JP2000023692A

JP2000023692A - β−グルコシドの製造方法

Info

Publication number: JP2000023692A
Application number: JP19926198A
Authority: JP
Inventors: Yasuichi Usui; 泰市碓氷; Kanzo Sakata; 完三坂田; Koichi Ogawa; 浩一小川; Masayasu Takada; 正保高田
Original assignee: Japan Maize Products Co Ltd; Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Current assignee: Japan Maize Products Co Ltd; Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Priority date: 1998-07-14
Filing date: 1998-07-14
Publication date: 2000-01-25

Abstract

(57)【要約】【課題】 β−グルコシダーゼを用いたβ−グルコシド
の製造方法であって、β−グルコシダーゼの供与体基質
として、安価及び／又は容易に製造することができる化
合物を使用することができる工業的に利用可能な方法の
提供。【手段】少なくとも1種の重合度3以上のβ−グルコオ
リゴ糖と水酸基を有する化合物とにβ−グルコシダーゼ
を作用させてβ−グルコシドを生成する工程を含むβ−
グルコシドの製造方法。グルコースを主成分として含む
糖液にβ−グルコシダーゼを作用させてβ−グルコオリ
ゴ糖を得る工程、及び得られたβ−グルコオリゴ糖と水
酸基を有する化合物とにβ−グルコシダーゼを作用させ
てβ−グルコシドを生成させる工程を含む、β−グルコ
シドの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、β−グルコシダー
ゼを用いたβ−グルコシドの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】各種アルコール配糖体、芳香族アルコー
ル配糖体、ポリフェノール配糖体は植物界に広く存在
し、配糖体は植物体内で様々な役割を担っていると言わ
れている。自然界に存在するこれらの配糖体のうち大多
数はβ−グルコシドである。天然物のβ−グルコシドは
グルコース残基がβ−結合したグルコシドである。β−
グルコシドは食品素材、食品添加物、甘味剤、医薬品
（鎮痛剤、下剤、抗マラリヤ剤等）、化粧品や芳香剤の
分野で広く利用されている。

【０００３】β−グルコシドを製造する方法として一般
的に３つの方法が知られている。第一の方法は、植物体
等の天然物から抽出する方法、第二の方法は化学合成
法、第三の方法は酵素的合成法である。しかし、第一の
方法は、植物体に含まれるβ−グルコシドの含有量が少
ない上、夾雑物が多く含まれるため精製コストが高くつ
くという問題があった。また、第二の方法（化学的合成
法）は、一般的に糖の水酸基の保護、脱保護等の工程を
多く必要とし、繁雑である。更に、有機溶媒を使用する
ため特殊な設備が必要である。そのため、工業的製造方
法としては不利な点が多かった。

【０００４】第三の方法（酵素的合成法）には様々な報
告があり、その1つとしてβ−グルコシダーゼによる糖
転移反応を利用した方法がある。特開昭５９−８２０９
６に記載の方法ではβ−グルコシダーゼの供与体基質と
してフェニルβ−グルコシドが使用されている。しか
し、このフェニルβ−グルコシドは高価であり、工業的
に製造することも困難であるため容易に入手することが
できなかった。従って、この方法を工業的大量生産に使
用することは困難であった。特開昭６３−２５８５９で
は、セロビオース、ホロセルロース、キシラン等のセル
ロース系糖質やメチルβ−グルコシドをβ−グルコシダ
ーゼの供与体基質として使用している。しかし、これら
の供与体基質も工業的に製造することは困難であるた
め、この方法をβ−グルコシドの工業的製造に利用する
ことは困難であった。

