JP2000026315A - カルシウムチャンネル活性化剤の評価方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 神経細胞におけるＣａチャンネルα₁サブユ
ニットとＧ蛋白との相互作用の解明とこれに基づく医薬
の提供。 【解決手段】 Ｇ蛋白のαサブユニットとＣａチャンネ
ルα₁サブユニットのＣ末端領域との結合を阻害する物
質又はＧ蛋白のαサブユニットとＣａチャンネルα₁サ
ブユニットの結合によりもたらされるＣａチャンネルの
機能変化を阻害する物質を有効成分とする神経細胞Ｃａ
チャンネル活性化剤、抗痴呆剤及び能機能改善剤、並び
にこれらの薬剤の評価方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は神経細胞カルシウム
チャンネル（Ｃａチャンネル）活性化剤の評価方法及び
神経細胞Ｃａチャンネル活性化剤に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】神経終
末には多くのＣａチャンネルが存在する。活動電位が伝
播してきた結果、Ｃａチャンネルは開口し、細胞内へと
カルシウムを流入させる。その結果として、神経伝達物
質が神経末端より分泌され、神経間での情報伝達がなさ
れる。細胞内へのカルシウム流入量を増加させれば、神
経伝達物質の遊離量が増え、神経伝達の効率が高められ
ることにより、高次脳機能改善作用が発現すると考えら
れている。

【０００３】Ｃａチャンネルには、膜受容体に共役し、
受容体の刺激に伴ってＣａを細胞内へ流入させる受容体
作働性Ｃａチャンネル（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｏｐｅｒａ
ｔｅｄ Ｃａ Ｃｈａｎｎｅｌ）ならびに膜電位に依存
して開口し、Ｃａを流入させる電位依存性Ｃａチャンネ
ル（Ｖｏｌｔａｇｅ Ｇａｔｅｄ Ｃａ Ｃｈａｎｎｅ
ｌ）の二種類が知られている。後者は更に、高閾値活性
型（Ｈｉｇｈ Ｖｏｌｔａｇｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ：
ＨＶＡ）ならびに低閾値活性型（Ｌｏｗ Ｖｏｌｔａｇ
ｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ：ＬＶＡ）Ｃａチャンネルのタ
イプに大別される。ＨＶＡ Ｃａチャンネルには、Ｎタ
イプ ＣａチャンネルならびにＰ／ＱタイプＣａチャン
ネル等が知られており、中枢神経系に広く分布するとと
もに、神経伝達物質の遊離、長期増強、神経細胞可塑性
調節他に深く関与しているものと考えられている。

【０００４】これらのＮタイプ及びＰ／ＱタイプＣａチ
ャンネルは、Ｇ蛋白によって抑制性の調節を受ける。Ｇ
蛋白は、α、β及びγサブユニットの三量体で構成さ
れ、Ｇ蛋白共役受容体に結合して不活性の状態で存在し
ている。ひとたび、Ｇ蛋白共役受容体が刺激されると、
Ｇ蛋白αサブユニットがリン酸化されるとともにαサブ
ユニットならびにβγサブユニットに解離し、遊離さ
れ、様々な生理学的作用を引き起こす。ＨＶＡ Ｃａチ
ャンネルであるＮタイプ及びＰ／ＱタイプＣａチャンネ
ルは、各種受容体刺激によって遊離されたＧ蛋白αサブ
ユニット及びβγサブユニットにより、抑制性の調節を
受けることが知られている。

【０００５】しかしながら、これらＧ蛋白のサブユニッ
トによる抑制は、直接的にＣａチャンネルに対して相互
作用した結果であるのか否かについて、またＣａチャン
ネルのいずれの領域とＧ蛋白のいずれのサブユニットと
が相互作用した結果であるか否かについても明らかとな
っていなかった。

【０００６】従って、神経細胞において、Ｇ蛋白のいず
れのサブユニットとＣａチャンネルのどの領域との相互
作用によってＣａチャンネルの活性化が制御されている
のかを明らかにすることは、新たなＣａチャンネル活性
化剤、ひいては抗痴呆剤に代表される脳機能改善剤の開
発に有用である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｇ蛋白の
サブユニット群とＣａチャンネルのサブユニット群との
結合能を検討したところ、Ｇ蛋白のαサブユニットがＣ
ａチャンネルのα₁サブユニットＣ末端領域と特異的に
結合し、当該結合によりＣａチャンネルの活性化が抑制
されることを見出した。そして、更に、当該結合能又は
当該結合による機能変化の測定を利用すればＣａチャン
ネル活性化剤の評価ができること、更にまた当該結合を
阻害する物質又は当該結合による機能変化を阻害する物
質はＣａチャンネル活性化剤、抗痴呆剤、脳機能改善剤
として有用であることを見出し、本発明を完成するに至
った。

【０００８】すなわち、本発明は、被検体の存在下、Ｇ
蛋白のαサブユニットとＣａチャンネルα₁サブユニッ
トのＣ末端領域との結合阻害試験、又は、神経細胞又は
遺伝子工学的にＣａチャンネル蛋白を発現させた細胞を
用いて、Ｇ蛋白のαサブユニットとＣａチャンネルα₁
サブユニットの結合に起因する機能変化測定試験を行う
ことを特徴とする神経細胞Ｃａチャンネル活性化剤の評
価方法、並びに当該方法により見いだされた物質を有効
成分とするＣａチャンネル活性化剤、抗痴呆剤及び脳機
能改善剤を提供するものである。

【０００９】また、本発明は、Ｇ蛋白のαサブユニット
とＣａチャンネルα₁サブユニットのＣ末端領域との結
合を阻害する物質又はＧ蛋白のαサブユニットとＣａチ
ャンネルα₁サブユニットの結合によりもたらされるＣ
ａチャンネルの機能変化を阻害する物質を有効成分とす
る神経細胞Ｃａチャンネル活性化剤、抗痴呆剤及び脳機
能改善剤を提供するものである。

【００１０】

【発明の実施の形態】Ｃａチャンネルα₁サブユニット
には、Ｇ蛋白と結合する可能性のある部分として、細胞
内Ｉ−IIループ領域とＣ末端領域がある。一方、Ｇ蛋白
には、Ｃａチャンネルα₁サブユニットと結合する可能
性のあるユニットとして、αサブユニットとβγサブユ
ニットがある。本発明者らは、Ｃａチャンネルα₁サブ
ユニットのＩ−IIループ領域にＧ蛋白のβγサブユニッ
トが結合するのを確認した。更に本発明者らはＣ末端領
域にはαサブユニットが特異的に結合することを明らか
にした。

