JP2000041682A - 変異バルナーゼ遺伝子およびその形質転換植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 バルナーゼ遺伝子を単独で葯特異的に発現さ
せることにより、植物に生じる好ましくない形質を伴わ
ない雄性不稔植物を作出することを目的とする。 【解決手段】 変異を生じさせることにより活性を保持
しつつも低下させたバルナーゼ遺伝子を植物に導入し、
葯特異的に発現させることにより、効率よく雄性不稔植
物の形質転換体を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物の特定部位、
特に葯に特異的に発現させることにより、効率よく雄性
不稔形質転換体が得られる変異バルナーゼ遺伝子に関す
る。本発明はまた、本発明の変異バルナーゼ遺伝子を、
宿主細胞中で発現することができる組換えベクター、該
ベクターにより形質転換された植物、および形質転換植
物の作出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】バルナーゼ（barnase）はバチルス・ア
ミロリクイファシエンス（Bacillusamyloliquifacien
s）由来のRNA分解酵素（RNase）である（S. Nishimura
and M.Nomura, Biochem.Biophys.Acta 30, 430-431:195
8; R.W. Hartley, J.Mol.Biol., 202, 913-915:198
8）。本酵素はアミノ酸残基110個を有し、RNAを加水分
解する酵素である。本酵素が細胞内で発現すると、その
強力なRNA分解活性により細胞機能が阻害され、多くの
場合細胞は死滅する。しかしながら、バルナーゼの遺伝
子を植物の所定の部位に発現させることができれば、所
定の部位の機能を選択的に抑制することができる。

【０００３】PCT出願国際公開第8910396号には、上記の
バルナーゼ遺伝子を葯組織のタペータム細胞に特異的な
発現プロモーターの下流に結合して作成した雄性不稔遺
伝子を植物に導入し、雄性不稔植物を得る技術が報告さ
れている。このような雄性不稔化技術は効率の良いF1ハ
イブリッド品種の開発において非常に有用である。

【０００４】しかし、バルナーゼ遺伝子を雄性不稔遺伝
子として使用した場合には、雄性不稔形質転換体が、好
ましくない形質を示す場合がしばしば観察されている。
PCT出願国際公開第9626283号にはイネにおけるこのよう
な問題が述べられているが、イネだけでなくレタスにお
いても同様な現象が報告されている（Scientia Horticu
lturae 55, 125-139:1993; Arlette Reymaerts, Hilde
Van de Wiele, Greta De Sutter, Jan Janssens:Engine
ered genes for fertility control and their applica
tion in hybrid seed production）。その報告によると
タバコ由来の葯特異的プロモーター（TA29）とバルナー
ゼを用いた雄性不稔遺伝子をレタスに導入した場合、活
力の低下した植物体が現れる。

【０００５】このような現象の正確な原因は解明されて
いないが、たとえば、いわゆる遺伝子導入部位の「位置
効果」の影響がそのメカニズムとして想定されている
（PCT出願国際公開第9626283号）。すなわち、より具体
的には、雄性不稔遺伝子が目的とする部位である葯での
み発現すれば希望する雄性不稔植物が作成できるが、当
該遺伝子の導入部位近傍に存在する内在性のエンハンサ
ー等の発現調節因子の影響で葯組織以外でもバルナーゼ
がごく微量発現する可能性がある。このような場合、酵
素活性が強力であるために、上述した好ましくない形質
が現れることが考えられる。

【０００６】この問題を克服するために、PCT出願国際
公開第9626283号にはまた、カリフラワーモザイクウィ
ルス35Sプロモーター（以下、CaMV35Sプロモーターとい
う）の、葯以外の組織で強力に発現するという性質を利
用した次のような方法が記載されている。すなわち、バ
ルナーゼに対する阻害タンパク質であるバースター（ba
rstar）を使用する方法であり、CaMV35Sプロモーターに
結合したバースター遺伝子を植物体に同時に導入して葯
以外の組織でバースター遺伝子を構成的に発現させるこ
とにより、葯以外におけるバルナーゼの影響を排除する
というものである。しかしながら、この方法ではバルナ
ーゼ遺伝子のみならず、バースター遺伝子を導入しなけ
ればならず、植物体に複数の外来遺伝子を導入すること
になる。植物では複数コピーの外来遺伝子を導入するこ
とにより、その遺伝子の発現が抑制されるというジーン
サイレンシング（gene silencing）の問題が知られてお
り、現在のところそのメカニズムは明確でないものの、
特に外来遺伝子を35Sプロモーターにより発現させた場
合にこの問題が起こりやすいとされている（R.B. Flave
l, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91, 3490-3496:1994; J. F
innegan, Bio.Technology 12, 883-888:1994; M.A. Mat
zke and A.J.M. Matzke, Plant Physiol., 107, 679-68
5:1995）。一方、バルナーゼを利用した雄性不稔遺伝子
を、イネやトウモロコシなどの種子を利用する作物のF1
品種育成に用いる場合には、花粉親（父親）に「雄性回
復遺伝子」としてバースター遺伝子を保持させることに
より、F1世代で花粉の稔性を回復させるという方法が採
られている（C. Mariani, et al., Nature 357, 384-38
7:1992）。そのため、前述のWO96/26283のような方法で
MS植物（母親）を作成した場合には、F1植物において複
数コピーのバースター遺伝子が存在することになり、ジ
ーンサイレンシングの影響で、その発現が抑制されてし
まうおそれが生じる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、バースター
遺伝子を用いることなくバルナーゼ遺伝子により雄性不
稔植物を作出する方法を提供する。

【０００８】本発明は、上記方法に使用する変異バルナ
ーゼ遺伝子およびその製造方法も提供する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明においては、バル
ナーゼ遺伝子のDNA配列（R.W. Hartley, J.Mol.Biol. 2
02, 913-915:1988）の少なくとも一部を変異させ、この
変異遺伝子を植物の葯で特異的に発現させたとき、葯以
外の組織に対して実質的に不利な影響を及ぼすことな
く、当該植物を実質的に雄性不稔化することができるよ
うにする。