【０００５】その後、様々な配糖体製造方法が報告され
てきた。例えば、特開平４−２７３８９０に記載のサイ
クロデキストリングルカノトランスフェラーゼを用いた
カテキン配糖体の製造方法、特開平５−１７６７８６に
記載のシュークロースホスホリラーゼを用いたカテキン
配糖体の製造方法、特開平９−２２４６９３及び特開平
９−８７２９４に記載のα−グルコシダーゼを用いたメ
ントール配糖体の製造方法等である。これらの方法で
は、使用している酵素の性質上α−グルコシドしか製造
されなかった。また、特開平５−２２１８３４に記載の
β−ガラクトシダーゼを用いるカテコール配糖体の製造
方法、特開平８−１９３９３に記載のβ−ガラクトシダ
ーゼを用いたステビオシド配糖体の製造方法、及び特開
平８−２３８０９３に記載のβ−ガラクトシダーゼを用
いたアルコール配糖体の製造方法では、酵素にβ−ガラ
クトシダーゼを使用していたため、β−ガラクトシドを
生成し、β−グルコシドを得ることはできなかった。従
って、いずれの方法を用いてもβ−グルコシドを製造す
ることはできなかった。

【０００６】従って、β−グルコシダーゼを用いたβ−
グルコシドの製造方法であって、安価及び／又は容易に
製造又は入手可能な供与体基質を用いる方法の開発が期
待されていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、β−
グルコシダーゼを用いたβ−グルコシドの製造方法であ
って、β−グルコシダーゼの供与体基質として、安価及
び／又は容易に製造することができる化合物を使用する
ことができる工業的に利用可能な方法を提供することに
ある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】β−グルコシドの製造方
法（１）本発明は、少なくとも1種の重合度3以上のβ−グルコオ
リゴ糖と水酸基を有する化合物とにβ−グルコシダーゼ
を作用させてβ−グルコシドを生成する工程を含むβ−
グルコシドの製造方法に関する。

【０００９】本発明者らは、研究を重ねた結果、重合度
３以上の糖がβ−グルコシダーゼの糖転移反応の糖供与
体基質として良好に使用できることを見出し、本発明を
完成した。本発明は、供与体基質として重合度３以上の
β−グルコオリゴ糖を用いたβ−グルコシダーゼの糖転
移反応によるβ−グルコシドの製造方法である。本供与
体基質は安価及び／又は容易に製造することができるた
め、本方法は工業的なβ−グルコシドの製造に利用する
ことができる。

【００１０】重合度3以上のβ−グルコオリゴ糖として
は、重合度3以上のものであれば特に制限はなく各種β
−グルコオリゴ糖を使用することできる。糖転移反応を
効率よく行なうためには、供与体基質として重合度3〜
７のものを使用することが好ましい。また、重合度3以
上のβ−グルコオリゴ糖2種以上を含む混合物をβ−グ
ルコオリゴ糖として使用することもできる。具体的に
は、例えば、重合度３の4-0-β-D-ゲンチオビオシル-D-
グルコ−ス並びに6-0-β-D-ゲンチオビオシル-D-グルコ
ース等のゲンチオトリオース、重合度４のゲンチオテト
ラオース等、又はそれらを含有する混合物等を使用する
ことができる。また、工業的に製造された市販のβ−グ
ルコオリゴ糖液、例えば、ゲンチオトリオース及びゲン
チオテトラオースを含有する「ゲントース#80」（日本
食品化工（株）製）等を使用することもできる。

【００１１】β−グルコシダーゼ糖転移反応の受容体基
質としては、水酸基を有する化合物を使用する。水酸基
を有する化合物としては、例えば、アルコール類、芳香
族アルコール類、及びポリフェノール類等を挙げること
ができる。

【００１２】アルコール類には、例えば、炭素数３〜１
５の直鎖若しくは環状アルコール、モノテルペンアルコ
ール、又はセスキテルペンアルコール等を使用すること
ができる。具体的には、モノテルペンアルコールとして
は、１−メントール、ゲラニオール、シトロネロール、
リナロール、ボルネオール、α−シクロゲラニオール、
ｉ−ボルネオール、ラバンジュロール、ネロール、ｉ−
プレゴール、テルピネオール等を挙げることができる。
セスキテルペンアルコールとしては、セドロール、ファ
ルネソール、ネロリドール、サンタロール、ランセオー
ル、及びオイデスモール等を挙げることができる。