【００１１】すなわち、これら４種のユニット又はその
部分ペプチドを遺伝子組換え技術又は合成等により調製
し、これらを反応させた後、Ｇ蛋白αサブユニットに対
する抗体又はＧ蛋白βγサブユニットに対する抗体を反
応させることにより結合の有無を確認することにより検
討を行った。なお、これらの抗体を用いた結合の有無
は、結合部位に相当するペプチドを用いた一次抗体の吸
収実験を採用するのが好ましい。

【００１２】更に、Ｃａチャンネルα₁サブユニットの
Ｃ末端領域とＧ蛋白のαサブユニットが結合したとき、
Ｃａチャンネル活性化が抑制されることを確認した。す
なわち、ミュータントＣａチャンネル又はキメラＣａチ
ャンネルを発現させたアフリカツメガエル卵母細胞を用
いた電気生理学的検討により、かかる結合があったとき
にＣａチャンネルの活性化が抑制されることを確認し
た。

【００１３】本発明の評価方法を実施するには、被検体
の存在下にＣａチャンネルα₁サブユニットのＣ末端領
域とＧ蛋白のαサブユニットとを反応させ、当該結合の
有無を検討すればよい。当該結合が抑制されれば、被検
体は、Ｇ蛋白の結合を抑制することにより、Ｃａチャン
ネルを活性化する作用を有することがわかる。一方、当
該結合が抑制されなければ、この被検体には直接結合抑
制作用によるＣａチャンネル活性化作用はないことがわ
かる。

【００１４】一方、当該結合を直接阻害しないにもかか
わらず、Ｃａチャンネル活性化作用を示す物質もあり得
る。すなわち、Ｃａチャンネルα₁サブユニットのＣ末
端領域とＧ蛋白のαサブユニットとの結合に基づく何ら
かの機能変化を阻害する場合である。この例としては、
被検体がＣａチャンネルα₁サブユニットのＣ末端領域
のうちＧ蛋白αサブユニットの結合部位以外の部分に結
合するような場合が挙げられる。

【００１５】かかる機能変化を阻害する物質としては、
ネフィラセタム（Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）−
２−（２−オキソ−１−ピロリジニル）アセトアミド）
が挙げられる。アフリカツメガエルの卵母細胞にδオピ
エート受容体（ＤＯＲ）ならびにＮタイプＣａチャンネ
ルのｍＲＮＡをマイクロインジェクションすることによ
りそれぞれの蛋白を発現させる。この実験系で電気生理
学的手法を用いて検討すると、膜電位を−８０ｍＶから
＋１０ｍＶに脱分極させることによりＮタイプＣａチャ
ンネルが開口し、内向きのカルシウム電流が観察され
る。この時ＤＯＲをそのリガンドであるロイシンエンケ
ファリンにて刺激すると、内因性のＧ蛋白を介してカル
シウム電流が抑制される（図１）。一方でネフィラセタ
ムを共存させることによって、このＧ蛋白による内向き
のカルシウム電流の抑制が解除されることが明らかにな
っている（図１）。またこのネフィラセタムは、その³
Ｈ−ラベル体を用いて検討すると、ＮタイプＣａチャン
ネルのＣ末端領域のうち、Ｇ蛋白αサブユニットの結合
部位以外の領域に対して特異的な結合能を有しているこ
とも明らかとなっている。従って、ネフィラセタムはＮ
タイプＣａチャンネルのα_1BサブユニットのＣ末端領域
とＧ蛋白αサブユニットとの結合を直接的に阻害せず、
その両者の結合領域以外のＮタイプＣａチャンネルα_1B
サブユニットのＣ末端領域に結合し、これらサブユニッ
ト（α_1BサブユニットＣ末端領域ならびにＧ蛋白αサブ
ユニット）の結合により生じる機能に影響を及ぼすこと
によってＣａチャンネルを活性化させているものと考え
られる。

【００１６】前記の如く、Ｃａチャンネル活性化剤は、
神経伝達物質の遊離能の低下、神経細胞可塑性の低下等
の脳機能が低下した疾患、例えばアルツハイマー症に代
表される痴呆症の改善剤として有用である。

【００１７】本発明の医薬は、上記薬効成分に、必要に
応じて賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、被覆剤、乳化
剤、懸濁剤、溶剤、安定化剤、吸収助剤、軟膏基剤等の
薬学的に許容される担体を適宜添加するか、又はリポソ
ーム化等を行い、常法に従って経口投与用、注射用、直
腸投与用等の剤型として製剤化することにより得られ
る。

【００１８】経口投与用の製剤としては、顆粒剤、錠
剤、糖衣錠、カプセル剤、ソフトカプセル剤、丸剤、液
剤、乳剤、懸濁剤等が、注射投与用の製剤としては、静
脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、点滴注射用等が、直
腸内投与用の製剤としては、坐剤、カプセル剤等が好ま
しい。

【００１９】投与量は、投与経路、患者の年齢、症状等
によって異なるが、通常成人１日当たり経口投与の場
合、薬効成分として１００〜２，０００mg、特に２００
〜１，０００mgが好ましく、これを１回あるいは数回に
分けて投与する。

【００２０】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００２１】実施例１ 〔実験方法〕Ｃａチャンネルのα_1Bサブユニット又はα
_1Aサブユニットの、蛋白を完全にコードするＤＮＡ配列
を有したｐＳＰ組換えプラスミド（それぞれｐＳＰＢ３
又はｐＳＰＣＢＩ−２）は、Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｃｈ
ａｎｎｅｌｓ，２，３０３−３１４（１９９４）及びＮ
ａｔｕｒｅ ３５０，３９８−４０２（１９９１）に従
ったものを使用した。

【００２２】〔Ｇｏα及びＧβγの結合実験〕α₁サブユニットのＣ末端領域をコードする組換えプラ
スミドの作製 α_1Bサブユニット（アミノ酸配列は配列番号１）の１９
１２−２３３８アミノ酸残基をコードするＤＮＡフラグ
メント（１．６ｋｂ）を上記の組換えプラスミドｐＳＰ
Ｂ３より制限酵素ＳｒｆＩ／ＳａｌＩで、更にα_1Aサブ
ユニット（アミノ酸配列は配列番号２）の１９７５−２
４２４アミノ酸残基をコードするＤＮＡフラグメント
（１．４ｋｂ）をｐＳＰＣＢＩ−２から制限酵素Ｓｃａ
Ｉ／ＢａｍＨ１でそれぞれ切り出した。これらチャンネ
ルのα₁サブユニットのＣ末端領域をコードするＤＮＡ
フラグメントからグルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼ（ＧＳＴ）融合蛋白を生合成させることを目的とし
て、ＧＳＴ蛋白をコードするプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ
（ファルマシア）にフレームをあわせて挿入し、組換え
プラスミドを作製した。（それぞれＮタイプ Ｃａチャ
ンネル Ｃ末端領域：ＧＳＴ−Ｂ３Ｔ．Ｐ／Ｑタイプ
Ｃａチャンネル Ｃ末端領域：ＧＳＴ−Ｂ１Ｔ）。