【００１０】変異の方法は、部位特異的変異形成法、制
限酵素による一部断片の削除、Low Fidelity PCR法など
の公知の方法で行うことができる。好ましい変異方法
は、Low Fidelity PCR法である（D. Leung, E. Chen an
d D.Goedda, Technique 1, 11-15:1989; Y.Z. Xiaoping
and R.H. Ebright, Nucleic Acid Res. 19, 6052:199
1; G.C. Rice et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89, 54
67-5471:1992）。この技法を用い、増幅時の反応を複数
エラーの起きやすい条件下で行うことで、目的のDNA断
片に効率よくランダム変異を導入することが可能であ
る。

【００１１】本発明においてLow Fidelity PCR法に用い
るプライマーは、通常のPCR法と同様にして選択する。
プライマーの長さは通常のPCR法と同様の塩基数である
ことが好ましい。

【００１２】本発明者らは、配列番号１の配列を含むDN
Aを鋳型に用いプライマー１（5’-CGTTCGGCTC GATGGTAC
CG GTTATCAACA CGTTTGA-3’、配列番号６）、プライマ
ー２（5’-CCTCTAGATT ATCTGATTTT TGTAAAGGTC TGATAAT
G-3’、配列番号７）の組合せでPCRを行ない、配列番号
３に示されるDNA配列を有する変異バルナーゼ遺伝子を
単離することができた。

【００１３】配列番号１の配列は、公知のプラスミドpV
E108（WO92/13956）上に存在するバルナーゼ遺伝子のコ
ーディング領域の配列であり、本来のバルナーゼ遺伝子
の配列からN末端側の菌体外への分泌シグナルに当たる
不要な部分を取り除いたものである。

【００１４】同様の方法で、さらに異なる変異バルナー
ゼ遺伝子を得ることも可能である。

【００１５】PCR増幅産物は、慣用の技術によって、大
腸菌等の宿主中でクローニングし、変異バルナーゼ遺伝
子を含む大腸菌クローンを単離する。このクローニング
において、バルナーゼ遺伝子を有するクローンは、該遺
伝子の発現により生じるRNase活性の測定によりスクリ
ーニングしてもよいが、バルナーゼの有するRNase活性
により、大腸菌の成長が影響を受けることを利用して、
以下に述べる２工程からなる方法によりスクリーニング
するのが都合がよい。

【００１６】第一の工程では、まず、上述のようにして
得た変異バルナーゼ遺伝子を用いてプラスミドを調製
し、これにより大腸菌を形質転換する。このようにして
得られた大腸菌形質転換株は、導入された変異バルナー
ゼの活性により成長が抑制される。この事実に基づき、
変異バルナーゼを導入していない対照ベクターを導入し
た大腸菌株と比較して、成長の遅い、すなわちコロニー
の大きさが小さいコロニーを選抜する。このようにして
選抜された大腸菌株は、変異バルナーゼ遺伝子を含むこ
とが予想されるが、確実に変異バルナーゼ遺伝子が発現
することにより成長抑制が起こっていることを確認する
ために、次いで第二の工程を行う。

【００１７】第二の工程においては、バースター遺伝子
を用いる。バースターは、前述したようにバルナーゼに
対して拮抗作用を有する酵素である。バースターを発現
させた大腸菌中では、バルナーゼの酵素活性が阻害さ
れ、バルナーゼ存在下ではその活性により分解されるは
ずのmRNAの分解を阻害することができる。その結果、バ
ースター遺伝子を発現させた大腸菌をバルナーゼ遺伝子
により形質転換した場合には、その生育が抑制されない
ことになるので、バースター遺伝子を発現させた大腸菌
をバルナーゼ遺伝子を含まない対照プラスミドにより形
質転換した場合と成長速度を比較すると、両者の成長速
度に大きな差はなく、したがってコロニーのサイズは大
きく変化しないと期待される。これに基づき、第一の工
程で選抜した大腸菌からプラスミドを調製し、これを用
いてバースター遺伝子を構成的に発現させた大腸菌を形
質転換し、対照プラスミドにより形質転換した大腸菌と
同程度のサイズのコロニーを、変異バルナーゼ遺伝子を
含むコロニーとして選択する。

【００１８】こうして得られた変異バルナーゼ遺伝子
は、必要であれば、慣用の方法によってDNA配列を解析
することで、その変異の詳細を調べることができる。

【００１９】本発明の変異バルナーゼ遺伝子の好ましい
一例は、配列番号３のDNA配列を有する。この遺伝子が
コードする塩基配列は、野生型活性を示す配列番号１の
塩基配列と比較すると、開始コドンであるATGのAから数
えて15番目にTの挿入があり、また333番目のAが欠失し
ている。この配列番号３のDNA配列に基づいてタンパク
質の翻訳が行われた場合、９番目コドンに終止コドンが
あらわれるため理論的には８アミノ酸からなるポリペプ
チドしか生成されず、そのため生成される変異バルナー
ゼタンパク質はRNA分解酵素活性を有さない可能性が考
えられる。しかしながら、配列番号３に基づくタンパク
質を発現させたとき、バルナーゼ活性を有するタンパク
質が生成されている。本発明においては、タンパク質へ
の翻訳過程でリボゾームが自動的に読み枠をずらして翻
訳する、フレームシフトリコーディング（Frame Shift
Re-coding）と呼ばれる現象が起こっている可能性があ
る。この現象はウィルス、大腸菌、動物のいくつかの遺
伝子において見つかっている。この現象が起こる結果、
読み枠のずれに伴う翻訳効率の低下が生じ、そのために
低活性になっていることが考えられる。

【００２０】さらに、配列番号３のDNA配列中の塩基の
一つまたは複数が置換、欠失、挿入、付加されても、配
列番号３の遺伝子と同様に、植物で葯特異的に発現させ
たとき、当該植物を実質的に雄性不稔化することができ
る変異遺伝子が存在すると考えられ、そのような変異遺
伝子も配列番号３のものと同様に本発明において好まし
い。