【００１３】芳香族アルコール類としては、ベンジルア
ルコール、フェネチルアルコール、サリチル酸メチル、
クミンアルコール、アニスアルコール、シンナミルアル
コール、ジメチルベンジルカルピノール、ハイロドロシ
ンナミルアルコール、メチルフェニルカルビノール、及
びバニリン等を挙げることができる。

【００１４】ポリフェノール類としては、ハイドロキノ
ン、カテキン、カテコール、コウジ酸、カフェー酸、及
びレゾルシノール等を挙げることができる。

【００１５】本発明に使用するβ−グルコシダーゼは、
配糖体生成能を有する、微生物起源又は植物由来の酵素
である。具体的には、例えば、アスペルギルス・ニガー
(Aspergillus niger)、アスペルギルス・プルベンレン
ス(Aspergillus pluverulentus)、ペニシリウム・フニ
クロサム(Penicillium funiculosum)、ペニシリウム・
フリクエンタス(Penicillium frequentus)、トリコデル
マ・ビリデ_イ(Trichoderma viride)、トリコデルマ・リ
ーセイ(Trichoderma reesei)等の微生物起源のβ−グル
コシダーゼを使用することができる。これらの微生物
は、公知であり、これらの微生物起源の各種酵素剤も多
数市販されているので、微生物及び酵素剤は容易に入手
することが可能である。

【００１６】β−グルコシダーゼ糖転移反応は以下の方
法により行うことができる。糖供与体及び受容体を混合
し、得られた混合物にβ−グルコシダーゼを添加し、反
応させる。反応液中の受容体基質濃度は1%〜50%、好ま
しくは5%〜30%とすることができる。β−グルコシダー
ゼの添加量は、混合物1ml当たり0.1〜50単位、好ましく
は、0.5〜10単位とすることができる。本反応液を10〜3
00時間、好ましくは、100〜150時間インキュベイトす
る。得られた反応液を1〜10、好ましくは3〜5分間煮沸
し、酵素を失活させ反応を終了させる。

【００１７】反応液は、使用する酵素に適する温度及び
pHに調整する。温度は、例えば、20〜70℃、好ましくは
30〜50℃とすることができる。pHは、例えば、3.0〜7.
0、好ましくは4.0〜6.0とすることができる。

【００１８】pHの調整は、緩衝液を反応液に添加するこ
とにより行なうことができる。緩衝液としては、酢酸ナ
トリウム、リン酸ナトリウム、及びリン酸カリウム等を
挙げることができる。緩衝液の濃度は、例えば、20〜20
0mM、好ましくは50〜100mMとすることができる。緩衝液
の使用量は、基質濃度を考慮し適宜調整する。

【００１９】使用する受容体基質が難溶解性である場合
は、使用する受容体化合物の溶解性を高め、目的物の生
成率を向上させるために、反応を水系ではなく水−有機
溶媒混合系にして行なうこともできる。反応を水−有機
溶媒混合系にするためには、反応溶媒として有機溶媒を
使用することができる。使用する有機溶媒としては、特
に限定はないが、例えば、アセトン又はアセトニトリル
を挙げることができる。有機溶媒は、反応液中10〜50%
（w/w）、好ましくは、10〜30%(w/w)の範囲で添加する
ことができる。

【００２０】必要に応じて、得られたβ−グルコシドを
含有する生成物を更に精製することができる。精製に使
用することができる方法としては、例えば、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー、強酸性カチイオン交換樹脂クロマト
グラフィー、吸着クロマトグラフィー、及び／又は逆浸
透膜法等を挙げることができる。具体的には、例えば、
以下の方法を用いることができる。反応失活液を合成吸
着樹脂充填したカラムに通液し配糖体を吸着させ、水洗
いする。吸着した配糖体を50%メタノールで溶出し、濃
縮した配糖体を得る。得られた濃縮配糖体を更にゲル濾
過により精製することもできる。

【００２１】β−グルコシドの製造方法（２）本発明は、グルコースを主成分として含む糖液にβ−グ
ルコシダーゼを作用させてβ−グルコオリゴ糖を得る工
程、及び得られたβ−グルコオリゴ糖と水酸基を有する
化合物とにβ−グルコシダーゼを作用させてβ−グルコ
シドを生成させる工程とを含む、β−グルコシドの製造
方法に関する。