【００２３】〔α₁サブユニットの細胞内Ｉ−IIループ
領域をコードする組換えプラスミドの作製〕前記と同様
に、α_1Bサブユニット及びα_1Aサブユニットの細胞内Ｉ
−IIループ領域のＧＳＴ融合蛋白を生合成させることを
目的として、α_1Bサブユニットの３６１−４８３アミノ
酸残基をコードするＤＮＡフラグメントを、又はα_1Aサ
ブユニットの３６５−４８９アミノ酸残基をコードする
ＤＮＡフラグメントをＰＣＲで増幅し、前述と同様、ｐ
ＧＥＸ−２Ｔに挿入し、組換えプラスミドを作製した
（それぞれＮタイプ Ｃａチャンネル Ｉ−IIループ：
ＧＳＴ−Ｂ３Ｌ１、Ｐ／Ｑタイプ Ｃａチャンネル Ｉ
−IIループ：ＧＳＴ−Ｂ１Ｌ１）。なおＰＣＲに用いた
プライマーは、α_1Bの場合にGGAGAATTCGTAAGGAGCGCGAGA
GA-TCTGTGCCTTCACCATGCGCCの組合わせで、α_1Aの場合に
GGGGAATTCGCAAAGAAAGGGAGCGG-AGAAGGCCTGAGTTTTGACCATG
の組合わせで行い、それぞれのテンプレートＤＮＡに
は、前述のｐＳＰＢ３及びｐＳＰＣＢＩ−２を使用し
た。Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３，８５６−８
５８（１９９２）に準じて、前述の４種類のプラスミド
ならびにｐＧＥＸ−２Ｔを大腸菌ＤＨ５αに形質転換
し、０．５mMイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラク
トシドによって誘導、発現させた。引き続き、定法に従
って可溶性蛋白を調整し、グルタチオン−セファロース
４Ｂビーズ（ファルマシア）とともに４℃にて５時間イ
ンキュベーションした。グルタチオン−セファロース４
Ｂビーズの４０倍容量の１％トリトン−Ｘ１００含有Ｐ
ＢＳにて洗浄し、結合したＧＳＴ蛋白もしくはＧＳＴ融
合蛋白を以下の結合実験に使用した。

【００２４】Ｇｏα及びＧβγ２との結合実験：Ｇｏα
を結合させる場合には、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０３，
９５０−９５３（１９８８）に従い、０．１％ Ｌｕｂ
ｒｏｌ ＰＸ，２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．
０），０．１mM ＥＤＴＡ，０．５mM ジチオスレイト
ール，２０mMＮａＰＯ₄ ，各種プロテアーゼ阻害薬
（２．５μｇ／mlペプスタチン，２μｇ／ml フェニル
メチルスルホニルフルオリド，０．０２mg／ml ロイペ
プチン，０．５mM ベンズアミジン）を含んだバッファ
ーにて、Ｇβγ２を結合させる場合にはＪ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６８，２０５１２−２０５１９（１９９
３）に従い、０．６％ コール酸Ｎａ，２０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH８．０），０．１mM ＥＤＴＡ，０．５
mM ジチオスレイトール，２０mM ＮａＰＯ₄ ，各種プ
ロテアーゼ阻害薬（２．５μｇ／ml ペプスタチン，２
μｇ／ml フェニルメチルスルホニルフルオリド，０．
０２mg／ml ロイペプチン，０．５mM ベンズアミジ
ン）を含んだバッファーにてＧＳＴ融合蛋白もしくはＧ
ＳＴ蛋白の結合したグルタチオン−セファロース４Ｂビ
ーズを平衡化した。引き続き、精製した牛脳Ｇｏαもし
くはＧβγ２複合体１０μｇを加え、４℃にて１２時間
インキュベーションした。再びグルタチオン−セファロ
ース４Ｂビーズの４０倍容量のそれぞれのバッファーに
て、ビーズを洗浄したのち、同グルタチオン−セファロ
ース４Ｂビーズを２００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥのロー
ディングバッファー中にて９０℃３分間で熱変性した。
熱変性させたサンプルの７０μｌをＳＤＳ−ゲルにて電
気泳動、分離し、定法に従ってイモビロン膜に転写した
後、ウエスタンブロッティングを実施した。ＧｏαのＣ
末端領域のデカペプタイド（ＦＧｏ）に対する抗体Ｇｏ
ＡＢはＤｒ．Ｈａｇａより供与されたもの（Ｊ．Ｎｅｕ
ｒｏｃｈｅｍ．５８，２２７５−２２８４（１９９
２））を用い、Ｇｏα及びＧβ１に対する抗体Ｋ−２０
及びＭ−１４は、サンタクルーズ社（ＳＡＮＴＡ ＣＲ
ＵＺ社）より購入した。一次抗体は、非特異的結合を減
らすため適時、希釈して使用した（×２０００〜×８０
００）。二次抗体（ビオチン化抗ウサギＩｇＧ，アマシ
ャム社）及びパーオキシダーゼストレプトアビジン（ベ
クター社）は、１：２０００の希釈率で使用した。いず
れのインキュベーションも室温で１時間行った。デカペ
プタイドであるＦＧｏは、Ｇｏαの３４５−３５４アミ
ノ酸残基に対応する配列に基いて合成し（Ｊ．Ｎｅｕｒ
ｏｃｈｅｍ．５８，２２７５−２２８４（１９９２），
Ｓａｗａｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｇｏα及びＧ
β１に対する抗体Ｋ−２０ならびにＭ−１４のそれぞれ
に対する抗原ｓｃ−３８７Ｐ及びｓｃ−２６１Ｐは、サ
ンタクルーズ社より購入した。各種ＧＳＴ融合蛋白（Ｇ
ＳＴ−Ｂ３Ｔ，ＧＳＴ−Ｂ１Ｔ，ＧＳＴ−Ｂ３Ｌ１及び
ＧＳＴ−Ｂ１Ｌ１）ならびにＧＳＴ蛋白に対するＧｏα
ならびにＧβγ２の結合能の有無に関しての検討は少な
くとも三回以上の検討を行った。なお、Ｇｏαに対する
二種類の抗体ＧｏＡＢならびにＫ−２０の、Ｇｏα検出
能に関しては、本質的な差異は認められなかった。