【００２１】変異バルナーゼ遺伝子により、雄性不稔化
することができる植物としては、本遺伝子が導入され、
実質的に雄性不稔化できる植物であれば、特に限定され
ないが、具体例を挙げると例えばイネ、トウモロコシ、
タバコ、レタス、ナタネなどを挙げることができる。こ
の中で特に、イネおよびトウモロコシが好ましい。

【００２２】植物を雄性不稔化するためには、変異バル
ナーゼ遺伝子を当該植物の葯で特異的に発現させ、その
RNase活性によって葯の機能を阻害する。葯で特異的に
発現させるためには、WO92/13957に記載されている方法
を用いることができる。簡単に述べると、変異バルナー
ゼ遺伝子を、約特異性のプロモーターの下流に連結し
て、発現ベクターを用いて植物細胞に組み込む。

【００２３】組み込みのためには、アグロバクテリウム
法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法な
どがある。

【００２４】形質転換した植物細胞から植物体を形成す
るためには、形質転換した植物細胞カルスから再生す
る。その方法は、Y. Hiei et al., Plant J. 6, 271-28
2:1994の様にして行えばよい。

【００２５】このようにして作出した植物体が、雄性不
稔化されていることは、これらの植物体を栽培しても、
稔性のある花粉を他の植物体から受粉しない限り稔実し
ないことから確認することができる。

【００２６】

【実施例】実施例１． 変異バルナーゼ遺伝子の調製 Low fidelity PCR プライマー１（CGTTCGGCTC GATGGTACCG GTTATCAACA CGT
TTGA、配列番号６）およびプライマー２（CCTCTAGATT A
TCTGATTTT TGTAAAGGTC TGATAATG、配列番号７）を、S.
L. Beaucage et al., Tetrahedron Lett., 22, 1859-18
62:1982に記載の方法でDNA合成装置（アプライドバイオ
システムズ社製）を用いて合成した。公知のプラスミド
pVE108（WO92/13956）を鋳型に用い、プライマー１およ
びプライマー２の組み合わせでPCRを行った。pVE108の
バルナーゼ遺伝子のコーディング領域に対応する部分の
配列を配列番号１に示す。また、反応条件は次の通りで
ある。すなわち、10mM Tris-HCl（pH9.5）、50mM KCl、
2mM MgCl₂、それぞれ1mMのdNTP、10ngの鋳型DNA、0.5un
itsのTaq DNAポリメラーゼ中で、 94℃１分、57℃１
分、72℃１分を、50サイクル行った。

【００２７】反応後、増幅産物をアガロースゲル電気泳
動（2% SeaKem GTG agarose, 1xTAE）で分離、DEAE-セ
ルロース法（村松正実編「ラボマニュアル遺伝子工学」
丸善、1988 pp111）により精製したものを鋳型に、上記
の条件で再びPCR反応をおこなった。

【００２８】変異導入バルナーゼ遺伝子断片のプラスミ
ドベクターへのライゲーション 反応産物を常法によりSacI、XbaIで消化後、アガロース
ゲル電気泳動で精製し、挿入断片を調製した。この挿入
断片を大腸菌へ導入するためのプラスミドは適宜選択で
きるか、たとえばプラスミドpHM1を用いることができ
る。プラスミドpHM1は、プラスミドpBR322のEcoRI部位
を切断した後T4 DNAポリメラーゼ（宝酒造）を用いて平
滑化後、その制限酵素部位にpUC18からPvuIIで切り出し
たlacZの発現カセット（322bp）を同様に平滑化した後
組み込むことによって作製されたプラスミドである。

【００２９】プラスミドpHM1をSacI、XbaIで消化した後
さらに仔ウシ小腸アルカリフォスファターゼ（Calf int
estine alkaline phosphstase、宝酒造）により脱リン
酸化して、制限酵素処理プラスミド断片を調製した。変
異バルナーゼ遺伝子を含む上記挿入断片は、Takara Lig
ation Kit ver.1（宝酒造）を用いて制限酵素処理され
たpHM1中にライゲーションした。

【００３０】大腸菌への導入とバルナーゼ活性クローン
の選抜 バルナーゼ遺伝子が導入された大腸菌は、たとえば次の
ようにして選抜する。すなわち、バルナーゼの活性によ
り細胞内でmRNAが分解されるため、タンパク質の合成が
低下して、結果として大腸菌の成長が抑制される。した
がって、変異バルナーゼ遺伝子を含まない対照プラスミ
ドで形質転換した大腸菌コロニーと比較してコロニーサ
イズが小さくなることを利用して、バルナーゼ遺伝子に
より形質転換された大腸菌を選択することができる。な
お、野生型バルナーゼ若しくは同等の活性を保持した変
異バルナーゼをpHMに組み込んだ場合には、大腸菌はコ
ロニーを形成できないため、十分に活性の弱まったクロ
ーンのみを選択することが可能である。

【００３１】そこで、変異バルナーゼ遺伝子をライゲー
ションしたプラスミドをエタノール沈殿した後、このプ
ラスミドをGenePulser（BioRad）を用いたエレクトロポ
ーレーション法により、大腸菌LE392株に導入した。導
入手順はBioRad社のマニュアルに従っておこなった。同
様の手順にしたがって、変異バルナーゼを含まない対照
プラスミドも大腸菌LE392株に導入した。

【００３２】その後、これらの形質転換された大腸菌を
テトラサイクリン（25μg/ml）を含むLB寒天培地にプレ
ーティングし、室温（25℃）で72時間培養後、対照とな
るプラスミドpHM1を導入した大腸菌のコロニーと比較し
てコロニーサイズの小さいコロニーを、変異バルナーゼ
が導入されたプラスミドを含む大腸菌のコロニーとして
選抜した（表１のＡ）。