【００２２】上記β−グルコシドの製造方法（２）は、
グルコースを主成分として含む糖液からβ−グルコオリ
ゴ糖を製造し、得られたβ−グルコオリゴ糖をβ−グル
コシダーゼの供与体基質として使用するβ−グルコシド
の製造方法である。この方法は、原料となるグルコース
が安価で容易に入手可能であるため、工業的なβ−グル
コシドの製造に適しているという利点がある。以下、β
−グルコオリゴ糖を得る工程を「工程１」とし、得られ
たβ−グルコオリゴ糖からβ−グルコシドを得る工程を
「工程２」とする。

【００２３】工程１工程１のグルコースを主成分として含む糖液は、特に限
定はなく、グルコースを含有する糖液であればいずれも
使用することができる。グルコースの含有量は、好まし
くは、0.5〜0.8g/ml、更に好ましくは、0.6〜0.7g/mlと
することができる。

【００２４】工程１に使用するβ−グルコシダーゼは、
β−グルコオリゴ糖を生成し得る微生物起源の酵素であ
る。好ましくは、重合度3以上のβ−グルコオリゴ糖を
効率良く生成し得る酵素を使用する。β−グルコオリゴ
糖を生成し得る微生物起源の酵素としては、例えば、ト
リコデルマ・ビリデ_イ(Trichoderma viride)、アスぺル
ギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス
・プルベンレンス(Aspergillus pluverulentus)、ペニ
シリウム・フニクロサム(Penicillium funicuolsum)、
ペニシリウム・フリクエンタス(Penicillium frequentu
s)、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)等の
微生物起源のβ−グルコシダーゼを挙げることができ
る。これらの微生物は、公知であり、これらの微生物起
源の各種酵素剤も多数市販されているので、微生物及び
酵素剤は容易に入手することが可能である。工程１及び
工程２のそれぞれに使用するβ−グルコシダーゼには、
明らかな区別はない。従って、同一のβ−グルコシダー
ゼを工程１及び工程２に使用することもできる。

【００２５】工程１の操作方法は既に公知であり、特開
平１−２２２７７９及び特開平２−２１９５８４に記載
の方法等を使用することができる。例えば、以下の方法
を使用することができる。グルコースを濃度0.5〜0.8g/
ml、好ましくは、0.6〜0.7g/mlとなるように水に溶解す
る。溶液を使用する酵素に適するpHに調製する。得られ
た調製溶液1mlに対してβ−グルコシダーゼを0.5〜10単
位、好ましくは1〜3単位添加する。得られた溶液を24〜
100時間、好ましくは48〜72時間インキュベイトする。
インキュベイト中の温度は、使用する酵素に適した温
度、例えば、30〜70℃、好ましくは、40〜50℃に調節す
る。

【００２６】工程２工程１で得られたβ−グルコオリゴ糖を供与体基質とし
て使用する。工程1で得られたβ−グルコオリゴ糖は、
好ましくは、重合度3以上のβ−グルコオリゴ糖を含有
するものであり、重合度2以上のβ−グルコオリゴ糖を
含有していてもよい。これは、重合度が2以上も供与体
基質となり得るが、3以上のβ−グルコオリゴ糖が特に
良好な供与体基質となりうるためである。

【００２７】工程２の受容体基質としては、水酸基を有
する化合物を使用することができる。水酸基を有する化
合物としては、例えば、アルコール類、芳香族アルコー
ル類、及びポリフェノール類等を挙げることができる。
これらの化合物の具体例としては、β−グルコシドの製
造方法（１）に記載されているものと同様のものを挙げ
ることができる。

【００２８】工程２に使用するβ−グルコシダーゼは、
配糖体生成能を有する、微生物起源又は植物由来の酵素
である。具体的には、β−グルコシドの製造方法（１）
と同様の酵素を使用することができる。これらの微生物
は、公知であり、これらの微生物起源の各種酵素剤も多
数市販されているので、微生物及び酵素剤は容易に入手
することが可能である。