【００２５】〔結果〕これまでの電気生理学的な検討か
ら推察されるように、Ｎタイプ及びＰ／ＱタイプのＣａ
チャンネルのＧ蛋白による抑制は、Ｇ蛋白のβγサブユ
ニットがそれぞれのチャンネル−α₁サブユニット細胞
内Ｉ−IIループ領域と相互作用をし、更にＧ蛋白のαサ
ブユニットがそれぞれのチャンネルのα₁サブユニット
Ｃ末端領域と相互作用した結果、引き起こされたものだ
と推察できた。

【００２６】そこで、Ｎタイプ Ｃａチャンネルのα_1B
サブユニットのＣ末端領域（１９１２−２３３８アミノ
酸残基）ならびに細胞内Ｉ−IIループ領域（３６１−４
８３アミノ酸残基）のＧＳＴ−融合蛋白を大腸菌に発現
させ、Ｇ蛋白の各種サブユニットとの相互作用について
検討を加えた。同様に、Ｐ／Ｑタイプ Ｃａチャンネル
のα_1Aサブユニットについても同様に検討を加えた（Ｃ
末端領域１９７５−２４２４アミノ酸残基、細胞内Ｉ−
IIループ３６５−４８９アミノ酸残基）。結合したＧ蛋
白αサブユニット又はβγサブユニットの検出は、それ
ぞれの抗体ＧｏＡＢもしくはＫ−２０、又はＭ−１４を
用いて行った。

【００２７】Ｃａチャンネルα_1Bサブユニットを用いた
結合試験：Ｇｏαとの結合実験 ：ＧｏＡＢ抗体は、牛脳より精製し
た３９−ｋＤａのＧｏαを認識した（図２、レーン１、
５）。更に、ＧｏＡＢ抗体は、Ｇｏαと反応させたＧＳ
Ｔ−Ｂ３Ｔの結合したビーズから熱変性により遊離され
たポリペプチドのいくつかを認識した（図２、レーン
２）。それらのうち、３９−ｋＤａの位置に観察された
バンドは、ウエスタンブロッティング時に一次抗体であ
るＧｏＡＢとともに、そのペプチド抗原であるＦＧｏを
共存させたことにより消失した（図２、レーン２、
４）。また、同様にＧｏＡＢをＦＧｏにて前処置するこ
とにより、精製したＧｏαに対するＧｏＡＢの反応性は
消失した（図２、レーン１、３）。これらのことは、３
９−ｋＤａに観察されたＧｏＡＢ抗体陽性のポリペプチ
ドは、チャンネルのＣ末端領域に結合していたＧｏαが
遊離されたものを特異的に検出した結果であると考えら
れた。一方でＧｏＡＢは、Ｇｏαと反応させたＧＳＴ−
Ｂ３Ｌ１もしくはＧＳＴの結合したビーズから、熱変性
により遊離されたポリペプチドとは反応しなかった（図
２、レーン５、６、７、８）。

【００２８】〔Ｇβγ２との結合実験〕一方で、β１サ
ブユニットを検出する抗体であるＭ−１４の抗体は、牛
脳より精製した３６−ｋＤａのＧβと反応した（図３、
レーン１、３、５、７）。また更に、Ｍ−１４抗体は、
Ｇβγ２と反応させたＧＳＴ−Ｂ３Ｌ１の結合したビー
ズから熱変性により遊離されたポリペプチドのいくつか
を確認した（図３、レーン４）。これら両者の免疫反応
性は、ウエスタンブロッティング時に一次抗体であるＭ
−１４とともに、そのペプチド抗原であるｓｃ−２６１
Ｐを共存させることによって消失した。これらのこと
は、３６−ｋＤａに観察されたＭ−１４抗体陽性のポリ
ペプチドは、チャンネルのＩ−IIループ領域に結合して
いたＧβγ２が遊離されたものを特異的に検出した結果
であると考えられた。

【００２９】一方で、Ｍ−１４抗体は、Ｇβγ２と反応
させたＧＳＴ−Ｂ３ＴもしくはＧＳＴの結合したビーズ
から、熱変性により遊離されたポリペプチドとは反応し
なかった（図３、レーン２）。以上、これらの結果はＧ
蛋白αサブユニットならびにＧ蛋白βγサブユニット
が、Ｎタイプ Ｃａチャンネルのα_1BサブユニットのＣ
末端領域もしくは細胞内Ｉ−IIループ領域に直接結合す
ることによりその活性を抑制するという事実を示してい
る。

【００３０】Ｐ／Ｑタイプ Ｃａチャンネルα_1Aサブユ
ニットを用いた結合試験：Ｇｏαとの結合実験 ：本実験では、前述のＧｏＡＢ抗体
とは異なり、Ｇｏαの抗体Ｋ−２０を用いて検討を行っ
た。Ｇｏαの抗体として得た、Ｋ−２０抗体もまた、実
際に、牛脳より精製した３９−ｋＤａのＧｏαを認識し
た（図２、レーン９）。更に、Ｋ−２０抗体は、Ｇｏα
と反応させたＧＳＴ−Ｂ１Ｔの結合したビーズから、熱
変性により遊離された３９−ｋＤａのポリペプチドを主
に認識した（図３、レーン１０）。また、Ｋ−２０抗体
が認識した３９−ｋＤａポリペプチドは、ウエスタンブ
ロッティング時に一次抗体であるＫ−２０とともに、そ
のペプチド抗原ｓｃ−３８７Ｐを共存させることにより
消失した（図２、レーン１０、１２）。また、同様にＫ
−２０抗体をｓｃ−３８７Ｐで前処置すると、精製した
Ｇｏαに対するＫ−２０の反応性も消失した（図２レー
ン９、１１）。一方でＫ−２０は、Ｇｏαと反応させた
ＧＳＴ−Ｂ１Ｌ１もしくはＧｏαと反応させたＧＳＴの
結合したビーズから、熱変性により遊離されたポリペプ
チドとは反応しなかった。