【００３３】バースター遺伝子による変異バルナーゼク
ローンの選抜 バースターは、前述したようにバルナーゼに対して拮抗
作用を有する酵素である。バースターを発現させた大腸
菌中では、バルナーゼの酵素活性が阻害され、バルナー
ゼ存在下ではその活性により分解されるはずのmRNAの分
解を阻害することができる。その結果、バースターを発
現させた大腸菌をバルナーゼ遺伝子を挿入したプラスミ
ドにより形質転換した場合には、その生育が抑制されな
いので、バースターを発現させた大腸菌をバルナーゼ遺
伝子含まない対照プラスミドにより形質転換した場合と
成長速度を比較した場合、その成長速度は両者で大きな
差はなく、したがってコロニーのサイズは大きく変化し
ないと期待される。

【００３４】この大腸菌は以下のように作成した。R.W.
Hartley, J.Mol.Biol. 202, 913-915:1988に記載のバ
ースター遺伝子をHindIIIとXbaIできりだし、tacプロモ
ーター（de Boer et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,
21-25:1983）とインフレームで結合し、さらにクロラ
ムフェニコール耐性遺伝子（N.K. Alton, and D. Vapne
k, Nature 282, 864-869:1979）とともに（Herrero et
al., J.Bacteriol.172, 6557-6567:1990）に記載のベク
ター上の、転移酵素を欠損したトランスポゾン（defect
ive transposon）の内部に結合し、その後、得られたプ
ラスミドを大腸菌MC1061株へ導入し、このトランスポゾ
ン（バースター遺伝子カセットを含む。）を当該大腸菌
染色体に転移させた。この大腸菌が安定してバースター
遺伝子カセットを維持していることはクロラムフェニコ
ール耐性により確認することが可能である。また大腸菌
MC1061株ではlacI遺伝子が欠損しているため、tacプロ
モーターは常に誘導されており、バースター遺伝子は構
成的（constitutive）に発現することとなる。

【００３５】エレクトロポレーション法により変異バル
ナーゼ遺伝子を挿入断片として含むプラスミド、または
それを含まない対照のプラスミドを大腸菌に導入した
後、これらの大腸菌をIPTG（1mM）、テトラサイクリン
（25μg/mL）を含むLB寒天培地にプレーティングし、25
℃で72時間培養した。その後、変異バルナーゼ遺伝子で
形質転換した大腸菌のコロニーの中から、同時に平板培
養を開始した対照プラスミドpHM1導入大腸菌コロニーと
比較して、コロニーの大きさが変わらないクローン
（“#4-31”と命名）を選抜した（表１のＢ）。

【００３６】

【表１】 選抜クローンとコロニーの大きさ （mm） -------------------------------------------------------------------- 選抜クローン pHM1（対照） -------------------------------------------------------------------- Ａ：E.coli LE392＊¹ 1.77±0.33 2.65±0.47 -------------------------------------------------------------------- Ｂ：バースター遺伝子を 発現させたE.coli＊² 1.39±0.10 1.55±0.08 -------------------------------------------------------------------- *1：LB寒天プレート（25ug/mL テトラサイクリン）上で28℃、48時間培養後のコ ロニーの大きさ *2：LB寒天プレート（25ug/mL テトラサイクリン）上で28℃、24時間培養後のコ ロニーの大きさ実施例２． 変異バルナーゼ遺伝子の塩基配列の決定 実施例１で選抜した大腸菌から、本発明の目的に適した
クローン化された変異バルナーゼ遺伝子を調製した。ま
ず、実施例１で選抜したクローン#4-31を調製した。次
いでクローン#4-31に組み込まれた変異バルナーゼ遺伝
子断片をKpnI、XbaIで切り出し、同様にKpnI、XbaIで切
断したpUC119のKpnI、XbaIサイトにライゲーションし
た。このプラスミドを大腸菌を用いて増幅させた後、Ta
qポリメラーゼを用いたサイクルシークエンス法を用い
て（Taq Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, Appli
ed Biosystems Inc.）、メーカーのプロトコルに従って
反応を行い、次いでApplied Biosystems社製のDNAシー
ケンサー（Model 373A）で配列を解析した。その結果、
配列番号３に示す配列を得た。この配列は、本来のバル
ナーゼ遺伝子のDNA配列と比較して、開始コドンであるA
TGのAから数えて15番目にTの挿入があり、また333番目
のAが欠失している。

【００３７】実施例３． 弱毒性変異バルナーゼ遺伝子
を用いた雄性不稔イネの作成 上述したようにpUC119に組み込んだ弱毒性変異バルナー
ゼ遺伝子を、プラスミドを制限酵素XbaI、KpnIで切断し
て利用し、配列番号５に示すプラスミドベクターpTS431
を構築した。pTS431は既知のプラスミドであるpVE108プ
ラスミド（PCT出願国際公開第9213956号）とは以下の点
に相違があるが、葯特異的プロモーターと変異バルナー
ゼ部分を除き、実質的に等価であると考えられる。

【００３８】（１） pVE108プラスミドではバルナーゼ
遺伝子（配列番号１）を導入していた部分が、本発明の
pTS431では変異バルナーゼ遺伝子（配列番号３）に変更
されている。

【００３９】（２） pVE108プラスミドではタバコ由来
の葯特異的プロモーターを使用していたが、本発明のpT
S431ではイネE1遺伝子（PCT出願国際公開第9213956号）
由来の葯特異的プロモーターに変更している。

【００４０】（３） 本発明では、バルナーゼ遺伝子の
上流にpVE108プラスミドでは使用されていなかった1376
bpの35S3プロモーター（EP 0344029）を用いている。

【００４１】（４） 本発明では、バルナーゼ遺伝子の
下流部にpVE108プラスミドでは使用されていなかったpJ
D884（PCT出願国際公開第9309218号）から切り出したAg
robacterium T-DNA gene7の下流部由来の配列を用いて
いる。