【００２９】工程２はβ−グルコシドの製造方法（１）
と同様の方法及び条件により行うことができる。更に、
β−グルコシドの製造方法（２）で得られたβ−グルコ
シドを含む生成物はβ−グルコシドの製造方法（１）と
同様の方法で精製することができる。

【００３０】工程１及び工程２は、同一のβ−グルコシ
ダーゼを用いて連続的に行なうことができる。連続的に
行なう場合は、酵素を失活させずに、工程１により得ら
れた糖溶液へ受容体基質を添加して、続けて工程２の反
応を行なう。この方法を用いることにより、工業的製造
を単純化することも可能である。

【００３１】一方、工程１及び工程２を段階的に行なう
こともできる。工程１及び工程２を段階的に行なうに
は、例えば、以下の方法を用いることができる。工程１
で得られた溶液を煮沸することにより、酵素を失活さ
せ、反応を終了させる。得られたβ−グルコオリゴ糖を
工程２の供与体基質として使用する。

【００３２】この場合、工程１で得られたβ−グルコオ
リゴ糖混合物を、工程２で使用する前に分画することが
できる。β−グルコオリゴ糖混合物を分画することによ
り、グルコースを除去し、β−グルコオリゴ糖の含量を
向上させることができる。β−グルコオリゴ糖の含量を
向上させるにより、工程２の反応効率を上げることがで
きる。

【００３３】β−グルコオリゴ糖の混合物を分画する方
法としては、例えば、イオン交換樹脂クロマトグラフィ
ー、及び膜分離等を挙げることができる。以下、本発明
を実施例により更に説明する。

【００３４】

【実施例】全ての実施例における酵素活性測定法（β−
グルコシダ−ゼ活性測定法及び糖組成の分析方法）は以
下のようにして行った。

【００３５】β−グルコシダ−ゼ活性測定法 0.5mlの0.5%(w/v)p-ニトロフェニルβ−グルコシドと50
mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）0.45mlを混合し、3
5℃で5分間プレインキュベションした。適当濃度に希釈
した酵素液0.05mlを添加して35℃、10分間反応させた
後、反応液1mlに0.2M炭酸ナトリウム2mlを添加し405nm
の吸光度を測定した。PNP量は検量係数設定用4-ニトロ
フェノ−ル（和光純薬工業（株）製）を用いて検量線を
求めた。なお上記条件で1分間に1μmolのpNPを遊離する
酵素量を1Uとした。

【００３６】糖組成の分析方法糖組成は試料を各種分析用カラムを装着した高速液体ク
ロマトグラフィ−（HPLC）により分析し、ピ−ク面積よ
り算出した。

【００３７】実施例１芳香族アルコール及びポリフェ
ノール類配糖体の調製 β-グルコオリゴ糖液として商品名「ゲントース#80」
（ゲンチオトリオース他3糖類：28%、ゲンチオテトラオ
ース：14%含有）(日本食品化工（株）製、70%(w/v)濃
度)10mlと受容体基質としてフェエネチルアルコール2m
l、アセトニトリル2ml、1M酢酸緩衝液pH5.0を2ml混合
し、β−グルコシダーゼを含有するトリコデルマ・ビリ
デ_イ起源の酵素製剤(cellulase、SIGMA社製)を100単位
添加し、得られた混合物を40℃でインキュベイトした。

【００３８】上記反応液から50μlをエッペンチューブ
にとり、5分間煮沸した後、HPLCにより配糖体を含む糖
組成の分析を行った。上記HPLCはカラム；Shodex Asahi
pak GS-220HQ(7.5mmI.D. × 500mm)、カラム温度；60
℃、溶離液；脱塩水、流速；0.6ml/min、検出器；RIモ
ニターという条件で分析した。

【００３９】72時間インキュベイトして反応を行った
後、得られた反応液を10分間煮沸し、酵素を失活した。
合成吸着樹脂HP-20(三菱化学社製)を充填したカラム(2.
5cmI.D.×16cm)に得られた反応失活液を通液し、水洗い
した後、50%のメタノールで配糖体画分を溶出し濃縮し
た。更に得られた濃縮液3ml(40%、w/v、固形物として1.
2g)をToyopearl HW-40Ss(東ソー(株)製)を充填したカラ
ム(5cmI.D.×95cm)を用い、カラム温度;65℃、流速;5ml
/min、検出器;RIモニターでゲル濾過により精製し、フ
ェネチルアルコール配糖体400mgを得た。