【００３１】Ｇβγ２との結合実験：一方で、β１サブ
ユニットの抗体であるＭ−１４の抗体は、牛脳より精製
した３６−ｋＤａのＧβと反応した（図３、レーン５、
７）。また更に、Ｍ−１４抗体は、Ｇβγ２と反応させ
たＧＳＴ−Ｂ１Ｌ１の結合したビーズから、熱変性によ
り遊離されたポリペプチドのいくつかを認識した（図
３、レーン８）。これら両者の免疫反応性は、ウエスタ
ンブロッティング時に一次抗体であるＭ−１４ととも
に、そのペプチド抗原ｓｃ−２６１Ｐを共存させること
によって消失した。一方でＭ−１４は、Ｇβγ２と反応
させたＧＳＴ−Ｂ１ＴもしくはＧＳＴの結合したビーズ
から、熱変性により遊離されたポリペプチドとは反応し
なかった（図２、レーン６）。以上、これらの結果は、
Ｇ蛋白αサブユニットならびにＧ蛋白βγサブユニット
は、Ｐ／Ｑタイプ Ｃａチャンネルのα_1Aサブユニット
のＣ末端領域もしくは細胞内Ｉ−IIループ領域に直接結
合することによりその活性を抑制するという事実を示し
たものである。

【００３２】実施例２ （Ｇｏα及びＧβγのＮタイプＣａチャンネルに対する
結合に及ぼすネフィラセタムの影響）

【００３３】〔実験方法〕各種融合蛋白の大腸菌による発現ならびに精製 前述のプラスミドのうち、ＮタイプＣａチャンネルα_1B
サブユニットに関する２種類のプラスミドならびにｐＧ
ＥＸ−２Ｔをそれぞれ大腸菌ＤＨ５αに導入し、０．５
mMイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドによ
って誘導、発現させた（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
１３，８５６−８５８（１９９２））。引き続き、定
法に従って可溶性蛋白を調整し、グルタチオン−セファ
ロース４Ｂビーズ（ファルマシア）とともに４℃にて５
時間インキュベーションした。グルタチオン−セファロ
ース４Ｂビーズの４０倍容量の１％トリトンＸ−１００
含有ＰＢＳにて洗浄し、結合したＧＳＴ蛋白若しくはＧ
ＳＴ融合蛋白を前記のとおり平衡化した。

【００３４】Ｇｏαの結合実験 ビーズを平衡化した後、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０３，
９５０−９５３（１９８８）に従い精製した牛脳Ｇｏα
１０μｇを、４℃にて１２時間、ＧＳＴ融合蛋白の結合
したビーズとともにインキュベーションした。ネフィラ
セタムの１０μＭを、Ｇｏαとともに添加した。グルタ
チオン−セファロース４Ｂビーズの４０倍容量のバッフ
ァーにて洗浄したのち、同グルタチオン−セファロース
４Ｂビーズを２００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥのローディ
ング バッファー中にて９０℃３分間で変成させた。こ
の熱変成したサンプルの上清７０μｌをＳＤＳ−ゲルに
て電気泳動、分離し、定法に従ってイモビロン膜に転写
した後、ウェスタン ブロッティングを実施した。Ｇｏ
αのＣ末端領域のデカペプタイド（ＦＧｏ）に対する抗
体ＧｏＡＢはＤｒ．Ｈａｇａより供与されたものを用い
た（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５８，２２７５−２２８
４（１９９２））。一次抗体は、非特異的結合を減らす
ため適時、希釈して使用した（×２０００〜×８００
０）。二次抗体（ビオチン化抗ウサギＩｇＧ，アマシャ
ム社）及びペロキシダーゼ−ストレプトアビジン（ベク
ター社）は、１：２０００の希釈率で使用した。いずれ
のインキュベーションも室温で一時間行った。

【００３５】Ｇβγの結合実験 Ｇβ１並びにＧγ２サブユニットの全アミノ酸をコード
するｃＤＮＡを含んだ組換えｐＳＰプラスミドより、Ｇ
β１γ２複合体の³⁵Ｓラベル体を、インビトロ転写翻訳
システム（ＴＮＴ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏ
ｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ，プロメガ社）
並びに³⁵Ｓ−メチオニン（アムシャム）を用いて生合成
した。生合成した³⁵Ｓ−Ｇβ１γ２複合体を４℃にて１
２時間、ＧＳＴ融合蛋白の結合したビーズとともにイン
キュベーションした。ネフィラセタムの１０μＭは、³⁵
Ｓ−Ｇβ１γ２複合体とともに添加した。グルタチオン
−セファロース４Ｂビーズの４０倍容量のバッファーに
て洗浄したのち、同グルタチオン−セファロース４Ｂビ
ーズを２００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥのローディング
バッファー中にて９０℃、３分間変成させた。この熱変
成したサンプルの上清７０μｌをＳＤＳ−ゲルにて電気
泳動、分離した。同ゲルを染色、乾燥した後、ＢＡＳシ
ステム（富士フィルム）用いてオートラジオグラフィー
を実施した。

【００３６】溶出蛋白を用いてのネフィラセタムのＮタ
イプＣａチャンネルＣ末端領域に対する特異的結合実験 前述のＮタイプＣａチャンネルＣ末端領域ＧＳＴ−Ｂ３
Ｔペプチドを結合させたグルタチオン−セファロース４
Ｂビーズから、融合蛋白を溶出させ、³Ｈ−ネフィラセ
タムと結合実験を行った。カラムに充填させた同ビーズ
に１０mM還元型グルタチオン含有５０mMＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（pH８．０）２mlを加え、ビーズに結合している融合
蛋白を溶出させた。³Ｈ−ネフィラセタム及び融合蛋白
１〜１００μｇを反応溶液中に加え、１〜２４時間、４
又は３０℃にてインキュベーションした。引き続き、定
法に従い、グラスフィルター（ワットマン社，ＧＦ／
Ｃ）に蛋白を吸着させ、その放射活性を液体シンチレー
ションカウンターにて測定することにより結合実験を行
った。³Ｈ−ネフィラセタムの特異的結合は、１〜１０
００μＭのネフィラセタムの存在下で行った結果との差
より算出した。