【００４２】（５） 本発明では、pUC19に由来する部
分からlacZに相当する領域を取り除いている。なお、変
異型ではなく、従来型のバルナーゼ遺伝子を組み込んだ
プラスミド（pTS172）を配列番号４に示す。

【００４３】pTS431（変異バルナーゼ遺伝子導入プラス
ミド、配列番号５）、pTS172（バルナーゼ遺伝子導入プ
ラスミド、配列番号４）から制限酵素EcoRIによりそれ
ぞれ約4.5kbpの断片を切り出し、中間ベクター pSB11
（T. Komari et al., PlantJ. 10(1), 165-174:1996）
の EcoRI 部位に挿入し、さらに相同組換えによりそのT
-DNA 領域をacceptor vector pSB1（T. Komari et al.,
Plant J. 10(1), 165-174:1996）に組み込んだ。この
組換型プラスミド（それぞれpSB1431、pSB1172）をもつ
Agrobacterium tumefaciens LBA4404をイネ（品種アサ
ノヒカリ）の形質転換に用いた。形質転換の方法は、基
本的に樋江井らの方法（Plant J. 6(2),271-282:1994）
に従ったが、構築した雄性不稔遺伝子が選抜マーカーと
してbar遺伝子（phosphinithricine acetyl transferas
eをコードする）を含んでいるので、形質転換の際の選
抜には、形質転換は選抜にphosphinothricine（濃度10m
g/L）を用いた。phosphinothricineは、遺伝子が導入さ
れたカルスを選抜するために用いる。

【００４４】イネにおいて、野生型バルナーゼ遺伝子を
利用した場合と変異バルナーゼ遺伝子を利用した場合と
を比較すると、形質転換の効率、形態の正常な雄性不稔
形質転換の割合は表２のように変異バルナーゼの導入に
より顕著に改善された。

【００４５】

【表２】 形質転換効率 ---------------------------------------------------------------------- 感染 再分化 PCR陽性 形態の正常な カルス数 カルス数 系統数＊¹ 雄性不稔系統数 ---------------------------------------------------------------------- pSB1172（対照） 2838 83 52/83 9/52 (17.3%) pSB1431（対照） 787 69 43/45＊² 27/28＊³ (96.4%) ---------------------------------------------------------------------- *1：PCRによりバルナーゼの断片遺伝子を検出 *2：69系統のうち45系統のみ調査 *3：43系統のうち28系統のみ調査

【００４６】

【発明の効果】本発明において、変異により効果を弱め
たバルナーゼ遺伝子を作出し、これを用いた雄性不稔遺
伝子を植物に導入することにより、バースター遺伝子を
用いずに、単一の遺伝子により、好ましくない形質を持
たない雄性不稔植物を効率よく得ることに成功した。