【００４０】トリコデルマ・ビリデ_イ起源の酵素製剤の
代わりにトリコデルマ・リーセイのβ-グルコシダーゼ
(SIGMA社製)を用いて上記と同様の実験を行なっても同
様の結果が得られた。

【００４１】得られたフェネチルアルコール配糖体の¹³
C核磁気共鳴スペクトルを重水中でテトラメチルシラン
を標準物として測定した結果、δ38.1、 63.6、 72.5、
73.6、 76.0、 78.6、 78.7、 105.1、 129.5、 131.
6、 131.9、 141.5ppmにシグナルが観察された。

【００４２】また得られたフェネチルアルコール配糖体
を1%(w/v)の水溶液として、アーモンド由来の β-グル
コシダーゼ(SIGMA社製)で加水分解した反応液を、Shode
x Asahipak GS-220HQカラムを用いるHPLCで分析したと
ころ、グルコースとフェネチルアルコールと一致するピ
ークが出現することが確認できた。以上の結果から得ら
れたフェネチルアルコール配糖体がフェネチル-β-グル
コシドであることが確認できた。

【００４３】フェネチルアルコールの代わりに、ベンジ
ルアルコール、サリチル酸メチル、クミンアルコール、
アニスアルコール、シンナミルアルコール、ジメチルベ
ンジルカルビノール、ハイロドロシンナミルアルコー
ル、メチルフェニルカルビノール、バニリン、ハイドロ
キノン、カテキン、カテコール、コウジ酸、カフェー
酸、レゾルシノールを用い上記と同様の反応を行い、HP
LC分析を行った結果、各受容体基質に対応したβ-グル
コシドの生成を確認することができた。

【００４４】実施例２直鎖及び環状アルコ−ル配糖体
の調製 D-グルコ−ス300gを80mlの水に60℃で溶解し、pHを5.0
に調製した後、トリコデルマ・ビリデ_イ起源のβ−グル
コシダ−ゼを800単位添加して、60℃で24時間反応させ
た。次いで、得られた反応液を10分間煮沸して酵素を失
活させた後、カチオン交換樹脂アンバ−ライトIR120B、
アニイオン交換樹脂IRA-410各51に通液した。得られた
液体をロータリーエバポレーターで糖濃度30%(w/v)まで
濃縮した。本濃縮液を全量、強酸性カチオン交換樹脂Do
wex XFS-43278（ダウケミカル社製）を充填したカラム
（26cm I.D. ×267cm）を用い、カラム温度；65℃、流
速；1500ml/min、検出器；RIモニターで精製した。精製
液のβ−グルコオリゴ糖組成をカラム；ULTORON PS80N
(8mm I.D. × 500mm)、カラム温度；50℃、溶離液；脱
塩水、流速0.9ml/min、検出器；RIモニターというHPLC
条件で分析した。本液の糖組成は単糖であるグルコ−ス
2.3%及びフラクト−ス0.5%、β−グルコオリゴ糖である
2種類62.0%、同3糖類24.5%、同4糖類及び5糖類10.7%で
あった。

【００４５】上記β−グルコオリゴ糖濃縮液(60%(w/v)
濃度)10mlに、受容体基質としてシクロペンタノ−ル2m
l、及び1M酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0を2ml混合
した。得られた混合物にβ−グルコシダーゼを含有する
ペニシリウム・フニクロサム起源の酵素製剤(cellulas
e, SIGMA社製)を100単位添加し、40℃でインキュベイト
した。

【００４６】本反応液の場合、糖組成は反応液50μlを
マイクロチューブにとり、5分間煮沸した後、HPLCによ
り分析を行った。上記HPLCはカラム；Shodex Asahipak
GS-220HQ(7.5mmI.D. × 500mm)、カラム温度；60℃、溶
離液；脱塩水、流速；0.6ml/min、検出器；RIモニター
という条件で分析した。