【００３７】〔結果〕前述の検討より、今回調製した各
種チャンネルの融合蛋白は少なくともＧ蛋白と結合しう
る生物学的活性を有したものであることが明らかとなっ
た。そこで同蛋白に対する³Ｈ−ネフィラセタムの結合
能の有無に関して検討を加えた。まず、ＮタイプＣａチ
ャンネルのＣ末端領域に対するＧｏαの結合並びに、Ｎ
タイプＣａチャンネルのループ領域に対するＧβγの結
合をネフィラセタムが阻害しうるか否かについて検討を
加えた。しかしながら、ネフィラセタムの１０μＭは、
ＧｏαのＮタイプカルシウムチャンネルのＣ末端領域に
対する結合に何ら、影響を及ぼさなかった。更にＮタイ
プＣａチャンネルのα_1BサブユニットＩ−IIループ領域
に対するＧβγの結合に対してもネフィラセタムは何
ら、影響を及ぼさなかった。この事は、ネフィラセタム
が直接的にＧ−蛋白の結合を阻害して活性を発現させて
いるのではなく、別の結合部位を有して、間接的にその
作用を発現しているものと考えられた。そこで、Ｎタイ
プＣａチャンネルのＣ末端領域の融合蛋白を精製し、³
Ｈ−ネフィラセタムが実際に結合しうるものか否かにつ
いて検討を加えた。この時、対照群には、ＧＳＴのみを
発現させた蛋白を使用した。その結果を（表１）に示
す。統計学的に有意な差は認められなかったものの、Ｇ
ＳＴのみの蛋白と比較して、ＮタイプＣａチャンネルの
Ｃ末端領域のフュージョン蛋白においてより高い特異的
結合が観察された。

【００３８】

【表１】

【００３９】参考例（³Ｈ−ネフィラセタムの合成） （１）フラスコにヨウ素３７１mg及び発煙硫酸３．８ml
を加えて油浴中で１００℃３分間加熱後、１，３−ジメ
チル−２−ニトロベンゼン１６６．５mgを加えて５分間
加熱攪拌した。反応後、反応液を氷水中に注ぎクロロホ
ルムで抽出し、クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで
乾燥後、減圧下濃縮し無色の結晶を得た（１４５．２m
g）。この結晶を分取用ＴＬＣ（ｎ−ヘキサン）で精製
し、１，３−ジメチル−４，５，６−トリヨード−２−
ニトロベンゼン（４４．０mg，７．５％，Ｒｆ＝０．２
２）を得た。無色針状晶、mp 207-208℃

【００４０】（２）フラスコに１，３−ジメチル−４，
５，６−トリヨード−２−ニトロベンゼン１９９．４m
g、ＳｎＣｌ₂・Ｈ₂Ｏ８５２．５mg、クロロホルム１２m
l及び２５ｗ／ｗ％−ＨＣｌ−メタノール１０mlを加え
て室温で７．５時間攪拌した。反応後、反応液にクロロ
ホルム（１００ml）を加え、飽和炭酸水素ナトリウム水
溶液（１００ml）及び水（１００ml）で洗浄し、クロロ
ホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下濃縮し
茶色の結晶を得た。この結晶を分取用ＴＬＣ（ｎ−ヘキ
サン：酢酸エチル＝１０：１）で精製し、３，４，５−
トリヨード−２，６−キシリジン（１４８．７mg，７
９．１％，Ｒｆ＝０．１４）を得た。褐色針状晶、mp 1
74-175℃

【００４１】（３）フラスコに２−ピロリドン−Ｎ−酢
酸３７５．０mg、乾燥ベンゼン４ml、塩化チオニル６．
５２４ｇを加えて、８０℃で１０分間加熱攪拌し、減圧
下濃縮した。得られた油状物質にアルゴン置換下乾燥ジ
クロロメタン１mlを加えて溶解し、これに３，４，５−
トリヨード−２，６−キシリジン１０６．３mgの乾燥ジ
クロロメタン溶液（１０ml）を加え室温で２０時間反応
した。反応後、反応液にクロロホルム（５０ml）を加え
水（５０ml）で洗浄し、クロロホルム層を無水硫酸ナト
リウムで乾燥後、減圧下濃縮し茶色の粗結晶（４５１m
g）を得た。この結晶を分取用ＴＬＣ（ベンゼン：アセ
トン＝５：４）で精製後、黄色の針状結晶（３１３mg）
を得た。この結晶をクロロホルム（５０ml）に溶解し、
飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ml）及び水（５０
ml）で洗浄し、クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで
乾燥後、減圧下濃縮し得られた無色の結晶を分取用ＴＬ
Ｃ（クロロホルム：アセトン＝５：１）で精製後、Ｎ−
（２，６−ジメチル−３，４，５−トリヨードフェニ
ル）−２−（２−オキソ−１−ピロリジニル）アセトア
ミド〔トリヨードネフィラセタム〕（１２３mg，９２．
５％）を得た。

【００４２】無色針状晶、mp 260-261℃(EtOH) IR(CHCl₃):3220cm^-1(NH), 1690cm^-1(C=O).¹ H-NMR(CDCl₃):8.045(1H,s,NH), 4.079(2H,s,CH₂),3.61
2(2H,t,J=7.0Hz,3-H₂),2.471(6H,s,Me×2),2.488(2H,t,
J=8.0Hz,5-H₂), 2.158(2H,m,4-H₂). HRMS m/z:M⁺,624.8350(calcd for C₁₄H₁₆O₂N₂I₃;624.83
46). Anal. cacld for C₁₄H₁₆O₂N₂I₃;C 26.95, H 2.42, N 4.
49, I 61.01;found;C27.17, H 2.44, N 4.51, I 60.77

【００４３】（４）上記（３）で得たトリヨードネフィ
ラセタム２０mgをメタノール−酢酸エチル混液（１：
１，３ml）に溶解し、これにトリエチルアミン（５０μ
ｌ）及び５％Ｐｄ／Ａｌ₂Ｏ₃（２０mg）を加え、トリチ
ウム（³Ｈ）ガス雰囲気下、室温で３時間攪拌した。３
倍量のメタノールを加えて蒸発させて不安定物質を除去
した。ＴＬＣ（クロロホルム−エタノール−アンモニア
＝１９：１：０．１）で９０％ラジオケミカル純度を有
する生成物１９７０ｍＣｉ得た。生成物３００ｍＣｉを
ＨＰＬＣにより精製し、１８４ｍＣｉ含有フラクション
として、Ｎ−（２，６−ジメチル−３，４，５−トリチ
ウムフェニル）−２−（２−オキソ−１−ピロリジニ
ル）アセトアミド〔³Ｈ−ネフィラセタム〕を得た。