【００４７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Tobacco Inc. <120> 変異バルナーゼ遺伝子およびその形質転換植物 <130> 980687 <160> 7 <210> 1 <211> 343 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquifaciens <220> <221> NAME/KEY: CDS <222> 1..336 <400> 1 atg gta ccg gtt atc aac acg ttt gac ggg gtt gcg gat tat ctt cag 48 Met Val Pro Val Ile Asn Thr Phe Asp Gly Val Ala Asp Tyr Leu Gln 1 5 10 15 aca tat cat aag cta cct gat aat tac att aca aaa tca gaa gca caa 96 Thr Tyr His Lys Leu Pro Asp Asn Tyr Ile Thr Lys Ser Glu Ala Gln 20 25 30 gcc ctc ggc tgg gtg gca tca aaa ggg aac ctt gca gac gtc gct ccg 144 Ala Leu Gly Trp Val Ala Ser Lys Gly Asn Leu Ala Asp Val Ala Pro 35 40 45 ggg aaa agc atc ggc gga gac atc ttc tca aac agg gaa ggc aaa ctc 192 Gly Lys Ser Ile Gly Gly Asp Ile Phe Ser Asn Arg Glu Gly Lys Leu 50 55 60 ccg ggc aaa agc gga cga aca tgg cgt gaa gcg gat att aac tat aca 240 Pro Gly Lys Ser Gly Arg Thr Trp Arg Glu Ala Asp Ile Asn Tyr Thr 65 70 75 80 tca ggc ttc aga aat tca gac cgg att ctt tac tca agc gac tgg ctg 288 Ser Gly Phe Arg Asn Ser Asp Arg Ile Leu Tyr Ser Ser Asp Trp Leu 85 90 95 att tac aaa aca acg gac cat tat cag acc ttt aca aaa atc aga taa 336 Ile Tyr Lys Thr Thr Asp His Tyr Gln Thr Phe Thr Lys Ile Arg 100 105 110 ggtaacc 343 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquifaciens <400> 2 Met Val Pro Val Ile Asn Thr Phe Asp Gly Val Ala Asp Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Thr Tyr His Lys Leu Pro Asp Asn Tyr Ile Thr Lys Ser Glu Ala Gln 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Val Ala Ser Lys Gly Asn Leu Ala Asp Val Ala Pro 35 40 45 Gly Lys Ser Ile Gly Gly Asp Ile Phe Ser Asn Arg Glu Gly Lys Leu 50 55 60 Pro Gly Lys Ser Gly Arg Thr Trp Arg Glu Ala Asp Ile Asn Tyr Thr 65 70 75 80 Ser Gly Phe Arg Asn Ser Asp Arg Ile Leu Tyr Ser Ser Asp Trp Leu 85 90 95 Ile Tyr Lys Thr Thr Asp His Tyr Gln Thr Phe Thr Lys Ile Arg 100 105 110 <210> 3 <211> 342 <212> DNA <213> <400> 3 atggtaccgg ttattcaaca cgtttgacgg ggttgcggat tatcttcaga catatcataa 60 gctacctgat aattacatta caaaatcaga agcacaagcc ctcggctggg tggcatcaaa 120 agggaacctt gcagacgtcg ctccggggaa aagcatcggc ggagacatct tctcaaacag 180 ggaaggcaaa ctcccgggca aaagcggacg aacatggcgt gaagcggata ttaactatac 240 atcaggcttc agaaattcag accggattct ttactcaagc gactggctga tttacaaaac 300 aacggaccat tatcagacct ttacaaaaat cagtaatcta ga 342 <210> 4 <211> 6548 <212> DNA <213> Escherichia coli LE392 <220> <223> Clone: pTS172 <400> 4 aattcaagct tgacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt 60 ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg 120 cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt 180 cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta 240 aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc 300 ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa 360 gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc 420 cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt 480 acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact 540 gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac 600 aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata 660 ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta 720 ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg 780 gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat 840 aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt 900 aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga 960 aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa 1020 gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag 1080 gtgaagatcc tttttggctc gagtctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 1140 cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 1200 cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 1260 gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 1320 aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 1380 cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 1440 tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 1500 acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 1560 ctacagcgtg agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 1620 ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 1680 tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 1740 tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 1800 ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg 1860 gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag 1920 cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc 1980 gcgcgttggc ctgatcagaa ttcatatgca cgtgttcccg atctagtaac atagatgaca 2040 ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa 2100 tgtataattg cgggactcta atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca 2160 tgttaattat tacatgctta acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac 2220 cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tctgcttcgg 2280 aggttacctt atctgatttt tgtaaaggtc tgataatggt ccgttgtttt gtaaatcagc 2340 cagtcgcttg agtaaagaat ccggtctgaa tttctgaagc ctgatgtata gttaatatcc 2400 gcttcacgcc atgttcgtcc gcttttgccc gggagtttgc cttccctgtt tgagaagatg 2460 tctccgccga tgcttttccc cggagcgacg tctgcaaggt tcccttttga tgccacccag 2520 ccgagggctt gtgcttctga ttttgtaatg taattatcag gtagcttatg atatgtctga 2580 agataatccg caaccccgtc aaacgtgttg ataaccggta ccatcgcgac ggcttgatgg 2640 atctcttgct ggacaccggg atgctaggat gggttatcgt ggccggcgtg cgtgtgtggc 2700 ttttgtaggc gccggcgacg gcgggggcaa tgtggcaggt gagtcacggt gcaagcgtgc 2760 gcaagtgact gcaacaacca aggacggtca tggcgaaagc acctcacgcg tccaccgtct 2820 acaggatgta gcagtagcac ggtgaaagaa gtgttgtccc gtccattagg tgcattctca 2880 ccgttggcca gaacaggacc gttcaacagt taggttgagt gtaggacttt tacgtggtta 2940 atgtatggca aatagtagta aattttgccc ccattggtct ggctgagata gaacatattc 3000 tggaaagcct ctagcatatc ttttttgaca gctaaacttt gcttcttgcc ttcttggtct 3060 agcaatgacg ttgcccatgt cgtggcaaac atctggtaag gtaactgtat tcgtttgttc 3120 ccttcaacgg ctcaatcccc acaggccaag ctatcctttc cttggcagta taggctcctt 3180 gagagattat actaccattt ttaagtgctt ataaagacga tgctctctaa ccagatcgat 3240 cagaaacaca aagttttagc agcgtaatat cccacacaca tacacacacg aagctatgcc 3300 tcctcatttt ccgagagatt ctgacagtga ccagaatgtc agaatgccat ttcatgggca 3360 caagtcgatc cacaagcttc ttggtggagg tcaaggtgtg ctattattat tcgctttcta 3420 ggaaattatt cagaattagt gccttttatc ataacttctc tctgagccga tgtggttttg 3480 gatttcattg ttgggagcta tgcagttgcg gatattctgc tgtggaagaa caggaactta 3540 tctgcggggg tccttgctgg ggcaacattg atatggttcc tgttcgatgt agtagaatac 3600 aatataattc cgctcctttg ccagattgcc attcttgcca tgcttgtgat cttcatttgg 3660 tcaaatgccg caccactctt ggacaggtat tagctttatt tcctgtggag atggtagaaa 3720 actcagctta cagaaatggc atttcacgta gtataacgca agacattagg tactaaaact 3780 caactaactg tttccgaatt tcagggcccc tccaaggatc ccagaaatca tcatctctga 3840 acatgccttc agagaaatgg cattgaccgt ccattacaaa ctaacgtaca ctgtatctgt 3900 tctttacgac attgcatgtg gaaaggatct gaagagattt ctcctggtac ataataatct 3960 actcctttgc tacgttaata agagatgtaa aaacatgcaa cagttccagt gccaacattg 4020 tccaaggatt gtgcaattct ttctggagcg ctaaaattga ccagattaga cgcatcagaa 4080 tattgaattg cagagttagc caataatcct cataatgtta atgtgctatt gttgttcact 4140 actcaatata gttctggact aacaatcaga ttgtttatga tattaaggtg gttggatctc 4200 tattggtatt gtcggcgatt ggaagttctt gcagcttgac aagtctacta tatattggta 4260 ggtattccag ataaatatta aattttaata aaacaatcac acagaaggat ctgcggccgc 4320 tagcctaggc ccgggcccac aaaaatctga gcttaacagc acagttgctc ctctcagagc 4380 agaatcgggt attcaacacc ctcatatcaa ctactacgtt gtgtataacg gtccacatgc 4440 cggtatatac gatgactggg gttgtacaaa ggcggcaaca aacggcgttc ccggagttgc 4500 acacaagaaa tttgccacta ttacagaggc aagagcagca gctgacgcgt acacaacaag 4560 tcagcaaaca gacaggttga acttcatccc caaaggagaa gctcaactca agcccaagag 4620 ctttgctaag gccctaacaa gcccaccaaa gcaaaaagcc cactggctca cgctaggaac 4680 caaaaggccc agcagtgatc cagccccaaa agagatctcc tttgccccgg agattacaat 4740 ggacgatttc ctctatcttt acgatctagg aaggaagttc gaaggtgaag gtgacgacac 4800 tatgttcacc actgataatg agaaggttag cctcttcaat ttcagaaaga atgctgaccc 4860 acagatggtt agagaggcct acgcagcagg tctcatcaag acgatctacc cgagtaacaa 4920 tctccaggag atcaaatacc ttcccaagaa ggttaaagat gcagtcaaaa gattcaggac 4980 taattgcatc aagaacacag agaaagacat atttctcaag atcagaagta ctattccagt 5040 atggacgatt caaggcttgc ttcataaacc aaggcaagta atagagattg gagtctctaa 5100 aaaggtagtt cctactgaat ctaaggccat gcatggagtc taagattcaa atcgaggatc 5160 taacagaact cgccgtgaag actggcgaac agttcataca gagtctttta cgactcaatg 5220 acaagaagaa aatcttcgtc aacatggtgg agcacgacac tctggtctac tccaaaaatg 5280 tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg ctattgagac ttttcaacaa aggataattt 5340 cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcgaa aggacagtag 5400 aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcattcaag 5460 atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 5520 aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgacatc tccactgacg 5580 taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 5640 catttcattt ggagaggaca cgctgaaatc accagtctct ctctataaat ctatctctct 5700 ctctataacc atggacccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga 5760 catgccggcg gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg 5820 taccgagccg caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta 5880 tccctggctc gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggcccctg 5940 gaaggcacgc aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca 6000 ccagcggacg ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca 6060 gggcttcaag agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca 6120 cgaggcgctc ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa 6180 ctggcatgac gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggtaccgc cccgtccggt 6240 cctgcccgtc accgagatct gagatcacgc gttctaggat cccccgatga gctaagctag 6300 ctatatcatc aatttatgta ttacacataa tatcgcactc agtctttcat ctacggcaat 6360 gtaccagctg atataatcag ttattgaaat atttctgaat ttaaacttgc atcaataaat 6420 ttatgttttt gcttggacta taatacctga cttgttattt tatcaataaa tatttaaact 6480 atatttcttt caagatggga attaacatct acaaattgcc ttttcttatc gaccatgtac 6540 gtatcgcg 6548 <210> 5 <211> 6539 <212> DNA <213> Escherichia coli LE392 <220> <223> Clone: pTS431 <400> 5 aattcaagct tgacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt 60 ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg 120 cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt 180 cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta 240 aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc 300 ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa 360 gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc 420 cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt 480 acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact 540 gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac 600 aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata 660 ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta 720 ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg 780 gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat 840 aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt 900 aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga 960 aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa 1020 gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag 1080 gtgaagatcc tttttggctc gagtctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 1140 cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 1200 cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 1260 gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 1320 aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 1380 cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 1440 tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 1500 acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 1560 ctacagcgtg agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 1620 ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 1680 tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 1740 tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 1800 ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg 1860 gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag 1920 cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc 1980 gcgcgttggc ctgatcagaa ttcttcccga tctagtaaca tagatgacac cgcgcgcgat 2040 aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc 2100 gggactctaa tcataaaaac ccatctcata aataacgtca tgcattacat gttaattatt 2160 acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattat atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga 2220 ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg tttgaacgat ctgcttcgga tcctctagat 2280 tactgatttt tgtaaaggtc tgataatggt ccgttgtttt gtaaatcagc cagtcgcttg 2340 agtaaagaat ccggtctgaa tttctgaagc ctgatgtata gttaatatcc gcttcacgcc 2400 atgttcgtcc gcttttgccc gggagtttgc cttccctgtt tgagaagatg tctccgccga 2460 tgcttttccc cggagcgacg tctgcaaggt tcccttttga tgccacccag ccgagggctt 2520 gtgcttctga ttttgtaatg taattatcag gtagcttatg atatgtctga agataatccg 2580 caaccccgtc aaacgtgttg aataaccggt accatcgcga cggcttgatg gatctcttgc 2640 tggacaccgg gatgctagga tgggttatcg tggccggcgt gcgtgtgtgg cttttgtagg 2700 cgccggcgac ggcgggggca atgtggcagg tgagtcacgg tgcaagcgtg cgcaagtgac 2760 tgcaacaacc aaggacggtc atggcgaaag cacctcacgc gtccaccgtc tacaggatgt 2820 agcagtagca cggtgaaaga agtgttgtcc cgtccattag gtgcattctc accgttggcc 2880 agaacaggac cgttcaacag ttaggttgag tgtaggactt ttacgtggtt aatgtatggc 2940 aaatagtagt aaattttgcc cccattggtc tggctgagat agaacatatt ctggaaagcc 3000 tctagcatat cttttttgac agctaaactt tgcttcttgc cttcttggtc tagcaatgac 3060 gttgcccatg tcgtggcaaa catctggtaa ggtaactgta ttcgtttgtt cccttcaacg 3120 gctcaatccc cacaggccaa gctatccttt ccttggcagt ataggctcct tgagagatta 3180 tactaccatt tttaagtgct tataaagacg atgctctcta accagatcga tcagaaacac 3240 aaagttttag cagcgtaata tcccacacac atacacacac gaagctatgc ctcctcattt 3300 tccgagagat tctgacagtg accagaatgt cagaatgcca tttcatgggc acaagtcgat 3360 ccacaagctt cttggtggag gtcaaggtgt gctattatta ttcgctttct aggaaattat 3420 tcagaattag tgccttttat cataacttct ctctgagccg atgtggtttt ggatttcatt 3480 gttgggagct atgcagttgc ggatattctg ctgtggaaga acaggaactt atctgcgggg 3540 gtccttgctg gggcaacatt gatatggttc ctgttcgatg tagtagaata caatataatt 3600 ccgctccttt gccagattgc cattcttgcc atgcttgtga tcttcatttg gtcaaatgcc 3660 gcaccactct tggacaggta ttagctttat ttcctgtgga gatggtagaa aactcagctt 3720 acagaaatgg catttcacgt agtataacgc aagacattag gtactaaaac tcaactaact 3780 gtttccgaat ttcagggccc ctccaaggat cccagaaatc atcatctctg aacatgcctt 3840 cagagaaatg gcattgaccg tccattacaa actaacgtac actgtatctg ttctttacga 3900 cattgcatgt ggaaaggatc tgaagagatt tctcctggta cataataatc tactcctttg 3960 ctacgttaat aagagatgta aaaacatgca acagttccag tgccaacatt gtccaaggat 4020 tgtgcaattc tttctggagc gctaaaattg accagattag acgcatcaga atattgaatt 4080 gcagagttag ccaataatcc tcataatgtt aatgtgctat tgttgttcac tactcaatat 4140 agttctggac taacaatcag attgtttatg atattaaggt ggttggatct ctattggtat 4200 tgtcggcgat tggaagttct tgcagcttga caagtctact atatattggt aggtattcca 4260 gataaatatt aaattttaat aaaacaatca cacagaagga tctgcggccg ctagcctagg 4320 cccgggccca caaaaatctg agcttaacag cacagttgct cctctcagag cagaatcggg 4380 tattcaacac cctcatatca actactacgt tgtgtataac ggtccacatg ccggtatata 4440 cgatgactgg ggttgtacaa aggcggcaac aaacggcgtt cccggagttg cacacaagaa 4500 atttgccact attacagagg caagagcagc agctgacgcg tacacaacaa gtcagcaaac 4560 agacaggttg aacttcatcc ccaaaggaga agctcaactc aagcccaaga gctttgctaa 4620 ggccctaaca agcccaccaa agcaaaaagc ccactggctc acgctaggaa ccaaaaggcc 4680 cagcagtgat ccagccccaa aagagatctc ctttgccccg gagattacaa tggacgattt 4740 cctctatctt tacgatctag gaaggaagtt cgaaggtgaa ggtgacgaca ctatgttcac 4800 cactgataat gagaaggtta gcctcttcaa tttcagaaag aatgctgacc cacagatggt 4860 tagagaggcc tacgcagcag gtctcatcaa gacgatctac ccgagtaaca atctccagga 4920 gatcaaatac cttcccaaga aggttaaaga tgcagtcaaa agattcagga ctaattgcat 4980 caagaacaca gagaaagaca tatttctcaa gatcagaagt actattccag tatggacgat 5040 tcaaggcttg cttcataaac caaggcaagt aatagagatt ggagtctcta aaaaggtagt 5100 tcctactgaa tctaaggcca tgcatggagt ctaagattca aatcgaggat ctaacagaac 5160 tcgccgtgaa gactggcgaa cagttcatac agagtctttt acgactcaat gacaagaaga 5220 aaatcttcgt caacatggtg gagcacgaca ctctggtcta ctccaaaaat gtcaaagata 5280 cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aaggataatt tcgggaaacc 5340 tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc acttcatcga aaggacagta gaaaaggaag 5400 gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcattcaa gatgcctctg 5460 ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 5520 ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgacat ctccactgac gtaagggatg 5580 acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 5640 tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctataaa tctatctctc tctctataac 5700 catggaccca gaacgacgcc cggccgacat 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Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 <400> 6 cgttcggctc gatggtaccg gttatcaaca cgtttga 37 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 <400> 7 cctctagatt atctgatttt tgtaaaggtc tgataatg 38