【００４７】インキュベイトにより反応を72時間行った
後、反応液を10分間煮沸し、酵素を失活させた。合成吸
着樹脂HP-20（三菱化学社製）を充填したカラム（2.5cm
I.D.×16cm)に得られた反応失活液を通液し、水洗した
後、50%のメタノ−ルでシクロペンタノ−ル配糖体を溶
出し濃縮した。更に得られた濃縮液3ml（40%、w/v1.2
g）をToyopearl HW-40S（東ソー（株）製）を充填した
カラム（5cm、I.D. ×95cm)を用い、カラム温度；65
℃、流速；5ml/min、検出器；RIモニターでゲル濾過に
より精製し、シクロペンタノ−ル配糖体を500mg得た。

【００４８】ペニシリウム・フニクロサム起源の酵素製
剤の代わりにペニシリウム・フリクエンタス起源のβ−
グルコシダ−ゼを用いて上記実施例２の実験を行なって
も同様の結果が得られた。

【００４９】得られたシクロペンタノ−ル配糖体の¹³C
核磁気共鳴スペクトルを重水中でテトラメチルシランを
標準物質をして測定した結果、δ25.5、 25.8、 34.5、
35.4、 63.7、 72.6、 76.0、 78.7、 78.8、 85.2、
103.8ppmにシグナルが観察された。また得られたシクロ
ペンタノ−ル配糖体を 1%(w/v)の水溶液とし、ア−モン
ド由来のβ−グルコシダ−ゼ(SIGMA社製)で加水分解し
た反応液を上記ShodexAsahipak GS-220HQカラムを用い
るHPLCで分析したところ、グルコースとシクロペンタノ
−ルと一致するピ−クが出現することが確認できた。以
上の結果から得られたシクロペンタノ−ル配糖体がシク
ロペンチル−β−グルコシドであることが確認できた。

【００５０】シクロペンタノ−ルの代わりに、1-プロパ
ノ−ル、2-プロパノ−ル、ブチルアルコ−ル、シクロプ
ロパンメタノ−ル、シクロペンタンメタノ−ル、シクロ
ブタノ−ル、シクロブタンメタノ−ル、1-ヘキサノ−
ル、1-ヘプタノ−ル、1-オクタノ−ル、1-デカノ−ルを
用いて実施例２と同様の反応を行い、HPLC分析を行った
結果、各受容体基質に対応するβ−グルコシドの生成を
確認することができた。

【００５１】実施例３モノテルペンアルコ−ル及びセ
スキテルペンアルコ−ル配糖体の調製実施例２と同様の方法により得たβ-グルコオリゴ糖濃
縮液(60%(w/v)濃度)10mlと、受容体基質として和光純薬
工業（株）製ゲラニオ−ル2ml、アセトニトリル2ml、及
び1M酢酸緩衝液pH5.0を2ml混合し、β−グルコシダーゼ
を含有するアスペルギルス・プルペルレンタス起源の酵
素製剤（商品名ペクチナーゼG、天野製薬（株）)を100
単位添加し、40℃でインキュベイトした。

【００５２】反応液50μlをエッペンチューブにとり、5
分間煮沸した後、HPLCにより糖組成の分析を行った。本
反応の場合はカラム;DAISOPAK SO-120-5-ODS-BP(4.6mm
I.D.×250mm)、カラム温度;40℃、溶離液;メタノール/
脱塩水=50/50(v/v)、流速1.0ml/min、検出器;RIモニタ
ー及びUVモニター(220nm)というHPLC条件で分析した。

【００５３】インキュベイトにより反応を72時間行った
後、得られた反応液を10分間煮沸し、酵素を失活させ
た。合成吸着樹脂HP-20(三菱化学社製)を充填したカラ
ム(2.5cmI.D×16cm)に上記反応失活液を通液し、水洗い
した後、50%エタノールで配糖体画分であるゲラニオー
ル配糖体を溶出し、濃縮した。更に濃縮液3ml(40%w/v、
固形物として1.2g)をToyopearl HW-40S(トーソー(株)
製)を充填したカラム(5cm、I.D.×95cm)を用い、カラム
温度;65℃、流速;5ml/min、検出器;RIモニターでゲル濾
過により精製し、ゲラニオール配糖体を250mg得た。