【００４４】

【発明の効果】本発明により中枢神経のＣａチャンネル
とＧ蛋白との関係が明確になり、この作用による痴呆等
の脳機能障害の治療薬が得られる。

【００４５】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２３３８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 特徴を表す記号：ループ領域 存在位置：３６１．．４８３ 特徴を表す記号：Ｃ末端領域 存在位置：１９１２．．２３３８ 配列 mvrfgdelgg ryggaggaer argggaggag gpgpgglppg qrvlykqsia qrartmalyn 60 pipvkqncft vnrslfvfse dnvvrkyakr itewppfeym ilatiianci vlaleqhlpd 120 gdktpmserl ddtepyfigi fcfeagikil algfvlhkgs ylrngwnvmd fvvvltgila 180 tagtdfdlrt lravrvlrpl klvsgipslq vvlksimkam vpllqiglll ffailmfaii 240 glefymgkfh kacfpnstdp dpvgdfpcgk eaparlcegd tecreywagp nfgitnfdni 300 lfailtvfqc itmegwtdil yntndaagnt wnwlyfipli iigsffmlnl vlgvlsgefa 360 kerervenrr aflklrrqqq ierelngyle wifkaeevml aeedrnaeek spldavlkra 420 aakksrsdli qaeegegrlt glcapgspfa raslksgkte sssyfrrkek mfrffirrmv 480 kaqsfywtvl cvvalntlcv amvhynqpqr lttalyfaef vflglfltem slkmyglgpr 540 syfrssfncf dfgvivgsif evvwaavkpg tsfgisvlra lrllrifkvt kywnslrnlv 600 vsllnsmksi isllfllflf ivvfallgmq lfggqfnfkd etpttnfdtf paailtvfqi 660 ltgedwnavm yhgiesqggv srgmfssfyf ivltlfgnyt llnvflaiav dnlanaqelt 720 kdeeemeeaa nqklalqkak evaevspmsa anisiaarqq nsakarsvwe qrasqlrlqn 780 lrascealys emdpeerlry atarhlrpdv kthldrplvv epgrdaprgp pggksrpdgs 840 eapegadppr rhhrhrdkdk apatvpsage qdraealrae ggelgpreer grprrsrske 900 apgapevrsd rgrgpcpegg rrhhrrgspe eaaereprrh rahrhgpdpg kegpasgtrg 960 errarhrtgp racpreaess eeparrhrar hkapptqeta ekdkeaaekg geateaekdk 1020 earnhqpkel pcdleaigml gvgavhtlps tclqkveeqp edadnqrnvt rmgsqppdts 1080 ttvhipvtlt gppgettvvp sgnvdlesqa egkkevetsd vmrsgprpiv pyssmfclsp 1140 tnllrrcchy ivtmryfemv ilvvialssi alaaedpvrt dsprnnalky mdyiftgvft 1200 femvikmidl glllhpgayf rdlwnildfi vvsgalvafa fsgskgkdis tikslrvlrv 1260 lrplktikrl pklkavfdcv vnslknvlni livymlfmfi faviavqlfk gkffyctdes 1320 kelerdcrgq yldyekeeve aqprqwkkyd fhydnvlwal ltlftvstge gwpmvlkhsv 1380 datyeeqgps pgyrmelsif yvvyfvvfpf ffvnifvali iitfqeqgdk vmsecslekn 1440 eracidfais arpltrympq nkqsfqyktw tfvvsppfey fimamialnt vvlmmkfyda 1500 pyeyelmlkc lnivftsmfs mecvlkiiaf gvlnyfrdaw nvfdfvtvlg sitdilvtei 1560 annfinlsfl rlfraarlik llrqgytiri llwtfvqsfk alpyvcllia mlffiyaiig 1620 mqvfgniald ddtsinrhnn frtflqalml lfrsatgeaw heimlsclss racdehsnas 1680 ecgsdfayfy fvsfiflcsf lmlnlfvavi mdnfeyltrd ssilgphhld efirvwaeyd 1740 paacgrisys dmfemlkhms pplglgkkcp arvaykrlvr mnmpissedm tvhftstlma 1800 lirtaldikl apagtkqhqc daelrkeisc vwanlpqktl dllvpphkpd emtvgkvyaa 1860 lmifdfykqn ktsrdqtqqa pgglsqlgpv slfhplkatl eqtqpalrga raflrqkssa 1920 slsnggavqt qesgikesvs wgtqrtqdvl cearaplerg hsaeipvgqp gtlavdvqmq 1980 nmtlsgpdae pqpglesqgr aasmprlaae tqpapdaspm krsistlapr phtarlgsta 2040 ldrpapsqap hhhhhrchrr rdrkqrslek gpslsadtdg apdstvgpgl ptgegppgcr 2100 rererrqerg rsqerrqpss sssekhrfys cdrfggrepp qpkpslsshp tsptagqepg 2160 phpqgsgsvh gspllstsga stpgrgrrql pqtpltprps vtyktanssp vhfagapsgl 2220 pafspgrlsr glsehnallq rdplsrplap gsrigsdpyl gqrldseapa ralpedapaf 2280 eetaasnsgr ssrtsyvssl tsqppplrrv pngyhctlgl ggggrarrgc hhpdrdrr 2338