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA17 CA19 CB03 CD03 CD10 CD17 CG01 4B024 AA08 BA11 CA05 FA02 GA25 4B050 CC03 DD02 LL10 4B065 AA16Y AA88X AA99Y AB01 BA02 BA14 BA16 CA53

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バルナーゼをコードする遺伝子におい
   て、該遺伝子のDNA配列の少なくとも一部に変異を有す
   ることにより、該変異遺伝子を植物中で葯特異的に発現
   させたとき、当該植物を実質的に雄性不稔化することが
   できる、変異バルナーゼ遺伝子。
2. 【請求項２】 配列番号１に記載のアミノ酸配列と同
   じアミノ酸配列をコードするDNA配列において、１また
   は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加さ
   れ、かつ植物中で葯特異的に発現させたとき当該植物を
   実質的に雄性不稔化することを特徴とするタンパク質を
   コードする遺伝子。
3. 【請求項３】 配列番号１に記載のアミノ酸配列と同
   じアミノ酸配列をコードするDNA配列において、１また
   は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加さ
   れたDNA配列であって、その上流に葯特異的な発現をも
   たらすプロモーター配列を有し、植物ゲノム中に導入さ
   れたとき、当該植物を実質的に雄性不稔化することを特
   徴とする遺伝子。
4. 【請求項４】 配列番号３で示され、かつ植物中で葯
   特異的に発現させたとき当該植物を実質的に雄性不稔化
   することを特徴とするタンパク質をコードする遺伝子。
5. 【請求項５】 配列番号３で示される配列、およびそ
   の上流に存在して葯特異的な発現をもたらすプロモータ
   ー配列を有し、植物ゲノム中に導入されたとき、当該植
   物を実質的に雄性不稔化することを特徴とする遺伝子。
6. 【請求項６】 請求項１ないし請求項５のいずれか１
   項に記載の遺伝子を含み、宿主植物中で該遺伝子を発現
   することができる組換えベクター。
7. 【請求項７】 請求項１ないし請求項５のいずれか１
   項に記載の変異バルナーゼ遺伝子を用いて植物を形質転
   換し、該変異バルナーゼ遺伝子を葯特異的に発現させる
   ことにより当該植物を雄性不稔化する方法。
8. 【請求項８】 変異バルナーゼ遺伝子による植物の形
   質転換が、該遺伝子を植物のゲノムへ組み込むことによ
   り行われる、請求項７の方法。
9. 【請求項９】 請求項１ないし請求項５のいずれか１
   項に記載の遺伝子を導入した形質転換植物。