【００５４】アスペルギルス・プルベルレンタス起源の
酵素製剤の代わりにアスペルギルス・ニガーのβ-グル
コシダーゼ(SIGMA社製)を用いて上記実施例３と同様の
実験を行なっても同様の結果を得ることができた。

【００５５】得られたゲラニオール配糖体の¹³C核磁気
共鳴スペクトルを重水中でテトラメチルシランを標準物
質として測定した結果、δ16.6、 17.8、 25.9、 27.
5、 40.7、 62.9、 66.0、 71.8、 75.2、 78.1、 78.
8、 103.0、 121.6、 125.1、 132.6、 142.0ppmにシグ
ナルが観察された。

【００５６】また、得られたゲラニオール配糖体を1%(w
/v)の水溶液として、アーモンド由来のβ-グルコシダー
ゼ(SIGMA社製)で加水分解し、得られた反応液をDAISOPA
K SO-120-5-ODS-BPカラムを用いるHPLCで分析したとこ
ろ、グルコースとゲラニオールと一致するピークが出現
することが確認できた。以上の結果から得られたゲラニ
オール配糖体がゲラニオール−β−グルコシドであるこ
とが確認できた。

【００５７】ゲラニオールの代わりに、1-メントール、
シトロネロール、リナロール、ボルネオール、α-シク
ロゲラニオール、i-ボルネエオール、ラバンジュロー
ル、ネロール、i-プレゴール、テルピネオール、セドロ
ール、ファルネソール、ネロリドール、サンタロール、
ランセオール、オイデスモールを用い上記実施例３と同
様の反応を行い、HPLC分析を行った結果、各受容体基質
に対応するβ-グルコシドの生成を確認することができ
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B064 AF04 AF12 AF41 BH03 CA05 CB07 CD06 DA16

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも1種の重合度3以上のβ−グル
コオリゴ糖と水酸基を有する化合物とにβ−グルコシダ
ーゼを作用させてβ−グルコシドを生成する工程を含む
β−グルコシドの製造方法。
【請求項２】 β−グルコオリゴ糖が、重合度3以上の
β−グルコオリゴ糖２種以上を含む混合物である請求項
１に記載の製造方法。
【請求項３】 β−グルコオリゴ糖が、4-0-β-D-ゲン
チオオリゴシル-D-グルコース、及び6-0-β-D-ゲンチオ
オリゴシル-D-グルコースからなる群から選ばれる少な
くとも一種を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】水酸基を有する化合物がアルコール類、
芳香族アルコール類、及びポリフェノール類からなる群
から選ばれる少なくとも一種である請求項1から３のい
ずれか１項に記載の方法。
【請求項５】 β−グルコシダーゼが配糖体生成能を有
し、微生物起源又は植物由来の酵素である請求項１から
４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】 β−グルコシダーゼが、アスペルギルス
・ニガー、アスペルギルス・プルベルレンタス、ペニシ
リウム・フニクロサム、ペニシリウム・フリクエンタ
ス、トリコデルマ・ビリデ_イ、トリコデルマ・リーセイ
からなる群から選ばれる微生物起源のβ−グルコシダー
ゼである請求項1から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】グルコースを主成分として含む糖液にβ
−グルコシダーゼを作用させてβ−グルコオリゴ糖を得
る工程、及び得られたβ−グルコオリゴ糖と水酸基を有
する化合物とにβ−グルコシダーゼを作用させてβ−グ
ルコシドを生成させる工程を含む、β−グルコシドの製
造方法。
【請求項８】 β−グルコオリゴ糖が、重合度３以上の
β−グルコオリゴ糖を含有する請求項７に記載の製造方
法。
【請求項９】 β−グルコオリゴ糖が、重合度２以上の
β−グルコオリゴ糖を含有する請求項８に記載の製造方
法。