【００４６】 配列番号：２ 配列の長さ：２４２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 特徴を表す記号：ループ領域 存在位置：３６５．．４８９ 特徴を表す記号：Ｃ末端領域 存在位置：１９７５．．２４２４ 配列 marfgdempa ryggggagaa agvvvgaagg rgaggsrqgg qpgaqrmykq smaqrartma 60 lynpipvrqn cltvnrslfl fsednvvrky akkitewppf eymilatiia ncivlaleqh 120 lpdddktpms erlddtepyf igifcfeagi kiialgfafh kgsylrngwn vmdfvvvltg 180 ilatvgtefd lrtlravrvl rplklvsgip slqvvlksim kamipllqig lllffailif 240 aiiglefymg kfhttcfeeg tddiqgespa pcgteepart cpngtrcqpy wegpnngitq 300 fdnilfavlt vfqcitmegw tdllynsnda sgntwnwlyf ipliiigsff mlnlvlgvls 360 gefakererv enrraflklr rqqqiereln gymewiskae evilaedetd veqrhpfdga 420 lrratikksk tdllhpeeae dqladiasvg spfarasiks aklenssffh kkerrmrfyi 480 rrmvktqafy wtvlslvaln tlcvaivhyn qpewlsdfly yaefiflglf msemfikmyg 540 lgtrpyfhss fncfdcgvii gsifeviwav ikpgtsfgis vlralrllri fkvtkywasl 600 rnlvvsllns mksiisllfl lflfivvfal lgmqlfggqf nfdegtpptn fdtfpaaimt 660 vfqiltgedw nevmydgiks qggvqggmvf siyfivltlf gnytllnvfl aiavdnlana 720 qeltkdeqee eeavnqklal qkakevaevs plsaanmsia mkeqqknqkp aksvweqrts 780 emrkqnllas realysemdp eerwkasyar hlrpdmkthl drplvvdpqe nrnnntnksr 840 vaeptvdqrl gqqraedflr kqarhhdrar dpsahaaagl darrpwagsq eaelsregpy 900 gresdhqare ggleppgfwe geaergkagd phrrhahrqg vggsggsrsg sprtgtadge 960 prrhrvhrrp gedgpddkae rrgrhregsr parsgegeae gpdggggggg errrrhrhgp 1020 ppaydpdarr ddrerrhrrr kdtqgsgvpv sgpnlsttrp iqqdlsrqep plaedmdnlk 1080 nsrlataepv sphenlshag lpqspakmgs stdpagptpa taanpqnsta srrtpnnpgn 1140 psnpgppktp enslivtnps taqtnsakta rkpdhttvei ppacppplnh tvvqvnknan 1200 pdplpkkede kkeevdegpg edgpkpmppy ssmfilsttn plrrlchyil nlryfemcil 1260 mviamssial aaedpvqpna prnnvlryfd yvftgvftfe mvikmidlgl vlhqgayfrd 1320 lwnildfivv sgalvafaft gnskgkdint ikslrvlrvl rplktikrlp klkavfdcvv 1380 nslknvfnil ivymlfmfif avvavqlfkg kffhctdesk efekdcrgky llyeknevka 1440 rdrewkkyef hydnvlwall tlftvstgeg wpqvlkhsvd atfenqgpsp gyrmemsify 1500 vvyfvvfpff fvnifvalii itfqeqgdkm meeyslekne racidfaisa kpltrhmpqn 1560 kqsfqyrmwq fvvsppfeyt imamialnti vlmmkfygas vaydnalkvf nivftslfsl 1620 ecllkvlafg ilnyfrdawn ifdfvtvlgs itdilvtefg nnfinlsflr lfraarlikl 1680 lrqgytiril lwtfvqsfka lpyvclliam lffiyaiigm qvfgnigidm ededsdedef 1740 qitehnnfrt ffqalmllfr satgeawhni mlsclsgkpc dknsgiltpe cgnefayfyf 1800 vsfiflcsfl mlnlfvavim dnfeyltrds silgphhlde yvrvwaeydp aawgrmlyrd 1860 myamlrhmpp plglgkncpa rvaykrllrm dlpvaddntv hfnstlmali rtaldikiak 1920 ggadkqqmda elrkemmaiw pnlsqktldl lvtphkstdl tvgkiyaamm imeyyrqska 1980 kklqamreeq nrtplmfqrm epppdeggag qnalpstqld pagglmahed glkdspswvt 2040 qraqemfqkt gtwsperapp admadsqpkp qsvemremsq dgysdsehcl pmegqaraas 2100 mprlpaenqr rrgrprgsdl sticdtspmk rsasvlgpka srrlddysle rvppeenqrh 2160 hprrrerahr tserslgryt dvdtglgtdl smttqsgdlp srereqergr pkdrkhrphh 2220 hhhhhhhpgr gpgrvspgvs arrrrrgpva rvrparapal aharararap arllpelrlr 2280 rarrprprqr rrprrrrggg gralrrapgp replaqdspg rgpsvclara arpagpqrll 2340 pgprtgqapr arlpqkpars vqrerrglvl sppppppgel aprahpartp rpgpgdsrsr 2400 rggrrwtasa gkggggpras apsp 2424

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｃａチャンネルに対するネフィラセタムの作用
を示す図である。

【図２】Ｃａチャンネルα₁サブユニットとＧ蛋白との
結合性を示す電気泳動像の写真である。

【図３】Ｃａチャンネルα₁サブユニットとＧ蛋白との
結合性を示す電気泳動像の写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA16 MA01 MA16 MA22 MA23 MA35 MA37 MA41 MA52 MA60 MA66 NA14 ZA152 ZC502

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検体の存在下、Ｇ蛋白のαサブユニッ
   トとカルシウムチャンネルα₁サブユニットのＣ末端領
   域との結合阻害試験、又は、神経細胞又は遺伝子工学的
   にカルシウムチャンネル蛋白を発現させた細胞を用い
   て、Ｇ蛋白のαサブユニットとカルシウムチャンネルα
   ₁サブユニットの結合に起因する機能変化測定試験を行
   うことを特徴とする神経細胞カルシウムチャンネル活性
   化剤の評価方法。
2. 【請求項２】 遺伝子工学的にカルシウムチャンネル蛋
   白を発現させた細胞がアフリカツメガエル卵母細胞であ
   る請求項１記載の評価方法。
3. 【請求項３】 Ｇ蛋白のαサブユニットとカルシウムチ
   ャンネルα₁サブユニットの結合による機能変化測定試
   験が、電気生理学的試験である請求項１又は２記載の評
   価方法。
4. 【請求項４】 Ｇ蛋白のαサブユニットとカルシウムチ
   ャンネルα₁サブユニットのＣ末端領域との結合阻害試
   験が、Ｇ蛋白サブユニット抗体を用いたものである請求
   項１の評価方法。
5. 【請求項５】 Ｇ蛋白のαサブユニットとカルシウムチ
   ャンネルα₁サブユニットのＣ末端領域との結合を阻害
   する物質又はＧ蛋白のαサブユニットとカルシウムチャ
   ンネルα₁サブユニットの結合によりもたらされるカル
   シウムチャンネルの機能変化を阻害する物質を有効成分
   とする神経細胞のカルシウムチャンネル活性化剤。
6. 【請求項６】 Ｇ蛋白のαサブユニットとカルシウムチ
   ャンネルα₁サブユニットのＣ末端領域との結合を阻害
   する物質又はＧ蛋白のαサブユニットとカルシウムチャ
   ンネルα₁サブユニットの結合によりもたらされるカル
   シウムチャンネルの機能変化を阻害する物質を有効成分
   とする抗痴呆剤。
7. 【請求項７】 Ｇ蛋白のαサブユニットとカルシウムチ
   ャンネルα₁サブユニットのＣ末端領域との結合を阻害
   する物質又はＧ蛋白のαサブユニットとカルシウムチャ
   ンネルα₁サブユニットの結合によりもたらされるカル
   シウムチャンネルの機能変化を阻害する物質を有効成分
   とする脳機能改善剤。
8. 【請求項８】 請求項１乃至４のいずれか１項に記載の
   方法により見いだされた物質を有効成分とするカルシウ
   ムチャンネル活性化剤。
9. 【請求項９】 請求項１乃至４のいずれか１項に記載の
   方法により見いだされた物質を有効成分とする抗痴呆剤
   又は脳機能改善剤。