質ＮＹＫ、その誘導体またはその機能的同等体と、前記
ＮＹＫ、その誘導体またはその機能的同等体と前記分子
との結合を可能とするのに適した条件下で接触させ、
（ＩＩ）結合が起こったか否かを測定し、ついで、（Ｉ
ＩＩ）（Ｉ）に記載の受容体タンパク質ＮＹＫ、その誘
導体またはその機能的同等体と、ＮＹＫの天然リガンド
とを適当な条件下で接触させることからなる対照におけ
る結合の量と、（ＩＩ）に記載の前記測定を比較するこ
と、からなる検出方法。 - 【請求項１８】 前記分子が野生型ＶＥＧＦの突然変異
体である請求項１７記載の検出方法。 - 【請求項１９】 前記分子がＫ１０６*２である請求項
１８記載の検出方法。 - 【請求項２０】 ＮＹＫまたはその変異体を含有すると
考えられる試料をＮＹＫの既知のリガンドと、前記ＮＹ
Ｋまたはその変異体と前記既知のリガンドとの間で結合
が起こることを可能とするのに適した条件下で接触さ
せ、ついで、結合が起こったか否かを測定することを特
徴とする試料中の受容体タンパク質ＮＹＫまたはその変
異体を検出する方法。 - 【請求項２１】 前記既知のリガンドが抗体およびＶＥ
ＧＦよりなる群から選択される請求項２０記載の検出方
法。 - 【請求項２２】 前記既知のリガンドがバイオセンサー
チップに結合したモノクローナル抗体である請求項２１
記載の検出方法。 - 【請求項２３】 神経上皮チロシンキナーゼＮＹＫの細
胞外ドメインの生物学的活性を有する組み換えタンパク
質の生産方法であって、以下の工程、 ａ）タンパク質をコードする核酸において、受容体の細
胞外および予測される膜貫通ドメインの結合点（ｊｕｎ
ｃｔｉｏｎ）に制限酵素切断部位を生じさせ、ここで、
前記制限酵素切断部位はコンストラクトに対してユニー
クとなるように選択され、 ｂ）工程ａ）で生成した核酸に、マーカーペプチドをコ
ードするオリゴヌクレオチド配列およびイン−フレーム
停止コドンを連結させ、 ｃ）工程ｂ）で生成したコンストラクトを培養中の哺乳
動物宿主細胞で発現させてタンパク質を得、 ｄ）前記マーカーペプチドに特異的なアフィニティー試
薬を用いることによって前記タンパク質を単離するこ
と、からなる神経上皮チロシンキナーゼＮＹＫの細胞外
ドメインの生物学的活性を有する組み換えタンパク質の
生産方法。 - 【請求項２４】 前記タンパク質を精製する請求項２３
記載の方法。 - 【請求項２５】 工程ａ）を部位特異的突然変異誘発ま
たはポリメラーゼ連鎖反応を用いることによって行う請
求項２３記載の方法。 - 【請求項２６】 前記制限酵素切断部位がＢｇｌＩＩま
たはＢａｍＨＩである請求項２３記載の方法。 - 【請求項２７】 工程ｂ）で導入したユニーク制限酵素
切断部位がＣｌａＩである請求項２３記載の方法。 - 【請求項２８】 前記マーカーペプチドがＦＬＡＧTMで
ある請求項２３記載の方法。 - 【請求項２９】 前記マーカーペプチドを細胞外ドメイ
ンのＣ−末端に挿入する請求項２３記載の方法。 - 【請求項３０】 前記精製を抗−ＦＬＡＧTMペプチドア
フィニティーゲルおよび遊離ＦＬＡＧTMペプチドでのお
だやかな溶出を用いて行う請求項２４記載の方法。 - 【請求項３１】 前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である請求
項２３記載の方法。
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